DE69712878T2

DE69712878T2 - Phosphatasemodulator

Info

Publication number: DE69712878T2
Application number: DE69712878T
Authority: DE
Inventors: Prof. Goris; Arthur Hemmings; Dr. Zolnierowicz
Original assignee: Novartis Erfindungen Verwaltungs GmbH; Novartis AG
Current assignee: Novartis Pharma GmbH; Novartis AG
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-17
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2017-03-18
Also published as: DE69712878D1; EP0889971B1; AU2027997A; ATE218165T1; JP2000514642A; JP4033490B2; WO1997037037A1; EP0889971A1; US6159704A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Modulator der Proteinphosphatase 2A (PP2A). Insbesondere betrifft die Erfindung die Beteiligung von eRF1 bei der PP2A Regulation und die Verwendung von Modulatoren der eRF1-PP2A Wechselwirkung zur Regulation der intrazellulären Signalübermittlung und Proteinsynthese.
Die Proteinphosphatase 2A (PP2A) ist bei der Regulation vieler zellulärer Prozesse einschließlich Metabolismus, Signaltransduktion, Wachstum, Entwicklung, Fortschritt und Umwandlung des Zellzyklus beteiligt (zusammengefaßt in M. C. Mumby und G. Walter (1993). Physiol. Rev. 73. 673-699, R. E. Mayer-Jaekel und B. A. Hemmings (1994). Trends Cell Biol. 4. 287-291). PP2A ist eine Familie aus trimeren Holoenzymen, die bestehen aus einer katalytischen 36 kDa Untereinheit (PP2Ac), die an die konstante Regulationsuntereinheit mit 65 kDa (PR65/A) gebunden ist, die dann wiederum mit der dritten variablen Regulationsuntereinheit assoziiert ist. Mehrere trimere PP2A Holoenzyme wurden gereinigt, die unterschiedliche variable Untereinheiten von jeweils 54, 55, 72 oder 74 kDa enthalten.
Wie es durch einen in vitro Rekonstitutionstest und durch die Analyse der Hefe und Drosophila Mutanten dokumentiert, die für die Regulationsproteine defizient sind, sind sowohl die konstanten als auch variablen Untereinheiten zur Kontrolle der PP2A Aktivität und Substratspezifität wichtig. Beispielsweise ist die PP2A Aktivität aus Hirnextrakten von Drosophila aar¹ Mutanten, worin das für PR55 kodierende Gen durch eine P-Elementinsertion zerstört wurde, gegenüber des durch p34cdc2 phosphorylierten Histons H1 und Caldesmons mehrfach geringer im Vergleich zu Wildtypfliegen. Im Gegensatz dazu ist die Phosphorylase-Phosphatase-Aktivität von PP2A ähnlich in aar¹ und Kontrollfliegen. Die variablen regulatorischen Untereinheiten stellen auch Ziele für potentielle Botenstoffe und virale Proteine dar. Es wurde gezeigt, daß Ceramid nur trimeres PP2A aktiviert, das die PR55 Untereinheit enthält, wobei das PP2Ac-PR65 Dinier nicht beeinflußt wird. Kürzliche Daten zeigen jedoch, daß weder die konstanten noch die variablen regulatorischen Untereinheiten für die Ceramidstimulierung der PP2A Aktivität erforderlich sind, da sowohl PP2Ac als auch das PP2Ac-PR65 Dinier durch Ceramid auf eine Weise stimuliert werden könnten, die zu der des trimeren Holoenzyms ähnlich ist was nahelegt, daß PP2Ac selbst ein Ziel der Ceramidwirkung ist. Ferner wurde von PP2A gezeigt, daß es mit transformierenden Antigenen bestimmter DNA Tumorviren assoziiert ist wie Klein-t und mittel-T-Polyomaviren und Klein-t-SV40. Man nimmt an, daß diese Onkoproteine die Veränderung der PP2A Aktivität durch Ersetzen der normalen zellulären variablen Regulationsuntereinheiten des trimeren Holoenzyms wirken. Einige virale Proteine interagieren nur mit spezifischen Formen der PP2A Holoenzyme, beispielsweise ist das Klein-t-Antigen von SV40 fähig, die B-Untereinheit (PR55) zu ersetzen, aber nicht die B'- Untereinheit des trimeren PP2A. Es wurde auch gezeigt, daß der Adenovirus E4orf4 an das trimere PP2A Holoenzym bindet, das PR55 enthält. Zusammengenommen zeigen diese Beispiele, daß die Aktivität von PP2Ac in vivo durch regulatorische Proteine streng kontrolliert wird.
Von vielen Komponenten des eukaryontischen Translationsapparats ist bekannt, daß sie phosphoryliert werden, und in manchen Fällen wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung die Translationsgeschwindigkeit kontrolliert. Darüberhinaus werden Elongations- und Terminationsfaktoren phosphoryliert, die direkt bei der Aufrechterhaltung der Translationsgenauigkeit wirken. Die Phosphorylierungsmengen sind auch bei der Kontrolle der Translationsaktivität in Schizosaccharomyces pombe beteiligt, da das Allosuppressorgen, nämlich sal3, zu cdc25 allelisch ist, von dem jetzt bekannt ist, daß es für eine Proteinphosphatase mit dualer Spezifität kodiert. Andere Beispiele der Beteiligung der Proteinphosphatasen bei der Aufrechterhaltung der Translationsgenauigkeit wurden berichtet, wobei in diesem Bezug der Translationsallosuppressor SAL6 der Hefe am bemerkenswertesten ist, der kürzlich als Serin/Threonin-Proteinphosphatase identifiziert wurde, die PPQ genannt wird.
Eine fundamentale Frage der Signaltransduktion ist, wie Proteinkinasen und Proteinphosphatasen reguliert werden, um die korrekten Zielproteine schnell und bevorzugt zur korrekten Zeit und am korrekten Ort zu phosphorylieren/dephosphorylieren. Die Zielhypothese von Hubbard und Cohen (1993), Trends Biochem. Bei. 81, 172-177 postuliert, daß eine "Zieluntereinheit" die Proteinkinasen und Proteinphosphatasen zu bestimmten subzellulären Orten dirigiert, wo sie auf ihre Ziele einwirken. Es existiert eine substanzielle Evidenz, um zu beweisen, daß mehrere Proteinkinasen und Proteinphosphatasen mit einer breiten Substratspezifität durch spezifisch wechselwirkende Proteine zu ihren Zielen dirigiert werden. Es wurde gezeigt, daß das Typ-II-Holoenzym der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) an spezifische subzelluläre Orte durch die Wechselwirkung der regulatorischen Untereinheit (RII) mit A-Kinaseverankerungsproteinen oder AKAPs gebunden wird. Interessanterweise wurden die PKA- verankenden Proteine anfänglich als Proteine identifiziert, die mit RII nach einer Affinitätschromatographie gemeinsam gereinigt werden. Darüberhinaus wurde von einer RACKs (Rezeptoren für aktivierte C-Kinase) genannten Gruppe gezeigt, daß sie an die aktivierte Form der Proteinkinase C-Isoenzyme bindet und die Translokation des Enzyms zum spezifischen subzellulären Kompartiment vermittelt, wo dies seine Wirkung entfaltet.
Für PP2A wurde angenommen, daß dieser Regulationstyp durch die aufbauenden Regulationsuntereinheiten vermittelt wird. Aber unter Berücksichtigung der vielen zellulären Prozesse, worin PP2A beteiligt ist, ist es möglich zu spekulieren, daß ein bestimmter Regulationsmodus auch von extrinsischen Proteinen kommen kann, statt nur von den intrinsischen Holoenzymkomponenten. Die Beteiligung von PP2A bei krankheitsbezogenen Prozessen, wie Zellzyklusfortschritt und Transformation legt dies nahe und macht die Kontrollmechanismen zu Zielen für die Therapie.
eRF1 ist ein Polypeptid, das die Genexpression durch die Beeinflussung der Freisetzung der Polypeptidketten vom Ribosom moduliert (Frolova et al.. (1994). Nature. 372. 701-703). Es wurden Vertreter der eRF1 Proteinfamilie von mehreren höheren eukaryontischen Organismen auf der Grundlage einer signifikanten Sequenzähnlichkeit zu einem Ribosom-assoziierten Protein aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae ursprünglich identifiziert (P. Berining und W. Pipersberg (1986). Nuc. Acid. res. 14. 5098-5107). Dieses Protein. Sup45 genannt, wurde durch die genetische Analyse von Mutanten, die eine defekte Nonsensesuppression in vivo zeigen, der Aufrechterhaltung der Translationsgenauigkeit zugeordnet. Das Hefe Sup45 zeigt ~70% Aminosäureidentität zu den eukaryontischen Entsprechungen und eine Mutation im SUP45 Gen kann durch das Xenopus laevis Sup45 Homologe C11 komplementiert werden, was nahelegt, daß dessen Funktion bei der Translationstermination ein konserviertes evolutorisches Merkmal ist.
Es wurde vorgeschlagen, daß eRF1 nicht nur der für die Translationstermination in vivo benötigte Freisetzungsfaktor ist, da es vorher gezeigt wurde, daß die Translationstermination bei Eukaryonten ein GTP-abhängiger Prozeß ist, aber die Vertreter der eRF Familie ihrerseits keine GTP-Bindungsstellen aufweisen (Frolova et al., 1994). Ein wahrscheinlicher Kandidat für diese Komponente der eukaryontischen Translationsterminationsmaschinerie könnte das Sup35 Protein sein (M. Tuite und I. Stansfield (1994). Nature. 372. 614-615). Ebenfalls ursprünglich in Saccharomyces cerevisiae beschrieben, zeigen Mutanten des SUP35 Gens ein ähnliches Muster an Phenotypen, wie SUP45 Mutanten, was die Beteiligung von Sup35 im Translationsterminationsprozeß nahelegt (zusammengefaßt von Stansfield und Tuite. 1994) und es enthält auch mehrere GTP-Konsensusbindungsstellen.
Tatsächlich haben die jüngsten Erkenntnisse gezeigt, daß Sup45 (eRF1) und Sup35 (auch eRF3) genannt tatsächlich unter Bildung eines Freisetzungsfaktorkomplexes sowohl in Hefen als auch höheren Eukaryonten wechselwirken (G. Zhouravleva et al. (1995) EMBO J., 4065-4072. I. Stansfield et al (1995) EMBO J. 14. 4365-4373). Sup35 (eRF3) ist selbst als Freisetzungsfaktor inaktiv, aber stimuliert die Aktivität von eRF1 stark und einer der Funktionen des Freisetzungsfaktorkomplexes könnte die GTP-Bindung und Hydrolyse sein. Berichte, daß Sup35 ein Prionen-ähnliches Protein ist, das in funktionell unterschiedlichen Konformationen vorkommen kann, legt eine Möglichkeit für die Regulation der Translationstermination bei Eukaryonten nahe.
Es wurde eine Strategie für die gleichzeitige Reinigung von unterschiedlichen PP2A Holoenzymen aus dem Skelettmuskel des Kaninchens entwickelt, um ihre Untereinheitstruktur weiter zu analysieren. Dieser Ansatz führte zur Reinigung von zwei heterotrimeren Formen von PP2A&sub0;. die unterschiedliche Isoformen eines neuen Typs einer variablen Regulationsuntereinheit (PR61 genannt) enthalten, die möglicherweise dazu dient, PP2A zu nuklearen Substraten zu führen. Darüberhinaus wurden zwei neue Proteine mit 54 kDa und 55 kDa zusammen mit dem trimeren PP2A&sub1; Holoenzym nach einer Affinitätsreinigung gereinigt. Das 54 kDa Protein ist eRF1.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung liefen demnach ein Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren der Proteinexpression, das das Screenen auf Mittel umfaßt, die die Wechselwirkung zwischen PP2A und eRF1 beeinflussen. Darüberhinaus liefert die Erfindung Screeningsstemme, die die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen, und Modulatoren der Proteinsynthese, die auf die eRF1-PP2A Wechselwirkung abzielen.

Detallierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis der Wechselwirkung der katalytischen Untereinheit der Proteinphosphatase 2A (PP2Ac) mit dem Protein, das zu einer kürzlich etablierten eRF1 genannten Proteinfamilie gehört, welches bei der Termination der Proteinsynthese als Polypeptidfreisetzungsfaktor fungiert (Frolova et al. 1994). Die Identifizierung dieses Proteins wird durch die Analyse der Untereinheitzusammensetzung von gereinigten PP2a Präparationen und der gemeinsam gereinigten Proteine erleichtert, die in solchen Präparationen typischerweise gefunden werden. Die Neuheit dieses Ergebnisses ist, daß eRF1 das erste zelluläre Protein im Gegensatz zu den etablierten regulatorischen Untereinheiten der PP2A ist, von denen bisher eine Wechselwirkung mit der katalytischen Untereinheit der PP2A festgestellt wurde. Es wird auch der Mechanismus geklärt, durch den die PP2A in der Regulation der Proteinsynthese beteiligt ist. In Anbetracht der Ergebnisse, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, scheint eRF1 eine duale Rolle zu spielen bei (i) der Polypeptidkettentermination und (ii) der Begleitung der PP2A zu den Polysomen und daher liefern sowohl eRF1 als auch PP2A ein brauchbares Mittel zur Identifizierung von Modulatoren der Proteinexpression, die zur Beeinflussung der Wechselwirkung zwischen eRF1 und Pp2A fähig sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren versucht demnach die Wechselwirkung zwischen eRF1 und PP2Ac zu delektieren und diese Wechselwirkung zum Screenen auf Verbindungen zu verwenden, die potentielle Modulatoren der Proteinsynthese sind. Die Wechselwirkung zwischen eRF1 und PP2A kann auf vielen Wegen detektiert werden, wobei die bevorzugten Detektionsverfahren die Aktivierung von Reportergenen in genetischen Tests, die physikalische Detektion der Proteinbindung in Lösung, wie durch spektroskopische Analyse, und Festphasenbindungstests umfassen, worin eRf1 und PP2A als kooperatives Bindungspaar fungieren, wobei die Detektion beispielsweise durch Enzym-Substrat-Reagenzien oder dergleichen ausgeführt wird, wie dies bei Tests, wie ELISAs, Standard ist.
Gemäß der Erfindung umfaßt "eRF1" alle Polypeptide der eRF1 Familie, wie auch Derivate hiervon, die zumindest eine gemeinsame Strukturdeterminante enthalten. "Gemeinsame Strukturdeterminante" meint, daß das in Frage kommende Derivat zumindest ein Strukturmerkmal von eRF1 aufweist, wobei das Merkmal in der Bindung von eRF1 und PP2A beteiligt ist. Strukturmerkmale umfassen die Anwesenheit eines Epitops oder einer antigenen Stelle, die zur Kreuzreaktion mit Antikörpern fähig ist, die gegen natürlich vorkommendes oder denaturiertes eRF1 Polypeptid oder einem Fragment hiervon erzeugt wurden, das Vorkommen einer Aminosäuresequenzidentität mit eRF1 und Merkmale, die eine gemeinsame Struktur-Funktionsbeziehung aufweisen. Daher umfaßt von der vorliegenden Erfindung bereitgestelltes eRF1 Splicevarianten, die durch mRNA kodiert werden, welche durch alternatives Splicen eines Primärtranskripts erzeugt wurden. Aminosäuremutanten, Glycosylierungsvarianten und andere kovalente Derivate von eRF1, die die Eigenschaften von eRF1 behalten, für die Bindung an PP2A verantwortlich zu sein. Beispielhafte Derivate umfassen eRF1 Moleküle, die durch Substitution, chemisch, enzymatisch oder durch andere geeignete Mittel mit einem Rest modifiziert sind, der keine natürlich vorkommende Aminosäure ist. Ein solcher Rest kann ein detektierbarer Rest sein, wie ein Enzym oder radioaktives Isotop. Ferner sind alle natürlich vorkommenden Varianten von eRF1 umfaßt, die in einer bestimmten Spezies gefunden werden, vorzugsweise einem Säuger. Eine solche Variante kann durch ein verwandtes Gen derselben Genfamilie, durch eine allelische Variante eines bestimmten Gens kodiert werden oder eine alternative Splicingvariante des eRF1 Gens darstellen.
Derivate, die die gemeinsamen Strukturmerkmale behalten, können Fragmente von eRf1 sein. Fragmente von eRF1 umfassen einzelne Domänen hiervon, wie auch kleinere Polypeptide, die von den Domänen stammen. Vorzugsweise definieren kleinere Polypeptide, die gemäß der Erfindung von RF1 stammen, ein einzelnes Merkmal, das für eRf1 charakteristisch ist. Die Fragmente können von der Theorie her fast jede Größe haben, solange sie ein Merkmal von eRF1 behalten. Vorzugsweise sind die Fragmente 5 bis 200 Aminosäuren lang. Längere Fragmente werden als Verkürzungen des Vollängen-eRFI betrachtet und im allgemeinen durch den Ausdruck "eRF1" umfaßt.
Derivate von eRf1 umfassen auch Mutanten hiervon, die Deletionen. Additionen oder Substitutionen von Aminosäuren umfassen, mit der Maßgabe, daß sie zumindest ein Merkmal behalten, das für eRF1 charakteristisch ist. Daher können konservative Aminosäuresubstitutionen im wesentlichen ohne der Veränderung der Art von eRF1 ausgeführt werden, wie viele Verkürzungen von den 5'- oder 3'-Enden. Deletionen und Substitutionen können darüberhinaus bei Fragmenten von eRF1 vorgenommen werden, die durch die Erfindung umfaßt werden, eRF1 Mutanten können aus einer DNA hergestellt werden, die für eRF1 kodiert, welche einer in vitro Mutagenese unterzogen wurde, was beispielsweise zu Anfügung. Austausch und/oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren führt. Beispielsweise können Substitutions-, Deletions- oder Insertionsvarianten von eRF1 durch rekombinante Verfahren hergestellt werden und mit den nativen Formen von eRF1 auf Immunkreuzreaktivität gescreent werden.
Die Fragmente. Mutanten und anderen Derivate von eRF1 behalten vorzugsweise eine substanzielle Homologie mit eRF1. Wie hierin verwendet meint "Homologie", daß die zwei Einheiten für den Fachmann ausreichend Charakteristiken teilen, um zu bestimmen, daß sie in Ursprung und Funktion ähnlich sind. Vorzugsweise wird die Homologie verwendet, um sich auf eine Sequenzidentität zu beziehen. Daher behalten die Derivate von eRF1 vorzugsweise eine substanzielle Sequenzidentität mit dem Wildtyp des humanen eRF1 (Frolova et al. 1994).
"Substanzielle Homologie" meint, wenn die Homologie eine Sequenzidentität anzeigt, mehr als 50% Sequenzidentität, vorzugsweise mehr als 75% Sequenzidentität und am bevorzugtesten eine Sequenzidentität von 90 % oder mehr.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Ausdrücke PP2A und PP2Ac auf die Proteinphosphatase 2A und die katalytische Untereinheit hiervon und sollten in Bezug auf eRF1 interpretiert werden, wie dies oben angegeben ist.
Da es durch Deletionsanalyse gefunden wurde, daß die für die Wechselwirkung zwischen PP2Ac und eRF1 verantwortlichen Bindungsdomänen innerhalb der 50 N-terminalen Aminosäuren von PP2Ac und zwischen den Aminosäureresten 338 und 381 im C-terminalen Teil von humanem eRF1 liegen, umfassen bevorzugte Fragmente, Mutanten und andere Derivate von PP2Ac und eRF1 wie sie oben definiert sind zumindest diese Bindedomänen oder funktionell äquivalente Aminosäuresequenzen.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren basiert auf dem Two-Hybrid-System, das von S. Fields und O. Song (1989). Nature. 340. 345-346 entwickelt wurde. Gemäß diesem System sind die DNA Bindungs- und Transkriptionsaktivierungsdomänen eines Transkriptionsfaktors getrennt und mit zwei Polypeptiden komplexiert, deren Kooperation detektien werden soll. Falls die Polypeptide kooperieren, werden die DNA Bindungs- und Transkriptionsaktivierungsdomänen in Assoziation gebracht und der Transkriptionsfaktor wird aktiv, was die Expression eines Reportergens nach oben reguliert. Wenn die Polypeptide andererseits nicht kooperieren, wird kein aktiver Transkriptionsfaktor gebildet, weil die zwei Domänen hiervon nicht assoziieren. In diesem Verfahren hängt die Detektion der Hochregulation des Reportergens von der erfolgreichen Kooperation zwischen eRF1 und PP2Ac ab und so wird letztlich die Detektion der Bindung durch den Test auf die Reportergenexpression ausgeführt. Die Expression von sichtbaren Markern, wie das grün fluoreszierende Protein oder β-Galaktosidase, ist bevorzugt.
Die Interpretation des Verfahrens hängt von der Art der zu screenenden Verbindungen ab. Daher zeigt ein Fehlen einer Reportergenexpression im Vergleich zu einer Kontrolle eine Aktivität einer Verbindung an, wenn auf Inhibitoren gescreent wird. Im Gegensatz dazu zeigt eine Erhöhung der Reportergenexpression im Vergleich zur Kontrolle an, daß eine Verbindung eine Aktivität zur Potentierung der eRF1/PP2Ac Wechselwirkung aufweisen kann. Dieses Muster kann durch die Verwendung von DNA Bindungsdomänen und/oder Transkriptions-beeinflussenden Domänen, die von einem Transkriptions-Silencer statt einem Transkriptionsaktivator stammen, umgekehrt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf den Entwurf von Screeningsystemen angewendet werden, um putative therapeutische Mittel zur Verwendung bei der Behandlung der Proteinsyntheseanomalien zu identifizieren. Daher liefert die Erfindung ein Verfahren zum Screenen von potentiellen Modulatoren der intrazellulären Signalübertragung, das die folgenden Schritte umfaßt:
a) Inkubation von eRF1 und PP2Ac oder Fragmenten hiervon mit der zu screenenden Verbindung, und
b) Detektion jeder Modulation der Wechselwirkung zwischen eRF1 und PP2Ac.
PP2Ac und eRF1 können zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Form von isolierten Polypeptiden oder Fragmenten hiervon vorliegen. Wie oben erwähnt umfassen die bevorzugten Fragmente von PP2Ac und eRF1 zumindest ihre jeweiligen Bindungsdomänen füreinander, das heißt die 50 N-terminalen Aminosäuren von PP2Ac (SEQ ID Nr. 1) und die Aminosäurereste 338 bis 381 des C-terminalen Teils des humanen eRF1 (SEQ ID Nr. 2) oder funktionell äquivalente Fragmente hiervon, die zur gegenseitigen Bindung fähig sind. Darüberhinaus können PP2Ac und eRF1 in Form der Polypeptide oder Fragmente vorliegen, die mit weiteren Polypeptiden komplexiert sind. Beispielsweise ist das Polypeptid oder Fragment im Fall eines auf das Two-Hybrid-System basierenden Screenings an eine DNA Bindungsdomäne oder Transkriptionsaktivierungsdomäne komplexiert, die von einem anderen Protein stammt, wie dem Aktivator GAL4 der Hefe. Das PP2Ac Polypeptid oder ein Fragment hiervon ist entweder an das Transkriptionsaktivator- oder DNA-Bindungselement gebunden, während das eRF1 Polypeptid oder ein Fragment hiervon an die komplementäre Domäne gebunden ist.
Darüberhinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren zur weiteren Aufklärung der Mechanismen verwendet werden, die die Aktivität der PP2A kontrollieren, indem zelluläre Verbindungen delektiert und charakterisiert werden, die die eRF1-PP2Ac Wechselwirkung modulieren.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verbindungen geliefert, die die Wechselwirkung zwischen eRF1 und PP2Ac modulieren. Solche Verbindungen können Potentierer dieser Wechselwirkung sein, wie eRF3, aber vorzugsweise sind sie Inhibitoren hiervon und wirken durch die Störung der Bindung zwischen eRF1 und PP2Ac.
Verbindungskandidaten umfassen Polypeptide, die von eRF1 oder PP2Ac stammen, die das jeweilige Protein in einem solchen Ausmaß nachahmen, daß sie hiermit um die Bindung an die andere Hälfte des Bindungspaars konkurrieren, wie auch anti-eRF1 and anti-PP2Ac Antikörper, die zur Zerstörung der Bindung der zwei Moleküle fähig sind. Bevorzugt sind jedoch niedermolekulare Verbindungen, die spezifisch die Bindung hemmen und zur pharmazeutischen Anwendung geeignet sind. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungskandidaten Polypeptide mit im wesentlichen denselben physiologischen Bindungseigenschaften, wie sie durch die 50 N-terminalen Aminosäuren von PP2Ac (SEQ ID Nr. 1) und die Aminosäurereste 338 bis 381 im C- terminalen Teil des humanen eRF1 (SEQ ID Nr. 2) oder durch monoklonale Antikörper bereitgestellt werden, die gegen diese Polypeptide gerichtet sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind potentielle Modulatoren der gestörten Hochregulation der Proteinsynthese und der assoziierten zellulären Proliferation und können daher zur Behandlung von Erkrankungen brauchbar sein, die mit einer zellulären Proliferation assoziiert sind, insbesondere Krebs.
Die Erfindung wird nur zu Erläuterungszwecken in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.

Experimentalteil

Co-Reinigung des PP2A&sub1; Holoenzyms mit zwei Proteinen mit 54 und 55 kDa

PP2A wird aus dem Skelettmuskel des Kaninchens mittels des Protokolls gereinigt, wie es durch Zolnierowicz et al. (1994) Biochemistry 33, 11858-11867 modifiziert wurde. Beim DEAE Sepharosechromatographieschritt wird die Säule (5 · 40 cm) mit einem 2000 ml Gradienten aus 0,05 bis 0,6 M NaCl eluiert. Die PP2A entsprechenden Fraktionen, die von der DEAE Sepharose bei 0,27-0,32 M. 0,34-0,38 M und 0,39-0,44 M NaCl (jeweils als Pool 1, Pool 2 und Pool 3 bezeichnet) eliminiert werden, werden vereinigt und weiter gereinigt. Die PP2A in den Pools 1 und 3 wird durch sequenzielle Chromatographie auf Poly-L-Lysin-Agarose. ω-Aminohexyl-Sepharose und Thiophosphorylase-a-Sepharosesäulen gereinigt. Für die PP2A in Pool 2 wird das Enzym durch Poly-L-Lysin-Agarose und Thiophosphon 1-a-Sepharose gereinigt. Der schließliche Reinigungsschritt für alle drei PP2A Präparationen umfaßt einen Ionenaustauscher mit Mono-Q-FPLC (0,5 · 5 cm Säule. Pharmacia) mittels eines 40 ml Gradienten von 0,2 bis 0,5 M NaCl. Die PP2A Aktivität wird während der Reinigung durch Testen der durch Protamin stimulierten Phosphorylase-Phosphataseaktivität verfolgt, wie dies von Waelkens et al.. (1987) J. Biol. Chem., 262. 1049- 1059 beschrieben ist. Die gereinigten Proteine, die aus den letzen Schritten erhalten werden, werden durch SDS- PAGE und Immundetektion durch Western-Blot analysiert.
Das aus DEAE-Sepharosepools 1, 2 und 3 erhaltene partiell gereinigte Material wird mittels mehrerer Antiseren analysiert, die gegen die Untereinheitenbestandteile der PP2A entwickelt wurden, die in früheren Publikationen beschrieben wurden (Hendrix et al. (1993a). J. Biol. Chem., 268, 15267-15276. Hendrix et al., (1993b) J. Biol. Chem., 268, 7330-7337. Turowski et al., (1995) J. Cell. Biol., 129. 397-410). Die Mono Q FPLC der dem Pool 1 entsprechenden Fraktionen (von der DEAE Sepharose zwischen 0,27-0,32 M NaCl eluiert) zeigen die Existenz eines trimeren PP2A Holoenzyms an, das 36 kDa große katalytische (PP2Ac) und 65 kDa große regulatorische (PR65) Untereinheiten und einen neuen Typ der variablen regulatorischen Untereinheiten mit einem scheinbaren Molekulargewicht enthält, das von 56 bis 61 kDa reicht. Dieses trimere Holoenzym entspricht der PP2A&sub0; gemäß der Klassifikation, die vorher von Tuns et al. (1985) Eur. J. Biochem., 148. 253-263 etabliert wurde.
Die SDS-PAGE Analyse von Pool 2 (Fraktionen, die von der DEAE-Sepharose zwischen 0,34 und 0,38 M NaCl eluieren) nach dem Reinigungsschritt der Thiophosphorylase-a-Sepharose zeigt, daß diese Präparation die 36 kDa große katalytische und 65 kDa große regulatorische Untereinheit und mehrere Proteine im Bereich von 54-55 kDa enthält. Eine weitere Fraktionierung durch Mono Q FPLC fuhrt zur Abtrennung der PP2A&sub1; (Trimer. das die 55 kDa große regulatorische Untereinheit. PR55) und PP2A&sub2; (die diniere Form des Enzyms) von den zwei Proteinen mit 54 und 55 kDa. Diese zwei Proteine scheinen nicht mit PR55 in Verbindung zu stehen, da sie mit anti-PR55 Antikörpern nicht kreuzreagieren. Freies PR55a wird in dieser Präparation durch SDS-PAGE und Immunoblotanalyse (Fraktionen 37 und 38) identifiziert. Dies legt nahe, daß die identifizierte PP2A&sub2; möglicherweise aus der Dissoziation von PR55 und möglicherweise der 54 und 55 kDa Proteine vom Komplex resultiert.

54 kDa Protein, das zusammen mit PP2A&sub1; gereinigt wird, ist ein Vertreter der eRF1 Proteinfamilie mit einer Freisetzungsfaktoraktivität für Polypeptidketten

Die 54 und 55 kDa Proteine, die durch Mono Q FPLC Chromatographie gereinigt werden, werden verwendet, um die Proteinsequenzdaten gemäß etablierter Verfahren zu erhalten. Man erhält Sequenzen von drei tryptischen Peptiden mit 30 Aminosäuren, die sich vom 54 kDa Protein ableiten: Peptid 3 YFDEISQDTGK. Peptid 9/10 ILYLTPEQEK und Peptid 25/26 S/GFGGIGGIL. Ein Vergleich dieser Sequenzen mittels des FASTA Programms ergibt 76% Homologie zur abgeleiteten Proteinsequenz, die vom SUP45 Gen von Saccharomyces cerevisiae kodiert wird. Es werden cDNAs, die dein Protein entsprechen, das zusammen mit PP2A&sub1; gereinigt wird, folgendermaßen mittels eines reversen Transkriptions/PCR Ansatzes isoliert:
Die einzelsträngige cDNA wird aus der humanen Brustkarzinomzellinie T47D isoliert, wie dies vorher beschrieben wurde (Healy et al.. (1991) Mol. Cell. Biol 11. 5767-5780). Zwei degenerierte Oligonukleotide, die eine HindII Restriktionsschnittstelle (unterstrichen) enthalten, werden synthetisiert: Sinnstrang 5'-ACAAGCTT- TAYTTYGAYGARATIWSC-ARGA-3', der der Aminosäuresequenz YFDEISQD entspricht und Antisinnstrang 5'- ACAAGCTTTTYTCYTGYTCIGGIGTIARRTA-3', die den Aminosäuren YLTPEQEK entspricht. Die PCR wird mittels AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin Eimer) ausgeführt. Die PCR Produkte werden im Gel gereinigt, wie dies in Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. NY. beschrieben ist, in die HindII Schnittstelle von pBlueskript (Stratagene) subkloniert und mittels Sequenase 2,0 (USB) sequenziert. Der PCR Klon 18 enthält ein Insert mit 188 bp, das ein Polypeptid mit 62 Aminosäuren mit einer 57% Identität zum Hefe SUP45 Genprodukt kodiert und wird anschließend zum Screenen der humanen fötalen Gehirn-cDNA Bank (Stratagene) verwendet. Die DNA wird mit [α-³²P]dATP durch das Zufallsprimerverfahren von Feinberg und Vogelstein (1983) Anal. Biochem., 132, 6-13 mit einer spezifischen Aktivität von etwa 10&sup9; cpm/ug markiert. Es wird ein Screening der cDNA Bank ausgeführt, wie dies vorher beschrieben wurde (Hendrix et al. 1993a). Eine cDNA, die für humanes eRF3 kodiert, wird aus einer revers transkribierten T47D Gesamt-cDNA, die wie oben hergestellt wurde, mittels der folgenden PCR Oligonukleotide amplifiziert: Sinn 5'- ATAAGCTTCACCATGGAACTTTCAGAACCT-3' (Hind II Schnittstelle ist unterstrichen) und Antisinn 5'-TAT- GGATCCTTAGTCTTTCTCTGGAACG-3' (BamHI ist unterstrichen). Die PCR Produkte werden in pBlueskript subkloniert und wie oben beschrieben sequenziert.
Unter mehreren Klonen, die aus der humanen fötalen Gehirnbank isoliert und durch Sequenzierung analysiert werden, enthält nur einer, der BBZ.eRF1-4b genannt wird, einen Leserahmen in voller Länge (1311 bp) wie auch 231 bp der 5'-nichtkodierenden Region und etwa 2,22 kb der 3'-nichtkodierenden Region. Diese cDNA ist zur TB3-1 cDNA identisch (Frolova et al. 1994), cDNAs, die für homologe Proteine kodieren, wurden auch bei Arabidopsis thaliana (Quigley et al., The EMBL Data Bank. Ausgabe 37) und Xenopus laevis (Tassan et al. (1993) Mol. Cell. Biol., 13. 2815-2821) identifiziert. Das von dieser cDNA kodierte Protein ist eRF1. Ein Sequenzvergleich zeigt, daß das eRF1 Protein zwischen den Arten hoch konserviert ist, wobei das Protein aus der Hefe und dem Menschen zu 67,5% identisch ist.

mRNA, die für humanes eRF1 kodiert, wird ubiquitär exprimiert

Die Transkriptmengen, die für humanes eRF1 kodieren, werden in Poly(A)&spplus; RNA analysiert, die aus verschiedenen humanen Geweben isoliert wurde. Mit der Sonde, die der vollständigen humanen eRF1 cDNA entspricht (BBZ.eRFMb), die durch Zufallsprimer markiert wurden, werden mehrere Transkripte mit etwa 2, 2,5 und 4 kb durch Northern Blot gemäß etablierter Verfahren delektiert. Die für humanes eRF1 kodierende mRNA scheint ubiquitär exprimiert zu werden, wobei die höchsten Transkriptmengen in der Lunge, dem Skelettmuskel und den Plazentageweben delektiert werden. Von den drei detektierten Transkriptklassen zeigt der 4 kb Typ in allen Geweben die höchste Expressionsmenge. Eine Quantifizierung durch ImageQant Software zeigt, daß 2,5 und 2 kb Transkriptklassen etwa 2 bis 4-fach geringer exprimiert werden, als das Transkript mit dem hohen Molekulargewicht. Diese mRNA Verteilung ist zu der unterschiedlich, die für C11, das eRF1 Homolog aus Xenopus laevis, berichtet wird, bei dem ein viel beschränkteres Expressionsmuster gefunden wird, wobei sowohl die mRNA als auch das Protein in der Leber vollständig fehlen (Tassan et al. 1993).

Humanes eRF1 interagiert spezifisch mit der katalytischen Untereinheit von PP2A im Two-Hybrid-System der Hefe

Um zu untersuchen, welche Untereinheit von PP2A mit humanem eRF1 assoziiert und ob eRF3, von dem gezeigt wurde, daß es an eRF1 bindet und dessen Aktivität bei der Polypeptidkettentermination in S. cerevisiae und X. laevis stimulieren kann, ebenfalls ein Wechselwirkungspartner sein kann, wird das Two-Hybrid-System (Fields und Song, 1989) mittels des Matchmaker® Two-Hybrid-Systems verwendet (Clontech Laboratories Inc.). Die cDNAs, die für humanes Vollängen PP2Acα (Khew-Goodall et al (1991). Biochemistry, 30. 89-97), PR65α (Hemmings et al. (1990) Biochemistry. 29. 3166-3173). PR55α (Mayer et al (1991) Biochemistry, 30. 3589-3597), eRF1 und eRF3 kodieren, werden im Leserahmen mit den GAL4 DNA Bindungs- und/oder Transaktivierungsdomänen jeweils mittels pGBT9 und pGAD424 Expressionsvektoren fusioniert. Es wird eine Reihe an N- und C-terminalen Deletionen sowohl für PP2Ac als auch eRF1 mittels einer auf PCR basierenden Strategie konstruiert. Die PCR Produkte, die die drei N-terminalen (eRF&sup5;¹&supmin;&sup4;³&supmin;, eRF1&sup9;³&supmin;&sup4;³&sup7; und eRF1¹&sup5;&sup0;&supmin;&sup4;³&sup7;) und drei C-terminale Verkürzungen (eRF1¹&supmin; &sup4;¹¹, eRF1¹&supmin;³&sup8;¹ und eRF¹&supmin;³³&sup8;) von humanem eRF1 kodieren, werden in pGAD424 im Leserahmen mit der GAL4 Transaktivierungsdomäne subkloniert. Die PCR Produkte, die drei N-terminale (PP2Ac&sup5;&sup0;&supmin;³&sup0;&sup9;, PP2Ac¹&sup0;&sup0;&supmin;³&sup0;&sup9; und PP2Ac¹&sup5;&sup0;&supmin;³&sup0;&sup9;) und drei C-terminale (PP2Ac¹&supmin;²&sup5;&sup9;, PP2Ac¹&supmin;²&sup0;&sup9; und PP2Ac¹&supmin;¹&sup5;&sup9;) Verkürzungen von PP2Acα kodieren, werden in pGBT9 im Leserahmen mit der GAL4 DNA Bindedomäne subkloniert. Kontrollplasmide, die für Wildtyp-GAL4 Protein (pCh1), großes T-Antigen von SV40 (pTD1), p53 (pVA3) und Lamin C (pLAM5') kodieren, wobei die letzteren drei an die geeigneten Domänen von GAL4 fusioniert sind, werden vom Hersteller bereitgestellt und für Kontrollwechselwirkungen verwendet. Die Expressionskonstrukte werden in S. cerevisiae Wirtsstämme SFY526 (lacZ Reportergen) und HF7c (lacZ und HIS3 Reportergene) transformiert. Die Expression der Fusionsproteine wird in Doppeltransformanden überprüft, die auf Wachstum auf selektivem SD Medium, dem Leucin und Tryptophan fehlt, ausgewählt werden, und die Wechselwirkung von PP2A Untereinheiten mit humanem eRF1 und eRF3 wird durch Verfolgen der Expression von zwei verschiedenen Reportergenen, nämlich lacZ und HIS3, evaluiert. Die Expression des lacZ Reportergens wird durch Messen der β-Galaktosidaseaktivität mittels 5-Brom-4-chlor- 3-indolyl-β-D-Galaktosid [X-Gal] und O-Nitrophenyl-β-D-Galaktosid [ONPG] als Substrate bestimmt während die Expression des HIS3 Reportergens durch Verfolgen des Wachstums auf dreifach selektivem SD Medium verfolgt wird, dem Leucin, Tryptophan und Histidin fehlt. Alle Medien und Reagenzien werden gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt. Eine Transkriptionsaktivierung der Reportergene, die durch das Wildtyp GAL4 Protein gesteuert wird oder durch die Wechselwirkung zwischen groß T von SV40 und p53 herbeigeführt wird, wird als Positivkontrolle verwendet. Um eine intrinsische Transkriptionsaktivierungsmöglichkeit oder eine unspezifische Bindung eines der Moleküle an nicht hiermit in Zusammenhang stehende Proteine auszuschließen, werden Cotransformationen mit dem leeren Vektor oder dem Vektor, der für humanes Lamin C kodiert, das mit der entgegengesetzten Domäne von GAL4 fusioniert ist, als Negativkontrollen verwendet.
Diese Experimente zeigen, daß humanes eRF1 an eRF3 bindet und daß es direkt und spezifisch mit PP2Ac in beiden Reportersystemen wechselwirkt, aber nicht mit PR65 oder PR55, da nur PP2Ac/eRF1 Doppeltransformanden β-Galaktosidase-positiv sind, wie dies durch β-Galaktosidasetests (Tabelle I) bestätigt wird, und kein Histidin für das Wachstum brauchen. Aus dieser Analyse folgt, daß die PP2A Untereinheit, die eRF1 bindet, selbst die katalytische Untereinheit ist. Andererseits kann eRF3 interessanterweise nicht an eine der 3 in diesem System getesteten PP2A Untereinheiten binden.

Identifizierung von Domänen, die für die Wechselwirkung von PP2Ac und eRF1 erforderlich sind

Zusätzlich zur Analyse der Wechselwirkungen von Vollängenproteinen im Two-Hybrid-System werden die Regionen sowohl von eRF1 als auch von PP2Ac, die für diese Assoziation erforderlich sind, kartiert. Zu diesem Zweck wird eine Reihe an N- und C-terminal verkürzten Versionen beider Proteine konstruiert und im selben experimentellen Ansatz getestet, wie er oben beschrieben ist. Alle drei C-terminalen Deletionsmutanten von PP2Ac (PP2Ac¹&supmin;²&sup5;&sup9;, PP2Ac¹&supmin;²&sup0;&sup9; und PP2Ac¹&supmin;¹&sup5;&sup9;) aber keine der N-terminalen Deletionsmutanten (PP2Ac&sup5;&sup0;&supmin;³&sup0;&sup9;, PP2Ac¹&sup0;&sup0;&supmin;³&sup0;&sup9; und PP2Ac¹&sup5;&sup0;&supmin;³&sup0;&sup9;) sind zur Wechselwirkung mit eRF1 fähig. Demnach ist die Region von PP2Ac, die zur Bindung an eRF1 erforderlich ist, innerhalb der N-terminalen 50 Aminosäuren des Proteins lokalisiert. Die Unterschiede bei der Bindung der C-terminalen Verkürzungen von PP2Ac an das Vollängen-eRF1 legen nahe, daß der C-terminale Teil des Proteins auch Sequenzen enthält, die diese Wechselwirkung beeinflussen. Die N-terminalen Deletionsmutanten von eRF1 (eRF1&sup5;¹&supmin;&sup4;³&sup7;, eRF1&sup9;³&supmin;&sup4;³&sup7; und eRF1¹&sup5;&sup0;&supmin;&sup4;³&sup7;) weisen immer noch die Wechselwirkung auf und von den drei C-terminalen Deletionen von eRF1 (eRF1¹&supmin;&sup4;¹¹, eRF1¹&supmin;³&sup8;¹ und eRF1¹&supmin;³³&sup8;) bindet nur die größte, die das Protein bei Thr³³&sup8; verkürzt, nicht mehr an PP2Ac. Dies zeigt, daß die putative Bindungsdomäne auf eRF1 zwischen Thr³³&sup8; und Asn³&sup8;¹ liegt. Jedoch sind sogar die minimal ausreichenden Polypeptide, die durch diese Experimente definiert werden (PP2Ac¹&supmin;¹&sup5;&sup9; und eRF1¹&supmin;³&sup8;¹), immer noch zur Wechselwirkung miteinander fähig, wenn auch in einer vergleichbar schwachen Weise. Eine Zusammenfassung aller Wechselwirkungen, die im Two-Hybrid-System getestet werden, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle I: Zusammenfassung aller Wechselwirkungen, die in der Two-Hybrid-Analyse der PP2A/eRF1 Assoziation getestet wurden

Immunpräzipitate von eRF1 enthalten PP2A Aktivität

Um zu testen, ob eine Komplexbildung zwischen PP2A und eRF1 bei Säugerzellen auftritt, wird bestimmt, ob diese zwei Proteine zusammen immunpräzipitieren. Eine Assoziation zwischen PP2Ac und PR65 unter denselben experimentellen Bedingungen wird als Positivkontrolle verwendet. Für eine transiente Expression in COS-1 Zellen werden humanes eRF1, eRF3 und PR65α mit dein Hämagglutinin (HA)-Epitop am jeweiligen N-Terminus versehen. Es wird PCR verwendet, um eine EcoRI Schnittstelle am 5'-Ende und eine XbaI Schnittstelle am 3'-Ende der kodierenden Region der humanen eRF1 cDNA mittels der folgenden Oligonukleotide einzuführen: Sinn 5'- ACGAATTCATGGCGGACGACCCCAGT-3' und Antisinn 5'-ACTCTAGACTAGTAGTCATCAAGG-3'. Das EcoRI-XbaI Fragment wird in den Säugerexpressionsvektor pEV3S kloniert (M. Strubin et al (1995) Cell, 80, 497- 506), um den HA-Anhang am N-Terminus des Proteins anzubringen. Ein HindII-BamHI Fragment, das für humanes eRF3 kodiert wird durch den pMV Vektor geschleust, um den HA-Anhang an den N-Terminus des Proteins anzufügen und anschließend als KpnI-SacI Fragment in den eukaryontischen Expressionsvektor pECE subkloniert. Ein pRC/CMV Expressionskonstrukt, das ein mit HA-Anhang versehenes humanes PR6Sα kodiert wird ähnlich konstruiert.
Die Zellen werden durch das DEAE-Dextranverfahren transfiziert und 48-60 Stunden nach der Transfektion in 1 · TBS (150 mM NaCl. 50 mM Tris-HCl pH 7,4) gesammelt. Die ganzen Zellen werden durch 20 Impulse in einem Dounce Homogenisator in 1 · TBS lysiert, worin 0,1% 2-Mercaptoethanol. 0,5 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Benzamidin-HCl, 0,1 mM Nα-Tosyl-L-Lysinchlormethylketon-HCl, 0,1 mM Tosyl-L- Phenylalaninchlormethylketon, 2 ug/ml Leupeptin, 2 ug/ml Aprotinin und 2 ug/ml Pepstatin A enthalten sind. Die Homogenate werden bei 4ºC für 15 Minuten bei 10000 · g zentrifugiert. Die Proteinbestimmungen werden mittels des Bio-Rad Bradford Reagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Rinderserumalbumin als Proteinstandard ausgeführt.
Frisch präparierte COS-1 Zellextrakte werden zweimal mit 1/20 Volumen Pansorbin (Calbiochem) vorgeklärt. Die Protein A Sepharose (Pharmacia Biotech Inc.) wird dreimal mit Lysepuffer gewaschen, mit monoklonalem 12CA5 Antikörper, der für den HA-Anhang spezifisch ist, bei 4ºC über Nacht inkubiert und dann ausgiebig mit Lysepuffer gewaschen, um überschüssigen Antikörper zu entfernen. Die vorgeklärten Extrakte werden zu einer konstanten Menge an mit Antikörper gesättigter Protein-A-Sepharose gegeben und für 4 Stunden bei 4ºC unter Mischen inkubiert. Die pelletierten Kügelchen werden dreimal in Lysepuffer gewaschen und in 1 · SDS Probenpuffer für die SDS-PAGE Analyse oder in Testpuffer für die Phosphataseaktivitätsmessungen resuspendiert (E. Shacter (1984) Anal. Biochem. 138. 416-420).

Präparation der Peptid-spezifischen Antiseren und Western Blot Analyse

Es werden Antiseren gegenüber humanem eRF1 durch die Immunisierung mit dem Peptid YQGGD- DEFFDLDDY (Aminosäuren 424-437) hergestellt, die dem C-Terminus des Proteins entsprechen. Die Peptidsynthese und die Kupplung an das Hämocyanin des Pfeilschwanzkrebses mit Glutaraldehyd und eine anschließende Immunisierung von Kaninchen wie auch der Proteintransfer und die Western Blot Analyse werden ausgeführt, wie dies von Hendrix et al (1993b) beschrieben wurde. Die Antikörper, die zur Detektion der PP2A Untereinheiten in gereinigten Holoenzymen verwendet werden, sind Peptid-spezifische polyklonale Antiseren aus dem Kaninchen: Ab C¹&supmin;²&sup0; (gegen das N-terminale Peptid von PP2Ac). Ab 65 ¹&sup7;&sup7;&supmin;¹&sup9;&sup6; (gegen das interne Peptid von PR65, Turowski et al. 1995). Ab 55α¹&supmin;¹&sup8; (gegen das N-terminale peptid von PR55α. Hendrix et al.. 1993b) und Ab 72/130COOH (gegen das C-terminale Peptid von PR72/130. Hendrix et al. 1993a). Die Antikörper, die zur Detektion von spezifischen Proteinen in Immunpräzipitaten verwendet werden, sind: Ab eRF1&sup4;²&sup4;&supmin;&sup4;³&sup7; (gegen das C-terminale Peptid von humanem eRF1), Ab C¹&supmin;²&sup0; und Ab 65¹&sup7;&sup7;&supmin;¹&sup9;&sup6;, wie auch der monoklonale 12CA5 Antikörper, der für den HA-Anhang spezifisch ist. Für Ab eRF1&sup4;²&sup4;&supmin;&sup4;³&sup7; und 12CA5 werden die IgG Fraktionen auf Protein A/Sepharosekügelchen (Pharmacia) gereinigt, wie dies von Harlow und Lane (1988) Antibodies: A labaratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, NY beschrieben ist und die anderen Antikörper werden als rohe Antiseren verwendet. Die Immundetektion wird mittels ¹²&sup5;I-konjugierten Esel-anti-Kaninchen IgGs (Amersham Corp.) für die Autoradiographie ausgeführt. Die primären Antikörper werden in Blockierungspuffer 1 : 100 und die sekundären Antikörper 1 : 1000 verdünnt. Die Blots werden für 12-24 Stunden im PhosphorImager exponiert und mittels ImageQuant Software (Molecular Dynamics) quantifiziert.
Die Extrakte aus COS-1 Zellen, die transient mit humanem eRF1, eRF3 oder PR65 transformiert wurden, welche an den N-Tennini mit dem Hämagglutininepitop (HA) versehen wurden, wie auch von scheintransformierten Zellen werden der Immunfällung mit dem monoklonalen anti-HA-Anhang Antikörper 12CA5 unterzogen. Die PP2A Aktivität wird in transfizierten -COS-1 Zellextrakten und den Immunpräzipitaten mittels einem ³²P- markierten Peptid (LRRASVA Val&sup6;. Ala&supmin;) als Substrat gemessen. Die Tests werden in Gegenwart und Abwesenheit von 10 nM Okadainsäure ausgeführt, die typischerweise zur Unterscheidung zwischen PP1 und PP2A Aktivitäten verwendet wird. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß die spezifische Aktivität von PP2A in den Extrakten für alle transfizierten Zellen im selben Bereich liegt und daß 12CA5 Immunpräzipitate der Zellen, die mit eRF1 oder PR65 mit HA-Anhang transfiziert wurden, eine signifikante Okadainsäure-sensitive PP2A-ähnliche Phosphataseaktivität im Vergleich zu Immunpräzipitaten von scheintransformierten Zellen aufweisen (Tabelle II). Die Menge an gesamter cytoplasmatischer PP2A. Aktivität, die mit eRF1 assoziiert ist, wird ebenfalls quantifiziert. Eine Immunfällung von eRF1 verringert die gesamte cytoplasmatische PP2A Aktivität um etwa 1% (Bereich von 0,4-1,6%), während die Aktivität bei den PR65-Immunfällungen etwa 10-fach höher liegt (Tabelle II). Eine Immunfällung von eRF3 verringert die PP2A Aktivität nicht signifikant stärker als den Hintergrund. Dieses Ergebnis legt nahe, daß die Wechselwirkung von PP2A und cRF3 mit eRF1 jeweils exklusiv ist. Tabelle II: Immunfällung von eRF1 verringert die PP2A Aktivität
Die PP2A Aktivität wird in Extrakten und 12CA5 Immunpräzipitaten aus COS-1 Zellen gemessen, die transient mit humanem eRF1, eRF3 oder PR65a transfiziert sind, welche mit HA-Anhang versehen sind. Die PP2A Aktivität wird mittels ³²P-markiertem synthetischem Peptid (LRRASVA) als Substrat in Gegenwart und Abwesenheit von 10 nM Okadainsäure in zweifachen Tests gemessen. Die Werte stellen die Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten ± SEM dar. Die spezifische Aktivität der Extrakte (E/mg Protein) ist dieselbe für scheintransfizierte und mit HA-PR65/HA-eRF1/HA-eRF3 transfizierte Zellen (etwa 2,4 E/mg). In den Immunpräzipitaten aus scheintransfizierten Zellen beträgt der durch unspezifische Bindung an Protein-A-Sepharose verringerte Wert der Phosphataseaktivität weniger als 0,1 mE.

PP2Ac und eRF1 sind in vivo in Säugerzellen assoziiert

Um zu bestimmen, welche PP2A Untereinheiten im Komplex mit eRF1 vorkommen werden die HA-eRF1 Immunpräzipitate einem Western Blot mit polyklonalen Anti-Peptid-Antikörpern aus dem Kaninchen unterzogen, die für die folgenden unterschiedlichen Untereinheiten von PP2A spezifisch sind: (Ab C¹&supmin;²&sup0;, Ab 65 ¹&sup7;&sup7;&supmin;¹&sup9;&sup6;, Ab 55α¹&supmin;¹&sup9; und Ab 72/130COOH). Diese Experimente zeigen, daß PP2Ac in Immunpräzipitaten aus HA-eRF1- oder HA- PR65-transfizierten aber nicht scheintransfizierten Zellen delektiert werden kann. Wenn man das Vorkommen von anderen etablierten Regulationsuntereinheiten von PP2A in eRF1 Immunpräzipitaten untersucht, wird PR65 aber nicht PR55 oder PR72 detektiert. Es wird daher geschlossen, daß eRF1 Komplexe mit dem Kerndimer von PP2A aus PP2Ac und PR65 unter Bildung eines neuen trimeren Komplexes bestehen, der viel seltener vorkommt, als andere PP2A Komplexe. Diese Ergebnisse liefern die erste Evidenz für eine in vivo Assoziation zwischen der katalytischen PP2A Untereinheit und dem eRF1 Protein in Säugerzellen.

Expression von eRF1 mit HA-Anhang in COS-1 Zellen erhöht die Menge an PP2A, die mit dem Polysomen assoziiert ist

Die Verteilung von PP2A in fraktionierten exponentiell wachsenden COS-1 Zellen wie auch in COS-1 Zellen, die transient mit eRF1 mit HA-Anhang transfiziert sind, wird untersucht. Ribosomen (80 S) aus diesen Zellen erhält man durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation von zellfreien Extrakten durch ein 38% Saccharosekissen. Es werden Kontrollen mittels Antikörper ausgeführt, die für ribosomale (56) und cytosolische (regulatorische RII Untereinheit der Proteinkinase A) Proteine spezifisch sind, um eine erfolgreiche Trennung zu evaluieren. Die PP2A Verteilung wird in zellfreien Extrakten und in den Saccharosefraktionen und ribosomalen Fraktionen analysiert. Die Analyse wird durch Western Blot und Aktivitätsmessungen mittels ³²P-markiertem Peptid (Kemptid Val&sup6;. Ala&sup7;) als Substrat ausgeführt. Diese Experimente zeigen, daß in nicht-transfizierten COS-1 Zellen in den Polysomen vorkommende PP2A ein sehr kleiner Teil der gesamten cytoplasmatischen PP2A Aktivität (1-2%) ist, was mit den Abschätzungen aus früheren Untersuchungen übereinstimmt, die mit Kaninchenretikulocytenlysaten ausgeführt wurden. Jedoch erhöht die Überexpression von eRF1 signifikant die Menge an PP2A, die in den Polysomen vorhanden ist, was nahelegt, daß die PP2A durch die Erhöhung der Menge an freiem eRF1, die zur Bindung an PP2Ac verfügbar ist, zu den Polysomen geführt werden kann. Die Daten aus den Aktivitätsmessungen werden anschließend durch Western Blot Analyse von PP2A und eRF1 bestätigt, die eine signifikante Erhöhung von PP2Ac und PR65 in COS-1 Zellen nach einer Überexpression von eRF1 zeigt. Die langsamer laufende Bande, die mit eRF1 Antikörpern über Kreuz reagiert, stellt die Form mit HA-Anhang dar. Im Gegensatz zu früheren Berichten über das S. cerevisiae Homologe Sup45 (Stansfield et. al. 1992) wird von eRf1 des Säugers gezeigt, daß es nicht ausschließlich in der polysomalen Fraktion, sondern ziemlich gleichverteilt zwischen den cytoplasmatischen und polysomalen Fraktionen vorkommt, was auf die relativ lose Bindung an die 40S Untereinheit in Säugerzellen hindeutet.
Anschließende Immunfällungsexperimente aus wie oben beschriebenen fraktionierten COS-1 Zellen, gefolgt von Aktivitätsmessungen und Immunblots zeigen, daß das PP2A Dimer und eine assoziierte. Okadainsäure sensitive Phosphataseaktivität in den immungefällten Fraktionen von eRF1 vorkommt, was bestätigt, daß die in der Polysomfraktion delektierte tatsächlich erhöhte PP2A mit eRF1 assoziiert ist.

Effekte von verschiedenen Formen der PP2A auf die Polypeptidkettenfreisetzungsfaktoraktivität von eRF1

Da anfänglich kein Effekt von eRF1 auf die basale oder durch Protamin stimulierte Aktivität von PP2A beobachtet wurde, werden mögliche Effekte der PP2A auf die Polypeptidkettenfreisetzungsfaktoraktivität von eRF1 untersucht. Demnach wird die Stopcodon-abhängige Freisetzung von f[³&sup5;S]-Methionin aus dem f[³&sup5;S]-MethionyltRNAfMet-AUG-80S Substratkomplex, die durch eRF1 vermittelt wird, in einem in vitro Terminationstest gemessen (W. P. Täte und C. T. Caskey (1990) in G. Spedding (Herausgeber), Ribosomes and Protein Synthesis. A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press. 88-100). Diese Experimente werden mittels eines rekominanten humanen mit Histidin-Anhang versehenen eRF1 (His-eRF1) und einem mit GST-Anhang versehenen eRF3 (GST- eRF3), die zur scheinbaren Homogenität gereinigt sind, wie auch gereinigten Präparationen von PP2Ac. PP2A&sub2; und PP2A&sub1; ausgeführt. His-eRF1 ist selbst als Freisetzungsfaktor aktiv, aber die Behandlung mit äquimolaren Konzentrationen der verschiedenen Formen von PP2A hat keine dramatischen Effekte auf die Aktivität des rekombinanten Proteins. Wie vorher für die Homologe aus S. cerevisiae und X. laevis berichtet, ist GST-eRF3 zur Stimulierung der eRF1 Freisetzungsfaktoraktivität fähig. Es bestellt kein signifikanter Effekt von verschiedenen PP2A Präparationen auf die durch eRF3 stimulierte Aktivität von His-eRF1. Ferner wird die Freisetzungsaktivität einer mit Mono Q gereinigten Präparation von PP2A getestet, die eRF1 (MQ I) enthält, wie dies durch Western Blot Analyse mit Ab eRF1&sup4;²&sup4;&supmin;&sup4;³&sup7; bestätigt wird. Das eRF1, das in dieser Präparation vorkommt, ist auch in Terminationstests aktiv, obwohl in einem etwas geringeren Ausmaß, als das rekombinante Protein, aber die Aktivität in Gegenwart von 10 nM Okadainsäure (Sigma) ist nicht signifikant unterschiedlich zu der in den unbehandelten Proben.
Um die Wechselwirkung von PP2A mit eRF1 weiter zu verstehen, wird die Freisetzungsaktivität in Immunpräzipitaten von HA-eRF1 aus transfizierten COS-1 Zellen bestimmt. Die Daten zeigen, daß die Aktivität von eRF1 im Vergleich zur ähnlichen Menge des rekombinanten Proteins extrem gering ist (> 5%). Diese Immunpräzipitate enthalten PP2Ac und PR65. Die Ergebnisse legen zumindest zwei Möglichkeiten nahe: (a) Die eRF1- Immunpräzipitate enthalten zusätzliche Proteine, die die Aktivität hemmen (in diesem Fall würde dem teilweise gereinigten eRF1 dieses putative hemmende Protein fehlen und so dessen Aktivität erklären) oder (b) das auf Protein-A-Sepharose-Kügelchen über den monoklonalen 12CA5 Antikörper immobilisierte eRF1 ist aufgrund von Größenbeschränkungen unfähig, zum Substrat auf dem Ribosom zu kommen.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse eine komplexe Beziehung zwischen eRF1 Aktivität und Assoziation mit PP2A und/oder eRF3.

Sequenzliste

(1) Allgemeine Information:

(i) Anmelder:
(A) Name: Novartis AG
(B) Straße: Schwarzwaldallee
(C) Stadt: Basel
(E) Land: Schweiz
(F) Postleitzahl (ZIP): 4002
(G) Telefon: +41 61 696 11 11
(H) Telefax: +41 61 696 79 76
(I) Telex: 962 991
(ii) Titel der Erfindung: Phosphatasemodulator
(iii) Anzahl an Sequenzen: 2
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Diskette
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release Nr. 1.0. Version Nr. 1.30 (EPO)
(2) Information für SEQ ID Nr: 1
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangart:
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(iii) Hypothetisch: Nein
(v) Fragmenttyp: N-terminal
(ix) Merkmal:
(A) Name Schlüssel. Bindungsstelle
(B) Lage: 1.....50
(D) Andere Information: Anmerkung = "Bindungsstelle von PP2Ac für eRF1" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 1
(2) Information für SEQ ID Nr. 2
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 44 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangart:
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(iii) Hypothetisch: Nein
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Bindungsstelle
(B) Lage: 1.....44
(D) Andere Information: Anmerkung = "Bindungsstelle von eRF1 für PP2Ac" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 2

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren der Proteinexpression, das das Screening auf Mittel umfaßt, die die Wechselwirkung zwischen PP2A und eRF1 beeinflussen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das folgende Schritte umfaßt

a) Inkubation von eRF1 und PP2Ac oder Fragmenten hiervon mit der zu screenenden Verbindung, und

b) Detektion jeder Modulation der Wechselwirkung zwischen eRF1 und PP2Ac.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Fragment von eRF1 zumindest die terminalen Aminosäurereste 338 bis 381 umfaßt, wie dies in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist oder funktionell äquivalente Fragmente hiervon und worin das Fragment von PP2Ac zumindest die 50 N-terminalen Aminosäuren umfaßt, wie dies in SEQ ED Nr. 2 gezeigt ist, oder funktionell äquivalente Fragmente hiervon.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin eRF1 und PP2Ac durch Derivate hiervon substituiert sind, die eine gemeinsame Strukturdeterminante teilen, wobei die gemeinsame Strukturdeterminante mehr als 50% Sequenzidentität aufweist oder ein Epitop oder eine antigene Stelle besitzt, die zur Kreuzreaktion mit Antikörpern fähig ist, die gegen natürlich vorkommendes oder denaturiertes eRF1 oder PP2Ac erzeugt wurden.

5. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, worin die Wechselwirkung zwischen eRF1 und PP2Ac mittels eines genetischen Tests delektiert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Wechselwirkung zwischen eRF1 und PP2Ac mittels eines Festphasenbindungstests delektiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Detektion durch die Untersuchung der Reportergenexpression ausgeführt wird.

8. Polypeptid oder Antikörper, welche die Wechselwirkung zwischen eRF1 und PP2Ac modulieren.

9. Polypeptid oder Antikörper nach Anspruch 8 zur Verwendung als Arzneimittel.

10. Verwendung eines Polypeptids oder Antikörpers nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, die mit der Proteinsynthese und Zellproliferation assoziiert sind.