DE69435020T2

DE69435020T2 - Protein-tyrosin-phosphatase ptp-s31

Info

Publication number: DE69435020T2
Application number: DE69435020T
Authority: DE
Inventors: Niels P. Moller; Karin B. Moller; Axel Ullrich
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1993-03-23
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2014-03-24
Also published as: US5585233A; US5952212A; WO1994021800A3; ATE372384T1; EP0690918A1; CA2158939A1; IL109090A0; US6492495B1; EP0690918B1; DE69435020D1; WO1994021800A2; US20030138932A1; JPH08508877A; AU6429394A

Description

1. EINFÜHRUNG
Die Erfindung betrifft, auf den Gebieten der Biochemie und der Zell- und Molekularbiologie, ein neuartiges Proteintyrosinphosphatase-Protein (PTPase- oder PTP-Protein) oder -Glykoprotein, genannt PTP-S31, die Verwendung eines solchen Moleküls in pharmazeutischen Präparaten und pharmazeutische Zusammensetzungen, die PTP-S31 oder funktionale Derivate davon umfassen. Diese Erfindung richtet sich auch auf Nukleinsäuremoleküle, welche das PTP-S31-Protein oder funktionale Derivate codieren, rekombinante Expressionsvektoren, die die Nukleinsäuremoleküle tragen, Zellen, die die rekombinanten Expressionsvektoren enthalten, Verfahren zur Herstellung und Identifizierung von PTP-S31 oder der dafür codierenden DNA, Antikörper spezifisch für PTP-S31, und Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die in der Lage sind, an die enzymatische Proteintyrosinphosphataseaktivität von PTP-S31 zu binden und sie zu hemmen oder zu stimulieren.
2. ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Phosphorylierung von Proteinen ist ein grundlegender Mechanismus zur Regulation verschiedener zellulärer Prozesse. Während der Großteil der Proteinphosphorylierung an Serin- und Threoninresten stattfindet, zieht die Phosphorylierung an Tyrosinresten seit der Entdeckung, dass viele onkogene Produkte und Wachstumsfaktorrezeptoren intrinsische Proteintyrosinkinaseaktivität besitzen, großes Interesse auf sich. Die Bedeutung der Proteintyrosinphosphorylierung bei der Wachstumsfaktorsignaltransduktion, der Zellzyklusprogression und der neoplastischen Transformation ist nun gut belegt (Hunter et al., Ann. Rev. Biochem. 54: 987-930 (1985), Ullrich et al., Cell 61: 203-212 (1990), Nurse, Nature 344: 503-508 (1990), Cantley et al., Cell 64: 281-302 (1991)).
Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Phosphorylierung an Tyrosinresten einer Vielzahl zellulärer Proteine ein dynamischer Prozess ist, der konkurrierende Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen einschließt. Die Regulation von Proteintyrosinphosphorylierung wird durch die reziproken Wirkungen von Proteintyrosinkinasen (PTKasen oder PTKs) und Proteintyrosinphosphatasen (PTPs) vermittelt. Die Tyrosinphosphorylierungsreaktionen werden durch PTKs katalysiert. Tyrosin-phosphorylierte Proteine können durch die Wirkung von PTPs spezifisch dephosphoryliert sein. Das Niveau der Proteintyrosinphosphorylierung intrazellulärer Substanzen wird durch das Gleichgewicht von PTK- und PTP-Aktivitäten bestimmt. (Hunter, T., Cell 58: 1013-1016 (1989)).
2.1. PTKs
Die Proteintyrosinkinasen (PTKs; ATP: Protein-Tyrosin-O-Phosphotransferase, EC 2.7.1.112) sind eine große Proteinfamilie, die viele Wachstumsfaktorrezeptoren und potentielle Onkogene enthält. (Hanks et al., Science 241:42-52 (1988)). Viele PTKs wurden mit initialen Signalen in Verbindung gebracht, die zur Induktion des Zellzyklus erforderlich sind (Weaver et al., Mol. and Cell. Biol. 11(9): 4415-4422 (1991)). PTKs umfassen eine diskrete Familie von Enzymen, die gleicher Herkunft sind wie Serin-/Threonin-spezifische Proteinkinasen, aber große Unterschiede zu diesen aufweisen (Hanks et al., supra). Die Mechanismen, die zu Veränderungen in der Aktivität von PTKs führen, sind im Fall von rezeptorartigen PTKs, die eine Transmembrantopologie aufweisen, am besten verstanden (Ullrich et al. (1990) supra). Von dem Binden spezifischer Liganden an die extrazelluläre Domäne von Mitgliedern der rezeptorartigen PTKs wird gedacht, dass es ihre Oligomerisation induziert, was zu einem Anstieg der Tyrosinkinaseaktivität und der Aktivierung der Signaltransduktionswege führt (Ullrich et al., (1990) supra). Die Deregulation der Kinaseaktivität durch Mutation oder Überexpression ist ein gut belegter Mechanismus zur Zelltransformation (Hunter et al., (1985) supra; Ullrich et al., (1990) supra).
2.2. PTPs
Die Proteinphosphatasen bestehen aus mindestens zwei separaten und verschiedenen Familien (Hunter, T.(1989) supra), den Proteinserin-/threoninphosphatasen und den Proteintyrosinphosphatasen (PTPs; Proteintyrosinphosphatphosphohydrolase, EC 3.13.48)). Die PTPs sind eine Proteinfamilie, die in zwei Untergruppen eingeteilt wurde. Die erste Untergruppe setzt sich aus intrazellulären Enzymen mit geringem Molekulargewicht zusammen, die eine einzige konservierte katalytische Phosphatasedomäne enthalten. Alle bekannten PTPs intrazellulären Typs enthalten eine einzige konservierte katalytische Phosphatasedomäne. Beispiele für die erste Gruppe von PTPs beinhalten (1) plazentale PTP 1B (Charbonneau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5252-5256 (1989); Chernoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2735-2789 (1990)), (2) T-Zellen-PTP (Cool et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5257-5261 (1989)), (3) Rattenhirn-PTP (Guan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1501-1502 (1990)), (4) neuronale Phosphatase (STEP) (Lombroso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7242-7246 (1991)), und (5) zytoplasmatische Phosphatasen, die eine Homologieregion zu zytoskeletalen Proteinen enthalten (Guet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5867-57871 (1991); Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5949-5953 (1991)).
Die zweite Untergruppe ist aus den rezeptorgebundenen PTPs mit hohem Molekulargewicht, genannt RPTPs, zusammengesetzt. RPTPs bestehen aus (a) einer intrazellulären katalytischen Region, (b) einem einzigen transmembranen Segment, und (c) einer putativen ligandenbindenden extrazellulären Domäne. Die Strukturen und Größen der putativen ligandenbindenden extrazellulären „Rezeptor"-Domänen von RPTPs sind ziemlich divergent. Dagegen sind die intrazellulären katalytischen Regionen von RPTPs stark homolog. Alle RPTPs haben zwei tandemartig duplizierte katalytische Phosphatasehomologiedomänen, mit der prominenten Ausnahme einer RPTP, genannt HPTPβ, die nur eine einzige katalytische Phosphatasedomäne hat. (Tsai et al., J. Biol. Chem. 266: 10534-10543 (1991)).
Ein Beispiel für RPTPs ist eine Proteinfamilie, genannt LCA-Leukozyten (Leucocyte Common Antigens, LCA) (Ralph, S. J., EMBO J. 6: 1251-1257 (1987)), die Glykoproteine mit hohem Molekulargewicht sind, die auf der Oberfläche aller Leukozyten und deren hemopoietischen Vorläuferzellen exprimiert werden (Thomas, Ann. Rev. Immunol. 7: 339-369 (1989)). Es ist ein bemerkenswerter Grad an Ähnlichkeit in den Sequenzen von LCA mehrerer Spezies vorhanden (Charbonneau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7182-7186 (1988)). Die LCAs wurden in der Literatur mit verschiedenen Namen bezeichnet, einschließlich T200 (Trowbridge et al., Eur. J. Immunol. 6: 557-562 (1962)), B220 für die B-Lymphozytenform (Coffman et al., Nature 289: 681-683 (1981)), des allotypischen Mausmarkers Ly-5 (Komuro et al., Immunogenetics 1: 452-456 (1975)), und in jüngster Zeit CD45 (Cobbold et al., Leucocyte Typing III, A. J. McMichael et al., Hrsg., S. 788-803 (1987)).
CD45 scheint eine entscheidende Rolle in der Aktivierung der T-Zellen zu spielen (untersucht in Weiss A., Ann. Rev. Genet. 25: 487-510 (1991)). Zum Beispiel hatten Klone von T-Zellen, die chemisch mutagenisiert und aufgrund ihres Mangels ausgewählt wurden, CD45 zu exprimieren, eine gestörte Reaktion auf Rezeptorstimuli von T-Zellen (Weaver et al., supra).
Diese Klone von T-Zellen waren in ihren Reaktionen auf Signale funktionell fehlerhaft, die durch den Antigenrezeptor der T-Zellen übertragen wurden, einschließlich Zytolyse geeigneter Targets, Proliferation und Lymphokinproduktion (Weaver et al., supra). Andere Untersuchungen weisen darauf hin, dass die PTP-Aktivität von CD45 bei der Aktivierung von pp56^kk, einer Lymphozyten-spezifischen PTK, eine Rolle spielt (Mustelin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6302-6306 (1989); Ostergaard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8959-8963 (1989)). Diese Autoren stellten die Hypothese auf, dass die Phosphataseaktivität von CD45 pp56^kk durch Dephosphorylierung eines C-terminalen Tyrosinrests aktiviert, welche ihrerseits mit der Aktivierung der T-Zellen zusammenhängen kann.
Ein anderes Beispiel für eine RPTP ist das LAR-Molekül (Leucocyte Common Antigen related Molecule, LAR), das anfänglich als ein Homolog von LCA identifiziert wurde (Streuli et al., J. Exp. Med. 168: 1523-1530 (1988)). Obwohl die intrazelluläre katalytische Region des LAR-Moleküls zwei katalytische Phosphatasehomologiedomänen (Domäne I und Domäne II) enthält, wiesen Mutationsanalysen darauf hin, dass nur Domäne I eine katalytische Phosphataseaktivität aufweist, während Domäne II enzymatisch inaktiv ist (Streuli et al., EMBO J. 9(8): 2399-2407 (1990)). Chemisch induzierte LAR-Mutanten, bei denen das Tyrosin auf der Aminosäureposition 1379 zu einem Phenylalanin verändert wurde, waren temperaturempfindlich (Tsai et al., J. Biol. Chem. 266(16): 10534-10543 (1991)).
Bei einer unlängst klonierten Maus-RPTP, die mit mRPTPμ bezeichnet wird, wurde festgestellt, dass sie eine extrazelluläre Domäne hat, die einige strukturelle Motive mit LAR gemeinsam hat. (Gebbink, M. F. B. G. et al., FEBS Lett. 290: 123-130 (1991). Diese Autoren klonierten auch einen humanen Homolog von RPTPμ und lokalisierten das Gen auf dem humanen Chromosom 18.
Zwei Drosophila-PTPs, genannt DLAR und DPTP, wurden basierend auf den Sequenzen von cDNA-Klonen vorhergesagt (Streuli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8698-8702 (1989)). cDNAs, die für eine andere Drosophila-RPTP, genannt DPTP 99A, codierten, wurden kloniert und charakterisiert (Hariharan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11266-11270 (1991)).
Andere Beispiele für RPTPs beinhalten RPTP-α, -β, -γ und -ξ. (Krueger et al., EMBO J. 9: 3241-3252 (1990), Sap et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6112-6116 (1990), Kaplan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7000-7004 (1990), Jirik et al., FEBS Lett. 273: 239-242 (1990), Mathews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4444-4448 (1990), Ohagi et al., Nucl. Acids Res. 18: 7159 (1990)). Schlessinger, PCT-Veröffentlichung WO92/01050 (23. Jan. 1992) offenbart humane RPTP-α, -β und -γ, und beschreibt die Natur der strukturellen Homologien unter den konservierten Domänen dieser drei RPTPs und anderer Mitglieder dieser Proteinfamilie. Die murine RPTP-α hat 794 Aminosäuren, während die humane RPTP-α 802 Aminosäuren aufweist. RPTP-α hat eine intrazelluläre Domäne, die zu den katalytischen Domänen anderer Tyrosinphosphatasen homolog ist. Die extrazelluläre Domäne mit 142 Aminosäuren (einschließlich dem Signalpeptid von RPTP-α) hat einen hohen Serin- und Threoningehalt (32 %) und 8 potentielle N-Glykosylierungsstellen. Es wurden cDNA-Klone hergestellt, die für RPTP-α codieren, und RPTP-α wurde aus eukaryotischen Wirten exprimiert. Northern-Analyse wurde verwendet, um die natürliche Expression von RPTP-α in verschiedenen" Zellen und Geweben zu identifizieren. Ein polyklonaler Antikörper zu RPTP-α, hergestellt durch Immunisierung mit einem synthetischen Peptid von RPTP-α, identifiziert ein Protein mit 130 kDa in Zellen, die mit einem cDNA-Klon transfiziert wurden, der einen Abschnitt von RPTP-α codiert.
Eine andere RPTP, HePTP (Jirik et al., FASEB J. 4: 82082 (1990) Abstract 2253) wurde durch Screenen einer cDNA-Bank entdeckt, die aus einer Hepatoblastomzelllinie, HepG2, abgeleitet wurde, mit einer Sonde, die die beiden PTP-Domänen von LCA codiert. Das HePTP-Gen schien in einer Vielzahl von humanen und murinen Zelllinien und Geweben exprimiert zu werden.
Seit der ersten Aufreinigung, Sequenzierung und Klonierung von PTP wurden in rascher Folge weitere potentielle PTPs identifiziert. Die Anzahl der unterschiedlichen PTPs, die identifiziert wurden, steigt stetig an, was zu Spekulationen führt, dass diese Familie ebenso groß sein könnte wie die PTK-Familie (Hunter (1989) supra).
Konservierte Aminosäuresequenzen, als „Consensus-Sequenzen" bezeichnet, wurden in den katalytischen Domänen bekannter PTPs identifiziert (Krueger et al., EMBO J. 9: 3241-3252 (1990) und Yi et al., Mol. Cell. Biol. 12: 836-846 (1992), die hier als Bezugsdokumente beigefügt sind). Yi et al. ordneten die katalytischen Phosphatasedomänesequenzen der folgenden PTPs an: LCA, PTP1B, TCPTP, LAR, DLAR und HPTPα, HPTPβ und HPTPγ. Diese Anordnung beinhaltet die folgenden „Consensus-Sequenzen" (Yi et al., supra, 2(A)):

1. K C X X Y W P [SEQ ID NR.: 1]
2. H C S X G X G R X G [SEQ ID NR.: 2]

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1. K C X X Y W P [SEQ ID NR.: 1]
2. H C S X G X G R X G [SEQ ID NR.: 2]

Es wird klar, dass die Dephosphorylierung von Tyrosinresten für sich allein als wichtiger Regulationsmechanismus fungieren kann. Es hat sich gezeigt, dass die Dephosphorylierung eines C-terminalen Tyrosinrests die Tyrosinkinaseaktivität in der src-Familie der Tyrosinkinasen aktiviert (Hunter, T. Cell 49: 1-4 (1987)). Es wurde darauf hingewiesen, dass die Tyrosindephosphorylierung ein obligatorischer Schritt bei der mitotischen Aktivierung der M-Phase-Förderfaktorkinase (MPF-Kinase) ist (Morla et al., Cell 58: 193-203 (1989)). Diese Beobachtungen zeigen die Notwendigkeit für den Fachmann auf, die Mechanismen zu verstehen, die die Tyrosinphosphataseaktivität regulieren.
Es ist klar, dass eine weitere Analyse der Struktur-Funktion-Beziehungen unter den PTPs benötigt wird, um die Mechanismen der Signaltransduktion, der Zellzyklusprogression und des Zellwachstums und der neoplastischen Transformation umfassend zu verstehen. Ein solches Verständnis wird auch nützliche Mittel zur Regulation dieser Prozesse und zur Behandlung von Krankheiten bereitstellen, die mit deren Fehlfunktion in Zusammenhang steht.
3. Zusammenfassung DER ERFINDUNG
Die Erfinder beschreiben hier die Identifikation einer neuartigen PTP, genannt PTP S31. Diese neuartige PTP unterscheidet sich in ihrer Struktur signifikant von PTPs, über die zuvor berichtet wurde. Ferner wurden mehrere Varianten dieser PTP identifiziert. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein bereit, welches eine PTP ist oder strukturelle Merkmale enthält, von denen bekannt ist, dass sie in PTPs zu finden sind, sowie Varianten davon.
Wenn ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein der vorliegenden Erfindung eines ist, das in der Natur vorkommt, ist es im Wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Glykoproteinen, mit denen es nativ assoziiert ist. Ein im Wesentlichen reines PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein der Erfindung kann durch biochemische Aufreinigung, durch chemische Mittel oder durch rekombinante Mittel in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt hergestellt werden, und wird im Wesentlichen frei von anderen Proteinen bereitgestellt, mit denen es nativ assoziiert ist. Die PTP-S31 kann modifizierte Aminosäuren haben.
Die Erfindung richtet sich ferner auf:

(1) Ein Fragment eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins;
(2) ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, das zusätzliche Aminosäuren aufweist;
(3) ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, das substituierte Aminosäuren aufweist; und
(4) ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, das jede Kombination von deletierten, zusätzlichen oder substituierten Aminosäuren aufweist.

In allen Fällen besitzt das modifizierte PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein oder dessen Fragment die gewünschte biologische Aktivität.
Die Erfindung richtet sich ferner auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein PTP-S31-Protein gemäß der Erfindung codiert. Das Nukleinsäuremolekül kann cDNA, Genom-DNA oder RNA sein. Die Erfindung richtet sich ferner auf ein Nukleinsäurekonstrukt in Form eines Expressionsvehikels. Es werden auch prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen bereitgestellt, die das Expressionsvehikel enthalten.
Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung enthalten ist ein Prozess zur Herstellung eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins dieser Erfindung, umfassend:

(a) das Kultivieren eines Wirts, der in der Lage ist, ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein unter Kultivierungsbedingungen zu exprimieren,
(b) das Exprimieren des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins; und
(b) das Gewinnen des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins aus der Kultur.

Die Erfindung richtet sich auch auf einen polyklonalen, monoklonalen oder chimärischen Antikörper, spezifisch für ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, oder für ein Epitop eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins.
Die Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zum Erkennen der Gegenwart von, oder dem Messen der Menge an PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein in einer Probe, bevorzugt einer Zelle oder einer biologischen Probe eines Probanden, umfassend:

(a) das Inkontaktbringen der Probe, wie etwa eines Zellpräparats oder eines Zellextrakts, mit einem Antikörper spezifisch für ein Epitop eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins; und
(b) das Erkennen der Bindung des Antikörpers an Probenmaterial, oder das Messen der Menge an gebundenem Antikörper,

Die Erfindung richtet sich auch auf ein Verfahren zum Erkennen der Gegenwart einer Nukleinsäure, die ein normales oder mutiertes PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein in einer Probe, bevorzugt einer Zelle oder einer biologischen Probe eines Probanden, codiert, umfassend:

(a) das Inkontaktbringen der Probe, wie etwa einer Zelle oder eines Zellextrakts, mit einer Oligonukleotidsonde, welche mindestens einen Abschnitt eines normalen oder mutierten PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins codiert, unter Hybridisierungsbedingungen; und
(b) das Messen der Hybridisierung der Sonde zur Nukleinsäure der Zelle,

Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf ein Verfahren zum Identifizieren oder Isolieren einer Probe, bevorzugt einer chemischen oder biologischen Probe, einer Verbindung, welche in der Lage ist, an ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein zu binden, wobei das Verfahren umfasst:

(a) das Anhaften eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins oder dessen an die Verbindung bindenden Abschnitts an eine/n Festphasenmatrix oder -träger,
(b) das Inkontaktbringen der Probe mit PTP-S31 gebunden an die Festphasenmatrix, wobei zugelassen wird, dass jegliche Verbindung an PTP-S31 bindet, und das Wegwaschen jeglichen ungebundenen Materials;
(c) das Erkennen der Gegenwart der Verbindung gebunden an die Festphase.

Zum Zwecke der Isolierung wird die gebundene Verbindung einem zusätzlichen Schritt des (d) Eluierens der gebundenen Verbindung unterzogen, wodurch die Verbindung isoliert wird.
Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Identifizieren eines Molekülstoffs, der in der Lage ist, die Phosphataseaktivität von PTP-S31 zu stimulieren oder zu hemmen, umfassend:

(a) das Inkontaktbringen des Stoffs mit einem PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein oder einem Proteinfragment, wobei das PTP-S31 in reiner Form, in einem Membranpräparat oder in einer ganzen lebenden oder fixierten Zelle vorliegt;
(b) das Inkubieren der Mischung aus Schritt (a) für einen ausreichenden Zeitraum;
(c) das Messen der Phosphataseaktivität des PTP-S31;
(d) das Vergleichen der Phosphataseaktivität mit der des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins inkubiert ohne den Stoff,

Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Identifizieren von Agonisten oder Antagonisten der PTP-S31-Wirkung bereit, basierend auf der Fähigkeit solcher Mittel, die Interaktionen zwischen (a) PTP-S31 und dessen Targetmolekülen oder (b) PTP-S31 und Molekülen zu modulieren, die dessen enzymatische Aktivität regulieren. Verbindungen, die durch solche Verfahren identifiziert wurden, können nützlich sein, um Krankheiten zu behandeln, die mit der PTP-S31-Fehlfunktion oder mit gestörter Signaltransduktion assoziiert sind.
4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt einen Teil der cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.: 3] und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 4] von PTP-S31 dar, die ein PCR-Fragment ist.
2 zeigt einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des PTP-S31-PCR-Fragments [SEQ ID NR.: 4], das in 1 gezeigt wird, mit der Aminosäuresequenz von PTP 1B [SEQ ID NR.: 5] (Chernoff et al., supra). Es wird das GAP-Verfahren zur Anordnung verwendet (Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970))
3 stellt die cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.: 6] und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 7] von PTP-S31C dar, einem cDNA-Klon (1.20.4), der aus einer RD-Zellen-cDNA-Bank erhalten wurde (#1). Dieser Teil der cDNA-Sequenz beinhaltet die cDNA-Sequenz des PCR-Fragments, das in 1 gezeigt wird.
4 zeigt einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz des PTP-S31C-cDNA-Klons, der in 3 gezeigt wird, mit der Aminosäuresequenz von PTP 1B. Es wird das GAP-Verfahren zur Anordnung verwendet (Needleman et al., supra).
5 stellt die cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.: 8] und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 9] eines PCR-Fragments dar, das mit den Oligonukleotiden Nr. 223 und 224 erhalten wurde.
6 zeigt die kombinierte cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.: 10] und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 11] von PTP-S31D. Diese cDNA-Sequenz beinhaltet die cDNA-Sequenz des PCR-Fragments, das in 5 gezeigt wird.
7 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz von PTP-S31D und der Sequenz von PTP 1B, der ersten PTP-Domäne von CD45 [SEQ ID NR.: 12] (Ralph et al. EMBO J. 6: 1251-1257 (1987)) bzw. LAR [SEQ ID NR.: 13] (Streuli et al., J. Exp. Med. 168: 1523-1530 (1988)). Es wurde das Programm CLUSTAL verwendet (Higgins, C. et al., Multiple Sequence Alignment; CABIOS (1991).
8 zeigt die Ergebnisse eines enzymatischen PTP-Assays unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (pNP-P) als Substrat. Die Aktivität des Glutathion-S-Transferase(GST)/PTP-S31D-Fusionsproteins wird mit der des GST/PTP-S31C-Fusionsproteins und der Glutathion-S-Transferase verglichen (Negativkontrolle).
9 zeigt die cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.: 14] und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 15] des längsten PTP-S31D-cDNA-Klons (S31D-63), der aus einer cDNA-Bank (#2) isoliert wurde, die aus humaner Skelettmuskel-mRNA hergestellt wurde. Das 5'-Ende dieses Klons unterscheidet sich von dem des PTP-S31C-Klons, der aus einer RD-cDNA-Bank (3) isoliert wurde. Ein Pfeil zeigt die Position an, an der sich dieser Klon von PTP-S31C unterscheidet.
10 stellt einen schematischen Überblick über die verschiedenen Arten von PTP-S31-Klonen dar, die in den humanen Skelettmuskel-cDNA-Banken #2 und #3 identifiziert wurden. Nur die 5'-Enden, die sich von dem PTP-S31C-cDNA-Klon (3) unterscheiden, sind dargestellt.
11 zeigt die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der PTP-S31-Varianten, die im human Skelettmuskel gefunden wurden, einschließlich S31-14 [SEQ ID NR.: 16), S31-2 (SEQ ID NR.: 17], S31-5 [SEQ ID NR.: 18], S31-63 [SEQ ID NR.: 19] und S31-III [SEQ ID NR.: 20].
12 zeigt den Teil einer cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.: 21] und die vorhergesagte Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 22] eines cDNA-Klons, PTPS31-RD#2, der aus einer RD-λ-ZAP-II-cDNA-Bank (Bank #14) isoliert wurde. Die putative Transmembranregion ist unterstrichen.
13 zeigt die Anordnung eines Abschnitts der Aminosäuresequenzen von PTPS31-RD#2 und der Interleukin-2-Rezeptor-β-Kette (SEQ ID NR.: 23). Es werden nur die Teile der extrazellulären Domänen gezeigt, die neben den Transmembranregionen liegen.
14 zeigt Fibronektin-Typ-III-ähnliche Domänen der extrazellulären Regionen von PTP-S31. Die am meisten C-terminale Domäne wird mit S31-FN-1 gekennzeichnet, und die am meisten N-terminale Domäne ist S31-FN-4. Die FN-ähnlichen Domänen werden zu einer Domäne vom Typ III (FN-III benannt) (SEQ ID NR.: 24) des humanen Fibronektins angeordnet (Kornblihtt et al., EMBO J. 4: 1755-1759 (1985)).
15 zeigt eine Anordnung der Aminosäuresequenz eines Teils der extrazellulären Region von PTP-S31-RD#2 (in der Figur mit PTP-S31 bezeichnet) mit dem humanen Insulinrezeptor (IR) (SEQ ID NR.: 25), dem humanen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1-Rezeptor (IGF1R) (SEQ ID NR.: 26) und dem humanen Insulin-related Rezeptor (IRR) (SEQ ID NR.: 27).
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Durch die Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren haben die betreffenden Erfinder eine neuartige Säuger-Proteintyrosinphosphatase (PTP; EC 3.1.3.48), genannt PTP-S31, humanen Ursprungs und mehrere Derivate davon identifiziert. Die betreffenden Erfinder haben cDNA-Klone produziert, die für das neuartige Protein codieren, und das Protein in E. coli und in eukaryotischen 293-Zellen exprimiert. Northern-Analyse wurde verwendet, um die natürliche Expression des Proteins in verschiedenen Zellen und Geweben zu identifizieren. Ferner haben sie einen polyklonalen Antikörper zu dem Protein durch Immunisierung mit einem rekombinanten Fusionsprotein, einschließlich der PTP-S31-Variante, PTP-931D, produziert.
5.1. Identifikation von Stoffen, welche die PTP-Aktivität modulieren
Das PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein oder Derivate davon, die eine Phosphataseaktivität aufweisen, können zum Testen von Verbindungen verwendet werden, die in der Lage sind, die Phosphataseaktivität zu fördern oder zu hemmen. Die Fähigkeit einer zu testenden Verbindung, die Phosphataseaktivität zu modifizieren, kann in einem In-vitro-System getestet werden, wobei die Testverbindung einem aufgereinigten PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein oder enzymatisch aktiven Derivaten davon zugefügt wird, und wobei die Effekte auf die Enzymaktivität unter Verwendung von enzymologischen Standardprozeduren gemessen werden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Alternativ kann die Wirkung einer Verbindung auf die PTP-Aktivität in einem Ganzzellpräparat unter Verwendung lebender oder fixierter Zellen oder einer Fraktion gemessen werden, die aus lebenden oder fixierten Zellen abgeleitet wurde. Dieses Verfahren ist zum Screenen von Verbindungen nützlich, die auf das Protein, insbesondere auf den enzymatischen Abschnitt des Proteins, wirken. Eine Testverbindung wird mit Zellen oder mit einem daraus abgeleiteten Präparat inkubiert, die (das) große Mengen der PTP dieser Erfindung exprimieren (exprimiert), wie etwa transfizierte COS- oder NIH-3T3-Zellen. Die Menge an zellulärem Phosphotyrosin wird unter Verwendung von Verfahren gemessen, die dem Fachmann gut bekannt sind (Honegger et al., Cell 51: 199-209 (1987); Margolis et al., Cell 51: 1101-1107 (1989)). Die Ergebnisse werden mit Ergebnissen verglichen, die in Abwesenheit der Testverbindung, oder in Abwesenheit oder Gegenwart eines bekannten PTP-Aktivators erhalten wurden. In solchen Untersuchungen kann auch die Wirkung der Testverbindung in Gegenwart einer Aktivatortyrosinkinase gemessen werden.
Eine Verbindung, die die PTP-Aktivität stimuliert, führt zu einer Nettoabnahme der Menge an Phosphotyrosin, während eine Verbindung, die die PTP- Aktivität hemmt, zu einen Nettoanstieg der Menge an Phosphotyrosin führen wird.
5.2. Behandlung von Krankheiten, die mit der PTP-Funktion oder -Fehlfunktion in Zusammenhang stehen
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher identifizierter Antagonisten oder Agonisten in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Behandlung von Krankheiten oder Zuständen in Zusammenhang mit anomaler Expression eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins vorgesehen sind. Alternativ können die pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, um eine Krankheit oder einen Zustand in Zusammenhang mit normalem PTP-S31 zu behandeln, jedoch mit einer oder mehreren Defizienzen stromabwärts im Signaltransduktionsweg oder sogar einem Zustand ohne irgendwelche stromabwärtigen Defizienzen. Die Zusammensetzung kann typischerweise in einer Form zur systemischen oder topischen Injektion oder Infusion vorliegen und kann, als solche, mit einem geeigneten Träger zur Injektion oder Infusion formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln von Krankheiten oder Zuständen, an denen die Aktivierung von PTP-S31 beteiligt ist, wobei das Verfahren die Verabreichung an einen Patienten, der ihrer bedarf, einer wirksamen Dosierung eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins der Erfindung oder eines Antikörpers der Erfindung oder eines Moleküls umfasst, das die Phosphataseaktivität eines PTP-Proteins der Erfindung stimuliert oder hemmt.
Im Falle der Wachstumsfaktorrezeptoren, die Tyrosinkinasen sind, wie etwa die Rezeptoren für den Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) und für den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF), ist die Tyrosinphosphorylierung mit dem Zellwachstum und mit der onkogenen Transformation verbunden. Die Aktivierung einer PTP, die zu Dephosphorylierung führt, würde als gegenregulatorischer Mechanismus dienen, um Wachstum zu verhindern oder es zu hemmen, und könnte als ein endogener Regulationsmechanismus gegen Krebs dienen. Somit kann die Mutation oder Regulation dieses Rezeptor/Enzymsystems die Suszeptibilät gegenüber Krebs fördern.
Der Insulinrezeptor ist auch eine Tyrosinkinase, und die Phosphorylierung von Tyrosin in Zellen, die Insulinrezeptoren tragen, stünde in Zusammenhang mit normaler physiologischer Funktion in Zusammenhang mit Insulin. Drei spezifische Tyrosinreste im intrazellulären Abschnitt des Insulinrezeptors sind phosphoryliert, wenn Insulin an die extrazelluläre Domäne bindet. Gleichzeitig wird der Insulinrezeptor ein aktives Enzym, das sich selbst oder andere Proteine an Tyrosinresten phosphorylieren kann. Die Phosphorylierung aller drei spezifischen intrazellulären Tyrosine des Insulinrezeptors scheint für die volle Tyrosinkinaseaktivität erforderlich zu sein. Der voll aktive Insulinrezeptor überträgt das Signal in die Zelle (wie etwa Skelettmuskelzelle, Leberzelle usw.) durch Phosphorylierung intrazellulärer Proteine, die dadurch aktiviert werden, und die Impulse weiter stromabwärts über den Insulinsignaltransduktionsweg befördern. Somit resultieren die wohl bekannten physiologischen Effekte von Insulin aus einer Kaskade von Phosphorylierungsereignissen.
Die Insulinsignaltransduktion wird streng kontrolliert von Enzymen der PTP-Klasse, die dephosphorylieren, und im Falle des Insulinrezeptors, Tyrosinkinasen deaktivieren können. Die Existenz von PTPs mit Aktivität gegenüber dem Insulinrezeptor kann leicht bewiesen werden. In diesem Setting würde die Aktivierung einer PTP dann den Insulineffekten entgegenwirken, während die Hemmung der PTPs den Insulineffekt imitieren sollte. Tatsächlich induziert die Behandlung ganzer Zellen, wie etwa Skelettmuskelzellen oder Adipozyten mit Pervanadat, das die PTPs hemmt, eine fast vollständige Insulinreaktion (Fantus, I. G. et al., Biochemistry 28: 8864-8871 (1989); Leighton, B. et al., Biochem. J. 276: 289-292 (1989)). Sobald die PTP identifiziert ist, die spezifisch auf den Insulinrezeptor wirkt, kann sie in einem hochproduktiven Screeningsystem und zum rationellen Wirkstoffdesign benutzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die, wie Pervanadat, die Phosphatase hemmen und die Wirkung von Insulin imitieren.
Es wäre zu erwarten, dass Überaktivität oder ungeeignete Aktivierung einer PTP die Wirkung von Insulin auf Zellen hemmt oder diese komplett verhindert, was zu Diabetes (einer Insulin-resistenten Abart) führt. Somit kann die Suszeptibilität für Diabetes in Zusammenhang mit PTP-Fehlregulation stehen und kann durch Messen der PTP-Aktivität, einschließlich PTP-S31, diagnostiziert werden.
Daher können die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren normaler oder mutierter PTP-S31-Gene oder zum Messen der Menge oder Aktivität von PTP-S31 in Zusammenhang mit einer Zelle oder Gewebe, als Verfahren zum Identifizieren der Suszeptibiliät gegenüber Krebs, Diabetes oder anderen Krankheiten in Zusammenhang mit Umbauten im zellulären Phosphotyrosinmetabolismus dienen. Außerdem können das PTP-S31-Protein, funktionelle Derivate davon und Stoffe, die die PTP-S31-Phosphataseaktivität modulieren (aktivieren oder hemmen), verwendet werden, um der Entwicklung von Krankheiten, wie etwa Krebs und Diabetes, zu verhindern oder zu behandeln.
5.3. Erkennen und Messen von PTP-S31-Protein oder -Nukleinsäure
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Bewertung der Gegenwart und des Niveaus an normalem oder mutiertem PTP-S31 in einem Probanden bereit. Die Abwesenheit, oder typischer die geringe Expression von PTP-S31, oder die Gegenwart eines mutierten PTP-S31 in einem Individuum kann als ein wichtiger Prädiktor der Suszeptibilität gegenüber onkogener Transformation und der Entwicklung von Krebs dienen. Alternativ kann die Überexpression von PTP-S31 möglicherweise aufgrund eines mutierten Rezeptor/Enzymsystems, das gegenüber negativer Regulation unempfindlich ist, oder aufgrund eines Übermaßes an einem stimulierenden Faktor, der im Körper vorhanden ist, als ein wichtiger Prädiktor für die Suszeptibilität gegenüber Diabetes dienen.
Oligonukleotidsonden, die verschiedene Abschnitte von PTP-S31 codieren (siehe unten), werden verwendet, um Zellen eines Probanden auf die Gegenwart von DNA- oder RNA-Sequenzen zu testen, die die PTP codieren. Eine Vorsonde wäre eine, die sich auf die Nukleinsäuresequenz richtet, die mindestens 4 Aminosäurereste und bevorzugt mindestens 5 Aminosäurereste des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins der vorliegenden Erfindung codiert. Qualitative oder quantitative Assays können unter Verwendung solcher Sonden durchgeführt werden. Zum Beispiel wird die Northern-Analyse (vgl. Beispiele unten) verwendet, um die Expression einer PTP-mRNA in einem Zell- oder Gewebepräparat zu messen.
Solche Verfahren können sogar, nach der Verwendung selektiver Amplifikationstechniken, mit sehr geringen Mengen an DNA, erhalten aus einem Individuum, verwendet werden. Rekombinante DNA-Methodologien, die in der Lage sind, aufgereinigte Nukleinsäurefragmente zu amplifizieren, sind schon seit langem bekannt.
Typischerweise schließen solche Methodologien die Einführung des Nukleinsäurefragments in einen DNA- oder RNA-Vektor, die klonale Amplifikation des Vektors und das Gewinnen des amplifizierten Nukleinsäurefragments ein. Beispiele für solche Methodologien werden von Cohen et al. ( US-Patentschrift Nr. 4,237,224 ), Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) bereitgestellt.
Ein enzymatisches In-vitro-Verfahren, das in der Lage ist, die Konzentration eines solchen gewünschten Nukleinsäuremoleküls zu erhöhen, wird als „Polymerase-Kettenreaktion" (PCR) bezeichnet (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich et al., EP 50,424 ; EP 84,796 , EP 258,017 , EP 237,362 ; Mullis, K., EP 201,184 ; Mullis et al., US-Patentschrift Nr. 4,683,202 ; Erlich, H., US-Patentschrift Nr. 4,582,788 ; und Saiki et al., US-Patentschrift Nr. 4,683,194 ). Die PCR stellt ein Verfahren zur selektiven Erhöhung der Konzentration einer bestimmten Nukleinsequenz bereit, sogar wenn diese Sequenz zuvor nicht aufgereinigt wurde, und nur als Einzelkopie in einer bestimmten Probe vorhanden ist. Das Verfahren kann verwendet werden, um entweder einzelsträngige oder doppelsträngige DNA zu amplifizieren. Im Wesentlichen schließt das Verfahren die Verwendung von zwei Oligonukleotidsonden ein, um als Primer für die Template-abhängige, Polymerasevermittelte Replikation eines gewünschten Nukleinsäuremoleküls zu dienen.
Die exakte Natur der beiden Oligonukleotidsonden des PCR-Verfahrens ist für den Erfolg des Verfahrens entscheidend. Bekanntermaßen besitzt ein DNA- oder RNA-Molekül Direktionalität, die durch die 5'-3'-Verbindung des Phosphats des Moleküls verliehen wird. DNA- oder RNA-Sequenzen sind durch die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der terminalen 5'- Phosphatgruppe einer Sequenz und der terminalen 3'-Hydroxylgruppe einer zweiten Sequenz miteinander verbunden. Die Polymerase-abhängige Amplifikation eines Nukleinsäuremoleküls erfolgt durch die Zugabe eines 5'-Nukleotidtriphosphats zu dem 3'-Hydroxylende eines Nukleinsäuremoleküls. Somit verlängert die Wirkung einer Polymerase das 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls. Diese inhärenten Eigenschaften werden bei der Auswahl der Oligonukleotidsonden der PCR verwertet. Die Oligonukleotidsequenzen der PCR-Sonden werden derart ausgewählt, dass sie Sequenzen enthalten, die identisch mit, oder komplementär zu Sequenzen sind, welche die bestimmte Nukleinsäuresequenz flankieren, deren Amplifikation gewünscht ist.
Spezifischer werden die Oligonukleotidsequenzen der „ersten" Sonde derart ausgewählt, dass sie in der Lage ist, an eine Oligonukleotidsequenz zu hybridisieren, die 3' zur gewünschten Sequenz liegt, während die Oligonukleotidsequenz der „zweiten" Sonde derart ausgewählt ist, dass sie eine Oligonukleotidsequenz enthält, die identisch mit derjenigen ist, die 5' zur gewünschten Region vorhanden ist. Beide Sonden besitzen 3'-Hydroxygruppen und können daher als Primer für die Nukleinsäuresynthese dienen.
In der PCR werden die Reaktionsbedingungen periodisch zwischen jenen ausgeführt, die für die Hybridisierung und Nukleinsäurepolymerisation förderlich sind, und jenen, die zu einer Denaturierung von doppelsträngigen Molekülen führen. In dem ersten Schritt der Reaktion werden die Nukleinsäuren der Probe vorübergehend erhitzt und dann abgekühlt, um die doppelsträngigen Moleküle, die vorhanden sein können, zu denaturieren. Die „ersten" und „zweiten" Sonden werden der Probe dann in einer Konzentration zugefügt, die diejenige des gewünschten Nukleinsäuremoleküls stark übersteigt. Wenn die Probe unter Bedingungen inkubiert wird, die für die Hybridisierung und Polymerisation förderlich sind, wird die „erste" Sonde zu dem Nukleinsäuremolekül der Probe an einer Position 3' zu der Sequenz hybridisieren, die amplifiziert werden soll. Wenn das Nukleinsäuremolekül der Probe anfangs doppelsträngig war, wird die „zweite" Sonde zum komplementären Strang des Nukleinsäuremoleküls an einer Position 3' zu der Sequenz hybridisieren, die das Komplement der Sequenz ist, deren Amplifikation gewünscht wird. Bei Zugabe einer Polymerase werden die 3'-Enden der „ersten" und (wenn das Nukleinsäuremolekül doppelsträngig war) der „zweiten" Sonde verlängert sein. Die Verlängerung der „ersten" Sonde wird zur Synthese eines Oligonukleotids führen, das genau die Sequenz der gewünschten Nukleinsäure aufweist. Die Verlängerung der „zweiten" Sonde wird zur Synthese eines Oligonukleotids führen, das genau die Sequenz des Komplements der gewünschten Nukleinsäure aufweist.
Die PCR-Reaktion ist in der Lage, spezifische Nukleinsäuresequenzen exponentiell zu amplifizieren, weil das Verlängerungsprodukt der „ersten" Sonde notwendigerweise eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz der „zweiten" Sonde komplementär ist, und somit als Template für die Produktion eines Verlängerungsprodukts der „zweiten" Sonde dienen kann. Auf ähnliche Weise enthält das Verlängerungsprodukt der „zweiten" Sonde notwendigerweise eine Sequenz, die zu einer Sequenz der „ersten" Sonde komplementär ist, und somit als Template für die Produktion eines Verlängerungsprodukts der „ersten" Sonde dienen kann. Somit kann, indem Polymerisations- und Denaturierungszyklen ermöglicht werden, ein geometrischer Anstieg der Konzentration des gewünschten Nukleinsäuremoleküls erreicht werden. Überblicke über die PCR werden von Mullis, K. B. (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986)); Saiki et al., Bio/Technology 3: 1008-1012 (1985)); und Mullis et al., Meth. Enzymol. 155: 335-350 (1987)) bereitgestellt.
5.4. PTP-S31-Proteine und funktionelle Derivate
In einer Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein natürlich vorkommendes Säuger-PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein. In einer anderen Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf ein rekombinantes Säuger-PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein. Das bevorzugte PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein der vorliegenden Erfindung ist humanen Ursprungs. Die Erfindung stellt das natürlich vorkommende Molekül bereit, das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, mit denen es nativ assoziiert ist. „Im Wesentlichen frei von anderen Proteinen" zeigt an, dass das Protein zu mindestens 90 Prozent (auf Gewichtsbasis) und wenn gewünscht zu mindestens 99 Prozent von anderen Proteinen und Glykoproteinen gereinigt wurde, mit denen es nativ assoziiert ist, und dass es daher im Wesentlichen frei von ihnen ist. Dies kann erreicht werden, indem Zellen, Gewebe oder Fluide, die die RPTP enthalten, Standard-Proteinreinigungstechniken unterzogen werden, wie etwa Immunoadsorptionssäulen, die monoklonale Antikörper tragen, die gegen das Protein reaktiv sind. Andere Formen der Affinitätsreinigung können Festphasensubstrate benutzen, die an die PTP-Domäne binden können, oder einen Liganden, der an die Rezeptordomäne binden wird. Alternativ kann die Aufreinigung durch eine Kombination von Standardverfahren, wie etwa Ammoniumsulfatpräzipitation, Molekularsiebchromatographie und Ionenaustauschchromatographie, erreicht werden.
In einer anderen Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Proteintyrosinphosphatase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die PTP-S31 oder mindestens 9 angrenzenden Aminosäuren, stärker bevorzugt mindestens 10, 15 20 oder 30 angrenzenden Aminosäuren, davon entspricht.
Es versteht sich, dass das Säuger-PTP-S31 der vorliegenden Erfindung biochemisch aus einer Vielzahl von Zell- oder Gewebezellen aufgereinigt werden kann. Zur Herstellung von natürlich vorkommendem PTP-S31 ist Säuger-Skelettmuskel, insbesondere humanen Ursprungs, bevorzugt.
Alternativ kann, wenn gewünscht, da das Nukleinsäuremolekül, das PTP-S31 codiert, isoliert oder synthetisiert werden kann, die Proteintyrosinphosphatase im Wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Glykoproteinen, mit denen es nativ assoziiert ist, in einem prokaryotischen Organismus oder in einem eukaryotischen Nicht-Säuger-Organismus synthetisiert werden. Wie von der vorliegenden Erfindung vorgesehen, ist ein rekombinantes PTP-S31-Molekül, das in Säugerzellen, wie etwa in transfizierten COS-, NIH-3T3-, CHO- oder 293-Zellen usw. produziert wird, zum Beispiel entweder eine natürlich vorkommende Proteinsequenz oder ein funktionelles Derivat davon. Wenn ein natürlich vorkommendes Protein durch rekombinante Mittel produziert wird, wird es im Wesentlichen frei von den anderen Proteinen und Glykoproteinen bereitgestellt, mit denen es nativ assoziiert ist.
Alternativ gibt es bekanntermaßen Verfahren zur Synthese von Polypeptiden der gewünschten Sequenz auf Festphasenträgermaterialien und deren anschließende Trennung von dem Trägermaterial.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung „funktionelle Derivate" von PTP-S31 bereit. Mit „funktionellem Derivat" ist ein „Fragment", eine „Variante", ein „Analog" oder „chemisches Derivat" von PTP-S31 gemeint, dessen Modalitäten unten definiert werden. Ein funktionelles Derivat bewahrt mindestens einen Abschnitt der Funktion von PTP-S31, wie etwa das Binden an einen spezifischen Antikörper oder eine enzymatische Phosphataseaktivität, welche dessen Nützlichkeit in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
Ein „Fragment" von PTP-S31 bezieht sich auf jede Untereinheit des Moleküls, das heilt ein kürzeres Peptid. Der Begriff „Fragment" wird verwendet, um ein Polypeptid anzuzeigen, das von einem PTP-S31-Protein abgeleitet ist, das eine natürlich vorkommende Proteinsequenz aufweist, indem die DNA-Sequenz, die das PTP-S31-Protein codiert, auf geeignete Weise modifiziert wird, was zur Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des C-Terminus, N-Terminus und innerhalb der nativen Sequenz führt. Fragmente eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins sind für das Screenen nach Verbindungen nützlich, die Antagonisten oder Agonisten sind (wie unten definiert). Es versteht sich, dass solche Fragmente eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins einen charakterisierende(n) Abschnitt(e) des nativen PTP-S31 bewahren können. Insbesondere sollten solche Fragmente eine oder mehrere biologische Aktivitäten oder Funktionen bewahren, die für das intakte PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein charakteristisch sind. Beispiele für PTP-S31-Fragmente, die nicht dazu bestimmt sind, den Umfang der beanspruchten Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken, sind: a) die katalytische Domäne; b) Regionen des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins, die mit anderen Molekülen in der intakten Zelle interagieren; c) regulatorische Teile von PTPO-S31.
Eine „Variante" von PTP-S31 bezieht sich auf ein Molekül, das im Wesentlichen entweder der gesamten Proteintyrosinphosphatase oder einem Fragment davon ähnlich ist. Proteintyrosinphosphatasevarianten können bequem durch direkte chemische Synthese der Proteintyrosinphosphatasevarianten unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Alternativ können Aminosäuresequenzvarianten der Proteintyrosinphosphatase durch Mutationen in der DNA hergestellt werden, die die synthetisierte Proteintyrosinphosphatase codiert. Solche Varianten beinhalten zum Beispiel Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz. Es kann auch jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution erfolgen, um ein fertiges Konstrukt zu erhalten, unter der Voraussetzung, dass das fertige Konstrukt die gewünschte Aktivität besitzt. Offensichtlich müssen die Mutationen, die in der DNA gemacht werden, die die Proteintyrosinphosphatasevariante codiert, den Leserahmen nicht abändern und werden bevorzugt keine komplementären Regionen erzeugen, die sekundäre mRNA-Struktur produzieren könnten (vgl. Europäische Patentveröffentlichung Nr. EP 75,444 ).
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein bereit, das zusätzliche Aminosäuren aufweist, das von einem natürlich vorkommenden PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein abgeleitet ist, indem die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, auf geeignete Weise modifiziert wird, was zur Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des C-Terminus, N-Terminus und innerhalb der nativen Sequenz führt. Es versteht sich, dass ein solches PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, das zusätzliche Aminosäuren aufweist, einen charakterisierende(n) Abschnitt(e) des nativen PTP-S31 bewahren kann (können). Insbesondere sollte solch ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein mit zusätzlichen Aminosäuren eine oder mehrere biologische Aktivitäten oder Funktionen bewahren, die charakteristisch für das PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein sind, wobei Beispiele hierfür beinhalten: (a) die katalytische Aktivität; (b) die Substratspezifität; (c) Interaktion mit anderen Molekülen in der intakten Zelle; (d) regulatorische Funktionen. Diese Beispiele sind nicht dazu bestimmt, den Umfang der beanspruchten Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein bereit, das substituierte Aminosäuren aufweist, die von einem natürlich vorkommenden PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein abgeleitet sind, indem die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, auf geeignete Weise modifiziert oder mutiert wird, was zur Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des C-Terminus, N-Terminus und innerhalb der nativen Sequenz führt. Es versteht sich, dass solch ein Protein, das substituierte Aminosäuren aufweist, (einen) charakteristische(n) Abschnitt(e) von PTP-S31 bewahren kann, und bevorzugt eine oder mehrere biologische Aktivitäten oder Funktionen bewahren sollte, die für das intakte PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein charakteristisch sind, zum Beispiel: (a) die katalytische Aktivität; (b) die Substratspezifität; (c) Interaktion mit anderen Molekülen in der intakten Zelle; (d) regulatorische Funktionen. Diese Beispiele sind nicht dazu bestimmt, den Umfang der beanspruchten Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken.
Es kann auch jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution erfolgen, um ein fertiges Konstrukt eines funktionellen PTP-S31-Derivats zu erhalten, unter der Voraussetzung, dass das fertige Konstrukt die gewünschte Aktivität oder Funktion besitzt, die in dem intakten PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein vorhanden ist, zum Beispiel: (a) die katalytische Aktivität; (b) Substratspezifität; (c) Interaktion mit anderen Molekülen in vitro und in vivo; (d) regulatorische Funktionen. Es muss nur eine dieser Aktivitäten oder Funktionen nach jeder Kombination aus Deletion, Insertion und Substitution bewahrt werden. Diese Beispiele sind nicht dazu bestimmt, den Umfang der beanspruchten Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken. Offensichtlich müssen die Modifikationen oder Mutationen, die in der DNA gemacht werden, die das PTP-S31-Protein codiert, den Leserahmen nicht abändern und werden bevorzugt keine komplementären Regionen erzeugen, die sekundäre mRNA-Struktur produzieren könnten (vgl. Europäische Patentveröffentlichung Nr. EP 75,444 ). Auf genetischem Niveau werden diese Varianten gewöhnlich durch ortsgerichtete Mutagenese (wie von Adelman et al., DNA 2: 183 (1983) beispielhaft dargestellt) von Nukleotiden in der DNA hergestellt, die das Peptidmolekül codiert, wodurch DNA produziert wird, die die Variante codiert, und anschließendes Exprimieren der DNA in rekombinanten Zellkulturen (vgl. unten). Die Varianten weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität auf wie das invariante Peptid.
Ein „Analog" von PTP-S31 bezieht sich auf ein nicht natürliches Molekül, das im Wesentlichen entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ähnlich ist.
Ein „chemisches Derivat" von PTP-S31 enthält zusätzliche chemische Komponenten, die normalerweise kein Teil der Proteintyrosinphosphatase sind. Kovalente Modifikationen der Proteintyrosinphosphatase sind im Umfang dieser Erfindung enthalten. Solche Modifikationen können in das Molekül eingeführt werden, indem gerichtete Aminosäurereste des Peptids mit einem organischen derivatisierenden Stoff reagiert werden, der in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren.
Cysteinylreste werden üblicherweise mit α-Haloacetaten (und entsprechenden Aminen), wie etwa Chloressigsäure oder Chloracetamid, reagiert, um Carboxymethyl oder Carboxyamidomethylderivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylprocarbonat bei einem pH-Wert von 5,5-7,0 derivatisiert, da dieser Stoff relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Para-Bromphenacylbromid ist auch nützlich; die Reaktion wird bevorzugt in 0,1 M Natriumcacodylat bei einem pH-Wert von 6,0 durchgeführt.
Lysinyl und Amino-Terminusreste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden reagiert. Die Derivatisierung mit diesen Stoffen hat die Wirkung, die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung α-Amino-enthaltender Reste beinhalten Imidoester, wie etwa Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzensulfonsäure; O-Methylisourea; 2,4-Pentandion; und Transaminasekatalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin modifiziert. Die Derivatisierung der Argininreste erfordert, dass die Reaktion aufgrund des hohen pK₉-Werts der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Zudem können diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie mit der Arginin-ε-Aminogruppe reagieren.
Tyrosylreste sind gut bekannte Stellen für die chemische Modifikation, insbesondere zur Einführung spektraler Marker in Tyrosylreste, durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Üblicherweise werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R'), wie etwa 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid modifiziert. Zudem werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten entamidiert. Alternativ werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen entamidiert. Jede Form dieser Reste gehört zum Umfang dieser Erfindung.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Stoffen ist für die Vernetzung des Peptids zu einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder anderen makromolekularen Trägern nützlich. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel beinhalten z. B. 1-1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie etwa 3,3''-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleimide, wie etwa bis-N-Maleimido-1,8-octan. Derivatisierende Stoffe, wie etwa Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat-Zwischenprodukte, die in der Lage sind, Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrizen, wie etwa Cyanbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patentschriften Nr. 3,969,287 ; 3,691,016 ; 4,195,128 ; 4,247,642 , 4,229,537 ; und 4,330,440 beschrieben werden, zur Proteinimmobilisierung benutzt.
Andere Modifikationen beinhalten die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., Francisco, pp. 79-86 (1983)), die Acetylierung der N-terminalen und, in einigen Fällen, die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
Solche derivatisierten Komponenten können die Löslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit usw. verbessern. Die Komponenten können alternativ alle unerwünschten Nebeneffekte des Proteins usw. eliminieren oder dämpfen. Komponenten, die in der Lage sind, solche Effekte zu vermitteln, sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Hack Publishing Co., Easton, PA. (1980) offenbart.
5.5. Chimärische PTP-S31-Moleküle
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung so genannte chimärische Moleküle bereit, die aus anderen PTPs bestehen, bei denen eine oder mehrere spezifische Aminosäuresequenzen mit homologer (homologen) Sequenz(en) aus einem anderen PTP-Protein oder -Glykoprotein ersetzt ist (sind). Die chimärischen Moleküle können zum Beispiel ein rezeptorartiges PTP-(RPTP)-Protein oder -Glykoprotein beinhalten, das eine ligandenbindende extrazelluläre Domäne aufweist, die auf einen Abschnitt eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins gepfropft ist. Andere chimärische Moleküle, die im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten sind, beinhalten PTPs, bei denen die katalytische Phosphatasedomäne mit der Phosphatasedomäne von PTP-S31 ersetzt wurde. In diesem Fall liegt die bevorzugte Anzahl an Aminosäuren zwischen 220 und 260.
„Homologe Sequenzen" sind als Sequenzen in zwei oder mehreren PTPs definiert, die in der primären Sequenz ähnlich positioniert sind, und die Sequenzhomologie aufweisen können. Es sollte betont werden, dass „homologe Sequenzen" nicht auf Fälle mit einem hohen Grad an Homologie beschränkt werden sollte. Chimärische Moleküle sind wichtige Werkzeuge zur Aufklärung von Struktur-Funktion-Beziehungen und zum Identifizieren spezifischer Verbindungen (Wirkstoffe). Daher sind die nützlichsten Chimären häufig aber nicht immer Moleküle, bei denen ein bestimmter Abschnitt eines Moleküls durch die ähnlich positionierte, aber divergente Sequenz eines anderen, ansonsten homologen Moleküls ersetzt wurde. Somit werden die ausgetauschten Abschnitte ziemlich oft die Teile der Moleküle repräsentieren, in denen sie sich am meisten unterscheiden.
5.6. Antikörper spezifisch für PTP-S31 und deren Verwendung beim Erkennen oder Messen von PTP-S31
Diese Erfindung richtet sich auch auf einen Antikörper spezifisch für ein Epitop eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins, am stärksten bevorzugt von humanem PTP-S31, und die Verwendung eines solchen Antikörpers, um die Gegenwart oder die Menge oder Konzentration an PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein in einer Zelle, einem Zell- oder Gewebeextrakt oder einem biologischen Fluid zu messen.
Der Begriff „Antikörper" soll polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), chimärische Antikörper und anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper beinhalten.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren abgeleitet sind, die mit einem Antigen immunisiert wurden.
Monoklonale Antikörper sind eine im Wesentlichen homogene Population von Antikörpern zu spezifischen Antigenen. MAbs können durch Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Vgl. zum Beispiel Kohler und Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) und die US-Patentschrift Nr. 4,376,110 . Solche Antikörper können von jeder Immunoglobulinklasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA und IgD, und jeder Unterklasse davon. Das Hybridom, das den mAbs dieser Erfindung produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Produktion der hohen Titer an mAbs in der In-vivo-Produktion macht dies zum derzeit bevorzugten Produktionsverfahren. Kurz gesagt, werden Zellen aus den einzelnen Hybridomzellen intraperitoneal in Pristan-geprimte BALB/c-Mäuse injiziert, um Aszitesfluid mit hohen Konzentrationen des gewünschten mAbs zu produzieren. MAbs des Isotyps IgM oder IgG kann aus solchen Aszitesfluiden oder aus Kulturüberständen unter Verwendung von Säulenchromatographieverfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, auf gereinigt werden.
Chimärische Antikörper sind Moleküle, von denen unterschiedliche Abschnitte von unterschiedlichen Tierspezies abgeleitet sind, wie etwa jene, die eine variable Region aufweisen, die von einem murinen mAb und einer humanen konstanten Immunoglobulinregion abgeleitet ist. Chimärische Antikörper und Verfahren zu deren Produktion sind dem Fachmann bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., Europäische Patentanmeldung 171496 (19. Feb. 1985); Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173494 (5. März 1986); Neuberger et al., PCT-Anmeldung WO86/01533 (13. März 1986); Kudo et al., Europäische Patentanmeldung 184187 , veröffentlicht am 11. Jun. 1986); Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173494 (veröffentlicht am 5. März 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., Internationale Patentveröffentlichung #PCT/ US86/02269 (veröffentlicht am 7. Mai 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Retter et al., Science 240: 1041-1043 (1988)).
Ein anti-idiotypischer (anti-Id) Antikörper ist ein Antikörper, der einzelne Determinanten erkennt, die im Allgemeinen mit der Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers assoziiert sind. Ein anti-Id-Antikörper kann hergestellt werden, indem ein Tier gleicher Spezies und gleichen genetischen Typs (z. B. Mausstamm) als Quelle des mAb mit dem mAb immunisiert wird, gegen den ein anti-Id-Antikörper hergestellt werden soll. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und auf sie reagieren, indem ein Antikörper zu diesen idiotypischen Determinanten (der anti-Id-Antikörper) produziert wird.
Der anti-Id-Antikörper kann auch als „Immunogen" verwendet werden, um eine Immunantwort in einem weiteren Tier zu induzieren, das einen so genannten anti-anti-Id-Antikörper produziert. Der anti-anti-Id kann epitopisch mit dem originalen mAb identisch sein, der den anti-Id induziert. Somit ist es möglich, indem Antikörper gegen die idiotypischen Determinanten eines mAb verwendet werden, andere Klone zu identifizieren, die Antikörper mit identischer Spezifität exprimieren.
Dementsprechend kann mAbs, der gegen PTP-S31 generiert wurde, verwendet werden, um anti-Id-Antikörper in geeignete Tiere, wie etwa BALB/c-Mäuse, zu induzieren. Milzzellen solcher immunisierter Mäuse werden verwendet, um anti-Id-Hybridomzellen zu produzieren, die anti-Id-mAbs sekretieren. Ferner kann der anti-Id-mAbs an einen Träger, wie etwa Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), gekoppelt sein, und verwendet werden, um zusätzliche BALG/c-Mäuse zu immunisieren. Seren von diesen Mäusen werden anti-anti-Id-Antikörper enthalten, die die Bindungseigenschaften des fertigen mAb haben, der für ein PTP-S31-Epitop spezifisch ist.
Die anti-Id-mAbs haben somit ihre idiotypischen Epitope, oder „Idiotope", die strukturell dem Epitop ähnlich sind, das bewertet wird, wie etwa PTP-S31.
Der Begriff „Antikörper" soll auch sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie zum Beispiel Fab und F(ab')₂ beinhalten, die in der Lage sind, Antigen zu binden. Fab- und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie werden schneller aus dem Blutkreislauf ausgeschieden und können weniger nichtspezifische Gewebebindung haben als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).
Man wird zu schätzen wissen, dass Fab und F(ab')₂ und andere Fragmente der Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, zum Erkennen und der Quantifizierung von PTP-S31 gemäß den Verfahren verwendet werden können, die hier für intakte Antikörpermoleküle offenbart werden. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung produziert, unter Verwendung von Enzymen, wie etwa Papain (um Fab-Fragmente zu produzieren) oder Pepsin (um F(ab')₂-Fragmente zu produzieren).
Ein Antikörper wird als „in der Lage", ein Molekül „zu binden" bezeichnet, wenn er in der Lage ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Begriff „Epitop" soll sich auf den Abschnitt jedes Moleküls beziehen, der in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, der auch durch diesen Antikörper erkannt werden kann. Die Epitope oder „antigenen Determinanten" bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie etwa Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und haben spezifische dreidimensionale strukturelle Charakteristika sowie spezifische Ladungscharakteristika.
Ein „Antigen" ist ein Molekül oder ein Abschnitt eines Moleküls, das in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, das zusätzlich in der Lage ist, ein Tier zu induzieren, einen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop haben. Die spezifische Reaktion, auf die oben Bezug genommen wird, soll anzeigen, dass das Antigen in hochselektiver Weise mit seinem entsprechenden Antikörper reagieren wird, und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die durch andere Antigene evoziert sein können.
Die Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können verwendet werden, um quantitativ die Gegenwart von Zellen zu erkennen, die PTP-S31 exprimieren. Dies kann durch Immunofluoreszenztechniken erreicht werden, bei denen ein fluoreszierend markierter Antikörper (vgl. unten) mit lichtmikroskopischem, durchflusszytometrischem oder fluorimetrischem Erkennen gekoppelt wird.
Die Antikörper (oder Fragmente davon), die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können histologisch, wie bei der Immunofluoreszenz der Immunoelektronenmikroskopie für das In-situ-Erkennen von PTP-S31 benutzt werden. Das In-situ-Erkennen kann durch das Entfernen eines histologischen Spezimens aus einem Patienten und durch das Bereitstellen eines markierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung für ein solches Spezimen erreicht werden. Der Antikörper (oder das Fragment) wird bevorzugt bereitgestellt, indem der markierte Antikörper (oder das Fragment) auf eine biologische Probe aufgebracht oder überschichtet wird. Durch die Verwendung einer solchen Prozedur ist es möglich, nicht nur die Gegenwart der PTP sondern auch ihre Verteilung auf dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung wird der Durchschnittsfachmann schnell verstehen, dass jedes einer großen Vielzahl histologischer Verfahren (wie etwa Färbeprozeduren) modifiziert werden kann, um ein solches In-situ-Erkennen zu erreichen. Solche Assays für PTP-S31 umfassen typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe, wie etwa ein biologisches Fluid, eine Gewebeextrakt, frisch entnommene Zellen, wie etwa Lymphozyten oder Leukozyten, oder Zellen, die in Gewebekultur in Gegenwart eines nachweisbaren markierten Antikörpers inkubiert wurden, der in der Lage ist, PTP-S31 zu identifizieren, und das Erkennen des Antikörpers durch jede einer Anzahl von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Die biologische Probe kann mit einem Festphasenträgermaterial, wie etwa Nitrocellulose oder einem anderen festen Trägermaterial behandelt werden, das in der Lage ist, Zellen, Zellteilchen oder lösliche Proteine zu immobilisieren. Das Trägermaterial kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, gefolgt von einer Behandlung mit dem nachweisbaren markierten PTP-S31-spezifischen Antikörper. Das Festphasenträgermaterial kann dann ein zweites Mal mit dem Puffer gewaschen werden, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem festen Trägermaterial kann dann durch herkömmliche Mittel erkannt werden.
Unter „Festphasenträgermaterial" ist jedes Trägermaterial zu verstehen, das in der Lage ist, Antigen oder Antikörper zu binden. Gut bekannte Trägermaterialien oder Träger beinhalten Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifiziert Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit. Die Natur der Träger kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder bis zu einem gewissen Umfang löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann tatsächlich jede mögliche strukturelle Konfiguration haben, solange das gekoppelte Molekül in der Lage ist, an ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Somit kann die Trägermaterialkonfiguration kugelförmig sein, wie bei einer Perle, oder zylindrisch, wie die Innenfläche eines Reagenzglases oder die Außenfläche eines Stäbchens. Alternativ kann die Oberfläche flach wie ein Blatt, Teststreifen usw. sein. Bevorzugte Trägermaterialien beinhalten Polystyrolperlen. Fachleute werden viele andere geeignete Träger zum Binden von Antikörper oder Antigen kennen oder werden in der Lage sein, denselben durch die Verwendung von Routineversuchen zu ermitteln.
Die Bindungsaktivität einer gegebenen Charge an anti-PTP-S31-Antikörper kann gemäß gut bekannter Verfahren bestimmt werden. Fachleute werden in der Lage sein, operative und optimale Assaybedingungen für jede Bestimmung durch die Nutzung von Routineversuchen zu bestimmen.
Andere solche Schritte, wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtern usw. können den Assays zugefügt werden, je nach dem, wie es für die besondere Situation gebräuchlich oder notwendig ist.
Einer der Wege, mit denen der PTP-S31-spezifische Antikörper nachweisbar markiert werden kann, ist durch Verbinden desselben mit einem Enzym und die Verwendung in einem Enzym-Immunoassay (EIA). Dieses Enzym wird seinerseits, wenn es später einem geeigneten Substrat ausgesetzt wird, mit dem Substrat auf eine solche Weise reagieren, dass es eine chemische Komponente produziert, die zum Beispiel durch spektrophotometrische, fluorimetrische oder durch visuelle Mittel erkannt werden kann. Enzyme, die verwendet werden können, um den Antikörper nachweisbar zu markieren, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Malatdehydrogenase, Staphylokokkennuclease, Delta-5-Steroidisomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, α-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Merrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase. Das Erkennen wird durch kalorimetrische Verfahren erreicht, die ein chromogenes Substrat für das Enzym verwenden. Das Erkennen kann auch durch Sichtvergleich des Umfangs der enzymatischen Reaktion des Substrats im Vergleich zu ähnlich hergestellten Standards erreicht werden.
Das Erkennen kann unter Verwendung jeder einer Vielzahl anderer Immunoassays erreicht werden. Zum Beispiel ist es möglich, durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente, RPTP durch die Verwendung eines Radioimmunoassays (RIA) zu erkennen (vgl. zum Beispiel Work, T. S. et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, New York, 1978). Das radioaktive Isotop kann durch solche Mittel, wie etwa die Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie erkannt werden.
Es ist auch möglich, den Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszent markierte Antikörper Licht einer passenden Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Gegenwart aufgrund der Fluoreszenz erkannt werden. Zu den üblicherweise zur Fluoreszenzmarkierung verwendeten Verbindungen gehören Fluorescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Der Antikörper kann auch unter Verwendung von fluoreszenzemittierenden Metallen, wie etwa ¹⁵²Eu oder anderer aus der Lanthanidgruppe nachweisbar markiert werden. Diese Metalle können an den Antikörper unter Verwendung solcher Metallchelatgruppen, wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) angehaftet werden.
Der Antikörper kann auch durch Ankoppeln an eine chemilumineszierende Verbindung nachweisbar markiert werden. Die Gegenwart des chemilumineszierend markierten Antikörpers wird bestimmt, indem die Gegenwart von Lumineszenz erkannt wird, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele für besonders nützliche chemilumineszierende Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol, thermoaromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
Gleichermaßen kann auch eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art der Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen anzutreffen ist, in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Die Gegenwart eines biolumineszenten Proteins wird durch Erkennen der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszente Verbindungen zum Zweck der Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Die Antikörpermoleküle der vorliegenden Erfindung können für die Nutzung in einem immunometrischen Assay angepasst werden, der auch als „Two-site"- oder „Sandwich"-Assay bekannt ist. In einem typischen immunometrischen Assay wird eine Menge an unmarkiertem Antikörper (oder Antikörperfragment) an ein festes Trägermaterial gebunden und eine Menge an nachweisbar markiertem löslichem Antikörper wird zugefügt, um das Erkennen und/oder die Quantifizierung des ternären Komplexes zu ermöglichen, der sich zwischen dem Festphasenantikörper, dem Antigen und dem markierten Antikörper gebildet hat.
Typische und bevorzugte immunometrische Assays beinhalten „Vorwärts"-Assays, in denen der Antikörper, der an eine feste Phase gebunden ist, zuerst mit der zu testenden Probe in Kontakt gebracht wird, um das Antigen aus der Probe durch Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird das feste Trägermaterial gewaschen, um den Rest der Fluidprobe zu entfernen, einschließlich des gegebenenfalls nicht gebundenen Antigens, und dann mit der Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Antikörper (der als „Reporter-Molekül" dient) enthält. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten Antikörpern erlaubt, durch den unmarkierten Antikörper mit dem an das feste Trägermaterial gebundene Antigen zu komplexieren, wird das feste Trägermaterial ein zweites Mal gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu entfernen.
In einer anderen Art von „Sandwich"-Assay, der für die Antigene der vorliegenden Erfindung auch nützlich sein kann, werden so genannte „simultane" und „reverse" Assays verwendet. Ein simultaner Assay schließt einen einzigen Inkubationsschritt ein, da beide, der Antikörper, der an das feste Trägermaterial gebunden ist, und der markierte Antikörper, der Probe zugeführt werden und dabei gleichzeitig getestet werden. Nach Abschluss der Inkubation wird das feste Trägermaterial gewaschen, um den Rest der Fluidprobe und des nicht komplexierten markierten Antikörpers zu entfernen. Die Gegenwart von markiertem Antikörper, der mit dem festen Trägermaterial assoziiert ist, wird dann genauso bestimmt, wie beim herkömmlichen „Vorwärts"-Sandwich-Assay.
Beim „reversen" Assay wird die schrittweise Zugabe zunächst einer Lösung des markierten Antikörpers zur Fluidprobe, gefolgt von der Zugabe von unmarkiertem Antikörper, der an ein festes Trägermaterial gebunden ist, nach einer geeigneten Inkubationszeit, verwendet. Nach einer zweiten Inkubation wird die Festphase auf herkömmliche Weise gewaschen, um sie von den Resten der zu testenden Probe und der Lösung aus markiertem Antikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit einem festen Trägermaterial assoziiert ist, wird dann genauso bestimmt wie im „simultanen" Assay und im „Vorwärts"-Assay.
Die Gegenwart eines normal funktionierenden PTP-S31 in einem Probanden kann auch unter Verwendung direkter enzymatischer Assays, bevorzugt für die Tyrosinphosphataseaktivität, getestet werden. Solche biochemischen Messungen können in vitro unter Verwendung gereinigter Enzyme, die das exakte Messen der Enzymaktivität zulassen, oder mit Membranpräparaten oder ganzen Zellen durchgeführt werden, in denen das Netto-Phosphotyrosinniveau bestimmt wird.
5.7. Nukleinsäuremoleküle, die PTP-S31 codieren
In zusätzlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden eine DNA-Sequenz, die ein PTP-S31-Molekül codiert, und Verfahren zum Exprimieren der DNA-Sequenz bereitgestellt. Ein Durchschnittsfachmann wird wissen, wie zusätzliche PTP-Moleküle von humanen Spezies oder anderen Säuger-Spezies, ohne unnötige Versuche zu identifizieren und zu klonieren sind, die eine Sequenzhomologie zu dem PTP-S31-Protein und den hier beschriebenen funktionellen Derivaten aufweisen, unter Verwendung der genetischen Sequenzen und Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung.
In einer Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Proteintyrosinphosphatase codiert, die die Aminosäuresequenz von PTP-S31 oder mindestens 9 angrenzende Aminosäuren, bevorzugt mindestens 10, 15, 20 oder 30 angrenzende Aminosäuren davon aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsformen codiert die isolierte Nukleinsäure eine Proteintyrosinphosphatase, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NR.: 4 oder eine mutierte Variante oder Speziesvariante davon aufweist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die isolierte Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR.: 3 oder mindestens 27 benachbarte Nukleotide davon, bevorzugt mindestens 30, 35, 40 oder 50 Nukleotide davon.
Die Manipulation der genetischen Konstrukte der vorliegenden Erfindung lässt das Pfropfen einer bestimmten ligandenbindenden Rezeptordomäne und einer transmembranen Domäne einer RPTP auf katalytische Abschnitte von PTP-S31 zu, was zu chimärischen Molekülen führt. Nicht beschränkende Beispiele für solche chimärischen Moleküle beinhalten eine PTP, wobei der Rezeptor ein Epidermis-Wachstumsfaktorrezeptor, ein Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor usw. sein kann. Es werden auch PTP-PTP-Chimären in Betracht gezogen, zum Beispiel zwischen PTP-S31 und PTPα oder PTPε. Gentechnisch veränderte chimärische Rezeptoren sind dem Fachmann bekannt (vgl. zum Beispiel Riedel, H. et al., Nature 324: 628-670 (1986)).
Genetische Konstrukte, die PTP-S31 codieren, funktionelle Derivate davon und chimärische Moleküle, wie jene, die oben beschrieben wurden, können in der Gentherapie verwendet werden. Ein anomales oder funktionsgestörtes PTP-S31, das zu einer Krankheit führt, kann durch die Infusion von Zellen der gewünschten Linie (wie zum Beispiel blutbildende Zellen), die mit DNA transfiziert wurden, die normales PTP-S31 codiert, ersetzt werden. Alternativ oder zusätzlich können Zellen für eine solche Gentherapie verwendet werden, die eine chimärische RPTP tragen, die einen Rezeptor für einen Liganden der Wahl (z. B. EGF) aufweisen.
Die rekombinanten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können durch jedes einer Vielzahl von Mitteln, wie zum Beispiel DNA- oder RNA-Synthese, oder stärker bevorzugt durch die Anwendung rekombinanter DNA-Techniken, produziert werden. Techniken zum Synthetisieren solcher Moleküle wurden zum Beispiel von Wu, R., et al. (Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978)) offenbart. Prozeduren zur Konstruktion rekombinanter Moleküle in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden von Sambrook et al. (supra) offenbart.
Der 3'-Terminus des rekombinanten Moleküls dieser Erfindung wird bevorzugt behandelt, um ihn für die Polymerisation ungeeignet zu machen. Eine solche Behandlung kann erreicht werden, indem der Terminus durch chemische Mittel blockiert wird oder indem die terminalen Basen derart modifiziert werden, dass sie die Polymerasewirkung sterisch stören. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine solche Behandlung erreicht, indem der 3'-Terminus immobilisiert wird, etwa durch seine Koppelung an ein festes Trägermaterial (wie zum Beispiel Glas, Plastik, Latex usw.). Das Trägermaterial kann jede Form haben (d. h. ein Blatt, Stab, Kugel, Ei usw.). Prozeduren für solche Immobilisationen sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist das 3'-Ende des rekombinanten Moleküls kovalent an das feste Trägermaterial gebunden. Es kann eine Spacer-Region verwendet werden, um die Sonde von dem festen Trägermaterial aus nach außen zu verlängern, so lange (1) sie nicht irgendeine Funktion oder Charakteristik des rekombinanten Moleküls sterisch hindern wird, und (2) die Sequenz der Spacer-Region nicht an den Hybridisierungs- oder Polymerisationsreaktionen des Assays beteiligt ist. Es ist typischerweise wünschenswert, mehrere und bevorzugt eine große Anzahl solcher rekombinanter Moleküle auf dem Träger zu immobilisieren.
Oligonukleotide, die einen Abschnitt von PTP-S31 repräsentieren, sind zum Screenen auf die Gegenwart von Genen, die solche Proteine codieren, und zum Klonieren von PTP-S31-Genen nützlich. Techniken zum Synthetisieren solcher Oligonukleotide wurden zum Beispiel von Wu, R., et al. (Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978)) offenbart.
Proteinmoleküle werden zum Beispiel mit Cyanbromid fragmentiert, oder mit Proteasen, wie etwa Papain, Chymotrypsin, Trypsin usw. (Oike, Y., et al., J. Biol. Chem. 257: 9751-9758 (1982); Liu, C., et al., Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209-215 (1983)). Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um eine bestimmte Aminosäure zu codieren (Watson, J. D., In: Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl., Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, Calif. (1987)). Bei der Verwendung des genetischen Codes können ein oder mehrere verschiedene Oligonukleotide identifiziert werden, wobei jedes davon in der Lage wäre, die Aminosäure zu codieren. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Oligonukleotid in der Tat die tatsächliche XXX-codierende Sequenz bilden wird, kann durch die Berücksichtigung anomaler Basenpaarungs-Beziehungen und der Häufigkeit eingeschätzt werden, mit der ein bestimmter Codon in eukaryotischen Zellen tatsächlich verwendet wird (um eine bestimmte Aminosäure zu codieren). Solche „Codon-Verwendungsregeln" wurden von Lethe, R., et al., J. Molec. Biol. 183: 1-12 (1985) offenbart. Bei der Verwendung der „Codon-Verwendungsregeln" von Lathe wird ein einziges Oligonukleotid, oder ein Satz von Oligonukleotiden identifiziert, der eine theoretisch „wahrscheinlichste" Nukleotidsequenz enthält, die in der Lage ist, eine PTP-S31-Sequenz zu codieren.
Obwohl eine Aminosäuresequenz gelegentlich von nur einem einzigen Oligonukleotid codiert wird, kann die Aminosäuresequenz häufig von jedem Oligonukleotid aus einem Satz ähnlicher Oligonukleotide codiert werden. Dabei ist wichtig, dass, während alle Mitglieder dieses Satzes Oligonukleotide enthalten, die in der Lage sind, das Peptidfragment zu codieren, und somit potentiell die gleiche Oligonukleotidsequenz enthalten wie das Gen, das das Peptidfragment codiert, nur ein Mitglied dieses Satzes die Nukleotidsequenz enthält, die mit der Nukleotidsequenz des Gens identisch ist. Da dieses Mitglied in dem Satz vorhanden ist und in der Lage ist, sogar in Gegenwart der anderen Mitglieder des Satzes zu DNA zu hybridisieren, ist es möglich, den unfraktionierten Satz an Oligonukleotiden auf die gleiche Weise zu benutzen, auf die ein einziges Oligonukleotid benutzt werden könnte, um das Gen zu klonieren, das das Peptid codiert.
Das Oligonukleotid oder der Satz an Oligonukleotiden, die die theoretisch „wahrscheinlichste" Sequenz enthalten, die in der Lage ist, ein PTP-S31-Fragment zu codieren, wird verwendet, um die Sequenz eines komplementären Oligonukleotids oder eines Satzes an Oligonukleotiden zu identifizieren, die in der Lage sind, zu der „wahrscheinlichsten" Sequenz oder dem Satz an Sequenzen zu hybridisieren. Ein Oligonukleotid, das eine solche komplementäre Sequenz enthält, kann als Sonde benutzt werden, um das PTP-S31-Gen zu identifizieren und zu isolieren (Sambrook et al., supra).
Ein geeignetes Oligonukleotid oder ein Satz an Oligonukleotiden, die in der Lage sind, ein Fragment eines PTP-S31-Gens zu codieren (oder die komplementär zu einem solchen Oligonukleotid oder Satz an Oligonukleotiden sind), wird (unter Verwendung der oben beschriebenen Prozedur) identifiziert, synthetisiert, und hybridisiert, durch Mittel, die dem Fachmann gut bekannt sind, gegen eine DNA, oder stärker bevorzugt ein cDNA-Präparat, das aus Zellen abgeleitet ist, die in der Lage sind, das PTP-S31-Gen zu exprimieren. Einzelsträngige Oligonukleotidmoleküle, die zu den „wahrscheinlichsten" PTP-S31-Peptid-codierenden Sequenzen komplementär sind, können unter Verwendung von Prozeduren synthetisiert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind (Belagaje et al., J. Biol. chem. Mechanisms in the Control of Gene Expression; Nierlich et al., Hrsg., Acad. Press, NY (1976); Wu et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978); Khorana, R. G., Science 203: 614-625 (1979)). Zusätzlich kann die DNA-Synthese durch die Verwendung automatisierter Synthesegeräte erreicht werden. Techniken der Nukleinsäurehybridisierung wurden durch Sambrook et al. (supra) und durch Haymes et al. (In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)) offenbart. Techniken wie die oben beschriebenen oder diesen ähnliche Techniken haben das Klonieren von Genen für humane Aldehyddehydrogenasen (Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985), Fibronektin (Suzuki et al. EMBO J. 4: 2519-2524 (1985), das humane Östrogenrezeptorgen (Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985)), gewebeartige Plasminogenaktivatoren (Pennica et al., Nature 301: 214-221 (1983)) und zu humaner alkalischer Term-Plazenta-Phosphatase komplementäre DNA (Dam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 715-8719 (1985)) erfolgreich ermöglicht.
In einem alternativen Weg zum Klonieren des PTP-S31-Gens wird eine Bank von Expressionsvektoren hergestellt, indem DNA oder, stärker bevorzugt, cDNA (aus einer Zelle, die in der Lage ist, PTP-S31 zu exprimieren) in einen Expressionsvektor kloniert. Die Bank wird dann auf Mitglieder gescreent, die in der Lage sind, ein Protein zu exprimieren, das an einen anti-PTP-S31-Antikörper bindet und das eine Nukleotidsequenz hat, die in der Lage ist, Proteintyrosinphosphatase zu codieren, die die gleiche Aminosäuresequenz wie PTP-S31 oder Fragmente davon, aufweisen. In dieser Ausführungsform wird DNA oder, stärker bevorzugt, cDNA extrahiert und aus einer Zelle aufgereinigt, die in der Lage ist, das PTP-S31-Protein zu exprimieren. Die gereinigte cDNA wird (durch Scheren, Endonucleasedigestion usw.) fragmentiert, um einen Pool von DNA- oder cDNA-Fragmenten zu produzieren. DNA- oder cDNA-Fragmente aus diesem Pool werden dann in einen Expressionsvektor kloniert, um eine Genbank von Expressionsvektoren zu produzieren, deren Mitglieder jeweils ein einziges kloniertes DNA- oder cDNA-Fragment enthalten.
Ein „Expressionsvektor" ist ein Vektor, der (aufgrund der Gegenwart geeigneter Transkriptions- und/oder Translationskontrollsequenzen) in der Lage ist, ein DNA- (oder cDNA-)Molekül zu exprimieren, das in den Vektor kloniert wurde, und dabei ein Polypeptid oder Protein zu produzieren. Die Expression der klonierten Sequenzen findet statt, wenn der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Wenn ein prokaryotischer Expressionsvektor benutzt wird, dann wäre die geeignete Wirtszelle jede prokaryotische Zelle, die in der Lage ist, die klonierten Sequenzen zu exprimieren. Auf ähnliche Weise wäre dann, wenn ein eukaryotischer Expressionsvektor benutzt wird, die geeignete Wirtszelle jede eukaryotische Zelle, die in der Lage ist, die klonierten Sequenzen zu exprimieren. Dabei ist wichtig, da eukaryotische DNA intervenierende Sequenzen enthalten kann und da solche Sequenzen in prokaryotischen Zellen nicht korrekt verarbeitet werden können, dass es bevorzugt ist, cDNA aus einer Zelle zu benutzen, die in der Lage ist, PTP-S31 zu exprimieren, um eine prokaryotische genomische Expressionsvektorbank zu produzieren. Prozeduren zur Herstellung von cDNA und zum Produzieren einer Genbank wurden von Sambrook et al. (supra) offenbart.
Eine DNA-Sequenz, die PTP-S31 oder dessen funktionelle Derivate codiert, kann mit Vektor-DNA gemäß herkömmlicher Techniken rekombiniert werden, einschließlich Termini mit stumpfen oder versetzten Enden zur Ligation, Restriktionsenzymdigestion, um geeignete Termini bereitzustellen, gegebenenfalls Auffüllen kohäsiver Enden, alkalische Phosphatasebehandlung, um unerwünschtes Verbinden zu vermeiden, und Ligation mit geeigneten Ligasen. Techniken für solche Manipulationen wurden von Sambrook et al., supra, offenbart und sind dem Fachmann gut bekannt.
Man sagt, dass ein Nukleinsäuremolekül, wie etwa DNA, „in der Lage ist", ein Polypeptid „zu exprimieren", wenn es Nukleotidsequenzen enthält, die regulatorische Transkriptions- und Translationsinformation enthalten, und solche Sequenzen sind mit Nukleotidsequenzen „wirkungsmässig verbunden", die das Polypeptid codieren. Eine wirkungsmässige Verbindung ist eine Verbindung, bei der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, auf eine solche Weise verknüpft sind, dass sie Genexpression ermöglicht. Die exakte Natur der regulatorischen Regionen, die für die Genexpression benötigt werden, kann von Organismus zu Organismus variieren, sollte aber im Allgemeinen eine Promoterregion beinhalten, die in Prokaryoten sowohl die Promotersequenz (die den Start der RNA-Transkription leitet) sowie die DNA-Sequenzen enthält, die, wenn sie in RNA transkribiert werden, den Start der Proteinsynthese signalisieren werden. Solche Regionen werden normalerweise jene 5'-nicht-codierenden Sequenzen beinhalten, die beim Start der Transkription und Translation beteiligt sind, wie etwa TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz usw.
Wenn gewünscht, kann die nicht codierende Region 3' für die Gensequenz, die für das Protein codiert, durch die oben beschriebenen Verfahren erhalten werden. Diese Region kann für ihre transkriptionalen regulatorischen Terminationssequenzen, wie etwa Termination und Polyadenylierung, bewahrt werden. Somit können, indem die 3'-Region, die natürlich benachbart zur DNA-Sequenz ist, die für das Protein codiert, die trankriptionalen Terminationssignale bereitgestellt werden. Wenn die transkriptionalen Terminationssignale in der Expressionswirtszelle nicht zufriedenstellend funktionell sind, dann kann eine 3'-Region substituiert werden, die in der Wirtszelle funktionell ist.
Man sagt, dass zwei DNA-Sequenzen (wie etwa eine Promoterregionsequenz und eine PTP-S31-codierende Sequenz) wirkungsmässig verbunden sind, wenn die Natur der Verbindung zwischen den beiden DNA-Sequenzen nicht (1) zur Einführung einer Rasterverschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit der Promoterregionsequenz beeinträchtigt, die Transkription der R-PTP-Gensequenz zu leiten, oder (3) die Fähigkeit der R-PTP-Gensequenz beeinträchtigt, durch die Promoterregionsequenz transkribiert zu werden. Eine Promoterregion wäre wirkungsmässig mit einer DNA-Sequenz verbunden, wenn der Promoter in der Lage wäre, die Transkription dieser DNA-Sequenz auszuführen. Somit sind, um das Protein zu exprimieren, Transkriptions- und Translationssignale notwendig, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden.
Ein Promoter ist eine doppelsträngige DNA- oder RNA-Sequenz, die in der Lage ist, RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer „wirkungsmässig verbundenen" Nukleinsäuresequenz zu fördern. Wie hier verwendet ist eine „Promotersequenz" die Sequenz des Promoters, die auf dem Strang der DNA oder RNA liegt, die durch die RNA-Polymerase transkribiert wird. Ein „Promotersequenzkomplement" ist ein Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz das Komplement einer „Promotersequenz" ist. Folglich wird bei der Verlängerung eines DNA- oder RNA-Primers, der neben einem einzelsträngigen „Promotersequenzkomplement" oder einer „Promotersequenz" liegt, ein doppelsträngiges Molekül erzeugt, das einen funktionellen Promoter enthalten wird, wenn diese Verlängerung in Richtung der „Promotersequenz" oder des „Promotersequenzkomplements" fortschreitet. Dieser funktionelle Promoter wird die Transkription der Nukleinsäuresequenz leiten, die wirkungsmässig mit dem Strang des doppelsträngigen Moleküls verbunden ist, der die „Promotersequenz" enthält.
Bestimmte RNA-Polymerasen weisen eine hohe Spezifität für solche Promoter auf. Die RNA-Polymerasen der Bakteriophagen T7, T3 und SP-6 sind ganz besonders gut charakterisiert und weisen eine hohe Promoterspezifität auf. Die Promotersequenzen, die für jede dieser RNA-Polymerasen spezifisch sind, leiten die Polymerase auch, um nur einen Strang der zwei Stränge eines Duplex-DNA-Templates zu transkribieren. Die Auswahl, welcher Strang transkribiert wird, wird durch die Orientierung der Promotersequenz bestimmt. Diese Auswahl bestimmt die Transkriptionsrichtung, da RNA nur enzymatisch durch die Zugabe eines Nukleotids 51 Phosphats zu einem 3'-Hydroxylterminus polymerisiert wird.
Man sagt, dass zwei Sequenzen eines Nukleinsäuremoleküls „wirkungsmässig verbunden" sind, wenn sie auf eine Weise miteinander verbunden sind, die es entweder beiden Sequenzen ermöglicht, auf das gleiche RNA-Transkript transkribiert zu werden, oder ein RNA-Transkript ermöglicht, das in einer Sequenz begonnen wird und in die zweite Sequenz verlängert wird. Somit sind zwei Sequenzen, wie etwa eine Promotersequenz und jede andere „zweite Sequenz einer DNA oder RNA, wirkungsmässig verbunden, wenn der Beginn der Transkription in der Promotersequenz ein RNA-Transkript der wirkungsmässig verbundenen zweiten Sequenz produzieren. Um „wirkungsmässig verbunden" zu sein, ist es nicht notwendig, dass zwei Sequenzen unmittelbar nebeneinander liegen.
Die Promotersequenzen der vorliegenden Erfindung können entweder prokaryotisch, eukaryotisch oder viral sein. Geeignete Promoter sind reprimierbar oder, stärker bevorzugt, konstitutiv. Beispiele für geeignete prokaryotische Promoter beinhalten Promoter, die in der Lage sind, die T4-Polymerasen (Malik, S., et al., J. Biol. Chem. 263: 1174-1181 (1984); Rosenberg, A. H., et al., Gene 59: 191-200 (1987); Shinedling, S., et al., J. Molec. Biol. 195: 471-480 (1987); Hu, M., et al., Gene 42: 21-30 (1986)), T3-, Sp6- und T7-Polymerasen (Chamberlin, M., et al., Nature 228: 227-231 (1970); Bailey, J. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2814-2818 (1983); Davanloo, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2035-2039 (1984)); die P_R- und P_L-Promoter des Bakteriophagen Lambda (The Bacteriophage Lambda, Hershey, A. D., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1973); Lambda II, Hendrix, R. W., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980)); die trp-, recA-, Hitzeschock- und lacZ-Promoter von E. coli; die α-Amylase (Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol. 162: 176-182 (1985)) und die σ-28-spezifischen Promoter von B. subtilis (Gilman, M. Z., et al., Gene 32: 11-20 (1984)); die Promoter des Bakteriophagen von Bacillus(Gryczan, T. J., in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., N.Y. (1982)); Streptomyces-Promoter (Ward, J. M., et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478 (1986)); den int-Promoter des Bakteriophagen Lambda; den bla-Promoter des β-Lactamasegens von pBR322 und den CAT-Promoter des Chloramphenicolacetyltransferasegens von pPR325 usw. zu erkennen. Prokaryotische Promoter wurden von Glick, B. R. (J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68: 505-516 (1986)); Watson, J. D., et al. (in: Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin Cummins, Menlo Park, Calif. (1987)); und Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18: 415-442 (1984)) untersucht. Bevorzugte eukaryotische Promoter beinhalten die Promoter des Maus-Metallothionein-I-Gens (Hamer, D., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982)); den TK-Promoter von Herpes virus (McKnight, S., Cell 31: 355-365 (1982)); den frühen SV40-Promoter (Benoist, C., et al., Nature (London) 290: 304-310 (1981)); und den gal4-Gen-Hefepromoter (Johnston, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6971-6975 (1982); Silver, P. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5951-5955 (1984)).
Starke Promoter sind bevorzugt. Beispiele für solche bevorzugten Promoter sind jene, die die T3-, SP6- und T7-Polymerasen erkennen, der P_L-Promoter und der Promoter des Maus-Metallothionein-I-Gens. Ein am stärksten bevorzugter Promoter für die eukaryotische Expression von PTP-S31 ist ein SV40-Promoter, wie etwa derjenige, der die Transkription in dem pLSV-Vektor antreibt (Livneh, E., et al., J. Bol. Chem. 261: 12490-12497 (1986)). Die Sequenzen solcher Polymeraseerkennungsstellen wurden von Watson, J. D., et al. (in: Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl., Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, Calif. (1987)) offenbart.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird diese unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel leichter verstanden werden, das zur Illustration bereitgestellt wird und das, wenn nicht anders spezifiziert, die vorliegende Erfindung nicht beschränken soll.
6. BEISPIEL: IDENTIFIKATION EINES NEUARTIGEN PTP UNTER VERWENDUNG VON POLYMERASE-KETTENREAKTION
Um neuartige PTPs in insulinempfindlichen Geweben zu identifizieren, benutzten die Erfinder PCR-Technik. Erststrang-cDNA des Skelettmuskels wurde als Template verwendet und degenerierte Oligonukleotide, die stark konservierten Regionen entsprachen, wurden als Primer verwendet. Eine Anzahl bereits charakterisierter PTPs (wie etwa RPTPα, RPTPβ, RPTPγ, PTP 1B, T-Zellen-PTP, MEG1) wurde unter Verwendung des unten beschriebenen Ansatzes identifiziert. Außerdem wurde eine neuartige PTP, PTP-S31 genannt, entdeckt.
Voll-RNA wurde aus humanem Skelettmuskel durch die Guanidiniumthiocyanat/CsCl-Prozedur isoliert (Chirgwin et al., Biochem. 18: 5293-5299 (1979)). Poly(A)⁺RNA wurde isoliert auf einer Oligo(dT)-Cellulosesäule (Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58: 1408-1412 (1972)) isoliert. Die Erststrang-cDNA wurde aus 2 μg poly(A)⁺RNA unter Verwendung von oligo(dT)-Priming und Moloney Murine Leukämievirus RNase H-Umkehrtranskriptase von GIBCO BRL (Gaithersburg, Md., USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers synthetisiert.
cDNA, die den PTPs entspricht, die im Skelettmuskel exprimiert wurde, wurde nach PCR isoliert (Saiki et al., Science 239: 487-491 (1988)). Die humane Skelettmuskel-Erststrang-cDNA von oben (die etwa 50 ng entspricht) wurde mit dem folgenden Satz an gemischten degenerativen Oligonukleotidprimer unter Verwendung des Gene Amp Kits (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn., USA) amplifiziert.
Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 58):
5' A(CT)TT(CT)TGG(ACG)(AG)(AG)ATG(AG)T(TCGA)TGG 3' [SEQ ID NR.: 28]
das der PTP-Aminosäure-Consensus-Sequenz entspricht: F W X M X W
Antisense-Primer (Oligonukleotid Nr. 57):
5' CC(TCGA)A(CT)(AGT)CC(ATC)GC(AG)CT(GA)CAGTG 3' [SEQ ID NR.: 29]
das der PTP-Aminosäure-Consensus-Sequenz entspricht: H C S A G (S/I/V) G.
Jeder PCR-Zyklus umfasste einen Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 Minute, dann einen Annealing-Schritt bei 37 °C für 2 Minuten und einen Verlängerungsschritt bei 72 °C für 2 Minuten. Dreißig bis 40 Zyklen wurden ausgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Die Fragmente der erwarteten Größe (basierend auf der Struktur bereits beschriebener PTPs) wurden isoliert, unter Verwendung des TA-Klonierungssystems (Invitrogen, San Diego, Calif.) subkloniert und mit dem enzymatischen Kettenabbruchverfahren, das von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)) beschrieben wurde, sequenziert (Sequenase, U.S. Biochemicals) unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1988).
Der Teil der DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines PCR-Fragments, genannt PTP-S31, wird in 1 gezeigt.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von PTP-S31 wird in 2 mit PTP 1B (Chernoff et al., supra) unter Verwendung des GAP-Verfahrens zur Anordnung (Needleman et al., supra) verglichen.
PTP-S31 ist eindeutig homolog mit anderen bekannten PTPs, aber hat überraschenderweise ein Merkmal, das für diese Enzymklasse noch nicht beschrieben wurde, die von der Universität von Wisconsin, Genetics Computer Group Program, analysiert wurde. Dieses einmalige Merkmal von PTP-S31 wird unten im Vergleich mit den Consensus-Sequenzen der zuvor beschriebenen bekannten PTPs verglichen (die Abweichung ist unterstrichen):
PTP-S31: R C X X Y W P [SEQ ID NR.: 30]
Consensus: K C X X Y W P [SEQ ID NR. 1]
7. BEISPIEL: cDNA-KLONIEREN EINES MITGLIEDS DER PTP-S31-UNTERFAMILIE
mRNA wurde aus der Rhabdomyosarkomzelllinie RD (ATCC #CCL 136), wie oben in Kapitel 6 beschrieben, hergestellt. Eine cDNA-Bank (Bank #1) wurde unter Verwendung der von Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 2: 161-170 (1982); Mol. Cell. Biol. 3: 280-289 (1983)) beschriebenen Verfahren konstruiert.
Der pCDVI-PL-Vektor wurde zur Herstellung des Primer-Fragments verwendet (Noma et al., Nature 319: 640-646 (1986). Ein kurzer synthetischer Adaptor wurde als Zweitstrangprimer verwendet (Boel et al., BioTechniques 11: 26-28 (1991)). E. coli DH5α (Gibco BRL, Gaithersburg, Md., USA) wurde für die Transformation verwendet (Inuoue, H. et al., Gene 96: 23-28 (1990)). Nach der Transformation wurden die Zellen auf LB-Platten (die 50 μg Ampicillin/ml enthielten) mit einer Dichte von 15.000-20.000 Kolonien pro Platte plattiert.
Nitrocellulose-Replikafilter (Schleicher & Schuell, BA85) wurden mit Standard-Koloniehybridisierungstechnik gescreent (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Das folgende Oligonukleotid (#185) wurde synthetisiert, am 5'-Ende unter Verwendung von T₄-Polynukleotidkinase und [γ-³²P]ATP (Amersham) markiert und zum Screenen der cDNA-Bank verwendet:
5' CCA TCA GTA TTG GCC AGA GG 3' [SEQ ID NR.: 31]
Dieses Oligonukleotid entspricht der Aminosäuresequenz His-Gln-Tyr-Trp-Pro-Glu des PTP-S31-PCR-Fragments, das in Kapitel 6 beschrieben wird. Zehn pmol des markierten Oligonukleotids in 50 ml Hybridisierungslösung (6 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 0,05 % SDS (Ausubel et al., supra) wurden den Replika-Nitrocellulosefiltern zugefügt und bei 42 °C 3 Stunden lang hybridisiert. Dann wurden die Filter in 6 × SSC, 0,05 % SDS drei Mal bei Raumtemperatur, ein Mal bei 42 °C und schließlich ein Mal bei 48 °C gewaschen. Eine positive Kolonie (Klon 1.20.4) wurde durch Autoradiographie identifiziert, isoliert und durch Standardtechniken sequenziert (Sambrook et al., supra).
Die Nukleotidsequenz dieses Klons, nun mit PTP-S31C [SEQ ID NR.: 6] gekennzeichnet, und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 7] werden in 3 gezeigt. Diese Sequenz beinhaltet die Sequenz des PCR-Fragments von oben und bestätigt somit die Identität des isolierten cDNA-Klons. Die Größe dieses Klons PTP-S31C liegt bei etwa 2300 bp. Er enthält zwei In-frame-, putative Methionin-Initiatorcodone, gefolgt von einem offenen Leserahmen, der ein Protein von etwa 39 kDa codiert. Das erste ATG stimmt mit einer Consensus-Translations-Initiationssequenz überein (Kozak, M. Nucleic Acids Research 15: 8125-8148 (1984)). Zudem ist der Abstand von dem 5'-Ende der PTP-Domäne (N(K/R)XXXNR) zum Initiatorcodon ähnlich dem anderer PTPs, z. B. PTP 1B (Chernoff et al., supra) und PEP (Matthews et al., supra). Es gibt jedoch kein In-frame- Stoppcodon 5' von dem ersten ATG. Es ist daher möglich, dass PTP-S31C kein Volllängenklon ist.
PTP-S31C enthält die meisten der konservierten Aminosäurereste, die in anderen PTPs zu finden sind; die Aminosäuresequenz ist zu etwa 45 % mit zuvor beschriebenen PTPs identisch. PTP-S31 fehlt ein Signalpeptid und eine Transmembranregion und könnte daher zu der Klasse der kleinen, intrazellulären PTPs gehören. Unerwarteterweise unterschied sich die abgeleitete Aminosäuresequenz um den katalytisch essentiellen Cysteinrest herum markant von der Consensus-Sequenz: HCSXGXGRXG [SEQ ID NR.: 32]. Es ist insbesondere bemerkenswert, dass das Arginin an Position 6 C-terminal von der aktiven Cysteinstelle in anderen PTPs mit Phenylalanin in PTP-S31C ersetzt ist. Es wurde festgestellt, dass dieser Argininrest in allen beschriebenen PTPs konserviert ist, einschließlich PTPs, denen viele andere Merkmale fehlen, die bei den meisten PTPs üblich sind, zum Beispiel cdc25 (Sandu et al., supra) und die Tyrosin/Serinphosphatase, die von dem Vakziniavirus codiert wird (Guan et al., supra).
Außerdem lässt sich die Restsubstanz des C-Terminus nur schlecht mit bekannten PTPs anordnen. Eine Anordnung von PTP 1B (Chernoff et al., supra) und PTP-S31C wird in 4 gezeigt.
8. BEISPIEL: IDENTIFIKATION VON PTP-S31D, EINER ALTERNATIVEN FORM DER NEUARTIGEN PTP
Die in Kapitel 7 offenbarten Ergebnisse, die den betreffenden Erfindern zuerst etwas rätselhaft zu sein schienen, wurden einer sorgfältigen Prüfung der Sequenz um das aktive Zentrum von Cystein herum unterzogen. Diese Analyse offenbarte, in einem anderen Leserahmen, ein Motiv, das üblicherweise in dem C-terminalen Teil der PTP-Domänen zu sehen ist: QYIFXXXXXXD (Krueger et al., EMBO J. 9: 3241-3252 (1990)).
Um zu analysieren, ob dies ein Klonierungsartefakt war oder eine sehr ungewöhnliche Form des alternativen Spleissens, wobei zwei Sets an PCR-Primers wie folgt designed wurden (zwei Primer auf jeder Seite der aktiven Stelle Cysteine):
Primersatz #1

Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 223): 5' GACGGATCCGATGCCATCAGTATTGG 3' [SEQ ID NR.: 33]
Anti-Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 224): 5' TGGTCTAGATATTTACATAGTGGTT 3' [SEQ ID NR.: 34]

Primersatz #2

Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 185): 5' CCATCAGTATTGGCCAGAGG 3' [SEQ ID NR.: 35]
Anti-Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 225): 5' CAAGCTCAACATCACCTTCCA 3' [SEQ ID NR.: 36]

PCR auf PTP-S31C cDNA erbrachte ein Band von etwa 450 bp mit Primersatz #1 und etwa 430 bp mit Primersatz #2. Wenn eine Deletion oder ein alternatives Spleissereignis stattgefunden hat, sollte es möglich sein, ein zusätzliches Band durch PCR direkt auf der Erststrang-cDNA aus der RD-Zelllinie und/oder dem Skelettmuskel zu erkennen. Die erwartete Größe dieses Bands läge bei 430/450 bp plus den Abstand, der normalerweise bei PTPs zwischen dem aktiven Cysteinzentrum und dem QYIF-Motif, d. h. bei etwa 130 bp.
mRNA und 1.-Strang-cDNA wurde aus der Rhabdomyosarkomzelllinie RD (American Tissue Type Collection CCL 136) und humanem Skelettmuskel wie in Kapitel 6 beschrieben, hergestellt. Etwa 50 ng der Erststrang-cDNA wurde mit den oben genannten Primern verwendet. Jeder PCR-Zyklus umfasste einen Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 Minute, dann einen Annealing-Schritt bei 37 °C für 2 Minuten und einen Verlängerungsschritt bei 72 °C für 2 Minuten. Dreißig bis 40 Zyklen wurden ausgeführt. Die PCR-Fragmente wurden durch Standard-Agarosegel-Elektrophorese analysiert (Ausubel et al., supra). Primersatz #1 führte zu zwei Bändern der vorhergesagten Größen unter Verwendung von cDNA aus der RD-Zelllinie als Template. Primersatz #2 führte zu zwei Bändern der vorhergesagten Größen in der RD-Zelllinie sowie in der Skelettmuskel-cDNA.
Beide Bänder aus der RD-Zelllinie, die mit Primersatz #1 erhalten wurden, wurden kloniert und sequenziert. Wie erwartet wurde festgestellt, dass das untere Band der PTPS31C-Sequenz entspricht. Das obere Band hat ebenfalls eine Sequenz, die identisch mit der PTPS31C-Sequenz ist, aber mit einer 133-bp-Insertion (5). Das obere Band, das mit Primersatz #2 unter Verwendung von Skelettmuskel-cDNA erhalten wurde, wurde direkt unter Verwendung des Antisense-Oligonukleotid-Primers Nr. 225 sequenziert. Identische Sequenzen wurden in der RD-Zelllinie und dem Skelettmuskel gefunden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz dieser Region zeigt nun die üblichen Merkmale von PTPs, einschließlich der Sequenz HCSXGXGR und ist in frame mit dem 5'-Ende von PTP-S31C. Diese neuartige Form von PTP wurde mit PTP-S31D bezeichnet. Die kombinierte Sequenz von PTP-S31C und PTP-S31D wird in 6 gezeigt.
7 zeigt eine Anordnung von PTP-S31D mit den ersten PTP-Domänen von CD45 (Ralph et al., supra) bzw. LAR (Streuli et al., supra), und mit der PTP-Domäne von PTP 1B (Chernoff et al., supra). Das CLUSTAL-Programm wurde verwendet (Higgins et al., supra).
9. BEISPIEL: INSERTION DES S31D-FRAGMENTS IN DAS PTP-S31C
Die folgenden drei Basisschritte wurden benutzt:

1. Eine BspHI-Stelle wurde an das erste ATG in PTP-S31C eingeführt.
2. Diese BspHI-Stelle wurde verwendet, um die codierende Region von PTP-S31C in den Vektor pSP72 zu übertragen (Promega).
3. Die S31D-Sequenz wurde in die PTP-S31-Sequenz eingeführt.

Schritt 1
Um die Einführung der PTP-S31-Sequenz in verschiedene Klonierungsvektoren zu erleichtern, haben wir eine BamHI- und eine BspHI-Stelle (unter Verwendung von PCR) stromaufwärts des ersten Met in der Sequenz von PTP-S31C eingeführt:
Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 202: BamHI/BspHI):
5' CGGGATCCATCATGAGAATGAGGCCAATAAGC 3 [SEQ ID NR.: 37]
Antisense-Primer (Oligonukleotid Nr. 203): XbaI):
5' GCTCTAGAGCTTGTAATCACTATATCTCCA 3' [SEQ ID NR.: 38]
Etwa 100 ng von Plasmid-DNA von PTP-S31C (Klon 1.20.4) wurden als Template verwendet. Jeder PCR-Zyklus umfasst einen Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 Minute, einen Annealing-Schritt bei 50 °C für 2 Minuten und einen Verlängerungsschritt bei 72 °C für 2 Minuten. Es wurden zehn Zyklen durchgeführt. Die PCR-Fragmente wurden mit Agarosegel-Elektrophorese analysiert, mit BamHI und AlwNI verdaut, und ein 470 bp-Fragment wurde unter Verwendung von Standardtechniken isoliert (Ausubel et al., supra). Dieses Fragment entspricht dem 5'-Ende von PTP-S31C und enthält die codierende Region von PTP-S31, beginnend mit dem ersten Methionin.
Schritt 2
Unter Verwendung von Standardtechniken wurde ein 940 bp-Fragment aus dem originalen PTP-S31C-Klon (1.20.4) isoliert, indem er mit AlwNI und EcoRV verdaut wurde. Dieses Fragment wird mit dem PCR-Fragment, das in Schritt 1 isoliert und in den pSP72-Vektor ligiert wurde (Promega), der mit BamHI und EcoRV verdaut wird. Das resultierende Plasmid wird pSP-S31C genannt.
Schritt 3
Das obere Band (etwa 580 bp einschließlich der S31D-Sequenz) aus der in Kapitel 8 beschriebenen PCR (Primersatz #1) wurde in den Vektor pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, Calif.) unter Verwendung passender Restriktionsstellen (BamHI/XbaI) kloniert, die in den Primer (Oligonukleotide Nr. 223 bzw. 224) enthalten waren. Das resultierende Plasmid wurde seinerseits mit DraIII und NcoI verdaut, um zu einem 330 bp-Fragment zu führen, das die S31D-Sequenz umspannt, die in das Plasmid pSP-S31C (Schritt 2) inseriert wurde, das mit den gleichen Enzymen (DraIII/NcoI) verdaut wurde. Das resultierende Plasmid wird pSP-S31D genannt.
10. BEISPIEL: ANALYSE DER ENZYMATISCHEN AKTIVITAT VON PTP-S31D
10.1. Veränderung des prokaryotischen Expressionsvektors pGEX
Um ein cDNA-Fragment von PTP-S31D (vgl. unten) aufzunehmen, wurden die Klonierungsstellen des pGEX2T-Vektors (Pharmacia, Uppsala, Sweden) unter Verwendung von Standardtechniken verändert (Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. F. M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 1988). Der pGEX2T-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut und isoliert. Die folgenden Oligonukleotide wurden in den verdauten pGEX2T-Vektor ligiert.

5' GATCTCCGAATTCCATGGATCCAGGCCTCTAGAAGCTTAC 3' [SEQ ID NR.: 39]
3' AGGCTTAAGGTACCTAGGTCCGGAGATCTTCGAATGTTAA 5' [SEQ ID NR.: 40]

10.2. Einführung der PTP-S31D-codierenden Region in pGEX-AK2
Das Plasmid pSP-S31D (Kapitel 9) wurde mit BamHI und EcoRV verdaut und in den pcDNA-I-Vektor (Invitrogen) inseriert, der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde. Das resultierende Plasmid, pc-S31D, wurde seinerseits mit BspHI und XbaI verdaut, was zu einem Fragment von etwa 1500 bp führte. Das PTP-S31D-Fragment wurde anschließend in den pGEX-AK2 (geschnitten mit NcoI und XbaI) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde p16 (pGEX-AK2/PTP-S31D) genannt und in den unten beschriebenen Expressionsuntersuchungen verwendet. p16 codiert ein Fusionsprotein von Glutathion-S-Transferase und PTP-S31D (beginnend mit dem ersten Methionin) und enthält ferner etwa 500 bp der nicht translatierten 3'-Region von PTP-S31C (und PTP-S31D).
Eine identische Strategie wurde verwendet, um PTP-S31C in pGEX-AK2 einzuführen, abgesehen davon, dass pSP-S31C verwendet wurde, um das pcDNA-I-basierte Plasmid: pc-S31C zu produzieren: Das resultierende Plasmid wurde p17 (pGEX-AK2/PTP-S31C) genannt.
10.3. Expression des GST-PTP-S31-Fusionsproteins in E. coli
Das pGEX-AK2/PTP-S31D-Vektorkonstrukt, p16, und das pGEX-AK2/PTP-S31C-Vektorkonstrukt, p17, das Fusionsproteine von Glutathion-S-Transferase (GST) bzw. PTP-S31D oder PTP-S31C codiert (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 87-3-8707 (1988)) wurden in E. coli, Stamm DH5α (Cat. No. 8263SA, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) und SURF^® (Cat. No. 200294, Stratagene, La Jolla, Calif. 92037) eingeführt.
Übernacht-Kulturen des transformierten E. coli wurden in LB-Medium gewachsen und 1:10 in frischem Medium verdünnt (45 ml Übernacht-Kultur plus 405 ml LB-Medium mit Ampicillin) und 1 Stunde lang bei 37 °C gewachsen. Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM (DH5β) und 5 mM (SURF) zugefügt und die Kulturen wurden weitere 4 Stunden inkubiert. Ein Volumen von 400 ml aus jeder Kultur wurde bei 4 °C 10 Minuten lang bei 5.000 U/Min. in einem Sorvall-GS3-Rotor zentrifugiert. Die Pellets wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, dann in 3 ml Lysepuffer (0,03 M Tris HCl, pH-Wert 8,0, 2,5 mM EDTA, 10 μg/ml Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 (v/v) 2-Mercaptoethanol) aufgetaut und auf Eis beschallt (M.S.E. Ultraschall-Disintegrator-100-W-Model (cat. no. 7100): 3 Zyklen mit 30 Sekunden, maximale Einstellung). Nach der Beschallung wurden die Lysate zentrifugiert und der Überstand durch einen Filter mit 0,45 μm (Millipore) gefiltert. Kontrollen waren: (1) pGEX-AK2 mit und ohne IPTG; und (2) p16 und p17 ohne Zugabe von IPTG. Die GST-PTP-S31D- und GST-PTP-S31C-Fusionsproteine sowie GST wurden als lösliche Proteine durch Glutathion-Sepharose-4B-Affinitätschromatographie (Cat. No. 17-0756-01, Pharmacia, Uppsala, Sweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 150 μl Glutathion-Sepharose 4B pro Milliliter der beschallten und sterilgefilterten bakteriellen Lysate isoliert und mit langsamer Drehung 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Die Sepharoseperlen wurden 3-mal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und schließlich in 250 μl Lysepuffer (vgl. oben) resuspendiert. Die Expression der GST/PTP-S31D- bzw. GST/PTP-S31C-Fusionsprotein sowie der Glutathion-S-Transferase wurde durch Natriumdodecylsulfat-(SDS) Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., supra) überprüft. Verschiedene Mengen der Suspension aus Glutathion-Sepharoseperlen mit GST-PTP-S31D, GST-PTP-S31C und GST (Kontrolle) wurden auf die enzymatische Aktivität analysiert, wie unten beschrieben.
10.4. Analyse der enzymatischen Aktivität des GST-PTP-S-31D-Fusionsproteins
Die Aktivität von PTP-S31D gegenüber dem Substrat p-Nitrophenylphosphat (pNP-P) wurde im Wesentlichen gemessen, wie von Tonks et al., J. Biol. Chem. 263: 6731-6737 (1988)) beschrieben. Steigende Mengen der Glutathion-Sepharoseperlen mit GST/PTP-S31D, GST/PTP-931C bzw. GST von oben wurden mit 25 mM pNP-P bei Raumtemperatur in einer Reaktionsmischung inkubiert, die 50 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) pH-Wert 5,5, 10 mM Dithiothreitol und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe gleicher Volumen von 0,4 M NaOH gestoppt. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände auf Mikrotiterplatten übertragen und die Absorbanz bei 405 nm wurde mit einem Dynatech MR5000-Lesegerät gelesen.
In diesem Phosphataseassay zeigte nur das GST/PTP-S31D-Fusionsprotein Aktivität (8).
11. BEISPIEL: NORTHERN-BLOT-ANALYSE VON PTP-S31
Voll-RNA wurde aus mehreren humanen Geweben (Milz, Plazenta, Lunge, Niere, Dickdarm, Leber und aus zwei Quellen normalen Skelettmuskels sowie aus diabetischem Skelettmuskel) und Zelllinien (KG1 (ATCC CCL 246); MOLT-4 (ATCC CRL 1582); Raji (ATCC CCL86); K-562 (ATCC CCL 243); MEG01; Hep G2 (HB 8065); Ea.hy (erhalten von Dr. Cora-Jean S. Edgell, University of North Carolina, Chapel Hill, N.C.); A673 (ATCC CRL 1598); und RD (ATCC CCL 136)) durch die saure Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsprozedur isoliert, wie von Puissant et al., BioTechniques 8: 148-149 (1990)) beschrieben.
Poly(A)⁺RNA wurde auf einer Oligo(dT)-Säule (Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412 (1972)) isoliert. Zwei μg Poly(A)⁺RNA wurden unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., supra) in die Spuren geladen, in einem Agarose-Formaldehydgel getrennt und auf Nylonfilter geblottet (Stratagene, La Jolla). Die Filter wurden mit dem mit [α³²P)dATP markierten PTP-S31-PCR-Fragment (das in Kapitel 6 beschrieben wurde) hybridisiert. Die ³²P-Markierung erfolgte mit dem Random Primers DNA Labeling System (Cat. no. 8187SA, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md. 20877, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Anschließend wurden die Filter unter stringenten Bedingungen gewaschen und auf Röntgenfilme aufgebracht.
Die Analyse der Northern Blots zeigte ein breites Spektrum von Transkripten von PTP-S31 (von etwa 2,1 bis 2,8 kb) in der Poly(A)⁺RNA aus einer der Skelettmuskelquellen, während die Expression in der anderen Probe aus normalem Skelettmuskel kaum nachweisbar war. Das breite Band in diesem Northern Blot könnte die Existenz mehrerer Formen von mRNA (z. B. alternatives Spleissen) anzeigen, die vom gleichen Gen abgeleitet sind. Die Expression von PTP-S31 wurde auch im Skelettmuskel eines Patienten mit Typ-II-Diabetes nachgewiesen.
Überraschenderweise beträgt die Größe des Haupttranskripts in der RD-Zelllinie etwa 4,4 kb. Zusätzlich wurden ein relativ breites aber schwächeres Band (2,1-2,4 kb) sowie ein schwaches Band von etwa 6 kb in der RD-Zelllinie gefunden. Eine lange Exposition des Northern Blots mit Skelettmuskel-RNA zeigt, dass es ein kleineres Transkript von etwa 4,4 kb, wie in der RD-Zelllinie, gibt. In Lungengewebe wurde ein schwaches Signal bei etwa 8 kb gefunden. Bei der Verwendung von Northern-Blotting zeigte keine der anderen Gewebe oder Zelllinien ein messbares Expressionsniveau von PTP-S31. Mit der empfindlichen PCR-Technik wurde jedoch festgestellt, dass PTP-S31 in den folgenden Geweben und Zelllinien exprimiert wurde: Leber (Schwangerschaft); Plazenta; Skelettmuskel; Niere; periphere Blutlymphozyten; HepG2-Zellen (ATCC CCL 86) (beinahe ausschließlich in der PTP-S31C-Form), RD-Zellen (ATCC CCL 136); A673-Zellen (ATCC CRL 1598); IM9-Zellen (ATCC CCL 159); CEM-Zellen (ATCC CCL 119); U937-Zellen (ATCC CRL 1593); A549-Zellen (ATCC CCL 185); und KLE-Zellen (ATCC CRL 1622).
12. BEISPIEL: KLONIEREN ZUSÄTZLICHER SUBTYPEN VON PTP-S31
Aufgrund der beobachteten Größenunterschiede zwischen den Haupttranskripten von PTP-S31 in der RD-Zelllinie und dem Skelettmuskel wurden weitere Versuche ausgeführt, die cDNA-Klonieren von PTP-S31 aus den beiden Quellen normalen Skelettmuskels einschlossen, die niedrige bzw. hohe Expressionsniveaus (basierend auf der Northern-Blot-Analyse, die in Kapitel 11 beschrieben wurde) zeigten.
Poly(A)⁺RNA wurde aus den beiden Quellen normalen humanen Skelettmuskels isoliert, wie in Kapitel 11 oben beschrieben. Unter Verwendung von 5 μg dieser Poly(A)⁺RNA-Präparate wurden zwei λ-ZAP-II-cDNA-Banken gemäß den Anleitungen des Herstellers (Stratagene, La Jolla, Calif.) hergestellt. Die Bank, die aus der RNA mit niedrigen Expressionsniveaus von PTP-S31 konstruiert wurde, wurde Bank #2 genannt. Die Bank, die aus RNA mit hohen Expressionsniveaus von PTP-S31 konstruiert wurde, wurde Bank #3 genannt. Insgesamt wurden 2 × 10⁶ Platten aus jeder Bank unter Verwendung von Standard-Filterhybridisierungstechniken (Ausubel et al., supra) gescreent. Doppelte Hybond-N+-Filter (Amersham) wurden mit dem gleichen ³²P-markierten PCR-Fragment hybridisiert, das in Kapitel 11 oben verwendet wurde.
Die ³²P-Markierung erfolgte mit dem Random Primers DNA Labeling System (Cat. no. 8187SA, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md. 20877, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Filter wurden bei hoher Stringenz (0,1 × SSC, 0,05 % SDS) gewaschen. Anschließend wurden die Filter auf Röntgenfilme aufgebracht.
Es wurden drei positive Klone aus der Bank #2 identifiziert, isoliert, In-vivo-Exzision gemäß den Anleitungen des Herstellers unterzogen und durch Sequenzierung analysiert. Aus Bank #3 wurden insgesamt neun positive Klone isoliert und analysiert.
Der längste Klon (931D-63) wurde aus der cDNA-Bank #2 isoliert; seine Nukleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz wird in 9 gezeigt. Überraschenderweise enthielt weder dieser Klon noch irgendeiner der anderen analysierten Klone das 5'-Ende des PTP-S31C-Klons (Klon 1.20.4), der aus der RD-cDNA-Bank (Bank #1) isoliert wurde. Stattdessen enthielten alle Klone aus den Skelettmuskel-cDNA-Banken 5'-Enden, die keiner der bekannten Sequenzen ähnlich waren. Keiner dieser Klone schien ein Volllängenklon zu sein, da es kein In-frame-ATG-Trielet stromaufwärts des Nukleotids gab, an dem sich diese Klone von Klon 1.20.4 unterschieden. Die verschiedenen identifizierten Formen werden in 10 schematisch dargestellt.
Die Isolierung zusätzlicher Teilklone aus Bank #3 zeigte weitere Varianten von PTP-S31, die höchstwahrscheinlich aus alternativem Spleißen resultierten. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen dieser Varianten werden in 11 gezeigt.
Eine neue cDNA-Bank (Bank #14) wurde aus Poly(A)⁺RNA aus der RD-Zelllinie unter Verwendung der λ-ZAP-II-cDNA-Klonierungsprozedur (Stratagene, La Jolla, Calif.), wie oben beschrieben, konstruiert. Insgesamt wurden 2 × 10⁶ Platten unter Verwendung von Standard-Filterhybridisierungstechniken (Ausubel et al., supra) gescreent. Doppelte Hybond-N-Filter (Amersham) wurden mit dem gleichen ³²P-markierten PCR-Fragment hybridisiert, das in Kapitel 11 oben verwendet wurde. Die ³²P-Markierung erfolgte mit dem Random Primers DNA Labeling System (Cat. no. 8187SA, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Filter wurden bei hoher Stringenz (0,1 × SSC, 0,05 % SDS) gewaschen und anschließend auf Röntgenfilm aufgebracht. Aus Bank #14 wurden insgesamt 7 positive Klone isoliert, In-vivo-Exzision gemäß den Anleitungen des Herstellers unterzogen und analysiert.
Zwei der Klone aus Bank #14 sind mit dem Klon 1.20.4 identisch, abgesehen davon, dass sie am 5'-Ende einige Basen kürzer sind (d. h. beide sind PTP-S31C). Es wurde festgestellt, dass fünf Klone dem Klon S31D-63 von oben ähnlich waren, sich aber an den 5'-Enden unterschieden. Der längste dieser beiden Klone wurde durch Sequenzierung charakterisiert. Klon S31-RD#2 entspricht der D-Form von PTP-S31, während Klon S31-RD#6, der am 5'-Ende etwa 250 Basenpaare kürzer ist als Klon S31-RD#2, entspricht der C-Form. Ansonsten sind beide Klone identisch. Teilnukleotidsequenzen (SEQ ID NR.: 21) und vorhergesagte Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR.: 22) von PTP-S31-RD#2 werden in 12 gezeigt. Überraschenderweise enthielt diese Form von PTP-S31 eine Transmembrandomäne. Daher kann PTP-S31 sowohl als intrazelluläre und als rezeptorartige PTP vorhanden sein.
Es ist bemerkenswert, dass bisher nur bei einer Säugetier-Transmembran-PTP, RPTPβ, festgestellt wurde, dass sie eine einzige PTPase-Domäne (Krueger et al., supra) enthält. Wie RPT-β hat PTP-S31-RD#2 nur eine PTPase-Domäne.
Zudem teilt die Aminosäuresequenz von PTP-S31-RD#2 nahe der putativen Transmembranregion Ähnlichkeit mit der Interleukin-2-Rezeptor-β-Kette und anderen Zytokin-Rezeptoren (Miyajama et al., Annu. Rev. Immunol. 10: 295-3331 (1992). Diese Region teilt auch eine gewisse Homologie mit Fibronektin-III-artigen (FN-III) Domänen (Patthy, L., Cell 61: 13-14 (1990)).
Einige der strukturellen Merkmale, die für Fibronektin-Typ-III-ähnliche Domänen üblich sind, sind auch in der extrazellulären Domäne von PTP-S31-RD#2 zu sehen. In der Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.: 22), die in 12 dargestellt wird, können insgesamt vier FN-III-ähnliche Domänen identifiziert werden (vgl. 14). Die Domänen werden mit S31-FN-1 (die am stärksten C-terminale und daher nahe der Transmembranregion liegende) bis S31-FN-4 (die am stärksten N-terminale) bezeichnet. Diese FN-III-ähnlichen Domänen enthalten eine relativ hohe Anzahl an Cysteinresten. Dies ist ein Gegensatz zu den FN-III-ähnlichen Domänen von LAR (Streuli et al., supra) und Cytokin-Rezeptoren (Patthy, supra). Auch ein ansonsten stark konservierter Tryptophanrest wird in S31-FN-2 durch einen Phenylalaninrest ersetzt. Ferner sind die Demarkationen zwischen einzelnen FN-III-Domänen bei weitem nicht so gut konserviert wie in RPTPβ.
Es gibt mehrere potentielle Stellen für N-Glykosylierung in der extrazellulären Domäne von PTP-S31.
Überraschenderweise zeigt eine Dehnung von etwa 100 Aminosäuren oder PTP-S31-RD#2 eine relative hohe Sequenzähnlichkeit mit einem Abschnitt der α-Untereinheit des Insulinrezeptors (15). Die Ähnlichkeit von PTP-S31-RD#2 mit dem Insulinrezeptor sowie mit Cytokinrezeptoren zeigt an, dass die Transmembranform von PTP-S31 durch Hormone oder Cytokine reguliert werden könnte. Alternativ können die FN-III-ähnlichen Domänen anzeigen, dass PTP-S31 an Interaktionen zwischen Zellen beteiligt ist.
13. BEISPIEL: ERKENNEN UND MESSEN VON PTP-S31-PROTEIN IN EINER ZELLE
13.1. Produktion von Antikörpern mit Spezifität für PTP-S31D
Antiserum mit Spezifität für PTP-S31D wurde durch Standardtechniken produziert (Hudson, L. et al., Practical Immunology, 3. Aufl., Blackwell, Oxford, 1989). Kurz zusammengefasst wurden 200 μg des GST-PTP-S31D-Fusionsproteins (vgl. Kapitel 10) in 200 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einer gleichen Menge an Freund's Complete Adjuvans (Sigma, Cat. No. F5881) kombiniert und intrakutan in zwei Neuseelandkaninchen injiziert. Jedes Kaninchen erhielt 100 μg des Fusionsproteins. Zwei Wochen nach der ersten Injektion wurden Auffrischungsinjektionen ohne Freund's Adjuvans verabreicht. Nach weiteren 2 Wochen wurden 20 ml Blut aus jedem Kaninchen erhalten und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang in Glasröhrchen zum Gerinnen stehengelassen. Die Klumpen wurden nach dem Lösen von dem Röhrchen zentrifugiert, und Aliquots des Serums wurden in frische Röhrchen übertragen und bei –20 °C bis zur Verwendung gelagert.
Um die Antikörper zu entfernen, die für Glutathion-S-Transferase (GST) spezifisch sind, wurde das Serum über eine Glutathion-Sepharose-4B-Säule geleitet, die mit Glutathion-S-Transferase gesättigt worden war, unter Verwendung der Prozedur, die in Kapitel 10 beschrieben wurde. Das pGEX-AK2-Konstrukt wurde verwendet, um das GST-Protein zu produzieren. Das Serum wurde dreimal über die Säule geleitet, um das vollständige Entfernen der Anti-GST-Antikörper zu gewährleisten. Die Effizienz der Entfernung wurde durch Western-Blotting, wie unten beschrieben, beurteilt.
13.2. Erkennen und Messen von PTP-S31D in einer Zelllinie
Der Anti-PTP-S31D-Antikörper kann verwendet werden, um die Expression von PTP-S31 in Säugetierzellen zu erkennen. Standardimmunofluoreszenztechniken stellen Informationen über die Expression dieses Proteins in spezifischen Zelllinien und Geweben bereit. Dabei ist es sogar noch wichtiger, dass dieses Antikörperpräparat verwendet werden kann, um die Menge des Proteins in Zelllinien und Geweben zu bestimmen. Als Beispiel für die spätere Anwendung des Anti-PTP-S31-Antikörpers wird das Erkennen von PTP-S31 in der RD-Zelllinie (ATCC CCL 136) unten beschrieben. Es sollte betont werden, dass dieses Beispiel keinesfalls die Verwendung des Antikörpers beschränken soll, der auf gleiche Weise zum Erkennen von PTP-S31 in anderen Zellen und Geweben verwendet werden kann. Ebenso kann das Antikörperpräparat nützlich sein bei der Aufreinigung von natürlich vorkommendem oder rekombinantem PTP-S31 und zum Einrichten anderer Arten von Erkennungsassays.
Unter Verwendung von Standardtechniken wird die RD-Zelllinie in Eagle's Minimal Essential Medium (Cat. No. 041-022570, GIBCO Life Technologies Ltd., Paisley, Schottland) mit zweimal der normalen Konzentrationen an Aminosäuren und Vitaminen mit Hanks' Balanced Salt Solution und 10 % fetalem Kälberserum (FCS) (GIBCO-BRL) kultiviert.
Die Zellen werden zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und der Überstand entfernt. Die Zellen aus einer Gewebekulturplatte (10 cm Durchmesser) werden in 800 μl eines Triton-X-100-Lysepuffers (20 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 50 mM NaCl, 10 % Glycerol, 1,0 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, 4 mM Ethylenglycol-bis(β-aminoethylethylether) N,N,N',N'-Tetraacetat (EGTA; Sigma ED2SS), 10 μg/ml Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) lysiert. Das Lysat wird zentrifugiert und der Überstand in frische Röhrchen in Aliquots zur Lagerung bei –80 °C bis zur Verwendung übertragen.
Zum Testen werden 1-50 μl dieses Lysats mit 25 μl SDS-Probepuffer (62,5 mM Tris HCl, pH-Wert 7,0, 3.0 (v/v) SDS, 10 % (v/v) Glycerol, 10 % 2-Mercaptoethanol und 0,05 % (w/v) Bromophenolblau) gemischt, 5 Minuten lang gekocht, mit 7,5 % SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gekocht und unter Verwendung von Standardtechniken auf Nitrocellulose geblottet (Burnette, W. N., Anal. Biochem. 112: 195-201 (1981)).
Eine Standardkurve für die quantitative Bestimmung von PTP-S31D wird generiert, indem definierte Mengen an gereinigtem E.-coli-produziertem GST-PTP-S31D-Fusionprotein von oben gleichzeitig mit den RD-Zelllysaten verwendet werden.
Die Nitrocellulosefilter werden 30 Minuten lang mit 2 Gramm Milchpulver (Carnation, Non-Fat Dry Milk, Carnation, Los Angeles, Calif.) pro Liter PBS inkubiert, um unspezifisches Binden zu blockieren, einmal in PBS gewaschen, die 0,02 % (v/v) Tween-20 (Sigma, P1379) (PBS-Tween) und 0,2 % (w/v) Gelatine (BioRad Cat. No. 170-6537, Richmond, Calif. enthält, 3-mal in PBS-Tween gewaschen und schließlich 4 Std. lang mit einer 1:200-Verdünnung (in PBS-Tween) des oben beschriebenen Anti-PTP-S31D-Antiserum-Präparats inkubiert. Nach drei Wäschen in PBS-Tween werden die Filter mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege anti-Kaninchen-IgG (Cat. No. 170-6525, BioRad) inkubiert. Die Filter werden dreimal in PBS-Tween gewaschen und die Menge an gebundenem Kaninchenantikörper, der die Menge an PTP-S31D anzeigt, wird durch die verstärkte Chemilumineszenztechnik (ECL-Technik) gemäß den Anleitungen des Herstellers (Cat. No. RPN 2106, Amersham, UK) bestimmt. Ein Vergleich der Signale, die aus der RD-Zelllinie erhalten wurden mit der Standardkurve, die mit dem E.-coli-produzierten GST-PTP-S31D-Fusionprotein erhalten wurden, lassen die Bestimmung der Menge an PTP-S31D zu, die von der RD-Zelllinie produziert wird.
14. BEISPIEL: IDENTIFIKATION EINES STOFFS, DER DIE ENZYMATISCHE AKTIVITÄT VON PTP-S31 STIMULIERT ODER HEMMT
Es werden zwei unterschiedliche Quellen des PTP-S31-Proteins für die Bewertung potentieller Modulatoren der enzymatischen Aktivität verwendet:

1. Die GST-PTP-S31D- (und GST-PTP-S31C-)Fusionsproteine wie in Kapitel 10 beschrieben;
2. PTP-S31, das vorübergehend in 293-Zellen exprimiert wird, wie unten beschrieben.

Die cDNA, die die gesamte codierende Region von PTP-S31 (C oder D) oder einen funktionellen Abschnitt davon enthält, wird in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA I (Cat. No. V490-20, Invitrogen, San Diego) unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., supra) inseriert. Das System der vorübergehenden Expression in 293-Zellen, das von Gorman et al., Virology 171: 377-385 (1989) beschrieben wird, wird verwendet, um enzymatisch aktives PTP-S31D zu produzieren. Unter Verwendung von Standardtechniken werden die 293-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Cat. No. a041-02430, GIBCO, Life Technologies Ltd., Paisley, Schottland), angereichert mit 10 % FCS in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert.
Zehn μg des Plasmidkonstrukts PTP-S31D/pcDNA I (oder PTP-S31C/pcDNA I) werden mit 0,5 ml 0,25 M CaCl₂ und 0,5 ml 2 × BBS (50 mM N,N-bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (BES), 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂ HPO₄) gemischt und zur Transfektion von 1,5 × 10⁶ 293-Zellen in einer 10-cm-Petrischale verwendet, wie von Chen et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987) beschrieben. Die Zellen werden 24 Std. lang bei 37 °C unter 3 % CO₂ nach der Zugabe des Ca-Phosphat-DNA-Präzipitats inkubiert, dann einmal in DMEM gewaschen, das mit 10 % FCS angereichert ist, und in frischem Medium weitere 24 Stunden lang bei 37 °C unter 5 % CO₂ inkubiert. Das Medium wird entfernt und die Zellen in 1,0 ml Lysepuffer (20 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 10 % Glycerol, 1.0 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, 4 mM EGTA, 10 μg/ml Aprotinin, 1 mM PMSF) lysiert. Die Zelllysate werden bei 2.500 × g 2 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, und 100 μl Aliquots werden in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und bis zur Verwendung bei –70 °C gelagert.
Das PTP-S31 in dem Lysat kann unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer Techniken, wie etwa Anionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationen, teilweise aufgereinigt werden.
Es werden drei unterschiedliche Substrate für die Bewertung potentieller Modulatoren der PTP-S31-Phosphatase-Aktivität verwendet:

(1) p-Nitrophenylphosphat (pNP-P; Sigma 104-0);
(2) ³²P-markiertes Raytide (Oncogene Science Inc., Manhasset, N.Y.);
(3) ³²P-markiertes bovines basisches Myelinprotein (MBP).

Substanzen, die die Aktivität von PTP-S31 gegen eines oder mehrere dieser Substrate entweder senken oder erhöhen, werden weiter analysiert.
14.1. Markieren von Raytide und basischem Myelinprotein mit ³²P)
Die Aktivität gegenüber ³²P-markiertem Raytide der GST/PTP-S31D- (und GST/PTP-S31C-)Fusionsproteine (Kapitel 10) sowie des vollständigen und bevorzugt halb aufgereinigten PTP-S31D-Proteins oder -Glykoproteins oder eines funktionellen Teils davon, der in 293-Zellen exprimiert wurde, wird im Wesentlichen wie von Krueger et al. (EMBO J. 9: 3241-3252 (1990)) beschrieben, gemessen. Das synthetische Peptid Raytide wird unter Verwendung der Tyrosinekinase p60^c-src gemäß den Anleitungen des Herstellers (Oncogene Science) mit kleineren Modifikationen mit ³²P markiert. Kurz zusammengefasst, werden 2 μl von p60^c-src mit 20 μl Raytide (1 mg/ml) und 108 μl des Kinasepuffers gemischt (50 mM HEPES, pH-Wert 7, 5, der 10 mM MgCl₂, 0,2 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 30 μM ATP und 50 μCi [γ-³²P]ATP enthält). Die Mischung wird bei 37 °C 16 Stunden lang inkubiert, und die Reaktion wird durch die Zugabe von 500 μl 20 % (w/v) Trichloressigsäure (TCA) in 20 mM NaH₂PO₄ und 100 μl von 5 mg/ml acetylatiertem bovinem Serumalbumin gestoppt. Die Mischung wird zentrifugiert, das Präzipitat wird dreimal in 20 % TCA/20 mM NaH₂PO₄ gewaschen und wird schließlich in 0,2 M Tris-HCl pH-Wert 8,0 wieder aufgelöst.
Basisches Myelinprotein (Sigma) wird unter Verwendung einer Prozedur markiert, die ähnlich derjenigen ist, die für Raytide verwendet wurde (Guan et al., Nature 350: 359-362 (1991)). Dreißig μg von MBP werden in einem 60 μl Reaktionsvolumen markiert, das die folgenden Bestandteile enthält: 50 mM HEPES-Puffer, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 0,067 % β-Mercaptoethanol, 0,05 mM ATP, einschließlich 150 μCi [γ-³²P]ATP und 4 Einheiten p43^v-abl-Kinase (Oncogene Science). Die Mischung wird 60 Minuten lang bei 30 °C inkubiert, und die Reaktion wird durch die Zugabe von eiskalter TCA auf eine Endkonzentration von 20 % gestoppt. Nach 30 Minuten auf Eis wird das Präzipitat dreimal in 20%-iger TCA gewaschen und in 100 μl H₂O wieder aufgelöst.
14.2. Beurteilung der PTP-Aktivität unter Verwendung des Substrats pNP-P
Die Aktivität des GST/PTP-S31D-Fusionsproteins gegenüber pNP-P wird gemessen wie in Kapitel 10 oben beschrieben. Die Substanzen, die auf ihre Fähigkeit analysiert werde, die Phosphataseaktivität zu stimulieren oder zu hemmen, werden dem GST/PTP-S31D-Fusionsprotein 5 Minuten vor der Zugabe von pNP-P zugefügt. Eine ähnliche Prozedur wird für das in 293-Zellen exprimierte PTP-S31D verwendet, wobei das Lysat aus PTP-S31D und 293-Zellen direkt verwendet wird.

Tabelle I unten zeigt den Effekt mehrere Stoffe auf die PTP-Aktivität des GST/PTP-S31-Fusionsproteins, das an Glutathion-Sepharoseperlen gebunden ist, wie in Kapitel 10 beschrieben. Die angegebenen Konzentrationen der Stoffe sind die Endkonzentrationen in der Reaktionsmischung nach der Zugabe des Substrats pNP-P. Die Phosphatase-Assaymischung enthielt 50 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) pH-Wert 5,5, 10 mM Dithiothreitol, 25 mM pNP-P und 2 μl der GST/PTP-S31-Sepharosesuspension. Beim Testen von Orthovanadat, wurde Poly(Glu/Tyr)4:1 und Poly-L-Lysin, 5 mM EDTA in die Assay-Mischung gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur ausgeführt und nach 30 Minuten durch die Zugabe gleicher Volumen von 0,4 M NaOH gestoppt. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände auf Mikrotiterplatten übertragen und die Absorbanz bei 405 nm mit einem Dynatech MR5000-Plattenlesegerät gelesen. Zum Vergleich enthält Tabelle I veröffentlichte Daten über die Aktivität von PTPβ und LAR unter Verwendung von Raytide als Substrat (Itoh et al. (J. Biol. Chem. 267: 12356-12363 (1992)).

TABELLE I
EFFEKTE VERSCHIEDENER STOFFE AUF DIE PTP-AKTIVITÄT
	Konz.	PTP-Aktivität (% der Kontrolle)
Stoff	(mM)	S31D	PTPβ	LAR
MgCl₂	1	123	90	119
	10	140	141	56
MnCl₂	1	110	85	72
	10	140	64	30
ZnCl₂	0.1	68	18	90
	1	13	3	120
	10	9	0	6
Ortho-	0.1	64	33	59
vanadat	1	23	6	25
	(μg/ml)
Poly	1	84	97	103
(Glu/Tyr)	10	85	85	97
	100	77	61	96
Poly-L-	1	156	239	123
Lysin	10	172	653	230
	100	192	125	247

Es sollte betont werden, dass das oben genannte Beispiel nicht dazu bestimmt ist, den Umfang der Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken.
14.3. Beurteilung der PTP-Aktivität unter Verwendung der Substrate Raytide oder MBP
Fünf μl 10 × PTP-Puffer (250 mM HEPES, pH-Wert 7,3, 50 mM EDTA, 100 mM Dithiothreitol) werden mit (a) 5 μl ³²P-markiertem Raytide oder MBP (entspricht 10-20 × 10⁴ cpm), b) 5, 10 bzw. 25 μl des Lysats aus PTP-S31D und 293-Zellen oder 0,5, 1 und 5 μl der Suspension des GST-PTP-S31D-Fusionsproteins, das an Glutathion-Sepharoseperlen gebunden ist (vgl. Kapitel 10) und (c) H₂O auf ein Endvolumen von 50 μl gemischt. Die Reaktion wird nach 30 Minuten bei 37 °C gestoppt. Wenn Raytide verwendet wird, wird die Reaktion durch die Zugabe von 0,75 ml azidischer Kohlemischung gestoppt (Krueger et al., EMBO J. 9: 3241-3252 (1990)): 0,9 M HCl, 90 mM Natriumpyrophosphat, 2 mM NaH₂PO₄, 4 % (v/v) Norit A (Sigma)). Nach dem Mischen und Zentrifugieren werden 400 μl des Überstands entfernt und die Menge an Radioaktivität gemessen. Wenn MBP verwendet wird, wird die Reaktion mit 20 % TCA (Endvolumen) gestoppt. Dann wird die Menge an ³²P im Überstand gemessen.
Die Substanzen, die auf ihre modulatorischen Aktivitäten analysiert werden sollen, werden dem Lysat aus PTP-S31 und 293-Zellen 5 Minuten vor Start der Assays zugefügt.
Die oben zitierten Quellenangaben sind alle hier als Bezugsdokumente beigefügt, ob spezifisch beigefügt oder nicht.
Zwar wurde diese Erfindung in Zusammenhang mit ihren spezifischen Ausführungsformen beschrieben, man wird jedoch verstehen, dass sie in der Lage ist, weitere Modifikationen zu erfahren. Diese Anmeldung ist dazu bestimmt, alle Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abzudecken, die dabei im Allgemeinen den Prinzipen der Erfindung folgen, und schließt solche Abweichungen in die vorliegende Offenbarung ein, wie sie unter die bekannte oder gebräuchliche Praxis innerhalb des Fachgebiets fallen, auf das sich die Erfindung bezieht, und wie sie auf die vorgenannten wesentlichen Merkmale angewendet werden können, die wie folgt im Umfang der beigefügten Ansprüche dargestellt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Proteintyrosinphosphatase PTP-S31, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NR. 7, SEQ. ID. NR. 11, SEQ. ID. NR. 15, SEQ. ID. NR. 16, SEQ. ID. NR. 17, SEQ. ID. NR. 18, SEQ. ID. NR. 19, SEQ. ID. NR. 20 oder SEQ. ID. NR. 22.
Proteintyrosinphosphatase nach Anspruch 1, wobei die Proteintyrosinphosphatase rekombinant hergestellt ist.
Proteintyrosinphosphatase nach Anspruch 1, wobei die Proteintyrosinphosphatase glykosyliert ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches Folgendes aufweist: (a) eine Nukleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NR. 7 codiert; oder (b) eine Nukleotidsequenz SEQ. ID. NR. 6; oder (c) eine Nukleotidsequenz, welche eine Proteintyrosinphosphatase nach Anspruch 3 codiert; oder (d) eine Nukleotidsequenz SEQ. ID. NR. 14; oder (e) eine Nukleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NR. 22 codiert; oder (f) eine Nukleotidsequenz SEQ. ID. NR. 21.
Rekombinanter Vektor, umfassend die Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 4(a) oder 4(e).
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4(a) oder 4(e), welches eine Genom-DNA ist.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, wobei die Nukleotidsequenz wirkungsmäßig verbunden ist mit einem Element, welches die Expression der Nukleotidsequenz in einer Wirtszelle steuert.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4(a) oder 4(e).
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 5 oder 7.
Verfahren zum Herstellen von PTP-S31-Proteinen, umfassend: (a) das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 8 oder 9, derart dass das Protein durch die Wirtszelle exprimiert wird; und (b) das Gewinnen des Proteins aus der Kultur.
Verfahren zum Erkennen der Gegenwart eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein normales oder mutiertes PTP-S31-Protein codiert, in einer Probe, welche Nukleinsäuremoleküle enthält, umfassend: (a) das Inkontaktbringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde, welche einen Abschnitt der Aminosäuresequenz SEQ. ID. NR. 7, SEQ. ID. NR. 15, SEQ. ID. NR. 16, SEQ. ID. NR. 17, SEQ. ID. NR. 18, SEQ. ID. NR. 20 oder SEQ. ID. NR. 22 codiert, in einer Lösung, umfassend 6 × SSC, 5 × Denhardts-Lösung und 0,05 % SDS; und (b) das Messen der Hybridisierung der Sonde zu Nukleinsäuremolekülen in der Probe, dadurch Erkennen der Gegenwart des Nukleinsäuremoleküls, welches das normale oder mutierte PTP-S31-Protein codiert.
Verfahren nach Anspruch 11, außerdem umfassend vor Schritt (a): (c) das selektive Amplifizieren der Menge des Nukleinsäuremoleküls, welches das normale oder mutierte PTP-S31-Protein codiert.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche in der Lage ist, an ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein zu binden, in einer Probe, umfassend: (a) das Anhaften eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins nach Anspruch 1-3 an eine/n Festphasenmatrix oder -träger; (b) das Inkontaktbringen der Probe mit dem PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein gebunden an die/den Festphasenmatrix oder -träger, unter Bedingungen, die zulassen, dass sich eine Verbindung an das PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein bindet; und (c) das Erkennen der Gegenwart der Verbindung gebunden an die/den Festphasenmatrix oder -träger.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das humane PTP-S31-Protein- oder -Glykoproteinmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus PTPS31C (SEQ. ID. NR. 7), PTPS31D (SEQ. ID. NR. 11), PTPS31D-63 (SEQ. ID. NR. 15), PTPS31-14 (SEQ. ID. NR. 16), PTPS31-2 (SEQ. ID. NR. 17), PTPS31-5 (SEQ. ID. NR. 18), PTPS31-63 (SEQ. ID. NR. 19), PTPS31-III (SEQ. ID. NR. 20) und PTPS31-RD#2 (SEQ. ID. NR. 22).
Verfahren nach Anspruch 13, ferner umfassend das Wegwaschen jeglichen ungebundenen Materials von der/m Festphasenmatrix oder -träger.
Verfahren des Identifizierens einer Verbindung, welche in der Lage ist, die Phosphataseaktivität von PTP-S31 zu stimulieren oder zu hemmen, umfassend: (a) das Inkontaktbringen der Verbindung mit einem PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein nach Anspruch 1-3, welches die Phosphataseaktivität von PTP-S31 aufweist; (b) das Inkubieren der Mischung aus Schritt (a) für einen ausreichenden Zeitraum um zuzulassen, dass die Verbindung die Phosphataseaktivität von PTP-S31 beeinflusst; (c) das Messen der Phosphataseaktivität des PTP-S31; und (d) das Vergleichen der Phosphataseaktivität mit der des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins inkubiert ohne die Verbindung, dadurch Bestimmung, ob die Verbindung die Phosphataseaktivität von PTP-S31 stimuliert oder hemmt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das humane PTP-S31-Protein- oder -Glykoproteinmolekül PTPS31D (SEQ. ID. NR. 11) ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein in reiner Form, in einem Membranpräparat oder in einer ganzen lebenden oder fixierten Zelle vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Phosphataseaktivität durch Messung des zellulären Phosphotyrosins bestimmt wird.
Verfahren zum Erkennen von PTP-S31 in einer Probe, umfassend: (a) das Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper spezifisch für die Proteintyrosinphosphatase nach Anspruch 1 unter Bedingungen und für eine ausreichende Zeit um zuzulassen, dass sich Antikörper-Antigen-Komplexe bilden; und (b) das Erkennen jeglicher Antikörper-Antigen-Komplexe gebildet in der Probe.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln oder Verhindern einer Krankheit in Zusammenhang mit einem anomalen PTP-S31, wobei die Zusammensetzung einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine therapeutisch wirksame Menge der Proteintyrosinphosphatase nach Anspruch 1-3 umfasst.
Isolierter Antikörper spezifisch für ein humanes Proteintyrosinphosphatase (PTP-S31)-Protein- oder -Glykoproteinmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PTP-931C (SEQ. ID. NR. 7), PTPS31D (SEQ. ID. NR. 11), PTPS31D-63 (SEQ. ID. NR. 15), PTPS31-14 (SEQ. ID. NR. 16), PTPS31-2 (SEQ. ID. NR. 17), PTPS31-5 (SEQ. ID. NR. 18), PTPS31-63 (SEQ. ID. NR. 19), PTPS31-III (SEQ. ID. NR. 20) und PTPS31-RD#2 (SEQ. ID. NR. 22).
Antikörper nach Anspruch 22, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Hybridomzelle, welche den Antikörper nach Anspruch 23 erzeugt.
Verfahren zum Isolieren einer Verbindung, welche in der Lage ist, PTP-S31 zu binden, aus einer chemischen oder biologischen Probe, umfassend: (a) das Inkontaktbringen der Probe mit der Proteintyrosinphosphatase nach Anspruch 1-3 angehaftet an einer Festphasenmatrix unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend sind, dass eine Bindung stattfindet; (b) das Entfernen ungebundener Komponenten; und (c) das Eluieren jeglicher Verbindungen gebunden an das immobilisierte Protein von der Festphase und das Sammeln der eluierten Verbindung.