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1. EINFÜHRUNG
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Die
Erfindung betrifft, auf den Gebieten der Biochemie und der Zell-
und Molekularbiologie, ein neuartiges Proteintyrosinphosphatase-Protein
(PTPase- oder PTP-Protein)
oder -Glykoprotein, genannt PTP-S31, die Verwendung eines solchen
Moleküls
in pharmazeutischen Präparaten
und pharmazeutische Zusammensetzungen, die PTP-S31 oder funktionale
Derivate davon umfassen. Diese Erfindung richtet sich auch auf Nukleinsäuremoleküle, welche
das PTP-S31-Protein oder funktionale Derivate codieren, rekombinante
Expressionsvektoren, die die Nukleinsäuremoleküle tragen, Zellen, die die
rekombinanten Expressionsvektoren enthalten, Verfahren zur Herstellung
und Identifizierung von PTP-S31 oder der dafür codierenden DNA, Antikörper spezifisch
für PTP-S31,
und Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die in der Lage sind,
an die enzymatische Proteintyrosinphosphataseaktivität von PTP-S31
zu binden und sie zu hemmen oder zu stimulieren.
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2. ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Die
Phosphorylierung von Proteinen ist ein grundlegender Mechanismus
zur Regulation verschiedener zellulärer Prozesse. Während der
Großteil
der Proteinphosphorylierung an Serin- und Threoninresten stattfindet,
zieht die Phosphorylierung an Tyrosinresten seit der Entdeckung,
dass viele onkogene Produkte und Wachstumsfaktorrezeptoren intrinsische
Proteintyrosinkinaseaktivität
besitzen, großes
Interesse auf sich. Die Bedeutung der Proteintyrosinphosphorylierung
bei der Wachstumsfaktorsignaltransduktion, der Zellzyklusprogression
und der neoplastischen Transformation ist nun gut belegt (Hunter
et al., Ann. Rev. Biochem. 54: 987-930 (1985), Ullrich et al., Cell
61: 203-212 (1990), Nurse, Nature 344: 503-508 (1990), Cantley et
al., Cell 64: 281-302 (1991)).
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Biochemische
Untersuchungen haben gezeigt, dass die Phosphorylierung an Tyrosinresten
einer Vielzahl zellulärer
Proteine ein dynamischer Prozess ist, der konkurrierende Phosphorylierungs-
und Dephosphorylierungsreaktionen einschließt. Die Regulation von Proteintyrosinphosphorylierung
wird durch die reziproken Wirkungen von Proteintyrosinkinasen (PTKasen
oder PTKs) und Proteintyrosinphosphatasen (PTPs) vermittelt. Die
Tyrosinphosphorylierungsreaktionen werden durch PTKs katalysiert.
Tyrosin-phosphorylierte Proteine können durch die Wirkung von
PTPs spezifisch dephosphoryliert sein. Das Niveau der Proteintyrosinphosphorylierung
intrazellulärer
Substanzen wird durch das Gleichgewicht von PTK- und PTP-Aktivitäten bestimmt. (Hunter,
T., Cell 58: 1013-1016 (1989)).
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2.1. PTKs
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Die
Proteintyrosinkinasen (PTKs; ATP: Protein-Tyrosin-O-Phosphotransferase,
EC 2.7.1.112) sind eine große
Proteinfamilie, die viele Wachstumsfaktorrezeptoren und potentielle
Onkogene enthält.
(Hanks et al., Science 241:42-52 (1988)). Viele PTKs wurden mit
initialen Signalen in Verbindung gebracht, die zur Induktion des
Zellzyklus erforderlich sind (Weaver et al., Mol. and Cell. Biol.
11(9): 4415-4422 (1991)). PTKs umfassen eine diskrete Familie von
Enzymen, die gleicher Herkunft sind wie Serin-/Threonin-spezifische
Proteinkinasen, aber große
Unterschiede zu diesen aufweisen (Hanks et al., supra). Die Mechanismen,
die zu Veränderungen
in der Aktivität
von PTKs führen,
sind im Fall von rezeptorartigen PTKs, die eine Transmembrantopologie
aufweisen, am besten verstanden (Ullrich et al. (1990) supra). Von
dem Binden spezifischer Liganden an die extrazelluläre Domäne von Mitgliedern
der rezeptorartigen PTKs wird gedacht, dass es ihre Oligomerisation
induziert, was zu einem Anstieg der Tyrosinkinaseaktivität und der
Aktivierung der Signaltransduktionswege führt (Ullrich et al., (1990)
supra). Die Deregulation der Kinaseaktivität durch Mutation oder Überexpression
ist ein gut belegter Mechanismus zur Zelltransformation (Hunter
et al., (1985) supra; Ullrich et al., (1990) supra).
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2.2. PTPs
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Die
Proteinphosphatasen bestehen aus mindestens zwei separaten und verschiedenen
Familien (Hunter, T.(1989) supra), den Proteinserin-/threoninphosphatasen
und den Proteintyrosinphosphatasen (PTPs; Proteintyrosinphosphatphosphohydrolase,
EC 3.13.48)). Die PTPs sind eine Proteinfamilie, die in zwei Untergruppen
eingeteilt wurde. Die erste Untergruppe setzt sich aus intrazellulären Enzymen
mit geringem Molekulargewicht zusammen, die eine einzige konservierte
katalytische Phosphatasedomäne
enthalten. Alle bekannten PTPs intrazellulären Typs enthalten eine einzige
konservierte katalytische Phosphatasedomäne. Beispiele für die erste
Gruppe von PTPs beinhalten (1) plazentale PTP 1B (Charbonneau et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5252-5256 (1989); Chernoff et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2735-2789 (1990)), (2) T-Zellen-PTP
(Cool et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5257-5261 (1989)), (3)
Rattenhirn-PTP (Guan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1501-1502
(1990)), (4) neuronale Phosphatase (STEP) (Lombroso et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:7242-7246 (1991)), und (5) zytoplasmatische
Phosphatasen, die eine Homologieregion zu zytoskeletalen Proteinen
enthalten (Guet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5867-57871
(1991); Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5949-5953 (1991)).
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Die
zweite Untergruppe ist aus den rezeptorgebundenen PTPs mit hohem
Molekulargewicht, genannt RPTPs, zusammengesetzt. RPTPs bestehen
aus (a) einer intrazellulären
katalytischen Region, (b) einem einzigen transmembranen Segment,
und (c) einer putativen ligandenbindenden extrazellulären Domäne. Die Strukturen
und Größen der
putativen ligandenbindenden extrazellulären „Rezeptor"-Domänen
von RPTPs sind ziemlich divergent. Dagegen sind die intrazellulären katalytischen
Regionen von RPTPs stark homolog. Alle RPTPs haben zwei tandemartig
duplizierte katalytische Phosphatasehomologiedomänen, mit der prominenten Ausnahme
einer RPTP, genannt HPTPβ,
die nur eine einzige katalytische Phosphatasedomäne hat. (Tsai et al., J. Biol.
Chem. 266: 10534-10543 (1991)).
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Ein
Beispiel für
RPTPs ist eine Proteinfamilie, genannt LCA-Leukozyten (Leucocyte
Common Antigens, LCA) (Ralph, S. J., EMBO J. 6: 1251-1257 (1987)),
die Glykoproteine mit hohem Molekulargewicht sind, die auf der Oberfläche aller
Leukozyten und deren hemopoietischen Vorläuferzellen exprimiert werden
(Thomas, Ann. Rev. Immunol. 7: 339-369 (1989)). Es ist ein bemerkenswerter
Grad an Ähnlichkeit
in den Sequenzen von LCA mehrerer Spezies vorhanden (Charbonneau
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7182-7186 (1988)). Die LCAs
wurden in der Literatur mit verschiedenen Namen bezeichnet, einschließlich T200
(Trowbridge et al., Eur. J. Immunol. 6: 557-562 (1962)), B220 für die B-Lymphozytenform (Coffman
et al., Nature 289: 681-683 (1981)), des allotypischen Mausmarkers
Ly-5 (Komuro et al., Immunogenetics 1: 452-456 (1975)), und in jüngster Zeit
CD45 (Cobbold et al., Leucocyte Typing III, A. J. McMichael et al.,
Hrsg., S. 788-803 (1987)).
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CD45
scheint eine entscheidende Rolle in der Aktivierung der T-Zellen
zu spielen (untersucht in Weiss A., Ann. Rev. Genet. 25: 487-510
(1991)). Zum Beispiel hatten Klone von T-Zellen, die chemisch mutagenisiert und
aufgrund ihres Mangels ausgewählt
wurden, CD45 zu exprimieren, eine gestörte Reaktion auf Rezeptorstimuli
von T-Zellen (Weaver et al., supra).
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Diese
Klone von T-Zellen waren in ihren Reaktionen auf Signale funktionell
fehlerhaft, die durch den Antigenrezeptor der T-Zellen übertragen
wurden, einschließlich
Zytolyse geeigneter Targets, Proliferation und Lymphokinproduktion
(Weaver et al., supra). Andere Untersuchungen weisen darauf hin,
dass die PTP-Aktivität
von CD45 bei der Aktivierung von pp56kk,
einer Lymphozyten-spezifischen PTK, eine Rolle spielt (Mustelin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6302-6306 (1989); Ostergaard
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8959-8963 (1989)). Diese
Autoren stellten die Hypothese auf, dass die Phosphataseaktivität von CD45
pp56kk durch Dephosphorylierung eines C-terminalen
Tyrosinrests aktiviert, welche ihrerseits mit der Aktivierung der T-Zellen
zusammenhängen
kann.
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Ein
anderes Beispiel für
eine RPTP ist das LAR-Molekül
(Leucocyte Common Antigen related Molecule, LAR), das anfänglich als
ein Homolog von LCA identifiziert wurde (Streuli et al., J. Exp.
Med. 168: 1523-1530 (1988)). Obwohl die intrazelluläre katalytische
Region des LAR-Moleküls zwei
katalytische Phosphatasehomologiedomänen (Domäne I und Domäne II) enthält, wiesen
Mutationsanalysen darauf hin, dass nur Domäne I eine katalytische Phosphataseaktivität aufweist,
während
Domäne
II enzymatisch inaktiv ist (Streuli et al., EMBO J. 9(8): 2399-2407
(1990)). Chemisch induzierte LAR-Mutanten,
bei denen das Tyrosin auf der Aminosäureposition 1379 zu einem Phenylalanin
verändert
wurde, waren temperaturempfindlich (Tsai et al., J. Biol. Chem.
266(16): 10534-10543 (1991)).
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Bei
einer unlängst
klonierten Maus-RPTP, die mit mRPTPμ bezeichnet wird, wurde festgestellt,
dass sie eine extrazelluläre
Domäne
hat, die einige strukturelle Motive mit LAR gemeinsam hat. (Gebbink,
M. F. B. G. et al., FEBS Lett. 290: 123-130 (1991). Diese Autoren
klonierten auch einen humanen Homolog von RPTPμ und lokalisierten das Gen auf
dem humanen Chromosom 18.
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Zwei
Drosophila-PTPs, genannt DLAR und DPTP, wurden basierend auf den
Sequenzen von cDNA-Klonen vorhergesagt (Streuli et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86: 8698-8702 (1989)). cDNAs, die für eine andere
Drosophila-RPTP, genannt DPTP 99A, codierten, wurden kloniert und
charakterisiert (Hariharan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
11266-11270 (1991)).
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Andere
Beispiele für
RPTPs beinhalten RPTP-α,
-β, -γ und -ξ. (Krueger
et al., EMBO J. 9: 3241-3252 (1990), Sap et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87: 6112-6116 (1990), Kaplan et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87: 7000-7004 (1990), Jirik et al., FEBS Lett. 273: 239-242
(1990), Mathews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4444-4448
(1990), Ohagi et al., Nucl. Acids Res. 18: 7159 (1990)). Schlessinger,
PCT-Veröffentlichung
WO92/01050 (23. Jan. 1992)
offenbart humane RPTP-α,
-β und -γ, und beschreibt
die Natur der strukturellen Homologien unter den konservierten Domänen dieser
drei RPTPs und anderer Mitglieder dieser Proteinfamilie. Die murine
RPTP-α hat
794 Aminosäuren,
während
die humane RPTP-α 802
Aminosäuren
aufweist. RPTP-α hat
eine intrazelluläre
Domäne,
die zu den katalytischen Domänen
anderer Tyrosinphosphatasen homolog ist. Die extrazelluläre Domäne mit 142
Aminosäuren
(einschließlich
dem Signalpeptid von RPTP-α)
hat einen hohen Serin- und Threoningehalt (32 %) und 8 potentielle
N-Glykosylierungsstellen. Es wurden cDNA-Klone hergestellt, die für RPTP-α codieren,
und RPTP-α wurde
aus eukaryotischen Wirten exprimiert. Northern-Analyse wurde verwendet, um die natürliche Expression
von RPTP-α in
verschiedenen" Zellen
und Geweben zu identifizieren. Ein polyklonaler Antikörper zu
RPTP-α,
hergestellt durch Immunisierung mit einem synthetischen Peptid von
RPTP-α,
identifiziert ein Protein mit 130 kDa in Zellen, die mit einem cDNA-Klon
transfiziert wurden, der einen Abschnitt von RPTP-α codiert.
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Eine
andere RPTP, HePTP (Jirik et al., FASEB J. 4: 82082 (1990) Abstract
2253) wurde durch Screenen einer cDNA-Bank entdeckt, die aus einer
Hepatoblastomzelllinie, HepG2, abgeleitet wurde, mit einer Sonde,
die die beiden PTP-Domänen
von LCA codiert. Das HePTP-Gen schien in einer Vielzahl von humanen
und murinen Zelllinien und Geweben exprimiert zu werden.
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Seit
der ersten Aufreinigung, Sequenzierung und Klonierung von PTP wurden
in rascher Folge weitere potentielle PTPs identifiziert. Die Anzahl
der unterschiedlichen PTPs, die identifiziert wurden, steigt stetig
an, was zu Spekulationen führt,
dass diese Familie ebenso groß sein
könnte
wie die PTK-Familie
(Hunter (1989) supra).
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Konservierte
Aminosäuresequenzen,
als „Consensus-Sequenzen" bezeichnet, wurden
in den katalytischen Domänen
bekannter PTPs identifiziert (Krueger et al., EMBO J. 9: 3241-3252
(1990) und Yi et al., Mol. Cell. Biol. 12: 836-846 (1992), die hier
als Bezugsdokumente beigefügt
sind). Yi et al. ordneten die katalytischen Phosphatasedomänesequenzen
der folgenden PTPs an: LCA, PTP1B, TCPTP, LAR, DLAR und HPTPα, HPTPβ und HPTPγ. Diese Anordnung
beinhaltet die folgenden „Consensus-Sequenzen" (Yi et al., supra, 2(A)):
- 1. K C X X
Y W P [SEQ ID NR.: 1]
- 2. H C S X G X G R X G [SEQ ID NR.: 2]
Krueger
et al. ordneten die katalytischen Phosphatasedomänesequenzen von PTP1B, TCPTP,
LAR, LCA, HPTPα,
-β, -δ, -ε und -ξ, und DLAR
und DPTP an. Diese Anordnung beinhaltet die folgenden „Consensus-Sequenzen": (Krueger et al.,
supra, 7): - 1.
K C X X Y W P [SEQ ID NR.: 1]
- 2. H C S X G X G R X G [SEQ ID NR.: 2]
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Es
wird klar, dass die Dephosphorylierung von Tyrosinresten für sich allein
als wichtiger Regulationsmechanismus fungieren kann. Es hat sich
gezeigt, dass die Dephosphorylierung eines C-terminalen Tyrosinrests
die Tyrosinkinaseaktivität
in der src-Familie
der Tyrosinkinasen aktiviert (Hunter, T. Cell 49: 1-4 (1987)). Es
wurde darauf hingewiesen, dass die Tyrosindephosphorylierung ein
obligatorischer Schritt bei der mitotischen Aktivierung der M-Phase-Förderfaktorkinase (MPF-Kinase)
ist (Morla et al., Cell 58: 193-203 (1989)). Diese Beobachtungen
zeigen die Notwendigkeit für
den Fachmann auf, die Mechanismen zu verstehen, die die Tyrosinphosphataseaktivität regulieren.
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Es
ist klar, dass eine weitere Analyse der Struktur-Funktion-Beziehungen unter den PTPs
benötigt wird,
um die Mechanismen der Signaltransduktion, der Zellzyklusprogression
und des Zellwachstums und der neoplastischen Transformation umfassend
zu verstehen. Ein solches Verständnis
wird auch nützliche
Mittel zur Regulation dieser Prozesse und zur Behandlung von Krankheiten
bereitstellen, die mit deren Fehlfunktion in Zusammenhang steht.
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3. Zusammenfassung DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder beschreiben hier die Identifikation einer neuartigen PTP,
genannt PTP S31. Diese neuartige PTP unterscheidet sich in ihrer
Struktur signifikant von PTPs, über
die zuvor berichtet wurde. Ferner wurden mehrere Varianten dieser
PTP identifiziert. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein PTP-S31-Protein oder
-Glykoprotein bereit, welches eine PTP ist oder strukturelle Merkmale
enthält,
von denen bekannt ist, dass sie in PTPs zu finden sind, sowie Varianten
davon.
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Wenn
ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein der vorliegenden Erfindung
eines ist, das in der Natur vorkommt, ist es im Wesentlichen frei
von anderen Proteinen oder Glykoproteinen, mit denen es nativ assoziiert
ist. Ein im Wesentlichen reines PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein der Erfindung
kann durch biochemische Aufreinigung, durch chemische Mittel oder
durch rekombinante Mittel in einem prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirt hergestellt werden, und wird im Wesentlichen frei von anderen
Proteinen bereitgestellt, mit denen es nativ assoziiert ist. Die
PTP-S31 kann modifizierte Aminosäuren
haben.
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Die
Erfindung richtet sich ferner auf:
- (1) Ein
Fragment eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins;
- (2) ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, das zusätzliche
Aminosäuren
aufweist;
- (3) ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, das substituierte
Aminosäuren
aufweist; und
- (4) ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, das jede Kombination
von deletierten, zusätzlichen
oder substituierten Aminosäuren
aufweist.
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In
allen Fällen
besitzt das modifizierte PTP-S31-Protein
oder -Glykoprotein oder dessen Fragment die gewünschte biologische Aktivität.
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Die
Erfindung richtet sich ferner auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz
umfasst, die ein PTP-S31-Protein gemäß der Erfindung codiert. Das
Nukleinsäuremolekül kann cDNA,
Genom-DNA oder RNA sein. Die Erfindung richtet sich ferner auf ein
Nukleinsäurekonstrukt
in Form eines Expressionsvehikels. Es werden auch prokaryotische
und eukaryotische Wirtszellen bereitgestellt, die das Expressionsvehikel
enthalten.
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Ebenfalls
in der vorliegenden Erfindung enthalten ist ein Prozess zur Herstellung
eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins dieser Erfindung, umfassend:
- (a) das Kultivieren eines Wirts, der in der
Lage ist, ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein unter Kultivierungsbedingungen
zu exprimieren,
- (b) das Exprimieren des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins;
und
- (b) das Gewinnen des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins aus
der Kultur.
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Die
Erfindung richtet sich auch auf einen polyklonalen, monoklonalen
oder chimärischen
Antikörper, spezifisch
für ein
PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, oder für ein Epitop eines PTP-S31-Proteins
oder -Glykoproteins.
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Die
Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zum Erkennen der
Gegenwart von, oder dem Messen der Menge an PTP-S31-Protein oder
-Glykoprotein in einer Probe, bevorzugt einer Zelle oder einer biologischen
Probe eines Probanden, umfassend:
- (a) das Inkontaktbringen
der Probe, wie etwa eines Zellpräparats
oder eines Zellextrakts, mit einem Antikörper spezifisch für ein Epitop
eines PTP-S31-Proteins
oder -Glykoproteins; und
- (b) das Erkennen der Bindung des Antikörpers an Probenmaterial, oder
das Messen der Menge an gebundenem Antikörper,
dadurch Erkennen
der Gegenwart oder das Messen der Menge des PTP-S31-Proteins oder
-Glykoproteins.
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Die
Erfindung richtet sich auch auf ein Verfahren zum Erkennen der Gegenwart
einer Nukleinsäure, die
ein normales oder mutiertes PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein in
einer Probe, bevorzugt einer Zelle oder einer biologischen Probe
eines Probanden, codiert, umfassend:
- (a) das
Inkontaktbringen der Probe, wie etwa einer Zelle oder eines Zellextrakts,
mit einer Oligonukleotidsonde, welche mindestens einen Abschnitt
eines normalen oder mutierten PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins
codiert, unter Hybridisierungsbedingungen; und
- (b) das Messen der Hybridisierung der Sonde zur Nukleinsäure der
Zelle,
dadurch Erkennen der Gegenwart der Nukleinsäure. Die
Nukleinsäure
der Probe kann selektiv amplifiziert werden, zum Beispiel, indem
die Polymerase-Kettenreaktion
vor dem Assay verwendet wird.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auch auf ein Verfahren zum Identifizieren
oder Isolieren einer Probe, bevorzugt einer chemischen oder biologischen
Probe, einer Verbindung, welche in der Lage ist, an ein PTP-S31-Protein
oder -Glykoprotein zu binden, wobei das Verfahren umfasst:
- (a) das Anhaften eines PTP-S31-Proteins oder
-Glykoproteins oder dessen an die Verbindung bindenden Abschnitts
an eine/n Festphasenmatrix oder -träger,
- (b) das Inkontaktbringen der Probe mit PTP-S31 gebunden an die
Festphasenmatrix, wobei zugelassen wird, dass jegliche Verbindung
an PTP-S31 bindet, und das Wegwaschen jeglichen ungebundenen Materials;
- (c) das Erkennen der Gegenwart der Verbindung gebunden an die
Festphase.
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Zum
Zwecke der Isolierung wird die gebundene Verbindung einem zusätzlichen
Schritt des (d) Eluierens der gebundenen Verbindung unterzogen,
wodurch die Verbindung isoliert wird.
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Die
Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Identifizieren eines Molekülstoffs,
der in der Lage ist, die Phosphataseaktivität von PTP-S31 zu stimulieren
oder zu hemmen, umfassend:
- (a) das Inkontaktbringen
des Stoffs mit einem PTP-S31-Protein
oder -Glykoprotein oder einem Proteinfragment, wobei das PTP-S31
in reiner Form, in einem Membranpräparat oder in einer ganzen
lebenden oder fixierten Zelle vorliegt;
- (b) das Inkubieren der Mischung aus Schritt (a) für einen
ausreichenden Zeitraum;
- (c) das Messen der Phosphataseaktivität des PTP-S31;
- (d) das Vergleichen der Phosphataseaktivität mit der des PTP-S31-Proteins
oder -Glykoproteins inkubiert ohne den Stoff,
dadurch
Bestimmung, ob das Mittel die Phosphataseaktivität stimuliert oder hemmt.
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Außerdem stellt
die vorliegende Erfindung Verfahren zum Identifizieren von Agonisten
oder Antagonisten der PTP-S31-Wirkung
bereit, basierend auf der Fähigkeit
solcher Mittel, die Interaktionen zwischen (a) PTP-S31 und dessen
Targetmolekülen
oder (b) PTP-S31 und Molekülen
zu modulieren, die dessen enzymatische Aktivität regulieren. Verbindungen,
die durch solche Verfahren identifiziert wurden, können nützlich sein, um
Krankheiten zu behandeln, die mit der PTP-S31-Fehlfunktion oder mit gestörter Signaltransduktion
assoziiert sind.
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4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 stellt
einen Teil der cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.: 3] und die abgeleitete
Aminosäuresequenz [SEQ
ID NR.: 4] von PTP-S31 dar, die ein PCR-Fragment ist.
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2 zeigt
einen Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des PTP-S31-PCR-Fragments [SEQ
ID NR.: 4], das in 1 gezeigt wird, mit der Aminosäuresequenz
von PTP 1B [SEQ ID NR.: 5] (Chernoff et al., supra). Es wird das
GAP-Verfahren zur Anordnung verwendet (Needleman et al., J. Mol.
Biol. 48: 443-453 (1970))
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3 stellt die cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.:
6] und die abgeleitete Aminosäuresequenz
[SEQ ID NR.: 7] von PTP-S31C
dar, einem cDNA-Klon (1.20.4), der aus einer RD-Zellen-cDNA-Bank erhalten wurde (#1). Dieser
Teil der cDNA-Sequenz beinhaltet die cDNA-Sequenz des PCR-Fragments, das in 1 gezeigt
wird.
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4 zeigt einen Vergleich der abgeleiteten
Aminosäuresequenz
des PTP-S31C-cDNA-Klons, der in 3 gezeigt
wird, mit der Aminosäuresequenz
von PTP 1B. Es wird das GAP-Verfahren zur Anordnung verwendet (Needleman
et al., supra).
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5 stellt die cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.:
8] und die abgeleitete Aminosäuresequenz
[SEQ ID NR.: 9] eines PCR-Fragments dar, das mit den Oligonukleotiden
Nr. 223 und 224 erhalten wurde.
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6 zeigt die kombinierte cDNA-Sequenz [SEQ
ID NR.: 10] und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 11]
von PTP-S31D. Diese cDNA-Sequenz beinhaltet die cDNA-Sequenz des
PCR-Fragments, das in 5 gezeigt wird.
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7 zeigt
einen Vergleich der Aminosäuresequenz
von PTP-S31D und der Sequenz von PTP 1B, der ersten PTP-Domäne von CD45
[SEQ ID NR.: 12] (Ralph et al. EMBO J. 6: 1251-1257 (1987)) bzw.
LAR [SEQ ID NR.: 13] (Streuli et al., J. Exp. Med. 168: 1523-1530
(1988)). Es wurde das Programm CLUSTAL verwendet (Higgins, C. et
al., Multiple Sequence Alignment; CABIOS (1991).
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8 zeigt
die Ergebnisse eines enzymatischen PTP-Assays unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat
(pNP-P) als Substrat.
Die Aktivität
des Glutathion-S-Transferase(GST)/PTP-S31D-Fusionsproteins wird
mit der des GST/PTP-S31C-Fusionsproteins und der Glutathion-S-Transferase verglichen
(Negativkontrolle).
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9 zeigt die cDNA-Sequenz [SEQ ID NR.:
14] und die abgeleitete Aminosäuresequenz
[SEQ ID NR.: 15] des längsten
PTP-S31D-cDNA-Klons (S31D-63), der aus einer cDNA-Bank (#2) isoliert
wurde, die aus humaner Skelettmuskel-mRNA hergestellt wurde. Das
5'-Ende dieses Klons
unterscheidet sich von dem des PTP-S31C-Klons, der aus einer RD-cDNA-Bank (3) isoliert wurde. Ein Pfeil zeigt die
Position an, an der sich dieser Klon von PTP-S31C unterscheidet.
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10 stellt einen schematischen Überblick über die verschiedenen Arten
von PTP-S31-Klonen dar, die in den humanen Skelettmuskel-cDNA-Banken
#2 und #3 identifiziert wurden. Nur die 5'-Enden, die sich von dem PTP-S31C-cDNA-Klon
(3) unterscheiden, sind dargestellt.
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11 zeigt die abgeleiteten Aminosäuresequenzen
der PTP-S31-Varianten, die im human Skelettmuskel gefunden wurden,
einschließlich
S31-14 [SEQ ID NR.: 16), S31-2 (SEQ ID NR.: 17], S31-5 [SEQ ID NR.:
18], S31-63 [SEQ ID NR.: 19] und S31-III [SEQ ID NR.: 20].
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12 zeigt den Teil einer cDNA-Sequenz [SEQ
ID NR.: 21] und die vorhergesagte Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 22]
eines cDNA-Klons, PTPS31-RD#2, der aus einer RD-λ-ZAP-II-cDNA-Bank (Bank #14) isoliert
wurde. Die putative Transmembranregion ist unterstrichen.
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13 zeigt die Anordnung eines Abschnitts der Aminosäuresequenzen
von PTPS31-RD#2 und der Interleukin-2-Rezeptor-β-Kette (SEQ ID NR.: 23). Es
werden nur die Teile der extrazellulären Domänen gezeigt, die neben den
Transmembranregionen liegen.
-
14 zeigt Fibronektin-Typ-III-ähnliche Domänen der extrazellulären Regionen
von PTP-S31. Die am meisten C-terminale
Domäne
wird mit S31-FN-1 gekennzeichnet, und die am meisten N-terminale
Domäne ist
S31-FN-4. Die FN-ähnlichen
Domänen
werden zu einer Domäne
vom Typ III (FN-III benannt) (SEQ ID NR.: 24) des humanen Fibronektins
angeordnet (Kornblihtt et al., EMBO J. 4: 1755-1759 (1985)).
-
15 zeigt eine Anordnung der Aminosäuresequenz
eines Teils der extrazellulären
Region von PTP-S31-RD#2 (in der Figur mit PTP-S31 bezeichnet) mit
dem humanen Insulinrezeptor (IR) (SEQ ID NR.: 25), dem humanen Insulin-ähnlichen
Wachstumsfaktor-1-Rezeptor (IGF1R) (SEQ ID NR.: 26) und dem humanen
Insulin-related Rezeptor (IRR) (SEQ ID NR.: 27).
-
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Durch
die Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren haben die betreffenden
Erfinder eine neuartige Säuger-Proteintyrosinphosphatase
(PTP; EC 3.1.3.48), genannt PTP-S31, humanen Ursprungs und mehrere Derivate
davon identifiziert. Die betreffenden Erfinder haben cDNA-Klone produziert,
die für
das neuartige Protein codieren, und das Protein in E. coli und in
eukaryotischen 293-Zellen exprimiert. Northern-Analyse wurde verwendet,
um die natürliche
Expression des Proteins in verschiedenen Zellen und Geweben zu identifizieren. Ferner
haben sie einen polyklonalen Antikörper zu dem Protein durch Immunisierung
mit einem rekombinanten Fusionsprotein, einschließlich der
PTP-S31-Variante,
PTP-931D, produziert.
-
5.1. Identifikation von Stoffen, welche
die PTP-Aktivität modulieren
-
Das
PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein oder Derivate davon, die eine
Phosphataseaktivität
aufweisen, können zum
Testen von Verbindungen verwendet werden, die in der Lage sind,
die Phosphataseaktivität zu
fördern
oder zu hemmen. Die Fähigkeit
einer zu testenden Verbindung, die Phosphataseaktivität zu modifizieren,
kann in einem In-vitro-System getestet werden, wobei die Testverbindung
einem aufgereinigten PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein oder enzymatisch
aktiven Derivaten davon zugefügt
wird, und wobei die Effekte auf die Enzymaktivität unter Verwendung von enzymologischen
Standardprozeduren gemessen werden, die dem Fachmann gut bekannt
sind.
-
Alternativ
kann die Wirkung einer Verbindung auf die PTP-Aktivität in einem
Ganzzellpräparat
unter Verwendung lebender oder fixierter Zellen oder einer Fraktion
gemessen werden, die aus lebenden oder fixierten Zellen abgeleitet
wurde. Dieses Verfahren ist zum Screenen von Verbindungen nützlich,
die auf das Protein, insbesondere auf den enzymatischen Abschnitt
des Proteins, wirken. Eine Testverbindung wird mit Zellen oder mit
einem daraus abgeleiteten Präparat
inkubiert, die (das) große
Mengen der PTP dieser Erfindung exprimieren (exprimiert), wie etwa
transfizierte COS- oder NIH-3T3-Zellen. Die Menge an zellulärem Phosphotyrosin
wird unter Verwendung von Verfahren gemessen, die dem Fachmann gut
bekannt sind (Honegger et al., Cell 51: 199-209 (1987); Margolis
et al., Cell 51: 1101-1107 (1989)). Die Ergebnisse werden mit Ergebnissen verglichen,
die in Abwesenheit der Testverbindung, oder in Abwesenheit oder
Gegenwart eines bekannten PTP-Aktivators erhalten wurden. In solchen
Untersuchungen kann auch die Wirkung der Testverbindung in Gegenwart
einer Aktivatortyrosinkinase gemessen werden.
-
Eine
Verbindung, die die PTP-Aktivität
stimuliert, führt
zu einer Nettoabnahme der Menge an Phosphotyrosin, während eine
Verbindung, die die PTP- Aktivität hemmt,
zu einen Nettoanstieg der Menge an Phosphotyrosin führen wird.
-
5.2. Behandlung von Krankheiten, die mit
der PTP-Funktion
oder -Fehlfunktion in Zusammenhang stehen
-
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher identifizierter Antagonisten
oder Agonisten in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Behandlung
von Krankheiten oder Zuständen
in Zusammenhang mit anomaler Expression eines PTP-S31-Proteins oder
-Glykoproteins vorgesehen sind. Alternativ können die pharmazeutischen Zusammensetzungen
verwendet werden, um eine Krankheit oder einen Zustand in Zusammenhang
mit normalem PTP-S31 zu behandeln, jedoch mit einer oder mehreren
Defizienzen stromabwärts
im Signaltransduktionsweg oder sogar einem Zustand ohne irgendwelche
stromabwärtigen
Defizienzen. Die Zusammensetzung kann typischerweise in einer Form
zur systemischen oder topischen Injektion oder Infusion vorliegen
und kann, als solche, mit einem geeigneten Träger zur Injektion oder Infusion
formuliert werden.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Verhindern
oder Behandeln von Krankheiten oder Zuständen, an denen die Aktivierung
von PTP-S31 beteiligt ist, wobei das Verfahren die Verabreichung an
einen Patienten, der ihrer bedarf, einer wirksamen Dosierung eines
PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins der Erfindung oder eines Antikörpers der
Erfindung oder eines Moleküls
umfasst, das die Phosphataseaktivität eines PTP-Proteins der Erfindung
stimuliert oder hemmt.
-
Im
Falle der Wachstumsfaktorrezeptoren, die Tyrosinkinasen sind, wie
etwa die Rezeptoren für
den Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) und für den aus Blutplättchen gewonnenen
Wachstumsfaktor (PDGF), ist die Tyrosinphosphorylierung mit dem
Zellwachstum und mit der onkogenen Transformation verbunden. Die Aktivierung
einer PTP, die zu Dephosphorylierung führt, würde als gegenregulatorischer
Mechanismus dienen, um Wachstum zu verhindern oder es zu hemmen,
und könnte
als ein endogener Regulationsmechanismus gegen Krebs dienen. Somit
kann die Mutation oder Regulation dieses Rezeptor/Enzymsystems die
Suszeptibilät gegenüber Krebs
fördern.
-
Der
Insulinrezeptor ist auch eine Tyrosinkinase, und die Phosphorylierung
von Tyrosin in Zellen, die Insulinrezeptoren tragen, stünde in Zusammenhang
mit normaler physiologischer Funktion in Zusammenhang mit Insulin.
Drei spezifische Tyrosinreste im intrazellulären Abschnitt des Insulinrezeptors
sind phosphoryliert, wenn Insulin an die extrazelluläre Domäne bindet.
Gleichzeitig wird der Insulinrezeptor ein aktives Enzym, das sich
selbst oder andere Proteine an Tyrosinresten phosphorylieren kann.
Die Phosphorylierung aller drei spezifischen intrazellulären Tyrosine
des Insulinrezeptors scheint für
die volle Tyrosinkinaseaktivität
erforderlich zu sein. Der voll aktive Insulinrezeptor überträgt das Signal
in die Zelle (wie etwa Skelettmuskelzelle, Leberzelle usw.) durch
Phosphorylierung intrazellulärer
Proteine, die dadurch aktiviert werden, und die Impulse weiter stromabwärts über den
Insulinsignaltransduktionsweg befördern. Somit resultieren die
wohl bekannten physiologischen Effekte von Insulin aus einer Kaskade
von Phosphorylierungsereignissen.
-
Die
Insulinsignaltransduktion wird streng kontrolliert von Enzymen der
PTP-Klasse, die dephosphorylieren, und im Falle des Insulinrezeptors,
Tyrosinkinasen deaktivieren können.
Die Existenz von PTPs mit Aktivität gegenüber dem Insulinrezeptor kann
leicht bewiesen werden. In diesem Setting würde die Aktivierung einer PTP
dann den Insulineffekten entgegenwirken, während die Hemmung der PTPs
den Insulineffekt imitieren sollte. Tatsächlich induziert die Behandlung
ganzer Zellen, wie etwa Skelettmuskelzellen oder Adipozyten mit
Pervanadat, das die PTPs hemmt, eine fast vollständige Insulinreaktion (Fantus,
I. G. et al., Biochemistry 28: 8864-8871 (1989); Leighton, B. et
al., Biochem. J. 276: 289-292 (1989)). Sobald die PTP identifiziert
ist, die spezifisch auf den Insulinrezeptor wirkt, kann sie in einem
hochproduktiven Screeningsystem und zum rationellen Wirkstoffdesign
benutzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die, wie Pervanadat,
die Phosphatase hemmen und die Wirkung von Insulin imitieren.
-
Es
wäre zu
erwarten, dass Überaktivität oder ungeeignete
Aktivierung einer PTP die Wirkung von Insulin auf Zellen hemmt oder
diese komplett verhindert, was zu Diabetes (einer Insulin-resistenten
Abart) führt. Somit
kann die Suszeptibilität
für Diabetes
in Zusammenhang mit PTP-Fehlregulation stehen und kann durch Messen
der PTP-Aktivität,
einschließlich
PTP-S31, diagnostiziert werden.
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Daher
können
die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren normaler
oder mutierter PTP-S31-Gene oder zum Messen der Menge oder Aktivität von PTP-S31
in Zusammenhang mit einer Zelle oder Gewebe, als Verfahren zum Identifizieren
der Suszeptibiliät
gegenüber
Krebs, Diabetes oder anderen Krankheiten in Zusammenhang mit Umbauten
im zellulären
Phosphotyrosinmetabolismus dienen. Außerdem können das PTP-S31-Protein, funktionelle
Derivate davon und Stoffe, die die PTP-S31-Phosphataseaktivität modulieren
(aktivieren oder hemmen), verwendet werden, um der Entwicklung von
Krankheiten, wie etwa Krebs und Diabetes, zu verhindern oder zu
behandeln.
-
5.3. Erkennen und Messen von PTP-S31-Protein
oder -Nukleinsäure
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Bewertung der Gegenwart
und des Niveaus an normalem oder mutiertem PTP-S31 in einem Probanden
bereit. Die Abwesenheit, oder typischer die geringe Expression von
PTP-S31, oder die Gegenwart eines mutierten PTP-S31 in einem Individuum
kann als ein wichtiger Prädiktor
der Suszeptibilität
gegenüber
onkogener Transformation und der Entwicklung von Krebs dienen. Alternativ
kann die Überexpression
von PTP-S31 möglicherweise
aufgrund eines mutierten Rezeptor/Enzymsystems, das gegenüber negativer
Regulation unempfindlich ist, oder aufgrund eines Übermaßes an einem
stimulierenden Faktor, der im Körper
vorhanden ist, als ein wichtiger Prädiktor für die Suszeptibilität gegenüber Diabetes
dienen.
-
Oligonukleotidsonden,
die verschiedene Abschnitte von PTP-S31 codieren (siehe unten),
werden verwendet, um Zellen eines Probanden auf die Gegenwart von
DNA- oder RNA-Sequenzen zu testen, die die PTP codieren. Eine Vorsonde
wäre eine,
die sich auf die Nukleinsäuresequenz
richtet, die mindestens 4 Aminosäurereste
und bevorzugt mindestens 5 Aminosäurereste des PTP-S31-Proteins
oder -Glykoproteins der vorliegenden Erfindung codiert. Qualitative
oder quantitative Assays können
unter Verwendung solcher Sonden durchgeführt werden. Zum Beispiel wird
die Northern-Analyse (vgl. Beispiele unten) verwendet, um die Expression
einer PTP-mRNA in einem Zell- oder Gewebepräparat zu messen.
-
Solche
Verfahren können
sogar, nach der Verwendung selektiver Amplifikationstechniken, mit
sehr geringen Mengen an DNA, erhalten aus einem Individuum, verwendet
werden. Rekombinante DNA-Methodologien, die in der Lage sind, aufgereinigte
Nukleinsäurefragmente
zu amplifizieren, sind schon seit langem bekannt.
-
Typischerweise
schließen
solche Methodologien die Einführung
des Nukleinsäurefragments
in einen DNA- oder RNA-Vektor, die klonale Amplifikation des Vektors
und das Gewinnen des amplifizierten Nukleinsäurefragments ein. Beispiele
für solche
Methodologien werden von Cohen et al. (
US-Patentschrift Nr. 4,237,224 ), Sambrook
et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition,
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) bereitgestellt.
-
Ein
enzymatisches In-vitro-Verfahren, das in der Lage ist, die Konzentration
eines solchen gewünschten
Nukleinsäuremoleküls zu erhöhen, wird
als „Polymerase-Kettenreaktion" (PCR) bezeichnet
(Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273
(1986); Erlich et al.,
EP 50,424 ;
EP 84,796 ,
EP 258,017 ,
EP 237,362 ; Mullis, K.,
EP 201,184 ; Mullis et al.,
US-Patentschrift Nr. 4,683,202 ;
Erlich, H.,
US-Patentschrift Nr.
4,582,788 ; und Saiki et al.,
US-Patentschrift Nr.
4,683,194 ). Die PCR stellt ein Verfahren zur selektiven
Erhöhung
der Konzentration einer bestimmten Nukleinsequenz bereit, sogar
wenn diese Sequenz zuvor nicht aufgereinigt wurde, und nur als Einzelkopie
in einer bestimmten Probe vorhanden ist. Das Verfahren kann verwendet
werden, um entweder einzelsträngige
oder doppelsträngige
DNA zu amplifizieren. Im Wesentlichen schließt das Verfahren die Verwendung
von zwei Oligonukleotidsonden ein, um als Primer für die Template-abhängige, Polymerasevermittelte
Replikation eines gewünschten
Nukleinsäuremoleküls zu dienen.
-
Die
exakte Natur der beiden Oligonukleotidsonden des PCR-Verfahrens
ist für
den Erfolg des Verfahrens entscheidend. Bekanntermaßen besitzt
ein DNA- oder RNA-Molekül Direktionalität, die durch
die 5'-3'-Verbindung des Phosphats
des Moleküls
verliehen wird. DNA- oder RNA-Sequenzen sind durch die Bildung einer
Phosphodiesterbindung zwischen der terminalen 5'- Phosphatgruppe
einer Sequenz und der terminalen 3'-Hydroxylgruppe
einer zweiten Sequenz miteinander verbunden. Die Polymerase-abhängige Amplifikation
eines Nukleinsäuremoleküls erfolgt
durch die Zugabe eines 5'-Nukleotidtriphosphats
zu dem 3'-Hydroxylende
eines Nukleinsäuremoleküls. Somit
verlängert
die Wirkung einer Polymerase das 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls. Diese inhärenten Eigenschaften
werden bei der Auswahl der Oligonukleotidsonden der PCR verwertet.
Die Oligonukleotidsequenzen der PCR-Sonden werden derart ausgewählt, dass
sie Sequenzen enthalten, die identisch mit, oder komplementär zu Sequenzen
sind, welche die bestimmte Nukleinsäuresequenz flankieren, deren
Amplifikation gewünscht
ist.
-
Spezifischer
werden die Oligonukleotidsequenzen der „ersten" Sonde derart ausgewählt, dass sie in der Lage ist,
an eine Oligonukleotidsequenz zu hybridisieren, die 3' zur gewünschten
Sequenz liegt, während die
Oligonukleotidsequenz der „zweiten" Sonde derart ausgewählt ist,
dass sie eine Oligonukleotidsequenz enthält, die identisch mit derjenigen
ist, die 5' zur
gewünschten
Region vorhanden ist. Beide Sonden besitzen 3'-Hydroxygruppen und können daher
als Primer für
die Nukleinsäuresynthese
dienen.
-
In
der PCR werden die Reaktionsbedingungen periodisch zwischen jenen
ausgeführt,
die für
die Hybridisierung und Nukleinsäurepolymerisation
förderlich
sind, und jenen, die zu einer Denaturierung von doppelsträngigen Molekülen führen. In
dem ersten Schritt der Reaktion werden die Nukleinsäuren der
Probe vorübergehend
erhitzt und dann abgekühlt,
um die doppelsträngigen
Moleküle,
die vorhanden sein können,
zu denaturieren. Die „ersten" und „zweiten" Sonden werden der
Probe dann in einer Konzentration zugefügt, die diejenige des gewünschten
Nukleinsäuremoleküls stark übersteigt.
Wenn die Probe unter Bedingungen inkubiert wird, die für die Hybridisierung
und Polymerisation förderlich
sind, wird die „erste" Sonde zu dem Nukleinsäuremolekül der Probe
an einer Position 3' zu
der Sequenz hybridisieren, die amplifiziert werden soll. Wenn das
Nukleinsäuremolekül der Probe
anfangs doppelsträngig
war, wird die „zweite" Sonde zum komplementären Strang
des Nukleinsäuremoleküls an einer
Position 3' zu der
Sequenz hybridisieren, die das Komplement der Sequenz ist, deren
Amplifikation gewünscht
wird. Bei Zugabe einer Polymerase werden die 3'-Enden der „ersten" und (wenn das Nukleinsäuremolekül doppelsträngig war)
der „zweiten" Sonde verlängert sein.
Die Verlängerung
der „ersten" Sonde wird zur Synthese
eines Oligonukleotids führen,
das genau die Sequenz der gewünschten
Nukleinsäure
aufweist. Die Verlängerung
der „zweiten" Sonde wird zur Synthese
eines Oligonukleotids führen,
das genau die Sequenz des Komplements der gewünschten Nukleinsäure aufweist.
-
Die
PCR-Reaktion ist in der Lage, spezifische Nukleinsäuresequenzen
exponentiell zu amplifizieren, weil das Verlängerungsprodukt der „ersten" Sonde notwendigerweise
eine Sequenz enthält,
die zu einer Sequenz der „zweiten" Sonde komplementär ist, und
somit als Template für
die Produktion eines Verlängerungsprodukts
der „zweiten" Sonde dienen kann.
Auf ähnliche
Weise enthält
das Verlängerungsprodukt
der „zweiten" Sonde notwendigerweise
eine Sequenz, die zu einer Sequenz der „ersten" Sonde komplementär ist, und somit als Template
für die
Produktion eines Verlängerungsprodukts
der „ersten" Sonde dienen kann.
Somit kann, indem Polymerisations- und Denaturierungszyklen ermöglicht werden,
ein geometrischer Anstieg der Konzentration des gewünschten
Nukleinsäuremoleküls erreicht
werden. Überblicke über die
PCR werden von Mullis, K. B. (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
51: 263-273 (1986)); Saiki et al., Bio/Technology 3: 1008-1012 (1985));
und Mullis et al., Meth. Enzymol. 155: 335-350 (1987)) bereitgestellt.
-
5.4. PTP-S31-Proteine und funktionelle
Derivate
-
In
einer Ausführungsform
richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein natürlich vorkommendes
Säuger-PTP-S31-Protein oder
-Glykoprotein. In einer anderen Ausführungsform richtet sich die
Erfindung auf ein rekombinantes Säuger-PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein.
Das bevorzugte PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein der vorliegenden
Erfindung ist humanen Ursprungs. Die Erfindung stellt das natürlich vorkommende Molekül bereit,
das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, mit denen es
nativ assoziiert ist. „Im
Wesentlichen frei von anderen Proteinen" zeigt an, dass das Protein zu mindestens
90 Prozent (auf Gewichtsbasis) und wenn gewünscht zu mindestens 99 Prozent
von anderen Proteinen und Glykoproteinen gereinigt wurde, mit denen
es nativ assoziiert ist, und dass es daher im Wesentlichen frei
von ihnen ist. Dies kann erreicht werden, indem Zellen, Gewebe oder
Fluide, die die RPTP enthalten, Standard-Proteinreinigungstechniken unterzogen
werden, wie etwa Immunoadsorptionssäulen, die monoklonale Antikörper tragen,
die gegen das Protein reaktiv sind. Andere Formen der Affinitätsreinigung
können
Festphasensubstrate benutzen, die an die PTP-Domäne binden können, oder einen Liganden,
der an die Rezeptordomäne
binden wird. Alternativ kann die Aufreinigung durch eine Kombination
von Standardverfahren, wie etwa Ammoniumsulfatpräzipitation, Molekularsiebchromatographie
und Ionenaustauschchromatographie, erreicht werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Proteintyrosinphosphatase,
die eine Aminosäuresequenz
aufweist, die PTP-S31 oder mindestens 9 angrenzenden Aminosäuren, stärker bevorzugt
mindestens 10, 15 20 oder 30 angrenzenden Aminosäuren, davon entspricht.
-
Es
versteht sich, dass das Säuger-PTP-S31
der vorliegenden Erfindung biochemisch aus einer Vielzahl von Zell-
oder Gewebezellen aufgereinigt werden kann. Zur Herstellung von
natürlich
vorkommendem PTP-S31 ist Säuger-Skelettmuskel,
insbesondere humanen Ursprungs, bevorzugt.
-
Alternativ
kann, wenn gewünscht,
da das Nukleinsäuremolekül, das PTP-S31
codiert, isoliert oder synthetisiert werden kann, die Proteintyrosinphosphatase
im Wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Glykoproteinen,
mit denen es nativ assoziiert ist, in einem prokaryotischen Organismus
oder in einem eukaryotischen Nicht-Säuger-Organismus synthetisiert werden. Wie
von der vorliegenden Erfindung vorgesehen, ist ein rekombinantes
PTP-S31-Molekül,
das in Säugerzellen,
wie etwa in transfizierten COS-, NIH-3T3-, CHO- oder 293-Zellen usw. produziert
wird, zum Beispiel entweder eine natürlich vorkommende Proteinsequenz
oder ein funktionelles Derivat davon. Wenn ein natürlich vorkommendes
Protein durch rekombinante Mittel produziert wird, wird es im Wesentlichen
frei von den anderen Proteinen und Glykoproteinen bereitgestellt,
mit denen es nativ assoziiert ist.
-
Alternativ
gibt es bekanntermaßen
Verfahren zur Synthese von Polypeptiden der gewünschten Sequenz auf Festphasenträgermaterialien
und deren anschließende
Trennung von dem Trägermaterial.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung „funktionelle
Derivate" von PTP-S31
bereit. Mit „funktionellem
Derivat" ist ein „Fragment", eine „Variante", ein „Analog" oder „chemisches
Derivat" von PTP-S31
gemeint, dessen Modalitäten
unten definiert werden. Ein funktionelles Derivat bewahrt mindestens einen
Abschnitt der Funktion von PTP-S31, wie etwa das Binden an einen
spezifischen Antikörper
oder eine enzymatische Phosphataseaktivität, welche dessen Nützlichkeit
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
-
Ein „Fragment" von PTP-S31 bezieht
sich auf jede Untereinheit des Moleküls, das heilt ein kürzeres Peptid.
Der Begriff „Fragment" wird verwendet,
um ein Polypeptid anzuzeigen, das von einem PTP-S31-Protein abgeleitet
ist, das eine natürlich
vorkommende Proteinsequenz aufweist, indem die DNA-Sequenz, die
das PTP-S31-Protein codiert, auf geeignete Weise modifiziert wird,
was zur Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren
Stellen des C-Terminus,
N-Terminus und innerhalb der nativen Sequenz führt. Fragmente eines PTP-S31-Proteins
oder -Glykoproteins sind für
das Screenen nach Verbindungen nützlich, die
Antagonisten oder Agonisten sind (wie unten definiert). Es versteht
sich, dass solche Fragmente eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins
einen charakterisierende(n) Abschnitt(e) des nativen PTP-S31 bewahren
können.
Insbesondere sollten solche Fragmente eine oder mehrere biologische
Aktivitäten
oder Funktionen bewahren, die für
das intakte PTP-S31-Protein
oder -Glykoprotein charakteristisch sind. Beispiele für PTP-S31-Fragmente,
die nicht dazu bestimmt sind, den Umfang der beanspruchten Erfindung
auf irgendeine Weise zu beschränken,
sind: a) die katalytische Domäne;
b) Regionen des PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins, die mit anderen
Molekülen
in der intakten Zelle interagieren; c) regulatorische Teile von
PTPO-S31.
-
Eine „Variante" von PTP-S31 bezieht
sich auf ein Molekül,
das im Wesentlichen entweder der gesamten Proteintyrosinphosphatase
oder einem Fragment davon ähnlich
ist. Proteintyrosinphosphatasevarianten können bequem durch direkte chemische
Synthese der Proteintyrosinphosphatasevarianten unter Verwendung
von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
-
Alternativ
können
Aminosäuresequenzvarianten
der Proteintyrosinphosphatase durch Mutationen in der DNA hergestellt
werden, die die synthetisierte Proteintyrosinphosphatase codiert.
Solche Varianten beinhalten zum Beispiel Deletionen oder Insertionen
oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz.
Es kann auch jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution
erfolgen, um ein fertiges Konstrukt zu erhalten, unter der Voraussetzung,
dass das fertige Konstrukt die gewünschte Aktivität besitzt.
Offensichtlich müssen
die Mutationen, die in der DNA gemacht werden, die die Proteintyrosinphosphatasevariante codiert,
den Leserahmen nicht abändern
und werden bevorzugt keine komplementären Regionen erzeugen, die
sekundäre
mRNA-Struktur produzieren
könnten
(vgl. Europäische
Patentveröffentlichung
Nr.
EP 75,444 ).
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein PTP-S31-Protein oder
-Glykoprotein bereit, das zusätzliche
Aminosäuren
aufweist, das von einem natürlich
vorkommenden PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein abgeleitet ist,
indem die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, auf geeignete Weise
modifiziert wird, was zur Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an
einer oder mehreren Stellen des C-Terminus, N-Terminus und innerhalb
der nativen Sequenz führt.
Es versteht sich, dass ein solches PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein, das
zusätzliche
Aminosäuren
aufweist, einen charakterisierende(n) Abschnitt(e) des nativen PTP-S31
bewahren kann (können).
Insbesondere sollte solch ein PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein
mit zusätzlichen
Aminosäuren
eine oder mehrere biologische Aktivitäten oder Funktionen bewahren,
die charakteristisch für
das PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein sind, wobei Beispiele hierfür beinhalten:
(a) die katalytische Aktivität;
(b) die Substratspezifität;
(c) Interaktion mit anderen Molekülen in der intakten Zelle;
(d) regulatorische Funktionen. Diese Beispiele sind nicht dazu bestimmt,
den Umfang der beanspruchten Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken.
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein PTP-S31-Protein oder
-Glykoprotein bereit, das substituierte Aminosäuren aufweist, die von einem
natürlich
vorkommenden PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein abgeleitet sind,
indem die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, auf geeignete Weise
modifiziert oder mutiert wird, was zur Substitution einer oder mehrerer
Aminosäuren
an einer oder mehreren Stellen des C-Terminus, N-Terminus und innerhalb
der nativen Sequenz führt.
Es versteht sich, dass solch ein Protein, das substituierte Aminosäuren aufweist,
(einen) charakteristische(n) Abschnitt(e) von PTP-S31 bewahren kann,
und bevorzugt eine oder mehrere biologische Aktivitäten oder
Funktionen bewahren sollte, die für das intakte PTP-S31-Protein
oder -Glykoprotein charakteristisch sind, zum Beispiel: (a) die
katalytische Aktivität;
(b) die Substratspezifität;
(c) Interaktion mit anderen Molekülen in der intakten Zelle;
(d) regulatorische Funktionen. Diese Beispiele sind nicht dazu bestimmt,
den Umfang der beanspruchten Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken.
-
Es
kann auch jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution
erfolgen, um ein fertiges Konstrukt eines funktionellen PTP-S31-Derivats
zu erhalten, unter der Voraussetzung, dass das fertige Konstrukt die
gewünschte
Aktivität
oder Funktion besitzt, die in dem intakten PTP-S31-Protein oder
-Glykoprotein vorhanden ist, zum Beispiel: (a) die katalytische
Aktivität;
(b) Substratspezifität;
(c) Interaktion mit anderen Molekülen in vitro und in vivo; (d)
regulatorische Funktionen. Es muss nur eine dieser Aktivitäten oder
Funktionen nach jeder Kombination aus Deletion, Insertion und Substitution
bewahrt werden. Diese Beispiele sind nicht dazu bestimmt, den Umfang
der beanspruchten Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken. Offensichtlich
müssen
die Modifikationen oder Mutationen, die in der DNA gemacht werden,
die das PTP-S31-Protein codiert, den Leserahmen nicht abändern und
werden bevorzugt keine komplementären Regionen erzeugen, die
sekundäre
mRNA-Struktur produzieren könnten
(vgl. Europäische
Patentveröffentlichung
Nr.
EP 75,444 ). Auf genetischem
Niveau werden diese Varianten gewöhnlich durch ortsgerichtete
Mutagenese (wie von Adelman et al., DNA 2: 183 (1983) beispielhaft
dargestellt) von Nukleotiden in der DNA hergestellt, die das Peptidmolekül codiert,
wodurch DNA produziert wird, die die Variante codiert, und anschließendes Exprimieren
der DNA in rekombinanten Zellkulturen (vgl. unten). Die Varianten
weisen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität auf wie
das invariante Peptid.
-
Ein „Analog" von PTP-S31 bezieht
sich auf ein nicht natürliches
Molekül,
das im Wesentlichen entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon ähnlich ist.
-
Ein „chemisches
Derivat" von PTP-S31
enthält
zusätzliche
chemische Komponenten, die normalerweise kein Teil der Proteintyrosinphosphatase
sind. Kovalente Modifikationen der Proteintyrosinphosphatase sind
im Umfang dieser Erfindung enthalten. Solche Modifikationen können in
das Molekül
eingeführt
werden, indem gerichtete Aminosäurereste
des Peptids mit einem organischen derivatisierenden Stoff reagiert
werden, der in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen
Resten zu reagieren.
-
Cysteinylreste
werden üblicherweise
mit α-Haloacetaten
(und entsprechenden Aminen), wie etwa Chloressigsäure oder
Chloracetamid, reagiert, um Carboxymethyl oder Carboxyamidomethylderivate
zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat,
N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid,
p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol
derivatisiert.
-
Histidylreste
werden durch Reaktion mit Diethylprocarbonat bei einem pH-Wert von
5,5-7,0 derivatisiert, da dieser Stoff relativ spezifisch für die Histidylseitenkette
ist. Para-Bromphenacylbromid ist auch nützlich; die Reaktion wird bevorzugt
in 0,1 M Natriumcacodylat bei einem pH-Wert von 6,0 durchgeführt.
-
Lysinyl
und Amino-Terminusreste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden
reagiert. Die Derivatisierung mit diesen Stoffen hat die Wirkung,
die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien
zur Derivatisierung α-Amino-enthaltender
Reste beinhalten Imidoester, wie etwa Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat;
Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzensulfonsäure; O-Methylisourea; 2,4-Pentandion; und Transaminasekatalysierte
Reaktion mit Glyoxylat.
-
Arginylreste
werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen
Reagenzien, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion
und Ninhydrin modifiziert. Die Derivatisierung der Argininreste
erfordert, dass die Reaktion aufgrund des hohen pK9-Werts
der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird.
Zudem können
diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie mit der Arginin-ε-Aminogruppe
reagieren.
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Tyrosylreste
sind gut bekannte Stellen für
die chemische Modifikation, insbesondere zur Einführung spektraler
Marker in Tyrosylreste, durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen
oder Tetranitromethan. Üblicherweise
werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies
bzw. 3-Nitroderivate zu bilden.
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Carboxylseitengruppen
(Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R'), wie etwa 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)carbodiimid
oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid
modifiziert. Zudem werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion
mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
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Glutaminyl-
und Asparaginylreste werden häufig
zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten entamidiert.
Alternativ werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen entamidiert.
Jede Form dieser Reste gehört
zum Umfang dieser Erfindung.
-
Die
Derivatisierung mit bifunktionellen Stoffen ist für die Vernetzung
des Peptids zu einer wasserunlöslichen
Trägermatrix
oder anderen makromolekularen Trägern
nützlich. Üblicherweise
verwendete Vernetzungsmittel beinhalten z. B. 1-1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan,
Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, zum Beispiel Ester mit
4-Azidosalicylsäure,
homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie
etwa 3,3''-Dithiobis(succinimidylpropionat)
und bifunktionelle Maleimide, wie etwa bis-N-Maleimido-1,8-octan. Derivatisierende
Stoffe, wie etwa Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat-Zwischenprodukte,
die in der Lage sind, Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden.
Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrizen, wie etwa Cyanbromid-aktivierte
Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den
US-Patentschriften
Nr. 3,969,287 ;
3,691,016 ;
4,195,128 ;
4,247,642 ,
4,229,537 ; und
4,330,440 beschrieben werden, zur Proteinimmobilisierung
benutzt.
-
Andere
Modifikationen beinhalten die Hydroxylierung von Prolin und Lysin,
die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten,
die Methylierung der α-Aminogruppen
von Lysin-, Arginin- und
Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule
Properties, W. H. Freeman & Co., Francisco,
pp. 79-86 (1983)), die Acetylierung der N-terminalen und, in einigen Fällen, die
Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
-
Solche
derivatisierten Komponenten können
die Löslichkeit,
die Absorption, die biologische Halbwertszeit usw. verbessern. Die
Komponenten können
alternativ alle unerwünschten
Nebeneffekte des Proteins usw. eliminieren oder dämpfen. Komponenten,
die in der Lage sind, solche Effekte zu vermitteln, sind zum Beispiel
in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16. Aufl., Hack Publishing Co., Easton, PA. (1980) offenbart.
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5.5. Chimärische PTP-S31-Moleküle
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung so genannte chimärische Moleküle bereit,
die aus anderen PTPs bestehen, bei denen eine oder mehrere spezifische
Aminosäuresequenzen
mit homologer (homologen) Sequenz(en) aus einem anderen PTP-Protein
oder -Glykoprotein ersetzt ist (sind). Die chimärischen Moleküle können zum
Beispiel ein rezeptorartiges PTP-(RPTP)-Protein
oder -Glykoprotein beinhalten, das eine ligandenbindende extrazelluläre Domäne aufweist,
die auf einen Abschnitt eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins
gepfropft ist. Andere chimärische
Moleküle,
die im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten sind, beinhalten
PTPs, bei denen die katalytische Phosphatasedomäne mit der Phosphatasedomäne von PTP-S31
ersetzt wurde. In diesem Fall liegt die bevorzugte Anzahl an Aminosäuren zwischen
220 und 260.
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„Homologe
Sequenzen" sind
als Sequenzen in zwei oder mehreren PTPs definiert, die in der primären Sequenz ähnlich positioniert
sind, und die Sequenzhomologie aufweisen können. Es sollte betont werden, dass „homologe
Sequenzen" nicht
auf Fälle
mit einem hohen Grad an Homologie beschränkt werden sollte. Chimärische Moleküle sind
wichtige Werkzeuge zur Aufklärung
von Struktur-Funktion-Beziehungen und zum Identifizieren spezifischer
Verbindungen (Wirkstoffe). Daher sind die nützlichsten Chimären häufig aber
nicht immer Moleküle,
bei denen ein bestimmter Abschnitt eines Moleküls durch die ähnlich positionierte,
aber divergente Sequenz eines anderen, ansonsten homologen Moleküls ersetzt
wurde. Somit werden die ausgetauschten Abschnitte ziemlich oft die
Teile der Moleküle
repräsentieren,
in denen sie sich am meisten unterscheiden.
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5.6. Antikörper spezifisch für PTP-S31
und deren Verwendung beim Erkennen oder Messen von PTP-S31
-
Diese
Erfindung richtet sich auch auf einen Antikörper spezifisch für ein Epitop
eines PTP-S31-Proteins oder -Glykoproteins, am stärksten bevorzugt
von humanem PTP-S31,
und die Verwendung eines solchen Antikörpers, um die Gegenwart oder
die Menge oder Konzentration an PTP-S31-Protein oder -Glykoprotein in einer
Zelle, einem Zell- oder Gewebeextrakt oder einem biologischen Fluid
zu messen.
-
Der
Begriff „Antikörper" soll polyklonale
Antikörper,
monoklonale Antikörper
(mAbs), chimärische
Antikörper
und anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper beinhalten.
-
Polyklonale
Antikörper
sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren abgeleitet
sind, die mit einem Antigen immunisiert wurden.
-
Monoklonale
Antikörper
sind eine im Wesentlichen homogene Population von Antikörpern zu
spezifischen Antigenen. MAbs können
durch Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Vgl. zum Beispiel Kohler und Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)
und die
US-Patentschrift Nr. 4,376,110 .
Solche Antikörper
können
von jeder Immunoglobulinklasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA und
IgD, und jeder Unterklasse davon. Das Hybridom, das den mAbs dieser
Erfindung produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden.
Die Produktion der hohen Titer an mAbs in der In-vivo-Produktion
macht dies zum derzeit bevorzugten Produktionsverfahren. Kurz gesagt,
werden Zellen aus den einzelnen Hybridomzellen intraperitoneal in
Pristan-geprimte BALB/c-Mäuse
injiziert, um Aszitesfluid mit hohen Konzentrationen des gewünschten
mAbs zu produzieren. MAbs des Isotyps IgM oder IgG kann aus solchen
Aszitesfluiden oder aus Kulturüberständen unter
Verwendung von Säulenchromatographieverfahren,
die dem Fachmann gut bekannt sind, auf gereinigt werden.
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Chimärische Antikörper sind
Moleküle,
von denen unterschiedliche Abschnitte von unterschiedlichen Tierspezies
abgeleitet sind, wie etwa jene, die eine variable Region aufweisen,
die von einem murinen mAb und einer humanen konstanten Immunoglobulinregion
abgeleitet ist. Chimärische
Antikörper
und Verfahren zu deren Produktion sind dem Fachmann bekannt (Cabilly
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature
312: 643-646 (1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985);
Taniguchi et al.,
Europäische Patentanmeldung
171496 (19. Feb. 1985); Morrison et al.,
Europäische
Patentanmeldung 173494 (5. März 1986); Neuberger et al., PCT-Anmeldung
WO86/01533 (13. März 1986);
Kudo et al.,
Europäische Patentanmeldung
184187 , veröffentlicht
am 11. Jun. 1986); Morrison et al.,
Europäische Patentanmeldung
173494 (veröffentlicht
am 5. März 1986);
Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al.,
Internationale Patentveröffentlichung
#PCT/
US86/02269 (veröffentlicht
am 7. Mai 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987);
Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Retter
et al., Science 240: 1041-1043 (1988)).
-
Ein
anti-idiotypischer (anti-Id) Antikörper ist ein Antikörper, der
einzelne Determinanten erkennt, die im Allgemeinen mit der Antigen-Bindungsstelle
eines Antikörpers
assoziiert sind. Ein anti-Id-Antikörper kann hergestellt werden,
indem ein Tier gleicher Spezies und gleichen genetischen Typs (z.
B. Mausstamm) als Quelle des mAb mit dem mAb immunisiert wird, gegen
den ein anti-Id-Antikörper
hergestellt werden soll. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen
Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und auf sie
reagieren, indem ein Antikörper
zu diesen idiotypischen Determinanten (der anti-Id-Antikörper) produziert
wird.
-
Der
anti-Id-Antikörper
kann auch als „Immunogen" verwendet werden,
um eine Immunantwort in einem weiteren Tier zu induzieren, das einen
so genannten anti-anti-Id-Antikörper
produziert. Der anti-anti-Id kann epitopisch mit dem originalen
mAb identisch sein, der den anti-Id induziert. Somit ist es möglich, indem Antikörper gegen
die idiotypischen Determinanten eines mAb verwendet werden, andere
Klone zu identifizieren, die Antikörper mit identischer Spezifität exprimieren.
-
Dementsprechend
kann mAbs, der gegen PTP-S31 generiert wurde, verwendet werden,
um anti-Id-Antikörper
in geeignete Tiere, wie etwa BALB/c-Mäuse, zu induzieren. Milzzellen
solcher immunisierter Mäuse
werden verwendet, um anti-Id-Hybridomzellen zu produzieren, die
anti-Id-mAbs sekretieren. Ferner kann der anti-Id-mAbs an einen Träger, wie
etwa Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), gekoppelt sein, und verwendet
werden, um zusätzliche
BALG/c-Mäuse
zu immunisieren. Seren von diesen Mäusen werden anti-anti-Id-Antikörper enthalten,
die die Bindungseigenschaften des fertigen mAb haben, der für ein PTP-S31-Epitop spezifisch
ist.
-
Die
anti-Id-mAbs haben somit ihre idiotypischen Epitope, oder „Idiotope", die strukturell
dem Epitop ähnlich
sind, das bewertet wird, wie etwa PTP-S31.
-
Der
Begriff „Antikörper" soll auch sowohl
intakte Moleküle
als auch Fragmente davon, wie zum Beispiel Fab und F(ab')2 beinhalten,
die in der Lage sind, Antigen zu binden. Fab- und F(ab')2-Fragmenten
fehlt das Fc-Fragment
des intakten Antikörpers,
sie werden schneller aus dem Blutkreislauf ausgeschieden und können weniger
nichtspezifische Gewebebindung haben als ein intakter Antikörper (Wahl
et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).
-
Man
wird zu schätzen
wissen, dass Fab und F(ab')2 und andere Fragmente der Antikörper, die
in der vorliegenden Erfindung nützlich
sind, zum Erkennen und der Quantifizierung von PTP-S31 gemäß den Verfahren
verwendet werden können,
die hier für
intakte Antikörpermoleküle offenbart
werden. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische
Spaltung produziert, unter Verwendung von Enzymen, wie etwa Papain
(um Fab-Fragmente zu produzieren) oder Pepsin (um F(ab')2-Fragmente
zu produzieren).
-
Ein
Antikörper
wird als „in
der Lage", ein Molekül „zu binden" bezeichnet, wenn
er in der Lage ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren, um dadurch
das Molekül
an den Antikörper
zu binden. Der Begriff „Epitop" soll sich auf den
Abschnitt jedes Moleküls
beziehen, der in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, der
auch durch diesen Antikörper
erkannt werden kann. Die Epitope oder „antigenen Determinanten" bestehen üblicherweise
aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen
von Molekülen,
wie etwa Aminosäuren
oder Zuckerseitenketten, und haben spezifische dreidimensionale
strukturelle Charakteristika sowie spezifische Ladungscharakteristika.
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Ein „Antigen" ist ein Molekül oder ein
Abschnitt eines Moleküls,
das in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, das
zusätzlich
in der Lage ist, ein Tier zu induzieren, einen Antikörper zu
produzieren, der in der Lage ist, an ein Epitop dieses Antigens
zu binden. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop haben.
Die spezifische Reaktion, auf die oben Bezug genommen wird, soll
anzeigen, dass das Antigen in hochselektiver Weise mit seinem entsprechenden
Antikörper
reagieren wird, und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die
durch andere Antigene evoziert sein können.
-
Die
Antikörper
oder Fragmente von Antikörpern,
die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können verwendet
werden, um quantitativ die Gegenwart von Zellen zu erkennen, die
PTP-S31 exprimieren. Dies kann durch Immunofluoreszenztechniken
erreicht werden, bei denen ein fluoreszierend markierter Antikörper (vgl.
unten) mit lichtmikroskopischem, durchflusszytometrischem oder fluorimetrischem
Erkennen gekoppelt wird.
-
Die
Antikörper
(oder Fragmente davon), die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
können
histologisch, wie bei der Immunofluoreszenz der Immunoelektronenmikroskopie
für das
In-situ-Erkennen von PTP-S31 benutzt werden. Das In-situ-Erkennen
kann durch das Entfernen eines histologischen Spezimens aus einem
Patienten und durch das Bereitstellen eines markierten Antikörpers der
vorliegenden Erfindung für ein
solches Spezimen erreicht werden. Der Antikörper (oder das Fragment) wird
bevorzugt bereitgestellt, indem der markierte Antikörper (oder
das Fragment) auf eine biologische Probe aufgebracht oder überschichtet wird.
Durch die Verwendung einer solchen Prozedur ist es möglich, nicht
nur die Gegenwart der PTP sondern auch ihre Verteilung auf dem untersuchten
Gewebe zu bestimmen. Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung
wird der Durchschnittsfachmann schnell verstehen, dass jedes einer
großen
Vielzahl histologischer Verfahren (wie etwa Färbeprozeduren) modifiziert
werden kann, um ein solches In-situ-Erkennen zu erreichen. Solche Assays
für PTP-S31
umfassen typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe,
wie etwa ein biologisches Fluid, eine Gewebeextrakt, frisch entnommene
Zellen, wie etwa Lymphozyten oder Leukozyten, oder Zellen, die in
Gewebekultur in Gegenwart eines nachweisbaren markierten Antikörpers inkubiert
wurden, der in der Lage ist, PTP-S31 zu identifizieren, und das
Erkennen des Antikörpers
durch jede einer Anzahl von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt
sind.
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Die
biologische Probe kann mit einem Festphasenträgermaterial, wie etwa Nitrocellulose
oder einem anderen festen Trägermaterial
behandelt werden, das in der Lage ist, Zellen, Zellteilchen oder
lösliche
Proteine zu immobilisieren. Das Trägermaterial kann dann mit geeigneten
Puffern gewaschen werden, gefolgt von einer Behandlung mit dem nachweisbaren
markierten PTP-S31-spezifischen Antikörper. Das Festphasenträgermaterial
kann dann ein zweites Mal mit dem Puffer gewaschen werden, um ungebundene
Antikörper
zu entfernen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem festen
Trägermaterial
kann dann durch herkömmliche
Mittel erkannt werden.
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Unter „Festphasenträgermaterial" ist jedes Trägermaterial
zu verstehen, das in der Lage ist, Antigen oder Antikörper zu
binden. Gut bekannte Trägermaterialien
oder Träger
beinhalten Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran,
Nylon, Amylasen, natürliche
und modifiziert Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit.
Die Natur der Träger
kann für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder bis zu einem gewissen
Umfang löslich
oder unlöslich
sein. Das Trägermaterial
kann tatsächlich
jede mögliche
strukturelle Konfiguration haben, solange das gekoppelte Molekül in der
Lage ist, an ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Somit kann
die Trägermaterialkonfiguration
kugelförmig
sein, wie bei einer Perle, oder zylindrisch, wie die Innenfläche eines
Reagenzglases oder die Außenfläche eines
Stäbchens.
Alternativ kann die Oberfläche flach
wie ein Blatt, Teststreifen usw. sein. Bevorzugte Trägermaterialien
beinhalten Polystyrolperlen. Fachleute werden viele andere geeignete
Träger
zum Binden von Antikörper
oder Antigen kennen oder werden in der Lage sein, denselben durch
die Verwendung von Routineversuchen zu ermitteln.
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Die
Bindungsaktivität
einer gegebenen Charge an anti-PTP-S31-Antikörper kann
gemäß gut bekannter
Verfahren bestimmt werden. Fachleute werden in der Lage sein, operative
und optimale Assaybedingungen für
jede Bestimmung durch die Nutzung von Routineversuchen zu bestimmen.
-
Andere
solche Schritte, wie Waschen, Rühren,
Schütteln,
Filtern usw. können
den Assays zugefügt werden,
je nach dem, wie es für
die besondere Situation gebräuchlich
oder notwendig ist.
-
Einer
der Wege, mit denen der PTP-S31-spezifische Antikörper nachweisbar
markiert werden kann, ist durch Verbinden desselben mit einem Enzym
und die Verwendung in einem Enzym-Immunoassay (EIA). Dieses Enzym
wird seinerseits, wenn es später
einem geeigneten Substrat ausgesetzt wird, mit dem Substrat auf
eine solche Weise reagieren, dass es eine chemische Komponente produziert,
die zum Beispiel durch spektrophotometrische, fluorimetrische oder
durch visuelle Mittel erkannt werden kann. Enzyme, die verwendet
werden können,
um den Antikörper
nachweisbar zu markieren, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Malatdehydrogenase,
Staphylokokkennuclease, Delta-5-Steroidisomerase,
Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, α-Glycerophosphatdehydrogenase,
Triosephosphatisomerase, Merrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase,
Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase,
Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase
und Acetylcholinesterase. Das Erkennen wird durch kalorimetrische
Verfahren erreicht, die ein chromogenes Substrat für das Enzym
verwenden. Das Erkennen kann auch durch Sichtvergleich des Umfangs
der enzymatischen Reaktion des Substrats im Vergleich zu ähnlich hergestellten Standards
erreicht werden.
-
Das
Erkennen kann unter Verwendung jeder einer Vielzahl anderer Immunoassays
erreicht werden. Zum Beispiel ist es möglich, durch radioaktive Markierung
der Antikörper
oder Antikörperfragmente,
RPTP durch die Verwendung eines Radioimmunoassays (RIA) zu erkennen
(vgl. zum Beispiel Work, T. S. et al., Laboratory Techniques and
Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company,
New York, 1978). Das radioaktive Isotop kann durch solche Mittel,
wie etwa die Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder
durch Autoradiographie erkannt werden.
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Es
ist auch möglich,
den Antikörper
mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszent
markierte Antikörper
Licht einer passenden Wellenlänge
ausgesetzt wird, kann seine Gegenwart aufgrund der Fluoreszenz erkannt
werden. Zu den üblicherweise
zur Fluoreszenzmarkierung verwendeten Verbindungen gehören Fluorescinisothiocyanat,
Rhodamin, Phyoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
-
Der
Antikörper
kann auch unter Verwendung von fluoreszenzemittierenden Metallen,
wie etwa 152Eu oder anderer aus der Lanthanidgruppe
nachweisbar markiert werden. Diese Metalle können an den Antikörper unter
Verwendung solcher Metallchelatgruppen, wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)
oder Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA) angehaftet werden.
-
Der
Antikörper
kann auch durch Ankoppeln an eine chemilumineszierende Verbindung
nachweisbar markiert werden. Die Gegenwart des chemilumineszierend
markierten Antikörpers
wird bestimmt, indem die Gegenwart von Lumineszenz erkannt wird,
die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele für besonders
nützliche
chemilumineszierende Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol,
thermoaromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und
Oxalatester.
-
Gleichermaßen kann
auch eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der
vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art
der Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen anzutreffen ist,
in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten
Reaktion verstärkt.
Die Gegenwart eines biolumineszenten Proteins wird durch Erkennen
der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszente
Verbindungen zum Zweck der Markierung sind Luciferin, Luciferase
und Aequorin.
-
Die
Antikörpermoleküle der vorliegenden
Erfindung können
für die
Nutzung in einem immunometrischen Assay angepasst werden, der auch
als „Two-site"- oder „Sandwich"-Assay bekannt ist.
In einem typischen immunometrischen Assay wird eine Menge an unmarkiertem
Antikörper
(oder Antikörperfragment)
an ein festes Trägermaterial
gebunden und eine Menge an nachweisbar markiertem löslichem
Antikörper
wird zugefügt,
um das Erkennen und/oder die Quantifizierung des ternären Komplexes
zu ermöglichen,
der sich zwischen dem Festphasenantikörper, dem Antigen und dem markierten
Antikörper
gebildet hat.
-
Typische
und bevorzugte immunometrische Assays beinhalten „Vorwärts"-Assays, in denen
der Antikörper,
der an eine feste Phase gebunden ist, zuerst mit der zu testenden
Probe in Kontakt gebracht wird, um das Antigen aus der Probe durch
Bildung eines binären
Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes
zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird das feste
Trägermaterial
gewaschen, um den Rest der Fluidprobe zu entfernen, einschließlich des
gegebenenfalls nicht gebundenen Antigens, und dann mit der Lösung in
Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Antikörper (der
als „Reporter-Molekül" dient) enthält. Nach
einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten Antikörpern erlaubt,
durch den unmarkierten Antikörper
mit dem an das feste Trägermaterial
gebundene Antigen zu komplexieren, wird das feste Trägermaterial
ein zweites Mal gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben,
zu entfernen.
-
In
einer anderen Art von „Sandwich"-Assay, der für die Antigene
der vorliegenden Erfindung auch nützlich sein kann, werden so
genannte „simultane" und „reverse" Assays verwendet.
Ein simultaner Assay schließt einen
einzigen Inkubationsschritt ein, da beide, der Antikörper, der
an das feste Trägermaterial
gebunden ist, und der markierte Antikörper, der Probe zugeführt werden
und dabei gleichzeitig getestet werden. Nach Abschluss der Inkubation
wird das feste Trägermaterial gewaschen,
um den Rest der Fluidprobe und des nicht komplexierten markierten
Antikörpers
zu entfernen. Die Gegenwart von markiertem Antikörper, der mit dem festen Trägermaterial
assoziiert ist, wird dann genauso bestimmt, wie beim herkömmlichen „Vorwärts"-Sandwich-Assay.
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Beim „reversen" Assay wird die schrittweise
Zugabe zunächst
einer Lösung
des markierten Antikörpers
zur Fluidprobe, gefolgt von der Zugabe von unmarkiertem Antikörper, der
an ein festes Trägermaterial
gebunden ist, nach einer geeigneten Inkubationszeit, verwendet.
Nach einer zweiten Inkubation wird die Festphase auf herkömmliche
Weise gewaschen, um sie von den Resten der zu testenden Probe und
der Lösung aus
markiertem Antikörper,
der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten
Antikörpers,
der mit einem festen Trägermaterial
assoziiert ist, wird dann genauso bestimmt wie im „simultanen" Assay und im „Vorwärts"-Assay.
-
Die
Gegenwart eines normal funktionierenden PTP-S31 in einem Probanden
kann auch unter Verwendung direkter enzymatischer Assays, bevorzugt
für die
Tyrosinphosphataseaktivität,
getestet werden. Solche biochemischen Messungen können in
vitro unter Verwendung gereinigter Enzyme, die das exakte Messen
der Enzymaktivität
zulassen, oder mit Membranpräparaten
oder ganzen Zellen durchgeführt
werden, in denen das Netto-Phosphotyrosinniveau bestimmt wird.
-
5.7. Nukleinsäuremoleküle, die PTP-S31 codieren
-
In
zusätzlichen
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden eine DNA-Sequenz, die ein PTP-S31-Molekül codiert,
und Verfahren zum Exprimieren der DNA-Sequenz bereitgestellt. Ein Durchschnittsfachmann
wird wissen, wie zusätzliche
PTP-Moleküle
von humanen Spezies oder anderen Säuger-Spezies, ohne unnötige Versuche
zu identifizieren und zu klonieren sind, die eine Sequenzhomologie
zu dem PTP-S31-Protein und den hier beschriebenen funktionellen
Derivaten aufweisen, unter Verwendung der genetischen Sequenzen
und Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung.
-
In
einer Ausführungsform
richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine
Proteintyrosinphosphatase codiert, die die Aminosäuresequenz
von PTP-S31 oder mindestens 9 angrenzende Aminosäuren, bevorzugt mindestens
10, 15, 20 oder 30 angrenzende Aminosäuren davon aufweist. In einer
bevorzugten Ausführungsformen
codiert die isolierte Nukleinsäure
eine Proteintyrosinphosphatase, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NR.: 4 oder
eine mutierte Variante oder Speziesvariante davon aufweist. In einer
anderen bevorzugten Ausführungsform
umfasst die isolierte Nukleinsäuresequenz
SEQ ID NR.: 3 oder mindestens 27 benachbarte Nukleotide davon, bevorzugt
mindestens 30, 35, 40 oder 50 Nukleotide davon.
-
Die
Manipulation der genetischen Konstrukte der vorliegenden Erfindung
lässt das
Pfropfen einer bestimmten ligandenbindenden Rezeptordomäne und einer
transmembranen Domäne
einer RPTP auf katalytische Abschnitte von PTP-S31 zu, was zu chimärischen
Molekülen
führt.
Nicht beschränkende
Beispiele für
solche chimärischen
Moleküle
beinhalten eine PTP, wobei der Rezeptor ein Epidermis-Wachstumsfaktorrezeptor, ein
Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor usw. sein kann. Es werden auch
PTP-PTP-Chimären
in Betracht gezogen, zum Beispiel zwischen PTP-S31 und PTPα oder PTPε. Gentechnisch
veränderte
chimärische
Rezeptoren sind dem Fachmann bekannt (vgl. zum Beispiel Riedel,
H. et al., Nature 324: 628-670 (1986)).
-
Genetische
Konstrukte, die PTP-S31 codieren, funktionelle Derivate davon und
chimärische
Moleküle, wie
jene, die oben beschrieben wurden, können in der Gentherapie verwendet
werden. Ein anomales oder funktionsgestörtes PTP-S31, das zu einer
Krankheit führt,
kann durch die Infusion von Zellen der gewünschten Linie (wie zum Beispiel
blutbildende Zellen), die mit DNA transfiziert wurden, die normales
PTP-S31 codiert, ersetzt werden. Alternativ oder zusätzlich können Zellen
für eine
solche Gentherapie verwendet werden, die eine chimärische RPTP
tragen, die einen Rezeptor für
einen Liganden der Wahl (z. B. EGF) aufweisen.
-
Die
rekombinanten DNA-Moleküle
der vorliegenden Erfindung können
durch jedes einer Vielzahl von Mitteln, wie zum Beispiel DNA- oder
RNA-Synthese, oder stärker
bevorzugt durch die Anwendung rekombinanter DNA-Techniken, produziert
werden. Techniken zum Synthetisieren solcher Moleküle wurden
zum Beispiel von Wu, R., et al. (Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol.
21: 101-141 (1978)) offenbart. Prozeduren zur Konstruktion rekombinanter
Moleküle
in Übereinstimmung
mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden von Sambrook et al.
(supra) offenbart.
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Der
3'-Terminus des
rekombinanten Moleküls
dieser Erfindung wird bevorzugt behandelt, um ihn für die Polymerisation
ungeeignet zu machen. Eine solche Behandlung kann erreicht werden,
indem der Terminus durch chemische Mittel blockiert wird oder indem
die terminalen Basen derart modifiziert werden, dass sie die Polymerasewirkung
sterisch stören.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine solche Behandlung erreicht, indem der 3'-Terminus immobilisiert
wird, etwa durch seine Koppelung an ein festes Trägermaterial
(wie zum Beispiel Glas, Plastik, Latex usw.). Das Trägermaterial
kann jede Form haben (d. h. ein Blatt, Stab, Kugel, Ei usw.). Prozeduren
für solche
Immobilisationen sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. In
der am stärksten
bevorzugten Ausführungsform
ist das 3'-Ende
des rekombinanten Moleküls
kovalent an das feste Trägermaterial
gebunden. Es kann eine Spacer-Region verwendet werden, um die Sonde
von dem festen Trägermaterial
aus nach außen
zu verlängern,
so lange (1) sie nicht irgendeine Funktion oder Charakteristik des rekombinanten
Moleküls
sterisch hindern wird, und (2) die Sequenz der Spacer-Region nicht
an den Hybridisierungs- oder Polymerisationsreaktionen des Assays
beteiligt ist. Es ist typischerweise wünschenswert, mehrere und bevorzugt
eine große
Anzahl solcher rekombinanter Moleküle auf dem Träger zu immobilisieren.
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Oligonukleotide,
die einen Abschnitt von PTP-S31 repräsentieren, sind zum Screenen
auf die Gegenwart von Genen, die solche Proteine codieren, und zum
Klonieren von PTP-S31-Genen nützlich.
Techniken zum Synthetisieren solcher Oligonukleotide wurden zum
Beispiel von Wu, R., et al. (Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol.
21: 101-141 (1978)) offenbart.
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Proteinmoleküle werden
zum Beispiel mit Cyanbromid fragmentiert, oder mit Proteasen, wie
etwa Papain, Chymotrypsin, Trypsin usw. (Oike, Y., et al., J. Biol.
Chem. 257: 9751-9758 (1982); Liu, C., et al., Int. J. Pept. Protein
Res. 21: 209-215 (1983)). Da der genetische Code degeneriert ist,
kann mehr als ein Codon verwendet werden, um eine bestimmte Aminosäure zu codieren
(Watson, J. D., In: Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl., Benjamin/Cummings
Publishing Co., Inc., Menlo Park, Calif. (1987)). Bei der Verwendung
des genetischen Codes können
ein oder mehrere verschiedene Oligonukleotide identifiziert werden,
wobei jedes davon in der Lage wäre,
die Aminosäure
zu codieren. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Oligonukleotid
in der Tat die tatsächliche
XXX-codierende Sequenz bilden wird, kann durch die Berücksichtigung
anomaler Basenpaarungs-Beziehungen und der Häufigkeit eingeschätzt werden,
mit der ein bestimmter Codon in eukaryotischen Zellen tatsächlich verwendet
wird (um eine bestimmte Aminosäure
zu codieren). Solche „Codon-Verwendungsregeln" wurden von Lethe,
R., et al., J. Molec. Biol. 183: 1-12 (1985) offenbart. Bei der
Verwendung der „Codon-Verwendungsregeln" von Lathe wird ein
einziges Oligonukleotid, oder ein Satz von Oligonukleotiden identifiziert,
der eine theoretisch „wahrscheinlichste" Nukleotidsequenz
enthält,
die in der Lage ist, eine PTP-S31-Sequenz zu codieren.
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Obwohl
eine Aminosäuresequenz
gelegentlich von nur einem einzigen Oligonukleotid codiert wird, kann
die Aminosäuresequenz
häufig
von jedem Oligonukleotid aus einem Satz ähnlicher Oligonukleotide codiert
werden. Dabei ist wichtig, dass, während alle Mitglieder dieses
Satzes Oligonukleotide enthalten, die in der Lage sind, das Peptidfragment
zu codieren, und somit potentiell die gleiche Oligonukleotidsequenz
enthalten wie das Gen, das das Peptidfragment codiert, nur ein Mitglied
dieses Satzes die Nukleotidsequenz enthält, die mit der Nukleotidsequenz
des Gens identisch ist. Da dieses Mitglied in dem Satz vorhanden
ist und in der Lage ist, sogar in Gegenwart der anderen Mitglieder
des Satzes zu DNA zu hybridisieren, ist es möglich, den unfraktionierten
Satz an Oligonukleotiden auf die gleiche Weise zu benutzen, auf
die ein einziges Oligonukleotid benutzt werden könnte, um das Gen zu klonieren,
das das Peptid codiert.
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Das
Oligonukleotid oder der Satz an Oligonukleotiden, die die theoretisch „wahrscheinlichste" Sequenz enthalten,
die in der Lage ist, ein PTP-S31-Fragment zu codieren, wird verwendet,
um die Sequenz eines komplementären
Oligonukleotids oder eines Satzes an Oligonukleotiden zu identifizieren,
die in der Lage sind, zu der „wahrscheinlichsten" Sequenz oder dem
Satz an Sequenzen zu hybridisieren. Ein Oligonukleotid, das eine
solche komplementäre
Sequenz enthält,
kann als Sonde benutzt werden, um das PTP-S31-Gen zu identifizieren
und zu isolieren (Sambrook et al., supra).
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Ein
geeignetes Oligonukleotid oder ein Satz an Oligonukleotiden, die
in der Lage sind, ein Fragment eines PTP-S31-Gens zu codieren (oder
die komplementär
zu einem solchen Oligonukleotid oder Satz an Oligonukleotiden sind),
wird (unter Verwendung der oben beschriebenen Prozedur) identifiziert,
synthetisiert, und hybridisiert, durch Mittel, die dem Fachmann
gut bekannt sind, gegen eine DNA, oder stärker bevorzugt ein cDNA-Präparat, das
aus Zellen abgeleitet ist, die in der Lage sind, das PTP-S31-Gen
zu exprimieren. Einzelsträngige
Oligonukleotidmoleküle,
die zu den „wahrscheinlichsten" PTP-S31-Peptid-codierenden
Sequenzen komplementär
sind, können
unter Verwendung von Prozeduren synthetisiert werden, die dem Fachmann
gut bekannt sind (Belagaje et al., J. Biol. chem. Mechanisms in
the Control of Gene Expression; Nierlich et al., Hrsg., Acad. Press,
NY (1976); Wu et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 21: 101-141
(1978); Khorana, R. G., Science 203: 614-625 (1979)). Zusätzlich kann
die DNA-Synthese durch die Verwendung automatisierter Synthesegeräte erreicht
werden. Techniken der Nukleinsäurehybridisierung
wurden durch Sambrook et al. (supra) und durch Haymes et al. (In:
Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.
(1985)) offenbart. Techniken wie die oben beschriebenen oder diesen ähnliche
Techniken haben das Klonieren von Genen für humane Aldehyddehydrogenasen
(Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985), Fibronektin
(Suzuki et al. EMBO J. 4: 2519-2524 (1985), das humane Östrogenrezeptorgen
(Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985)),
gewebeartige Plasminogenaktivatoren (Pennica et al., Nature 301:
214-221 (1983)) und zu humaner alkalischer Term-Plazenta-Phosphatase komplementäre DNA (Dam
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 715-8719 (1985)) erfolgreich
ermöglicht.
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In
einem alternativen Weg zum Klonieren des PTP-S31-Gens wird eine Bank von Expressionsvektoren
hergestellt, indem DNA oder, stärker
bevorzugt, cDNA (aus einer Zelle, die in der Lage ist, PTP-S31 zu exprimieren)
in einen Expressionsvektor kloniert. Die Bank wird dann auf Mitglieder
gescreent, die in der Lage sind, ein Protein zu exprimieren, das
an einen anti-PTP-S31-Antikörper
bindet und das eine Nukleotidsequenz hat, die in der Lage ist, Proteintyrosinphosphatase
zu codieren, die die gleiche Aminosäuresequenz wie PTP-S31 oder
Fragmente davon, aufweisen. In dieser Ausführungsform wird DNA oder, stärker bevorzugt, cDNA
extrahiert und aus einer Zelle aufgereinigt, die in der Lage ist,
das PTP-S31-Protein zu exprimieren. Die gereinigte cDNA wird (durch
Scheren, Endonucleasedigestion usw.) fragmentiert, um einen Pool
von DNA- oder cDNA-Fragmenten zu produzieren. DNA- oder cDNA-Fragmente
aus diesem Pool werden dann in einen Expressionsvektor kloniert,
um eine Genbank von Expressionsvektoren zu produzieren, deren Mitglieder
jeweils ein einziges kloniertes DNA- oder cDNA-Fragment enthalten.
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Ein „Expressionsvektor" ist ein Vektor,
der (aufgrund der Gegenwart geeigneter Transkriptions- und/oder
Translationskontrollsequenzen) in der Lage ist, ein DNA- (oder cDNA-)Molekül zu exprimieren,
das in den Vektor kloniert wurde, und dabei ein Polypeptid oder
Protein zu produzieren. Die Expression der klonierten Sequenzen
findet statt, wenn der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle
eingeführt
wird. Wenn ein prokaryotischer Expressionsvektor benutzt wird, dann
wäre die
geeignete Wirtszelle jede prokaryotische Zelle, die in der Lage
ist, die klonierten Sequenzen zu exprimieren. Auf ähnliche
Weise wäre
dann, wenn ein eukaryotischer Expressionsvektor benutzt wird, die geeignete
Wirtszelle jede eukaryotische Zelle, die in der Lage ist, die klonierten
Sequenzen zu exprimieren. Dabei ist wichtig, da eukaryotische DNA
intervenierende Sequenzen enthalten kann und da solche Sequenzen
in prokaryotischen Zellen nicht korrekt verarbeitet werden können, dass
es bevorzugt ist, cDNA aus einer Zelle zu benutzen, die in der Lage
ist, PTP-S31 zu exprimieren, um eine prokaryotische genomische Expressionsvektorbank
zu produzieren. Prozeduren zur Herstellung von cDNA und zum Produzieren
einer Genbank wurden von Sambrook et al. (supra) offenbart.
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Eine
DNA-Sequenz, die PTP-S31 oder dessen funktionelle Derivate codiert,
kann mit Vektor-DNA gemäß herkömmlicher
Techniken rekombiniert werden, einschließlich Termini mit stumpfen
oder versetzten Enden zur Ligation, Restriktionsenzymdigestion,
um geeignete Termini bereitzustellen, gegebenenfalls Auffüllen kohäsiver Enden,
alkalische Phosphatasebehandlung, um unerwünschtes Verbinden zu vermeiden,
und Ligation mit geeigneten Ligasen. Techniken für solche Manipulationen wurden
von Sambrook et al., supra, offenbart und sind dem Fachmann gut
bekannt.
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Man
sagt, dass ein Nukleinsäuremolekül, wie etwa
DNA, „in
der Lage ist", ein
Polypeptid „zu
exprimieren", wenn
es Nukleotidsequenzen enthält,
die regulatorische Transkriptions- und Translationsinformation enthalten,
und solche Sequenzen sind mit Nukleotidsequenzen „wirkungsmässig verbunden", die das Polypeptid codieren.
Eine wirkungsmässige
Verbindung ist eine Verbindung, bei der die regulatorischen DNA-Sequenzen und
die DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, auf eine solche Weise
verknüpft
sind, dass sie Genexpression ermöglicht.
Die exakte Natur der regulatorischen Regionen, die für die Genexpression
benötigt
werden, kann von Organismus zu Organismus variieren, sollte aber
im Allgemeinen eine Promoterregion beinhalten, die in Prokaryoten
sowohl die Promotersequenz (die den Start der RNA-Transkription leitet)
sowie die DNA-Sequenzen enthält,
die, wenn sie in RNA transkribiert werden, den Start der Proteinsynthese
signalisieren werden. Solche Regionen werden normalerweise jene
5'-nicht-codierenden
Sequenzen beinhalten, die beim Start der Transkription und Translation
beteiligt sind, wie etwa TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz
usw.
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Wenn
gewünscht,
kann die nicht codierende Region 3' für
die Gensequenz, die für
das Protein codiert, durch die oben beschriebenen Verfahren erhalten
werden. Diese Region kann für
ihre transkriptionalen regulatorischen Terminationssequenzen, wie
etwa Termination und Polyadenylierung, bewahrt werden. Somit können, indem
die 3'-Region, die
natürlich
benachbart zur DNA-Sequenz ist, die für das Protein codiert, die trankriptionalen
Terminationssignale bereitgestellt werden. Wenn die transkriptionalen
Terminationssignale in der Expressionswirtszelle nicht zufriedenstellend
funktionell sind, dann kann eine 3'-Region substituiert werden, die in
der Wirtszelle funktionell ist.
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Man
sagt, dass zwei DNA-Sequenzen (wie etwa eine Promoterregionsequenz
und eine PTP-S31-codierende Sequenz) wirkungsmässig verbunden sind, wenn die
Natur der Verbindung zwischen den beiden DNA-Sequenzen nicht (1)
zur Einführung
einer Rasterverschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit
der Promoterregionsequenz beeinträchtigt, die Transkription der
R-PTP-Gensequenz zu leiten, oder (3) die Fähigkeit der R-PTP-Gensequenz
beeinträchtigt,
durch die Promoterregionsequenz transkribiert zu werden. Eine Promoterregion
wäre wirkungsmässig mit
einer DNA-Sequenz verbunden, wenn der Promoter in der Lage wäre, die
Transkription dieser DNA-Sequenz auszuführen. Somit sind, um das Protein
zu exprimieren, Transkriptions- und Translationssignale notwendig,
die von einem geeigneten Wirt erkannt werden.
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Ein
Promoter ist eine doppelsträngige
DNA- oder RNA-Sequenz,
die in der Lage ist, RNA-Polymerase zu binden und die Transkription
einer „wirkungsmässig verbundenen" Nukleinsäuresequenz
zu fördern.
Wie hier verwendet ist eine „Promotersequenz" die Sequenz des
Promoters, die auf dem Strang der DNA oder RNA liegt, die durch
die RNA-Polymerase transkribiert wird. Ein „Promotersequenzkomplement" ist ein Nukleinsäuremolekül, dessen
Sequenz das Komplement einer „Promotersequenz" ist. Folglich wird
bei der Verlängerung eines
DNA- oder RNA-Primers, der neben einem einzelsträngigen „Promotersequenzkomplement" oder einer „Promotersequenz" liegt, ein doppelsträngiges Molekül erzeugt,
das einen funktionellen Promoter enthalten wird, wenn diese Verlängerung
in Richtung der „Promotersequenz" oder des „Promotersequenzkomplements" fortschreitet. Dieser
funktionelle Promoter wird die Transkription der Nukleinsäuresequenz
leiten, die wirkungsmässig
mit dem Strang des doppelsträngigen
Moleküls
verbunden ist, der die „Promotersequenz" enthält.
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Bestimmte
RNA-Polymerasen weisen eine hohe Spezifität für solche Promoter auf. Die
RNA-Polymerasen der Bakteriophagen T7, T3 und SP-6 sind ganz besonders
gut charakterisiert und weisen eine hohe Promoterspezifität auf. Die
Promotersequenzen, die für
jede dieser RNA-Polymerasen
spezifisch sind, leiten die Polymerase auch, um nur einen Strang
der zwei Stränge
eines Duplex-DNA-Templates zu transkribieren. Die Auswahl, welcher
Strang transkribiert wird, wird durch die Orientierung der Promotersequenz
bestimmt. Diese Auswahl bestimmt die Transkriptionsrichtung, da
RNA nur enzymatisch durch die Zugabe eines Nukleotids 51 Phosphats
zu einem 3'-Hydroxylterminus
polymerisiert wird.
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Man
sagt, dass zwei Sequenzen eines Nukleinsäuremoleküls „wirkungsmässig verbunden" sind, wenn sie auf
eine Weise miteinander verbunden sind, die es entweder beiden Sequenzen
ermöglicht,
auf das gleiche RNA-Transkript transkribiert zu werden, oder ein
RNA-Transkript ermöglicht,
das in einer Sequenz begonnen wird und in die zweite Sequenz verlängert wird.
Somit sind zwei Sequenzen, wie etwa eine Promotersequenz und jede
andere „zweite
Sequenz einer DNA oder RNA, wirkungsmässig verbunden, wenn der Beginn
der Transkription in der Promotersequenz ein RNA-Transkript der wirkungsmässig verbundenen
zweiten Sequenz produzieren. Um „wirkungsmässig verbunden" zu sein, ist es
nicht notwendig, dass zwei Sequenzen unmittelbar nebeneinander liegen.
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Die
Promotersequenzen der vorliegenden Erfindung können entweder prokaryotisch,
eukaryotisch oder viral sein. Geeignete Promoter sind reprimierbar
oder, stärker
bevorzugt, konstitutiv. Beispiele für geeignete prokaryotische
Promoter beinhalten Promoter, die in der Lage sind, die T4-Polymerasen
(Malik, S., et al., J. Biol. Chem. 263: 1174-1181 (1984); Rosenberg,
A. H., et al., Gene 59: 191-200 (1987); Shinedling, S., et al., J.
Molec. Biol. 195: 471-480 (1987); Hu, M., et al., Gene 42: 21-30
(1986)), T3-, Sp6- und T7-Polymerasen (Chamberlin, M., et al., Nature
228: 227-231 (1970); Bailey, J. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80: 2814-2818 (1983); Davanloo, P., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 2035-2039 (1984)); die PR-
und PL-Promoter
des Bakteriophagen Lambda (The Bacteriophage Lambda, Hershey, A.
D., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1973);
Lambda II, Hendrix, R. W., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harbor, N.Y. (1980)); die trp-, recA-, Hitzeschock- und lacZ-Promoter
von E. coli; die α-Amylase (Ulmanen,
I., et al., J. Bacteriol. 162: 176-182 (1985)) und die σ-28-spezifischen Promoter von
B. subtilis (Gilman, M. Z., et al., Gene 32: 11-20 (1984)); die
Promoter des Bakteriophagen von Bacillus(Gryczan, T. J., in: The Molecular
Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., N.Y. (1982)); Streptomyces-Promoter
(Ward, J. M., et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478 (1986)); den
int-Promoter des Bakteriophagen Lambda; den bla-Promoter des β-Lactamasegens von
pBR322 und den CAT-Promoter des Chloramphenicolacetyltransferasegens
von pPR325 usw. zu erkennen. Prokaryotische Promoter wurden von
Glick, B. R. (J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987)); Cenatiempo,
Y. (Biochimie 68: 505-516 (1986)); Watson, J. D., et al. (in: Molecular
Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin Cummins, Menlo Park,
Calif. (1987)); und Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18: 415-442
(1984)) untersucht. Bevorzugte eukaryotische Promoter beinhalten
die Promoter des Maus-Metallothionein-I-Gens (Hamer, D., et al.,
J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982)); den TK-Promoter von Herpes
virus (McKnight, S., Cell 31: 355-365 (1982)); den frühen SV40-Promoter
(Benoist, C., et al., Nature (London) 290: 304-310 (1981)); und
den gal4-Gen-Hefepromoter (Johnston, S. A., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79: 6971-6975 (1982); Silver, P. A., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 5951-5955 (1984)).
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Starke
Promoter sind bevorzugt. Beispiele für solche bevorzugten Promoter
sind jene, die die T3-, SP6- und T7-Polymerasen erkennen, der PL-Promoter und der Promoter des Maus-Metallothionein-I-Gens. Ein
am stärksten
bevorzugter Promoter für
die eukaryotische Expression von PTP-S31 ist ein SV40-Promoter, wie
etwa derjenige, der die Transkription in dem pLSV-Vektor antreibt
(Livneh, E., et al., J. Bol. Chem. 261: 12490-12497 (1986)). Die Sequenzen solcher
Polymeraseerkennungsstellen wurden von Watson, J. D., et al. (in:
Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl., Benjamin/Cummings Publishing
Co., Inc., Menlo Park, Calif. (1987)) offenbart.
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Nachdem
die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird diese unter
Bezugnahme auf das folgende Beispiel leichter verstanden werden,
das zur Illustration bereitgestellt wird und das, wenn nicht anders spezifiziert,
die vorliegende Erfindung nicht beschränken soll.
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6. BEISPIEL: IDENTIFIKATION EINES NEUARTIGEN
PTP UNTER VERWENDUNG VON POLYMERASE-KETTENREAKTION
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Um
neuartige PTPs in insulinempfindlichen Geweben zu identifizieren,
benutzten die Erfinder PCR-Technik. Erststrang-cDNA des Skelettmuskels
wurde als Template verwendet und degenerierte Oligonukleotide, die
stark konservierten Regionen entsprachen, wurden als Primer verwendet.
Eine Anzahl bereits charakterisierter PTPs (wie etwa RPTPα, RPTPβ, RPTPγ, PTP 1B,
T-Zellen-PTP, MEG1) wurde unter Verwendung des unten beschriebenen
Ansatzes identifiziert. Außerdem
wurde eine neuartige PTP, PTP-S31 genannt, entdeckt.
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Voll-RNA
wurde aus humanem Skelettmuskel durch die Guanidiniumthiocyanat/CsCl-Prozedur
isoliert (Chirgwin et al., Biochem. 18: 5293-5299 (1979)). Poly(A)+RNA wurde isoliert auf einer Oligo(dT)-Cellulosesäule (Aviv
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58: 1408-1412 (1972)) isoliert.
Die Erststrang-cDNA wurde aus 2 μg
poly(A)+RNA unter Verwendung von oligo(dT)-Priming
und Moloney Murine Leukämievirus
RNase H-Umkehrtranskriptase
von GIBCO BRL (Gaithersburg, Md., USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers
synthetisiert.
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cDNA,
die den PTPs entspricht, die im Skelettmuskel exprimiert wurde,
wurde nach PCR isoliert (Saiki et al., Science 239: 487-491 (1988)).
Die humane Skelettmuskel-Erststrang-cDNA von oben (die etwa 50 ng entspricht)
wurde mit dem folgenden Satz an gemischten degenerativen Oligonukleotidprimer
unter Verwendung des Gene Amp Kits (Perkin Elmer Cetus, Norwalk,
Conn., USA) amplifiziert.
Sense-Primer (Oligonukleotid Nr.
58):
5' A(CT)TT(CT)TGG(ACG)(AG)(AG)ATG(AG)T(TCGA)TGG
3' [SEQ ID NR.:
28]
das der PTP-Aminosäure-Consensus-Sequenz
entspricht: F W X M X W
Antisense-Primer (Oligonukleotid Nr.
57):
5' CC(TCGA)A(CT)(AGT)CC(ATC)GC(AG)CT(GA)CAGTG
3' [SEQ ID NR.:
29]
das der PTP-Aminosäure-Consensus-Sequenz
entspricht: H C S A G (S/I/V) G.
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Jeder
PCR-Zyklus umfasste einen Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 Minute,
dann einen Annealing-Schritt bei 37 °C für 2 Minuten und einen Verlängerungsschritt
bei 72 °C
für 2 Minuten.
Dreißig
bis 40 Zyklen wurden ausgeführt.
Die Reaktionsprodukte wurden Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Die Fragmente
der erwarteten Größe (basierend
auf der Struktur bereits beschriebener PTPs) wurden isoliert, unter Verwendung
des TA-Klonierungssystems
(Invitrogen, San Diego, Calif.) subkloniert und mit dem enzymatischen
Kettenabbruchverfahren, das von Sanger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)) beschrieben wurde, sequenziert (Sequenase,
U.S. Biochemicals) unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel
et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,
1988).
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Der
Teil der DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines PCR-Fragments,
genannt PTP-S31, wird in 1 gezeigt.
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Die
abgeleitete Aminosäuresequenz
von PTP-S31 wird in 2 mit PTP 1B (Chernoff et al.,
supra) unter Verwendung des GAP-Verfahrens zur Anordnung (Needleman
et al., supra) verglichen.
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PTP-S31
ist eindeutig homolog mit anderen bekannten PTPs, aber hat überraschenderweise
ein Merkmal, das für
diese Enzymklasse noch nicht beschrieben wurde, die von der Universität von Wisconsin, Genetics
Computer Group Program, analysiert wurde. Dieses einmalige Merkmal
von PTP-S31 wird unten im Vergleich mit den Consensus-Sequenzen der zuvor
beschriebenen bekannten PTPs verglichen (die Abweichung ist unterstrichen):
PTP-S31: R C X X Y W P [SEQ ID NR.:
30]
Consensus: K C X X Y W P [SEQ ID NR. 1]
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7. BEISPIEL: cDNA-KLONIEREN EINES MITGLIEDS
DER PTP-S31-UNTERFAMILIE
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mRNA
wurde aus der Rhabdomyosarkomzelllinie RD (ATCC #CCL 136), wie oben
in Kapitel 6 beschrieben, hergestellt. Eine cDNA-Bank (Bank #1)
wurde unter Verwendung der von Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol.
2: 161-170 (1982); Mol. Cell. Biol. 3: 280-289 (1983)) beschriebenen
Verfahren konstruiert.
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Der
pCDVI-PL-Vektor wurde zur Herstellung des Primer-Fragments verwendet (Noma et al., Nature 319:
640-646 (1986). Ein kurzer synthetischer Adaptor wurde als Zweitstrangprimer
verwendet (Boel et al., BioTechniques 11: 26-28 (1991)). E. coli
DH5α (Gibco
BRL, Gaithersburg, Md., USA) wurde für die Transformation verwendet
(Inuoue, H. et al., Gene 96: 23-28 (1990)). Nach der Transformation
wurden die Zellen auf LB-Platten
(die 50 μg
Ampicillin/ml enthielten) mit einer Dichte von 15.000-20.000 Kolonien
pro Platte plattiert.
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Nitrocellulose-Replikafilter
(Schleicher & Schuell,
BA85) wurden mit Standard-Koloniehybridisierungstechnik gescreent
(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
Das folgende Oligonukleotid (#185) wurde synthetisiert, am 5'-Ende unter Verwendung
von T4-Polynukleotidkinase und [γ-32P]ATP (Amersham) markiert und zum Screenen
der cDNA-Bank verwendet:
5' CCA
TCA GTA TTG GCC AGA GG 3' [SEQ
ID NR.: 31]
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Dieses
Oligonukleotid entspricht der Aminosäuresequenz His-Gln-Tyr-Trp-Pro-Glu
des PTP-S31-PCR-Fragments, das in Kapitel 6 beschrieben wird. Zehn
pmol des markierten Oligonukleotids in 50 ml Hybridisierungslösung (6 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 0,05
% SDS (Ausubel et al., supra) wurden den Replika-Nitrocellulosefiltern
zugefügt
und bei 42 °C
3 Stunden lang hybridisiert. Dann wurden die Filter in 6 × SSC, 0,05
% SDS drei Mal bei Raumtemperatur, ein Mal bei 42 °C und schließlich ein
Mal bei 48 °C
gewaschen. Eine positive Kolonie (Klon 1.20.4) wurde durch Autoradiographie
identifiziert, isoliert und durch Standardtechniken sequenziert
(Sambrook et al., supra).
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Die
Nukleotidsequenz dieses Klons, nun mit PTP-S31C [SEQ ID NR.: 6]
gekennzeichnet, und die abgeleitete Aminosäuresequenz [SEQ ID NR.: 7]
werden in 3 gezeigt. Diese Sequenz
beinhaltet die Sequenz des PCR-Fragments
von oben und bestätigt
somit die Identität
des isolierten cDNA-Klons. Die Größe dieses Klons PTP-S31C liegt bei etwa
2300 bp. Er enthält
zwei In-frame-, putative Methionin-Initiatorcodone, gefolgt von
einem offenen Leserahmen, der ein Protein von etwa 39 kDa codiert.
Das erste ATG stimmt mit einer Consensus-Translations-Initiationssequenz überein (Kozak,
M. Nucleic Acids Research 15: 8125-8148 (1984)). Zudem ist der Abstand
von dem 5'-Ende
der PTP-Domäne
(N(K/R)XXXNR) zum Initiatorcodon ähnlich dem anderer PTPs, z.
B. PTP 1B (Chernoff et al., supra) und PEP (Matthews et al., supra).
Es gibt jedoch kein In-frame- Stoppcodon
5' von dem ersten
ATG. Es ist daher möglich,
dass PTP-S31C kein Volllängenklon
ist.
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PTP-S31C
enthält
die meisten der konservierten Aminosäurereste, die in anderen PTPs
zu finden sind; die Aminosäuresequenz
ist zu etwa 45 % mit zuvor beschriebenen PTPs identisch. PTP-S31
fehlt ein Signalpeptid und eine Transmembranregion und könnte daher
zu der Klasse der kleinen, intrazellulären PTPs gehören. Unerwarteterweise
unterschied sich die abgeleitete Aminosäuresequenz um den katalytisch
essentiellen Cysteinrest herum markant von der Consensus-Sequenz:
HCSXGXGRXG [SEQ ID NR.: 32]. Es ist insbesondere bemerkenswert,
dass das Arginin an Position 6 C-terminal von der aktiven Cysteinstelle
in anderen PTPs mit Phenylalanin in PTP-S31C ersetzt ist. Es wurde
festgestellt, dass dieser Argininrest in allen beschriebenen PTPs
konserviert ist, einschließlich
PTPs, denen viele andere Merkmale fehlen, die bei den meisten PTPs üblich sind,
zum Beispiel cdc25 (Sandu et al., supra) und die Tyrosin/Serinphosphatase,
die von dem Vakziniavirus codiert wird (Guan et al., supra).
-
Außerdem lässt sich
die Restsubstanz des C-Terminus nur schlecht mit bekannten PTPs
anordnen. Eine Anordnung von PTP 1B (Chernoff et al., supra) und
PTP-S31C wird in 4 gezeigt.
-
8. BEISPIEL: IDENTIFIKATION VON PTP-S31D,
EINER ALTERNATIVEN FORM DER NEUARTIGEN PTP
-
Die
in Kapitel 7 offenbarten Ergebnisse, die den betreffenden Erfindern
zuerst etwas rätselhaft
zu sein schienen, wurden einer sorgfältigen Prüfung der Sequenz um das aktive
Zentrum von Cystein herum unterzogen. Diese Analyse offenbarte,
in einem anderen Leserahmen, ein Motiv, das üblicherweise in dem C-terminalen
Teil der PTP-Domänen
zu sehen ist: QYIFXXXXXXD (Krueger et al., EMBO J. 9: 3241-3252
(1990)).
-
Um
zu analysieren, ob dies ein Klonierungsartefakt war oder eine sehr
ungewöhnliche
Form des alternativen Spleissens, wobei zwei Sets an PCR-Primers
wie folgt designed wurden (zwei Primer auf jeder Seite der aktiven
Stelle Cysteine):
-
Primersatz #1
-
- Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 223):
5' GACGGATCCGATGCCATCAGTATTGG
3' [SEQ ID NR.:
33]
- Anti-Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 224):
5' TGGTCTAGATATTTACATAGTGGTT
3' [SEQ ID NR.:
34]
-
Primersatz #2
-
- Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 185):
5' CCATCAGTATTGGCCAGAGG
3' [SEQ ID NR.:
35]
- Anti-Sense-Primer (Oligonukleotid Nr. 225):
5' CAAGCTCAACATCACCTTCCA
3' [SEQ ID NR.:
36]
-
PCR
auf PTP-S31C cDNA erbrachte ein Band von etwa 450 bp mit Primersatz
#1 und etwa 430 bp mit Primersatz #2. Wenn eine Deletion oder ein
alternatives Spleissereignis stattgefunden hat, sollte es möglich sein,
ein zusätzliches
Band durch PCR direkt auf der Erststrang-cDNA aus der RD-Zelllinie
und/oder dem Skelettmuskel zu erkennen. Die erwartete Größe dieses
Bands läge
bei 430/450 bp plus den Abstand, der normalerweise bei PTPs zwischen
dem aktiven Cysteinzentrum und dem QYIF-Motif, d. h. bei etwa 130
bp.
-
mRNA
und 1.-Strang-cDNA wurde aus der Rhabdomyosarkomzelllinie RD (American
Tissue Type Collection CCL 136) und humanem Skelettmuskel wie in
Kapitel 6 beschrieben, hergestellt. Etwa 50 ng der Erststrang-cDNA
wurde mit den oben genannten Primern verwendet. Jeder PCR-Zyklus
umfasste einen Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 Minute, dann einen Annealing-Schritt
bei 37 °C
für 2 Minuten
und einen Verlängerungsschritt
bei 72 °C
für 2 Minuten.
Dreißig
bis 40 Zyklen wurden ausgeführt.
Die PCR-Fragmente
wurden durch Standard-Agarosegel-Elektrophorese
analysiert (Ausubel et al., supra). Primersatz #1 führte zu
zwei Bändern
der vorhergesagten Größen unter
Verwendung von cDNA aus der RD-Zelllinie als Template. Primersatz
#2 führte
zu zwei Bändern
der vorhergesagten Größen in der
RD-Zelllinie sowie in der Skelettmuskel-cDNA.
-
Beide
Bänder
aus der RD-Zelllinie, die mit Primersatz #1 erhalten wurden, wurden
kloniert und sequenziert. Wie erwartet wurde festgestellt, dass
das untere Band der PTPS31C-Sequenz entspricht. Das obere Band hat
ebenfalls eine Sequenz, die identisch mit der PTPS31C-Sequenz ist, aber
mit einer 133-bp-Insertion (5). Das
obere Band, das mit Primersatz #2 unter Verwendung von Skelettmuskel-cDNA
erhalten wurde, wurde direkt unter Verwendung des Antisense-Oligonukleotid-Primers
Nr. 225 sequenziert. Identische Sequenzen wurden in der RD-Zelllinie
und dem Skelettmuskel gefunden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz dieser
Region zeigt nun die üblichen
Merkmale von PTPs, einschließlich
der Sequenz HCSXGXGR und ist in frame mit dem 5'-Ende von PTP-S31C. Diese neuartige
Form von PTP wurde mit PTP-S31D
bezeichnet. Die kombinierte Sequenz von PTP-S31C und PTP-S31D wird
in 6 gezeigt.
-
7 zeigt
eine Anordnung von PTP-S31D mit den ersten PTP-Domänen von
CD45 (Ralph et al., supra) bzw. LAR (Streuli et al., supra), und
mit der PTP-Domäne
von PTP 1B (Chernoff et al., supra). Das CLUSTAL-Programm wurde
verwendet (Higgins et al., supra).
-
9. BEISPIEL: INSERTION DES S31D-FRAGMENTS
IN DAS PTP-S31C
-
Die
folgenden drei Basisschritte wurden benutzt:
- 1.
Eine BspHI-Stelle wurde an das erste ATG in PTP-S31C eingeführt.
- 2. Diese BspHI-Stelle wurde verwendet, um die codierende Region
von PTP-S31C in den Vektor pSP72 zu übertragen (Promega).
- 3. Die S31D-Sequenz wurde in die PTP-S31-Sequenz eingeführt.
-
Schritt 1
-
Um
die Einführung
der PTP-S31-Sequenz in verschiedene Klonierungsvektoren zu erleichtern,
haben wir eine BamHI- und eine BspHI-Stelle (unter Verwendung von
PCR) stromaufwärts
des ersten Met in der Sequenz von PTP-S31C eingeführt:
Sense-Primer (Oligonukleotid
Nr. 202: BamHI/BspHI):
5' CGGGATCCATCATGAGAATGAGGCCAATAAGC
3 [SEQ ID NR.: 37]
Antisense-Primer (Oligonukleotid Nr. 203):
XbaI):
5' GCTCTAGAGCTTGTAATCACTATATCTCCA
3' [SEQ ID NR.:
38]
-
Etwa
100 ng von Plasmid-DNA von PTP-S31C (Klon 1.20.4) wurden als Template
verwendet. Jeder PCR-Zyklus umfasst einen Denaturierungsschritt
bei 94 °C
für 1 Minute,
einen Annealing-Schritt bei 50 °C
für 2 Minuten
und einen Verlängerungsschritt
bei 72 °C
für 2 Minuten.
Es wurden zehn Zyklen durchgeführt.
Die PCR-Fragmente wurden mit Agarosegel-Elektrophorese analysiert,
mit BamHI und AlwNI verdaut, und ein 470 bp-Fragment wurde unter
Verwendung von Standardtechniken isoliert (Ausubel et al., supra).
Dieses Fragment entspricht dem 5'-Ende
von PTP-S31C und enthält
die codierende Region von PTP-S31, beginnend mit dem ersten Methionin.
-
Schritt 2
-
Unter
Verwendung von Standardtechniken wurde ein 940 bp-Fragment aus dem
originalen PTP-S31C-Klon (1.20.4) isoliert, indem er mit AlwNI und
EcoRV verdaut wurde. Dieses Fragment wird mit dem PCR-Fragment,
das in Schritt 1 isoliert und in den pSP72-Vektor ligiert wurde
(Promega), der mit BamHI und EcoRV verdaut wird. Das resultierende
Plasmid wird pSP-S31C genannt.
-
Schritt 3
-
Das
obere Band (etwa 580 bp einschließlich der S31D-Sequenz) aus der
in Kapitel 8 beschriebenen PCR (Primersatz #1) wurde in den Vektor
pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, Calif.) unter Verwendung
passender Restriktionsstellen (BamHI/XbaI) kloniert, die in den
Primer (Oligonukleotide Nr. 223 bzw. 224) enthalten waren. Das resultierende
Plasmid wurde seinerseits mit DraIII und NcoI verdaut, um zu einem
330 bp-Fragment zu führen,
das die S31D-Sequenz umspannt, die in das Plasmid pSP-S31C (Schritt
2) inseriert wurde, das mit den gleichen Enzymen (DraIII/NcoI) verdaut
wurde. Das resultierende Plasmid wird pSP-S31D genannt.
-
10. BEISPIEL: ANALYSE DER ENZYMATISCHEN
AKTIVITAT VON PTP-S31D
-
10.1. Veränderung des prokaryotischen
Expressionsvektors pGEX
-
Um
ein cDNA-Fragment von PTP-S31D (vgl. unten) aufzunehmen, wurden
die Klonierungsstellen des pGEX2T-Vektors (Pharmacia, Uppsala, Sweden)
unter Verwendung von Standardtechniken verändert (Current Protocols in
Molecular Biology, Hrsg. F. M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York,
1988). Der pGEX2T-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI
und EcoRI verdaut und isoliert. Die folgenden Oligonukleotide wurden
in den verdauten pGEX2T-Vektor ligiert.
- 5' GATCTCCGAATTCCATGGATCCAGGCCTCTAGAAGCTTAC
3' [SEQ ID NR.:
39]
- 3' AGGCTTAAGGTACCTAGGTCCGGAGATCTTCGAATGTTAA
5' [SEQ ID NR.:
40]
dadurch Hervorrufen des Vektors pGEX-AK2 mit den folgenden
Klonierungsstellen:
5' EcoRI,
NcoI, BamHI, StuI, XbaI, HindIII 3'
-
10.2. Einführung der PTP-S31D-codierenden
Region in pGEX-AK2
-
Das
Plasmid pSP-S31D (Kapitel 9) wurde mit BamHI und EcoRV verdaut und
in den pcDNA-I-Vektor (Invitrogen) inseriert, der mit den gleichen
Enzymen verdaut wurde. Das resultierende Plasmid, pc-S31D, wurde
seinerseits mit BspHI und XbaI verdaut, was zu einem Fragment von
etwa 1500 bp führte.
Das PTP-S31D-Fragment wurde anschließend in den pGEX-AK2 (geschnitten
mit NcoI und XbaI) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde p16
(pGEX-AK2/PTP-S31D) genannt und in den unten beschriebenen Expressionsuntersuchungen
verwendet. p16 codiert ein Fusionsprotein von Glutathion-S-Transferase
und PTP-S31D (beginnend mit dem ersten Methionin) und enthält ferner
etwa 500 bp der nicht translatierten 3'-Region
von PTP-S31C (und PTP-S31D).
-
Eine
identische Strategie wurde verwendet, um PTP-S31C in pGEX-AK2 einzuführen, abgesehen
davon, dass pSP-S31C verwendet wurde, um das pcDNA-I-basierte Plasmid:
pc-S31C zu produzieren:
Das resultierende Plasmid wurde p17 (pGEX-AK2/PTP-S31C) genannt.
-
10.3. Expression des GST-PTP-S31-Fusionsproteins
in E. coli
-
Das
pGEX-AK2/PTP-S31D-Vektorkonstrukt, p16, und das pGEX-AK2/PTP-S31C-Vektorkonstrukt, p17,
das Fusionsproteine von Glutathion-S-Transferase (GST) bzw. PTP-S31D
oder PTP-S31C codiert (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83: 87-3-8707 (1988)) wurden in E. coli, Stamm DH5α (Cat. No.
8263SA, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) und SURF® (Cat.
No. 200294, Stratagene, La Jolla, Calif. 92037) eingeführt.
-
Übernacht-Kulturen
des transformierten E. coli wurden in LB-Medium gewachsen und 1:10
in frischem Medium verdünnt
(45 ml Übernacht-Kultur
plus 405 ml LB-Medium mit Ampicillin) und 1 Stunde lang bei 37 °C gewachsen.
Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid
(IPTG) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM (DH5β) und 5 mM
(SURF) zugefügt
und die Kulturen wurden weitere 4 Stunden inkubiert. Ein Volumen
von 400 ml aus jeder Kultur wurde bei 4 °C 10 Minuten lang bei 5.000
U/Min. in einem Sorvall-GS3-Rotor zentrifugiert. Die Pellets wurden
in flüssigem
Stickstoff eingefroren, dann in 3 ml Lysepuffer (0,03 M Tris HCl,
pH-Wert 8,0, 2,5 mM EDTA, 10 μg/ml
Aprotinin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 (v/v) 2-Mercaptoethanol) aufgetaut
und auf Eis beschallt (M.S.E. Ultraschall-Disintegrator-100-W-Model
(cat. no. 7100): 3 Zyklen mit 30 Sekunden, maximale Einstellung).
Nach der Beschallung wurden die Lysate zentrifugiert und der Überstand durch
einen Filter mit 0,45 μm
(Millipore) gefiltert. Kontrollen waren: (1) pGEX-AK2 mit und ohne
IPTG; und (2) p16 und p17 ohne Zugabe von IPTG. Die GST-PTP-S31D-
und GST-PTP-S31C-Fusionsproteine
sowie GST wurden als lösliche
Proteine durch Glutathion-Sepharose-4B-Affinitätschromatographie (Cat. No.
17-0756-01, Pharmacia, Uppsala, Sweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers
unter Verwendung von 150 μl
Glutathion-Sepharose 4B pro Milliliter der beschallten und sterilgefilterten
bakteriellen Lysate isoliert und mit langsamer Drehung 1 Stunde
lang bei 4 °C
inkubiert. Die Sepharoseperlen wurden 3-mal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
gewaschen und schließlich
in 250 μl
Lysepuffer (vgl. oben) resuspendiert. Die Expression der GST/PTP-S31D-
bzw. GST/PTP-S31C-Fusionsprotein sowie der Glutathion-S-Transferase wurde durch
Natriumdodecylsulfat-(SDS) Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., supra) überprüft. Verschiedene
Mengen der Suspension aus Glutathion-Sepharoseperlen mit GST-PTP-S31D,
GST-PTP-S31C und
GST (Kontrolle) wurden auf die enzymatische Aktivität analysiert,
wie unten beschrieben.
-
10.4. Analyse der enzymatischen Aktivität des GST-PTP-S-31D-Fusionsproteins
-
Die
Aktivität
von PTP-S31D gegenüber
dem Substrat p-Nitrophenylphosphat
(pNP-P) wurde im Wesentlichen gemessen, wie von Tonks et al., J.
Biol. Chem. 263: 6731-6737 (1988)) beschrieben. Steigende Mengen
der Glutathion-Sepharoseperlen mit GST/PTP-S31D, GST/PTP-931C bzw. GST von
oben wurden mit 25 mM pNP-P bei Raumtemperatur in einer Reaktionsmischung
inkubiert, die 50 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)
pH-Wert 5,5, 10
mM Dithiothreitol und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
enthielt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe gleicher Volumen von
0,4 M NaOH gestoppt. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände auf
Mikrotiterplatten übertragen
und die Absorbanz bei 405 nm wurde mit einem Dynatech MR5000-Lesegerät gelesen.
-
In
diesem Phosphataseassay zeigte nur das GST/PTP-S31D-Fusionsprotein Aktivität (8).
-
11. BEISPIEL: NORTHERN-BLOT-ANALYSE VON
PTP-S31
-
Voll-RNA
wurde aus mehreren humanen Geweben (Milz, Plazenta, Lunge, Niere,
Dickdarm, Leber und aus zwei Quellen normalen Skelettmuskels sowie
aus diabetischem Skelettmuskel) und Zelllinien (KG1 (ATCC CCL 246);
MOLT-4 (ATCC CRL 1582); Raji (ATCC CCL86); K-562 (ATCC CCL 243);
MEG01; Hep G2 (HB 8065); Ea.hy (erhalten von Dr. Cora-Jean S. Edgell,
University of North Carolina, Chapel Hill, N.C.); A673 (ATCC CRL
1598); und RD (ATCC CCL 136)) durch die saure Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsprozedur
isoliert, wie von Puissant et al., BioTechniques 8: 148-149 (1990))
beschrieben.
-
Poly(A)+RNA wurde auf einer Oligo(dT)-Säule (Aviv
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412 (1972)) isoliert.
Zwei μg
Poly(A)+RNA wurden unter Verwendung von
Standardtechniken (Ausubel et al., supra) in die Spuren geladen,
in einem Agarose-Formaldehydgel getrennt und auf Nylonfilter geblottet
(Stratagene, La Jolla). Die Filter wurden mit dem mit [α32P)dATP
markierten PTP-S31-PCR-Fragment (das in Kapitel 6 beschrieben wurde)
hybridisiert. Die 32P-Markierung erfolgte
mit dem Random Primers DNA Labeling System (Cat. no. 8187SA, Bethesda
Research Laboratories, Gaithersburg, Md. 20877, USA) gemäß den Anweisungen des
Herstellers. Anschließend
wurden die Filter unter stringenten Bedingungen gewaschen und auf
Röntgenfilme
aufgebracht.
-
Die
Analyse der Northern Blots zeigte ein breites Spektrum von Transkripten
von PTP-S31 (von etwa 2,1 bis 2,8 kb) in der Poly(A)+RNA
aus einer der Skelettmuskelquellen, während die Expression in der
anderen Probe aus normalem Skelettmuskel kaum nachweisbar war. Das
breite Band in diesem Northern Blot könnte die Existenz mehrerer
Formen von mRNA (z. B. alternatives Spleissen) anzeigen, die vom
gleichen Gen abgeleitet sind. Die Expression von PTP-S31 wurde auch
im Skelettmuskel eines Patienten mit Typ-II-Diabetes nachgewiesen.
-
Überraschenderweise
beträgt
die Größe des Haupttranskripts
in der RD-Zelllinie etwa 4,4 kb. Zusätzlich wurden ein relativ breites
aber schwächeres Band
(2,1-2,4 kb) sowie ein schwaches Band von etwa 6 kb in der RD-Zelllinie
gefunden. Eine lange Exposition des Northern Blots mit Skelettmuskel-RNA
zeigt, dass es ein kleineres Transkript von etwa 4,4 kb, wie in
der RD-Zelllinie, gibt. In Lungengewebe wurde ein schwaches Signal
bei etwa 8 kb gefunden. Bei der Verwendung von Northern-Blotting
zeigte keine der anderen Gewebe oder Zelllinien ein messbares Expressionsniveau
von PTP-S31. Mit der empfindlichen PCR-Technik wurde jedoch festgestellt,
dass PTP-S31 in den folgenden Geweben und Zelllinien exprimiert
wurde: Leber (Schwangerschaft); Plazenta; Skelettmuskel; Niere;
periphere Blutlymphozyten; HepG2-Zellen (ATCC CCL 86) (beinahe ausschließlich in
der PTP-S31C-Form), RD-Zellen (ATCC CCL 136); A673-Zellen (ATCC
CRL 1598); IM9-Zellen (ATCC CCL 159); CEM-Zellen (ATCC CCL 119);
U937-Zellen (ATCC CRL 1593); A549-Zellen (ATCC CCL 185); und KLE-Zellen
(ATCC CRL 1622).
-
12. BEISPIEL: KLONIEREN ZUSÄTZLICHER
SUBTYPEN VON PTP-S31
-
Aufgrund
der beobachteten Größenunterschiede
zwischen den Haupttranskripten von PTP-S31 in der RD-Zelllinie und
dem Skelettmuskel wurden weitere Versuche ausgeführt, die cDNA-Klonieren von
PTP-S31 aus den beiden Quellen normalen Skelettmuskels einschlossen,
die niedrige bzw. hohe Expressionsniveaus (basierend auf der Northern-Blot-Analyse,
die in Kapitel 11 beschrieben wurde) zeigten.
-
Poly(A)+RNA wurde aus den beiden Quellen normalen
humanen Skelettmuskels isoliert, wie in Kapitel 11 oben beschrieben.
Unter Verwendung von 5 μg
dieser Poly(A)+RNA-Präparate wurden zwei λ-ZAP-II-cDNA-Banken
gemäß den Anleitungen
des Herstellers (Stratagene, La Jolla, Calif.) hergestellt. Die
Bank, die aus der RNA mit niedrigen Expressionsniveaus von PTP-S31
konstruiert wurde, wurde Bank #2 genannt. Die Bank, die aus RNA
mit hohen Expressionsniveaus von PTP-S31 konstruiert wurde, wurde
Bank #3 genannt. Insgesamt wurden 2 × 106 Platten
aus jeder Bank unter Verwendung von Standard-Filterhybridisierungstechniken (Ausubel
et al., supra) gescreent. Doppelte Hybond-N+-Filter (Amersham) wurden
mit dem gleichen 32P-markierten PCR-Fragment hybridisiert,
das in Kapitel 11 oben verwendet wurde.
-
Die 32P-Markierung erfolgte mit dem Random Primers
DNA Labeling System (Cat. no. 8187SA, Bethesda Research Laboratories,
Gaithersburg, Md. 20877, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die
Filter wurden bei hoher Stringenz (0,1 × SSC, 0,05 % SDS) gewaschen.
Anschließend
wurden die Filter auf Röntgenfilme
aufgebracht.
-
Es
wurden drei positive Klone aus der Bank #2 identifiziert, isoliert,
In-vivo-Exzision gemäß den Anleitungen
des Herstellers unterzogen und durch Sequenzierung analysiert. Aus
Bank #3 wurden insgesamt neun positive Klone isoliert und analysiert.
-
Der
längste
Klon (931D-63) wurde aus der cDNA-Bank #2 isoliert; seine Nukleotidsequenz
und vorhergesagte Aminosäuresequenz
wird in 9 gezeigt. Überraschenderweise
enthielt weder dieser Klon noch irgendeiner der anderen analysierten
Klone das 5'-Ende
des PTP-S31C-Klons (Klon 1.20.4), der aus der RD-cDNA-Bank (Bank #1) isoliert
wurde. Stattdessen enthielten alle Klone aus den Skelettmuskel-cDNA-Banken
5'-Enden, die keiner
der bekannten Sequenzen ähnlich
waren. Keiner dieser Klone schien ein Volllängenklon zu sein, da es kein
In-frame-ATG-Trielet stromaufwärts
des Nukleotids gab, an dem sich diese Klone von Klon 1.20.4 unterschieden.
Die verschiedenen identifizierten Formen werden in 10 schematisch dargestellt.
-
Die
Isolierung zusätzlicher
Teilklone aus Bank #3 zeigte weitere Varianten von PTP-S31, die
höchstwahrscheinlich
aus alternativem Spleißen
resultierten. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen dieser Varianten
werden in 11 gezeigt.
-
Eine
neue cDNA-Bank (Bank #14) wurde aus Poly(A)+RNA
aus der RD-Zelllinie unter Verwendung der λ-ZAP-II-cDNA-Klonierungsprozedur (Stratagene, La
Jolla, Calif.), wie oben beschrieben, konstruiert. Insgesamt wurden
2 × 106 Platten unter Verwendung von Standard-Filterhybridisierungstechniken
(Ausubel et al., supra) gescreent. Doppelte Hybond-N-Filter (Amersham)
wurden mit dem gleichen 32P-markierten PCR-Fragment
hybridisiert, das in Kapitel 11 oben verwendet wurde. Die 32P-Markierung erfolgte mit dem Random Primers
DNA Labeling System (Cat. no. 8187SA, Bethesda Research Laboratories,
Gaithersburg, Md.) gemäß den Anweisungen
des Herstellers. Die Filter wurden bei hoher Stringenz (0,1 × SSC, 0,05
% SDS) gewaschen und anschließend
auf Röntgenfilm
aufgebracht. Aus Bank #14 wurden insgesamt 7 positive Klone isoliert, In-vivo-Exzision
gemäß den Anleitungen
des Herstellers unterzogen und analysiert.
-
Zwei
der Klone aus Bank #14 sind mit dem Klon 1.20.4 identisch, abgesehen
davon, dass sie am 5'-Ende
einige Basen kürzer
sind (d. h. beide sind PTP-S31C). Es wurde festgestellt, dass fünf Klone
dem Klon S31D-63 von oben ähnlich
waren, sich aber an den 5'-Enden
unterschieden. Der längste
dieser beiden Klone wurde durch Sequenzierung charakterisiert. Klon
S31-RD#2 entspricht der D-Form von PTP-S31, während Klon S31-RD#6, der am
5'-Ende etwa 250
Basenpaare kürzer
ist als Klon S31-RD#2,
entspricht der C-Form. Ansonsten sind beide Klone identisch. Teilnukleotidsequenzen
(SEQ ID NR.: 21) und vorhergesagte Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR.: 22)
von PTP-S31-RD#2 werden in 12 gezeigt. Überraschenderweise
enthielt diese Form von PTP-S31 eine Transmembrandomäne. Daher
kann PTP-S31 sowohl als intrazelluläre und als rezeptorartige PTP
vorhanden sein.
-
Es
ist bemerkenswert, dass bisher nur bei einer Säugetier-Transmembran-PTP, RPTPβ, festgestellt wurde,
dass sie eine einzige PTPase-Domäne
(Krueger et al., supra) enthält.
Wie RPT-β hat
PTP-S31-RD#2 nur eine PTPase-Domäne.
-
Zudem
teilt die Aminosäuresequenz
von PTP-S31-RD#2 nahe der putativen Transmembranregion Ähnlichkeit
mit der Interleukin-2-Rezeptor-β-Kette
und anderen Zytokin-Rezeptoren
(Miyajama et al., Annu. Rev. Immunol. 10: 295-3331 (1992). Diese
Region teilt auch eine gewisse Homologie mit Fibronektin-III-artigen (FN-III)
Domänen
(Patthy, L., Cell 61: 13-14 (1990)).
-
Einige
der strukturellen Merkmale, die für Fibronektin-Typ-III-ähnliche
Domänen üblich sind,
sind auch in der extrazellulären
Domäne
von PTP-S31-RD#2 zu sehen. In der Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.: 22), die
in 12 dargestellt wird, können insgesamt
vier FN-III-ähnliche
Domänen
identifiziert werden (vgl. 14).
Die Domänen
werden mit S31-FN-1 (die am stärksten
C-terminale und
daher nahe der Transmembranregion liegende) bis S31-FN-4 (die am
stärksten
N-terminale) bezeichnet. Diese FN-III-ähnlichen Domänen enthalten
eine relativ hohe Anzahl an Cysteinresten. Dies ist ein Gegensatz
zu den FN-III-ähnlichen
Domänen von
LAR (Streuli et al., supra) und Cytokin-Rezeptoren (Patthy, supra).
Auch ein ansonsten stark konservierter Tryptophanrest wird in S31-FN-2
durch einen Phenylalaninrest ersetzt. Ferner sind die Demarkationen
zwischen einzelnen FN-III-Domänen
bei weitem nicht so gut konserviert wie in RPTPβ.
-
Es
gibt mehrere potentielle Stellen für N-Glykosylierung in der extrazellulären Domäne von PTP-S31.
-
Überraschenderweise
zeigt eine Dehnung von etwa 100 Aminosäuren oder PTP-S31-RD#2 eine
relative hohe Sequenzähnlichkeit
mit einem Abschnitt der α-Untereinheit des
Insulinrezeptors (15). Die Ähnlichkeit von PTP-S31-RD#2
mit dem Insulinrezeptor sowie mit Cytokinrezeptoren zeigt an, dass
die Transmembranform von PTP-S31 durch Hormone oder Cytokine reguliert
werden könnte.
Alternativ können
die FN-III-ähnlichen
Domänen
anzeigen, dass PTP-S31 an Interaktionen zwischen Zellen beteiligt
ist.
-
13. BEISPIEL: ERKENNEN UND MESSEN VON
PTP-S31-PROTEIN IN EINER ZELLE
-
13.1. Produktion von Antikörpern mit
Spezifität
für PTP-S31D
-
Antiserum
mit Spezifität
für PTP-S31D
wurde durch Standardtechniken produziert (Hudson, L. et al., Practical
Immunology, 3. Aufl., Blackwell, Oxford, 1989). Kurz zusammengefasst
wurden 200 μg
des GST-PTP-S31D-Fusionsproteins
(vgl. Kapitel 10) in 200 μl
phosphatgepufferter Kochsalzlösung
mit einer gleichen Menge an Freund's Complete Adjuvans (Sigma, Cat. No.
F5881) kombiniert und intrakutan in zwei Neuseelandkaninchen injiziert.
Jedes Kaninchen erhielt 100 μg
des Fusionsproteins. Zwei Wochen nach der ersten Injektion wurden
Auffrischungsinjektionen ohne Freund's Adjuvans verabreicht. Nach weiteren
2 Wochen wurden 20 ml Blut aus jedem Kaninchen erhalten und bei
Raumtemperatur 1 Stunde lang in Glasröhrchen zum Gerinnen stehengelassen.
Die Klumpen wurden nach dem Lösen
von dem Röhrchen
zentrifugiert, und Aliquots des Serums wurden in frische Röhrchen übertragen
und bei –20 °C bis zur
Verwendung gelagert.
-
Um
die Antikörper
zu entfernen, die für
Glutathion-S-Transferase
(GST) spezifisch sind, wurde das Serum über eine Glutathion-Sepharose-4B-Säule geleitet,
die mit Glutathion-S-Transferase gesättigt worden war, unter Verwendung
der Prozedur, die in Kapitel 10 beschrieben wurde. Das pGEX-AK2-Konstrukt
wurde verwendet, um das GST-Protein zu produzieren. Das Serum wurde
dreimal über
die Säule
geleitet, um das vollständige
Entfernen der Anti-GST-Antikörper
zu gewährleisten.
Die Effizienz der Entfernung wurde durch Western-Blotting, wie unten
beschrieben, beurteilt.
-
13.2. Erkennen und Messen von PTP-S31D
in einer Zelllinie
-
Der
Anti-PTP-S31D-Antikörper
kann verwendet werden, um die Expression von PTP-S31 in Säugetierzellen
zu erkennen. Standardimmunofluoreszenztechniken stellen Informationen über die
Expression dieses Proteins in spezifischen Zelllinien und Geweben
bereit. Dabei ist es sogar noch wichtiger, dass dieses Antikörperpräparat verwendet
werden kann, um die Menge des Proteins in Zelllinien und Geweben
zu bestimmen. Als Beispiel für
die spätere
Anwendung des Anti-PTP-S31-Antikörpers
wird das Erkennen von PTP-S31 in der RD-Zelllinie (ATCC CCL 136)
unten beschrieben. Es sollte betont werden, dass dieses Beispiel
keinesfalls die Verwendung des Antikörpers beschränken soll,
der auf gleiche Weise zum Erkennen von PTP-S31 in anderen Zellen
und Geweben verwendet werden kann. Ebenso kann das Antikörperpräparat nützlich sein
bei der Aufreinigung von natürlich
vorkommendem oder rekombinantem PTP-S31 und zum Einrichten anderer
Arten von Erkennungsassays.
-
Unter
Verwendung von Standardtechniken wird die RD-Zelllinie in Eagle's Minimal Essential Medium (Cat. No.
041-022570, GIBCO Life Technologies Ltd., Paisley, Schottland) mit
zweimal der normalen Konzentrationen an Aminosäuren und Vitaminen mit Hanks' Balanced Salt Solution
und 10 % fetalem Kälberserum (FCS)
(GIBCO-BRL) kultiviert.
-
Die
Zellen werden zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
gewaschen und der Überstand entfernt.
Die Zellen aus einer Gewebekulturplatte (10 cm Durchmesser) werden
in 800 μl
eines Triton-X-100-Lysepuffers
(20 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 50 mM NaCl, 10 % Glycerol, 1,0 % Triton
X-100, 1,5 mM MgCl2, 4 mM Ethylenglycol-bis(β-aminoethylethylether)
N,N,N',N'-Tetraacetat (EGTA; Sigma ED2SS), 10 μg/ml Aprotinin,
1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) lysiert. Das Lysat wird
zentrifugiert und der Überstand
in frische Röhrchen
in Aliquots zur Lagerung bei –80 °C bis zur
Verwendung übertragen.
-
Zum
Testen werden 1-50 μl
dieses Lysats mit 25 μl
SDS-Probepuffer (62,5 mM Tris HCl, pH-Wert 7,0, 3.0 (v/v) SDS, 10
% (v/v) Glycerol, 10 % 2-Mercaptoethanol und 0,05 % (w/v) Bromophenolblau)
gemischt, 5 Minuten lang gekocht, mit 7,5 % SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gekocht
und unter Verwendung von Standardtechniken auf Nitrocellulose geblottet
(Burnette, W. N., Anal. Biochem. 112: 195-201 (1981)).
-
Eine
Standardkurve für
die quantitative Bestimmung von PTP-S31D wird generiert, indem definierte Mengen
an gereinigtem E.-coli-produziertem GST-PTP-S31D-Fusionprotein von oben gleichzeitig
mit den RD-Zelllysaten
verwendet werden.
-
Die
Nitrocellulosefilter werden 30 Minuten lang mit 2 Gramm Milchpulver
(Carnation, Non-Fat Dry Milk, Carnation, Los Angeles, Calif.) pro
Liter PBS inkubiert, um unspezifisches Binden zu blockieren, einmal
in PBS gewaschen, die 0,02 % (v/v) Tween-20 (Sigma, P1379) (PBS-Tween)
und 0,2 % (w/v) Gelatine (BioRad Cat. No. 170-6537, Richmond, Calif.
enthält,
3-mal in PBS-Tween
gewaschen und schließlich
4 Std. lang mit einer 1:200-Verdünnung
(in PBS-Tween) des oben beschriebenen Anti-PTP-S31D-Antiserum-Präparats inkubiert. Nach
drei Wäschen
in PBS-Tween werden die Filter mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem
Ziege anti-Kaninchen-IgG (Cat. No. 170-6525, BioRad) inkubiert. Die
Filter werden dreimal in PBS-Tween gewaschen und die Menge an gebundenem
Kaninchenantikörper,
der die Menge an PTP-S31D anzeigt, wird durch die verstärkte Chemilumineszenztechnik
(ECL-Technik) gemäß den Anleitungen
des Herstellers (Cat. No. RPN 2106, Amersham, UK) bestimmt. Ein
Vergleich der Signale, die aus der RD-Zelllinie erhalten wurden
mit der Standardkurve, die mit dem E.-coli-produzierten GST-PTP-S31D-Fusionprotein
erhalten wurden, lassen die Bestimmung der Menge an PTP-S31D zu,
die von der RD-Zelllinie
produziert wird.
-
14. BEISPIEL: IDENTIFIKATION EINES STOFFS,
DER DIE ENZYMATISCHE AKTIVITÄT
VON PTP-S31 STIMULIERT ODER HEMMT
-
Es
werden zwei unterschiedliche Quellen des PTP-S31-Proteins für die Bewertung potentieller
Modulatoren der enzymatischen Aktivität verwendet:
- 1.
Die GST-PTP-S31D- (und GST-PTP-S31C-)Fusionsproteine wie in Kapitel
10 beschrieben;
- 2. PTP-S31, das vorübergehend
in 293-Zellen exprimiert wird, wie unten beschrieben.
-
Die
cDNA, die die gesamte codierende Region von PTP-S31 (C oder D) oder
einen funktionellen Abschnitt davon enthält, wird in den Säuger-Expressionsvektor
pcDNA I (Cat. No. V490-20, Invitrogen, San Diego) unter Verwendung
von Standardtechniken (Ausubel et al., supra) inseriert. Das System
der vorübergehenden
Expression in 293-Zellen, das von Gorman et al., Virology 171: 377-385
(1989) beschrieben wird, wird verwendet, um enzymatisch aktives
PTP-S31D zu produzieren. Unter Verwendung von Standardtechniken
werden die 293-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Cat. No. a041-02430,
GIBCO, Life Technologies Ltd., Paisley, Schottland), angereichert
mit 10 % FCS in einer Atmosphäre
von 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert.
-
Zehn μg des Plasmidkonstrukts
PTP-S31D/pcDNA I (oder PTP-S31C/pcDNA I) werden mit 0,5 ml 0,25 M
CaCl2 und 0,5 ml 2 × BBS (50 mM N,N-bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (BES),
280 mM NaCl, 1,5 mM Na2 HPO4)
gemischt und zur Transfektion von 1,5 × 106 293-Zellen in einer 10-cm-Petrischale
verwendet, wie von Chen et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)
beschrieben. Die Zellen werden 24 Std. lang bei 37 °C unter 3
% CO2 nach der Zugabe des Ca-Phosphat-DNA-Präzipitats
inkubiert, dann einmal in DMEM gewaschen, das mit 10 % FCS angereichert
ist, und in frischem Medium weitere 24 Stunden lang bei 37 °C unter 5
% CO2 inkubiert. Das Medium wird entfernt
und die Zellen in 1,0 ml Lysepuffer (20 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 150
mM NaCl, 10 % Glycerol, 1.0 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl2,
4 mM EGTA, 10 μg/ml
Aprotinin, 1 mM PMSF) lysiert. Die Zelllysate werden bei 2.500 × g 2 Minuten
lang bei 4 °C
zentrifugiert. Der Überstand
wird entfernt, und 100 μl
Aliquots werden in flüssigem
Stickstoff schnellgefroren und bis zur Verwendung bei –70 °C gelagert.
-
Das
PTP-S31 in dem Lysat kann unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer
Techniken, wie etwa Anionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationen,
teilweise aufgereinigt werden.
-
Es
werden drei unterschiedliche Substrate für die Bewertung potentieller
Modulatoren der PTP-S31-Phosphatase-Aktivität verwendet:
- (1) p-Nitrophenylphosphat (pNP-P; Sigma 104-0);
- (2) 32P-markiertes Raytide (Oncogene
Science Inc., Manhasset, N.Y.);
- (3) 32P-markiertes bovines basisches
Myelinprotein (MBP).
-
Substanzen,
die die Aktivität
von PTP-S31 gegen eines oder mehrere dieser Substrate entweder senken
oder erhöhen,
werden weiter analysiert.
-
14.1. Markieren von Raytide und basischem
Myelinprotein mit 32P)
-
Die
Aktivität
gegenüber 32P-markiertem Raytide der GST/PTP-S31D-
(und GST/PTP-S31C-)Fusionsproteine (Kapitel 10) sowie des vollständigen und
bevorzugt halb aufgereinigten PTP-S31D-Proteins oder -Glykoproteins
oder eines funktionellen Teils davon, der in 293-Zellen exprimiert
wurde, wird im Wesentlichen wie von Krueger et al. (EMBO J. 9: 3241-3252
(1990)) beschrieben, gemessen. Das synthetische Peptid Raytide wird
unter Verwendung der Tyrosinekinase p60c-src gemäß den Anleitungen
des Herstellers (Oncogene Science) mit kleineren Modifikationen
mit 32P markiert. Kurz zusammengefasst,
werden 2 μl
von p60c-src mit 20 μl Raytide (1 mg/ml) und 108 μl des Kinasepuffers
gemischt (50 mM HEPES, pH-Wert 7, 5, der 10 mM MgCl2, 0,2
% (v/v) β-Mercaptoethanol,
30 μM ATP
und 50 μCi
[γ-32P]ATP enthält). Die Mischung wird bei
37 °C 16 Stunden
lang inkubiert, und die Reaktion wird durch die Zugabe von 500 μl 20 % (w/v)
Trichloressigsäure (TCA)
in 20 mM NaH2PO4 und
100 μl von
5 mg/ml acetylatiertem bovinem Serumalbumin gestoppt. Die Mischung
wird zentrifugiert, das Präzipitat
wird dreimal in 20 % TCA/20 mM NaH2PO4 gewaschen und wird schließlich in
0,2 M Tris-HCl pH-Wert
8,0 wieder aufgelöst.
-
Basisches
Myelinprotein (Sigma) wird unter Verwendung einer Prozedur markiert,
die ähnlich
derjenigen ist, die für
Raytide verwendet wurde (Guan et al., Nature 350: 359-362 (1991)).
Dreißig μg von MBP
werden in einem 60 μl
Reaktionsvolumen markiert, das die folgenden Bestandteile enthält: 50 mM
HEPES-Puffer, pH-Wert
7,5, 10 mM MgCl2, 0,067 % β-Mercaptoethanol,
0,05 mM ATP, einschließlich
150 μCi
[γ-32P]ATP und 4 Einheiten p43v-abl-Kinase
(Oncogene Science). Die Mischung wird 60 Minuten lang bei 30 °C inkubiert,
und die Reaktion wird durch die Zugabe von eiskalter TCA auf eine
Endkonzentration von 20 % gestoppt. Nach 30 Minuten auf Eis wird
das Präzipitat
dreimal in 20%-iger TCA gewaschen und in 100 μl H2O
wieder aufgelöst.
-
14.2. Beurteilung der PTP-Aktivität unter
Verwendung des Substrats pNP-P
-
Die
Aktivität
des GST/PTP-S31D-Fusionsproteins gegenüber pNP-P wird gemessen wie
in Kapitel 10 oben beschrieben. Die Substanzen, die auf ihre Fähigkeit
analysiert werde, die Phosphataseaktivität zu stimulieren oder zu hemmen,
werden dem GST/PTP-S31D-Fusionsprotein
5 Minuten vor der Zugabe von pNP-P zugefügt. Eine ähnliche Prozedur wird für das in
293-Zellen exprimierte
PTP-S31D verwendet, wobei das Lysat aus PTP-S31D und 293-Zellen
direkt verwendet wird.
-
Tabelle
I unten zeigt den Effekt mehrere Stoffe auf die PTP-Aktivität des GST/PTP-S31-Fusionsproteins,
das an Glutathion-Sepharoseperlen gebunden ist, wie in Kapitel 10
beschrieben. Die angegebenen Konzentrationen der Stoffe sind die
Endkonzentrationen in der Reaktionsmischung nach der Zugabe des
Substrats pNP-P. Die Phosphatase-Assaymischung enthielt 50 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)
pH-Wert 5,5, 10 mM Dithiothreitol, 25 mM pNP-P und 2 μl der GST/PTP-S31-Sepharosesuspension.
Beim Testen von Orthovanadat, wurde Poly(Glu/Tyr)4:1 und Poly-L-Lysin,
5 mM EDTA in die Assay-Mischung gegeben. Die Reaktion wurde bei
Raumtemperatur ausgeführt
und nach 30 Minuten durch die Zugabe gleicher Volumen von 0,4 M
NaOH gestoppt. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände auf
Mikrotiterplatten übertragen
und die Absorbanz bei 405 nm mit einem Dynatech MR5000-Plattenlesegerät gelesen.
Zum Vergleich enthält
Tabelle I veröffentlichte
Daten über
die Aktivität
von PTPβ und
LAR unter Verwendung von Raytide als Substrat (Itoh et al. (J. Biol.
Chem. 267: 12356-12363 (1992)).
TABELLE
I |
EFFEKTE
VERSCHIEDENER STOFFE AUF DIE PTP-AKTIVITÄT |
| Konz. | PTP-Aktivität (% der
Kontrolle) |
Stoff | (mM) | S31D | PTPβ | LAR |
MgCl2 | 1 | 123 | 90 | 119 |
| 10 | 140 | 141 | 56 |
MnCl2 | 1 | 110 | 85 | 72 |
| 10 | 140 | 64 | 30 |
ZnCl2 | 0.1 | 68 | 18 | 90 |
| 1 | 13 | 3 | 120 |
| 10 | 9 | 0 | 6 |
Ortho- | 0.1 | 64 | 33 | 59 |
vanadat | 1 | 23 | 6 | 25 |
| (μg/ml) | | | |
Poly | 1 | 84 | 97 | 103 |
(Glu/Tyr) | 10 | 85 | 85 | 97 |
| 100 | 77 | 61 | 96 |
Poly-L- | 1 | 156 | 239 | 123 |
Lysin | 10 | 172 | 653 | 230 |
| 100 | 192 | 125 | 247 |
-
Es
sollte betont werden, dass das oben genannte Beispiel nicht dazu
bestimmt ist, den Umfang der Erfindung auf irgendeine Weise zu beschränken.
-
14.3. Beurteilung der PTP-Aktivität unter
Verwendung der Substrate Raytide oder MBP
-
Fünf μl 10 × PTP-Puffer
(250 mM HEPES, pH-Wert 7,3, 50 mM EDTA, 100 mM Dithiothreitol) werden mit
(a) 5 μl 32P-markiertem Raytide oder MBP (entspricht
10-20 × 104 cpm), b) 5, 10 bzw. 25 μl des Lysats aus PTP-S31D und
293-Zellen oder 0,5, 1 und 5 μl
der Suspension des GST-PTP-S31D-Fusionsproteins, das an Glutathion-Sepharoseperlen gebunden
ist (vgl. Kapitel 10) und (c) H2O auf ein
Endvolumen von 50 μl
gemischt. Die Reaktion wird nach 30 Minuten bei 37 °C gestoppt.
Wenn Raytide verwendet wird, wird die Reaktion durch die Zugabe
von 0,75 ml azidischer Kohlemischung gestoppt (Krueger et al., EMBO
J. 9: 3241-3252 (1990)): 0,9 M HCl, 90 mM Natriumpyrophosphat, 2
mM NaH2PO4, 4 %
(v/v) Norit A (Sigma)). Nach dem Mischen und Zentrifugieren werden
400 μl des Überstands
entfernt und die Menge an Radioaktivität gemessen. Wenn MBP verwendet
wird, wird die Reaktion mit 20 % TCA (Endvolumen) gestoppt. Dann
wird die Menge an 32P im Überstand
gemessen.
-
Die
Substanzen, die auf ihre modulatorischen Aktivitäten analysiert werden sollen,
werden dem Lysat aus PTP-S31 und 293-Zellen 5 Minuten vor Start
der Assays zugefügt.
-
Die
oben zitierten Quellenangaben sind alle hier als Bezugsdokumente
beigefügt,
ob spezifisch beigefügt
oder nicht.
-
Zwar
wurde diese Erfindung in Zusammenhang mit ihren spezifischen Ausführungsformen
beschrieben, man wird jedoch verstehen, dass sie in der Lage ist,
weitere Modifikationen zu erfahren. Diese Anmeldung ist dazu bestimmt,
alle Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abzudecken,
die dabei im Allgemeinen den Prinzipen der Erfindung folgen, und
schließt
solche Abweichungen in die vorliegende Offenbarung ein, wie sie
unter die bekannte oder gebräuchliche
Praxis innerhalb des Fachgebiets fallen, auf das sich die Erfindung
bezieht, und wie sie auf die vorgenannten wesentlichen Merkmale
angewendet werden können,
die wie folgt im Umfang der beigefügten Ansprüche dargestellt werden. SEQUENZPROTOKOLL