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Die
vorliegende Erfindung stellt neue Verwendungen für Hilfsstoffe in der Herstellung
von Impfstoffen, die intradermal zu verabreichen sind, zur Verfügung. Die
Hilfsstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen ein Saponin und
ein Sterol, wobei das Saponin und das Sterol in einem Liposom formuliert
sind. Die intradermalen Hilfsstoffe werden in der Herstellung von
intradermalen Impfstoffen für
Menschen und in der intradermalen Behandlung von Menschen verwendet.
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Die
gegenwärtige
Impfpraxis ist gegenüber
einer intramuskulären
Verabreichung von Impfstoffen erheblich voreingenommen. Die intramuskuläre Route
ist über
einen Zeitraum von Dekaden extensiv studiert worden, hat einen langen
Weg des Erfolgsnachweises aus einer Anzahl von Gründen, einschließlich der
Tatsache, daß der
Muskel zur Stimulierung von Immunantworten effizient ist; auch daß es leicht
und üblich
ist, Impfstoffe in wiederholbarer Weise an den Muskel abzugeben.
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Im
Gegensatz dazu hat die Impfung über
andere Routen bewiesen, entweder schwierig in der Verabreichung
in wiederholbarer Weise zu sein, oder hatte unterschiedlichen Erfolg
in der Herbeiführung
von Immunantworten, die denen gleichwertig sind, die durch die intramuskuläre Route
erreicht wurden. Aus diesen Gründen
wird die überwiegende
Mehrheit von Impfungen, insbesondere nicht-lebende Impfstoffe, intramuskulär verabreicht.
Jedoch sind intramuskuläre
Impfstoffe mit erheblichen Nachteilen verbunden, die es wünschenswert
machen, andere Routen der Impfung zu entwickeln. Beispielsweise
erfordern intramuskuläre
Impfstoffe eine Verabreichung des Impfstoffes tief in das Gewebe,
mittels langer hypodermer Nadeln, die beim Patienten zu einer "Nadelangst" führen und
mit einer verminderten Compliance-Einstellung gegenüber einer
Impfung verbunden ist. Zusätzlich
lösen einige
intramuskulär
verabreichte Impfstoffe eine signifikante lokale und systemische
Reaktogenität
aus, wie eine lokale Muskelentzündung
oder eine Nekrose und damit verbundener Schmerz, oder systemische
Effekte, wie Kopfschmerzen, Übelkeit
oder "grippeähnliche" Syndrome.
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Demzufolge
besteht ein Bedarf, Alternativen zu intramuskulären Impfprotokollen zu entwickeln,
die wenigstens so effizient sind, wie eine intramuskuläre Impfung
und bevorzugt besser als diese sind.
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Saponine
werden in Lacaille-Dubois, M. und H. Wagner (1996, A review of the
biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine,
Bd. 2, S. 363–386)
gelehrt. Saponine sind Steroid- oder Triterpenglycoside, die in
der Pflanzenwelt und der Welt der Meerestiere weitverbreitet sind.
Saponine sind bekannt, kolloidale Suspensionen in Wasser zu bilden,
die beim Schütteln
schäumen,
und sie sind bekannt, Cholesterol auszufällen. Wenn Saponine nahe von
Zellmembranen sind, schaffen sie in der Membran porenähnliche
Strukturen, die die Membran veranlassen, aufzuplatzen. Die Hämolyse von
Erythrozyten ist ein Beispiel für
dieses Phänomen,
das eine Eigenschaft bestimmter, jedoch nicht aller Saponine ist.
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Saponine
sind als Hilfsstoffe in Impfstoffen zur systemischen Verabreichung
bekannt. Der Hilfsstoff und die hämolytische Aktivität individueller
Saponine wurden extensiv auf dem Fachgebiet studiert (Lacaille-Dubois
und Wagner, oben). Beispielsweise werden Quil A (gewonnen aus der
Rinde des südamerikanischen
Baumes Quillaja Saponaria Molina) und Fraktionen davon in
US 5,057,540 und "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C.R., Crit.
Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1-2): 1–55; und
EP 0 362 279 B1 beschrieben.
Einzelne Strukturen, die als Immune Stimulating Complexes (ISCOMS)
bezeichnet werden, die Fraktionen von Quil A umfassen, sind hämolytisch
und wurden in der Herstellung von Impfstoffen verwendet (Morein,
B.,
EP 0 109 942 B1 ;
WO 96/11711; WO 96/33739). Die hämolytischen
Saponine QS21 und QS17 (HPLC-gereinigte Fraktionen von Quil A) wurden
als potente systemische Hilfsstoffe beschrieben, und das Verfahren
zu ihrer Herstellung wird in US-Patent Nr. 5,057,540 und
EP 0 362 279 B1 beschrieben.
Andere in systemischen Impfstudien verwendete Saponine schließen die
von anderen Pflanzenspezies abgeleiteten ein, wie Gypsophilia und
Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572–577, 1992).
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Die
Verabreichung von QS21 in die Haut von Mäusen wurde in Kensil et al.,
1991, J. Immunol., 146(2): 431-7 beschrieben. Jedoch ist in dieser
Studie nicht sicher, ob wegen der technischen Beschränkungen
des Mäusehautmodells
das QS21 in die Dermis verabreicht wurde.
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Die
Saponin-Hilfsstoffe erfordern auch, in einer relativ hohen Dosis
an den Muskel abgegeben zu werden. Die oben beschriebenen Saponin-Hilfsstoffe
sind in unterschiedlichem Ausmaß schmerzvoll,
wenn sie intramuskulär
verabreicht werden. Es besteht daher ein Bedarf, die Qualität und Größenordnung
der Immunantwort, die durch intramuskuläre Impfstoffe, die ein Saponin
umfassen, ausgelöst
wird, zu verbessern.
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Die
hierin beschriebenen intradermalen Hilfsstoffe umfassen ein Saponin
und ein Sterol, wobei das Saponin und das Sterol in einem Liposom
formuliert sind. Die Verwendung dieser Hilfsstofformulierungen in der
Herstellung von intradermalen Impfstoffen für Menschen wird durch die vorliegende
Erfindung zur Verfügung
gestellt. Derartige humane intradermale Impfstoffe stimulieren überraschenderweise
signifikante Immunantworten gegen ein mitverabreichtes Antigen,
die in der Größenordnung
wenigstens so hoch sind wie die, die durch eine intramuskuläre Verabreichung
ausgelöst
werden, jedoch erfordert die Verwendung von Liposomen der vorliegenden
Erfindung erheblich weniger Antigen, um so zu wirken, und/oder signifikant
weniger Saponin-Hilfsstoff mit einer einhergehenden Verminderung
der reaktogenen Antworten.
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Bevorzugte
Sterole schließen
R-Sitosterol, Stigmasterol, Ergosterol, Ergocalciferol und Cholesterol ein.
Diese Sterole sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt, z.B.
ist Cholesterol im Merck-Index, 11. Ausgabe, Seite 341, als ein
im tierischen Fett natürlich
vorkommendes Sterol offenbart. Das am meisten bevorzugte Sterol
ist Cholesterol.
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Vorzugsweise
ist das Liposom ein einschichtiges Liposom. Die Hilfsstofformulierung
umfaßt
vorzugsweise ferner ein Lipid, das in der Lage ist, eine Zweischichtmembran
zu bilden. Dementsprechend enthalten die Liposome vorzugsweise ein
neutrales oder zwitterionisches Lipid (z.B. Phosphatidylcholin),
das bei Raumtemperatur vorzugsweise nicht kristallin ist, z.B. Eigelbphosphatidylcholin,
Dioleylphosphatidylcholin oder Dilaurylphosphatidylcholin, und unter
diesen Lipiden ist Dioleylphosphatidylcholin am meisten bevorzugt.
Die Vesikel können
auch ein beladenes Lipid enthalten, das die Stabilität der Liposomstruktur
für Liposomen,
die aus gesättigten
Lipiden zusammengesetzt sind, erhöht. In diesen Fällen beträgt die Menge
eines beladenen Lipids vorzugsweise 1 bis 20 Gew.%, am meisten bevorzugt
5 bis 10 Gew.%.
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Das
Verhältnis
von Sterol zu Phospholipid ist 1 bis 50 % (mol/mol), am meisten
bevorzugt 20 bis 25 %.
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Wenn
beide vorhanden sind, beträgt
typischerweise das Sterol (Cholesterol):Phosphatidylcholin-Verhältnis 1:4
(G/G).
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Liposome können einschichtig
oder vielschichtig sein. Am meisten bevorzugt sind Vesikel, die
einschichtige Liposomen sind. Der Durchmesser der Vesikel, wenn
er durch dynamische Lichtstreuungstechniken (wie zum Beispiel Messung
durch einen Malvern ZetasizerTM oder einen
Coulter CounterTM) gemessen wird, bewegt
sich typischerweise im Bereich von 10 bis 1000 nm und besonders
bevorzugt zwischen 10 und 220 nm, und besonders bevorzugt in einer
Größe zwischen
10 und 150 nm und am meisten bevorzugt zwischen 70 und 150 nm im
Durchmesser, wie ungefähr
115 nm (alle Bereiche sind als Größe "durch ihre Intensität" ausgedrückt). Bevorzugt sind wenigstens
90 % der Partikel innerhalb des spezifizierten Größenbereiches,
und am meisten bevorzugt sind wenigstens 95 % der Partikel innerhalb
der spezifizierten Bereiche vorhanden.
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Bevorzugte
Saponine sind diejenigen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, immunstimulierend
zu wirken. Die Saponine können
aus natürlichen
Quellen gereinigt sein, oder sie können Derivate von Saponinen sein,
die aus natürlichen
Quellen stammen. Alternativ können
die Saponine halb- oder vollsynthetisch sein. Halbsynthetische Saponine
können
aus anderen Chemikalien, die keine Saponine sind, zusammengesetzt werden.
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Die
am meisten bevorzugten Saponine sind immunstimulatorische, gereinigte,
synthetische oder halbsynthetische Saponine, die von der Rinde von
Quillaja Saponaria Molina stammen können. Die zu verwendenden Zusammensetzungen
enthalten eine immunologisch aktive Saponinfraktion aus der Rinde
von Quillaja Saponaria Molina in substantiell gereinigter Form.
Mit "gereinigtes
Saponin" ist ein
substantiell reines Saponin gemeint, das nach einem oder mehreren
der folgenden Standards gereinigt wurde: 1) Auftreten als nur eine größere Kohlenhydrat-Farbbande
auf Silicagel DC (EM Science HPTLC Si60) in einem Lösungsmittelsystem aus
40 mM Essigsäure
in Chloroform/Methanol/Wasser (60/45/10 Vol/Vol/Vol); 2) Auftreten
als nur eine größere Kohlenhydrat-Farbbande
in der Umkehrphasen-DC (EM Science Silica Gel RP-8) in einem Lösungsmittelsystem
aus Methanol/Wasser (70/30 V/V); oder 3) Auftreten als nur ein größerer Peak
bei Umkehrphasen-HPLC in einem Vydac C4 (5 μm Partikelgröße, 300 Å Porengröße, 4,6 mm ID × 25 cm
L) in 40 mM Essigsäure
in Methanol/Wasser (58/42 V/V) oder 4) wenigstens zu 90 % rein,
wie definiert, indem es frei von anderen Bestandteilen ist, die
in der Natur normalerweise mit dem Saponin einhergehen. Die Reinheit
von Saponinfraktionen kann unter Verwendung von HPLC-Techniken,
die in US-Patent
Nr. 5,057,540 beschrieben sind, gemessen werden.
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Bevorzugt
enthalten die in der Erfindung zu verwendenden Zusammensetzungen
die Saponinfraktion QS21. QS21 liegt vorzugsweise in substantiell
gereinigter Form vor, d.h. wie es durch Sammlung eines einzelnen
HPLC-Peaks nach Abtrennung eines Saponins aus der Rinde von Quillaja
saponaria molina isoliert wird, oder spezifischer ist das QS21 wenigstens
90 % rein, bevorzugt wenigstens 95 % rein und am meisten bevorzugt
wenigstens 98 % rein.
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Andere
in Zusammensetzungen der Erfindung nützliche immunologisch aktive
Saponinfraktionen schließen
QA17/QS17 ein. β-Escin
ist ein anderes bevorzugtes hämolytisches
Saponin zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Hilfsstoffzusammensetzungen.
Escin wird im Merck-Index (12. Ausgabe: Register Nr. 3737) als ein
Gemisch von Saponinen, das im Samen des Roßkastanienbaumes vorkommt,
beschrieben, lateinisch: Aesculus hippocastanum. Seine Isolierung
wird mittels Chromatographie und Reinigung (Fiedler, Arzneimittel-Forsch.
4, 213 (1953)) und mittels Ionenaustauschharzen (Erbring et al.,
US 3,238,190 ) beschrieben. Escin-Fraktionen, α und β, wurden
gereinigt und zeigten sich als biologisch aktiv (Yoshikawa M., et
al. (Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) Aug. 1996, 44(8): 1454–1464)). β-Escin ist
auch als Aescin bekannt.
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Ein
anderes zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugtes
Saponin ist Digitonin. Digitonin wird im Merck-Index (12. Ausgabe,
Registrier-Nr. 3204) als ein Saponin beschrieben, das aus den Samen von
Digitalis purpurea stammt und entsprechend dem bei Gisvold et al.,
J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, 664; und Ruhenstroth-Bauer, Physiol.
Chem , 1955, 301, 621 beschriebenen Verfahren gereinigt wird. Seine
Verwendung wird als klinisches Reagens zur Cholesterolbestimmung
beschrieben.
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Kleine
einschichtige Vesikel (SUV) mit einem mittleren Teilchendurchmesser
zwischen 40–150
nm, die das Saponin und das Sterol umfassen (bevorzugt QS21 und
Cholesterol), wobei dann ein Sterolüberschuß vorhanden ist, sind zur Verwendung
in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte Adjuvantien.
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Das
Verhältnis
von Saponin:Sterol in den liposomalen Hilfsstofformulierungen zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird typischerweise in
der Größenordnung
von 1:100 bis 1:1 Gew./Gew. sein. Bevorzugter ist ein Sterolüberschuß vorhanden,
und bevorzugter beträgt
das Verhältnis
von Saponin:Sterol wenigstens 1:2 (Gew./Gew.), und am meisten bevorzugt
wird das Verhältnis
1:5 (Gew./Gew.) betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform,
wenn das Saponin QS21 ist, wird das Verhältnis von QS21, das innerhalb
der Saponinfraktion enthalten ist, zu Sterol typischerweise in der
Größenordnung
von 1:100 bis 1:1 Gew./Gew. betragen. Bevorzugt ist ein Sterolüberschuß gegenüber QS21
vorhanden, und bevorzugter ist das Verhältnis von QS21:Sterol wenigstens
1:2 Gew./Gew., und am meisten bevorzugt wird das Verhältnis 1:5
(Gew./Gew.) betragen. In all diesen offenbarten Verhältnissen
ist Cholesterol das bevorzugte Sterol und die Verhältnisse
gelten in gleicher Weise hierfür.
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Zur
humanen Verabreichung werden Saponin und Sterol typischerweise in
einem Impfstoff im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 100 μg, bevorzugt
etwa 10 μg
bis etwa 50 μg
per Dosis vorhanden sein.
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Gegebenenfalls
schließen
die Hilfsstoffe und diese umfassende Verwendungen ferner ein LPS-Derivat ein.
Ein enterobakterielles Lipopolysaccharid (LPS) ist ein potenter
Stimulator des Immunsystems, obwohl seine Verwendung in Impfstoffen
aufgrund seiner toxischen Effekte nicht mehr häufig ist. Ein nicht-toxisches
Derivat von LPS, Monophosphoryllipid A (MPL), das durch Entfernung
der Kernkohlenwasserstoffgruppe und des Phosphats vom reduzierenden
Ende des Glucosamins hergestellt wird, ist von Ribi et al. (1986,
Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum
Publ. Corp., NY, S. 407–419)
beschrieben worden und hat die folgende Struktur:
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Eine
weitere entgiftete Version des MPL wird durch Entfernung der Acylkette
aus der 3-Stellung des Disaccharidgerüstes erhalten und wird als
3-O-deacyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL) bezeichnet. Es kann
durch die in
GB 21 22
204 B erläuterten
Verfahren gereinigt und hergestellt werden, wobei dieses Bezugsdokument
auch die Herstellung von Diphosphoryllipid A und 3-O-deacylierten
Varianten davon offenbart. Eine bevorzugte Form des 3D-MPL ist in
der Form einer Emulsion, die eine kleine Partikelgröße von weniger als
0,2 μm im
Durchmesser hat, und das Verfahren zu ihrer Herstellung wird in
WO 94/21292 offenbart. Wäßrige Formulierungen,
die ein Monophosphoryllipid A und ein Netzmittel umfassen, wurden
in WO 98/43670A2 beschrieben.
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Die
von dem bakteriellen Lipopolysaccharid abgeleiteten Hilfsstoffe,
die in den Hilfsstoffen der vorliegenden Erfindung formuliert werden
können,
können
aus bakteriellen Quellen gereinigt und hergestellt werden, oder
sie können
alternativ synthetisch sein. Beispielsweise wird ein gereinigtes
Monophosphoryllipid A in Ribi et al., 1986 (oben) beschrieben, und
das von Salmonella sp. abgeleitete 3-O-deacylierte Monophosphoryllipid
A oder -diphosphoryllipid A wird in
GB
22 20 211 und
US 4,912,094 beschrieben.
Andere gereinigte und synthetische Lipopolysaccharide wurden beschrieben
(
US 6,055,099 und
EP 0 729 473 B1 ;
Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392-6
Hilgers et a., 1987, Immunology, 60(1): 141-6; und
EP 0 549 074 B1 ). Besonders
bevorzugte bakterielle Lipopolysaccharid-Hilfsstoffe sind die in
US 6,005,099 und
EP 0 729 473 B1 beschriebenen
3D-MPL und die R(1-6) Glucosamindisaccharide.
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Dementsprechend
sind die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren LPS-Derivate
solche Immunstimulantien, die in ihrer Struktur der von LPS oder
MPL oder 3D-MPL ähnlich
sind. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die
LPS-Derivate ein acyliertes Monosaccharid sein, das eine Untereinheit zu
der oben genannten MPL-Struktur ist.
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Ein
bevorzugter Hilfsstoff in Form eines LPS-Disaccharid-Derivates ist
ein gereinigtes oder synthetisches Lipid A der folgenden Formel:
worin
R
2 H oder PO
3H
2 sein kann. R
3 kann
eine Acylkette oder β-Hydroxymyristoyl
oder ein 3-Acyloxyacyl-Rest sein, der die folgende Formel hat:
worin
ist und worin X und Y einen
Wert von 0 bis zu etwa 20 haben.
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Das
LPS-Derivat kann mit den Saponin- und Sterol-enthaltenden Liposomen
formuliert werden oder kann einfach den Saponin- und Sterolenthaltenden
Liposomen zugemischt werden. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen und deren
Verwendungen sind solche, worin Sterol-/Saponinenthaltende Liposome
eingangs ohne das LPS-Derivat hergestellt werden und das LPS-Derivat
anschließend
zugegeben wird, vorzugsweise als Partikel mit einem mittleren Durchmesser
von etwa 100 nm. In diesen Ausführungsformen
ist demzufolge das LPS-Derivat innerhalb der Vesikelmembran (bekannt
als Außen-LPS-Derivat)
nicht enthalten. Zusammensetzungen, worin ein LPS-Derivat innerhalb
der Liposom-Membran (bekannt als Innen-LPS-Derivat) enthalten ist,
bilden ebenfalls einen Aspekt der Erfindung. Diesbezüglich umfassen
die Hilfsstofformulierungen vorzugsweise ein Sterol- und Saponinenthaltendes
Liposom, und das LPS-Derivat (vorzugsweise 3D-MPL) ist innerhalb
der Liposom-Membran enthalten. Intradermale Impfstofformulierungen,
die in der Membran einer liposomalen Formulierung Sterol, Saponin
und 3D-MPL umfassen, sind besonders in der Einleitung von zellvermittelten
Immunantworten potent und bilden einen alternativen Aspekt der vorliegenden
Erfindung.
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Das
Antigen kann innerhalb der Vesikelmembran oder außerhalb
der Vesikelmembran enthalten sein. Bevorzugt befinden sich hydrophile
Antigene außerhalb
und hydrophobe oder mit Lipiden versehene Antigene sind entweder
innerhalb oder außerhalb
der Membranstruktur enthalten. Alternativ können hydrophile Antigene außerhalb
der Membranstruktur, aber innerhalb des Vesikelvolumens gefangen,
sein.
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Bevorzugter
umfassen diese Hilfsstofformulierungen QS21 als Saponin, und 3D-MPL
als LPS-Derivat und Cholesterol als Sterol, worin das Verhältnis von
QS21:Cholesterol von 1:1 bis 1:100 Gewicht/Gewicht beträgt und am
meisten bevorzugt 1:5 Gewicht/Gewicht ist. Solche Hilfsstofformulierungen
werden in
EP 0 822 831
B beschrieben, auf dessen Offenbarung hierin Bezug genommen
wird.
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In
einer alternativen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird hier die Verwendung eines Sterols,
eines Saponins (wie oben beschrieben) und eines immunstimulierenden
Oligonukleotids, das unmethylierte CpG-Dinukleotide (CpG) enthält in der
Herstellung eines intradermalen Impfstoffes zur Behandlung einer Krankheit
zur Verfügung
gestellt. Immunstimulierende Oligonukleotide, die unmethylierte
CpG-Dinukleotide ("CpG") enthalten, sind
auf dem Fachgebiet als Hilfsstoffe bekannt, wenn sie sowohl auf
systemischem Weg und mukosalem Weg verabreicht werden (WO 96/02555,
EP 468520 , Davis et al.,
J. Immunol. 1998, 160(2): 870–876;
McCluskie und Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463-6). CpG ist
eine Abkürzung
für Cytosin-Guanosin-Dinukleotidmotive,
die in der DNA vorhanden sind. Die zentrale Rolle des CG-Motivs
in der Immunstimulation wurde später
in einer Publikation von Krieg, Nature 374, S. 546, 1995 aufgeklärt.
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Die
zur Verwendung in Hilfsstoffen oder Impfstoffen der vorliegenden
Erfindung bevorzugten Oligonukleotide enthalten vorzugsweise zwei
oder mehr Dinukleotid-CpG-Motive, die durch wenigstens drei, bevorzugter
von wenigstens sechs oder mehr Nukleotiden getrennt sind. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind
typischerweise Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Internukleotid im Oligonukleotid Phosphordithionat, oder
bevorzugter eine Phosphorthionat-Bindung, obwohl Phosphodiester-
und andere Internukleotid-Bindungen innerhalb des Umfangs der Erfindung
sind, einschließlich
Oligonukleotide mit gemischten Internukleotid-Bindungen. Verfahren
zur Herstellung von Phosphorthionat-Oligonukleotiden oder Phosphordithionat
werden in
US 5,666,153 ,
US 5,278,302 und WO 95/26204
beschrieben.
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Beispiele
bevorzugter Oligonukleotide haben die folgenden Sequenzen. Bevorzugt
enthalten die Sequenzen Phosphorthionat-modifizierte Internukleotid-Bindungen.
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Alternative
CpG-Oligonukleotide können
die oben bevorzugten Sequenzen umfassen, indem sie zusätzlich unbedeutende
Deletionen oder Additionen haben. Die in der vorliegenden Erfindung
verwendeten CpG-Oligonukleotide können durch jedes auf dem Fachgebiet
bekannte Verfahren synthetisiert werden (z.B.
EP 468520 ). Gewöhnlich können solche Oligonukleotide
mittels eines automatisierten Synthesizers synthetisiert werden.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonukleotide sind typischerweise
Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Internukleotid-Bindung
in dem Oligonukleotid Phosphordithionat, oder bevorzugter eine Phosphorthionat-Bindung,
obwohl Phosphordiester innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung
sind. Oligonukleotide, die unterschiedliche Internukleotid-Bindungen
umfassen, sind berücksichtigt,
z.B. gemischte Phosphorthionatphosphodiester. Andere Internukleotid-Bindungen,
die das Oligonukleotid stabilisieren, können verwendet werden.
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Soweit
hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "intradermale Abgabe" die Abgabe des Impfstoffes an die Lederhaut
in der Haut. Jedoch wird der Impfstoff nicht notwendigerweise exklusiv
in die Lederhaut verbracht sein. Die Lederhaut ist die Schicht in
der Haut, die sich zwischen etwa 1,0 und etwa 2,0 mm von der Oberfläche in der
menschlichen Haut befindet, aber es gibt eine bestimmte Variationsmenge
zwischen Individuen und in unterschiedlichen Teilen des Körpers. Im
allgemeinen kann erwartet werden, die Lederhaut zu erreichen, indem
1,5 mm unter die Hautoberfläche
gegangen wird. Die Lederhaut befindet sich zwischen dem Stratum
corneum und der an der Oberfläche
befindlichen Epidermis und der Unterhautschicht darunter. In Abhängigkeit
von der Art der Abgabe, kann sich der Impfstoff letztendlich allein
oder in erster Linie innerhalb der Lederhaut befinden, oder er kann
letztendlich innerhalb der Epidermis und der Lederhaut verteilt
sein.
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Die
herkömmliche
Technik einer intradermalen Injektion, das "Mantoux-Verfahren", umfaßt die Schritte: Reinigen der
Haut, anschließendes
Straffen mit einer Hand und mit der Schrägkante einer engen Gauge-Nadel
(26–31
Gauge), die nach oben gewandt ist, wird die Nadel in einem Winkel
zwischen 10 bis 15 Grad eingeführt.
Sobald die Schrägkante
der Nadel eingeführt
ist, wird der Spritzenzylinder der Nadel abgesenkt und anschließend mit
leichtem Druck nach vorn getrieben, um sie unter die Haut zu heben.
Die Flüssigkeit
wird anschließend
sehr langsam injiziert, wobei sich ein Bläschen oder eine Blase an der
Hautoberfläche
bildet, gefolgt vom langsamen Entfernen der Nadel.
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In
jüngster
Zeit wurden Vorrichtungen beschrieben, die spezifisch entwickelt
wurden, um flüssige
Wirkstoffe in oder durch die Haut zu verabreichen, z.B. die in WO
99/34850 und
EP 10 92 444 beschriebenen
Vorrichtungen, aber auch Jet-Injektionsvorrichtungen, die beispielsweise
in WO 01/13977;
US 5,480,381 ,
US 5,599,302 ,
US 5,334,144 ,
US 5,993,412 ,
US 5,649,912 ,
US 5,569,189 ,
US 5,704,911 ,
US 5,383,851 ,
US 5,893,397 ,
US 5,466,220 ,
US 5,339,163 ,
US 5,312,335 ,
US 5,503,627 ,
US 5,064,413 ,
US 5,520,639 ,
US 4,596,556 ,
US 4,790,824 ,
US 4,941,880 US 4,940,460 , WO 97/37705 und WO 97/13537
beschrieben wurden. Alternative Verfahren der intradermalen Verabreichung
von Impfstoffzubereitungen können
herkömmliche Spritzen
und Nadeln oder Vorrichtungen, die zur ballistischen Abgabe von
Feststoffimpfstoffen entworfen wurden (WO 99/27961), oder transdermale
Pflaster (WO 97/48440; WO 98/28037) oder die auf der Hautoberfläche angewandt
werden (transdermale oder transkutane Abgabe, WO 98/20734; WO 98/28037),
einschließen.
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In
der vorliegenden Erfindung werden Liposomen in der Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung von Individuen verwendet, die an einer
Krankheit oder einem chronischem Leiden leiden, die die Verabreichung
einer Zusammensetzung in die Lederhaut eines Individuums umfaßt, wobei
die Zusammensetzung eine liposomale Zusammensetzung umfaßt, worin
das Liposom ein Sterol und ein immunologisch aktives Saponin, wie
hierin beschrieben, umfaßt.
Bevorzugt ist das Saponin ein gereinigtes oder ein synthetisches
Saponin aus der Quillaja Saponaria-Rinde, und Cholersterol-Adjuvantien
sind in einem einschichtigen Liposom formuliert. Die bevorzugten
Behandlungsmethoden sind die Behandlungen von Krankheiten, die durch
die folgenden Pathogene verursacht werden: humaner Papilloma-Virus;
respiratorischer Syncytium-Virus, Hepatitis B- und/oder Hepatitis
A-Virus (-Viren); Meningitis B; Meningokokken und/oder Haemophilus
influenzae b und/oder andere Antigene; Streptococcus pneumoniae;
Varicella Zoster-Virus.
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Bevorzugt
umfaßt
die Behandlungsmethode auch die Zugabe eines LPS-Derivates oder die Zugabe von CpG zu
der Hilfsstofformulierung.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Impfstofformulierungen
enthalten ein Antigen oder eine antigene Zusammensetzung, die in
der Lage ist, eine Immunantwort gegenüber einem menschlichen Pathogen
auszulösen,
wobei ein Antigen oder eine antigene Zusammensetzung abgeleitet
ist, von : HIV-1
(wie tat, nef, gp 120 oder gp 160) humanen Herpesviren (HSV), wie
gD oder Derivaten davon oder Immediate Early-Protein wie IC27 von
HSV1 oder HSV2, Cytomegalovirus (CMV (insbesondere humanes) (wie
gB oder Derivate davon), Rotavirus (einschließlich abgeschwächte Lebend-Viren),
Epstein Barr-Virus (wie gp350 oder Derivate davon), Varicella Zoster-Virus
(VZV, wie gpI, II und IE63), oder von einem Hepatitis-Virus abstammend,
wie Hepatitis B-Virus (zum Beispiel Hepatitis B-Oberflächenantigen
oder ein Derivat davon), Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis C-Virus
und Hepatitis E-Virus,
oder von anderen viralen Pathogenen, wie Paramyxoviren: respiratorisches
Syncytiumvirus (RSV, wie F- und G-Proteine oder Derivate davon),
Parainfluenza-Virus, Masern-Virus, Mumps-Virus, humane Papilloma-Viren (HPV, zum Beispiel
HPV6, 11, 16, 18), Flaviviren (z.B. Gelbfiebervirus, Dengue-Virus,
Zecken-Enzephalitis-Virus, Japan-Enzephalitis-Virus)
oder Influenzavirus (ganze Lebend- oder inaktivierte Viren, Spalt-Influenza-Virus,
in Eiern oder MDCK-Zellen gezüchtet,
oder ganze Flu-Virosomen (wie von R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915–920 beschrieben)
oder gereinigte oder rekombinante Proteine davon, wie HA-, NP-,
NA- oder M-Proteine oder Kombinationen davon) oder derivatisiert
aus bakteriellen Pathogenen, wie Neisseria spp., einsschließlich N.
gonorrhea und N. meningitidis (zum Beispiel Kapselpolysaccharide
und Konjugate davon, Transferrin-bindende Proteine, Lactoferrin-bindende
Proteine, PilC, Adhäsine);
S. pyogenes (zum Beispiel M-Proteine oder Fragmente davon, C5A-Protease, Lipoteichonsäuren), S.
agalactiae, S. Mutanten; H. ducreyi; Moraxella spp, einschließlich M.
catarrhalis, auch bekannt als Branhamella catarrhalis (zum Beispiel
Adhäsine
und Invasine mit niedrigem und hohem Molekulargewicht); Bordetella
spp., einschließlich
B. pertussis (zum Beispiel Pertactin, Pertussistoxin oder Derivate
davon, faseriges Hämagglutinin,
Adenylatcyclase, Fimbriae), B. parapertussis und B. bronchiseptica;
Mycobacterium spp., einschließlich
M. tuberculosis (zum Beispiel ESAT6, Antigen 85A, -B oder -C), M.
bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella
spp. einschließlich
L. pneumophila; Escherichia spp., einschließlich enterotoxisches E. coli
(zum Beispiel Koloniefaktoren, hitzelabiles Toxin oder Derivate
davon, hitzestabiles Toxin oder Derivate davon), enterohämorrhagisches
E. coli, enteropathogenes E. coli (zum Beispiel Shigatoxin-artiges
Toxin oder Derivate davon); Vibrio spp., einschließlich V.
cholera (zum Beispiel Cholera-Toxin oder Derivate davon); Shigella
spp., einschließlich
S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., einschließlich Y.
enterocolitica (zum Beispiel ein Yop-Protein), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis;
Campylobacter spp., einschließlich
C. jejuni (zum Beispiel Toxine, Adhäsine und Invasine) und C. coli;
Salmonella spp., einschließlich
S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria
spp., einschließlich
L. Monocytogenes; Helicobacter spp., einschließlich H. pylori (zum Beispiel
Urease, Catalase, vakuolisierendes Toxin); Pseudomonas spp., einschließlich P.
aeruginosa; Staphylococcus spp., einschließlich S. aureus, S. epidermidis;
Enterococcus spp., einschließlich
E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., einschließlich C.
tetani (zum Beispiel Tetanustoxin und Derivate davon), C. botulinum
(zum Beispiel Botulinum-Toxin und Derivate davon), C. difficile (zum
Beispiel Clostridium-Toxine A oder B und Derivate davon), Bacillus
spp., einschließlich
B. anthracis (zum Beispiel Botulinum-Toxin und Derivate davon),
Corynebacterium spp., einschließlich
C. diphtheriae (zum Beispiel Diphterie-Toxin und Derivate davon);
Borrelia spp., einschließlich
B. burgdorferi (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii
(zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (zum Beispiel
OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (zum Beispiel OspA, OspC,
DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., einschließlich E.
equi und das Mittel für
Human Granulocytic Ehrlichiosis; Ricksettsia spp., einschließlich R.
rickettsii; Chlamydia spp., einschließlich C. trachomatis (zum Beispiel
MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. pneumoniae (zum Beispiel MOMP,
Heparin-bindende Proteine), C. psittaci; Leptospira spp., einschließlich L.
interrogans; Treponema spp., einschließlich T. palladium (zum Beispiel
die seltenen äußere Membranproteine),
T. denticola, T. hyodysenteriae; oder von Parasiten, wie Plasmodium
spp., einschließlich
P. falciparum abgeleitet; Toxoplasma spp.,einschließlich T.
gondii (zum Beispiel SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., einschließlich E.
histolytica; Babesia spp., einschließlich B. microti; Trypanosoma
spp., einschließlich
T. cruzi; Giardia spp., einschließlich G. lamblia; Leshmania
spp., einschließlich
L. major; Pneumocystis spp., einschließlich P. carinii; Trichomonas
spp., einschließlich
T. vaginalis; Schisostoma spp., einschließlich S. mansoni oder von Hefe
abgeleitet, wie Candida spp., einschließlich C. albicans; Cryptococcus
spp.,einschließlich
C. neuformans.
-
Andere
bevorzugte spezifische Antigene für M. tuberculosis sind zum
Beispiel Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL,
mTTC2 und hTCC1 (WO 99/51748). Proteine für M. tuberculosis schließen auch
Fusionsproteine und Varianten davon ein, wobei wenigstens zwei,
vorzugsweise drei Polypeptide von M. tuberculosis in ein größeres Protein
fusioniert sind. Bevorzugte Fusionen schließen ein: Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI,
DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2,
Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2. TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748).
-
Die
am meisten bevorzugten Antigene für Chlamydia schließen zum
Beispiel ein Protein mit einem hohem Molekulargewicht (HWMP) (WO
99/17741), ORF3 (
EP 366 412 )
und mutmaßliche
Membranproteine (Pmps) ein. Andere Chlamydia-Antigene der Impfstofformulierung
können
aus der Gruppe, die in WO 99/28475 beschrieben wurde, ausgewählt werden.
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Bevorzugte
bakterielle Impfstoffe umfassen Antigene, die abgeleitet sind, von:
Streptococcus spp., einschließlich
S. pneumoniae (zum Beispiel Kapselpolysaccharide und Konjugate davon,
PsaA, PspA, Streptolysin, Cholinbindende Proteine) und das Protein-Antigen
Pneumolysin (Biochem. Biophys. Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al.,
Microbial Pathogenesis, 25, 337–342)
und entgiftete Mutantenderivate davon (WO 90/06951; WO 99/03884).
Besonders bevorzugte Pneumokokken-Impfstoffe sind die, die in WO
00/56539 beschrieben wurden.
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Die
Pht-Antigene (Poly-Histidin-Dreiergruppe) sind bevorzugte Streptococcus-Antigene,
für die
Verwendungen, pharmazeutischen Zubereitungen und Methoden der vorliegenden
Erfindung. Die Pht-Familie (Poly-Histidin-Dreiergruppe) umfaßt die Proteine
PhtA, PhtB, PhtD und PhtE. Die Familie ist charakterisiert durch:
eine Lipidisierungssequenz, zwei Domänen, die durch eine prolinreiche
Region und verschiedene Histidin-Dreiergruppen
getrennt sind, die möglicherweise
eine Metall- oder Nukleotidbindung oder eine enzymatische Aktivität mit sich
bringen, (3-5) ungeordnete Knäuelregionen,
einen beibehaltenen N-Terminus und einen heterogenen C-Terminus.
Sie ist in allen Stämmen
der getesteten Pneumokokken vorhanden. Homologe Proteine wurden
auch in anderen Streptokokken und in Neisseria gefunden. Bevorzugte
Familienmitglieder umfassen PhtA, PhtB und PhtD. Bevorzugter umfassen
sie PhtA oder PhtD. Das am meisten bevorzugte Pht-Antigen ist PhtD.
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Jedoch
ist klar, daß die
Bezeichnungen Pht A, B, D und E sich auf Proteine beziehen, die
die in den unten genannten Zitaten offenbarten Sequenzen haben,
sich aber auch auf natürlich
vorkommende Varianten davon beziehen (und vom Menschen hergestellt),
die eine Sequenzhomologie aufweisen, die wenigstens 90 % Identität mit den
in bezug genommenen Proteinen aufweist. Vorzugsweise liegt wenigstens
eine 95%ige Identität
und am meisten bevorzugt eine 97%ige Identität vor.
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Im
Hinblick auf die PhtX-Proteine ist PhtA in WO 98/18930 offenbart
und wird auch als Sp36 wiedergegeben. Wie oben erwähnt, ist
es ein Protein aus der Polyhistidin-Dreiergruppen-Familie und hat
das Typ-II-Signalmotiv von LXXC.
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PhtD
wird in WO 00/37105 offenbart und wird auch als Sp036D wiedergegeben.
Wie oben erwähnt, ist
es auch ein Protein aus der Polyhistidin-Dreiergruppenfamilie und hat das Typ-II-LXXC-Signalmotiv.
-
PhtB
wird in WO 00/37105 offenbart und auch als Sp036B wiedergegeben.
Ein anderes Mitglied der PhtB-Familie ist das C3-abbauende Polypeptid,
wie in WO 00/17370 offenbart. Dieses Protein stammt auch aus der
Polyhistidin-Dreiergruppen-Familie
und hat das Typ-II-LXXC-Signalmotiv. Ein bevorzugtes immunologisch
funktionelles Äquivalent
ist das Protein Sp42, das in WO 98/18930 offenbart wurde. Ein PhtB-Trunkat (angenähert 79
kD) wird in WO 99/15675 offenbart, das auch für ein Mitglied der PhtX-Familie
angesehen wird.
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PthE
wird in WO 00/30299 offenbart und als BVH-3 wiedergegeben. Andere
bevorzugte bakterielle Impfstoffe umfassen Antigene, die von Haemophilus
spp. stammen, einschließlich
H. influenzae Typ B ("Hib", zum Beispiel PRP
und Konjugate davon), nicht-typisierbare H. influenzae, zum Beispiel
OMP26, Adhäsine
mit hohem Molekulargewicht, P5, P6, Protein D und Lipoprotein D
und Fimbrin und vom Fimbrin abgeleitete Peptide (
US 5,843,464 ) oder Mehrfachkopievarianten
oder Fusionsproteine davon.
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Derivate
eines Hepatitis B-Oberflächenantigens
sind auf dem Fachgebiet gutbekannt und schließen unter anderem solche erwähnten PreS1-,
PreS2-S-Antigene ein, die in den europäischen Patentanmeldungen EP-A-414 374, EP-A-0 304
578 und
EP 197 474 erläuternd beschrieben
wurden. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt die erfindungsgemäße Impfstofformulierung
das HIV-1-Antigen, gp120, insbesondere, wenn es in CHO-Zellen exprimiert ist.
In einer weiteren Ausführungsform
umfaßt
die Impfstofformulierung der Erfindung gD2t, wie oben definiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfassen Impfstoffe, die den beanspruchten
Hilfsstoff enthalten, ein Antigen, das vom menschlichen Papilloma-Virus
(HPV) abgeleitet ist, und das für
Genitalwarzen (HPV6 oder HPV11 und andere) verantwortlich angesehen
wird, und HPV-Viren, die für Gebärmutterhalskrebs
(HPV16, HPV18 und andere) verantwortlich sind.
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Im
einzelnen bevorzugte Formen eines der Prophylaxe oder Therapie gegen
Genitalwarzen dienenden Impfstoffs umfassen L1-Partikel oder Capsomere
und Fusionsproteine, die ein oder mehrere Antigene, die aus HPV6
und HPV11 Proteinen E6, E7, L1 und L2 ausgewählt sind, umfassen.
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Die
am meisten bevorzugten Formen der Fusionsproteine sind: L2E7, wie
in WO 96/26277 offenbart, und Protein D/1/3)-E7, das in
GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285)
offenbart wurde.
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Eine
bevorzugte Impfstoffzusammensetzung zur Prophylaxe oder Therapie
von HPV-Gebärmutterhalsinfektion
oder Gebärmutterhalskrebs
kann HPV16- oder HPV18-Antigene umfassen. Beispielsweise sind Monomere
eines L1- oder L2-Antigens
oder L1- oder L2-Antigene zusammen als ein virusähnliches Partikel (VLP) vorhanden
oder das L1-Allein-Protein ist allein in einer VLP- oder Capsomer-Struktur
vorhanden. Derartige Antigene, virusähnliche Partikel und Capsomere
sind per se bekannt. Siehe zum Beispiel WO 94/00152, WO 94/20137,
WO 94/05792 und WO 93/02184.
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Zusätzlich können Frühproteine
allein oder als Fusionsproteine, wie beispielsweise E7, E2, oder
bevorzugt E5, enthalten sein; besonders bevorzugte Ausführungsformen
davon schließen
ein VLP ein, das L1E7-Fusionsproteine umfaßt (WO 96/11272).
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Besonders
bevorzugte HPV16-Antigene umfassen die Frühproteine E6 oder E7 in Verschmelzung
mit einem Protein D-Trägerstoff,
um Protein D-E6- oder -E7-Fusionen von HPV16, oder Kombinationen
daraus zu bilden oder Kombinationen aus E6 oder E7 mit L2 (WO 96/26277).
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Alternativ
können
die HPV16- oder -18-Frühproteine
E6 und E7 in einem Einzelmolekül
vorhanden sein, bevorzugt eine Protein D-E6/E7-Fusion. Ein solcher
Impfstoff kann gegebenenfalls entweder eines oder beide E6- und
E7-Proteine von
HPV18, bevorzugt in der Form eines Protein D-E6 oder eines Protein
D-E7-Fusionsproteins oder eines Protein D E6/E7-Fusionsproteins
enthalten.
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Der
Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich Antigene aus anderen
HPV-Stämmen,
vorzugsweise aus den Stämmen
HPV31 oder 33 umfassen.
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Die
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Impfstoffe
können
ferner Antigene umfassen, die von Parasiten abgeleitet sind, die
Malaria auslösen.
Beispielsweise schließen
bevorzugte Antigene von Plasmodia falciparum RTS,S und TRAP ein.
RTS ist ein Hybridprotein, das substantiell den gesamten C-terminalen
Teil des Circumsporozoit-Proteins (CS) von P. falciparum umfaßt, das über vier
Aminosäuren des
preS2-Teils des Hepatitis B-Oberflächenantigens an das Oberflächen (S)-Antigen
des Hepatitis B-Virus gebunden ist. Seine gesamte Struktur wird
in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP92/02591, veröffentlicht
unter der Nr. WO 93/10152, unter Beanspruchung der Priorität der UK-Patentanmeldung
Nr. 9124390.7 offenbart. Wenn in Hefe exprimiert, wird RTS als ein
Lipoprotein-Teilchen produziert und wenn es zusammen mit dem S-Antigen
aus HBV exprimiert ist, wird es als gemischtes Teilchen, bekannt
als RTS,S, produziert. TRAP-Antigene werden in der internationalen
Patentanmeldung Nr. PCT/GB89/00895, veröffentlicht als WO 90/01496,
beschrieben. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist die intradermale Verabreichung eines Malariaimpfstoffes,
bei dem die antigene Zubereitung eine Kombination aus den RTS,S-
und TRAP-Antigenen umfaßt.
Andere Plasmodia-Antigene, die wahrscheinlich Kandidaten sind, Bestandteile
eines Mehrstufenimpfstoffes gegen Malaria zu werden, sind P. faciparum
MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332,
LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16,
Pfs48/45, Pfs230 und deren Analoga in Plasmodium spp.
-
Die
verwendeten Formulierungen können
auch ein Antitumor-Antigen enthalten und zur immuntherapeutischen
Behandlung von Krebsarten nützlich
sein. Die Formulierungen können
auch ein Antitumor-Antigen enthalten und für die immuntherapeutische Behandlung
von Krebsarten nützlich
sein. Zum Beispiel findet die Hilfsstofformulierung Anwendung mit
Tumorunterdrückungsantigenen,
wie denen für
Prostatakrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Pankreaskrebs,
Nierenkrebs oder Melanomkrebs. Beispielhafte Antigene schließen ein:
MAGE 1, 3, und MAGE 4 oder andere MAGE-Antigene, wie in WO 99/40188
offenbart, PRAME, BAGE, Lage (auch als NY Eos 1 bekannt), SAGE und
HAGE (WO 99/53061) oder GAGE (Robbins und Kawakami, 1996, Current
Opinions in Immunology 8, 5.628–636;
Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research
(eingereicht 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National
Cancer Institute 89, S. 293. In der Tat werden diese Antigene innerhalb
eines weiten Bereiches von Tumortypen, wie einem Melanomkarzinom,
einem Lungenkarzinom, einem Sarkom und einem Blasenkarzinom exprimiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden Prostataantigene benutzt, wie Prostata-spezifisches Antigen
(PSA), PAP, PSCA (PNAS95(4)1735–1740,
1998), PSMA oder in einer bevorzugten Ausführungsform ein Antigen, das
als Prostase bekannt ist. Andere mit einem Tumor verbundene Antigene,
die im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein:
Plu-1 J. Biol. Chem. 274(22) 15633–15645, 1999, HASH-1, HasH-2, Cripto
(Salomon et al. Bioassays 199, 21, 61–70, US-Patent 5,654,140), Criptin, US-Patent
5,981,215. Zusätzlich
umfassen Antigene, die besonders relevant für Impfstoffe in der Therapie
von Krebs sind, auch Tyrosinase und Survivin. von Schleim abgeleitete
Peptide, wie Muc1, siehe zum Beispiel
US
5,744,144 ,
US 5,827,666 , WO
8805054,
US 4,963,484 .
Besonders überlegenswert
sind von Muc 1 abgeleitete Peptide, die wenigstens eine Wiederholungseinheit
des Muc 1-Peptids umfassen, vorzugsweise wenigstens zwei solcher
Wiederholungseinheiten, und die von dem SM3-Antikörper erkannt
werden (
US 6,054,438 ).
Andere von Schleim abgeleitete Peptide schließen ein Peptid von Muc 5 ein.
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Eine
erfindungsgemäße Impfung
ist auch in Kombination mit Brustkrebs-Antigenen nützlich, wie her 2/Neu, Mammaglobin
(US-Patent 5,668,267 oder die, die in WO/0052165, WO 99/33869, WO
99/19479, WO 98/45328 offenbart sind. Her 2 neu-Antigene werden
unter anderem in US-Patent 5,801,005 offenbart. Bevorzugt umfaßt das Her
2 neu-Antigen die gesamte extrazelluläre Domäne (umfassend angenähert Aminosäuren 1-645)
oder Fragmente davon und wenigstens einen immunogenen Teil der gesamten
intrazellulären
Domäne, ungefähr 580 C-terminale
Aminosäuren.
Insbesondere sollte der intrazelluläre Teil die Phosphorylierungsdomäne oder
Fragmente davon umfassen. Solche Konstrukte sind in WO 00/44899
offenbart.
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Eine
erfindungsgemäße intradermale
Impfung kann zur Prophylaxe oder Therapie einer Allergie verwendet
werden. Solche Impfungen würden
allergenspezifische (z.B. Derp1) und allergen-unspezifische Antigene
(z.B. Peptide, die vom menschlichen IgE abgeleitet sind, einschließlich, jedoch
nicht auf das Stanworth-Decapeptid (
EP 0 477 231 B1 )) beschränkt, umfassen.
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Eine
erfindungsgemäße intradermale
Impfung kann auch zur Prophylaxe oder Therapie von chronischen Erkrankungen,
die keine Allergie, Krebs oder infektiöse Erkrankungen sind, verwendet
werden. Solche chronischen Erkrankungen sind Krankheiten, wie Atherosklerose
und Alzheimer.
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Relevante
Antigene zur Prophylaxe und Therapie von Patienten, die für die Alzheimersche
neurodegenerative Erkrankung empfänglich sind oder an ihr leiden,
sind insbesondere das N-terminale 39-43 Aminosäurefragment (Aβ des Amyloid-Vorläuferproteins
und kleinere Fragmente). Dieses Antigen wird in der internationalen
Patentanmeldung Nr. WO 99/27944, (Athena Neuosciences) offenbart.
-
Bevorzugte
Antigene zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden aus
der Gruppe ausgewählt,
die aus RSV, Streptococcus (und insbesondere in Verwendung der Impfstoffe,
die in WO 00/56359 beschrieben sind, deren Inhalt hier durch Bezugnahme
eingeführt
wird), HSV, HAV, HBV, VZV, HPV und CMV besteht. Zusätzlich können wenigstens
zwei der Impfstoffe in dieser vorzugsweise eingeschränkten Liste
kombiniert werden, um bevorzugte Impfstoffkombinationen zu bilden;
zum Beispiel die Kombination eines Streptococcus- und RSV-Impfstoffes
und eine Kombination eines HPV- und
HSV-Impfstoffes und eine Kombination eines HBV- und HAV-Impfstoffes.
Eine andere spezifische Impfstoffkombination, die in diesem zweiten
Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt den InfanrixTM-Bereich,
der von G1axoSmithKline Biologicals hergestellt wird, ein. Solche
Impfstoffe basieren auf einer "Kern"-Kombination aus
Diphtherietoxin-, Tetanustoxin- und B. pertussis-Antigenen. Dieser
Impfstoff umfaßt
einen Pertussisbestandteil (entweder abgetötetes Ganzzellen-B.-pertussis
oder zellfreies Pertussis, das typischerweise aus zwei Antigenen,
PT und FHA und oft 69 kDa, gegebenenfalls mit einem oder zwei Agglutinogen
2 oder Agglutinogen 3 besteht). Solche Impfstoffe werden oft als
DTPw (Ganzzelle) oder DTPa (zellfrei) wiedergegeben.
-
Einzelne
Kombinationsimpfstoffe innerhalb des Schutzbereiches der Erfindung
schließen
ein:
Diphtherie-Tetanus-Pertussis-Hepatitis B (DTP-HB),
Diphtherie-Tetanus-Hepatitis
B (DT-HB),
Hib-Hepatitis B,
DTP-Hib-Hepatitis B,
IPV
(inaktivierter Polioimpfstoff)-DTP-Hib-Hepatitis B [z.B. Infanrix-Hexa
TM – SmithKline
Beecham Biologicals s.a.],
Diptherie-Tetanus-Pertussis-Hepatitis-B-IPV
(DTP-HB-IPV) [z.B. Infanrix-Penta TM – SmithKline Beecham Biologicals
s.a.].
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Der
Pertussis-Bestandteil ist passenderweise ein Ganzzellen-Pertussisimpfstoff
oder ein zellfreier Pertussis-Impfstoff, der teilweise gereinigte
oder hochgereinigte Antigene enthält. Die vorgenannten Kombinationen
können
gegebenenfalls einen Bestandteil enthalten, der gegenüber Hepatitis
A protektiv ist. Vorzugsweise ist der Hepatitis A-Bestandteil mit Formalin
inaktiviertes HM-175. Vorteilhafterweise wird HM-175 durch Behandlung des kultivierten
HM-175 mit Trypsin gereinigt, indem das intakte Virus aus einem
mit einer kleiner Protease digerierten Protein durch Permeationschromatographie
separiert wird und mit Formalin inaktiviert wird. Vorteilhafterweise
ist der das Hepatitis B-enthaltende Kombinationsimpfstoff ein pädiatrischer
Impfstoff.
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Die
am meisten bevorzugten Antigene werden aus den folgenden Pathogenen
ausgewählt:
humanes Papilloma-Virus; respiratorisches Syncytiumvirus; Hepatitis
B- und/oder Hepatitis A-Virus (Viren), Meningitis B; meningokokkale
Antigene und/oder Haemophilus influenzae b und/oder andere Antigene;
Streptococcus pneumoniae-Antigene allein oder in Kombination mit
anderen Antigenen; Varicella Zoster-Virus.
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Bevorzugt
umfaßt
die zu verwendende Impfstoffzusammensetzung kein Influenza-Antigen.
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Die
Menge eines Antigens in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge
ausgewählt,
die eine immunprotektive Antwort ohne signifikante Nebenwirkungen
in typischen Impflingen auslöst.
Solch eine Menge wird variieren, abhängig davon, welches spezifische
Immunogen verwendet wird und wie es dargeboten wird. Gewöhnlich umfaßt jede
Impfstoffdosis 1 bis 1000 μg
des Antigens oder jeden Antigens, bevorzugt 1 bis 500 μg, bevorzugt
1 bis 100 μg,
am meisten bevorzugt 1 bis 50 μg.
Bevorzugt beträgt
die Gesamtdosis eines Antigens 1 bis 500 μg, bevorzugt 1 bis 100 μg, am meisten
bevorzugt 1 bis 50 μg.
In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die
erhaltenen Impfstoffe "Niedrigdosierungen", indem sie 10 bis
100 μg des
Antigens oder jeden Antigens per Dosis umfassen, bevorzugter 1 bis
20 μg per
Dosis und am meisten bevorzugt etwa 10 μg pro Dosis. Bevorzugter liegt
die Gesamtdosis eines Antigens zwischen 1 und 50 μg, bevorzugter
1 bis 20 μg
per Dosis und am meisten bevorzugt etwa 10 μg pro Dosis. Eine optimale Menge
für einen
einzelnen Impfstoff kann über
Standardstudien, die eine Beobachtung geeigneter Immunantworten
in den Impflingen einschließen,
bestimmt werden. Auf eine Eingangsimpfung folgend, können die
Empfänger
eine oder mehrere Verstärkungsimmunisierungen
in adäquatem
zeitlichem Abstand, erhalten.
-
Bevorzugt
ist der Impfstoff in einem Flüssigkeitsvolumen,
das geringer als für
hierin beschriebene herkömmliche
intramuskuläre
Impfstoffe ist ("geringes
Volumen"), insbesondere
ein Volumen von etwa 0,05 ml und 0,2 ml. Bevorzugt beträgt das Volumen
einer Dosis eines erfindungsgemäßen Impfstoffes
zwischen 0,025 ml und 2,5 ml, bevorzugter ungefähr 0,1 ml oder ungefähr 0,2 ml.
Ein 50 μl
Dosisvolumen könnte
auch in Erwägung
gezogen werden. Eine 0,1 ml-Dosis ist angenähert ein Fünftel bis ein Zehntel des Volumens
einer herkömmlichen
intramuskulären
menschlichen Impfstoffdosis (herkömmlich zwischen 0,5 und 1 ml).
Das Flüssigkeitsvolumen,
das intradermal verabreicht werden kann, hängt teilweise vom Injektionsort
ab. Beispielsweise ist das für
eine Injektion im Bereich des Deltamuskels bevorzugte Maximum 0,1
ml, währenddessen
in der Lendenregion ein größeres Volumen,
z.B. etwa 0,2 ml gegeben werden kann.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt eine Verwendung eines Sterols, eines
Saponins, formuliert in einem Liposom zur Verfügung, in der Herstellung einer
intradermalen Impfstofformulierung mit einer geringen Dosis und
einem geringen Volumen.
-
Beispiel 1: Immunogenität von Spaltimpfstoffen
in Mäusen
-
Spalt-RSV-Formulierungen
-
Die
folgenden experimentellen Reihen veranschaulichen, daß ein Spalt-RSV eine potente
Immunantwort induziert, wenn es über
die intradermale Route (ID) verabreicht wird.
-
Methoden
-
Spalt-RSV
-
Eine
RSV-Probe wurde unter Verwendung von 2 % Natriumdesoxycholat gespalten.
Das zu spaltende Virus wurde über
Nacht bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren mit dem Detergens inkubiert.
-
Nach
Spaltung wurden die Lösungen
gegen eine Pufferformulierung (PO4, 10 mM/NaCl
150 mM, pH 7,5) zur Entfernung des Überschusses des Detergens dialysiert.
-
Analyse: Ultrazentrifugation
-
Nach
Befüllen
eines Zentrifugenröhrchens
zur Hälfte
mit 30%iger Saccharose-Lösung
(450 μl)
wurde die zu analysierende Probe (450 μl) sanft und vorsichtig auf
dieses Saccharosekissen gelegt und anschließend über eine Stunde bei 50 000
Upm bei +4°C
in einem Beckman TL100-Rotor zentrifugiert. Nach der Zentrifugation
wurde der Inhalt des Röhrchens
unter Bildung von 3 Teilen abgegossen. Die obere Phase (300 μl) wird als "Überstand" wiedergegeben. Die mittlere Phase (300 μl) ist die
Verbindungsphase zwischen der Probe und dem Saccharosekissen, hierin "die Mittlere" genannt. Die untere
Phase (300 μl)
ist die Bodenlösung
mit dem resuspen dierten Pellet, wenn die Zentrifugation an einem
ganzen Virus, durchgeführt
wurde; sie wird "Pellet" genannt.
-
Diese
drei Fraktionen wurden dann mittels Western Blot gegen spezifische
virale Antigene analysiert. Diese Analyse erlaubt die Integrität des zu
prüfenden
Virus (positive Pelletfraktion) und die Effektivität der zu bestimmenden
Spaltung (geeignet, Überstandsfraktion
positiv für
alle oder die meisten Strukturproteine, wie die Hüllproteine)
festzustellen.
-
FG-spezifischer ELISA
-
Die
ersten zur Auswertung der Immunantwort verwendeten Immunablesungen
waren ELISA-Assays, die das gesamte RSV FG-spezifische Immunglobulin
(Ig), das in den Seren der geimpften Tiere vorhanden ist, messen.
In diesen Assays wurden 96 Mikrotiterplatten mit rekombinantem RSV
FG-Antigen beschichtet,
und die Tierseren wurden seriell verdünnt und zu den beschichteten
Vertiefungen gegeben. Ein gebundener Antikörper wird durch Zugabe von
Meerrettich-gebundenem Anti-Meerschweinchen-Ig detektiert. Ein gebundener Antikörper wird
durch Zugabe eines OPDA-Substrats offengelegt, gefolgt von einer
Behandlung mit 2 N H2SO4 und
Messung der optischen Dichte (OD) bei 490 nm. Der Antikörpertiter
wird gegenüber
einer Referenz unter Verwendung der SoftMax Pro-Software (Anwendung
einer vier Parameter umfassenden Gleichung) berechnet und in EU/ml
ausgedrückt.
-
Neutralisationsassay
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Zusätzlich zu
den ELISA-Assays wurden Neutralisationsassays mit einbezogen, um
ferner die Qualität der
Immunantwort, die durch die Immunisierungen ausgelöst wurde,
zu charakterisieren. Beim Neutralisationsassay wurden Zweifachverdünnungen
der Tierseren mit RSV/A-Virus (3000 pfu) und Meerschweinchen-Komplement über eine
Stunde bei 37°C
in 96 Vertiefungen aufweisende Gewebekulturplatten inkubiert. Hep-2-Zellen
(104 Zellen/Vertiefung) wurden direkt in
jede Vertiefung gegeben und die Platten über 4 Tage bei 37°C inkubiert.
Die Überstände wurden
abgesaugt und eine käuflich
erhältliche
WST-1-Lösung
wurde jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden für weitere
18–24
Stunden bei 37°C
inkubiert. Das OD wurde bei 450 nm kontrolliert und die Titration
durch lineare Regressionsanalyse analysiert. Der berichtete Titer
ist der inverse der Serumverdünnung,
der aus einer 50%igen Verminderung des maximalen OD, der für nicht
infizierte Zellen beobachtet wurde, resultierte.
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Herstellung eines Impfstoffes
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1.1 Verfahren zur Herstellung
von Liposomens
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Ein
Gemisch aus einem Lipid (zum Beispiel Phosphatidylcholin) und Cholesterol
in einem organischen Lösungsmittel
wurde unter Vakuum ausführlich
getrocknet (oder alternativ in einem Strom eines Inertgases). Anschließend wurde
eine wäßrige Lösung (z.B.
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)
zugegeben und das Gefäß gerührt, bis
das gesamte Lipid suspendiert ist. Diese Suspension wurde anschließend mikrofluidisiert,
bis die Liposomgröße auf 100
nm reduziert ist und anschließend
wurde steril durch ein 0,2 μm-Filter
filtriert.
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Typischerweise
beträgt
das Cholesterol:Phosphatidylcholin-Verhältnis 1:4 (G/G), und die wäßrige Lösung wird
zugegeben, um eine Endkonzentration des Cholesterols von 5 bis 50 μg/ml zu ergeben.
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Die
Liposomen haben eine definierte Größe von 100 nm und werden als
SUV (stehend für:
small unilamelar vesicles) wiedergegeben. Wenn diese Lösung wiederholt
tiefgefroren und aufgetaut wird, verschmelzen die Vesikel, um große vielschichtige
Strukturen (MLV) in einer Größe zu bilden,
die von 500 nm bis 15 μm reichen.
Falls 3D-MPL in organischer Lösung
zu dem Lipid in organischer Lösung
gegeben wird, enthalten die endgültigen
Liposomen 3D-MPL in der Membran (wiedergegeben als 3D-MPL-innerhalb).
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Die
Liposomen an sich sind über
die Zeit stabil und weisen keine Fähigkeit auf, zu verschmelzen.
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1.2 Verfahren zur Herstellung
einer Formulierung
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QS21
wird in wäßriger Lösung zu
den Liposomen gegeben. Dieses Gemisch wird anschließend der Antigenlösung zugegeben.
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Impfprotokoll
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Die
Immunogenität
des RSV-Spaltantigens, das über
die ID-Route verabreicht wurde, wurde in Meerschweinchen bewertet.
Die Ausführbarkeit
einer tatsächlichen
ID-Injektion in dieser Spezies wurde durch Injektion von India-Tinte
in die Lederhaut und eine histologische Prüfung der Gewebe (Daten nicht
gezeigt) unter Verwendung des Mantoux-Verfahrens mit einer Tuberkulinnadel
bestätigt.
Wiederum in der Bemühung
den Immunstatus, der in Populationen von Älteren gefunden wurde (d.h.
sensibilisiert gegenüber
RSV), zu stimulieren, wurden die Hartley-Meerschweinchen (5 pro
Gruppe) entweder mit einem lebenden RSV-Virus (5 × 105 pfu, verabreicht IN, in 100 μl-50 μl/Nostril;
Gruppen A-E) oder mit gereinigtem ganzem RSV-Virus (enthaltend 6 μg F-Protein,
verabreicht IM, in 100 μl;
Gruppen F-J), sensibilisiert. Zwei äquivalente Dosen des Impfstoffes wurden
am Tag 21 und am Tag 42 nach der Sensibilisierung verabreicht. Die
Gruppen A und F erhielten die Spalt-RSV-Zubereitung, die 4,2 μg des F-Proteins
enthielt, die über
die ID-Route verabreicht wurde. Die Gruppen B und G erhielten die
Spalt-RSV-Zubereitung, die 0,84 μg
des F-Proteins, die über
ID-Route verabreicht wurde, enthielt. Die Gruppen C und H erhielten
die Spalt-RSV-Zubereitung,
die 4,2 μg
F-Protein, unterstützt mit
den Saponin/Sterol-Liposomen
der vorliegenden Erfindung (umfassend 5 μg QS21, 25 μg Cholesterol, Phosphatidylcholin
und 5 μ 3D-MPL
der Membran des Liposoms) und über
die ID-Route verabreicht wurde. Die Gruppen D und I erhielten die
Spalt-RSV-Zubereitung, die 0,84 μg
F-Protein enthielt, unterstützt
mit demselben Hilfsstoff, wie Gruppen C, die über die ID-Route verabreicht
wurde. Die Gruppen E und J erhielten die Spalt-RSV-Zubereitung,
die 4,2 μg
F-Protein enthielt, die über
die IM-Route verabreicht wurde. Den Tieren wurden 3 Wochen nach
der ersten Impfstoffdosis und zwei Wochen nach der zweiten Impfstoffdosis
Blut abgenommen und die Immunantwort ausgewertet.
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Die
Ergebnisse dieses Experiments werden in den 1 und 2 zusammengefaßt. 1 zeigt
die FG-spezifische Immunantwort, die in den Meerschweinchenseren
während
des Verlaufs des Experiments detektiert wurde. 2 faßt die Neutralisationsdaten
zusammen. Daher ist in einer sensibilisierten Population (sensibilisiert
entweder durch eine Lebendvirusinfektion oder Verabreichung eines
gereinigten Ganzvirus) eine Einzeldosis eines Spalt-RSV, das über ID-Route
verabreicht wurde, stark immunogen und diese Antwort kann ferner
durch eine zweite Dosis eines Impfstoffes verstärkt werden.