DE60217374T2

DE60217374T2 - Verwendung von Liposomen mit Saponinen und Sterolen in der Herstellung von intradermalen Impfstoffen

Info

Publication number: DE60217374T2
Application number: DE60217374T
Authority: DE
Inventors: Nathalie c/o GlaxoSmithKline Beecham GARCON
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2001-10-01
Filing date: 2002-09-30
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2022-10-01
Also published as: EP1432442A2; WO2003028760A2; ATE350059T1; GB0123580D0; EP1432442B1; ES2279890T3; DE60217374D1; US20080292686A1; JP2005507898A; WO2003028760A3; AU2002338832A1; CA2461924A1

Description

Die vorliegende Erfindung stellt neue Verwendungen für Hilfsstoffe in der Herstellung von Impfstoffen, die intradermal zu verabreichen sind, zur Verfügung. Die Hilfsstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen ein Saponin und ein Sterol, wobei das Saponin und das Sterol in einem Liposom formuliert sind. Die intradermalen Hilfsstoffe werden in der Herstellung von intradermalen Impfstoffen für Menschen und in der intradermalen Behandlung von Menschen verwendet.
Die gegenwärtige Impfpraxis ist gegenüber einer intramuskulären Verabreichung von Impfstoffen erheblich voreingenommen. Die intramuskuläre Route ist über einen Zeitraum von Dekaden extensiv studiert worden, hat einen langen Weg des Erfolgsnachweises aus einer Anzahl von Gründen, einschließlich der Tatsache, daß der Muskel zur Stimulierung von Immunantworten effizient ist; auch daß es leicht und üblich ist, Impfstoffe in wiederholbarer Weise an den Muskel abzugeben.
Im Gegensatz dazu hat die Impfung über andere Routen bewiesen, entweder schwierig in der Verabreichung in wiederholbarer Weise zu sein, oder hatte unterschiedlichen Erfolg in der Herbeiführung von Immunantworten, die denen gleichwertig sind, die durch die intramuskuläre Route erreicht wurden. Aus diesen Gründen wird die überwiegende Mehrheit von Impfungen, insbesondere nicht-lebende Impfstoffe, intramuskulär verabreicht. Jedoch sind intramuskuläre Impfstoffe mit erheblichen Nachteilen verbunden, die es wünschenswert machen, andere Routen der Impfung zu entwickeln. Beispielsweise erfordern intramuskuläre Impfstoffe eine Verabreichung des Impfstoffes tief in das Gewebe, mittels langer hypodermer Nadeln, die beim Patienten zu einer "Nadelangst" führen und mit einer verminderten Compliance-Einstellung gegenüber einer Impfung verbunden ist. Zusätzlich lösen einige intramuskulär verabreichte Impfstoffe eine signifikante lokale und systemische Reaktogenität aus, wie eine lokale Muskelentzündung oder eine Nekrose und damit verbundener Schmerz, oder systemische Effekte, wie Kopfschmerzen, Übelkeit oder "grippeähnliche" Syndrome.
Demzufolge besteht ein Bedarf, Alternativen zu intramuskulären Impfprotokollen zu entwickeln, die wenigstens so effizient sind, wie eine intramuskuläre Impfung und bevorzugt besser als diese sind.
Saponine werden in Lacaille-Dubois, M. und H. Wagner (1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, Bd. 2, S. 363–386) gelehrt. Saponine sind Steroid- oder Triterpenglycoside, die in der Pflanzenwelt und der Welt der Meerestiere weitverbreitet sind. Saponine sind bekannt, kolloidale Suspensionen in Wasser zu bilden, die beim Schütteln schäumen, und sie sind bekannt, Cholesterol auszufällen. Wenn Saponine nahe von Zellmembranen sind, schaffen sie in der Membran porenähnliche Strukturen, die die Membran veranlassen, aufzuplatzen. Die Hämolyse von Erythrozyten ist ein Beispiel für dieses Phänomen, das eine Eigenschaft bestimmter, jedoch nicht aller Saponine ist.
Saponine sind als Hilfsstoffe in Impfstoffen zur systemischen Verabreichung bekannt. Der Hilfsstoff und die hämolytische Aktivität individueller Saponine wurden extensiv auf dem Fachgebiet studiert (Lacaille-Dubois und Wagner, oben). Beispielsweise werden Quil A (gewonnen aus der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja Saponaria Molina) und Fraktionen davon in US 5,057,540 und "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C.R., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1-2): 1–55; und EP 0 362 279 B1 beschrieben. Einzelne Strukturen, die als Immune Stimulating Complexes (ISCOMS) bezeichnet werden, die Fraktionen von Quil A umfassen, sind hämolytisch und wurden in der Herstellung von Impfstoffen verwendet (Morein, B., EP 0 109 942 B1 ; WO 96/11711; WO 96/33739). Die hämolytischen Saponine QS21 und QS17 (HPLC-gereinigte Fraktionen von Quil A) wurden als potente systemische Hilfsstoffe beschrieben, und das Verfahren zu ihrer Herstellung wird in US-Patent Nr. 5,057,540 und EP 0 362 279 B1 beschrieben. Andere in systemischen Impfstudien verwendete Saponine schließen die von anderen Pflanzenspezies abgeleiteten ein, wie Gypsophilia und Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572–577, 1992).
Die Verabreichung von QS21 in die Haut von Mäusen wurde in Kensil et al., 1991, J. Immunol., 146(2): 431-7 beschrieben. Jedoch ist in dieser Studie nicht sicher, ob wegen der technischen Beschränkungen des Mäusehautmodells das QS21 in die Dermis verabreicht wurde.
Die Saponin-Hilfsstoffe erfordern auch, in einer relativ hohen Dosis an den Muskel abgegeben zu werden. Die oben beschriebenen Saponin-Hilfsstoffe sind in unterschiedlichem Ausmaß schmerzvoll, wenn sie intramuskulär verabreicht werden. Es besteht daher ein Bedarf, die Qualität und Größenordnung der Immunantwort, die durch intramuskuläre Impfstoffe, die ein Saponin umfassen, ausgelöst wird, zu verbessern.
Die hierin beschriebenen intradermalen Hilfsstoffe umfassen ein Saponin und ein Sterol, wobei das Saponin und das Sterol in einem Liposom formuliert sind. Die Verwendung dieser Hilfsstofformulierungen in der Herstellung von intradermalen Impfstoffen für Menschen wird durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt. Derartige humane intradermale Impfstoffe stimulieren überraschenderweise signifikante Immunantworten gegen ein mitverabreichtes Antigen, die in der Größenordnung wenigstens so hoch sind wie die, die durch eine intramuskuläre Verabreichung ausgelöst werden, jedoch erfordert die Verwendung von Liposomen der vorliegenden Erfindung erheblich weniger Antigen, um so zu wirken, und/oder signifikant weniger Saponin-Hilfsstoff mit einer einhergehenden Verminderung der reaktogenen Antworten.
Bevorzugte Sterole schließen R-Sitosterol, Stigmasterol, Ergosterol, Ergocalciferol und Cholesterol ein. Diese Sterole sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt, z.B. ist Cholesterol im Merck-Index, 11. Ausgabe, Seite 341, als ein im tierischen Fett natürlich vorkommendes Sterol offenbart. Das am meisten bevorzugte Sterol ist Cholesterol.
Vorzugsweise ist das Liposom ein einschichtiges Liposom. Die Hilfsstofformulierung umfaßt vorzugsweise ferner ein Lipid, das in der Lage ist, eine Zweischichtmembran zu bilden. Dementsprechend enthalten die Liposome vorzugsweise ein neutrales oder zwitterionisches Lipid (z.B. Phosphatidylcholin), das bei Raumtemperatur vorzugsweise nicht kristallin ist, z.B. Eigelbphosphatidylcholin, Dioleylphosphatidylcholin oder Dilaurylphosphatidylcholin, und unter diesen Lipiden ist Dioleylphosphatidylcholin am meisten bevorzugt. Die Vesikel können auch ein beladenes Lipid enthalten, das die Stabilität der Liposomstruktur für Liposomen, die aus gesättigten Lipiden zusammengesetzt sind, erhöht. In diesen Fällen beträgt die Menge eines beladenen Lipids vorzugsweise 1 bis 20 Gew.%, am meisten bevorzugt 5 bis 10 Gew.%.
Das Verhältnis von Sterol zu Phospholipid ist 1 bis 50 % (mol/mol), am meisten bevorzugt 20 bis 25 %.
Wenn beide vorhanden sind, beträgt typischerweise das Sterol (Cholesterol):Phosphatidylcholin-Verhältnis 1:4 (G/G).
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Liposome können einschichtig oder vielschichtig sein. Am meisten bevorzugt sind Vesikel, die einschichtige Liposomen sind. Der Durchmesser der Vesikel, wenn er durch dynamische Lichtstreuungstechniken (wie zum Beispiel Messung durch einen Malvern Zetasizer^TM oder einen Coulter Counter^TM) gemessen wird, bewegt sich typischerweise im Bereich von 10 bis 1000 nm und besonders bevorzugt zwischen 10 und 220 nm, und besonders bevorzugt in einer Größe zwischen 10 und 150 nm und am meisten bevorzugt zwischen 70 und 150 nm im Durchmesser, wie ungefähr 115 nm (alle Bereiche sind als Größe "durch ihre Intensität" ausgedrückt). Bevorzugt sind wenigstens 90 % der Partikel innerhalb des spezifizierten Größenbereiches, und am meisten bevorzugt sind wenigstens 95 % der Partikel innerhalb der spezifizierten Bereiche vorhanden.
Bevorzugte Saponine sind diejenigen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, immunstimulierend zu wirken. Die Saponine können aus natürlichen Quellen gereinigt sein, oder sie können Derivate von Saponinen sein, die aus natürlichen Quellen stammen. Alternativ können die Saponine halb- oder vollsynthetisch sein. Halbsynthetische Saponine können aus anderen Chemikalien, die keine Saponine sind, zusammengesetzt werden.
Die am meisten bevorzugten Saponine sind immunstimulatorische, gereinigte, synthetische oder halbsynthetische Saponine, die von der Rinde von Quillaja Saponaria Molina stammen können. Die zu verwendenden Zusammensetzungen enthalten eine immunologisch aktive Saponinfraktion aus der Rinde von Quillaja Saponaria Molina in substantiell gereinigter Form. Mit "gereinigtes Saponin" ist ein substantiell reines Saponin gemeint, das nach einem oder mehreren der folgenden Standards gereinigt wurde: 1) Auftreten als nur eine größere Kohlenhydrat-Farbbande auf Silicagel DC (EM Science HPTLC Si60) in einem Lösungsmittelsystem aus 40 mM Essigsäure in Chloroform/Methanol/Wasser (60/45/10 Vol/Vol/Vol); 2) Auftreten als nur eine größere Kohlenhydrat-Farbbande in der Umkehrphasen-DC (EM Science Silica Gel RP-8) in einem Lösungsmittelsystem aus Methanol/Wasser (70/30 V/V); oder 3) Auftreten als nur ein größerer Peak bei Umkehrphasen-HPLC in einem Vydac C4 (5 μm Partikelgröße, 300 Å Porengröße, 4,6 mm ID × 25 cm L) in 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42 V/V) oder 4) wenigstens zu 90 % rein, wie definiert, indem es frei von anderen Bestandteilen ist, die in der Natur normalerweise mit dem Saponin einhergehen. Die Reinheit von Saponinfraktionen kann unter Verwendung von HPLC-Techniken, die in US-Patent Nr. 5,057,540 beschrieben sind, gemessen werden.
Bevorzugt enthalten die in der Erfindung zu verwendenden Zusammensetzungen die Saponinfraktion QS21. QS21 liegt vorzugsweise in substantiell gereinigter Form vor, d.h. wie es durch Sammlung eines einzelnen HPLC-Peaks nach Abtrennung eines Saponins aus der Rinde von Quillaja saponaria molina isoliert wird, oder spezifischer ist das QS21 wenigstens 90 % rein, bevorzugt wenigstens 95 % rein und am meisten bevorzugt wenigstens 98 % rein.
Andere in Zusammensetzungen der Erfindung nützliche immunologisch aktive Saponinfraktionen schließen QA17/QS17 ein. β-Escin ist ein anderes bevorzugtes hämolytisches Saponin zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Hilfsstoffzusammensetzungen. Escin wird im Merck-Index (12. Ausgabe: Register Nr. 3737) als ein Gemisch von Saponinen, das im Samen des Roßkastanienbaumes vorkommt, beschrieben, lateinisch: Aesculus hippocastanum. Seine Isolierung wird mittels Chromatographie und Reinigung (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) und mittels Ionenaustauschharzen (Erbring et al., US 3,238,190 ) beschrieben. Escin-Fraktionen, α und β, wurden gereinigt und zeigten sich als biologisch aktiv (Yoshikawa M., et al. (Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) Aug. 1996, 44(8): 1454–1464)). β-Escin ist auch als Aescin bekannt.
Ein anderes zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugtes Saponin ist Digitonin. Digitonin wird im Merck-Index (12. Ausgabe, Registrier-Nr. 3204) als ein Saponin beschrieben, das aus den Samen von Digitalis purpurea stammt und entsprechend dem bei Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, 664; und Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem , 1955, 301, 621 beschriebenen Verfahren gereinigt wird. Seine Verwendung wird als klinisches Reagens zur Cholesterolbestimmung beschrieben.
Kleine einschichtige Vesikel (SUV) mit einem mittleren Teilchendurchmesser zwischen 40–150 nm, die das Saponin und das Sterol umfassen (bevorzugt QS21 und Cholesterol), wobei dann ein Sterolüberschuß vorhanden ist, sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte Adjuvantien.
Das Verhältnis von Saponin:Sterol in den liposomalen Hilfsstofformulierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird typischerweise in der Größenordnung von 1:100 bis 1:1 Gew./Gew. sein. Bevorzugter ist ein Sterolüberschuß vorhanden, und bevorzugter beträgt das Verhältnis von Saponin:Sterol wenigstens 1:2 (Gew./Gew.), und am meisten bevorzugt wird das Verhältnis 1:5 (Gew./Gew.) betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn das Saponin QS21 ist, wird das Verhältnis von QS21, das innerhalb der Saponinfraktion enthalten ist, zu Sterol typischerweise in der Größenordnung von 1:100 bis 1:1 Gew./Gew. betragen. Bevorzugt ist ein Sterolüberschuß gegenüber QS21 vorhanden, und bevorzugter ist das Verhältnis von QS21:Sterol wenigstens 1:2 Gew./Gew., und am meisten bevorzugt wird das Verhältnis 1:5 (Gew./Gew.) betragen. In all diesen offenbarten Verhältnissen ist Cholesterol das bevorzugte Sterol und die Verhältnisse gelten in gleicher Weise hierfür.
Zur humanen Verabreichung werden Saponin und Sterol typischerweise in einem Impfstoff im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 100 μg, bevorzugt etwa 10 μg bis etwa 50 μg per Dosis vorhanden sein.
Gegebenenfalls schließen die Hilfsstoffe und diese umfassende Verwendungen ferner ein LPS-Derivat ein. Ein enterobakterielles Lipopolysaccharid (LPS) ist ein potenter Stimulator des Immunsystems, obwohl seine Verwendung in Impfstoffen aufgrund seiner toxischen Effekte nicht mehr häufig ist. Ein nicht-toxisches Derivat von LPS, Monophosphoryllipid A (MPL), das durch Entfernung der Kernkohlenwasserstoffgruppe und des Phosphats vom reduzierenden Ende des Glucosamins hergestellt wird, ist von Ribi et al. (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, S. 407–419) beschrieben worden und hat die folgende Struktur:
Eine weitere entgiftete Version des MPL wird durch Entfernung der Acylkette aus der 3-Stellung des Disaccharidgerüstes erhalten und wird als 3-O-deacyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL) bezeichnet. Es kann durch die in GB 21 22 204 B erläuterten Verfahren gereinigt und hergestellt werden, wobei dieses Bezugsdokument auch die Herstellung von Diphosphoryllipid A und 3-O-deacylierten Varianten davon offenbart. Eine bevorzugte Form des 3D-MPL ist in der Form einer Emulsion, die eine kleine Partikelgröße von weniger als 0,2 μm im Durchmesser hat, und das Verfahren zu ihrer Herstellung wird in WO 94/21292 offenbart. Wäßrige Formulierungen, die ein Monophosphoryllipid A und ein Netzmittel umfassen, wurden in WO 98/43670A2 beschrieben.
Die von dem bakteriellen Lipopolysaccharid abgeleiteten Hilfsstoffe, die in den Hilfsstoffen der vorliegenden Erfindung formuliert werden können, können aus bakteriellen Quellen gereinigt und hergestellt werden, oder sie können alternativ synthetisch sein. Beispielsweise wird ein gereinigtes Monophosphoryllipid A in Ribi et al., 1986 (oben) beschrieben, und das von Salmonella sp. abgeleitete 3-O-deacylierte Monophosphoryllipid A oder -diphosphoryllipid A wird in GB 22 20 211 und US 4,912,094 beschrieben. Andere gereinigte und synthetische Lipopolysaccharide wurden beschrieben ( US 6,055,099 und EP 0 729 473 B1 ; Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392-6 Hilgers et a., 1987, Immunology, 60(1): 141-6; und EP 0 549 074 B1 ). Besonders bevorzugte bakterielle Lipopolysaccharid-Hilfsstoffe sind die in US 6,005,099 und EP 0 729 473 B1 beschriebenen 3D-MPL und die R(1-6) Glucosamindisaccharide.
Dementsprechend sind die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren LPS-Derivate solche Immunstimulantien, die in ihrer Struktur der von LPS oder MPL oder 3D-MPL ähnlich sind. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die LPS-Derivate ein acyliertes Monosaccharid sein, das eine Untereinheit zu der oben genannten MPL-Struktur ist.
Ein bevorzugter Hilfsstoff in Form eines LPS-Disaccharid-Derivates ist ein gereinigtes oder synthetisches Lipid A der folgenden Formel:
worin R² H oder PO₃H₂ sein kann. R³ kann eine Acylkette oder β-Hydroxymyristoyl oder ein 3-Acyloxyacyl-Rest sein, der die folgende Formel hat:
worin
ist und worin X und Y einen Wert von 0 bis zu etwa 20 haben.
Das LPS-Derivat kann mit den Saponin- und Sterol-enthaltenden Liposomen formuliert werden oder kann einfach den Saponin- und Sterolenthaltenden Liposomen zugemischt werden. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen und deren Verwendungen sind solche, worin Sterol-/Saponinenthaltende Liposome eingangs ohne das LPS-Derivat hergestellt werden und das LPS-Derivat anschließend zugegeben wird, vorzugsweise als Partikel mit einem mittleren Durchmesser von etwa 100 nm. In diesen Ausführungsformen ist demzufolge das LPS-Derivat innerhalb der Vesikelmembran (bekannt als Außen-LPS-Derivat) nicht enthalten. Zusammensetzungen, worin ein LPS-Derivat innerhalb der Liposom-Membran (bekannt als Innen-LPS-Derivat) enthalten ist, bilden ebenfalls einen Aspekt der Erfindung. Diesbezüglich umfassen die Hilfsstofformulierungen vorzugsweise ein Sterol- und Saponinenthaltendes Liposom, und das LPS-Derivat (vorzugsweise 3D-MPL) ist innerhalb der Liposom-Membran enthalten. Intradermale Impfstofformulierungen, die in der Membran einer liposomalen Formulierung Sterol, Saponin und 3D-MPL umfassen, sind besonders in der Einleitung von zellvermittelten Immunantworten potent und bilden einen alternativen Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Das Antigen kann innerhalb der Vesikelmembran oder außerhalb der Vesikelmembran enthalten sein. Bevorzugt befinden sich hydrophile Antigene außerhalb und hydrophobe oder mit Lipiden versehene Antigene sind entweder innerhalb oder außerhalb der Membranstruktur enthalten. Alternativ können hydrophile Antigene außerhalb der Membranstruktur, aber innerhalb des Vesikelvolumens gefangen, sein.
Bevorzugter umfassen diese Hilfsstofformulierungen QS21 als Saponin, und 3D-MPL als LPS-Derivat und Cholesterol als Sterol, worin das Verhältnis von QS21:Cholesterol von 1:1 bis 1:100 Gewicht/Gewicht beträgt und am meisten bevorzugt 1:5 Gewicht/Gewicht ist. Solche Hilfsstofformulierungen werden in EP 0 822 831 B beschrieben, auf dessen Offenbarung hierin Bezug genommen wird.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird hier die Verwendung eines Sterols, eines Saponins (wie oben beschrieben) und eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das unmethylierte CpG-Dinukleotide (CpG) enthält in der Herstellung eines intradermalen Impfstoffes zur Behandlung einer Krankheit zur Verfügung gestellt. Immunstimulierende Oligonukleotide, die unmethylierte CpG-Dinukleotide ("CpG") enthalten, sind auf dem Fachgebiet als Hilfsstoffe bekannt, wenn sie sowohl auf systemischem Weg und mukosalem Weg verabreicht werden (WO 96/02555, EP 468520 , Davis et al., J. Immunol. 1998, 160(2): 870–876; McCluskie und Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463-6). CpG ist eine Abkürzung für Cytosin-Guanosin-Dinukleotidmotive, die in der DNA vorhanden sind. Die zentrale Rolle des CG-Motivs in der Immunstimulation wurde später in einer Publikation von Krieg, Nature 374, S. 546, 1995 aufgeklärt.
Die zur Verwendung in Hilfsstoffen oder Impfstoffen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Oligonukleotide enthalten vorzugsweise zwei oder mehr Dinukleotid-CpG-Motive, die durch wenigstens drei, bevorzugter von wenigstens sechs oder mehr Nukleotiden getrennt sind. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind typischerweise Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Internukleotid im Oligonukleotid Phosphordithionat, oder bevorzugter eine Phosphorthionat-Bindung, obwohl Phosphodiester- und andere Internukleotid-Bindungen innerhalb des Umfangs der Erfindung sind, einschließlich Oligonukleotide mit gemischten Internukleotid-Bindungen. Verfahren zur Herstellung von Phosphorthionat-Oligonukleotiden oder Phosphordithionat werden in US 5,666,153 , US 5,278,302 und WO 95/26204 beschrieben.
Beispiele bevorzugter Oligonukleotide haben die folgenden Sequenzen. Bevorzugt enthalten die Sequenzen Phosphorthionat-modifizierte Internukleotid-Bindungen.
Alternative CpG-Oligonukleotide können die oben bevorzugten Sequenzen umfassen, indem sie zusätzlich unbedeutende Deletionen oder Additionen haben. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten CpG-Oligonukleotide können durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren synthetisiert werden (z.B. EP 468520 ). Gewöhnlich können solche Oligonukleotide mittels eines automatisierten Synthesizers synthetisiert werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonukleotide sind typischerweise Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Internukleotid-Bindung in dem Oligonukleotid Phosphordithionat, oder bevorzugter eine Phosphorthionat-Bindung, obwohl Phosphordiester innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind. Oligonukleotide, die unterschiedliche Internukleotid-Bindungen umfassen, sind berücksichtigt, z.B. gemischte Phosphorthionatphosphodiester. Andere Internukleotid-Bindungen, die das Oligonukleotid stabilisieren, können verwendet werden.
Soweit hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "intradermale Abgabe" die Abgabe des Impfstoffes an die Lederhaut in der Haut. Jedoch wird der Impfstoff nicht notwendigerweise exklusiv in die Lederhaut verbracht sein. Die Lederhaut ist die Schicht in der Haut, die sich zwischen etwa 1,0 und etwa 2,0 mm von der Oberfläche in der menschlichen Haut befindet, aber es gibt eine bestimmte Variationsmenge zwischen Individuen und in unterschiedlichen Teilen des Körpers. Im allgemeinen kann erwartet werden, die Lederhaut zu erreichen, indem 1,5 mm unter die Hautoberfläche gegangen wird. Die Lederhaut befindet sich zwischen dem Stratum corneum und der an der Oberfläche befindlichen Epidermis und der Unterhautschicht darunter. In Abhängigkeit von der Art der Abgabe, kann sich der Impfstoff letztendlich allein oder in erster Linie innerhalb der Lederhaut befinden, oder er kann letztendlich innerhalb der Epidermis und der Lederhaut verteilt sein.
Die herkömmliche Technik einer intradermalen Injektion, das "Mantoux-Verfahren", umfaßt die Schritte: Reinigen der Haut, anschließendes Straffen mit einer Hand und mit der Schrägkante einer engen Gauge-Nadel (26–31 Gauge), die nach oben gewandt ist, wird die Nadel in einem Winkel zwischen 10 bis 15 Grad eingeführt. Sobald die Schrägkante der Nadel eingeführt ist, wird der Spritzenzylinder der Nadel abgesenkt und anschließend mit leichtem Druck nach vorn getrieben, um sie unter die Haut zu heben. Die Flüssigkeit wird anschließend sehr langsam injiziert, wobei sich ein Bläschen oder eine Blase an der Hautoberfläche bildet, gefolgt vom langsamen Entfernen der Nadel.
In jüngster Zeit wurden Vorrichtungen beschrieben, die spezifisch entwickelt wurden, um flüssige Wirkstoffe in oder durch die Haut zu verabreichen, z.B. die in WO 99/34850 und EP 10 92 444 beschriebenen Vorrichtungen, aber auch Jet-Injektionsvorrichtungen, die beispielsweise in WO 01/13977; US 5,480,381 , US 5,599,302 , US 5,334,144 , US 5,993,412 , US 5,649,912 , US 5,569,189 , US 5,704,911 , US 5,383,851 , US 5,893,397 , US 5,466,220 , US 5,339,163 , US 5,312,335 , US 5,503,627 , US 5,064,413 , US 5,520,639 , US 4,596,556 , US 4,790,824 , US 4,941,880 US 4,940,460 , WO 97/37705 und WO 97/13537 beschrieben wurden. Alternative Verfahren der intradermalen Verabreichung von Impfstoffzubereitungen können herkömmliche Spritzen und Nadeln oder Vorrichtungen, die zur ballistischen Abgabe von Feststoffimpfstoffen entworfen wurden (WO 99/27961), oder transdermale Pflaster (WO 97/48440; WO 98/28037) oder die auf der Hautoberfläche angewandt werden (transdermale oder transkutane Abgabe, WO 98/20734; WO 98/28037), einschließen.
In der vorliegenden Erfindung werden Liposomen in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Individuen verwendet, die an einer Krankheit oder einem chronischem Leiden leiden, die die Verabreichung einer Zusammensetzung in die Lederhaut eines Individuums umfaßt, wobei die Zusammensetzung eine liposomale Zusammensetzung umfaßt, worin das Liposom ein Sterol und ein immunologisch aktives Saponin, wie hierin beschrieben, umfaßt. Bevorzugt ist das Saponin ein gereinigtes oder ein synthetisches Saponin aus der Quillaja Saponaria-Rinde, und Cholersterol-Adjuvantien sind in einem einschichtigen Liposom formuliert. Die bevorzugten Behandlungsmethoden sind die Behandlungen von Krankheiten, die durch die folgenden Pathogene verursacht werden: humaner Papilloma-Virus; respiratorischer Syncytium-Virus, Hepatitis B- und/oder Hepatitis A-Virus (-Viren); Meningitis B; Meningokokken und/oder Haemophilus influenzae b und/oder andere Antigene; Streptococcus pneumoniae; Varicella Zoster-Virus.
Bevorzugt umfaßt die Behandlungsmethode auch die Zugabe eines LPS-Derivates oder die Zugabe von CpG zu der Hilfsstofformulierung.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Impfstofformulierungen enthalten ein Antigen oder eine antigene Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine Immunantwort gegenüber einem menschlichen Pathogen auszulösen, wobei ein Antigen oder eine antigene Zusammensetzung abgeleitet ist, ^von ^: HIV-1 (wie tat, nef, gp 120 oder gp 160) humanen Herpesviren (HSV), wie gD oder Derivaten davon oder Immediate Early-Protein wie IC27 von HSV1 oder HSV2, Cytomegalovirus (CMV (insbesondere humanes) (wie gB oder Derivate davon), Rotavirus (einschließlich abgeschwächte Lebend-Viren), Epstein Barr-Virus (wie gp350 oder Derivate davon), Varicella Zoster-Virus (VZV, wie gpI, II und IE63), oder von einem Hepatitis-Virus abstammend, wie Hepatitis B-Virus (zum Beispiel Hepatitis B-Oberflächenantigen oder ein Derivat davon), Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis C-Virus und Hepatitis E-Virus, oder von anderen viralen Pathogenen, wie Paramyxoviren: respiratorisches Syncytiumvirus (RSV, wie F- und G-Proteine oder Derivate davon), Parainfluenza-Virus, Masern-Virus, Mumps-Virus, humane Papilloma-Viren (HPV, zum Beispiel HPV6, 11, 16, 18), Flaviviren (z.B. Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, Zecken-Enzephalitis-Virus, Japan-Enzephalitis-Virus) oder Influenzavirus (ganze Lebend- oder inaktivierte Viren, Spalt-Influenza-Virus, in Eiern oder MDCK-Zellen gezüchtet, oder ganze Flu-Virosomen (wie von R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915–920 beschrieben) oder gereinigte oder rekombinante Proteine davon, wie HA-, NP-, NA- oder M-Proteine oder Kombinationen davon) oder derivatisiert aus bakteriellen Pathogenen, wie Neisseria spp., einsschließlich N. gonorrhea und N. meningitidis (zum Beispiel Kapselpolysaccharide und Konjugate davon, Transferrin-bindende Proteine, Lactoferrin-bindende Proteine, PilC, Adhäsine); S. pyogenes (zum Beispiel M-Proteine oder Fragmente davon, C5A-Protease, Lipoteichonsäuren), S. agalactiae, S. Mutanten; H. ducreyi; Moraxella spp, einschließlich M. catarrhalis, auch bekannt als Branhamella catarrhalis (zum Beispiel Adhäsine und Invasine mit niedrigem und hohem Molekulargewicht); Bordetella spp., einschließlich B. pertussis (zum Beispiel Pertactin, Pertussistoxin oder Derivate davon, faseriges Hämagglutinin, Adenylatcyclase, Fimbriae), B. parapertussis und B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., einschließlich M. tuberculosis (zum Beispiel ESAT6, Antigen 85A, -B oder -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp. einschließlich L. pneumophila; Escherichia spp., einschließlich enterotoxisches E. coli (zum Beispiel Koloniefaktoren, hitzelabiles Toxin oder Derivate davon, hitzestabiles Toxin oder Derivate davon), enterohämorrhagisches E. coli, enteropathogenes E. coli (zum Beispiel Shigatoxin-artiges Toxin oder Derivate davon); Vibrio spp., einschließlich V. cholera (zum Beispiel Cholera-Toxin oder Derivate davon); Shigella spp., einschließlich S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., einschließlich Y. enterocolitica (zum Beispiel ein Yop-Protein), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., einschließlich C. jejuni (zum Beispiel Toxine, Adhäsine und Invasine) und C. coli; Salmonella spp., einschließlich S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., einschließlich L. Monocytogenes; Helicobacter spp., einschließlich H. pylori (zum Beispiel Urease, Catalase, vakuolisierendes Toxin); Pseudomonas spp., einschließlich P. aeruginosa; Staphylococcus spp., einschließlich S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., einschließlich E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., einschließlich C. tetani (zum Beispiel Tetanustoxin und Derivate davon), C. botulinum (zum Beispiel Botulinum-Toxin und Derivate davon), C. difficile (zum Beispiel Clostridium-Toxine A oder B und Derivate davon), Bacillus spp., einschließlich B. anthracis (zum Beispiel Botulinum-Toxin und Derivate davon), Corynebacterium spp., einschließlich C. diphtheriae (zum Beispiel Diphterie-Toxin und Derivate davon); Borrelia spp., einschließlich B. burgdorferi (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., einschließlich E. equi und das Mittel für Human Granulocytic Ehrlichiosis; Ricksettsia spp., einschließlich R. rickettsii; Chlamydia spp., einschließlich C. trachomatis (zum Beispiel MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. pneumoniae (zum Beispiel MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. psittaci; Leptospira spp., einschließlich L. interrogans; Treponema spp., einschließlich T. palladium (zum Beispiel die seltenen äußere Membranproteine), T. denticola, T. hyodysenteriae; oder von Parasiten, wie Plasmodium spp., einschließlich P. falciparum abgeleitet; Toxoplasma spp.,einschließlich T. gondii (zum Beispiel SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., einschließlich E. histolytica; Babesia spp., einschließlich B. microti; Trypanosoma spp., einschließlich T. cruzi; Giardia spp., einschließlich G. lamblia; Leshmania spp., einschließlich L. major; Pneumocystis spp., einschließlich P. carinii; Trichomonas spp., einschließlich T. vaginalis; Schisostoma spp., einschließlich S. mansoni oder von Hefe abgeleitet, wie Candida spp., einschließlich C. albicans; Cryptococcus spp.,einschließlich C. neuformans.
Andere bevorzugte spezifische Antigene für M. tuberculosis sind zum Beispiel Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 und hTCC1 (WO 99/51748). Proteine für M. tuberculosis schließen auch Fusionsproteine und Varianten davon ein, wobei wenigstens zwei, vorzugsweise drei Polypeptide von M. tuberculosis in ein größeres Protein fusioniert sind. Bevorzugte Fusionen schließen ein: Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2. TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748).
Die am meisten bevorzugten Antigene für Chlamydia schließen zum Beispiel ein Protein mit einem hohem Molekulargewicht (HWMP) (WO 99/17741), ORF3 ( EP 366 412 ) und mutmaßliche Membranproteine (Pmps) ein. Andere Chlamydia-Antigene der Impfstofformulierung können aus der Gruppe, die in WO 99/28475 beschrieben wurde, ausgewählt werden.
Bevorzugte bakterielle Impfstoffe umfassen Antigene, die abgeleitet sind, von: Streptococcus spp., einschließlich S. pneumoniae (zum Beispiel Kapselpolysaccharide und Konjugate davon, PsaA, PspA, Streptolysin, Cholinbindende Proteine) und das Protein-Antigen Pneumolysin (Biochem. Biophys. Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337–342) und entgiftete Mutantenderivate davon (WO 90/06951; WO 99/03884). Besonders bevorzugte Pneumokokken-Impfstoffe sind die, die in WO 00/56539 beschrieben wurden.
Die Pht-Antigene (Poly-Histidin-Dreiergruppe) sind bevorzugte Streptococcus-Antigene, für die Verwendungen, pharmazeutischen Zubereitungen und Methoden der vorliegenden Erfindung. Die Pht-Familie (Poly-Histidin-Dreiergruppe) umfaßt die Proteine PhtA, PhtB, PhtD und PhtE. Die Familie ist charakterisiert durch: eine Lipidisierungssequenz, zwei Domänen, die durch eine prolinreiche Region und verschiedene Histidin-Dreiergruppen getrennt sind, die möglicherweise eine Metall- oder Nukleotidbindung oder eine enzymatische Aktivität mit sich bringen, (3-5) ungeordnete Knäuelregionen, einen beibehaltenen N-Terminus und einen heterogenen C-Terminus. Sie ist in allen Stämmen der getesteten Pneumokokken vorhanden. Homologe Proteine wurden auch in anderen Streptokokken und in Neisseria gefunden. Bevorzugte Familienmitglieder umfassen PhtA, PhtB und PhtD. Bevorzugter umfassen sie PhtA oder PhtD. Das am meisten bevorzugte Pht-Antigen ist PhtD.
Jedoch ist klar, daß die Bezeichnungen Pht A, B, D und E sich auf Proteine beziehen, die die in den unten genannten Zitaten offenbarten Sequenzen haben, sich aber auch auf natürlich vorkommende Varianten davon beziehen (und vom Menschen hergestellt), die eine Sequenzhomologie aufweisen, die wenigstens 90 % Identität mit den in bezug genommenen Proteinen aufweist. Vorzugsweise liegt wenigstens eine 95%ige Identität und am meisten bevorzugt eine 97%ige Identität vor.
Im Hinblick auf die PhtX-Proteine ist PhtA in WO 98/18930 offenbart und wird auch als Sp36 wiedergegeben. Wie oben erwähnt, ist es ein Protein aus der Polyhistidin-Dreiergruppen-Familie und hat das Typ-II-Signalmotiv von LXXC.
PhtD wird in WO 00/37105 offenbart und wird auch als Sp036D wiedergegeben. Wie oben erwähnt, ist es auch ein Protein aus der Polyhistidin-Dreiergruppenfamilie und hat das Typ-II-LXXC-Signalmotiv.
PhtB wird in WO 00/37105 offenbart und auch als Sp036B wiedergegeben. Ein anderes Mitglied der PhtB-Familie ist das C3-abbauende Polypeptid, wie in WO 00/17370 offenbart. Dieses Protein stammt auch aus der Polyhistidin-Dreiergruppen-Familie und hat das Typ-II-LXXC-Signalmotiv. Ein bevorzugtes immunologisch funktionelles Äquivalent ist das Protein Sp42, das in WO 98/18930 offenbart wurde. Ein PhtB-Trunkat (angenähert 79 kD) wird in WO 99/15675 offenbart, das auch für ein Mitglied der PhtX-Familie angesehen wird.
PthE wird in WO 00/30299 offenbart und als BVH-3 wiedergegeben. Andere bevorzugte bakterielle Impfstoffe umfassen Antigene, die von Haemophilus spp. stammen, einschließlich H. influenzae Typ B ("Hib", zum Beispiel PRP und Konjugate davon), nicht-typisierbare H. influenzae, zum Beispiel OMP26, Adhäsine mit hohem Molekulargewicht, P5, P6, Protein D und Lipoprotein D und Fimbrin und vom Fimbrin abgeleitete Peptide ( US 5,843,464 ) oder Mehrfachkopievarianten oder Fusionsproteine davon.
Derivate eines Hepatitis B-Oberflächenantigens sind auf dem Fachgebiet gutbekannt und schließen unter anderem solche erwähnten PreS1-, PreS2-S-Antigene ein, die in den europäischen Patentanmeldungen EP-A-414 374, EP-A-0 304 578 und EP 197 474 erläuternd beschrieben wurden. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt die erfindungsgemäße Impfstofformulierung das HIV-1-Antigen, gp120, insbesondere, wenn es in CHO-Zellen exprimiert ist. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Impfstofformulierung der Erfindung gD2t, wie oben definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Impfstoffe, die den beanspruchten Hilfsstoff enthalten, ein Antigen, das vom menschlichen Papilloma-Virus (HPV) abgeleitet ist, und das für Genitalwarzen (HPV6 oder HPV11 und andere) verantwortlich angesehen wird, und HPV-Viren, die für Gebärmutterhalskrebs (HPV16, HPV18 und andere) verantwortlich sind.
Im einzelnen bevorzugte Formen eines der Prophylaxe oder Therapie gegen Genitalwarzen dienenden Impfstoffs umfassen L1-Partikel oder Capsomere und Fusionsproteine, die ein oder mehrere Antigene, die aus HPV6 und HPV11 Proteinen E6, E7, L1 und L2 ausgewählt sind, umfassen.
Die am meisten bevorzugten Formen der Fusionsproteine sind: L2E7, wie in WO 96/26277 offenbart, und Protein D/1/3)-E7, das in GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285) offenbart wurde.
Eine bevorzugte Impfstoffzusammensetzung zur Prophylaxe oder Therapie von HPV-Gebärmutterhalsinfektion oder Gebärmutterhalskrebs kann HPV16- oder HPV18-Antigene umfassen. Beispielsweise sind Monomere eines L1- oder L2-Antigens oder L1- oder L2-Antigene zusammen als ein virusähnliches Partikel (VLP) vorhanden oder das L1-Allein-Protein ist allein in einer VLP- oder Capsomer-Struktur vorhanden. Derartige Antigene, virusähnliche Partikel und Capsomere sind per se bekannt. Siehe zum Beispiel WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 und WO 93/02184.
Zusätzlich können Frühproteine allein oder als Fusionsproteine, wie beispielsweise E7, E2, oder bevorzugt E5, enthalten sein; besonders bevorzugte Ausführungsformen davon schließen ein VLP ein, das L1E7-Fusionsproteine umfaßt (WO 96/11272).
Besonders bevorzugte HPV16-Antigene umfassen die Frühproteine E6 oder E7 in Verschmelzung mit einem Protein D-Trägerstoff, um Protein D-E6- oder -E7-Fusionen von HPV16, oder Kombinationen daraus zu bilden oder Kombinationen aus E6 oder E7 mit L2 (WO 96/26277).
Alternativ können die HPV16- oder -18-Frühproteine E6 und E7 in einem Einzelmolekül vorhanden sein, bevorzugt eine Protein D-E6/E7-Fusion. Ein solcher Impfstoff kann gegebenenfalls entweder eines oder beide E6- und E7-Proteine von HPV18, bevorzugt in der Form eines Protein D-E6 oder eines Protein D-E7-Fusionsproteins oder eines Protein D E6/E7-Fusionsproteins enthalten.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich Antigene aus anderen HPV-Stämmen, vorzugsweise aus den Stämmen HPV31 oder 33 umfassen.
Die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Impfstoffe können ferner Antigene umfassen, die von Parasiten abgeleitet sind, die Malaria auslösen. Beispielsweise schließen bevorzugte Antigene von Plasmodia falciparum RTS,S und TRAP ein. RTS ist ein Hybridprotein, das substantiell den gesamten C-terminalen Teil des Circumsporozoit-Proteins (CS) von P. falciparum umfaßt, das über vier Aminosäuren des preS2-Teils des Hepatitis B-Oberflächenantigens an das Oberflächen (S)-Antigen des Hepatitis B-Virus gebunden ist. Seine gesamte Struktur wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP92/02591, veröffentlicht unter der Nr. WO 93/10152, unter Beanspruchung der Priorität der UK-Patentanmeldung Nr. 9124390.7 offenbart. Wenn in Hefe exprimiert, wird RTS als ein Lipoprotein-Teilchen produziert und wenn es zusammen mit dem S-Antigen aus HBV exprimiert ist, wird es als gemischtes Teilchen, bekannt als RTS,S, produziert. TRAP-Antigene werden in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB89/00895, veröffentlicht als WO 90/01496, beschrieben. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die intradermale Verabreichung eines Malariaimpfstoffes, bei dem die antigene Zubereitung eine Kombination aus den RTS,S- und TRAP-Antigenen umfaßt. Andere Plasmodia-Antigene, die wahrscheinlich Kandidaten sind, Bestandteile eines Mehrstufenimpfstoffes gegen Malaria zu werden, sind P. faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 und deren Analoga in Plasmodium spp.
Die verwendeten Formulierungen können auch ein Antitumor-Antigen enthalten und zur immuntherapeutischen Behandlung von Krebsarten nützlich sein. Die Formulierungen können auch ein Antitumor-Antigen enthalten und für die immuntherapeutische Behandlung von Krebsarten nützlich sein. Zum Beispiel findet die Hilfsstofformulierung Anwendung mit Tumorunterdrückungsantigenen, wie denen für Prostatakrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Pankreaskrebs, Nierenkrebs oder Melanomkrebs. Beispielhafte Antigene schließen ein: MAGE 1, 3, und MAGE 4 oder andere MAGE-Antigene, wie in WO 99/40188 offenbart, PRAME, BAGE, Lage (auch als NY Eos 1 bekannt), SAGE und HAGE (WO 99/53061) oder GAGE (Robbins und Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, 5.628–636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (eingereicht 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, S. 293. In der Tat werden diese Antigene innerhalb eines weiten Bereiches von Tumortypen, wie einem Melanomkarzinom, einem Lungenkarzinom, einem Sarkom und einem Blasenkarzinom exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Prostataantigene benutzt, wie Prostata-spezifisches Antigen (PSA), PAP, PSCA (PNAS95(4)1735–1740, 1998), PSMA oder in einer bevorzugten Ausführungsform ein Antigen, das als Prostase bekannt ist. Andere mit einem Tumor verbundene Antigene, die im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein: Plu-1 J. Biol. Chem. 274(22) 15633–15645, 1999, HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al. Bioassays 199, 21, 61–70, US-Patent 5,654,140), Criptin, US-Patent 5,981,215. Zusätzlich umfassen Antigene, die besonders relevant für Impfstoffe in der Therapie von Krebs sind, auch Tyrosinase und Survivin. von Schleim abgeleitete Peptide, wie Muc1, siehe zum Beispiel US 5,744,144 , US 5,827,666 , WO 8805054, US 4,963,484 . Besonders überlegenswert sind von Muc 1 abgeleitete Peptide, die wenigstens eine Wiederholungseinheit des Muc 1-Peptids umfassen, vorzugsweise wenigstens zwei solcher Wiederholungseinheiten, und die von dem SM3-Antikörper erkannt werden ( US 6,054,438 ). Andere von Schleim abgeleitete Peptide schließen ein Peptid von Muc 5 ein.
Eine erfindungsgemäße Impfung ist auch in Kombination mit Brustkrebs-Antigenen nützlich, wie her 2/Neu, Mammaglobin (US-Patent 5,668,267 oder die, die in WO/0052165, WO 99/33869, WO 99/19479, WO 98/45328 offenbart sind. Her 2 neu-Antigene werden unter anderem in US-Patent 5,801,005 offenbart. Bevorzugt umfaßt das Her 2 neu-Antigen die gesamte extrazelluläre Domäne (umfassend angenähert Aminosäuren 1-645) oder Fragmente davon und wenigstens einen immunogenen Teil der gesamten intrazellulären Domäne, ungefähr 580 C-terminale Aminosäuren. Insbesondere sollte der intrazelluläre Teil die Phosphorylierungsdomäne oder Fragmente davon umfassen. Solche Konstrukte sind in WO 00/44899 offenbart.
Eine erfindungsgemäße intradermale Impfung kann zur Prophylaxe oder Therapie einer Allergie verwendet werden. Solche Impfungen würden allergenspezifische (z.B. Derp1) und allergen-unspezifische Antigene (z.B. Peptide, die vom menschlichen IgE abgeleitet sind, einschließlich, jedoch nicht auf das Stanworth-Decapeptid ( EP 0 477 231 B1 )) beschränkt, umfassen.
Eine erfindungsgemäße intradermale Impfung kann auch zur Prophylaxe oder Therapie von chronischen Erkrankungen, die keine Allergie, Krebs oder infektiöse Erkrankungen sind, verwendet werden. Solche chronischen Erkrankungen sind Krankheiten, wie Atherosklerose und Alzheimer.
Relevante Antigene zur Prophylaxe und Therapie von Patienten, die für die Alzheimersche neurodegenerative Erkrankung empfänglich sind oder an ihr leiden, sind insbesondere das N-terminale 39-43 Aminosäurefragment (Aβ des Amyloid-Vorläuferproteins und kleinere Fragmente). Dieses Antigen wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 99/27944, (Athena Neuosciences) offenbart.
Bevorzugte Antigene zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus RSV, Streptococcus (und insbesondere in Verwendung der Impfstoffe, die in WO 00/56359 beschrieben sind, deren Inhalt hier durch Bezugnahme eingeführt wird), HSV, HAV, HBV, VZV, HPV und CMV besteht. Zusätzlich können wenigstens zwei der Impfstoffe in dieser vorzugsweise eingeschränkten Liste kombiniert werden, um bevorzugte Impfstoffkombinationen zu bilden; zum Beispiel die Kombination eines Streptococcus- und RSV-Impfstoffes und eine Kombination eines HPV- und HSV-Impfstoffes und eine Kombination eines HBV- und HAV-Impfstoffes. Eine andere spezifische Impfstoffkombination, die in diesem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt den Infanrix^TM-Bereich, der von G1axoSmithKline Biologicals hergestellt wird, ein. Solche Impfstoffe basieren auf einer "Kern"-Kombination aus Diphtherietoxin-, Tetanustoxin- und B. pertussis-Antigenen. Dieser Impfstoff umfaßt einen Pertussisbestandteil (entweder abgetötetes Ganzzellen-B.-pertussis oder zellfreies Pertussis, das typischerweise aus zwei Antigenen, PT und FHA und oft 69 kDa, gegebenenfalls mit einem oder zwei Agglutinogen 2 oder Agglutinogen 3 besteht). Solche Impfstoffe werden oft als DTPw (Ganzzelle) oder DTPa (zellfrei) wiedergegeben.
Einzelne Kombinationsimpfstoffe innerhalb des Schutzbereiches der Erfindung schließen ein:
Diphtherie-Tetanus-Pertussis-Hepatitis B (DTP-HB),
Diphtherie-Tetanus-Hepatitis B (DT-HB),
Hib-Hepatitis B,
DTP-Hib-Hepatitis B,
IPV (inaktivierter Polioimpfstoff)-DTP-Hib-Hepatitis B [z.B. Infanrix-Hexa TM – SmithKline Beecham Biologicals s.a.],
Diptherie-Tetanus-Pertussis-Hepatitis-B-IPV (DTP-HB-IPV) [z.B. Infanrix-Penta TM – SmithKline Beecham Biologicals s.a.].
Der Pertussis-Bestandteil ist passenderweise ein Ganzzellen-Pertussisimpfstoff oder ein zellfreier Pertussis-Impfstoff, der teilweise gereinigte oder hochgereinigte Antigene enthält. Die vorgenannten Kombinationen können gegebenenfalls einen Bestandteil enthalten, der gegenüber Hepatitis A protektiv ist. Vorzugsweise ist der Hepatitis A-Bestandteil mit Formalin inaktiviertes HM-175. Vorteilhafterweise wird HM-175 durch Behandlung des kultivierten HM-175 mit Trypsin gereinigt, indem das intakte Virus aus einem mit einer kleiner Protease digerierten Protein durch Permeationschromatographie separiert wird und mit Formalin inaktiviert wird. Vorteilhafterweise ist der das Hepatitis B-enthaltende Kombinationsimpfstoff ein pädiatrischer Impfstoff.
Die am meisten bevorzugten Antigene werden aus den folgenden Pathogenen ausgewählt: humanes Papilloma-Virus; respiratorisches Syncytiumvirus; Hepatitis B- und/oder Hepatitis A-Virus (Viren), Meningitis B; meningokokkale Antigene und/oder Haemophilus influenzae b und/oder andere Antigene; Streptococcus pneumoniae-Antigene allein oder in Kombination mit anderen Antigenen; Varicella Zoster-Virus.
Bevorzugt umfaßt die zu verwendende Impfstoffzusammensetzung kein Influenza-Antigen.
Die Menge eines Antigens in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine immunprotektive Antwort ohne signifikante Nebenwirkungen in typischen Impflingen auslöst. Solch eine Menge wird variieren, abhängig davon, welches spezifische Immunogen verwendet wird und wie es dargeboten wird. Gewöhnlich umfaßt jede Impfstoffdosis 1 bis 1000 μg des Antigens oder jeden Antigens, bevorzugt 1 bis 500 μg, bevorzugt 1 bis 100 μg, am meisten bevorzugt 1 bis 50 μg. Bevorzugt beträgt die Gesamtdosis eines Antigens 1 bis 500 μg, bevorzugt 1 bis 100 μg, am meisten bevorzugt 1 bis 50 μg. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die erhaltenen Impfstoffe "Niedrigdosierungen", indem sie 10 bis 100 μg des Antigens oder jeden Antigens per Dosis umfassen, bevorzugter 1 bis 20 μg per Dosis und am meisten bevorzugt etwa 10 μg pro Dosis. Bevorzugter liegt die Gesamtdosis eines Antigens zwischen 1 und 50 μg, bevorzugter 1 bis 20 μg per Dosis und am meisten bevorzugt etwa 10 μg pro Dosis. Eine optimale Menge für einen einzelnen Impfstoff kann über Standardstudien, die eine Beobachtung geeigneter Immunantworten in den Impflingen einschließen, bestimmt werden. Auf eine Eingangsimpfung folgend, können die Empfänger eine oder mehrere Verstärkungsimmunisierungen in adäquatem zeitlichem Abstand, erhalten.
Bevorzugt ist der Impfstoff in einem Flüssigkeitsvolumen, das geringer als für hierin beschriebene herkömmliche intramuskuläre Impfstoffe ist ("geringes Volumen"), insbesondere ein Volumen von etwa 0,05 ml und 0,2 ml. Bevorzugt beträgt das Volumen einer Dosis eines erfindungsgemäßen Impfstoffes zwischen 0,025 ml und 2,5 ml, bevorzugter ungefähr 0,1 ml oder ungefähr 0,2 ml. Ein 50 μl Dosisvolumen könnte auch in Erwägung gezogen werden. Eine 0,1 ml-Dosis ist angenähert ein Fünftel bis ein Zehntel des Volumens einer herkömmlichen intramuskulären menschlichen Impfstoffdosis (herkömmlich zwischen 0,5 und 1 ml). Das Flüssigkeitsvolumen, das intradermal verabreicht werden kann, hängt teilweise vom Injektionsort ab. Beispielsweise ist das für eine Injektion im Bereich des Deltamuskels bevorzugte Maximum 0,1 ml, währenddessen in der Lendenregion ein größeres Volumen, z.B. etwa 0,2 ml gegeben werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verwendung eines Sterols, eines Saponins, formuliert in einem Liposom zur Verfügung, in der Herstellung einer intradermalen Impfstofformulierung mit einer geringen Dosis und einem geringen Volumen.
Beispiel 1: Immunogenität von Spaltimpfstoffen in Mäusen
Spalt-RSV-Formulierungen
Die folgenden experimentellen Reihen veranschaulichen, daß ein Spalt-RSV eine potente Immunantwort induziert, wenn es über die intradermale Route (ID) verabreicht wird.
Methoden
Spalt-RSV
Eine RSV-Probe wurde unter Verwendung von 2 % Natriumdesoxycholat gespalten. Das zu spaltende Virus wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren mit dem Detergens inkubiert.
Nach Spaltung wurden die Lösungen gegen eine Pufferformulierung (PO₄, 10 mM/NaCl 150 mM, pH 7,5) zur Entfernung des Überschusses des Detergens dialysiert.
Analyse: Ultrazentrifugation
Nach Befüllen eines Zentrifugenröhrchens zur Hälfte mit 30%iger Saccharose-Lösung (450 μl) wurde die zu analysierende Probe (450 μl) sanft und vorsichtig auf dieses Saccharosekissen gelegt und anschließend über eine Stunde bei 50 000 Upm bei +4°C in einem Beckman TL100-Rotor zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Inhalt des Röhrchens unter Bildung von 3 Teilen abgegossen. Die obere Phase (300 μl) wird als "Überstand" wiedergegeben. Die mittlere Phase (300 μl) ist die Verbindungsphase zwischen der Probe und dem Saccharosekissen, hierin "die Mittlere" genannt. Die untere Phase (300 μl) ist die Bodenlösung mit dem resuspen dierten Pellet, wenn die Zentrifugation an einem ganzen Virus, durchgeführt wurde; sie wird "Pellet" genannt.
Diese drei Fraktionen wurden dann mittels Western Blot gegen spezifische virale Antigene analysiert. Diese Analyse erlaubt die Integrität des zu prüfenden Virus (positive Pelletfraktion) und die Effektivität der zu bestimmenden Spaltung (geeignet, Überstandsfraktion positiv für alle oder die meisten Strukturproteine, wie die Hüllproteine) festzustellen.
FG-spezifischer ELISA
Die ersten zur Auswertung der Immunantwort verwendeten Immunablesungen waren ELISA-Assays, die das gesamte RSV FG-spezifische Immunglobulin (Ig), das in den Seren der geimpften Tiere vorhanden ist, messen. In diesen Assays wurden 96 Mikrotiterplatten mit rekombinantem RSV FG-Antigen beschichtet, und die Tierseren wurden seriell verdünnt und zu den beschichteten Vertiefungen gegeben. Ein gebundener Antikörper wird durch Zugabe von Meerrettich-gebundenem Anti-Meerschweinchen-Ig detektiert. Ein gebundener Antikörper wird durch Zugabe eines OPDA-Substrats offengelegt, gefolgt von einer Behandlung mit 2 N H₂SO₄ und Messung der optischen Dichte (OD) bei 490 nm. Der Antikörpertiter wird gegenüber einer Referenz unter Verwendung der SoftMax Pro-Software (Anwendung einer vier Parameter umfassenden Gleichung) berechnet und in EU/ml ausgedrückt.
Neutralisationsassay
Zusätzlich zu den ELISA-Assays wurden Neutralisationsassays mit einbezogen, um ferner die Qualität der Immunantwort, die durch die Immunisierungen ausgelöst wurde, zu charakterisieren. Beim Neutralisationsassay wurden Zweifachverdünnungen der Tierseren mit RSV/A-Virus (3000 pfu) und Meerschweinchen-Komplement über eine Stunde bei 37°C in 96 Vertiefungen aufweisende Gewebekulturplatten inkubiert. Hep-2-Zellen (10⁴ Zellen/Vertiefung) wurden direkt in jede Vertiefung gegeben und die Platten über 4 Tage bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden abgesaugt und eine käuflich erhältliche WST-1-Lösung wurde jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden für weitere 18–24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das OD wurde bei 450 nm kontrolliert und die Titration durch lineare Regressionsanalyse analysiert. Der berichtete Titer ist der inverse der Serumverdünnung, der aus einer 50%igen Verminderung des maximalen OD, der für nicht infizierte Zellen beobachtet wurde, resultierte.
Herstellung eines Impfstoffes
1.1 Verfahren zur Herstellung von Liposomens
Ein Gemisch aus einem Lipid (zum Beispiel Phosphatidylcholin) und Cholesterol in einem organischen Lösungsmittel wurde unter Vakuum ausführlich getrocknet (oder alternativ in einem Strom eines Inertgases). Anschließend wurde eine wäßrige Lösung (z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) zugegeben und das Gefäß gerührt, bis das gesamte Lipid suspendiert ist. Diese Suspension wurde anschließend mikrofluidisiert, bis die Liposomgröße auf 100 nm reduziert ist und anschließend wurde steril durch ein 0,2 μm-Filter filtriert.
Typischerweise beträgt das Cholesterol:Phosphatidylcholin-Verhältnis 1:4 (G/G), und die wäßrige Lösung wird zugegeben, um eine Endkonzentration des Cholesterols von 5 bis 50 μg/ml zu ergeben.
Die Liposomen haben eine definierte Größe von 100 nm und werden als SUV (stehend für: small unilamelar vesicles) wiedergegeben. Wenn diese Lösung wiederholt tiefgefroren und aufgetaut wird, verschmelzen die Vesikel, um große vielschichtige Strukturen (MLV) in einer Größe zu bilden, die von 500 nm bis 15 μm reichen. Falls 3D-MPL in organischer Lösung zu dem Lipid in organischer Lösung gegeben wird, enthalten die endgültigen Liposomen 3D-MPL in der Membran (wiedergegeben als 3D-MPL-innerhalb).
Die Liposomen an sich sind über die Zeit stabil und weisen keine Fähigkeit auf, zu verschmelzen.
1.2 Verfahren zur Herstellung einer Formulierung
QS21 wird in wäßriger Lösung zu den Liposomen gegeben. Dieses Gemisch wird anschließend der Antigenlösung zugegeben.
Impfprotokoll
Die Immunogenität des RSV-Spaltantigens, das über die ID-Route verabreicht wurde, wurde in Meerschweinchen bewertet. Die Ausführbarkeit einer tatsächlichen ID-Injektion in dieser Spezies wurde durch Injektion von India-Tinte in die Lederhaut und eine histologische Prüfung der Gewebe (Daten nicht gezeigt) unter Verwendung des Mantoux-Verfahrens mit einer Tuberkulinnadel bestätigt. Wiederum in der Bemühung den Immunstatus, der in Populationen von Älteren gefunden wurde (d.h. sensibilisiert gegenüber RSV), zu stimulieren, wurden die Hartley-Meerschweinchen (5 pro Gruppe) entweder mit einem lebenden RSV-Virus (5 × 10⁵ pfu, verabreicht IN, in 100 μl-50 μl/Nostril; Gruppen A-E) oder mit gereinigtem ganzem RSV-Virus (enthaltend 6 μg F-Protein, verabreicht IM, in 100 μl; Gruppen F-J), sensibilisiert. Zwei äquivalente Dosen des Impfstoffes wurden am Tag 21 und am Tag 42 nach der Sensibilisierung verabreicht. Die Gruppen A und F erhielten die Spalt-RSV-Zubereitung, die 4,2 μg des F-Proteins enthielt, die über die ID-Route verabreicht wurde. Die Gruppen B und G erhielten die Spalt-RSV-Zubereitung, die 0,84 μg des F-Proteins, die über ID-Route verabreicht wurde, enthielt. Die Gruppen C und H erhielten die Spalt-RSV-Zubereitung, die 4,2 μg F-Protein, unterstützt mit den Saponin/Sterol-Liposomen der vorliegenden Erfindung (umfassend 5 μg QS21, 25 μg Cholesterol, Phosphatidylcholin und 5 μ 3D-MPL der Membran des Liposoms) und über die ID-Route verabreicht wurde. Die Gruppen D und I erhielten die Spalt-RSV-Zubereitung, die 0,84 μg F-Protein enthielt, unterstützt mit demselben Hilfsstoff, wie Gruppen C, die über die ID-Route verabreicht wurde. Die Gruppen E und J erhielten die Spalt-RSV-Zubereitung, die 4,2 μg F-Protein enthielt, die über die IM-Route verabreicht wurde. Den Tieren wurden 3 Wochen nach der ersten Impfstoffdosis und zwei Wochen nach der zweiten Impfstoffdosis Blut abgenommen und die Immunantwort ausgewertet.
Die Ergebnisse dieses Experiments werden in den 1 und 2 zusammengefaßt. 1 zeigt die FG-spezifische Immunantwort, die in den Meerschweinchenseren während des Verlaufs des Experiments detektiert wurde. 2 faßt die Neutralisationsdaten zusammen. Daher ist in einer sensibilisierten Population (sensibilisiert entweder durch eine Lebendvirusinfektion oder Verabreichung eines gereinigten Ganzvirus) eine Einzeldosis eines Spalt-RSV, das über ID-Route verabreicht wurde, stark immunogen und diese Antwort kann ferner durch eine zweite Dosis eines Impfstoffes verstärkt werden.

Claims

Verwendung eines Liposoms, das ein immunologisch aktives Saponin, ein Sterol und ein Antigen oder eine antigene Zubereitung umfaßt, in der Herstellung eines intradermalen Impfstoffes zur intradermalen Verabreichung zur Behandlung einer Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das immunologisch aktive Saponin QS21 ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Sterol Cholesterol ist.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, worin das Verhältnis von QS21:Cholesterol zwischen 1:1 und 1:100 G/G ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Liposom ein einschichtiges Liposom ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der mittlere Durchmesser der Liposomen zwischen 10 und 220 nm ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der intradermale Impfstoff ferner ein LPS-Derivat oder ein immunstimulierendes CpG-Oligonukleotid umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Antigen oder die antigene Zubereitung ein Antigen ist, das in der Lage ist, eine Immunantwort gegen wenigstens ein Pathogen aus der Gruppe von Pathogenen zu erzeugen, die aus einem Humanimmunschwächevirus, einem Varizella Zoster-Virus, einem Herpes simplex-Virus Typ 1, einem Herpes simplex-Virus Typ 2, einem humanen Cytomegalovirus, einem Denguevirus, Hepatitis A, B, C oder E, einem respiratorischen Syncytiumvirus, einem humanem Papillomavirus, einem Influenza (Grippe)-Virus, Haemophilus influenzae, Meningococcus, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Mycoplasma, Mycobakterien, Plasmodium oder Toxoplasma besteht.