DE69636553T2

DE69636553T2 - Nukleinsäuren bindender magnetischer Träger und Verfahren für die Nukleinsäureisolierung unter dessen Verwendung

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Publication number: DE69636553T2
Application number: DE69636553T
Authority: DE
Inventors: c/o Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Hiroaki Ohtsu-shi Uematsu; c/o Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Katsuya Ohtsu-shi Daimon; c/o Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Satoko Ohtsu-shi Yoshiga
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1995-07-07
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2016-07-06
Also published as: DE69636553D1; EP1260595A3; EP1260595A2; EP1260595B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Träger, der magnetisch reagierende Teilchen enthält, der zum Extrahieren oder Reinigen einer Nucleinsäure aus einem die Nucleinsäure enthaltenden biologischen Material oder zum Reinigen eines amplifizierten Produkts einer Nucleinsäure verwendet wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure aus einem eine Nucleinsäure enthaltenden biologischen Material unter Verwendung des magnetischen Trägers und eines magnetischen Felds und ein Kit zum Verwenden des Verfahrens.
In herkömmlichen Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure unter Verwendung eines eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Trägers ist bekannt, magnetisch reagierende Teilchen mit einem superparamagnetischen Eisenoxidkern zu verwenden, die mit einer polymeren Silanschicht bedeckt sind, an die ein bioverträgliches Molekül (zum Beispiel eine Nucleinsäure) kovalent gebunden wird (JP-A-60-1564).
WO-A-96/41811 betrifft magnetische Teilchen mit einer im Wesentlichen porenfreien äußeren Glasoberfläche oder einer äußeren Glasoberfläche mit Poren mit einem Durchmesser von weniger als 10 nm und deren Verwendung zur Isolierung biologischen Materials aus Proben.
DE-A-43 07 262 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung magnetischer polymerer Siliciumdioxidverbindungen in einer bestimmten Form durch Einschluss magnetischer Materialien in deren Matrix.
EP-A-0 125 995 offenbart ein magnetisch reaktives Teilchen, das einen magnetischen Metalloxidkern umfasst, der im Allgemeinen von einem Silanüberzug umgeben ist, an den Moleküle kovalent gekoppelt werden können, wobei eine Masse der Teilchen in wässrigen Medien dispergierbar ist, um eine wässrige Dispersion mit bestimmten Eigenschaften zu bilden.
WO-A-93/10162 betrifft magnetische poröse anorganische Siliciumdioxid-haltige Materialien mit einer Teilchengröße von etwa 1 bis etwa 200 μm, von denen gesagt wird, dass sie als feste Träger in verschiedenen Chromatographie-, Immunoassay-, Synthese- und anderen Trenn- und Reinigungsverfahren von Nutzen sind.
Ein Verfahren zum Bestimmen einer Ligatkonzentration, einschließlich der folgenden Schritte, ist ebenfalls bekannt: (1) Verwendung von magnetisch reagierenden Teilchen, die ein mit einer polymeren Silanschicht bedecktes superparamagnetisches Eisenoxid enthalten, an das ein bioverträgliches Molekül gebunden werden kann; (2) Umsetzung einer einen Ligat, eine bekannte Menge eines markierten Ligaten und die magnetisch reagierenden Teilchen, an die ein ligatspezifischer Ligand gebunden wird, enthaltenden Probenlösung, um so einen Liganden-Ligat-Komplex auf den magnetisch reagierenden Teilchen zu bilden; (3) magnetisches Trennen der magnetisch reagierenden Teilchen aus der Reaktionslösung; (4) Messen des markierten Ligaten, der an die magnetisch reagierenden Teilchen gebunden ist, oder des freien markierten Ligaten in der Reaktionslösung; und (5) Anwenden der Messung des markierten Ligaten auf die Standardkurve, um so die Ligatkonzentration zu erhalten. Das Verfahren ist in JP-B-7-6986 beschrieben.
In den vorstehend erwähnten Verfahren ist es zum Binden der Nucleinsäure an die magnetisch reagierenden Teilchen erforderlich, eine Silanschicht zu bilden, an die ein bioverträgliches Molekül (zum Beispiel eine Nucleinsäure) kovalent gebunden wird.
Außerdem sind ein Analyseverfahren und eine Vorrichtung unter Verwendung einer Sequenz einer Nucleinsäure bekannt, die an ein gegenüber dem magnetischen Feld empfindliches Material gebunden wird (WO-A-86/05815). Das Verfahren verwendet ein magnetisches oder magnetisierbares Teilchen, bedeckt mit einem Material, das zum Binden einer einsträngigen Nucleinsäure fähig ist, um so die einsträngige Nucleinsäure abzutrennen und nachzuweisen. Insbesondere ist die Oberfläche des magnetischen Teilchens mit Nitrocellulose bedeckt, die eine Art Cellulosederivat ist, und Nitrocellulose wird insbesondere an einsträngige DNA oder RNA gebunden. Die mit diesem Verfahren abgetrennte einsträngige DNA oder RNA wird zur Sequenzierung verwendet.
In dem Verfahren ist es erforderlich, die einsträngige DNA oder RNA spezifisch an den magnetischen Träger zu binden.
Es ist auch bekannt, ein polykationisches Substrat zum Reinigen, Abtrennen und Hybridisieren einer Nucleinsäure, insbesondere zum Reinigen und Abtrennen einer Verunreinigungen enthaltenden Nucleinsäure, zu verwenden (JP-A-1-502319). In dem Verfahren wird eine Verunreinigungen enthaltende Probenlösung mit dem polykationischen festen Träger (magnetisch reagierendes Teilchen) in Kontakt gebracht, so dass die Nucleinsäure an den Träger nicht kovalent gebunden wird, ohne dass in der Probenlösung enthaltende Verunreinigungen übermäßig an den Träger gebunden werden. Der Träger, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, wird dann von der Lösung abgetrennt. Beispiele des Trägers schließen Metalloxid, Glas und Polyamid ein. Beispiele der polykationischen magnetisch reagierenden Teilchen schließen magnetische Mikrokügelchen (typischerweise magnetische Aminmikrokügelchen) ein. Die Bindung zwischen der Nucleinsäure und dem Träger wird als auf ionischer Bindung basierend zwischen den magnetischen Aminmikrokügelchen mit positiver Ladung und einer Zuckerphosphat-Hauptkette in der Nucleinsäure mit negativer Ladung angesehen.
Außerdem ist auch ein Verfahren zum Isolieren einer Substanz von Interesse in einem biologischen Material unter Verwendung von magnetischen Teilchen, bestehend aus polymeren Innenkernteilchen und einer magnetisch reagierenden Metalloxid/Polymer-Beschichtung, die das Kernteilchen gleichmäßig bedeckt, bekannt (JP-A-2-501753).
Das Verfahren schließt die Schritte der Umsetzung der magnetischen Teilchen mit einem biologischen Material, um so einen Komplex zu bilden, der aus den magnetischen Teilchen und einer Substanz aus biologischem Material besteht; Abtrennen des Komplexes vom biologischen Material; und Entfernen der magnetischen Teilchen vom Komplex, um so die Substanz zu erhalten, ein.
In dem Verfahren wird ein Polymer, wie Polystyrol, als Innenkernteilchen verwendet, und Metalloxid und ein Polymer, wie Polystyrol, bedecken gleichmäßig das Innenkernteilchen.
Superparamagnetische Teilchen mit mehreren getrennten Oligonucleotidsequenzen mit Monodispergierbarkeit (weniger als 5 % Teilchendurchmesserverteilung) und ein Verfahren zur Herstellung magnetischer Teilchen, die die Oligonucleotide an funktionelle Gruppen (zum Beispiel Biotinylgruppen) oder Moleküle an der Oberfläche davon kovalent binden oder absorbieren, ist bekannt. Es ist auch bekannt, ein Teilchen, an das ein Oligonucleotid kovalent gebunden oder adsorbiert wird, als Test einer Nucleinsäure zu verwenden (WO-A-90/06045). Die Aufgabe des Verfahrens ist es, spezifisch kovalente Bindungen zu bilden oder eine Probe einer Nucleinsäure, die zur Hybridisierung verwendet wird, an das Teilchen zu adsorbieren. Daher sind die vorstehend erwähnten Teilchen kein Träger, der eine große Menge an Nucleinsäure nicht spezifisch immobilisiert (d.h. bindet oder adsorbiert).
Wie vorstehend beschrieben, wird in den Verfahren unter Verwendung eines Silans oder einer polymeren Schicht auf der Oberfläche des magnetischen Teilchenträgers eine Nucleinsäure zum Beispiel kovalent an das Silan oder die polymere Schicht auf der Trägeroberfläche gebunden. Solche Verfahren erfordern die Bereitstellung funktioneller Gruppen auf der Trägeroberfläche (magnetisches Teilchen). Demgemäß sind, während solche Verfahren vorteilhaft für die Trennung oder quantitative Bestimmung von Nucleinsäuren unter Verwendung der spezifischen Adsorption davon sind, sie nicht für einen Träger mit fester Phase geeignet, der nicht spezifisch eine große Menge an Nucleinsäuren adsorbiert, um so eine hohe Ausbeute zu erzielen.
Bei Verwendung von oberflächenbeschichteten magnetischen Teilchen als Träger mit fester Phase zum Isolieren einer Nucleinsäure ist ein großes Teilchen (zum Beispiel mit einem Durchmesser von mehr als 20 μm) zum Antworten auf ein schwaches magnetisches Feld oder eine kleine Änderung des magnetischen Feldes fähig; jedoch neigt es zum raschen Ausfallen und zu nicht ausreichender Dispergierbarkeit. Daher ist es schwierig, dass solche großen Teilchen eine kleine Nucleinsäure, wie Plasmid-DNA, in der Reaktion adsorbieren und immobilisieren, die Homogenität, wie Adsorption einer festen Phase, erfordert. Außerdem weisen große Teilchen kleinere spezifische Oberfläche pro Gewicht auf als kleine Teilchen. Als Ergebnis ist ein großes Teilchen nur fähig, eine kleine Menge biologisches Material daran zu binden.
Kleine Teilchen (zum Beispiel mit einem Durchmesser von weniger als 0,1 μm) weisen außerordentliche spezifische Oberfläche und Dispergierbarkeit auf; jedoch weisen sie nicht ausreichende Absetzeigenschaften auf. Daher ist, wenn kleine Teilchen in einer Trennung unter Verwendung des magnetischen Felds verwendet werden, ein größerer und teurerer Magnet mit größerer magnetischer Ladung erforderlich, und es braucht längere Zeit, um die Teilchen unter Verwendung des magnetischen Felds zu trennen.
In Bezug auf ein Verfahren unter Verwendung von Siliciumdioxidteilchen zur Reinigung einer Nucleinsäure wurde eine Säulentrennung, die im Wesentlichen eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie(HPLC)-Vorrichtung verwendet, herkömmlicherweise verwendet. Eine gewünschte Nucleinsäure wird auf der Siliciumdioxidträgeroberflächen unter Durchleiten einer synthetisierten Nucleinsäure oder eines amplifizierten Produkts durch die Säule adsorbiert. Eine Verunreinigung kann durch Spülen mit einem Waschpuffer abgewaschen werden. Die gewünschte Nucleinsäure kann unter Verwendung eines Puffers gesammelt werden. Das Verfahren weist insofern einen Vorteil auf, als die Siliciumdioxidträger umfassende Säule wiederholt verwendet werden kann. Jedoch kann die Isolierung einer Nucleinsäure aus Vollblut (das ein biologisches Material ist) nicht durchgeführt werden, da die Säule verstopft. Als Ergebnis weist das Verfahren insofern Nachteile auf, als nur eine kleine Menge an Nucleinsäure gesammelt werden kann. Zusätzlich ist die für das Verfahren verwendete Vorrichtung sehr teuer.
Ein Verfahren zum Abtrennen einer Nucleinsäure von einem biologischen Material (zum Beispiel Vollblut, Urin) unter Verwendung von Siliciumdioxidteilchen als Träger mit fester Phase ist ebenfalls bekannt (JP-A-2-289596 und JP-B-7-13077).
Jedoch sind in einem solchen Verfahren, das Siliciumdioxidteilchen als Träger verwendet, komplizierte Verfahren erforderlich (zum Beispiel muss eine Zentrifugation mehrmals durchgeführt werden). Zusätzlich erfordert nach Zugabe der Probenlösung zu den Teilchen das Verfahren einen Mischvorgang durch kräftiges Rühren mit einem Vortex-Mischer zum ausreichenden Mischen der Probenlösung und der Teilchen. Wegen des kräftigen Rührens neigt eine in der Probe enthaltene Nucleinsäure zum Abbau, und als Ergebnis kann eine langkettige Nucleinsäure kaum abgetrennt werden.
Wie vorstehend beschrieben, gibt es verschiedene Probleme in Bezug auf die nicht spezifische Immobilisierung einer großen Menge von Nucleinsäuren.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete, die Nucleinsäure bindende magnetische Träger umfasst magnetische Siliciumdioxidteilchen, die ein superparamagnetisches Metalloxid enthalten, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen eine spezifische Oberfläche von etwa 100 bis etwa 800 m²/g aufweisen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Verbund eines superparamagnetischen Metalloxids mit einer mit Siliciumdioxid bedeckten Oberfläche und eines anorganischen porösen Matrixmaterials, bestehend aus feinen Siliciumdioxidteilchen, und sind im Wesentlichen kugelförmig.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das superparamagnetische Metalloxid Eisenoxid.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das superparamagnetische Metalloxid in einer Menge von etwa 10 bis etwa 60 Gew.-% enthalten.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Siliciumdioxidteilchen weisen einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm, ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm auf.
Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung schließt ein Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure die Schritte ein:
Mischen eines eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Trägers, der magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, die ein superparamagnetisches Metalloxid enthalten, eines eine Nucleinsäure enthaltenden Materials und einer Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure, um so eine Probenlösung zu bilden;
Abtrennen des magnetischen Trägers, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, aus der Probenlösung unter Verwendung eines magnetischen Felds; und
Eluieren der Nucleinsäure vom magnetischen Träger, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Nucleinsäure eine Nucleinsäure in einem Plasmid oder amplifizierten Produkt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure ein chaotropes Material.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das chaotrope Material ausgewählt aus Guanidinsalzen, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumthiocyanat, Natriumisothiocyanat, Harnstoff und Kombinationen davon.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet das Verfahren im Elutionsschritt einen Elutionspuffer.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Puffer TE-Puffer oder sterilisiertes Wasser.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung schließt ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure die Schritte ein:
Mischen eines eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Trägers, der magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, die einen superparamagnetischen Metalloxidkristall enthalten, eines eine Nucleinsäure umfassenden Materials und einer Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure, um so eine Probenlösung zu bilden;
Abtrennen des magnetischen Trägers, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, aus der Probenlösung unter Verwendung eines magnetischen Felds;
Eluieren der Nucleinsäure vom magnetischen Träger; und
Nachweis einer Zielnucleinsäure, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt das Verfahren weiter den Schritt der Amplifikation der eluierten Nucleinsäure ein.
Gemäß noch einem anderen Gesichtspunkt der Erfindung schließt ein Kit zum Isolieren einer Nucleinsäure einen eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Träger, der magnetische Siliciumdioxidteilchen, die ein superparamagnetisches Metalloxid enthalten, und eine Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure enthält, wobei die magnetischen Silliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen, ein.
So ermöglicht die hier beschriebene Erfindung die Vorteile (1) der Verwendung eines magnetischen Trägers, der zur nicht spezifischen Adsorption einer großen Menge an Nucleinsäuren fähig ist und daher ausgezeichnete Abtrenneffizienz aufweist; (2) die Bereitstellung eines Verfahrens zum Isolieren einer Nucleinsäure, das zum nicht spezifischen Adsorbieren einer großen Menge an Nucleinsäuren fähig ist und daher ausgezeichnete Abtrenneffizienz aufweist; (3) die Bereitstellung eines Verfahrens zum Isolieren einer Nucleinsäure mit ausgezeichneter Handhabbarkeit; (4) die Bereitstellung eines Verfahrens zum Isolieren einer Nucleinsäure, das leicht automatisiert werden kann; (5) die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis einer Nucleinsäure mit ausgezeichneter Handhabbarkeit; (6) die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis einer Nucleinsäure, das leicht automatisiert werden kann; und (7) die Bereitstellung eines für solche Verfahren verwendeten Kits.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete, eine Nucleinsäure bindende magnetische Träger sind magnetische Siliciumdioxidteilchen, die ein superparamagnetisches Metalloxid umfassen. Die erfindungsgemäßen magnetischen Siliciumdioxidteilchen sind zum Binden einer Nucleinsäure und Trennen von Feststoff und Flüssigkeit unter Verwendung eines magnetischen Felds fähig.
Eine Nucleinsäure wird an das erfindungsgemäße magnetische Siliciumdioxidteilchen über eine Wasserstoff-Brückenbindung gebunden, die zwischen einer Hydroxylgruppe an der Teilchenoberfläche und einer Base der Nucleinsäure gebildet wird.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Siliciumdioxidteilchen weisen eine spezifische Oberfläche von etwa 100 bis etwa 800 m²/g, vorzugsweise etwa 200 bis etwa 600 m²/g und stärker bevorzugt etwa 300 bis etwa 500 m²/g, auf. Die spezifische Oberfläche kann mit einem Stickstoffgas-Adsorptionsverfahren bestimmt werden, das durch JIS K1150 „Test methods for silica gels" definiert ist. Wenn die spezifische Oberfläche der magnetischen Siliciumdioxidteilchen geringer als etwa 100 m²/g ist, ist die Adsorptionsfähigkeit einer Nucleinsäure nicht ausreichend. Infolgedessen kann in vielen Fällen nur eine kleine Menge an Nucleinsäuren gesammelt werden. Wenn die spezifische Oberfläche etwa 800 m²/g übersteigt, wird das Porenvolumen der Teilchen zu groß. Infolgedessen kann, da nur eine kleine Menge der Probenlösung durch Elution gesammelt werden kann, in vielen Fällen nur eine kleine Menge an Nucleinsäuren gesammelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Verbund des superparamagnetischen Metalloxids mit einer mit Siliciumdioxid bedeckten Oberfläche und eines anorganischen porösen Matrixmaterials, das aus feinen Siliciumdioxidteilchen besteht. Die magnetischen Siliciumdioxidteilchen sind im Wesentlichen kugelförmig.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete superparamagnetische Metalloxid bezieht sich auf das Metalloxid, das auf eine Magnetfeldänderung reagiert, jedoch nicht permanent magnetisiert ist und geringe Restmagnetisierung aufweist.
Ein bevorzugtes Beispiel des superparamagnetischen Metalloxids ist Eisenoxid. Als Eisenoxid können Trieisentetraoxid (Fe₃O₄), Eisensesquioxid (γFe₂O₃), das durch allmähliche Oxidation von Trieisentetraoxid erhalten wird, und dgl. verwendet werden. Trieisentetraoxid wird insbesondere bevorzugt verwendet. Das superparamagnetische Metalloxid ist vorzugsweise in der Form von Teilchen und stärker bevorzugt in der Form von im Wesentlichen kugelförmigen Teilchen. Der Durchmesser des superparamagnetischen Metalloxids liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 0,4 μm, stärker bevorzugt im Bereich von etwa 0,25 bis etwa 0,30 μm. Da Trieisentetraoxid mit im Wesentlichen kugelförmiger Form eine besonders geringe Restmagnetisierung und glatte Oberfläche aufweist, kann es wiederholt in Trennverfahren verwendet werden. Außerdem weist das magnetische Siliciumdioxidteilchen, das Trieisentetraoxid enthält, ausgezeichnete Stabilität in neutralen und schwach sauren wässrigen Lösungen auf und kann mehr als zwei Jahre in Lösung gelagert werden.
Die Menge des in den erfindungsgemäßen magnetischen Siliciumdioxidteilchen enthaltenen superparamagnetischen Metalloxids kann abhängig von der Magnetisierungs intensität des Metalloxids variieren; jedoch liegt die Menge vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 60 Gew.-%, stärker bevorzugt im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 Gew.-%. Durch Bereitstellen des superparamagnetischen Metalloxids in den magnetischen Siliciumdioxidteilchen in einem solchen vorzuziehenden Bereich kann der magnetische Träger (d.h. das magnetische Siliciumdioxidteilchen) schnell von der Probenlösung unter Verwendung von im Handel erhältlichen Magneten abgetrennt werden.
Außerdem liegt der mittlere Porendurchmesser der Oberfläche des magnetischen Siliciumdioxidteilchens im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 60 nm und bevorzugt im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 10 nm. Ein Porenvolumen der magnetischen Siliciumdioxidteilchen beträgt weniger als 0,5 ml/g und bevorzugt liegt es im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,5 ml/g. Der Porendurchmesser der Oberfläche und das Porenvolumen werden mit einem Stickstoffgas-Adsorptionsverfahren bestimmt, das gemäß JIS K1150 „Test methods for silica gels" definiert ist.
Die spezifische Oberfläche und das Porenvolumen hängen von der Größe des Porendurchmessers der Oberfläche ab. Je größer der Porendurchmesser der Oberfläche ist, desto größer sind die spezifische Oberfläche und das Porenvolumen. Je größer die spezifische Oberfläche ist, desto größer ist die adsorbierte Menge der Nucleinsäure; jedoch neigt die gesammelte Menge der Nucleinsäure zur Abnahme, da das Porenvolumen ebenfalls groß wird. Im vorstehend beschriebenen Bereich der spezifischen Oberfläche und des Porenvolumens kann eine bemerkenswert große Menge an Nucleinsäure gesammelt werden.
Der Teilchendurchmesser des magnetischen Siliciumdioxidteilchens liegt im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 15 μm und vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 μm. In einem solchen Bereich weist das magnetische Siliciumdioxidteilchen ausgezeichnete Dispergierbarkeit bei Mischen auf.
Die am stärksten bevorzugten magnetischen Siliciumdioxidteilchen erfüllen folgende Anforderungen: (1) sie enthalten ein superparamagnetisches Eisenoxid; (2) sie weisen eine spezifische Oberfläche von etwa 100 bis etwa 800 m²/g auf; (3) das Eisenoxid ist mit Siliciumdioxid fast bedeckt; (4) sie sind ein Verbund des mit Siliciumdioxid bedeckten Eisenoxids und eines anorganischen porösen Matrixmaterials, das aus feinen Siliciumdioxidteilchen besteht; (5) sie enthalten das Eisenoxid in einer Menge von etwa 10 bis etwa 60 Gew.-%; (6) sie weisen einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von etwa 0,1 bis etwa 60 nm auf; (7) sie weisen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g auf; und (8) sie weisen einen Teilchendurchmesser von etwa 0,5 bis etwa 15 μm auf.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Siliciumdioxidteilchen können gemäß dem zum Beispiel in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 6-47273 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel werden Trieisentetraoxid(Fe₃O₄)-Teilchen zu einer Tetraethoxysilan/Alkohol-Lösung gegeben und die Eisenoxidteilchen in der Lösung durch Ultraschall dispergiert. Ein hydrolytischer Katalysator für Tetraethoxysilan wird zur Dispersion gegeben und Siliciumdioxidteilchen auf der Oberfläche des Eisenoxidteilchens abgeschieden, während das Eisenoxidteilchen durch Ultraschall dispergiert wird. Natriumsilicat, ein organisches Lösungsmittel (zum Beispiel Toluol) und ein grenzflächenaktives Mittel (zum Beispiel Sorbitanmonostearat) werden zur so erhaltenen Dispersion gegeben, um so eine Emulsion des W/O-Typs zu bilden. Die Emulsion wird zu einer wässrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und das Gemisch gründlich gerührt. Die Emulsion wird dann filtriert, um die Teilchen von der Emulsion abzutrennen. Die Teilchen werden mit Wasser gewaschen, in Alkohol ausgefällt und getrocknet, wobei ein gewünschtes kugelförmiges Siliciumdioxidteilchen erhalten wird.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Siliciumdioxidteilchen weisen eine viel größere spezifische Oberfläche als die eines herkömmlichen magnetischen Teilchens auf. Daher sind die in der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Siliciumdioxidteilchen zur nicht spezifischen Adsorption einer großen Menge an Nucleinsäuren fähig. Außerdem werden, da die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ausgezeichnete Dispergierbarkeit aufweisen, sie leicht mit einer eine Nucleinsäure enthaltenden Probe und einer Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure gemischt. Infolgedessen kann eine große Menge an Nucleinsäuren durch Elution leicht gesammelt werden.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure schließt die Schritte Mischen eines eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Trägers, der ein magnetisches Siliciumdioxidteilchen ist, das ein superparamagnetisches Metalloxid enthält, eines eine Nucleinsäure enthaltenden Materials und einer Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure, um so eine Probenlösung zu bilden; Abtrennen des magnetischen Trägers, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, aus der Probenlösung unter Verwendung eines magnetischen Felds; und Eluieren der Nucleinsäure vom magnetischen Träger, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen, ein.
Der Schritt des Mischens des eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Trägers, des die Nucleinsäure enthaltenden Materials und der Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure kann unter Verwendung zum Beispiel eines im Handel erhältlichen Vortex-Mischers durchgeführt werden. Der Mischschritt kann auch durch Schütteln oder Umdrehen eines den vorstehend erwähnten Inhalt enthaltenden Probenrohrs durchgeführt werden.
Der Schritt der Abtrennung des magnetischen Trägers, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, von der Probenlösung unter Verwendung eines magnetischen Felds kann unter Verwendung eines Magneten durchgeführt werden. Der Magnet mit einer Magnetflußdichte von vorzugsweise etwa 200 bis etwa 4000 Gauss und stärker bevorzugt etwa 2000 Gauss kann verwendet werden. Zum Beispiel wird der Magnet nahe zur Seitenwand des Probenrohrs gebracht, das den eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Träger, das die Nucleinsäure enthaltende Material und die Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure enthält, um so den magnetischen Träger an die Seitenwand des Rohrs zu bringen. Der magnetische Träger wird dann von der Lösung abgetrennt.
Der Schritt der Elution der Nucleinsäure vom magnetischen Träger, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, kann zum Beispiel wie folgt durchgeführt werden. Der magnetische Träger, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, wird mehrmals mit einer wässrigen Lösung von etwa 70 % Ethanol gewaschen und dann getrocknet. Danach wird eine Lösung mit geringer Ionenstärke (zum Beispiel Tris-EDTA Puffer (TE-Puffer), sterilisiertes Wasser) zum Träger gegeben. Derart kann die Nucleinsäure, die an den magnetischen Träger gebunden ist, eluiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure erfordert keine spezifische Bindung einer einsträngigen DNA oder RNA an den magnetischen Träger.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete, die Nucleinsäure enthaltende Material ist ein biologisches Material, das ein Protein, eine Membran, DNA oder RNA, eine Nucleinsäure mit geringem Molekulargewicht und dgl. enthält. Beispiele für das biologische Material schließen einen Bakteriophagen, Virus und Bakterien enthaltendes Protein, eine Membran, DNA oder RNA, Nucleinsäure mit geringem Molekulargewicht und dgl., und Kombinationen davon ein. Zur Reinigung kann die Nucleinsäure auch eine Nucleinsäure in einem Plasmid oder amplifizierten Produkt sein.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure schließt einen z.B. ein chaotropes Material, EDTA oder Tris-HCl enthaltenden Puffer ein. Beispiele des chaotropen Materials schließen Guanidinsalze, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumthiocyanat, Natriumisothiocyanat und Harnstoff ein. Das chaotrope Material kann allein oder in Kombination verwendet werden. Die Konzentration des chaotropen Materials in der Lösung liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 mol/l und stärker bevorzugt im Bereich von etwa 3 bis etwa 5 mol/l.
Bevorzugte Beispiele der Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure in der vorliegenden Erfindung schließen Guanidinthiocyanat, Triton X-100 und Tris-HCl-Puffer ein.
Ein Elutionspuffer, wie TE-Puffer oder sterilisiertes Wasser, kann zum Eluieren und Abtrennen der Nucleinsäure verwendet werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure unter Verwendung von magnetischen Siliciumdioxidteilchen als Träger mit fester Phase ist die spezifische Oberfläche des Trägers mit fester Phase mehrmals so groß wie die, wenn herkömmliches poröses Glas oder magnetische Feinteilchen verwendet werden. Infolgedessen kann gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine große Menge von Nucleinsäuren abgetrennt werden.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure kann die extrahierte Nucleinsäure an den Träger in einer Lösung mit hoher Salzkonzentration gebunden werden. Außerdem kann die Elution der Nucleinsäure in einer Lösung mit geringer Ionenstärke (zum Beispiel TE-Puffer, sterilisiertes Wasser) durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure schließt folgende Vorgehensweisen ein.

(1) Eine Lösung zum Extrahieren einer Nucleinsäure wird in ein Mikro-zentrifugenröhrchen gegeben. Dann wird eine Vollblutprobe zugegeben und mit der Lösung gemischt.
(2) Eine magnetische Siliciumdioxidteilchen in sterilisiertem Wasser enthaltende Dispersion wird in das Röhrchen gegeben.
(3) Die Probe im Röhrchen wird wiederholt gemischt und man läßt sie über einen geeigneten Zeitraum absetzen.
(4) Das vorstehend erwähnte Röhrchen wird auf einen magnetischen Ständer gestellt, der mit der Form des Röhrchens übereinstimmt, so dass die magnetischen Siliciumdioxidteilchen an der Seitenwand des Röhrchens gesammelt werden.
(5) Die Lösung wird durch Saugen mit einer Filterspitze abgezogen. Die Lösung kann auch durch Dekantieren (z.B. durch Umdrehen des magnetischen Ständers mit den eingestellten Röhrchen) abgezogen werden; jedoch weist dieser Vorgang Kontaminationsprobleme durch Spritzen der Abfallflüssigkeit auf. Daher wird die Filterspitze vorzugsweise zum Abziehen der Lösung verwendet.
(6) Nach Herausnehmen des Röhrchens aus dem magnetischen Ständer wird ein Guanidinthiocyanat enthaltender Waschpuffer in das Röhrchen gegeben.
(7) Nach ausreichendem Mischen der magnetischen Siliciumdioxidteilchen und des Waschpuffers wird das Röhrchen auf einen magnetischen Ständer gestellt. Dann wird die Lösung auf vorstehend erwähnte Weise abgezogen.
(8) Der in (6) und (7) beschriebene Waschvorgang wird erneut durchgeführt.
(9) Die magnetischen Siliciumdioxidteilchen werden mit (einem) geeigneten organischen Lösungsmittel(n) (zum Beispiel etwa 70 %ige Ethanollösung und Acetonlösung) auf vorstehend erwähnte Weise gewaschen, um so Guanidinthiocyanat mit hoher Konzentration zu entfernen.
(10) Wieder werden die magnetischen Siliciumdioxidteilchen mit (einem) geeigneten organischen Lösungsmittel(n) (zum Beispiel etwa 70 %ige Ethanollösung und Acetonlösung) gewaschen.
(11) Das Röhrchen wird in einen Wärmeblock bei geeigneter Temperatur (zum Beispiel erhöhter Temperatur von etwa 56°C) eingebracht und stehengelassen, um so im Wesentlichen das organische Lösungsmittel durch Verdampfen zu entfernen.
(12) Sterilisiertes Wasser wird in das Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wird dann in den Wärmeblock bei geeigneter Temperatur (zum Beispiel erhöhter Temperatur von etwa 56°C) gestellt. Danach wird die in (3) beschriebene Vorgehensweise wiederholt.
(13) Das Röhrchen wird auf den magnetischen Ständer gestellt. Dann wird die zu sammelnde Lösung mit der Filterspitze in ein anderes Röhrchen übergeführt.
(14) Falls gewünscht kann die gesammelte Lösung bei geeigneter Temperatur (zum Beispiel etwa –70°C) gelagert werden.

Eine mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Nucleinsäure kann mit einem Verfahren der Amplifikation einer Nucleinsäure amplifiziert und mit einer nachweisbaren Probe, falls erforderlich, nachgewiesen werden.
Beispiele für das Verfahren der Amplifikation einer Nucleinsäure schließen ein Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahren und Amplifikationsverfahren auf Basis einer Nucleinsäuresequenz (NASBA) ein. Ein bevorzugtes Beispiel für das Verfahren der Amplifikation einer Nucleinsäure schließt die Schritte ein: (A) Denaturieren einer Zielnucleinsäure zum Erhalt einer einsträngigen Nucleinsäure, falls erforderlich; (B) Umsetzung der einsträngigen Nucleinsäure mit Vorwärts- und Rückwärtsstartermolekülen mit komplimentärer Nucleotidsequenz zu der der Zielnucleinsäure und vier Arten von dNTP in einem thermostabile DNA-Polymerase enthaltenden Puffer, um so die Startermoleküle an die einsträngige Nucleinsäure zu binden und eine Startermolekülausdehnung zu starten; (C) Abtrennen des ausgedehnten Produkts zum Erhalt eines einzelnen Strangs; und (D) Wiederholen der Schritte (B) und (C).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird, falls erforderlich, die Zielnucleinsäure zum Beispiel durch Hybridisierung einer markierten Probe mit dem amplifizierten Produkt des vorstehend erwähnten Amplifizierungsverfahrens nachgewiesen.
Als markierte Probe kann ein Oligonucleotid mit einer komplementären Nucleotidsequenz zu der der Zielnucleinsäure, die zum Binden eines markierten Materials oder Markierungsbinden eines Materials fähig ist, verwendet werden.
Beispiele für das Markierungsmaterial schließen Enzyme, wie alkalische Phosphatase, Peroxidase, Galactosidase, fluoreszierende Materialien und radioaktive Materialien ein. Beispiele für das markierungsbindende Material schließen Biotin und Digoxigenin ein. Das Markierungsmaterial kann an die Probe über Biotin, Digoxigenin oder Avidin gebunden werden.
Ein Verfahren zum Einmischen des Markierungsmaterials in die Probe schließt ein Verfahren zum Synthetisieren einer Probe unter Verwendung von dNTP, das zum Binden eines Markierungsmaterials oder eines markierungsbindenden Materials fähig ist, ein.
Als Verfahren zum Nachweis eine Nucleinsäure, an die eine markierte Probe gebunden ist, kann jedes bekannte Verfahren, wie Northern-Hybridisierung und Southern-Hybridisierung, verwendet werden.
Bei Nachweis der Markierung, zum Beispiel wenn alkalische Phosphatase als Markierungsmaterial verwendet wird, wird nur eine mit der markierten Probe hybridisierte Nucleinsäure luminesziert, wenn das Markierungsmaterial mit einem Chemilumineszenzsubstrat (zum Beispiel 1,2-Dioxetanverbindung (PPD)) umgesetzt wird. Die Größe und Stellung an der Elektrophorese einer Zielnucleinsäure kann durch Belichten der lumineszierenden Nucleinsäure auf einem Röntgenfilm bestimmt werden.
Ein erfindungsgemäßes Kit zum Isolieren einer Nucleinsäure umfasst einen eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Träger, der magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, die ein superparamagnetisches Metalloxid enthalten, und eine Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Der magnetische Träger und die Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure, die im Kit enthalten sind, sind wie vorstehend beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind, da die magnetischen Siliciumdioxidteilchen eine viel größere spezifische Oberfläche aufweisen als die von herkömmlichen magnetischen Teilchen, die magnetischen Siliciumdioxidteilchen fähig, eine große Menge an Nucleinsäuren nicht spezifisch zu adsorbieren. Außerdem werden, da die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ausgezeichnete Dispergierbarkeit aufweisen, sie leicht mit einer Probe gemischt, die eine Nucleinsäure und eine Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure enthält. Infolgedessen kann eine große Menge an Nucleinsäuren durch Elution gesammelt werden. Demgemäß werden unter Verwendung der magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Verfahren zum Isolieren und Nachweis einer Nucleinsäure und ein Kit zum Isolieren einer Nucleinsäure mit hoher Nucleinsäureausbeute bereitgestellt.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung durch ein veranschaulichendes Beispiel beschrieben.
Beispiele
Die in den erfindungsgemäßen Beispielen verwendeten magnetischen Siliciumdioxidteilchen werden wie folgt beschrieben: (i) der Teilchendurchmesser beträgt 1 bis 10 μm; (ii) der Gehalt an Trieisentetraoxid beträgt 30 Gew.-%; (iii) die spezifische Oberfläche beträgt 400 m²/g; (iv) das Porenvolumen beträgt 0,15 ml/g; und (v) der mittlere Porendurchmesser der Oberfläche beträgt etwa 1,20 nm. Die Teilchen werden von Suzuki Yushi Co. Ltd. hergestellt.
Der Teilchendurchmesser, die spezifische Oberfläche, das Porenvolumen und der Porendurchmesser der Oberfläche der magnetischen Siliciumdioxidteilchen werden mit einem Verfahren bestimmt, das durch JIS K1150 „Test methods for silica gels" definiert ist.
Da die magnetischen Siliciumdioxidteilchen nicht leicht in einer wässrigen Lösung dispergiert werden, ist es im Verfahren nicht bequem, wenn die Teilchen direkt in der Probenlösung dispergiert werden. Daher wurde die Dispersion, die 0,5 g der Teilchen in 1 cm³ sterilisiertem Wasser enthält, vorher hergestellt.
Beispiel 1: Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure aus einem biologischen Material
Eine gegenüber Methicillin-beständigen Staphylococcus aureus (MRSA) positive Vollblutprobe wurde als biologisches Material verwendet. Tris-HCl Puffer, der 5 mol/l Guanidinthiocyanat und Triton X-100 enthielt, wurde als Lösung zum Extrahieren einer Nucleinsäure verwendet. Tris-HCl Puffer, der Guanidinthiocyanat enthielt, wurde auch als Waschpuffer verwendet. 70 %ige Ethanollösung und Acetonlösung wurden zum Entfernen eines Salzes mit hoher Konzentration verwendet. Außerdem wurde sterilisiertes Wasser als Eluent zum Sammeln der Nucleinsäure verwendet, die an den Träger mit fester Phase (magnetisches Siliciumdioxidteilchen) gebunden ist.
Die Vorgehensweisen des Beispiels sind wie folgt.

(1) 900 μl einer Lösung zum Extrahieren einer Nucleinsäure wurden in ein 1,5 cm³-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Dann wurden 100 μl einer Vollblutprobe zugegeben und mit der Lösung gemischt.
(2) 140 μl der vorstehend erwähnten magnetische Siliciumdioxidteilchen in sterilisiertem Wasser enthaltenden Dispersion wurden in das Röhrchen gegeben.
(3) Die Probe in dem Röhrchen wurde gemischt, und man ließ sie zwei Minuten absetzen, und das gleiche Verfahren wurde vier weitere Male durchgeführt.
(4) Das vorstehend erwähnte Röhrchen wurde auf einen magnetischen Ständer gestellt, der mit der Form des Röhrchens übereinstimmt, um so die magnetischen Siliciumdioxidteilchen an der Seitenwand des Röhrchens zusammenzubringen.
(5) Die Lösung wurde durch Saugen mit einer Filterspitze abgezogen.
(6) Nach Herausnehmen des Röhrchens aus dem magnetischen Ständer wurde 1 cm³ Waschpuffer, der Guanidinthiocyanat enthielt, in das Röhrchen gegeben.
(7) Nach gründlichem Mischen des magnetischen Siliciumdioxidteilchens und des Waschpuffers wurde das Röhrchen auf den magnetischen Ständer gestellt. Dann wurde die Lösung auf vorstehend erwähnte Weise abgezogen.
(8) Der Waschvorgang wurde erneut durchgeführt.
(9) Das magnetische Siliciumdioxidteilchen wurde mit 1 cm³ 70 %iger Ethanollösung auf vorstehend erwähnte Weise gewaschen, um so die hohe Konzentration an Guanidinthiocyanat zu entfernen.
(10) Wieder wurden die magnetischen Siliciumdioxidteilchen mit 1 cm³ 70 %iger Ethanollösung und 1 cm³ Acetonlösung gewaschen.
(11) Das Röhrchen wurde in einen Wärmeblock bei etwa 56°C gegeben und zehn Minuten stehengelassen, um so im Wesentlichen das Aceton vom Röhrchen und den magnetischen Siliciumdioxidteilchen durch Verdampfen zu entfernen.
(12) 100 μl sterilisiertes Wasser wurden zum Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde dann in einen Wärmeblock bei etwa 56°C gegeben. Danach wurde die Probe in dem Röhrchen gemischt, und man ließ sie zwei Minuten absetzen, und die gleiche Vorgehensweise wurde vier weitere Male durchgeführt.
(13) Das Röhrchen wurde auf den magnetischen Ständer gestellt. Dann wurde die zu sammelnde Lösung mit der Filterspitze in ein anderes Röhrchen überführt. Das Volumen der gesammelten Lösung beträgt üblicherweise etwa 70 μl.
(14) Wenn die gesammelte Lösung gelagert wird, wurde sie bei –70°C gelagert.

Die Konzentration an Nucleinsäure in der so gesammelten Lösung wurde durch Messen der Absorption (OD, bei 260 nm) durch Absorptionsphotometrie bestimmt. Die gesammelte Menge an Nucleinsäure wurde durch Multiplizieren der Konzentration mit dem Volumen der gesammelten Lösung bestimmt.
Vergleichsbeispiel 1
Zum Vergleich wurde ein im Handel erhältliches Kit zum Extrahieren einer Nucleinsäure (Isoquick, hergestellt von Microprobe Inc.) verwendet. Die Extraktion der Nucleinsäure wurde auf folgende Weise durchgeführt. Zuerst wurde die biologische Probe von Beispiel 1 mit einem chaotropen Material umgesetzt, was zum Aufbrechen der Zellmembran und zur Hemmung der Nucleaseaktivität führte. Dann wurde die Nucleinsäure in die wässrige Phase überführt, während die restlichen Materialien in der organischen Phase belassen wurden. Schließlich wurde die Nucleinsäure mit Alkohol ausgefällt, um sie so aus der wässrigen Phase zu entfernen.
Die Konzentration und gesammelte Menge der so gesammelten Nucleinsäure wurden auf vorstehend erwähnte Weise bestimmt.
Die Ergebnisse von Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Menge der gesammelten Nucleinsäure
Wie aus Tabelle 1 zu erkennen ist, ist die Menge der in Beispiel 1 gesammelten Nucleinsäure (gemäß der vorliegenden Erfindung) höher als in Vergleichsbeispiel 1.
Beispiel 2: Test zum Bestimmen der Abtrenneffizienz unter Verwendung einer Nucleinsäureprobe mit bekannter MRSA-Konzentration
Nachdem Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) gezüchtet wurde, wurde die Konzentration (Zahl an MRSA) berechnet. Die Nucleinsäure, die aus MRSA durch das saure Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform (AGPC)-Verfahren extrahiert worden war, wurde zum Vollblut von gesunden Freiwilligen gegeben, um eine Testprobe herzustellen. Die Nucleinsäurelösung ohne Vollblut wurde als Kontrollprobe verwendet. Unter Verwendung beider Proben wurde die Abtrenneffizienz der Nucleinsäure unter Verwendung der magnetischen Siliciumdioxidteilchen von Beispiel 1 bestimmt.
Testprobe
100 μl der Nucleinsäurelösungen aus MRSA mit 10⁴ Zellen/100 μl und 10⁵ Zellen/100 μl wurden jeweils zum Vollblut von gesunden Freiwilligen gegeben, um Testproben herzustellen.
Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure
Die Nucleinsäure wurde wie in Beispiel 1 extrahiert.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure
Ein PCR-Verfahren wurde unter Verwendung zweier optimaler Startermoleküle (SEQUENZ ID Nr. 1 und 2) aus mecA Gensequenzen durchgeführt. 30 Zyklen von einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 55°C und einer Minute bei 75°C wurden durchgeführt.
Verfahren zum Nachweis der Nucleinsäure
Ein nachstehend beschriebenes Punktauftrags-Verfahren wurde als Verfahren zum Nachweis der Nucleinsäure verwendet. Eine Probe (SEQUENZ ID Nr. 3) wurde aus mecA Gensequenzen hergestellt. Die Probe wurde mit alkalischer Phosphatase markiert. Eine Sandwichhybridisierung wurde für die amplifizierte Testprobe unter Verwendung der markierten Probe durchgeführt. Nach Zugabe der 1,2-Dioxetanverbindung (PPD) als lumineszierendes Substrat wurde der Lumineszenzgrad für die Probe unter Verwendung eines Nachweismeßgeräts gemessen.
Abtrenneffizienz
Die Menge der gesammelten Nucleinsäure wurde basierend auf dem gemessenen Lumineszenzgrad mit einem allgemein bekannten Berechnungsverfahren berechnet. Die Abtrenneffizienz wurde durch Teilen der gesammelten Menge der Testprobe durch die der Kontrollprobe bestimmt.
Vergleichsbeispiel 2
Die Nucleinsäure wurde wie in Vergleichsbeispiel 1 unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits zum Extrahieren einer Nucleinsäure (Isoquick, hergestellt von Microprobe Inc.) extrahiert. Die Abtrenneffizienz wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 berechnet.
Die Ergebnisse von Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2: Abtrenneffizienz
Wie aus Tabelle 2 zu erkennen ist, ist die Abtrenneffizienz der Nucleinsäure in Beispiel 2 (gemäß der vorliegenden Erfindung) höher als die in Vergleichsbeispiel 2.
Beispiel 3: Test zum Bestimmen der Abtrenneffizienz unter Verwendung eines linearen DNA-Fragments
Eine Vollblutprobe eines gesunden Freiwilligen wurde als biologisches Material verwendet. Ein nachstehend beschriebenes lineares DNA-Fragment wurde zur Probe gegeben und davon zurückgewonnen. Die Nucleinsäure wurde aus dem biologischen Material gemäß dem Isolationsverfahren in Beispiel 1 zurückgewonnen.
Lineares DNA-Fragment
10 ng/μl pBluescriptII/ScaI-Fragment (2,96 kbp) oder 40 ng/μl γ/HindIII-Abbauprodukt wurde verwendet.
Nachweis
Die gesammelte Nucleinsäure wurde mit dem Punktauftragsverfahren in gleicher Weise wie in Beispiel 2 nachgewiesen. Die Abtrenneffizienz der Nucleinsäure wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 berechnet.
Vergleichsbeispiel 3
Zum Vergleich wurde die Nucleinsäure im folgenden Verfahren isoliert. Nachdem die Probe von Beispiel 3 mit einer festgelegten Extraktionslösung behandelt worden war, wurde die Nucleinsäure mit Siliciumdioxidharz adsorbiert. Das Siliciumdioxidharz wurde in einem Filterbecher gesammelt und gewaschen. Schließlich wurde die Nucleinsäure mit sterilisiertem Wasser oder verdünntem TE-Puffer eluiert. Die eluierte Nucleinsäure wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits zum Extrahieren einer Nucleinsäure (ClearCut Miniprep Kit, hergestellt von Stratagene Inc.) gesammelt. Die Vorgehensweise war wie folgt: (a) 100 μl der Probe, 100 μl der Lösung (3) (die im vorstehend erwähnten Kit enthalten ist) und 10 μl der Siliciumdioxiddispersion wurden in das Röhrchen des Kits gegeben; (b) nach dem Mischen wurden die Teilchen mit einer Spindelsäule abgetrennt und ein Überstand entfernt; (c) die Teilchen wurden zweimal mit 500 μl Waschpuffer gewaschen; und (d) 100 μl TE-Puffer wurden zu den gewaschenen Teilchen gegeben und der Überstand gesammelt.
Die Abtrenneffizienz wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 berechnet.
Die Ergebnisse von Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 3 sind in den nachstehenden Tabellen 3 und 4 gezeigt.
Tabelle 3: 10 ng/μl pBluescriptII/ScaI-Probe
Tabelle 4: 40 ng/μl γ/HindIII-Probe
Wie aus den Tabellen 3 und 4 zu erkennen ist, ist die Abtrenneffizienz des DNA-Fragments in Beispiel 3 (gemäß der vorliegenden Erfindung) höher als in Vergleichsbeispiel 3.
Das Verfahren zum Isolieren der Nucleinsäure unter Verwendung der erfindungsgemäßen magnetischen Siliciumdioxidteilchen ist zur nicht spezifischen Adsorption einer großen Menge an Nucleinsäuren fähig und weist daher ausgezeichnete Abtrenneffizienz auf. Außerdem ist, da das erfindungsgemäße Verfahren ausgezeichnete Handhabbarkeit aufweist, es zur Erforschung oder Vorbehandlung klinischer Proben geeignet, wobei eine große Zahl an Proben in kurzer Zeit behandelt werden muss. Da das erfindungsgemäße Verfahren auch zum effektiven Extrahieren von DNA und/oder RNA fähig ist, ist es für eine Vorbehandlung verschiedener Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure geeignet. Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren, da es das magnetische Teilchen von der Probenlösung unter Verwendung eines Magnetfelds abtrennt, leicht automatisiert werden.
Verschiedene andere Modifikationen sind für den Fachmann ohne Abweichen vom Umfang der Erfindung leicht zu erkennen und ohne weiteres zu bewerkstelligen. Demgemäß soll der Umfang der anhängenden Patentansprüche nicht auf die vorstehend angegebene Beschreibung beschränkt, sondern die Patentansprüche vielmehr breit aufgefaßt werden. Sequenzauflistung

Claims

Verfahren zum Isolieren einer Nucleinsäure, umfassend die Schritte: Mischen eines eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Trägers, bei dem es sich um magnetische Siliciumdioxidteilchen handelt, die ein superparamagnetisches Metalloxid umfassen; eines eine Nucleinsäure enthaltenden Materials und einer Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure, um so eine Probenlösung zu bilden; Abtrennen des magnetischen Trägers, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, aus der Probenlösung unter Verwendung eines magnetischen Felds; und Eluieren der Nucleinsäure vom magnetischen Träger, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen kugelförmig sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das superparamagnetische Metalloxid Eisenoxid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das superparamagnetische Metalloxid in einer Menge von 10 bis 60 Gew.-% enthalten ist.
Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure, umfassend die Schritte: Mischen eines eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Trägers, bei dem es sich um magnetische Siliciumdioxidteilchen handelt, die ein superparamagnetisches Metalloxid umfassen; eines eine Nucleinsäure enthaltenden Materials und einer Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure, um so eine Probenlösung zu bilden; Abtrennen des magnetischen Trägers, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, aus der Probenlösung unter Verwendung eines magnetischen Felds; und Eluieren der Nucleinsäure vom magnetischen Träger, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, und Amplifikation der eluierten Nucleinsäure; wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure, umfassend die Schritte: Mischen eines eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Trägers, welcher magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, die einen superparamagnetischen Metalloxidkristall enthalten; eines eine Nucleinsäure umfassenden Materials und einer Lösung zum Extrahieren der Nucleinsäure, um so eine Probenlösung zu bilden; Abtrennen des magnetischen Trägers, an den die Nucleinsäure gebunden wurde, aus der Probenlösung unter Verwendung eines magnetischen Felds; Eluieren der Nucleinsäure vom magnetischen Träger, und Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure nach Anspruch 6, das weiter den Schritt der Amplifikation der eluierten Nucleinsäure umfasst.
Verwendung eines magnetischen Trägers, der magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, welche ein superparamagnetisches Metalloxid umfassen, zum Isolieren einer Nucleinsäure, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Verwendung eines magnetischen Trägers, der magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, welche ein superparamagnetisches Metalloxid umfassen, zur Amplifikation einer Nucleinsäure, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Verwendung eines magnetischen Trägers, der magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, welche ein superparamagnetisches Metalloxid umfassen, zum Nachweis einer Nucleinsäure, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Kit zum Isolieren einer Nucleinsäure, umfassend einen eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Träger, der magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, welche ein superparamagnetisches Metalloxid umfassen, und eine Lösung zur Extraktion der Nucleinsäure, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Kit zum Nachweis einer Nucleinsäure, umfassend einen eine Nucleinsäure bindenden magnetischen Träger, der magnetische Siliciumdioxidteilchen umfasst, welche ein superparamagnetisches Metalloxid umfassen, und eine Lösung zur Extraktion der Nucleinsäure, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von weniger als 0,5 ml/g, einen mittleren Porendurchmesser der Oberfläche von 0,1 bis 60 nm und einen Teilchendurchmesser von 0,5 bis 15 μm aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5 und 6, Verwendung nach einem der Ansprüche 8, 9 und 10 und/oder Kit nach einem der Ansprüche 11 und 12, wobei die magnetischen Siliciumdioxidteilchen ein Porenvolumen von 0,1 bis weniger als 0,5 ml/g aufweisen.