HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung von
Materialien für die Festphasenextraktion, um Nucleinsäure-
Proben zu reinigen, die mit proteinhaltigem Material
verunreinigt sind.
Hintergrund
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T. Maniatis et al., [Molecular Cloning - A Laboratory Manual
(New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), S. 458-460]
beschreiben eine Methode zur Reinigung von Nucleinsäuren,
die auf den von K.S. Kirby [Biochim.J., Vol. 66, 494-504
(1957)] und J. Marmur [J.Mol.Biol., Vol. 3, 208-218 (1961)]
beschriebenen Arbeitsweisen beruht. Bei dieser Methode wird
Phenol in einem Flüssig/Flüssig-Extraktionsverfahren
verwendet, wodurch das Protein, das eine wäßrige Nucleinsäure-
Probe verunreinigt, in die Phenol-Phase extrahiert wird und
die Nucleinsäure in der wäßrigen Phase zurückbleibt. Dieses
Nucleinsäure-Reinigungsverfahren kann in Wirklichkeit eine
Reihe von Flüssig/Flüssig-Extraktionen beinhalten, bei denen
ein wäßriges Volumen einer Nucleinsäure-Probe nacheinander
mit gleichen Volumina verflüssigtem Phenol,
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50:48:2) und Chloroform/Isoamylalkohol
(96:4) extrahiert wird. Nach jeder Extraktion wird die das
Protein (und etwas Nucleinsäure) enthaltende organische
Phase mit wäßrigem Puffer rückextrahiert, um jegliche in die
organische Phase extrahierte Nucleinsäure wiederzugewinnen.
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Die wäßrige Nucleinsäure-Probe muß dann erschöpfend mit
Diethylether extrahiert werden, um alles an verbliebenem
Phenol, Chloroform oder Isoamylalkohol abzutrennen.
Schließlich wird der restliche Diethylether entweder unter
vermindertem Druck oder durch 10minütiges Überblasen der Probe mit
Stickstoff abgezogen. Die Abtrennung der restlichen
organischen Lösungsmittel ist von überragender Bedeutung, da sie
ansonsten bei nachfolgenden Klonierungs- oder
Hybridisierungsverfahren stören würden, bei denen die Nucleinsäure
möglicherweise verwendet wird.
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Die Phenol-Extraktion ist zwar eine sehr wirksame Methode
zur Reinigung von Nucleinsäure-Proben und wird sehr
weitläufig angewandt, doch ist das Verfahren auch sehr
arbeitsintesiv und zeitraubend. Zu den weiteren Nachteilen dieser
Technik gehören die mit der Verwendung organischer
Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol und Diethylether)
verbundenen Gefahren (chemischer Reizstoff, Carcinogen,
Gestank und Brennbarkeit).
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Ein zweites Verfahren zur Reinigung von Nucleinsäuren beruht
auf der bevorzugten Adsorption von Nucleinsäuren mit
NENSORB 20 Nucleinsäure-Reinigungspatronen (DuPont). Eine
proteinhaltige DNA-Probe wird durch eine Säule mit NENSORB -
Teilchen geschickt, wobei die DNA an die Teilchen bindet und
das Meiste des proteinhaltigen Materials mit einem wäßrigen
Puffer von der Säule waschengelassen wird. Die gebundene
Nucleinsäure wird dann von den Teilchen desorbiert, indem
man 20% wäßrigen Ethylalkohol (oder 50% wäßrigen
Methylalkohol) durch die Säule laufen läßt und die DNA im Säulenablauf
aufgefangen wird. Vor Verwendung der DNA zum Klonen oder
Hybridisieren muß der Alkohol durch mehrstündiges Anlegen
eines Vakuums an die Probe aus der DNA-Lösung abgezogen
werden.
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Die Verwendung von NENSORB unterliegt anderen
Beschränkungen. Das NENSORB -Material bindet neben Nucleinsäuren auch
Protein in unterschiedlichem Ausmaß. Dies begrenzt nicht nur
die Kapazität für die quantitative Nucleinsäure-Bindung aus
einer Probe, die stark mit proteinhaltigem Material
verunreinigt ist (z.B. Blutserum, Gewebehomogenisat), sondern
läßt auch die Möglichkeit offen, daß etwas an lose
gebundenem Protein mit der Nucleinsäure eluieren kann, wenn die
letztere durch Verwendung von wäßrigem Alkohol vom NENSORB
desorbiert wird. Es werden drei verschiedene Lösungsmittel
benötigt, um die NENSORB -Säule zu aktivieren, das
nichtgebundene Protein von der Säule zu waschen, und dann die
Nucleinsäure von der Säule zu eluieren. Die Nucleinsäure
wird in einem Lösungsmittel (20% Ethylalkohol oder 50%
Methylalkohol) von der Säule eluiert, das unvereinbar ist
mit Vorschriften für nachfolgende Verwendungen der
Nucleinsäure (z.B. Klonierung, Hybridisierung, Assays etc.). Das
Reinigungsverfahren unter Verwendung von NENSORB kann
zeitraubend sein; es kann eine Stunde oder länger in
Anspruch nehmen, eine einzige Nucleinsäure-Probe zu reinigen.
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C.A. Thomas et al., Analytical Biochemistry, Vol. 93,
158-166 (1979), offenbaren die Verwendung von
Glasfaserfiltern, um Protein und Protein/DNA-Komplexe aus wäßrigen
DNA-Proben zu adsorbieren. Dieses Verfahren weist folgende
Nachteile auf: 1) Die wäßrige DNA-Probe muß wenigstens
300 mM NaCl enthalten, damit das Protein wirksam an den
Glasfaserfilter bindet. Diese relativ hohe Salzkonzentration
müßte vor der weiteren Verwendung der DNA in biologischen
Reaktionen wie etwa Spaltung der DNA mit einem
Restriktionsenzym durch Abtrennen des Salzes aus der DNA-Probe oder
Verdünnen der Lösung verringert werden. 2) Die Ausbeute an
DNA aus dem Filter ist nur dann hoch, wenn das Filter
ausgiebig mit wäßrigem Puffer gewaschen wird. 3) Aus der
geringen spezifischen Oberfläche (ungefähr 2 m²/g) der Glasfasern
ergibt sich eine geringe Proteinbindungskapazität des
Glasfaserfilters. Die maximale Proteinbindungskapazität
errechnet sich zu 8,5 mg Rinderserumalbumin (BSA) pro Gramm
Glasfaserfilter.
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B. Vogelstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, Vol. 26,
Nr. 2, 615-619 (1979), offenbaren eine Methode zur
Abtrennung von DNA aus Agarose durch Binden der DNA an Glas,
vorzugsweise Glaspulver in Gegenwart von NaI. Die DNA wird
durch Elution mit Tris HCl, pH 7,2/0,2 M NaCl/2 mM EDTA vom
Glas entfernt. Offenbart wird auch, daß Kieselgel und poröse
Glasperlen für die DNA-Reinigung ungeeignet sind.
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J. Kirkland, J.Chromatographic Sci., Vol. 9, 206-214 (1971),
offenbart die Herstellung oberflächenmodifizierter
Kieselgele durch Umsetzung von Silan-Reagenzien mit der porösen
Hülle von Zipax -Chromatographieträger mit regulierter
Oberfläche.
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J. Kohler et al., J.Chromatography, Vol. 385, 125-150
(1987), offenbaren die Herstellung eines voll hydroxylierten
gebrannten Siliciumdioxids durch Auflösen und
Wiederabscheiden von Kieslsäure.
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T. Watanabe et al., J.Solid-Phase Biochem., Vol. 3, 161-173
(1978), offenbart die Herstellung immobilisierter Tannine
für die Proteinadsorption.
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Ziel dieser Erfindung ist, ein verbessertes
Festphasenextraktionsverfahren zur Abtrennung proteinhaltiger
Verunreinigungen aus Nucleinsäure-Proben bereitzustellen. Mit dem
Verfahren sollten sich hohe Anteile Protein aus winzigen
Mengen Nucleinsäure abtrennen und letztere in biologisch
aktivem Zustand gewinnen lassen. Auch sollte das Verfahren
schnell und bequem sein, es sollte quantitative Gewinnung
der Nucleinsäure ermöglichen und die Verwendung gefährlicher
Stoffe minimieren. Auch sollten damit keine kontaminierenden
Substanzen oder Verunreinigungen in die Nucleinsäure-Probe
eingebracht werden, die die weitere Verwendung der
Nucleinsäure beeinträchtigen können.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Bei dem Verfahren zur Abtrennung proteinhaltiger Materialien
von Nucleinsäuren wird eine Lösung, die die proteinhaltigen
Materialien und Nucleinsäuren enthält, mit einem
Festphasenextraktionsmaterial zusammengebracht, das Proteine zu binden
imstande ist, um gebundene und nichtgebundene Fraktionen zu
bilden, und dann wird die nichtgebundene Fraktion isoliert,
die die Nucleinsäuren enthält.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die für das beanspruchte Verfahren zur Trennung von
Proteinen und Nucleinsäuren vorteilhaften
Festphasenextraktionsmaterialien sind teilchenförmige feste Materialien mit sehr
hohen Affinitäten für proteinhaltige Materialien und sehr
geringen Affinitäten für Nucleinsäuren. Die Materialien zur
Festphasenextraktion sind dadurch gekennzeichnet, daß sie
hohe spezifische Oberflächen aufweisen mit hohen
Konzentrationen an leicht sauren Hydroxyl-Gruppen an der Oberfläche
sowie geringen Oberflächenkonzentrationen an polyvalenten
kationischen Spezies.
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Festphasenextraktionsmaterialien mit hoher spezifischer
Oberfläche sind bevorzugt aufgrund ihrer Fähigkeit, große
Proteinmengen abzutrennen. Vorzugsweise beläuft sich die
spezifische Oberfläche des Extraktionsmaterials auf
wenigstens 50 m²/g; stärker bevorzugt ist, wenn sie wenigstens
100 m²/g beträgt. Diese hohen Oberflächen ergeben sich
aufgrund des Vorhandenseins von Poren im gesamten
teilchenförmigen Material. Die Poren sollten einen effektiven
Durchmesser von > 60 Å aufweisen, und es gibt zwar keine
Obergrenze für den Porendurchmesser, doch wird eine vernünftige
Grenze von 500 Å bevorzugt, um hohe spezifische Oberfläche
zu bewahren. Der bevorzugte Bereich ist 60 Å bis 150 Å.
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Hohe Konzentrationen an leicht sauren Hydroxyl-Gruppen am
Extraktionsmaterial dienen dazu, sowohl die Affinität des
Extraktionsmaterials für proteinartige Verbindungen zu
steigern als auch dessen Affinität für Polyanionen wie etwa
Nucleinsäuren herabzusetzen. Die minimale wirksame
Konzentration an leicht sauren Hydroxyl-Gruppen ist 0,1 umol/m².
Vorzugsweise beläuft sich die Konzentration an leicht sauren
Hydroxyl-Gruppen auf 1-8 umol/m² und stärker bevorzugt auf
8 umol/m².
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Vorzugsweise ist der pKa der Hydroxyl-Gruppen an der
Oberfläche zwischen 6 und 10.
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Die Konzentration an polyvalenten kationischen Spezies an
der Oberfläche des Festphasenextraktionsmaterials sollte
minimiert werden, um Komplexierung anionischer Nucleinsäuren
durch kationische Spezies an der Oberfläche zu verhindern.
Dreiwertige Metall-Ionen wie etwa Eisen und Aluminium wirken
sich besonders schädlich auf die Leistungsfähigkeit des
Extraktionsmaterials aus.
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Die vorstehend erörterten Festphasenextraktionsmaterialien
mit den wünschenswerten Eigenschaften lassen sich auf einer
Reihe von Wegen herstellen, entweder unter Verwendung eines
homogenen teilchenförmigen Materials oder eines im Kern
teilchenförmigen Materials, auf dessen Oberfläche die
gewünschten funktionellen Einheiten mittels chemischer
Reaktionen eingeführt werden. Für ersteren Fall hat sich
gezeigt, daß rehydratisiertes Kieselgel die gewünschten
Eigenschaften besitzt. Kieselgel besitzt von vornherein eine hohe
Bedeckung der Oberfläche (8 umol/m²) mit leicht sauren
(6 < pKa < 10) Hydroxyl-Gruppen und erfüllt somit obige
Primäranforderungen. Zudem ist es sehr wirkungsvoll bei der
Adsorption von proteinhaltigem Material. Allerdings muß die
Oberfläche des Kieselgels von polyvalenten kationischen
Spezies befreit werden, wenn verhindert werden soll, daß
Nucleinsäuren an der Oberfläche der Siliciumdioxid-Teilchen
adsorbiert werden. Dies kann auf mehreren Wegen erreicht
werden.
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Bei der bevorzugten Methode wird die Oberflächenschicht des
Siliciumdioxid-Teilchens rehydroxyliert und gereinigt durch
Lösen und Wiederabscheiden der Oberflächenschicht des
Teilchens nach Kohler et al., J.Chromatography, Vol. 385,
125-150 (1987). Bei diesem Verfahren wird die äußere
Oberfläche der Siliciumdioxid-Teilchen in einer verdünnten
Flußsäure-Lösung bei erhöhter Temperatur gelöst. Das gelöste
Siliciumdioxid wird dann dadurch wieder auf die Oberfläche
eines jeden Teilchens abgeschieden, daß die das gelöste
Siliciumdioxid enthaltende Lösung auf Raumtemperatur
abkühlen gelassen wird, wo es in wäßrigen Medien geringere
Löslichkeit aufweist. Bei Wiederabscheidung der Schicht
verbleiben Verunreinigungen, die in der äußeren Siliciumdioxid-
Schicht, die dann gelöst wurde, vorhanden waren, in der
Lösung zurück, und es bildet sich eine im wesentlichen reine
Schicht aus Siliciumdioxid um das Kernteilchen.
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Alternativ können polyvalente metallische Verunreinigungen
durch aufeinanderfolgendes Behandeln mit mäßig
konzentrierter Salzsäure und Salpetersäure bei erhöhter Temperatur aus
dem Siliciumdioxid herausgelöst werden. Dieses Verfahren
extrahiert und bringt metallische Verunreinigungen auf der
Oberfläche der Kieselgel-Teilchen in Lösung, so daß eine
Oberfläche zurückbleibt, bei der es sich im wesentlichen um
reines Siliciumdioxid handelt.
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Eine dritte Methode zur Herstellung des
Festphasenextraktionsmaterials ist die Polymerisation einer dicken Schicht
eines organischen Materials, das eine hohe Bedeckung mit
leicht sauren Hydroxyl-Gruppen enthält, um die Oberfläche
eines porösen Trägermaterials herum. Dies läßt sich
bewerkstelligen durch Reagierenlassen eines organischen Silans,
das die gewünschte chemische Funktionalität aufweist, mit
Siliciumdioxid, wobei das Silan mit sich selbst und den
Siliciumdioxid-Teilchen vernetzt unter Bildung einer dicken
immobilisierten Schicht eines organischen Polymers
[J. Kirkland et al., J.Chromatographic Sci., Vol. 9, 206-214
(1971)], das die gewünschte Bedeckung mit leicht sauren
Hydroxyl-Gruppen aufweist. Die Hydroxyl-Gruppen verleihen
der Oberfläche die Fähigkeit, große Mengen an
proteinhaltigem Material zu adsorbieren, auch schirmen sie die
Nucleinsäuren vor jeglichen polyvalenten kationischen Spezies in
den Kernteilchen unter der Schicht aus organischem Polymer
ab und verhindern so, daß Nucleinsäuren an das
Festphasenextraktionsmaterial binden. Für diese Reaktion könnten
zahlreiche organische Silane verwendet werden. Zum Beispiel
würde die Verwendung von Silanen zur Immobilisierung von
Phenol (PKa = 9,9), β-Naphthol (pKa = 9,6) oder Tannin
(Polyhydroxycarbonsäuren) auf die Oberfläche von
Trägerteilchen brauchbare Festphasenextraktionsmaterialien ergeben. Zu
den brauchbaren Trägermaterialien können Siliciumdioxid,
Cellulose, Agarose und andere Materialien zählen, die über
eine hohe Bedeckung mit aktiven Oberflächengruppen verfügen.
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Welche Herstellungsmethode für das
Festphasenextraktionsmaterial auch immer angewandt wird, es können wenigstens
zwei Vorschriften für seine Verwendung zur Abtrennung von
proteinhaltigen Verunreinigungen aus Nucleinsäure-Proben
ausgeführt werden. Gemäß der ersten Vorschrift wird eine
Menge des teilchenförmigen Festphasenextraktionsmaterials
einem Volumen der zu deproteinierenden Probe zugesetzt. Die
Mischung wird in leichter Bewegung gehalten, damit das
teilchenförmige Material in Suspension bleibt. Wegen der
geringen Größe und der großen Oberfläche des
Festphasenextraktionsmaterials sind Diffusion und Adsorption des
proteinhaltigen Materials zum bzw. am
Festphasenextraktionsmaterial schnell (in der Größenordnung von Minuten). Das das
adsorbierte Protein enthaltende teilchenförmige Material
wird dann von der wäßrigen Nucleinsäure-Probe auf irgendeine
herkömmliche Art und Weise, z.B. Zentrifugation oder
Filtration, abgetrennt. Diese Vorschrift ist am wirkungsvollsten,
wenn ein großes Volumen (> 1 ml) Probe kleine Mengen Protein
enthält, und daher nur eine geringe Menge Teilchen (z.B.
< 10 mg) für die quantitative Abtrennung des Proteins
erforderlich ist.
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Bei einer zweiten Vorschrift wird das
Festphasenextraktionsmaterial in eine Säule gepackt, und die wäßrige Probe wird
über die Säule gegeben. Um dies zu bewerkstelligen, wird
eine Menge Teilchen in eine Drehsäule eingewogen und dadurch
gepackt, daß das verschlossene Ende der Säule auf dem
Labortisch aufgestoßen wird. Die Säule kann auch mit hoher
Geschwindigkeit in einer Zentrifuge geschleudert werden; durch
die Zentrifugalkraft werden die Teilchen im unteren Teil der
Säule fest gepackt. Dann wird die Säule angefeuchtet durch
Pipettieren eines Volumens des geeigneten Puffers (ein
Volumen, das wenigstens gleich ist dem Teilchenvolumen in
der Säule) auf die Säule, und dann läßt man den Puffer in
das Säulenbett einsickern. Überschüssiger Puffer wird dann
durch etwa 30 s langes Schleudern der Säule mit hoher
Geschwindigkeit in einer Zentrifuge entfernt. Jeglicher aus
dem Säulenbett eluierter Puffer wird verworfen. Nun ist die
Säule bereit, die zu deproteinierende Nucleinsäure-Probe
aufzunehmen; die Probe wird auf den Säulenkopf aufpipettiert
und in das Säulenbett einsickeren gelassen, wo das
proteinhaltige Material an die Teilchen bindet und die
Nucleinsäuren in Lösung bleiben. Als nächstes wird die Säule mit
hoher Geschwindigkeit in einer Zentrifuge geschleudert, um
die die Nucleinsäuren enthaltende wäßrige Phase in ein
Auffangröhrchen zu eulieren. Die Ausbeute an Nucleinsäure
von der Säule beträgt typischerweise > 80% der auf die Säule
aufgegebenen Menge. Die Ausbeute läßt sich auf etwa 95%
erhöhen, wenn ein kleines Volumen (typischerweise 1/3 bis
1/2 des ursprünglich auf die Säule aufgetragenen
Probenvolumens) auf den Säulenkopf aufpipettiert und in der
Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit durchgeschleudert wird.
Dadurch wird jegliche festgehaltene Nucleinsäure durch das
Säulenbett gewaschen, und diese Waschung sollte dem
Säulenablauf
zugesetzt werden, der den Großteil der Nucleinsäure
enthält. Diese Vorschrift funktioniert am besten bei Proben,
die stark mit proteinhaltigem Material verunreinigt sind, wo
es erforderlich ist, eine große Teilchenmenge (relativ zum
Volumen der Probe) einzusetzen. Diese Vorschrift ist auch
brauchbar, wenn ein sehr kleines Probenvolumen (z.B. 50 ul)
zu deproteinieren ist und die vorhergehende Methode mühselig
wäre.
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Bei der Beschaffenheit des Puffers, der beim
Säulenbefeuchtungsschritt und beim Säulenwaschschritt, wie vorher
beschrieben, verwendet wurde, können einige Beschränkungen
auferlegt werden. Die chemische Beschaffenheit des Puffers
scheint nicht von Bedeutung zu sein, wenn auch die
Verwendung von Salzen polyvalenter Metallkationen (z.B. Al, Fe, Ti
etc.) vermieden werden sollte. Standardmäßige biochemische
Puffer wie etwa TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 6,75), STE
(10 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,0) oder PBS
(120 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Phosphat, pH 7,4) arbeiten
sehr gut. Im allgemeinen sollte der pH-Wert des Puffers im
Bereich von 6 bis 7,5 liegen; bei niedrigeren pH-Werten kann
Nucleinsäure an das Festphasenextraktionsmaterial binden,
was zu geringeren Ausbeuten führt, wogegen bei höheren
pH-Werten der Träger in Lösung gehen kann, da Kieselgel in
alkalischen Lösungen merklich löslich ist. Ferner muß, wenn
die Nucleinsäure-Probe einen pH außerhalb des obigen
Bereichs aufweist, diese auf einen pH von 6 bis 7,5
neutralisiert werden, ehe sie zur Entfernung der Proteine auf die
Säule aufgebracht wird. Der bevorzugte pH-Bereich für alle
Puffer und Proben liegt im Bereich von 6,5 bis 7,0.
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Der Porendurchmesser des Festphasenextraktionsmaterials
sollte groß genug sein, um Proteine eindringen zu lassen, so
daß sie auf der Oberfläche der inneren Poren adsorbiert
werden können. Dadurch wird die Kapazität des Trägers für
die Proteinabtrennung aus Proben maximiert. Die Poren müssen
auch groß genug sein, damit die Nucleinsäure im Porenvolumen
nicht festgehalten wird. Es wurde gefunden, daß
Minimumporendurchmesser irgendwo zwischen 60 und 150 Å die
erforderlichen Merkmale erbringen. Für den Porendurchmesser gibt
es keine kritische Obergrenze, wenn auch mit zunehmendem
Porendurchmesser der Teilchen die spezifische Oberfläche
abnimmt. Somit läßt sich eine vernünftige Obergrenze von 300
bis 500 Å definieren. Teilchen, deren Porendurchmesser über
dieser Grenze liegt, haben eine geringer Oberfläche und
demzufolge geringere Proteinbindungskapazität.
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Das Festphasenextraktionsmaterial ist brauchbar für die
Abtrennung von proteinhaltigen Verunreinigungen aus einem
weiten Bereich von Nucleinsäure-Proben. Zu den bereits
gezeigten Verwendungen gehört die Abtrennung von Enzymen aus
Restriktionsbruchstücken, die Abtrennung alkalischer
Phosphatasen aus Reaktionsgemischen der Dephosphorylierung und
die Abtrennung von Kinase-Enzymen aus
Markierungsreaktionsgemischen. Es steht zu erwarten, daß sich auch andere
gängige Enzyme wie etwa reverse Transcriptase, DNA-Polymerase,
DNA-Ligase und terminale Transferase, die üblicherweise in
der Molekularbiologie verwendet werden, unter geeigneten
experimentellen Bedingungen aus Nucleinsäure-Proben
abtrennen lassen.
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Daneben ist das Festphasenextraktionsmaterial für die
Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren aus zahlreichen
biologischen Proben nutzbar. Wie schon gezeigt, wurde das
Material zur Reinigung von DNA aus Organismen in
Vollblutproben verwendet; es steht zu erwarten, daß - sobald die
passenden Reinigungsvorschriften entwickelt sind - ähnliche
Isolierungen aus anderen Proben von klinischem Interesse wie
etwa Sputum, Urin, Fäces und Gewebe möglich sind. Derartige
gereinigte Nucleinsäure-Proben sollten sich direkt für
klinische Hybridisierungsassays verwenden lassen. Des
weiteren sollte das Festphasenextraktionsmaterial nutzbar sein
zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren aus
Organismen, die in Kulturmedien gezogen wurden, vor allem zum Zweck
der Herstellung von DNA für Klonierungszwecke oder andere
gentechnische Verwendungen.
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Das Festphasenextraktionsmaterial ist brauchbar für die
Abtrennung von proteinhaltigen Verunreinigungen aus einem
weiten Bereich von Nucleinsäuren. Zum Beispiel kann das
Material verwendet werden, um Kinase-Enzyme abzutrennen, die
bei der radioaktiven Markierung von Mononucleotiden wie etwa
dATP, dCTP etc. verwendet werden. Auch wurde das Material
verwendet, um alkalische Phosphatase aus einer Mischung von
DNA abzutrennen, die von 125 Basenpaaren (bp) bis 21 226 bp
reichte. Ausgiebig wurde das Material verwendet bei pBR322-
DNA (4362 bp). Zudem wurde das Material bei intakter λ-DNA
(49 000 bp) verwendet, und es wurde kein Abbau dieser DNA
durch mechanische Scherung beobachtet. Größere DNA-Stränge
können beim Durchgang durch die Säule mit
Festphasenextraktionsmaterial anfällig gegenüber dem Abbau durch Scherkräfte
sein, obgleich dies nicht mit Sicherheit bekannt ist. Dieses
Problem ließe sich minimeren durch Verwendung größerer
Teilchengrößen bei der Herstellung des
Festphasenextraktionsmaterials, womit Scherkräfte in Säulen verringert
werden, die mit solchen Teilchen gepackt sind.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Deproteinierung von
Nucleinsäure-haltigen Proben weist gegenüber gegenwärtig
angewandten Methoden folgende Vorteile auf:
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1. Da das Festphasenextraktionsmaterial in geeigneten
Puffern im wesentlichen unlöslich ist, löst es sich
nicht in der Nucleinsäure-Probe, womit nachfolgende
Arbeitsgänge (z.B. Extraktionen) zu seiner Abtrennung
- wie bei den Phenol/Chloroform-Extraktionen - nicht
erforderlich sind.
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2. Die Nucleinsäure wird mit einem wäßrigen Medium
eluiert, das im wesentlichen identisch ist (außer zur
Abtrennung von Proteinen) mit dem Medium, in dem sie
auf die Säule aufgegeben wurde. Somit befindet sich die
Nucleinsäure in einem Lösungsmittel, das mit
anschliessenden biologischen Arbeitsgängen, bei denen sie
verwendet wird, verträglich ist. Es sind keine
Verunreinigungen zugegen (z.B. Phenol, Chloroform, Ethanol etc.),
um die für anschließende biologische Verfahren
verwendeten Enzyme zu hemmen oder zu deaktivieren.
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3. Die Reinigungsvorschrift unter Verwendung dieses
Materials erfordert zur Ausführung 5 bis 10 min für eine
Probe, während die auf Phenol/Chloroform-Extraktionen
oder NENSORB beruhenden Verfahren eine Stunde oder
länger in Anspruch nehmen können. Zudem erfordert die
Verarbeitung zusätzlicher Proben zwei Minuten je Probe.
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4. Zur Durchführung dieses Verfahrens sind keine
speziellen Reagenzien erforderlich. TE (pH 6,5) ist ein
annehmbarer Puffer zum Befeuchten und Auswaschen der
Säule, und dieser Puffer ist in allen Labors verfügbar,
die mit Nucleinsäuren arbeiten. Zudem besteht kein
Bedarf mehr an toxischen oder gefährlichen Reagenzien.
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5. Die Ausbeute an Nucleinsäuren ist hoch, typischerweise
80-95%.
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6. Im Gegensatz zu anderen Reinigungsmethoden, die auf der
Adsorption von DNA an einem Träger beruhen, werden bei
dieser Methode keine großen DNA-Fragmente
abgeschnitten. Somit wird die Unversehrtheit der Probe bewahrt.
Eine DNA-Scherung ist möglich bei Methoden, die auf der
Adsorption der Nucleinsäure an einem Festphasenmaterial
beruhen, da bei langen DNA-Fragmenten (z.B. 10
Kilobasenpaare oder mehr) die beiden Enden des DNA-Strangs
an zwei verschiedenen Teilchen gleichzeitig adsorbiert
werden können, und beim Rühren bewegen sich diese
beiden Teilchen in verschiedene Richtungen und ziehen
den DNA-Strang in zwei kleinere Fragmente auseinander.
Da die DNA beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht an
der festen Phase adsorbiert wird (stattdessen das
Protein), ist ein solcher DNA-Abbau nicht möglich.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.
BEISPIELE
Allgemeine Methoden und Reagenzien
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pBR322-DNA und PST-Restriktionsenzym wurden bezogen von
Pharmacia Inc., Piscataway, N.J.. 10x
PST-Restriktionsspaltungspuffer enthält 500 mM NaCl, 100 mM Tris HCl pH 7,5,
100 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreitol. Alkalische
Kälberdarm-Phosphatase wurde bezogen von Boehringer Mannheim
Biochemical, Indianapolis, IN. BCIP
(5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) wurde bezogen von Bethesda Research Labs,
Gaithersburg, MD.
Beispiel 1
Herstellung und Verwendung von Silan-behandeltem Kieselgel
A. Herstellung des Siliciumdioxid-Trägers
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Fractosil 500 (20,5 g; E. Merck, Darmstadt, Deutschland)
wurde mit drei 100 ml-Aliquotteilen 25%iger (Vol./Vol.)
Salpetersäure bei Raumtemperatur gewaschen durch 10minütiges
Suspendieren der Siliciumdioxid-Teilchen in der wäßrigen
Säure und anschließendes Dekantieren der überschüssigen
Säure, sobald sich die Teilchen am Boden des Becherglases
abgesetzt hatten. Die säurebehandelen Teilchen wurden
erschöpfend mit destilliertem, deionisiertem Wasser gewaschen,
bis der Überstand einen pH von 5,5 erreicht hatte. Die
Teilchen wurden dann in einen mit Filterpapier mittlerer
Porosität versehenen Büchner-Trichter überführt, mit
hochreinem Methanol (3 x 100 ml) gewaschen und 1 h bei 80ºC
(630 mmHg) getrocknet.
B. Aufpolymerisieren von Aminophenyltrimethoxysilan auf
den Siliciumdioxid-Träger
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Aminophenyltrimethoxysilan (4,0 ml; Petrarch Systems Inc.,
Bristol, PA) wurde zu destilliertem, deionisiertem Wasser
(24 ml) und Isopropylalkohol (12 ml) in einem Rundkolben
gegeben, der mit einem Rückflußkühler und einem
Magnetrührstäbchen ausgestattet war. Die resultierende Mischung wurde
gerührt, bis das Silan vollständig gelöst war. Die mit Säure
gewaschenen Siliciumdioxid-Teilchen (6,1 g) wurden der
Silan-Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde 2 h lang bei
81ºC am Rückfluß gehalten. Eisessig (3,5 ml) wurde dem
Kolben zugesetzt, und die Mischung wurde eine weitere Stunde
am Rückfluß gehalten. Die Suspension wurde auf
Raumtemperatur abkühlen gelassen, wonach die Siliciumdioxid-Teilchen
sich am Boden des Kolbens abgesetzt hatten. Der schwarze
Überstand wurde dekantiert, und die Teilchen wurden
erschöpfend mit qualitativ hochwertigem Methanol gewaschen,
bis die Waschflüssigkeit farblos war. Die
Aminophenyl-derivatisierten Siliciumdioxid-Teilchen wurden dann auf einem
Büchner-Trichter gesammelt, und es wurde Luft durch das
Teilchenbett gesaugt, um restlichen Alkohol zu entfernen.
Die Teilchen wurden unter einer Lampe mittlerer Stärke
weiter getrocknet. Eine Kohlenstoff- und Stickstoff-Analyse
der Teilchen zeigte, daß eine dicke Schicht aus Kohlenstoff-
haltigem Material auf die Oberfläche der Siliciumdioxid-
Teilchen aufpolymerisiert worden war (6,27% C; 1,13% N).
C. Diazotierung des Silan-behandelten Trägers
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Das Aminophenyl-derivatisierte Kieselgel (6,90 g) wurde
einer eiskalten Lösung von Wasser (10,0 ml) und
konzentrierter Schwefelsäure (7,0 g) zugegeben, und die Teilchen wurden
durch Magnetrühren in dieser Lösung suspendiert. Der obigen
Mischung wurde feinzerstoßenes Eis (ungefähr 17 g)
zugesetzt, und dann wurde eine Lösung von Natriumnitrit (2,24 g)
in Wasser (5,33 g) über einen Zeitraum von 8-10 min
tropfenweise
zugegeben. Während dieser Zeit wurde die Temperatur
der Mischung zwischen 0 und 5ºC gehalten. Die Teilchen
wurden absetzen gelassen, und der Überstand wurde von der
Mischung dekantiert. Dann wurden die Teilchen dreimal
gewaschen, indem sie in 100 ml kaltem Wasser suspendiert
wurden, die Teilchen absetzen gelassen wurden, und der
Überstand dekantiert wurde. Die gebildeten Teilchen, bei
denen die Oberflächen-Amine in die entsprechenden Diazonium-
Salze überführt worden waren, wurden für die nachstehend
beschriebene Hydrolysereaktion verwendet.
D. Hydrolyse des Diazonium-Salzes
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Wasser (24 ml) wurde mit konzentrierter Schwefelsäure
(32 ml) versetzt, und diese Mischung wurde zum Sieden
erhitzt (ungefähr 160ºC). Die Diazonium-Salz-haltigen Teilchen
wurden unter Beibehalten des Siedens langsam der heißen
Säure zugegeben, mit unterdrücktem Aufschäumen wegen des aus
der Zersetzung des Diazonium-Salzes gebildeten Stickstoff-
Gases. Die Mischung wurde ungefähr 5 min lang gekocht und
dann in ein Eisbad gestellt, um die Abkühlung zu
beschleunigen. Der saure Überstand wurde von den Teilchen dekantiert,
die dann mit destilliertem, deionisiertem Wasser (5mal
200 ml) gewaschen wurden. Die Teilchen wurden dann auf einem
mit Filterpapier mittlerer Porosität versehenen Büchner-
Trichter gesammelt und mit Methanol (200 ml) gewaschen. Es
wurde Luft durch das Teilchenbett gesaugt, um restliches
Methanol zu entfernen, und die Teilchen wurden unter einer
Infrarotlampe mittlerer Stärke getrocknet. Eine
Elementaranalyse zeigte, daß die Teilchen 0,55 Gew.-% Kohlenstoff und
weniger als 0,01 Gew.-% Stickstoff enthielten.
E. Proteinabtrennung mit Silan-behandelten Kieselgel
-
Das oben in Teil D beschriebene Silan-behandelte Kieselgel
wurde auf seine Wirksamkeit bei der Abtrennung eines
Modellproteins (Rinderserumalbumin, BSA) aus einer Lösung sowie
auf das Fehlen der Bindung zu DNA (Lachsspermien-DNA)
geprüft. Aliquote Teile von BSA wurden in verschiedene
Phosphat-Puffer (pH 5,0-7,0) gegeben, die Proben mit 250 mg
Silan-behandeltem Kieselgel gemischt, und dann wurden die
Lösungen durch Granulieren der Siliciumdioxid-Teilchen in
einer Zentrifuge vom Kieselgel abgetrennt. Die ursprüngliche
gepufferte Proteinlösung und das Filtrat wurden anhand der
UV-Absorption (200-480 nm) analysiert. Ein Vergleich der
UV-Spektren zeigte, daß die Proteinabtrennung stets > 90%
war. Eine gleichartige Prüfung unter Verwendung von
aliquoten Teilen von Lachsspermien-DNA zeigte, daß die
DNA-Ausbeute stets > 85% war.
Beispiel 2
Nucleinsäure-Reinigung mit Flußsäure-behandeltem Kieselgel
A. Herstellung von rehydratisiertem Kieselgel
-
Kieselgel (140 g; PSM300 Zorbax, Charge 9, DuPont) wurde in
einem Quarztiegel 2 h lang in einem Muffelofen auf 975ºC
erhitzt, wonach 15 g des abgekühlten Kieselgels in einen mit
Rückflußkühler ausgestatteten Rundkolben gegeben wurden. Dem
Kolben wurde destilliertes, deionisiertes Wasser (150 ml)
enthaltend 75 ppm HF zugesetzt, und die Mischung wurde 72 h
lang bei 110ºC am Rückfluß gehalten. Die Mischung wurde auf
Raumtemperatur abkühlen gelassen, und das Kieselgel wurde
mit 1 l destilliertem, deionisiertem Wasser gewaschen. Das
Kieselgel wurde über Nacht in Wasser (150 ml) gekocht,
nacheinander mit Wasser (500 ml) und Aceton (300 ml)
gewaschen und schließlich 5 h lang bei 110ºC getrocknet.
B. Verwendung von rehydratisiertem Kieselgel
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Röhrchen A wurde mit 1 ug (15 ul) pBR322-DNA, 32 Einheiten
(2 ul) PST-Restriktionsenzym, 6 ul 10x
PST-Restriktionsspaltungspuffer (minder starker Restriktionspuffer) und
37 ul Wasser versetzt. Der Inhalt dieses Röhrchens wurde
gemischt und 1,25 h lang bei 37ºC inkubiert. Röhrchen B
wurde mit Reagenzien versetzt, die mit denen in Röhrchen A
identisch waren. Unmittelbar nach dem Mischen jedoch wurde
der Inhalt dieses Röhrchens auf den Kopf einer Drehsäule
pipettiert, die 60 mg Flußsäure-behandeltes Kieselgel
enthielt. Unmittelbar vor Zugabe der Probe wurde die Säule
gepackt und mit 1x PST-Restriktionspuffer befeuchtet. Die
Probe wurde in das Säulenbett einsickern gelassen, und die
Säule wurde 5 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge (Modell
5412) geschleudert, und der Ablauf wurde aufgefangen. Ein
aliquoter Teil des Säulenablaufs wurde in ein drittes
Reaktionsröhrchen abgezweigt (Röhrchen C), und es wurde 1 ul (16
Einheiten) PST-Restriktionsenzym zugesetzt. Der Inhalt
dieses Röhrchens wurde gemischt und 1,25 h lang bei 37ºC
inkubiert. Aliquote Teile der Röhrchen A-C wurden dann mit
Agarosegel/Beladungspuffer (0,25% Bromphenolblau, 0,25%
Xylolcyanol und 30% Glycerin in Wasser) gemischt, und es
wurde jeweils ein Teil auf ein 0,7%
Agarose-Elektrophoresegel (0,105 g Agarose, 14,8 ml TBE-Puffer enthaltend
0,5 ug/ml Ethidiumbromid) in einem BioRad
Minizellen-Unterwasserelektrophoresegerät aufgebracht. Das Gel wurde etwa
4 h lang bei einem angelegten Potential von 100 V in einem
0,5x TBE-Puffer (0,5x TBE = 0,0445 M Tris-borat, 0,0445 M
Borsäure, 0,001 M EDTA, pH 8,0) arbeitengelassen.
Photographien des Gels wurden mittles Durchstrahlung mit 254 nm-
UV-Licht aufgenommen.
-
Aus Röhrchen A wurde ein linearisiertes DNA-Fragment
erhalten, das die gleiche Länge wie ein linearisierter pBR322-
Standard aufwies, was darauf hindeutet, daß das ringförmige
pBR322 vom PST-Restriktionsenzym an einer Stelle geschnitten
wurde. Die DNA von Röhrchen B lief als ringförmige DNA; es
wurde keine DNA-Bande an der Stelle des Gels beobachtet, die
dem linearisierten pBR322 entspricht, was darauf hindeutet,
daß die DNA nicht vom Enzym geschnitten wurde, d.h., das
Enzym war aufgrund des Durchgangs durch die Säule abgetrennt
worden. Auch aus Röhrchen C wurde ein linearisiertes DNA-
Fragment erhalten, das die gleiche Länge wie ein
linearisierter pBR322-Standard aufwies, was darauf hindeutet, daß
die DNA vom Restriktionsenzym geschnitten werden konnte, und
daß der Durchgang der DNA durch die Säule die biologische
Aktivität der DNA nicht verändert oder irgendeine der
notwendigen Pufferkomponenten (z.B. MgCl&sub2;) abtrennt; es wurde
lediglich das PST-Restriktionsenzym abgetrennt.
-
Dieses Beispiel zeigt, daß der Durchgang einer DNA und
Proteine enthaltenden Probe durch eine Drehsäule, die
rehydratisiertes Kieselgel enthält, diese Proteine, z.B.
PST-Restriktionsenzym, wirkungsvoll aus der Probe abtrennt.
Es zeigt auch, daß die im Ablauf der Säule aufgefangene DNA
biologisch wirksam ist, und daß die Säule die DNA nicht mit
Verunreinigungen belastet, die Enzyme hemmen würden, die in
nachfolgenden biologischen Reaktionen zur Modifizierung der
DNA verwendet werden.
Beispiel 3
Abtrennung von EcoRI-Restriktionsenzym
-
Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt
unter Verwendung von EcoRI-Restriktionsenzym und Puffer
(mittelstarker Puffer) anstelle von PST-Restriktionsenzym
und Puffer. Im Säulenablauf von Röhrchen B wurde nur
ringförmige pBR322-DNA beobachtet, was zeigte, daß beim
Durchgang der Mischung durch die Säule alles
EcoRI-Restriktionsenzym abgetrennt worden war, bevor es die DNA schneiden
konnte.
Beispiel 4
Abtrennung von SalI-Restriktionsenzym
-
Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt
unter Verwendung von SalI-Restriktionsenzym und Puffer
(Puffer hoher Stärke) anstelle von PST-Restriktionsenzym und
Puffer. Im Säulenablauf von Röhrchen B wurde nur ringförmige
pBR322-DNA beobachtet, was zeigte, daß beim Durchgang der
Mischung durch die Säule alles SalI-Restriktionsenzym
abgetrennt worden war, bevor es die DNA schneiden konnte.
Beispiel 5
Herstellung von rehydratisiertem Kieselgel mit Salzsäure und
Salpetersäure
-
Kieselgel (PSM300 Zorbax, DuPont) wurde zunächst 2 h lang
auf 300ºC erhitzt und dann 21 h lang in einem Quarztiegel in
einem Muffelofen auf 540ºC. 20 g dieses Kieselgels wurden
dann in ein Teflon -beschichtetes Becherglas gegeben, das
500 ml 10% (Vol./Vol.) Salzsäure enthielt, und die Mischung
wurde 4 h lang auf 100ºC erhitzt. Die Mischung wurde über
mehrere Stunden lang auf Raumtemperatur abkühlengelassen und
dann filtriert. Das Kieselgel wurde mit 1 l destilliertem,
deionisiertem Wasser gewaschen und dann in ein Teflon -
Becherglas überführt, das 500 ml 10% (Vol./Vol.)
Salpetersäure enthielt. Die Mischung wurde 4 h lang auf 100ºC
erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlengelassen und dann
filtriert. Das Kieselgel wurde mit 1 l Wasser gewaschen, und
dann wurden die Wäschen mit Salzsäure und Salpetersäure
wiederholt. Schließlich wurde das Kieselgel 4 h lang in
destilliertem, deionisiertem Wasser (500 ml) auf 100ºC
erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlengelassen, filtriert, mit
destilliertem, deionisiertem Wasser (1,5 l) gewaschen, mit
Aceton (300 ml) gespült und bei 110ºC getrocknet.
-
Ein
Teil dieses rehydratisierten Kieselgels wurde wie in
Beispiel 1 beschrieben auf DNA-Wiedergewinnung geprüft; es
wurden 87,2% einer 1 ug-DNA-Probe wiedergewonnen.
Beispiel 6
Abtrennung alkalischer Phosphatasen aus Reaktionsgemischen
der Dephosphorylierung
-
Linearisierte DNA (mit PST-Restriktionsenzym gespaltene
pBR322-DNA) wurde in 80 ul Dephosphorylierungspuffer (50 mM
Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,2) gelöst, und es wurde 1 ul (0,5
Einheiten) alkalische Kälberdarm-Phosphatase zugesetzt. Die
Mischung wurde 30 min lang bei 37ºC inkubiert. Ein 40 ul-
Aliquotteil der Reaktionsmischung wurde entnommen, und zur
Einstellung des pH auf 6,0 wurde dem Aliquotteil 7,6 ul
0,25 M HCl zugesetzt. Der neutralisierte Aliquotteil wurde
dann durch eine 40 mg-Säule mit rehydratisiertem Kieselgel
- hergestellt wie in Beispiel 2 - geschleudert, die vorher
gepackt und mit Dephosphorylierungspuffer (pH 6,0)
befeuchtet worden war.
-
Der gewonnene Säulenablauf wurde dann in einem Enzymassay
auf aktive alkalische Phosphatase analysiert: Der
Säulenablauf wurde mit 10 ul 1 M Tris HCl (pH 8,0) versetzt, um
den pH auf 7,8 einzustellen. Der Aliquotteil wurde dann zu
100 ul Testpuffer gegeben, der 0,1 M Tris HCl, pH 9,5, 0,1 M
NaCl, 50 mM MgCl&sub2; und 0,22 4g/ml BCIP enthielt, ein
farbloses Substrat für das Enzym alkalische Phosphatase, das
durch das Enzym in ein gefärbtes Produkt umgewandelt wird.
Die Testreaktion wurde 2 h lang laufengelassen, und dann
wurde das unlösliche gefärbte Produkt auf Filtern von 2 mm
Durchmesser aufgefangen.
-
Kontrollreaktionen, die 0,25 Einheiten aktive alkalische
Phosphatase enthielten, ergaben sehr starke blaue Färbungen.
Auch Verdünnungen von 0,0025 und 0,00025 Einheiten aktiver
alkalischer Phosphatase ergaben blaue Färbungen. Beim
Säulenablauf, der ursprünglich 0,25 Einheiten vor Durchgang
durch die Säule enthielt, war kein blauer Niederschlag
sichtbar, was zeigte, daß durch die Säule wenigstens 99,99%
der alkalischen Phosphatase aus der Probe bei deren
Durchgang durch die Säule abgetrennt worden waren. Um
vollständige Abtrennung des Enzyms sicherzustellen, ist es
erforderlich, die Dephosphorylierungsmischung der alkalischen
Phosphatase anzusäuern, ehe sie über die Säule gegeben wird. Bei
pH 8,2 wurden nur 99,9% des Enzyms abgetrennt.
-
Bei einem ähnlichen Experiment wurden mit Hilfe des oben
beschriebenen Verfahrens bis zu 5 Einheiten alkalischer
Phosphatase mit > 99,99% Wirkungsgrad abgetrennt.
Beispiel 7
Reinigung bakterieller DNA aus Vollblut
-
Menschliches Vollblut von gesunden Spendern wurde mit
E. coli-Bakterien versetzt, deren DNA eine Insertion von
Herpes-simplex-Virus-DNA enthielt (5 4g, New England Nuclear
Corp., Billerica, MA). Die so versetzte Blutprobe (10 ml)
wurde in einem Isolator -Röhrchen (DuPont) lysiert, um die
roten Blutzellen aufzubrechen. Dann wurden die intakten
Bakterien isoliert durch Schleudern des Isolator -Röhrchens
in einer Zentrifuge, um eine 1,5 ml-Schicht aus
Bakteriensediment am Boden des Röhrchens zu bilden, und Entfernen des
Überstands. Dann wurden die Bakterien in 2%
Natriumdodecylsulfat (SDS) 30 min lang bei 65ºC lysiert. Die Bakterien aus
der Blutprobe wurdem 10 min lang auf 100ºC erhitzt, um die
Masse des proteinhaltigen Materials zu koagulieren. Das
Koagulat wurde dann in einer Zentrifuge 10 min lang
sedimentiert, und der Überstand wurde gewonnen. Die koagulierte
Masse wurde dann in destilliertem Wasser (1 ml)
aufgebrochen, um alle DNA aus der Masse zu waschen, und nach dem
Zentrifugieren wurde der Überstand gewonnen und dem
ursprünglichen Überstand zugesetzt. Dieser Vorgang wurde dann
wiederholt.
-
An diesem Punkt war die freigesetzte Bakterien-DNA in 4 ml
Flüssigkeit isoliert, die noch immer eine erhebliche Menge
Protein enthielt (> 10 mg/ml), wie an der rostroten Farbe zu
erkennen war, die der Probe (unter anderem) durch die
verbliebenen Hämproteine verliehen wurde. Zur Abtrennung dieses
verbliebenen Proteins wurde die Probe auf den Kopf einer
Drehsäule aufgebracht, die mit rehydratisiertem Kieselgel
(hergestellt wie in Beispiel 2) gepackt war, das vorher mit
4 ml TE-Puffer (pH 6,75) befeuchtet worden war. Die Probe
wurde durch Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit in
das Säulenbett einfließen gelassen, und dann wurde die
Zentrifuge auf Hochgeschwindigkeit umgeschaltet, um die DNA
aus der Säule zu treiben. Nachdem der Ablauf aufgefangen
worden war (10 min), wurde die Säule mit 1 ml TE-Puffer
(pH 6,75) gewaschen, und die Waschflüssigeit wurde dem
Säulenablauf beigegeben. Die gereinigte DNA-Probe wurde unter
Vakuum zur Trockene gebracht und dann in einem
standardmäßigen Filterhybridisierungsassay geprüft.
-
Jeweils 12 ul 1 M NaOH und 3 M NaCl wurden der getrockneten
DNA-Probe, gelöst in 100 ml TE-Puffer (pH 6,75), zugesetzt.
Die Probe wurde 5 min lang auf 95ºC erhitzt, um die DNA zu
denaturieren, gekühlt und auf Eis gelagert, um die
Rehybridisierung zu verhindern.
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Aliquote Teile der denaturierten Probe wurden auf GeneScreen
Plus (New England Nuclear) aufgetüpfelt, das vorher in ein
Hybridot Manifold (Bethesda Research Laboratory) montiert
und mit 5x SSC-Puffer (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat,
pH 7,0) befeuchtet worden war. Die Proben wurden durch
Anlegen eines Vakuums langsam durch das Filter gezogen, und
die Punktproben wurden ausgewaschen, indem 100 ul 3 M
Ammoniumacetat durch die Probenpunkte gezogen wurden. Das die
Punktproben enthaltende Filter wurde vom Verteilerstück
entfernt und 30 min lang bei 50ºC vorhybridisiert in 0,5 M
Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 2 mg/ml
beschallte Lachsspermien-DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) und 1% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) (Sigma
Chemical Co.).
-
Eine ³²P-markierte pHSV106-DNA-Sonde (200 ul, 0,15 ug, Oncor
Inc., Gaithersburg, MD), komplementär zur HSV-DNA-Insertion
in der E. coli-DNA, wurde der Hybridisierungsmischung
zugesetzt. Das Filter wurde 30 min lang auf 60ºC erwärmt und bei
60ºC mit zwei 50 ml-Aliquotteilen 0,1 M Natriumphosphat-
Puffer (pH 7,0), enthaltend 1% (Gew./Vol.) SDS, gewaschen,
um alle nichthybridisierte DNA-Sonde zu entfernen. Das
Filter wurde bei Raumtemperatur luftgetrocknet und über
Nacht mit einem Kodak RP-Film autoradiographiert.
-
Die Ergebnisse dieses Experiments und eines analogen
Experiments unter Anwendung eines standardmäßigen
Phenol-Extraktionsverfahrens zeigen, daß intakte, hybridisierbare DNA von
der Drehsäule mit etwa dem gleichen Wirkungsgrad wie aus
einer Phenol-Extraktion gewonnen wurde. Außerdem ergaben
Blindblutproben (d.h., nicht mit E. coli-DNA versetzte), die
über Drehsäulen gegeben wurden, keine Punkte beim
Hybridisierungsassay, was zeigt, daß durch das rehydratisierte
Kieselgel in den Drehsäulen keine Störungen oder
Verunreinigungen in die Probe eingebracht wurden.
Gewinnung von DNA aus verschiedenen Kieselgel-Proben
-
Die Tabelle zeigt die Menge DNA, die gewonnen wurde aus neun
Proben rehydratisierten Kieselgels (Proben A-I), vier
unbehandelten, handelsüblichen Kieselgelen (Proben J-N) und zwei
rehydratisierten Kieselgelen (Proben O-P), die absichtlich
mit verschiedenen Metallen verunreinigt waren.
TABELLE
Siliciumdioxid
% gewonnene DNA
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Probe A: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM2000, DuPont),
Porengröße 2000 Å, hergestellt nach Beispiel 2A.
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B: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM1000, DuPont),
Porengröße 1000 Å, hergestellt nach Beispiel 2A.
-
C: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM300, DuPont),
Porengröße 300 Å, erhitzt auf 925ºC, dann hergestellt
nach Beispiel 2A.
-
D: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM300, Dupont),
Porengröße 300 Å, erhitzt auf 850ºC, dann hergestellt
nach Beispiel 2A.
-
E,F: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM300, DuPont),
Porengröße 300 Å, erhitzt auf 975ºC, dann hergestellt
nach Beispiel 2A.
-
Probe G: Siliciumdioxid mit Porengröße 300 Å, hergestellt
aus Tetraethylorthosilicat.
-
H,I: Fractosil 500 (E. Merck), behandelt mit HCl/HNO&sub3;
wie beschrieben in Beispiel 1A.
-
J: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM150, DuPont),
Porengröße 150 Å, unbehandelt.
-
K: Vydac -Siliciumdioxid (Charge 3700, The
Sep/a/ra/tions Group, Hesperia, CA).
-
L: Fractosil 500 (E. Merck), unbehandelt.
-
M: Nucleosil-100-S (Machery-Nagel, Deutschland),
unbehandelt.
-
N: Nucleosil-300 (Machery-Nagel, Deutschland),
unbehandelt.
-
O: Probe F, absichtlich verunreinigt mit jeweils
500 ppm Fe, Mg und Na.
-
P: Probe F, absichtlich verunreinigt mit 500 ppm Al.