DE68906799T2 - Verfahren zur reinigung von nukleinsaeuren. - Google Patents

Verfahren zur reinigung von nukleinsaeuren.

Info

Publication number
DE68906799T2
DE68906799T2 DE8989903325T DE68906799T DE68906799T2 DE 68906799 T2 DE68906799 T2 DE 68906799T2 DE 8989903325 T DE8989903325 T DE 8989903325T DE 68906799 T DE68906799 T DE 68906799T DE 68906799 T2 DE68906799 T2 DE 68906799T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
nucleic acids
column
silica gel
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE8989903325T
Other languages
English (en)
Other versions
DE68906799D1 (de
Inventor
Cormick Randy Miles Mc
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Application granted granted Critical
Publication of DE68906799D1 publication Critical patent/DE68906799D1/de
Publication of DE68906799T2 publication Critical patent/DE68906799T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/821—Separation of nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Silicon Compounds (AREA)

Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung von Materialien für die Festphasenextraktion, um Nucleinsäure- Proben zu reinigen, die mit proteinhaltigem Material verunreinigt sind.
    • Hintergrund
  • T. Maniatis et al., [Molecular Cloning - A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), S. 458-460] beschreiben eine Methode zur Reinigung von Nucleinsäuren, die auf den von K.S. Kirby [Biochim.J., Vol. 66, 494-504 (1957)] und J. Marmur [J.Mol.Biol., Vol. 3, 208-218 (1961)] beschriebenen Arbeitsweisen beruht. Bei dieser Methode wird Phenol in einem Flüssig/Flüssig-Extraktionsverfahren verwendet, wodurch das Protein, das eine wäßrige Nucleinsäure- Probe verunreinigt, in die Phenol-Phase extrahiert wird und die Nucleinsäure in der wäßrigen Phase zurückbleibt. Dieses Nucleinsäure-Reinigungsverfahren kann in Wirklichkeit eine Reihe von Flüssig/Flüssig-Extraktionen beinhalten, bei denen ein wäßriges Volumen einer Nucleinsäure-Probe nacheinander mit gleichen Volumina verflüssigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50:48:2) und Chloroform/Isoamylalkohol (96:4) extrahiert wird. Nach jeder Extraktion wird die das Protein (und etwas Nucleinsäure) enthaltende organische Phase mit wäßrigem Puffer rückextrahiert, um jegliche in die organische Phase extrahierte Nucleinsäure wiederzugewinnen.
  • Die wäßrige Nucleinsäure-Probe muß dann erschöpfend mit Diethylether extrahiert werden, um alles an verbliebenem Phenol, Chloroform oder Isoamylalkohol abzutrennen. Schließlich wird der restliche Diethylether entweder unter vermindertem Druck oder durch 10minütiges Überblasen der Probe mit Stickstoff abgezogen. Die Abtrennung der restlichen organischen Lösungsmittel ist von überragender Bedeutung, da sie ansonsten bei nachfolgenden Klonierungs- oder Hybridisierungsverfahren stören würden, bei denen die Nucleinsäure möglicherweise verwendet wird.
  • Die Phenol-Extraktion ist zwar eine sehr wirksame Methode zur Reinigung von Nucleinsäure-Proben und wird sehr weitläufig angewandt, doch ist das Verfahren auch sehr arbeitsintesiv und zeitraubend. Zu den weiteren Nachteilen dieser Technik gehören die mit der Verwendung organischer Lösungsmittel (Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol und Diethylether) verbundenen Gefahren (chemischer Reizstoff, Carcinogen, Gestank und Brennbarkeit).
  • Ein zweites Verfahren zur Reinigung von Nucleinsäuren beruht auf der bevorzugten Adsorption von Nucleinsäuren mit NENSORB 20 Nucleinsäure-Reinigungspatronen (DuPont). Eine proteinhaltige DNA-Probe wird durch eine Säule mit NENSORB - Teilchen geschickt, wobei die DNA an die Teilchen bindet und das Meiste des proteinhaltigen Materials mit einem wäßrigen Puffer von der Säule waschengelassen wird. Die gebundene Nucleinsäure wird dann von den Teilchen desorbiert, indem man 20% wäßrigen Ethylalkohol (oder 50% wäßrigen Methylalkohol) durch die Säule laufen läßt und die DNA im Säulenablauf aufgefangen wird. Vor Verwendung der DNA zum Klonen oder Hybridisieren muß der Alkohol durch mehrstündiges Anlegen eines Vakuums an die Probe aus der DNA-Lösung abgezogen werden.
  • Die Verwendung von NENSORB unterliegt anderen Beschränkungen. Das NENSORB -Material bindet neben Nucleinsäuren auch Protein in unterschiedlichem Ausmaß. Dies begrenzt nicht nur die Kapazität für die quantitative Nucleinsäure-Bindung aus einer Probe, die stark mit proteinhaltigem Material verunreinigt ist (z.B. Blutserum, Gewebehomogenisat), sondern läßt auch die Möglichkeit offen, daß etwas an lose gebundenem Protein mit der Nucleinsäure eluieren kann, wenn die letztere durch Verwendung von wäßrigem Alkohol vom NENSORB desorbiert wird. Es werden drei verschiedene Lösungsmittel benötigt, um die NENSORB -Säule zu aktivieren, das nichtgebundene Protein von der Säule zu waschen, und dann die Nucleinsäure von der Säule zu eluieren. Die Nucleinsäure wird in einem Lösungsmittel (20% Ethylalkohol oder 50% Methylalkohol) von der Säule eluiert, das unvereinbar ist mit Vorschriften für nachfolgende Verwendungen der Nucleinsäure (z.B. Klonierung, Hybridisierung, Assays etc.). Das Reinigungsverfahren unter Verwendung von NENSORB kann zeitraubend sein; es kann eine Stunde oder länger in Anspruch nehmen, eine einzige Nucleinsäure-Probe zu reinigen.
  • C.A. Thomas et al., Analytical Biochemistry, Vol. 93, 158-166 (1979), offenbaren die Verwendung von Glasfaserfiltern, um Protein und Protein/DNA-Komplexe aus wäßrigen DNA-Proben zu adsorbieren. Dieses Verfahren weist folgende Nachteile auf: 1) Die wäßrige DNA-Probe muß wenigstens 300 mM NaCl enthalten, damit das Protein wirksam an den Glasfaserfilter bindet. Diese relativ hohe Salzkonzentration müßte vor der weiteren Verwendung der DNA in biologischen Reaktionen wie etwa Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym durch Abtrennen des Salzes aus der DNA-Probe oder Verdünnen der Lösung verringert werden. 2) Die Ausbeute an DNA aus dem Filter ist nur dann hoch, wenn das Filter ausgiebig mit wäßrigem Puffer gewaschen wird. 3) Aus der geringen spezifischen Oberfläche (ungefähr 2 m²/g) der Glasfasern ergibt sich eine geringe Proteinbindungskapazität des Glasfaserfilters. Die maximale Proteinbindungskapazität errechnet sich zu 8,5 mg Rinderserumalbumin (BSA) pro Gramm Glasfaserfilter.
  • B. Vogelstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, Vol. 26, Nr. 2, 615-619 (1979), offenbaren eine Methode zur Abtrennung von DNA aus Agarose durch Binden der DNA an Glas, vorzugsweise Glaspulver in Gegenwart von NaI. Die DNA wird durch Elution mit Tris HCl, pH 7,2/0,2 M NaCl/2 mM EDTA vom Glas entfernt. Offenbart wird auch, daß Kieselgel und poröse Glasperlen für die DNA-Reinigung ungeeignet sind.
  • J. Kirkland, J.Chromatographic Sci., Vol. 9, 206-214 (1971), offenbart die Herstellung oberflächenmodifizierter Kieselgele durch Umsetzung von Silan-Reagenzien mit der porösen Hülle von Zipax -Chromatographieträger mit regulierter Oberfläche.
  • J. Kohler et al., J.Chromatography, Vol. 385, 125-150 (1987), offenbaren die Herstellung eines voll hydroxylierten gebrannten Siliciumdioxids durch Auflösen und Wiederabscheiden von Kieslsäure.
  • T. Watanabe et al., J.Solid-Phase Biochem., Vol. 3, 161-173 (1978), offenbart die Herstellung immobilisierter Tannine für die Proteinadsorption.
  • Ziel dieser Erfindung ist, ein verbessertes Festphasenextraktionsverfahren zur Abtrennung proteinhaltiger Verunreinigungen aus Nucleinsäure-Proben bereitzustellen. Mit dem Verfahren sollten sich hohe Anteile Protein aus winzigen Mengen Nucleinsäure abtrennen und letztere in biologisch aktivem Zustand gewinnen lassen. Auch sollte das Verfahren schnell und bequem sein, es sollte quantitative Gewinnung der Nucleinsäure ermöglichen und die Verwendung gefährlicher Stoffe minimieren. Auch sollten damit keine kontaminierenden Substanzen oder Verunreinigungen in die Nucleinsäure-Probe eingebracht werden, die die weitere Verwendung der Nucleinsäure beeinträchtigen können.
    • KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bei dem Verfahren zur Abtrennung proteinhaltiger Materialien von Nucleinsäuren wird eine Lösung, die die proteinhaltigen Materialien und Nucleinsäuren enthält, mit einem Festphasenextraktionsmaterial zusammengebracht, das Proteine zu binden imstande ist, um gebundene und nichtgebundene Fraktionen zu bilden, und dann wird die nichtgebundene Fraktion isoliert, die die Nucleinsäuren enthält.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die für das beanspruchte Verfahren zur Trennung von Proteinen und Nucleinsäuren vorteilhaften Festphasenextraktionsmaterialien sind teilchenförmige feste Materialien mit sehr hohen Affinitäten für proteinhaltige Materialien und sehr geringen Affinitäten für Nucleinsäuren. Die Materialien zur Festphasenextraktion sind dadurch gekennzeichnet, daß sie hohe spezifische Oberflächen aufweisen mit hohen Konzentrationen an leicht sauren Hydroxyl-Gruppen an der Oberfläche sowie geringen Oberflächenkonzentrationen an polyvalenten kationischen Spezies.
  • Festphasenextraktionsmaterialien mit hoher spezifischer Oberfläche sind bevorzugt aufgrund ihrer Fähigkeit, große Proteinmengen abzutrennen. Vorzugsweise beläuft sich die spezifische Oberfläche des Extraktionsmaterials auf wenigstens 50 m²/g; stärker bevorzugt ist, wenn sie wenigstens 100 m²/g beträgt. Diese hohen Oberflächen ergeben sich aufgrund des Vorhandenseins von Poren im gesamten teilchenförmigen Material. Die Poren sollten einen effektiven Durchmesser von > 60 Å aufweisen, und es gibt zwar keine Obergrenze für den Porendurchmesser, doch wird eine vernünftige Grenze von 500 Å bevorzugt, um hohe spezifische Oberfläche zu bewahren. Der bevorzugte Bereich ist 60 Å bis 150 Å.
  • Hohe Konzentrationen an leicht sauren Hydroxyl-Gruppen am Extraktionsmaterial dienen dazu, sowohl die Affinität des Extraktionsmaterials für proteinartige Verbindungen zu steigern als auch dessen Affinität für Polyanionen wie etwa Nucleinsäuren herabzusetzen. Die minimale wirksame Konzentration an leicht sauren Hydroxyl-Gruppen ist 0,1 umol/m². Vorzugsweise beläuft sich die Konzentration an leicht sauren Hydroxyl-Gruppen auf 1-8 umol/m² und stärker bevorzugt auf 8 umol/m².
  • Vorzugsweise ist der pKa der Hydroxyl-Gruppen an der Oberfläche zwischen 6 und 10.
  • Die Konzentration an polyvalenten kationischen Spezies an der Oberfläche des Festphasenextraktionsmaterials sollte minimiert werden, um Komplexierung anionischer Nucleinsäuren durch kationische Spezies an der Oberfläche zu verhindern. Dreiwertige Metall-Ionen wie etwa Eisen und Aluminium wirken sich besonders schädlich auf die Leistungsfähigkeit des Extraktionsmaterials aus.
  • Die vorstehend erörterten Festphasenextraktionsmaterialien mit den wünschenswerten Eigenschaften lassen sich auf einer Reihe von Wegen herstellen, entweder unter Verwendung eines homogenen teilchenförmigen Materials oder eines im Kern teilchenförmigen Materials, auf dessen Oberfläche die gewünschten funktionellen Einheiten mittels chemischer Reaktionen eingeführt werden. Für ersteren Fall hat sich gezeigt, daß rehydratisiertes Kieselgel die gewünschten Eigenschaften besitzt. Kieselgel besitzt von vornherein eine hohe Bedeckung der Oberfläche (8 umol/m²) mit leicht sauren (6 < pKa < 10) Hydroxyl-Gruppen und erfüllt somit obige Primäranforderungen. Zudem ist es sehr wirkungsvoll bei der Adsorption von proteinhaltigem Material. Allerdings muß die Oberfläche des Kieselgels von polyvalenten kationischen Spezies befreit werden, wenn verhindert werden soll, daß Nucleinsäuren an der Oberfläche der Siliciumdioxid-Teilchen adsorbiert werden. Dies kann auf mehreren Wegen erreicht werden.
  • Bei der bevorzugten Methode wird die Oberflächenschicht des Siliciumdioxid-Teilchens rehydroxyliert und gereinigt durch Lösen und Wiederabscheiden der Oberflächenschicht des Teilchens nach Kohler et al., J.Chromatography, Vol. 385, 125-150 (1987). Bei diesem Verfahren wird die äußere Oberfläche der Siliciumdioxid-Teilchen in einer verdünnten Flußsäure-Lösung bei erhöhter Temperatur gelöst. Das gelöste Siliciumdioxid wird dann dadurch wieder auf die Oberfläche eines jeden Teilchens abgeschieden, daß die das gelöste Siliciumdioxid enthaltende Lösung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen wird, wo es in wäßrigen Medien geringere Löslichkeit aufweist. Bei Wiederabscheidung der Schicht verbleiben Verunreinigungen, die in der äußeren Siliciumdioxid- Schicht, die dann gelöst wurde, vorhanden waren, in der Lösung zurück, und es bildet sich eine im wesentlichen reine Schicht aus Siliciumdioxid um das Kernteilchen.
  • Alternativ können polyvalente metallische Verunreinigungen durch aufeinanderfolgendes Behandeln mit mäßig konzentrierter Salzsäure und Salpetersäure bei erhöhter Temperatur aus dem Siliciumdioxid herausgelöst werden. Dieses Verfahren extrahiert und bringt metallische Verunreinigungen auf der Oberfläche der Kieselgel-Teilchen in Lösung, so daß eine Oberfläche zurückbleibt, bei der es sich im wesentlichen um reines Siliciumdioxid handelt.
  • Eine dritte Methode zur Herstellung des Festphasenextraktionsmaterials ist die Polymerisation einer dicken Schicht eines organischen Materials, das eine hohe Bedeckung mit leicht sauren Hydroxyl-Gruppen enthält, um die Oberfläche eines porösen Trägermaterials herum. Dies läßt sich bewerkstelligen durch Reagierenlassen eines organischen Silans, das die gewünschte chemische Funktionalität aufweist, mit Siliciumdioxid, wobei das Silan mit sich selbst und den Siliciumdioxid-Teilchen vernetzt unter Bildung einer dicken immobilisierten Schicht eines organischen Polymers [J. Kirkland et al., J.Chromatographic Sci., Vol. 9, 206-214 (1971)], das die gewünschte Bedeckung mit leicht sauren Hydroxyl-Gruppen aufweist. Die Hydroxyl-Gruppen verleihen der Oberfläche die Fähigkeit, große Mengen an proteinhaltigem Material zu adsorbieren, auch schirmen sie die Nucleinsäuren vor jeglichen polyvalenten kationischen Spezies in den Kernteilchen unter der Schicht aus organischem Polymer ab und verhindern so, daß Nucleinsäuren an das Festphasenextraktionsmaterial binden. Für diese Reaktion könnten zahlreiche organische Silane verwendet werden. Zum Beispiel würde die Verwendung von Silanen zur Immobilisierung von Phenol (PKa = 9,9), &beta;-Naphthol (pKa = 9,6) oder Tannin (Polyhydroxycarbonsäuren) auf die Oberfläche von Trägerteilchen brauchbare Festphasenextraktionsmaterialien ergeben. Zu den brauchbaren Trägermaterialien können Siliciumdioxid, Cellulose, Agarose und andere Materialien zählen, die über eine hohe Bedeckung mit aktiven Oberflächengruppen verfügen.
  • Welche Herstellungsmethode für das Festphasenextraktionsmaterial auch immer angewandt wird, es können wenigstens zwei Vorschriften für seine Verwendung zur Abtrennung von proteinhaltigen Verunreinigungen aus Nucleinsäure-Proben ausgeführt werden. Gemäß der ersten Vorschrift wird eine Menge des teilchenförmigen Festphasenextraktionsmaterials einem Volumen der zu deproteinierenden Probe zugesetzt. Die Mischung wird in leichter Bewegung gehalten, damit das teilchenförmige Material in Suspension bleibt. Wegen der geringen Größe und der großen Oberfläche des Festphasenextraktionsmaterials sind Diffusion und Adsorption des proteinhaltigen Materials zum bzw. am Festphasenextraktionsmaterial schnell (in der Größenordnung von Minuten). Das das adsorbierte Protein enthaltende teilchenförmige Material wird dann von der wäßrigen Nucleinsäure-Probe auf irgendeine herkömmliche Art und Weise, z.B. Zentrifugation oder Filtration, abgetrennt. Diese Vorschrift ist am wirkungsvollsten, wenn ein großes Volumen (> 1 ml) Probe kleine Mengen Protein enthält, und daher nur eine geringe Menge Teilchen (z.B. < 10 mg) für die quantitative Abtrennung des Proteins erforderlich ist.
  • Bei einer zweiten Vorschrift wird das Festphasenextraktionsmaterial in eine Säule gepackt, und die wäßrige Probe wird über die Säule gegeben. Um dies zu bewerkstelligen, wird eine Menge Teilchen in eine Drehsäule eingewogen und dadurch gepackt, daß das verschlossene Ende der Säule auf dem Labortisch aufgestoßen wird. Die Säule kann auch mit hoher Geschwindigkeit in einer Zentrifuge geschleudert werden; durch die Zentrifugalkraft werden die Teilchen im unteren Teil der Säule fest gepackt. Dann wird die Säule angefeuchtet durch Pipettieren eines Volumens des geeigneten Puffers (ein Volumen, das wenigstens gleich ist dem Teilchenvolumen in der Säule) auf die Säule, und dann läßt man den Puffer in das Säulenbett einsickern. Überschüssiger Puffer wird dann durch etwa 30 s langes Schleudern der Säule mit hoher Geschwindigkeit in einer Zentrifuge entfernt. Jeglicher aus dem Säulenbett eluierter Puffer wird verworfen. Nun ist die Säule bereit, die zu deproteinierende Nucleinsäure-Probe aufzunehmen; die Probe wird auf den Säulenkopf aufpipettiert und in das Säulenbett einsickeren gelassen, wo das proteinhaltige Material an die Teilchen bindet und die Nucleinsäuren in Lösung bleiben. Als nächstes wird die Säule mit hoher Geschwindigkeit in einer Zentrifuge geschleudert, um die die Nucleinsäuren enthaltende wäßrige Phase in ein Auffangröhrchen zu eulieren. Die Ausbeute an Nucleinsäure von der Säule beträgt typischerweise > 80% der auf die Säule aufgegebenen Menge. Die Ausbeute läßt sich auf etwa 95% erhöhen, wenn ein kleines Volumen (typischerweise 1/3 bis 1/2 des ursprünglich auf die Säule aufgetragenen Probenvolumens) auf den Säulenkopf aufpipettiert und in der Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit durchgeschleudert wird. Dadurch wird jegliche festgehaltene Nucleinsäure durch das Säulenbett gewaschen, und diese Waschung sollte dem Säulenablauf zugesetzt werden, der den Großteil der Nucleinsäure enthält. Diese Vorschrift funktioniert am besten bei Proben, die stark mit proteinhaltigem Material verunreinigt sind, wo es erforderlich ist, eine große Teilchenmenge (relativ zum Volumen der Probe) einzusetzen. Diese Vorschrift ist auch brauchbar, wenn ein sehr kleines Probenvolumen (z.B. 50 ul) zu deproteinieren ist und die vorhergehende Methode mühselig wäre.
  • Bei der Beschaffenheit des Puffers, der beim Säulenbefeuchtungsschritt und beim Säulenwaschschritt, wie vorher beschrieben, verwendet wurde, können einige Beschränkungen auferlegt werden. Die chemische Beschaffenheit des Puffers scheint nicht von Bedeutung zu sein, wenn auch die Verwendung von Salzen polyvalenter Metallkationen (z.B. Al, Fe, Ti etc.) vermieden werden sollte. Standardmäßige biochemische Puffer wie etwa TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 6,75), STE (10 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,0) oder PBS (120 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Phosphat, pH 7,4) arbeiten sehr gut. Im allgemeinen sollte der pH-Wert des Puffers im Bereich von 6 bis 7,5 liegen; bei niedrigeren pH-Werten kann Nucleinsäure an das Festphasenextraktionsmaterial binden, was zu geringeren Ausbeuten führt, wogegen bei höheren pH-Werten der Träger in Lösung gehen kann, da Kieselgel in alkalischen Lösungen merklich löslich ist. Ferner muß, wenn die Nucleinsäure-Probe einen pH außerhalb des obigen Bereichs aufweist, diese auf einen pH von 6 bis 7,5 neutralisiert werden, ehe sie zur Entfernung der Proteine auf die Säule aufgebracht wird. Der bevorzugte pH-Bereich für alle Puffer und Proben liegt im Bereich von 6,5 bis 7,0.
  • Der Porendurchmesser des Festphasenextraktionsmaterials sollte groß genug sein, um Proteine eindringen zu lassen, so daß sie auf der Oberfläche der inneren Poren adsorbiert werden können. Dadurch wird die Kapazität des Trägers für die Proteinabtrennung aus Proben maximiert. Die Poren müssen auch groß genug sein, damit die Nucleinsäure im Porenvolumen nicht festgehalten wird. Es wurde gefunden, daß Minimumporendurchmesser irgendwo zwischen 60 und 150 Å die erforderlichen Merkmale erbringen. Für den Porendurchmesser gibt es keine kritische Obergrenze, wenn auch mit zunehmendem Porendurchmesser der Teilchen die spezifische Oberfläche abnimmt. Somit läßt sich eine vernünftige Obergrenze von 300 bis 500 Å definieren. Teilchen, deren Porendurchmesser über dieser Grenze liegt, haben eine geringer Oberfläche und demzufolge geringere Proteinbindungskapazität.
  • Das Festphasenextraktionsmaterial ist brauchbar für die Abtrennung von proteinhaltigen Verunreinigungen aus einem weiten Bereich von Nucleinsäure-Proben. Zu den bereits gezeigten Verwendungen gehört die Abtrennung von Enzymen aus Restriktionsbruchstücken, die Abtrennung alkalischer Phosphatasen aus Reaktionsgemischen der Dephosphorylierung und die Abtrennung von Kinase-Enzymen aus Markierungsreaktionsgemischen. Es steht zu erwarten, daß sich auch andere gängige Enzyme wie etwa reverse Transcriptase, DNA-Polymerase, DNA-Ligase und terminale Transferase, die üblicherweise in der Molekularbiologie verwendet werden, unter geeigneten experimentellen Bedingungen aus Nucleinsäure-Proben abtrennen lassen.
  • Daneben ist das Festphasenextraktionsmaterial für die Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren aus zahlreichen biologischen Proben nutzbar. Wie schon gezeigt, wurde das Material zur Reinigung von DNA aus Organismen in Vollblutproben verwendet; es steht zu erwarten, daß - sobald die passenden Reinigungsvorschriften entwickelt sind - ähnliche Isolierungen aus anderen Proben von klinischem Interesse wie etwa Sputum, Urin, Fäces und Gewebe möglich sind. Derartige gereinigte Nucleinsäure-Proben sollten sich direkt für klinische Hybridisierungsassays verwenden lassen. Des weiteren sollte das Festphasenextraktionsmaterial nutzbar sein zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren aus Organismen, die in Kulturmedien gezogen wurden, vor allem zum Zweck der Herstellung von DNA für Klonierungszwecke oder andere gentechnische Verwendungen.
  • Das Festphasenextraktionsmaterial ist brauchbar für die Abtrennung von proteinhaltigen Verunreinigungen aus einem weiten Bereich von Nucleinsäuren. Zum Beispiel kann das Material verwendet werden, um Kinase-Enzyme abzutrennen, die bei der radioaktiven Markierung von Mononucleotiden wie etwa dATP, dCTP etc. verwendet werden. Auch wurde das Material verwendet, um alkalische Phosphatase aus einer Mischung von DNA abzutrennen, die von 125 Basenpaaren (bp) bis 21 226 bp reichte. Ausgiebig wurde das Material verwendet bei pBR322- DNA (4362 bp). Zudem wurde das Material bei intakter &lambda;-DNA (49 000 bp) verwendet, und es wurde kein Abbau dieser DNA durch mechanische Scherung beobachtet. Größere DNA-Stränge können beim Durchgang durch die Säule mit Festphasenextraktionsmaterial anfällig gegenüber dem Abbau durch Scherkräfte sein, obgleich dies nicht mit Sicherheit bekannt ist. Dieses Problem ließe sich minimeren durch Verwendung größerer Teilchengrößen bei der Herstellung des Festphasenextraktionsmaterials, womit Scherkräfte in Säulen verringert werden, die mit solchen Teilchen gepackt sind.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Deproteinierung von Nucleinsäure-haltigen Proben weist gegenüber gegenwärtig angewandten Methoden folgende Vorteile auf:
  • 1. Da das Festphasenextraktionsmaterial in geeigneten Puffern im wesentlichen unlöslich ist, löst es sich nicht in der Nucleinsäure-Probe, womit nachfolgende Arbeitsgänge (z.B. Extraktionen) zu seiner Abtrennung - wie bei den Phenol/Chloroform-Extraktionen - nicht erforderlich sind.
  • 2. Die Nucleinsäure wird mit einem wäßrigen Medium eluiert, das im wesentlichen identisch ist (außer zur Abtrennung von Proteinen) mit dem Medium, in dem sie auf die Säule aufgegeben wurde. Somit befindet sich die Nucleinsäure in einem Lösungsmittel, das mit anschliessenden biologischen Arbeitsgängen, bei denen sie verwendet wird, verträglich ist. Es sind keine Verunreinigungen zugegen (z.B. Phenol, Chloroform, Ethanol etc.), um die für anschließende biologische Verfahren verwendeten Enzyme zu hemmen oder zu deaktivieren.
  • 3. Die Reinigungsvorschrift unter Verwendung dieses Materials erfordert zur Ausführung 5 bis 10 min für eine Probe, während die auf Phenol/Chloroform-Extraktionen oder NENSORB beruhenden Verfahren eine Stunde oder länger in Anspruch nehmen können. Zudem erfordert die Verarbeitung zusätzlicher Proben zwei Minuten je Probe.
  • 4. Zur Durchführung dieses Verfahrens sind keine speziellen Reagenzien erforderlich. TE (pH 6,5) ist ein annehmbarer Puffer zum Befeuchten und Auswaschen der Säule, und dieser Puffer ist in allen Labors verfügbar, die mit Nucleinsäuren arbeiten. Zudem besteht kein Bedarf mehr an toxischen oder gefährlichen Reagenzien.
  • 5. Die Ausbeute an Nucleinsäuren ist hoch, typischerweise 80-95%.
  • 6. Im Gegensatz zu anderen Reinigungsmethoden, die auf der Adsorption von DNA an einem Träger beruhen, werden bei dieser Methode keine großen DNA-Fragmente abgeschnitten. Somit wird die Unversehrtheit der Probe bewahrt. Eine DNA-Scherung ist möglich bei Methoden, die auf der Adsorption der Nucleinsäure an einem Festphasenmaterial beruhen, da bei langen DNA-Fragmenten (z.B. 10 Kilobasenpaare oder mehr) die beiden Enden des DNA-Strangs an zwei verschiedenen Teilchen gleichzeitig adsorbiert werden können, und beim Rühren bewegen sich diese beiden Teilchen in verschiedene Richtungen und ziehen den DNA-Strang in zwei kleinere Fragmente auseinander. Da die DNA beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht an der festen Phase adsorbiert wird (stattdessen das Protein), ist ein solcher DNA-Abbau nicht möglich.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.
    • BEISPIELE Allgemeine Methoden und Reagenzien
  • pBR322-DNA und PST-Restriktionsenzym wurden bezogen von Pharmacia Inc., Piscataway, N.J.. 10x PST-Restriktionsspaltungspuffer enthält 500 mM NaCl, 100 mM Tris HCl pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreitol. Alkalische Kälberdarm-Phosphatase wurde bezogen von Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN. BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) wurde bezogen von Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD.
    • Beispiel 1 Herstellung und Verwendung von Silan-behandeltem Kieselgel A. Herstellung des Siliciumdioxid-Trägers
  • Fractosil 500 (20,5 g; E. Merck, Darmstadt, Deutschland) wurde mit drei 100 ml-Aliquotteilen 25%iger (Vol./Vol.) Salpetersäure bei Raumtemperatur gewaschen durch 10minütiges Suspendieren der Siliciumdioxid-Teilchen in der wäßrigen Säure und anschließendes Dekantieren der überschüssigen Säure, sobald sich die Teilchen am Boden des Becherglases abgesetzt hatten. Die säurebehandelen Teilchen wurden erschöpfend mit destilliertem, deionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand einen pH von 5,5 erreicht hatte. Die Teilchen wurden dann in einen mit Filterpapier mittlerer Porosität versehenen Büchner-Trichter überführt, mit hochreinem Methanol (3 x 100 ml) gewaschen und 1 h bei 80ºC (630 mmHg) getrocknet.
    • B. Aufpolymerisieren von Aminophenyltrimethoxysilan auf den Siliciumdioxid-Träger
  • Aminophenyltrimethoxysilan (4,0 ml; Petrarch Systems Inc., Bristol, PA) wurde zu destilliertem, deionisiertem Wasser (24 ml) und Isopropylalkohol (12 ml) in einem Rundkolben gegeben, der mit einem Rückflußkühler und einem Magnetrührstäbchen ausgestattet war. Die resultierende Mischung wurde gerührt, bis das Silan vollständig gelöst war. Die mit Säure gewaschenen Siliciumdioxid-Teilchen (6,1 g) wurden der Silan-Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde 2 h lang bei 81ºC am Rückfluß gehalten. Eisessig (3,5 ml) wurde dem Kolben zugesetzt, und die Mischung wurde eine weitere Stunde am Rückfluß gehalten. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, wonach die Siliciumdioxid-Teilchen sich am Boden des Kolbens abgesetzt hatten. Der schwarze Überstand wurde dekantiert, und die Teilchen wurden erschöpfend mit qualitativ hochwertigem Methanol gewaschen, bis die Waschflüssigkeit farblos war. Die Aminophenyl-derivatisierten Siliciumdioxid-Teilchen wurden dann auf einem Büchner-Trichter gesammelt, und es wurde Luft durch das Teilchenbett gesaugt, um restlichen Alkohol zu entfernen. Die Teilchen wurden unter einer Lampe mittlerer Stärke weiter getrocknet. Eine Kohlenstoff- und Stickstoff-Analyse der Teilchen zeigte, daß eine dicke Schicht aus Kohlenstoff- haltigem Material auf die Oberfläche der Siliciumdioxid- Teilchen aufpolymerisiert worden war (6,27% C; 1,13% N).
    • C. Diazotierung des Silan-behandelten Trägers
  • Das Aminophenyl-derivatisierte Kieselgel (6,90 g) wurde einer eiskalten Lösung von Wasser (10,0 ml) und konzentrierter Schwefelsäure (7,0 g) zugegeben, und die Teilchen wurden durch Magnetrühren in dieser Lösung suspendiert. Der obigen Mischung wurde feinzerstoßenes Eis (ungefähr 17 g) zugesetzt, und dann wurde eine Lösung von Natriumnitrit (2,24 g) in Wasser (5,33 g) über einen Zeitraum von 8-10 min tropfenweise zugegeben. Während dieser Zeit wurde die Temperatur der Mischung zwischen 0 und 5ºC gehalten. Die Teilchen wurden absetzen gelassen, und der Überstand wurde von der Mischung dekantiert. Dann wurden die Teilchen dreimal gewaschen, indem sie in 100 ml kaltem Wasser suspendiert wurden, die Teilchen absetzen gelassen wurden, und der Überstand dekantiert wurde. Die gebildeten Teilchen, bei denen die Oberflächen-Amine in die entsprechenden Diazonium- Salze überführt worden waren, wurden für die nachstehend beschriebene Hydrolysereaktion verwendet.
    • D. Hydrolyse des Diazonium-Salzes
  • Wasser (24 ml) wurde mit konzentrierter Schwefelsäure (32 ml) versetzt, und diese Mischung wurde zum Sieden erhitzt (ungefähr 160ºC). Die Diazonium-Salz-haltigen Teilchen wurden unter Beibehalten des Siedens langsam der heißen Säure zugegeben, mit unterdrücktem Aufschäumen wegen des aus der Zersetzung des Diazonium-Salzes gebildeten Stickstoff- Gases. Die Mischung wurde ungefähr 5 min lang gekocht und dann in ein Eisbad gestellt, um die Abkühlung zu beschleunigen. Der saure Überstand wurde von den Teilchen dekantiert, die dann mit destilliertem, deionisiertem Wasser (5mal 200 ml) gewaschen wurden. Die Teilchen wurden dann auf einem mit Filterpapier mittlerer Porosität versehenen Büchner- Trichter gesammelt und mit Methanol (200 ml) gewaschen. Es wurde Luft durch das Teilchenbett gesaugt, um restliches Methanol zu entfernen, und die Teilchen wurden unter einer Infrarotlampe mittlerer Stärke getrocknet. Eine Elementaranalyse zeigte, daß die Teilchen 0,55 Gew.-% Kohlenstoff und weniger als 0,01 Gew.-% Stickstoff enthielten.
    • E. Proteinabtrennung mit Silan-behandelten Kieselgel
  • Das oben in Teil D beschriebene Silan-behandelte Kieselgel wurde auf seine Wirksamkeit bei der Abtrennung eines Modellproteins (Rinderserumalbumin, BSA) aus einer Lösung sowie auf das Fehlen der Bindung zu DNA (Lachsspermien-DNA) geprüft. Aliquote Teile von BSA wurden in verschiedene Phosphat-Puffer (pH 5,0-7,0) gegeben, die Proben mit 250 mg Silan-behandeltem Kieselgel gemischt, und dann wurden die Lösungen durch Granulieren der Siliciumdioxid-Teilchen in einer Zentrifuge vom Kieselgel abgetrennt. Die ursprüngliche gepufferte Proteinlösung und das Filtrat wurden anhand der UV-Absorption (200-480 nm) analysiert. Ein Vergleich der UV-Spektren zeigte, daß die Proteinabtrennung stets > 90% war. Eine gleichartige Prüfung unter Verwendung von aliquoten Teilen von Lachsspermien-DNA zeigte, daß die DNA-Ausbeute stets > 85% war.
    • Beispiel 2 Nucleinsäure-Reinigung mit Flußsäure-behandeltem Kieselgel A. Herstellung von rehydratisiertem Kieselgel
  • Kieselgel (140 g; PSM300 Zorbax, Charge 9, DuPont) wurde in einem Quarztiegel 2 h lang in einem Muffelofen auf 975ºC erhitzt, wonach 15 g des abgekühlten Kieselgels in einen mit Rückflußkühler ausgestatteten Rundkolben gegeben wurden. Dem Kolben wurde destilliertes, deionisiertes Wasser (150 ml) enthaltend 75 ppm HF zugesetzt, und die Mischung wurde 72 h lang bei 110ºC am Rückfluß gehalten. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, und das Kieselgel wurde mit 1 l destilliertem, deionisiertem Wasser gewaschen. Das Kieselgel wurde über Nacht in Wasser (150 ml) gekocht, nacheinander mit Wasser (500 ml) und Aceton (300 ml) gewaschen und schließlich 5 h lang bei 110ºC getrocknet.
    • B. Verwendung von rehydratisiertem Kieselgel
  • Röhrchen A wurde mit 1 ug (15 ul) pBR322-DNA, 32 Einheiten (2 ul) PST-Restriktionsenzym, 6 ul 10x PST-Restriktionsspaltungspuffer (minder starker Restriktionspuffer) und 37 ul Wasser versetzt. Der Inhalt dieses Röhrchens wurde gemischt und 1,25 h lang bei 37ºC inkubiert. Röhrchen B wurde mit Reagenzien versetzt, die mit denen in Röhrchen A identisch waren. Unmittelbar nach dem Mischen jedoch wurde der Inhalt dieses Röhrchens auf den Kopf einer Drehsäule pipettiert, die 60 mg Flußsäure-behandeltes Kieselgel enthielt. Unmittelbar vor Zugabe der Probe wurde die Säule gepackt und mit 1x PST-Restriktionspuffer befeuchtet. Die Probe wurde in das Säulenbett einsickern gelassen, und die Säule wurde 5 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge (Modell 5412) geschleudert, und der Ablauf wurde aufgefangen. Ein aliquoter Teil des Säulenablaufs wurde in ein drittes Reaktionsröhrchen abgezweigt (Röhrchen C), und es wurde 1 ul (16 Einheiten) PST-Restriktionsenzym zugesetzt. Der Inhalt dieses Röhrchens wurde gemischt und 1,25 h lang bei 37ºC inkubiert. Aliquote Teile der Röhrchen A-C wurden dann mit Agarosegel/Beladungspuffer (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylolcyanol und 30% Glycerin in Wasser) gemischt, und es wurde jeweils ein Teil auf ein 0,7% Agarose-Elektrophoresegel (0,105 g Agarose, 14,8 ml TBE-Puffer enthaltend 0,5 ug/ml Ethidiumbromid) in einem BioRad Minizellen-Unterwasserelektrophoresegerät aufgebracht. Das Gel wurde etwa 4 h lang bei einem angelegten Potential von 100 V in einem 0,5x TBE-Puffer (0,5x TBE = 0,0445 M Tris-borat, 0,0445 M Borsäure, 0,001 M EDTA, pH 8,0) arbeitengelassen. Photographien des Gels wurden mittles Durchstrahlung mit 254 nm- UV-Licht aufgenommen.
  • Aus Röhrchen A wurde ein linearisiertes DNA-Fragment erhalten, das die gleiche Länge wie ein linearisierter pBR322- Standard aufwies, was darauf hindeutet, daß das ringförmige pBR322 vom PST-Restriktionsenzym an einer Stelle geschnitten wurde. Die DNA von Röhrchen B lief als ringförmige DNA; es wurde keine DNA-Bande an der Stelle des Gels beobachtet, die dem linearisierten pBR322 entspricht, was darauf hindeutet, daß die DNA nicht vom Enzym geschnitten wurde, d.h., das Enzym war aufgrund des Durchgangs durch die Säule abgetrennt worden. Auch aus Röhrchen C wurde ein linearisiertes DNA- Fragment erhalten, das die gleiche Länge wie ein linearisierter pBR322-Standard aufwies, was darauf hindeutet, daß die DNA vom Restriktionsenzym geschnitten werden konnte, und daß der Durchgang der DNA durch die Säule die biologische Aktivität der DNA nicht verändert oder irgendeine der notwendigen Pufferkomponenten (z.B. MgCl&sub2;) abtrennt; es wurde lediglich das PST-Restriktionsenzym abgetrennt.
  • Dieses Beispiel zeigt, daß der Durchgang einer DNA und Proteine enthaltenden Probe durch eine Drehsäule, die rehydratisiertes Kieselgel enthält, diese Proteine, z.B. PST-Restriktionsenzym, wirkungsvoll aus der Probe abtrennt. Es zeigt auch, daß die im Ablauf der Säule aufgefangene DNA biologisch wirksam ist, und daß die Säule die DNA nicht mit Verunreinigungen belastet, die Enzyme hemmen würden, die in nachfolgenden biologischen Reaktionen zur Modifizierung der DNA verwendet werden.
    • Beispiel 3 Abtrennung von EcoRI-Restriktionsenzym
  • Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von EcoRI-Restriktionsenzym und Puffer (mittelstarker Puffer) anstelle von PST-Restriktionsenzym und Puffer. Im Säulenablauf von Röhrchen B wurde nur ringförmige pBR322-DNA beobachtet, was zeigte, daß beim Durchgang der Mischung durch die Säule alles EcoRI-Restriktionsenzym abgetrennt worden war, bevor es die DNA schneiden konnte.
    • Beispiel 4 Abtrennung von SalI-Restriktionsenzym
  • Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von SalI-Restriktionsenzym und Puffer (Puffer hoher Stärke) anstelle von PST-Restriktionsenzym und Puffer. Im Säulenablauf von Röhrchen B wurde nur ringförmige pBR322-DNA beobachtet, was zeigte, daß beim Durchgang der Mischung durch die Säule alles SalI-Restriktionsenzym abgetrennt worden war, bevor es die DNA schneiden konnte.
    • Beispiel 5 Herstellung von rehydratisiertem Kieselgel mit Salzsäure und Salpetersäure
  • Kieselgel (PSM300 Zorbax, DuPont) wurde zunächst 2 h lang auf 300ºC erhitzt und dann 21 h lang in einem Quarztiegel in einem Muffelofen auf 540ºC. 20 g dieses Kieselgels wurden dann in ein Teflon -beschichtetes Becherglas gegeben, das 500 ml 10% (Vol./Vol.) Salzsäure enthielt, und die Mischung wurde 4 h lang auf 100ºC erhitzt. Die Mischung wurde über mehrere Stunden lang auf Raumtemperatur abkühlengelassen und dann filtriert. Das Kieselgel wurde mit 1 l destilliertem, deionisiertem Wasser gewaschen und dann in ein Teflon - Becherglas überführt, das 500 ml 10% (Vol./Vol.) Salpetersäure enthielt. Die Mischung wurde 4 h lang auf 100ºC erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlengelassen und dann filtriert. Das Kieselgel wurde mit 1 l Wasser gewaschen, und dann wurden die Wäschen mit Salzsäure und Salpetersäure wiederholt. Schließlich wurde das Kieselgel 4 h lang in destilliertem, deionisiertem Wasser (500 ml) auf 100ºC erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlengelassen, filtriert, mit destilliertem, deionisiertem Wasser (1,5 l) gewaschen, mit Aceton (300 ml) gespült und bei 110ºC getrocknet.
  • Ein Teil dieses rehydratisierten Kieselgels wurde wie in Beispiel 1 beschrieben auf DNA-Wiedergewinnung geprüft; es wurden 87,2% einer 1 ug-DNA-Probe wiedergewonnen.
    • Beispiel 6 Abtrennung alkalischer Phosphatasen aus Reaktionsgemischen der Dephosphorylierung
  • Linearisierte DNA (mit PST-Restriktionsenzym gespaltene pBR322-DNA) wurde in 80 ul Dephosphorylierungspuffer (50 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,2) gelöst, und es wurde 1 ul (0,5 Einheiten) alkalische Kälberdarm-Phosphatase zugesetzt. Die Mischung wurde 30 min lang bei 37ºC inkubiert. Ein 40 ul- Aliquotteil der Reaktionsmischung wurde entnommen, und zur Einstellung des pH auf 6,0 wurde dem Aliquotteil 7,6 ul 0,25 M HCl zugesetzt. Der neutralisierte Aliquotteil wurde dann durch eine 40 mg-Säule mit rehydratisiertem Kieselgel - hergestellt wie in Beispiel 2 - geschleudert, die vorher gepackt und mit Dephosphorylierungspuffer (pH 6,0) befeuchtet worden war.
  • Der gewonnene Säulenablauf wurde dann in einem Enzymassay auf aktive alkalische Phosphatase analysiert: Der Säulenablauf wurde mit 10 ul 1 M Tris HCl (pH 8,0) versetzt, um den pH auf 7,8 einzustellen. Der Aliquotteil wurde dann zu 100 ul Testpuffer gegeben, der 0,1 M Tris HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl&sub2; und 0,22 4g/ml BCIP enthielt, ein farbloses Substrat für das Enzym alkalische Phosphatase, das durch das Enzym in ein gefärbtes Produkt umgewandelt wird. Die Testreaktion wurde 2 h lang laufengelassen, und dann wurde das unlösliche gefärbte Produkt auf Filtern von 2 mm Durchmesser aufgefangen.
  • Kontrollreaktionen, die 0,25 Einheiten aktive alkalische Phosphatase enthielten, ergaben sehr starke blaue Färbungen. Auch Verdünnungen von 0,0025 und 0,00025 Einheiten aktiver alkalischer Phosphatase ergaben blaue Färbungen. Beim Säulenablauf, der ursprünglich 0,25 Einheiten vor Durchgang durch die Säule enthielt, war kein blauer Niederschlag sichtbar, was zeigte, daß durch die Säule wenigstens 99,99% der alkalischen Phosphatase aus der Probe bei deren Durchgang durch die Säule abgetrennt worden waren. Um vollständige Abtrennung des Enzyms sicherzustellen, ist es erforderlich, die Dephosphorylierungsmischung der alkalischen Phosphatase anzusäuern, ehe sie über die Säule gegeben wird. Bei pH 8,2 wurden nur 99,9% des Enzyms abgetrennt.
  • Bei einem ähnlichen Experiment wurden mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens bis zu 5 Einheiten alkalischer Phosphatase mit > 99,99% Wirkungsgrad abgetrennt.
    • Beispiel 7 Reinigung bakterieller DNA aus Vollblut
  • Menschliches Vollblut von gesunden Spendern wurde mit E. coli-Bakterien versetzt, deren DNA eine Insertion von Herpes-simplex-Virus-DNA enthielt (5 4g, New England Nuclear Corp., Billerica, MA). Die so versetzte Blutprobe (10 ml) wurde in einem Isolator -Röhrchen (DuPont) lysiert, um die roten Blutzellen aufzubrechen. Dann wurden die intakten Bakterien isoliert durch Schleudern des Isolator -Röhrchens in einer Zentrifuge, um eine 1,5 ml-Schicht aus Bakteriensediment am Boden des Röhrchens zu bilden, und Entfernen des Überstands. Dann wurden die Bakterien in 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) 30 min lang bei 65ºC lysiert. Die Bakterien aus der Blutprobe wurdem 10 min lang auf 100ºC erhitzt, um die Masse des proteinhaltigen Materials zu koagulieren. Das Koagulat wurde dann in einer Zentrifuge 10 min lang sedimentiert, und der Überstand wurde gewonnen. Die koagulierte Masse wurde dann in destilliertem Wasser (1 ml) aufgebrochen, um alle DNA aus der Masse zu waschen, und nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand gewonnen und dem ursprünglichen Überstand zugesetzt. Dieser Vorgang wurde dann wiederholt.
  • An diesem Punkt war die freigesetzte Bakterien-DNA in 4 ml Flüssigkeit isoliert, die noch immer eine erhebliche Menge Protein enthielt (> 10 mg/ml), wie an der rostroten Farbe zu erkennen war, die der Probe (unter anderem) durch die verbliebenen Hämproteine verliehen wurde. Zur Abtrennung dieses verbliebenen Proteins wurde die Probe auf den Kopf einer Drehsäule aufgebracht, die mit rehydratisiertem Kieselgel (hergestellt wie in Beispiel 2) gepackt war, das vorher mit 4 ml TE-Puffer (pH 6,75) befeuchtet worden war. Die Probe wurde durch Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit in das Säulenbett einfließen gelassen, und dann wurde die Zentrifuge auf Hochgeschwindigkeit umgeschaltet, um die DNA aus der Säule zu treiben. Nachdem der Ablauf aufgefangen worden war (10 min), wurde die Säule mit 1 ml TE-Puffer (pH 6,75) gewaschen, und die Waschflüssigeit wurde dem Säulenablauf beigegeben. Die gereinigte DNA-Probe wurde unter Vakuum zur Trockene gebracht und dann in einem standardmäßigen Filterhybridisierungsassay geprüft.
  • Jeweils 12 ul 1 M NaOH und 3 M NaCl wurden der getrockneten DNA-Probe, gelöst in 100 ml TE-Puffer (pH 6,75), zugesetzt. Die Probe wurde 5 min lang auf 95ºC erhitzt, um die DNA zu denaturieren, gekühlt und auf Eis gelagert, um die Rehybridisierung zu verhindern.
  • Aliquote Teile der denaturierten Probe wurden auf GeneScreen Plus (New England Nuclear) aufgetüpfelt, das vorher in ein Hybridot Manifold (Bethesda Research Laboratory) montiert und mit 5x SSC-Puffer (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat, pH 7,0) befeuchtet worden war. Die Proben wurden durch Anlegen eines Vakuums langsam durch das Filter gezogen, und die Punktproben wurden ausgewaschen, indem 100 ul 3 M Ammoniumacetat durch die Probenpunkte gezogen wurden. Das die Punktproben enthaltende Filter wurde vom Verteilerstück entfernt und 30 min lang bei 50ºC vorhybridisiert in 0,5 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0), enthaltend 2 mg/ml beschallte Lachsspermien-DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 1% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) (Sigma Chemical Co.).
  • Eine ³²P-markierte pHSV106-DNA-Sonde (200 ul, 0,15 ug, Oncor Inc., Gaithersburg, MD), komplementär zur HSV-DNA-Insertion in der E. coli-DNA, wurde der Hybridisierungsmischung zugesetzt. Das Filter wurde 30 min lang auf 60ºC erwärmt und bei 60ºC mit zwei 50 ml-Aliquotteilen 0,1 M Natriumphosphat- Puffer (pH 7,0), enthaltend 1% (Gew./Vol.) SDS, gewaschen, um alle nichthybridisierte DNA-Sonde zu entfernen. Das Filter wurde bei Raumtemperatur luftgetrocknet und über Nacht mit einem Kodak RP-Film autoradiographiert.
  • Die Ergebnisse dieses Experiments und eines analogen Experiments unter Anwendung eines standardmäßigen Phenol-Extraktionsverfahrens zeigen, daß intakte, hybridisierbare DNA von der Drehsäule mit etwa dem gleichen Wirkungsgrad wie aus einer Phenol-Extraktion gewonnen wurde. Außerdem ergaben Blindblutproben (d.h., nicht mit E. coli-DNA versetzte), die über Drehsäulen gegeben wurden, keine Punkte beim Hybridisierungsassay, was zeigt, daß durch das rehydratisierte Kieselgel in den Drehsäulen keine Störungen oder Verunreinigungen in die Probe eingebracht wurden.
    • Gewinnung von DNA aus verschiedenen Kieselgel-Proben
  • Die Tabelle zeigt die Menge DNA, die gewonnen wurde aus neun Proben rehydratisierten Kieselgels (Proben A-I), vier unbehandelten, handelsüblichen Kieselgelen (Proben J-N) und zwei rehydratisierten Kieselgelen (Proben O-P), die absichtlich mit verschiedenen Metallen verunreinigt waren. TABELLE Siliciumdioxid % gewonnene DNA
  • Probe A: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM2000, DuPont), Porengröße 2000 Å, hergestellt nach Beispiel 2A.
  • B: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM1000, DuPont), Porengröße 1000 Å, hergestellt nach Beispiel 2A.
  • C: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM300, DuPont), Porengröße 300 Å, erhitzt auf 925ºC, dann hergestellt nach Beispiel 2A.
  • D: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM300, Dupont), Porengröße 300 Å, erhitzt auf 850ºC, dann hergestellt nach Beispiel 2A.
  • E,F: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM300, DuPont), Porengröße 300 Å, erhitzt auf 975ºC, dann hergestellt nach Beispiel 2A.
  • Probe G: Siliciumdioxid mit Porengröße 300 Å, hergestellt aus Tetraethylorthosilicat.
  • H,I: Fractosil 500 (E. Merck), behandelt mit HCl/HNO&sub3; wie beschrieben in Beispiel 1A.
  • J: Zorbax -Siliciumdioxid (PSM150, DuPont), Porengröße 150 Å, unbehandelt.
  • K: Vydac -Siliciumdioxid (Charge 3700, The Sep/a/ra/tions Group, Hesperia, CA).
  • L: Fractosil 500 (E. Merck), unbehandelt.
  • M: Nucleosil-100-S (Machery-Nagel, Deutschland), unbehandelt.
  • N: Nucleosil-300 (Machery-Nagel, Deutschland), unbehandelt.
  • O: Probe F, absichtlich verunreinigt mit jeweils 500 ppm Fe, Mg und Na.
  • P: Probe F, absichtlich verunreinigt mit 500 ppm Al.

Claims (4)

1. Verfahren zur Abtrennung proteinhaltiger Materialien von Nucleinsäuren, umfassend
(a) das Zusammenbringen einer Lösung, die proteinhaltige Materialien und Nucleinsäuren enthält, mit einem rehydratisierten Kieselgel, wobei das rehydratisierte Kieselgel eine spezifische Oberfläche von wenigstens 50 m²/g hat und überall Poren mit einem effektiven Durchmesser von mehr als 6 nm aufweist, die proteinhaltige Materialien binden können, um eine nichtgebundene Fraktion zurückzulassen, die die Nucleinsäuren enthält; und
(b) Isolieren der nichtgebundenen Fraktion.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das rehydratisierte Kieselgel ein teilchenförmiges Material ist, das auf seiner Oberfläche im wesentlichen frei von polyvalenten Kationen ist, und das Oberflächen-Hydroxylgruppen mit einer Minimumkonzentration von 0,1 umol/m² und mit einem pKa zwischen 6 und 10 aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäuren DNA enthalten.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Nucleinsäuren DNA enthalten.
DE8989903325T 1987-12-28 1989-03-10 Verfahren zur reinigung von nukleinsaeuren. Expired - Fee Related DE68906799T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/138,038 US4923978A (en) 1987-12-28 1987-12-28 Process for purifying nucleic acids
PCT/US1989/000902 WO1990010637A1 (en) 1987-12-28 1989-03-10 Method for purifying nucleic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE68906799D1 DE68906799D1 (de) 1993-07-01
DE68906799T2 true DE68906799T2 (de) 1993-09-02

Family

ID=42211805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE8989903325T Expired - Fee Related DE68906799T2 (de) 1987-12-28 1989-03-10 Verfahren zur reinigung von nukleinsaeuren.

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4923978A (de)
EP (1) EP0462100B1 (de)
JP (1) JP2703636B2 (de)
AT (1) ATE89827T1 (de)
AU (2) AU625639B2 (de)
DE (1) DE68906799T2 (de)
DK (1) DK175017B1 (de)
FI (1) FI95270C (de)
NO (1) NO177856C (de)
WO (1) WO1990010637A1 (de)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5075430A (en) * 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
US5175271A (en) * 1989-07-10 1992-12-29 University Of Kansas Use of silica gel for DNA extraction with organic solvents
US5106966A (en) * 1989-07-10 1992-04-21 University Of Kansas Use of gel polymer for dna extraction with organic solvents
GB9020683D0 (en) * 1990-09-22 1990-11-07 Univ Strathclyde Isolation of dna
US5625055A (en) * 1990-09-22 1997-04-29 University Of Strathclyde Rapid isolation of polynucleotides
US5204257A (en) * 1991-04-29 1993-04-20 Autogen Instruments, Inc. Method of recovering bacteriophage
CA2067711C (en) * 1991-05-03 2000-08-08 Daniel Lee Woodard Solid phase extraction purification of dna
US6093558A (en) * 1991-07-25 2000-07-25 Edge Biosystems, Inc. Binding protein of biologically active compositions to an adhesive formulation on a substrate
US5329000A (en) * 1991-10-31 1994-07-12 Becton, Dickinson And Company Purification of DNA with silicon tetrahydrazide
DE4143639C2 (de) * 1991-12-02 2002-10-24 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren
US5438128A (en) * 1992-02-07 1995-08-01 Millipore Corporation Method for rapid purifiction of nucleic acids using layered ion-exchange membranes
DE69324716T2 (de) * 1992-02-13 1999-09-09 Becton Dickinson And Co. Celithydrat und Reinigung von DNS
DE69324681T2 (de) * 1992-06-23 1999-12-09 Minnesota Mining And Mfg. Co., Saint Paul Entproteinisierung mit azlacton-gekoppelten funktionsträgern
EP0580305B1 (de) * 1992-07-02 1999-09-22 Edge Biosystems, Inc. Verfahren und Material für Reinigung von Nukleinsäuren
AU669398B2 (en) * 1992-11-13 1996-06-06 Becton Dickinson & Company Boron silicates aluminum silicates phosphosilicates and purification of DNA
DE69429812T2 (de) * 1993-05-24 2002-08-14 Naucno-Proizvodstvennoe Predprijatie "Farmek", Moscow Niedermolekulare dna aus störmilch, methode zur gewinnung der dna und ein pharmazeutisches präparat darauf basierend
US5561064A (en) * 1994-02-01 1996-10-01 Vical Incorporated Production of pharmaceutical-grade plasmid DNA
DE4432654C2 (de) 1994-09-14 1998-03-26 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus natürlichen Quellen
GB9425138D0 (en) * 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
US5804684A (en) * 1995-08-24 1998-09-08 The Theobald Smith Research Institute, Inc. Method for isolating nucleic acids
US5783686A (en) * 1995-09-15 1998-07-21 Beckman Instruments, Inc. Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
AU5512598A (en) * 1996-11-27 1998-06-22 Edge Biosystems, Inc. Matrix for rapid purification of nucleic acids
WO1999000168A1 (en) * 1997-06-27 1999-01-07 Life Technologies, Inc. One step device and process for concentration and purification of biological molecules
US5958677A (en) * 1997-07-28 1999-09-28 The New York Blood Center, Inc. Method for purifying viral nucleic acids
US6368871B1 (en) 1997-08-13 2002-04-09 Cepheid Non-planar microstructures for manipulation of fluid samples
US6914137B2 (en) * 1997-12-06 2005-07-05 Dna Research Innovations Limited Isolation of nucleic acids
BR9815569A (pt) * 1997-12-06 2001-10-09 Dna Res Instr Ltd Método para extração de biomoléculas de material biológico
DK1179585T3 (da) 1997-12-24 2008-11-10 Cepheid Indretning og fremgangsmåde til lysis
AU763349B2 (en) * 1998-02-05 2003-07-17 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Simplified method for removing free protein during preparation of protein-polysaccharide conjugates and vaccines using restricted-access media
US5973138A (en) 1998-10-30 1999-10-26 Becton Dickinson And Company Method for purification and manipulation of nucleic acids using paramagnetic particles
US6887693B2 (en) 1998-12-24 2005-05-03 Cepheid Device and method for lysing cells, spores, or microorganisms
US7914994B2 (en) 1998-12-24 2011-03-29 Cepheid Method for separating an analyte from a sample
US6431476B1 (en) 1999-12-21 2002-08-13 Cepheid Apparatus and method for rapid ultrasonic disruption of cells or viruses
US8815521B2 (en) 2000-05-30 2014-08-26 Cepheid Apparatus and method for cell disruption
US9073053B2 (en) 1999-05-28 2015-07-07 Cepheid Apparatus and method for cell disruption
CA2374423C (en) * 1999-05-28 2013-04-09 Cepheid Apparatus and method for analyzing a liquid sample
US20040200909A1 (en) * 1999-05-28 2004-10-14 Cepheid Apparatus and method for cell disruption
US6479296B1 (en) * 1999-07-07 2002-11-12 Alex G. Bonner Solid phase precipitation and extraction
US6383783B1 (en) 1999-09-21 2002-05-07 3M Innovative Properties Company Nucleic acid isolation by adhering to hydrophobic solid phase and removing with nonionic surfactant
US20020012990A1 (en) * 1999-12-22 2002-01-31 Lander Russel Jackson Process for the scaleable purification of plasmid DNA
EP1301591A4 (de) * 2000-07-13 2004-05-26 Invitrogen Corp Verfahren und zusammensetzungen zur schnellen protein- und peptidextraktion und -isolierung mittels lysismatrize
AU2001276023A1 (en) * 2000-07-21 2002-02-05 Mark B Lyles Materials and methods for binding nucleic acids to surfaces
US7208271B2 (en) 2001-11-28 2007-04-24 Applera Corporation Compositions and methods of selective nucleic acid isolation
US7347976B2 (en) 2001-12-20 2008-03-25 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using a hydrophilic solid support in a hydrophobic matrix
US7192560B2 (en) * 2001-12-20 2007-03-20 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using anion exchange
US8110351B2 (en) 2002-01-16 2012-02-07 Invitrogen Dynal As Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample
AU2003217552A1 (en) * 2002-02-19 2003-09-09 Choicepoint Asset Company Selective extraction of dna from groups of cells
GB0212826D0 (en) * 2002-05-31 2002-07-10 Dna Res Innovations Ltd Materials and methods relating to polyions and substance delivery
US7879621B2 (en) * 2003-05-08 2011-02-01 Phynexus, Inc. Open channel solid phase extraction systems and methods
JP4723254B2 (ja) * 2002-12-23 2011-07-13 バイカル インコーポレイテッド プラスミドｄｎａを精製するための方法
US20040157219A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-12 Jianrong Lou Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor
US7601491B2 (en) * 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
US7981600B2 (en) * 2003-04-17 2011-07-19 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using an anion exchange material that includes a polyoxyalkylene
WO2005012522A1 (en) * 2003-07-23 2005-02-10 Cyclops Genome Sciences Limited Clean-up beads
GB0317199D0 (en) 2003-07-23 2003-08-27 Cyclops Genome Sciences Ltd Clean-up beads
EP1660631B1 (de) * 2003-08-01 2013-04-24 Life Technologies Corporation Zusammensetzungen und verfahren zur aufreinigung kurzer rna-moleküle
NZ545469A (en) * 2003-09-12 2009-11-27 Biocontrol Systems Inc Methods, compositions, and kits for the concentration and detection of microorganisms without a separate DNA extraction step
US20050130177A1 (en) * 2003-12-12 2005-06-16 3M Innovative Properties Company Variable valve apparatus and methods
US7727710B2 (en) * 2003-12-24 2010-06-01 3M Innovative Properties Company Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface
US7939249B2 (en) * 2003-12-24 2011-05-10 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step
US20050239091A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Collis Matthew P Extraction of nucleic acids using small diameter magnetically-responsive particles
CA2575446C (en) * 2004-08-03 2014-03-25 Becton, Dickinson And Company Use of magnetic material to direct isolation of compounds and fractionation of multipart samples
AU2005271687A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Becton, Dickinson And Company Use of magnetic material to fractionate samples
EP1856262B1 (de) 2005-01-31 2012-08-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Upstream- und downstream-reinigungsverfahren zur massenfertigung von plasmider dna
US20090215124A1 (en) 2005-02-15 2009-08-27 Weidong Cao Nucleic acid isolation methods and materials and devices thereof
US20060202922A1 (en) * 2005-03-10 2006-09-14 Hanna Christopher P Method for optimizing a purification procedure
US7378260B2 (en) * 2005-04-01 2008-05-27 Applera Corporation Products and methods for reducing dye artifacts
WO2008134470A2 (en) * 2007-04-25 2008-11-06 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid amplification
AU2008273030B2 (en) * 2007-06-29 2013-01-17 Becton, Dickinson And Company Methods for extraction and purification of components of biological samples
US20090088560A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-02 Hong Shen Process for Nucleic Acid Purification
US7759112B2 (en) 2007-10-31 2010-07-20 Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids
US8775092B2 (en) * 2007-11-21 2014-07-08 Cosmosid, Inc. Method and system for genome identification
US8478544B2 (en) 2007-11-21 2013-07-02 Cosmosid Inc. Direct identification and measurement of relative populations of microorganisms with direct DNA sequencing and probabilistic methods
DE102008010693A1 (de) 2008-02-22 2009-08-27 Qiagen Gmbh Neue Matrixmaterialien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen
US10514330B2 (en) * 2010-07-14 2019-12-24 Qiagen Gmbh Device for isolation and/or purification of biomolecules
PT3270141T (pt) 2011-03-08 2020-08-28 Univ Laval Dispositivo centrípeto fluídico
WO2014035090A1 (ko) 2012-08-28 2014-03-06 주식회사 바이오큐브시스템 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 다공성 고체상 및 이의 용도
KR102196230B1 (ko) 2012-09-17 2020-12-29 더블유.알. 그레이스 앤드 캄파니-콘. 크로마토그래피 매질 및 장치
GB201217405D0 (en) 2012-09-28 2012-11-14 Fermentas Uab Protein removal agent
EP3049539B1 (de) 2013-09-25 2018-09-05 Bio-Id Diagnostic Inc. Verfahren für den nachweis von nukleinsäurefragmenten
ES2929099T3 (es) 2014-05-02 2022-11-24 Grace W R & Co Material de soporte funcionalizado y métodos de fabricación y uso de material de soporte funcionalizado
JP2018517559A (ja) 2015-06-05 2018-07-05 ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンＷ Ｒ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ−Ｃｏｎｎ 吸着性バイオプロセス清澄化剤並びにその製造及び使用方法
USD799715S1 (en) 2015-10-23 2017-10-10 Gene POC, Inc. Fluidic centripetal device
ES2964100T3 (es) 2017-09-18 2024-04-04 Phase Scient International Ltd Método de utilización de un sistema acuoso bifásico para el aislamiento, purificación y/o concentración de fragmentos cortos de ácidos nucleicos
KR20220075978A (ko) 2020-11-30 2022-06-08 (주)바이오니아 중저 비유전율을 가진 화합물을 포함한 핵산 결합 완충액을 이용한 핵산 분리방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3639949A1 (de) * 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren

Also Published As

Publication number Publication date
ATE89827T1 (de) 1993-06-15
FI95270B (fi) 1995-09-29
NO913545L (no) 1991-09-09
AU3352589A (en) 1990-10-09
AU625639B2 (en) 1992-07-16
JP2703636B2 (ja) 1998-01-26
NO913545D0 (no) 1991-09-09
FI914240A0 (fi) 1991-09-09
DK156191D0 (da) 1991-09-05
DK156191A (da) 1991-09-05
FI95270C (fi) 1996-01-10
DK175017B1 (da) 2004-04-26
AU632284B2 (en) 1992-12-24
US4923978A (en) 1990-05-08
WO1990010637A1 (en) 1990-09-20
EP0462100B1 (de) 1993-05-26
EP0462100A1 (de) 1991-12-27
NO177856B (no) 1995-08-28
NO177856C (no) 1995-12-06
DE68906799D1 (de) 1993-07-01
JPH04503942A (ja) 1992-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE68906799T2 (de) Verfahren zur reinigung von nukleinsaeuren.
DE4321904B4 (de) Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
EP1071691B1 (de) Verfahren zur isolierung und aufreinigung von nucleinsäuren
DE69533317T2 (de) Isolierung von nukleinsäuren
DE69933186T2 (de) Methode zur Reinigung und Manipulation von Nukleinsäure mittels paramagnetischen Partikeln
US5783686A (en) Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
DE60012318T2 (de) pH ABHÄNGIGE IONTAUSCHERMATRIX UND ANWENDUNGSVERFAHREN IN DER ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN
EP1851313B1 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren, wobei die nukleinsäuren bei erhöhter temperatur an einer matrix immobilisiert werden
DE69836587T2 (de) Nukleinsäuresammlung
DE10084502B4 (de) Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäure mit Siliciumcarbid
DE69636553T2 (de) Nukleinsäuren bindender magnetischer Träger und Verfahren für die Nukleinsäureisolierung unter dessen Verwendung
DE60015148T2 (de) Simultane isolierung und quantifizierung von dna
EP0743949A1 (de) Verfahren zur herstellung endotoxinfreier oder an endotoxin abgereicherter nucleinsäuren und/oder oligonucleotide für die gentherapie
EP0743950A1 (de) Verfahren zur trennung von doppelstrang/einzelstrangnukleinsäurestrukturen
EP0853123A1 (de) Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration
EP1771242B1 (de) Verfahren zur effizienten isolierung von nukleinsäuren
WO2000029562A1 (de) Verfahren zur isolierung von plasmid-dna
DE60123828T2 (de) Lysat-klärung und nukleinsäureisolierung mit silanisierten silicamatrizes
WO2002004620A2 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren
EP1242816A2 (de) Chromatographiematerial und verfahren unter verwendung desselben

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee