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Fachgebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die in der Lage sind, das
Hüllprotein
E2 des Hepatitis-C-Virus (HCV) zu binden, und Verfahren zur Herstellung
und Reinigung.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der Proteine in der
Therapie und Diagnose und in Arzneimitteln und diagnostischen Kits
für solche
Verwendungen. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Durchmusterung
von mutmaßlichen
Molekülen,
die mit HCV um die Rezeptorbindung konkurrieren. Die Erfindung betrifft
ebenfalls ein Tiermodel für
die HCV-Infektion.
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Kurze Beschreibung des
Fachgebiets
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HCV
(früher
bekannt als Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis – NANBV) ist ein RNA-Virus mit positiver
Sense-Orientierung von etwa 10000 Nucleotiden mit einem einzelnen
offenen Leserahmen, der ein Polyprotein von etwa 3000 Aminosäuren codiert.
Obwohl die Struktur des Virus durch rekombinante DNA-Techniken aufklärt wurde
(1, 2), wurde das Virus selbst nicht isoliert und die Funktionen
der verschiedenen viralen Proteine, die durch Proteolyse des Polyproteins
hergestellt wurden, wurden nur durch die Analogie mit anderen ähnlichen
Viren mit einer ähnlichen
genomischen Organisation abgeleitet (3).
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Die
viralen Proteine sind alle in rekombinanter Form, die in einer Vielfalt
von Zellen und Zellarten einschließlich Hefe, Bakterien, Insekten-
und Säugerzellen
exprimiert werden, erhältlich
(4, 5).
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Von
zwei Proteinen, die E1 und E2 (die jeweils den Aminosäuren 192–383 und
384–750
entsprechen) genannt werden, wurde vermutet, dass sie externe Proteine
der viralen Hülle
sind, die für
die Bindung des Virus an die Zielzellen verantwortlich sind (3).
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Die
HCV-Forschung wird sehr beträchtlich
durch den begrenzen Wirtsbereich des Virus eingeschränkt. Das
einzige zuverlässige
Tiermodel für
die HCV-Infektion ist der Schimpanse und es ist nicht möglich HCV
in Gewebekultur zu vermehren.
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In
unserer schwebenden internationalen Patentanmeldung WO 9605513 beschreiben
wir ein Verfahren, das die Durchflusszytrometrie verwendet, um Zellen,
die den HCV-Rezeptor tragen, zu identifizieren. Wir haben gezeigt,
dass es durch die Markierung von Zellen mit dem rekombinanten E2-Hüllprotein
möglich
ist, Zellen unter Verwendung der Durchflusszytrometrie zu sortieren
und solche Zellen, die in der Lage sind das E2-Proein spezifisch
zu binden und daher möglicherweise
den HCV-Rezeptor tragen, zu isolieren. Unter Verwendung dieser Technik
haben wir ein Protein identifiziert, das in der Lage ist, das E2-Hüllprotein
von HCV zu binden, und von dem wir glauben, dass es der Rezeptor
für HVC
ist, wodurch es ermöglicht
wird, viele Probleme auf dem Fachgebiet zu lösen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Assay, der ein Protein verwendet, das ein Molekulargewicht
von etwa 24 kD besitzt und das in der Lage ist, ein Protein des
Hepatitis-C-Virus spezifisch zu binden, oder eine funktionell äquivalente
Variante oder ein Fragment davon, zur Verfügung gestellt, wie in dem Anspruch
1 definiert ist.
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Es
wird für
den Fachmann selbstverständlich
sein, dass die Molekulargewichte, die, wie nachfolgend beschrieben
wird, unter Verwendung von Elektrophorese gemessen werden, von Natur
aus der Interpretation unterworfen sind, da sie relativ zu Standard-Molekulargewichtsmarkern
gemessen werden. Im Rahmen dieser Beschreibung ist jedoch der Ausdruck „24 kd" eindeutig, wenn
er in diesem Zusammenhang gelesen wird, da nur ein solches Protein
durch die nachfolgenden Verfahren, die nachfolgend beschrieben werden,
mit dem definierten Kennzeichen der Bindung des Hepatitis-C-Virus
erhalten wird.
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Eine
bedeutende kennzeichnende Eigenschaft des Proteins gemäß der vorliegenden
Erfindung ist seine Fähigkeit,
spezifisch an ein HCV-Protein zu binden, vorzugsweise an ein Hüllprotein,
besonders das E2-Protein.
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Auf
der Grundlage dieser Spezifität
und anderer Kennzeichen, die nachfolgend beschrieben werden, schließen wir,
dass das 24 kd große
Protein der Erfindung ein zellulärer
Rezeptor für
HCV ist.
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Wir
haben gezeigt, dass das Protein in Menschen unter den Zellarten,
die wir getestet haben, allgemein verbreitet ist, was parallel zu
der Situation ist, die für
viele andere Viren dieser Art (wie z.B. das Vaccina-Virus und das
Grippevirus) gefunden wird.
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Wir
haben gezeigt, dass das Protein in einer Weise artspezifisch ist,
die der Artspezifität
von HCV selbst gleicht.
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Unsere
Experimente zeigten, dass das 24 kd große Protein funktionell nicht
glycosyliert ist. Die Behandlung mit Glycosidasen hat keinen Einfluss
auf die Fähigkeit
des 24 kd großen
Proteins, an das E2-Protein zu binden, und scheint das Molekulargewicht
nicht deutlich zu vermindern. Wir leiten daher ab, dass die Glycosylierung
nur auf eine geringe Anzahl von Zuckereinheiten beschränkt ist,
wenn das Protein überhaupt
glycosyliert ist, und dass es nicht notwendig für die funktionelle Aktivität des Proteins
ist.
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Unsere
Experimente zeigten ebenfalls, dass das Protein ein Transmembranprotein
ist, was erneut darauf hinweist, dass es sich um einen zellulären Rezeptor
handelt.
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Experimente
mit Zelllinien, die das Protein überexprimieren,
zeigen schließlich,
dass solche Zellen zur Aggregation neigen, was darauf hinweist,
dass das Protein eine Art von Adhäsionsmolekül sein kann.
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Das
24 kd große
Protein kann in seiner natürlich
vorkommenden Form vorliegen, wenn auch isoliert aus seiner natürlichen
Umgebung, oder es kann modifiziert sein, vorrausgesetzt, dass es
die funktionellen Eigenschaften von zumindest der Bindung an das
E2-Protein von HCV behält.
Zum Beispiel kann das 24 kd große
Protein chemisch modifiziert sein, um eine oder mehrere chemische
Modifikationen in der Aminosäurestruktur
einzubringen. Es kann Modifikationen der Aminosäuresequenz einschließen, wobei
eine oder mehrere Insertionen, Deletionen oder ersetzte Aminosäuren eingeschlossen
sind. Es kann zum Beispiel durch die Entfernung eines funktionellen
Anteils der transmembranen Domäne
verkürzt
sein, um die einfache Herstellung durch rekombinante DNA-Verfahren
in einer geeigneten Säuger-Wirtszelle
zu erleichtern (6).
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Das
Protein der vorliegenden Erfindung kann von Zellen isoliert werden,
die eine Bindung an ein HCV-Protein wie z.B. das E2-Protein zeigen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird hierin ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins
gemäß der Erfindung
oder einer funktionell äquivalenten
Variante oder eines Fragments davon beschrieben, umfassend den Schritt
der Kultivierung der Zellen, die eine Bindung an ein HCV-Protein
zeigen, und der Reinigung eines Proteins gemäß der Erfindung aus einer Zellzubereitung.
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Die
Zellen können
transformierte oder nicht transformierte Säugerzellen sein und sind geeigneterweise
menschliche Zellen.
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Die
Zellen können
unter Verwendung der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie oder durch
jeden anderen geeigneten Assay auf die Bindung an ein HCV-Protein
durchgemustert werden. Die vorliegende Beschreibung stellt zum Beispiel
die Informationen zur Verfügung,
die notwendig sind, um das 24 kd große Protein oder eine funktionell äquivalente
Variante oder ein Fragment davon herzustellen, welches anschließend selbst
dazu verwendet wird, um weitere Zellen, die das Protein tragen,
zu untersuchen.
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Die
Zellherstellung kann eine Zellmembranzubereitung sein, aber sie
ist vorzugsweise eine Plasmazellmembranzubereitung.
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Vorzugsweise
werden die Zellen ausgewählt
und cloniert, um eine Überexpression
des Proteins der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen.
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Wir
haben herausgefunden, dass das Protein durch Ammoniumsulfat bei
einer Sättigung
zwischen 33 und 50% gefällt
wird.
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Daher
wird für
die Zellherstellung vorzugsweise ein Reinigungsschritt durch die
Ammoniumsulfatfällung,
wobei Ammoniumsulfat zwischen 33 und 50% verwendet wird, durchgeführt. Geeigneterweise
wird eine erste Fällung
bei weiniger als 33% durchgeführt
und das gefällte
Material wird verworfen, gefolgt von einer Fällung des gewünschten
Materials zwischen 33 und 50%, am stärksten bevorzugt 50%.
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Vorzugsweise
schließt
die Reinigung mindestens einen Schritt der hydrophoben Chromatographie
ein.
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Wir
haben ebenfalls herausgefunden, dass das Protein gegenüber einer
Aceton-Fällung
stabil ist, wodurch es ein noch weiteres Kennzeichen und einen nützlichen
Verfahrungsschritt zur Reinigung zur Verfügung stellt.
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In
einer optimierten Form umfasst das Verfahren der Reinigung besonders
bevorzugt die Schritte:
- i) das Herstellen einer
Plasmazellmembranzubereitung aus Säugerzellen, ausgewählt für die Überexpression
des 24 kd großen
Proteins der Erfindung;
- ii) das Durchführen
einer Ammoniumsulfatfällung
bei weniger als 33% Sättigung
bei der Zubereitung und das Zurückbehalten
des Überstands;
- iii) das Durchführen
einer Ammoniumsulfatfällung
bei 33 bis 50% Sättigung
mit dem Überstand
und das Zurückbehalten
des Präzipitats;
und
- iv) das Resuspendieren des Präzipitats und das Durchführen einer
hydrophoben Chromatographie.
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Als
eine Alternative zur Reinigung aus Wildtyp-Zelllinien kann das Protein
der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein
Fragment davon durch jedes geeignetes synthetisches Verfahren einschließlich der
chemischen Synthese hergestellt werden. Geeigneterweise wird das
Protein oder eine funktionell äquivalente
Variante oder ein funktionell äquivalentes
Fragment davon durch die Expression eines Gens, welches das Protein
codiert, in einer geeigneten Wirtszelle oder einem geeigneten Wirtstier
hergestellt.
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Eine
geeignete lösliche
Form des Proteins der Erfindung kann zum Beispiel eine verkürzte Form
des Proteins umfassen, von dem die transmembrane Domäne entweder
durch einen Schritt der Proteinspaltung oder durch Konstruktion
in einer chemischen oder einer rekombinanten DNA-Synthese entfernt
wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
könnte
ein hybrider Partikel, der mindestens ein partikelformendes Protein
wie z.B. das Hepatitis B-Oberflächenantigen
oder ein partikelformendes Fragment davon in Kombination mit dem
Protein der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem
funktionell äquivalenten
Fragment davon umfasst, als Antagonist zur Bindung von HCV an den
zellulären
Rezeptor verwendet werden.
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Die
Fähigkeit
eines Proteins der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten
Variante oder eines funktionell äquivalenten
Fragments davon, an HCV zu binden, erlaubt die Verwendung des Proteins
oder einer funktionell äquivalenten
Variante oder eines funktionell äquivalenten
Fragments davon als ein diagnostisches Mittel für die HCV-Infektion, zum Beispiel
in einem ELISA oder RIA.
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Eine
lösliche
Form des Proteins könnte
zum Beispiel in einer ELISA-Assayform
verwendet werden, um die neutralisierenden Antikörper im Serum zu messen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Analyse für HCV-Antikörper in
einer Serumprobe zur Verfügung
gestellt, welches den Schritt umfasst, die kompetitive Bindung zwischen
Antikörpern
in der Probe und einer bekannten Menge eines HCV-Proteins zur Bindung
an ein Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente
Variante oder ein funktionell äquivalentes
Fragment davon und das Messen der Menge des bekannten HCV-Proteins,
das gebunden ist, zu ermöglichen.
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Vorzugsweise
wird das Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente
Variante oder ein Fragment davon an einer festen Trägersubstanz
immobilisiert und das HCV-Protein, das geeigneterweise das E2-HCV-Hüllprotein
sein kann, gegebenenfalls ein rekombinantes E2-Protein, wird markiert,
geeigneterweise wird es durch ein Enzym markiert.
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In
einer Analyse dieser Form führt
die kompetitive Bindung zwischen Antikörpern und dem HCV-Protein für die Bindung
an das Protein der Erfindung zu einem gebundenen HCV-Protein, welches
ein Maß für die Antikörper in
der Serumprobe ist, insbesondere von neutralisierenden Antikörpern in
der Serumprobe.
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Ein
deutlicher Vorteil des Assays ist, dass die Messung direkt von neutralisierenden
Antikörpern
durchgeführt
wird (das heißt
von solchen, welche die Bindung des HCV-Hüllproteins an einen zellulären Rezeptor beeinflussen).
Ein solcher Assay, besonders in der Form eines ELISA-Tests, findet
in der klinischen Umgebung und in dem routinemäßigen Durchmustern von Blutproben
eine beträchtliche
Anwendung.
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Weil
der Assay den Titer von neutralisierenden Antikörpern misst, bildet der Assay
ein einfaches Maß einer
mutmaßlichen
Impfwirksamkeit, wobei der Titer der neutralisierenden Antikörper mit
dem Schutz des Wirts korreliert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein diagnostisches Kit, welches das Protein der Erfindung
oder eine funktionell äquivalente
Variante oder ein funktionell äquivalentes
Fragment davon umfasst, zur Verfügung
gestellt, wie in Anspruch 1 beschrieben wird. Vorzugsweise enthält das Kit
ebenfalls mindestens ein HCV-markiertes HCV-Protein, welches gegebenenfalls
durch ein Enzym markiert ist.
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Das
Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein
funktionell äquivalentes Fragment
davon kann verwendet werden, um nach chemischen Verbindungen zu
suchen, welche die HCV-Oberflächenstruktur,
die für
die Bindung an den HCV-Rezeptor verantwortlich ist, nachahmt.
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Zur
Zeit ist das einzig erhältliche
Tiermodel der Schimpanse, der eine geschützte Art ist. Die Experimente
an solchen Tieren werfen eine Anzahl von Schwierigkeiten auf, die
zusammen zu einer sehr beträchtlichen
Ausgabe führen
(ein Experiment für
ein Jahr mit einem Schimpansen kann 70.000 $ kosten). Im Vergleich dazu
wäre ein
Mausmodell deutlich akzeptierbarer. Wie nachfolgend beschrieben
wird, ist der HCV-Rezeptor, während
im Menschen allgemein verbreitet ist und im Schimpansen gefunden
wird, leider nicht in anderen Säugern
vorhanden. Ein transgener Säuger,
zum Beispiel eine Maus, der den HCV-Rezeptor auf der Zelloberfläche trägt, würde von
großem
Nutzen für
die HCV-Forschung und für
die Entwicklung von Impfstoffen sein.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
ein schematisches Diagramm, das einen Assay beschreibt, in dem die
HCV-Rezeptor bindenden Liganden an Rezeptoren auf HCV-Rezeptor-Zielzellen
binden und zuerst durch die Bindung von Kaninchen-anti-HCV-Antikörpern und
anschließend
durch die Bindung eines markierten anti-Kaninchen-IgG-FITC F(ab')-Fragments vor der Zelltrennung mittels
einer FACScan-Analyse gemessen werden.
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2 ist ein computerhergestelltes Histogramm,
das die Ergebnisse einer FACScan-Analyse der Bindung des HCV-Proteins
an hämatopoetische
Zellen (MOLT-4, Jurkat, K562, Daudi, EBV-B) und Epithelzellen (HeLa,
Adenocarcinom und Huh 7) beschreibt, die sich aus der Bindung mit
den HCV-Proteinen ergeben (ausgefüllte Kurve unmarkierte Kontrolle,
offene Kurve markierte). Die Kurve zeigt die Zellpopulation gegen
die Intensität
der Fluoreszenz.
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3 ist ein computerhergestelltes Histogramm,
das die Ergebnisse einer FACScan-Analyse von gereinigter RA, gereinigtem
RO, gereinigter RA aus Nabelschnurblut, Pha stim. RA aus Nabelschnurblut,
einem KC3-T-Zellclon (TCC) und SAG-S9-TCC zeigt, die auf ihre Bindung
an ein rekombinantes HCV-E2-Protein, das in CHO-Zellen exprimiert
wird, getestet wurden (ausgefüllte
Kurve unmarkierte Kontrolle, offene Kurve markierte). Die Kurve
zeigt die Zellpopulation gegen die Intensität der Fluoreszenz.
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4 zeigt
eine Gruppe von computergenerierten Histogrammen, welche die Ergebnisse
einer FACScan-Analyse der Bindung von E2-CHO- an MOLT-4-Zellen mit
und ohne Behandlung mit beta-Mercaptoethanol (BSH), ein S-S-Brücken reduzierender
Wirkstoff, zeigen (ausgefüllte
Kurven unmarkierte Kontrolle, offene Kurven markierte). Die Kurve
zeigt die Zellpopulation gegen die Intensität der Fluoreszenz.
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5 zeigt
eine Gruppe von computergenerierten Histogrammen, welche die Ergebnisse
einer FACScan-Analyse der Bindung von E2-CHO- an MOLT-4-Zellen mit
und ohne Behandlung mit Endo-H, ein deglycosylierendes Enzym, zeigen
(ausgefüllte
Kurven unmarkierte Kontrolle, offene Kurven markierte). Die Kurve zeigt
die Zellpopulation gegen die Intensität der Fluoreszenz.
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6 zeigt
einen Western-Blot von Membranen, die von MOLT-4-Zellen hergestellt
und in verschiedenen Puffern löslich
gemacht wurden (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 22).
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7 zeigt
einen Western-Blot von Plasmamembran von MOLT-4-Zellen (vergl. Spurbeschriftungen auf
Seite 23).
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8 zeigt
einen Western-Blot von MOLT-4- und PBMC-Membranproteinen (vergl.
Spurbeschriftungen auf Seite 23).
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9 zeigt
einen Western-Blot von Membranproteinen, die mit N-Glycosidase F behandelt
wurden, von MOLT-4-Zellen (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 26).
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10 zeigt
einen Western-Blot von MOLT-4- und COS-7-Membranen, die unter reduzierenden
und nicht reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt
wurden (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 27).
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11 zeigt
einen Western-Blot eines Experiments, das eine Immunpräzipitation
eines E2-CHO/mutmaßlicher
Rezeptor-Komplexes zeigt (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 30).
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12 zeigt
einen Western-Blot von Ammoniumsulfat-Fraktionen von MOLT-4-Zellmembranen (vergl. Spuren
auf Seite 32)
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13 zeigt
einen Western-Blot von Proben von einem Experiment einer hydrophoben
Chromatographie mit einem Aceton-Fällungsschritt (vergl. Spuren
auf Seite 33).
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Der
Aufbau der detaillierten Beschreibung ist, wie nachfolgend aufgeführt wird:
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1. Allgemeine Beschreibung
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Falls
es nicht anders beschrieben wird, wird das Verfahren der vorliegenden
Erfindung konventionelle Techniken der Immunologie, der Cytofluorometrie
und der Molekularbiologie verwenden, die auf dem Fachgebiet bekannt
sind. Solche Techniken werden vollständig in der Literatur erklärt (7).
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Der
Fachmann wird die allgemeinen Verfahren und Techniken der Planung
und der Durchführung
des Assays verstehen und mit ihnen vertraut sein. Die Erfindung
ist hierin ausreichend detailliert beschrieben, so dass ein Fachmann
die offenbarten Experimente verstehen und wiederholen kann.
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Standardabkürzungen
für Viren
und Proteine werden in dieser Beschreibung verwendet. Hülle 1 („Envelope
1", E1) und Hülle 2 („Envelope
2", E2) von HCV
beziehen sich auf die Proteine und die Fragmente davon, deren Nucleotidsequenz
publiziert sind (EP-A-0318216 und EP-A-0388232, vorstehend zitiert).
Die Nucleotide der Gene von E1 und E2 und die codierten Proteinen
unterscheiden sich in verschiedenen HCV-Isolaten. Darum sind E1
und E2 von jedem HCV-Isolat identifiziert, weil sie in den Aminosäuresequenzen
192–383 beziehungsweise
384–750
eingeschlossen sind.
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E1
und E2 wurden durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt, wobei
verschiedene Expressionssysteme verwendet wurden (Spaete et al.
und Chien et al., vorstehend zitiert).
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2. Zelluläre Analyse
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2.1. FACS-Analyse von
Zellen, die an E2 binden
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Ein
Experiment wurde mit der Absicht durchgeführt, die Fähigkeit des HCV-Proteins zu messen,
an verschiedene Zellarten zu binden, die einen mutmaßlichen
HCV-Rezeptor besitzen sollten.
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Zellen
(105/Vertiefung) von dem menschlichen T-Zell-Lymphom
MOLT-4 (im Handel käuflich
und erhältlich
bei der American Type Culture Collection) wurden in Mikroplatten
mit 96 Vertiefungen mit U-förmigen Boden
(Costar) durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 Minuten bei 4°C pelletiert.
20 Mikroliter des HCV-Proteins (rekombinantes, in CHO exprimiertes
E2-Protein), das in PBS in verschiedenen Konzentrationen (von 10 μg/ml bis
0,001 μg/ml)
verdünnt
wurde, wurden mit dem Pellet der MOLT-4-Zellen gemischt und bei
4°C für 60 Minuten
inkubiert. Nicht gebundene HCV-Proteine wurden durch zwei Zentrifugationen
in PBS bei 200 × g
für 5 Minuten
bei 4°C
entfernt.
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Die
Zellen wurden anschließend
für 30
Minuten bei 4°C
mit verschiedenen Verdünnungen
(von 1/10 bis 1/300000) des Serums von Menschen, Schimpansen, Kaninchen
oder Mäusen,
die entweder mit HCV infiziert waren oder die mit den rekombinanten
HCV-Proteinen oder den entsprechenden Prä-Immunseren als Kontrolle immunisiert
worden waren, inkubiert.
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Die
Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und für 30 Minuten mit den geeigneten
Verdünnungen der
Fluorescein-Isothiocyanat-konjugierten Antiseren (entweder menschliches
IgG oder Kaninchen-IgG oder Maus-IgG) inkubiert.
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Die
Zellen wurden anschließend
in PBS bei 4°C
gewaschen, in 100 μl
PBS resuspendiert und die zellgebundene Fluoreszenz wurde mit einem
FACScan-Durchflusszytometer
(Becton & Dickinson)
analysiert. Durch die Verwendung einer Dot-Plot-Darstellung des
Vorwärts-
und Seitwärts-Streulichts
wird mit der Maschine ein Gaten durchgeführt, um lebende einzelne Zellen
einzuschließen
und Zelltrümmer und
Zellklumpen auszuschließen.
Eine Gesamtzahl von 5000 Ereignissen wurde gesammelt und die Analyse
der Daten wurde unter Verwendung des Lysis II-Software-Programms von Becton & Dickinson durchgeführt. Dieses
Programm stellt Histogramme von jeder Zellprobe her und berechnet
die mittlere Kanalfluoreszenz der Zellpopulation, die in einer direkten
Beziehung zu der Oberflächendichte
der mit Fluoreszenz markierten HCV-Proteine steht, die an den Zellen
gebunden sind.
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Die
Werte der mittleren Fluoreszenz (mittlere Kanalanzahl) der Zellen,
die mit oder ohne HCV-Proteine und mit Immun- oder mit Prä-Immunseren
inkubiert wurden, wurden verglichen. Der Grenzwert für die Positivität wird für jedes
Experiment durch die durchflusszytrometrische Analyse von Zellen,
an die keine HCV-Proteine gebunden sind und die mit Antiseren gegen
HCV-Proteine und dem FITC-markiertem zweiten Antikörper inkubiert
wurden, festgelegt. Ein repräsentatives
Bindungsexperiment wird in 1 gezeigt,
welche die Trennung zeigt, die durch die durchflusszytometrische
Analyse erzielt wurde.
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Das
Experiment wurde ebenfalls mit einer Vielfalt von Zelllinien (zum
Beispiel mit anderen hämatopoetische
Zellen als MOLT-4 wie z.B. Jurkat, K562, Daudi, EBV-B (eine B-Zelllinie,
die mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert wurde) und Epithelzellen
wie z.B. Hela, Adenocarcinom und Huh 7 durchgeführt, um Zellen zu identifizieren,
die fähig
sind, HCV-Proteine zu binden, und daher Zellen, die den/die mutmaßlichen
Rezeptoren) für
HCV besitzen, wobei das vorstehend beschriebene Protokoll verwendet
wurde. Man wird es zu schätzen
wissen, dass die Wiederholung dieses Experiments für die Ausführung der
vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, sondern dazu dient,
dass die allgemein verbreitete Natur des mutmaßlichen Rezeptors nachgewiesen
wird (die meisten der Zelllinien sind in jedem Fall allgemein erhältlich und
wurden tatsächlich
von der ATCC erhalten). Die Ergebnisse werden zusammen mit denen
für MOLT-4
in 2 gezeigt und zeigen, dass die
spezifische Bindung von E2 an Zellen weitverbreitet ist, was darauf
hinweist, dass der HCV-Rezeptor
allgemein verbreitet ist.
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In
einer ähnlichen
Serie von Experimenten wurden gereinigte RA, gereinigtes RO, gereinigte
RA aus Nabelschnurblut, Pha stim. RA aus Nabelschnurblut, KC3- TCC und SAG-S9-TCC
auf ihre Bindung an rekombinantes HCV-E2-Protein, das in CHO-Zellen
(E2-CHO) exprimiert wird, getestet und man stellte eine Bindung fest,
was bestätigte,
dass die Bindung an nicht transformierte Zelllinien stattfindet.
Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
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2.2. Wirkung von Modifikationen
von E2 auf die Bindung
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Die
Wirkungen der Modifizierung des rekombinanten HCV-Proteins E2, das
in CHO-Zellen (E2-CHO) exprimiert wurde, auf die Bindung an MOLT-4-Zellen
wurden untersucht, wobei ein reduzierendes Mittel und ein deglycosylierendes
Enzym verwendet wurden.
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2.2.1. Reduktion von E2
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25 μl von E2-CHO-SMC-PC
(130 μg/ml)
in 20 mM Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH-Wert 6,0, wurden auf einen
pH-Wert von 8,0 mit 1 M Tris-Base (1 μl Gesamtvolumen) gepuffert und
anschließend
wurde BSH (Beta-Mercaptoethanol) bis zu einer Endkonzentration von
500 mM zugegeben; die Röhrchen
wurden mit Stickstoff durchgespült
und man ließ die
Reaktion für
100 Minuten bei 37°C
ablaufen.
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Die
vorstehend beschriebenen Proben wurden 1:20 mit RPMI-Medium verdünnt und
in einer FACS-Bindungsanalyse mit MOLT-4-Zellen verwendet, wie vorstehend
beschrieben wurde. Die Endkonzentration von BSH in der FACS-Analyse
betrug 12,5 mM und unter diesen Bedingungen wurden in früheren vorläufigen Experimenten
nachgewiesen, dass die Zellen lebend waren (über 90% der Zellen waren bei
50 mM BSH noch lebend).
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Die
Ergebnisse in 4 zeigen, dass die Bindung von
MOLT-4-Zellen an das rekombinante E2 nach der Reduktion mit beta-Mercaptoethanol
deutlich vermindert ist, was auf eine Notwendigkeit für eine korrekte E2-Konformation,
die durch S-S-Brücken
erhalten wird, hinweist.
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2.2.2. Deglycosylierung
von E2
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Zu
25 μl von
E2-CHO-SMC-PC (130 μg/ml)
in 20 mM Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH-Wert 6,0, wurden 30 μl 0,2 M NaH2PO4 bis zu einem
entgültigem
pH-Wert von 5,5 plus SDS bis zu einer Endkonzentration 0,01 % zugegeben.
Anschließend
wurden 10 μl
der Endo-H-Vorratslösung
bis zu einer Endkonzentration von 200 mE/ml zugegeben, wobei der
pH-Wert konstant gehalten wurde und man beließ die so erhaltene Probe bei
37°C für 20 Stunden.
Die Probe wurde anschließend
1:20 mit RPMI verdünnt
und in einer FACS-Bindungsanalyse verwendet, wie vorstehend beschrieben
wurde.
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Die
Ergebnisse in 5 zeigen, dass die Bindung von
MOLT-4-Zellen an das rekombinante E2 nach der Deglycosylierung mit
Endo-H deutlich vermindert ist, was auf eine Notwendigkeit von der
Glycosylierung von E2 für
die Bindung hinweist.
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2.3. Herstellung von monoclonalen
Antikörpern
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Monoclonale
Antikörper
wurden unter Verwendung von Standardverfahren und durch die Immunisierung
von Mäusen
mit dem rekombinanten HCV-E2, das in CHO-Zellen (E2-CHO) hergestellt
wurde, hergestellt. Verschiedene Zelllinien, die zu der Bindung
an E2-CHO fähig
waren, wurden etabliert, sowie Zelllinien, die an E2, das an MOLT-4-Zellen
gebunden war, binden konnten, und Zelllinien, welche die Bindung
von E2-CHO an MOLT-4-Zellen neutralisieren konnten.
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3. Herstellung des 24
kd großen
mutmaßlichen
Rezeptors
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3.1. Herstellung eines
24 kd großen
Proteins von MOLT-4-Zellen
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Das
24 kd große
Protein wurde von MOLT-4-Zellen durch eine Membranreinigung und
durch eine Plasmamembranreinigung gereinigt, wobei das zuletzt genannte
Verfahren die bessere Ausbeute des Proteins ergab.
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3.1.1. Membranreinigung
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Man
ließ Molt-4-Zellen
bei 37°C,
5% CO2 in RPMI-Medium, das mit 25 mM Hepes
gepuffert war, in Wachstumsmedium, das Fötales Kälberserum (FCS – Endkonzentration
5%), 1 mM Glutamin, 100 μg/ml
Kanamycin, MEM-Vitamine (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat, nicht essentielle
MEM-Aminosäuren
(Gibco), 5 × 10–5 M β-Mercaptoethanol
enthielt, wachsen.
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Die
Zellen wurden geerntet, nachdem sie eine Dichte von 750.000–1.000.000
Zellen pro ml erreicht hatten.
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Das
Wachstumsmedium, das die Zellen enthielt, wurde bei 300 g für 10 Minuten
zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die pelletierten Zellen
wurden dreimal in PBS-Puffer gewaschen (resuspendiert und erneut
zentrifugiert).
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Das
Zellpellet wurde in einer hypotonen Lösung mit 1 ml der hypotonen
Lösung
pro 100 × 106 Zellen resuspendiert.
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Die
hypotone Lösung
enthielt Tris (10 mM), NaCl (10 mM), CaCl2 (0,2
mM), MgCl2 (1,5 mM), PMSF (1,0 mM), Aprotinin
(2,0 μg/ml),
Pepstatin (0,7 μg/ml)
und Leupeptin (0,5 μg/ml).
-
Man
beließ die
Zellen bei 4°C
unter leichtem Schütteln
für 20
Minuten und brach sie anschließend
mit 25 Stößen mit
einem Potter-Handhomogenisator auf.
-
Die
Membranen wurden nach einer sequentiellen Zentrifugation des Überstands
bei 100 g für
7 Minuten, 3500 g für
10 Minuten und 40.000 g für
60 Minuten gewonnen. Das Pellet, das von dem vorstehend beschriebenen
Verfahren erhalten wurde, wurde in einem geeigneten Puffer gelöst.
-
Der
Puffer, der zum Lösen
des 40.000 g-Membranpellets verwendet wurde, enthielt 1 % Triton
X-100 in PBS-Puffer, pH-Wert 7,4, 8 mM Chaps in PBS-Puffer, pH-Wert 7,4, und 4 M
Harnstoff in Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4.
-
Alle
Puffer, die zur Löslichmachung
der Membran verwendet wurden, enthielten Protease-Inhibitoren mit
Konzentrationen, die vorstehend für die hypotone Lösung beschrieben
wurden, und wurden mit einem Verhältnis von 200 μl Puffer
pro 5 × 108 Zellen verwendet.
-
Das
löslich
gemachte Material wurde bei 100.000 g für 60 Minuten zentrifugiert
und der Überstand
wurde für
die weitere Verwendung nach der Abschätzung des Proteingehalts durch
das BCA-Verfahren aufgehoben.
-
Das
erhaltene Material wurde anschließend verwendet, um die Analysen
durchzuführen,
die nachstehend beschrieben werden.
-
3.1.2. Plasmamembranreinigung
-
Das
Verfahren zur Plasmamembranreinigung basierte auf Morre' D.J. et al. (8).
-
Man
ließ Molt-4-Zellen
bei 37°C,
5% CO2 in RPMI, das mit 25 mM Hepes gepuffert
war, in einem Wachstumsmedium, das Fötales Kälberserum (FCS – Endkonzentration
5%), 1 mM Glutamin, 100 μl/ml
Kanamycin, MEM-Vitamine (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat, nicht essentielle
MEM-Aminosäuren
(Gibco), 5 × 105 M β-Mercaptoethanol
enthielt, wachsen.
-
Die
Zellen wurden aus dem Kulturmedium pelletiert und dreimal mit PBS
gewaschen.
-
Die
pelletierten Zellen wurden in 0,2 mM EDTA, 1 mM NaHCO3 in
einem Verhältnis
zwischen Puffer und Zellen von 2 ml pro 108 Zellen
resuspendiert, wobei der Puffer die nachfolgenden Protease-Inhibitoren
enthielt: PMSF (1,0 mM), Aprotinin (2,0 μg/ml), Pepstatin (0,7 μg/ml), Leupeptin
(0,5 μg/ml).
-
Die
resuspendierten Zellen wurden mit einem Polytron-Homogenisator aufgebrochen,
wobei eine S25 N10 G-Sonde für
40 Sekunden bei 9500 UpM verwendet wurde. Das Aufbrechen der Zellen
wurde durch ein optisches Mikroskop überprüft. Das Homogenat wurde bei
300 g zentrifugiert und der so erhaltene Überstand wurde erneut bei 23.500
g für 60
Minuten zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 0,2 M Kaliumphosphat, pH-Wert
7,2, der Protease-Inhibitoren enthielt, in den Verhältnissen,
die vorstehend beschrieben wurden, resuspendiert. Das Puffervolumen
betrug 1 ml pro 5 × 108 Zellen.
-
Die
Membransuspension wurde über
das nachfolgende Zwei-Phasen-System unterteilt:
20% (Gew./Gew.)
T500 Dextran 13,2 g
40% (Gew./Gew.) PEG 3350 6,6 g
0,2
KP, pH-Wert 7,2 0,8 ml
Membran-Susp. 5,0 g
Destilliertes
Wasser bis zu 35 g
-
Die
Probe wurde auf 4°C
gekühlt
und die Röhrchen
wurden 30- bis 40-mal umgedreht, wobei die Temperatur konstant gehalten
wurde. Die Probe wurde anschließend
auf einem Ausschwing-Becherrotor bei 150–200 g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Die obere Phase wurde entfernt und fünffach mit 1 mM Natriumbicarbonat,
das Protease-Inhibitoren enthielt, verdünnt. Die Membranen wurden durch
Zentrifugation bei 30.000 g für
30 Minuten gesammelt.
-
Das
Pellet wurde in einem geeigneten Puffer gelöst und bei 100.000 g für 60 Minuten
zentrifugiert, um das ungelöste
Material zu entfernen.
-
Das
so erhaltene Material wurde für
Analysen verwendet, die nachfolgend beschrieben werden.
-
3.2. Überexpremierende MOLT-4-Zellen
-
Eine
weitere Zelllinie, die zur Überexpression
der charakteristischen Bindungsfähigkeit
für E2
fähig war,
wurde durch die Auswahl und durch das erneute Clonieren von MOLT-4-Zellen,
die stark an E2 binden, hergestellt. Die so erhaltene Zelllinie
zeigte eine deutlich höhere
Bindungsaffinität
für E2
als der Wildtypstamm.
-
4. Charakterisierung
des Rezeptors
-
4.1. Protokoll des Western-Blots
-
Die
nachfolgenden Experimente zeigen die Bindung von E2 an ein gereinigtes
24 kd großes
Protein in einem Western-Blot von Proteinen von MOLT-4-Zellen, die
von Membranen und von Plasmamembranen gereinigt worden waren und
von peripheren mononucleären
Blutzellen (PBNC).
-
Wenn
es nicht anders angezeigt wird, wurden alle SDS-PAGE-Experimente
gemäß Laemmli
et al. (9) durchgeführt,
wobei die Proben der löslich
gemachten Membranen unter nichtreduzierenden Bedingungen und ohne
Kochen vor jeder elektrophoretischen Auftrennung untersucht wurden.
-
Nach
dem elektrophoretischen Transfer (Western-Blot) in einem Puffer,
der 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol enthielt, bei einem
konstanten elektrischen Feld von 10 Volt/cm wurden die geblotteten Transferträger für 2 Stunden
in einem PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4, der 0,05% Tween 20
und 10% fettarmes Milchpulver enthielt, bei Raumtemperatur gesättigt. Nach
dem Waschen für
1 × 15
Minuten und 2 × 5
Minuten in PBS, 0,05% Tween 20, das 1 % fettarmes Milchpulver enthielt,
wurden die Transferträger über Nacht
mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein,
das in PBS-Puffer, der 0,05% Tween 20, 1 % Milch, 0,02% Natriumazid
enthielt, gelöst
wurde, bei einer Konzentration von 1–2 μg/ml inkubiert.
-
Transferträger für die Negativkontrolle
(geblottet mit den gleichen Proben) wurden für den gleichen Zeitraum in
dem gleichen Puffer ohne dem E2-CHO-Protein inkubiert.
-
Um
rekombinantes E2-CHO-Protein, das an den Transferträgern gebunden
war, zu detektieren, wurden diese mit dem Kulturüberstand eines Hybridoms mit
dem Namen 291A2 (ein monoclonaler Antikörper, der Epitope erkennt,
die auf E2 exponiert sind, wenn es an seinem mutmaßlichen
Rezeptor gebunden ist) mit einer Verdünnung von 1:500 in PBS, Tween
0,05%, Milch 1% für
2 Stunden inkubiert.
-
Nach
diesem Schritt wurden die Transferträger 1 × 15 Minuten und 2 × 5 Minuten
mit einer Lösung
von PBS, Tween 0,05%, Milch 1 % gewaschen. Die Transferträger wurden
anschließend
für 1 Stunde
mit einem spezifischen, polyclonalen, mit Biotin konjugiertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper von
einer kommerziellen Quelle (Pharmingen, San Diego, CA, USA) mit
einer Verdünnung
von 1:2000 in der PBS/Tween/Milch-Lösung, die vorstehend erwähnt wurde,
inkubiert. Nach diesem Schritt wurden die Transferträger 1 × 15 Minuten
und 2 × 5
Minuten mit PBS/Tween/Milch gewaschen. Schließlich wurden die Transferträger für 1 Stunde
mit Extravidin®-Peroxidase
(Sigma Immunochemicals Co., St Louis, MO, USA) mit einer Verdünnung von
1:2500 in PBS/Tween/Milch inkubiert. Die Transferträger wurden
anschließend
1 × 15
Minuten und 4 × 5
Minuten mit einem PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4, der 0,05%
Tween 20 enthielt, gewaschen. Die Chemilumineszenzfärbung wurde
unter Verwendung von ECLTM Nachweisreagenzien
für Western-Blot-Verfahren
(Amersham, UK) durchgeführt.
-
4.1.1. Membranproteine
-
Eine
Membranherstellung wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben
wurde.
-
Die
Membranpellets, die von der 40.000 g-Zentrifugation erhalten wurden,
wurden in Puffern gelöst, die
nachfolgend beschrieben werden, und bei 100.000 g zentrifugiert,
um das nichtgelöste
Material zu entfernen. Die Pellets wurden erneut mit 1 % Triton
X-100 in PBS, pH-Wert 7,4 extrahiert.
-
Nach
der SDS-PAGE (15 μg/Spur
und dem Blot-Verfahren wurden die Transferträger mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein
inkubiert, wie vorstehend beschrieben wurde.
-
Die
Ergebnisse werden in
6 gezeigt.
Spur | Beschreibung |
1A | 4
M Harnstoff in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,2 |
2A | Pellet
der Probe von Spur 1A, in 1 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4,
löslich
gemacht |
3A | 1
% Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4 |
4A | Pellet
der Probe von Spur 3A, in 1 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4,
löslich
gemacht |
5A | 0,01
% Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4 |
6A | Pellet
der Probe von Spur 5A, in 1 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4,
löslich
gemacht |
-
1B
bis 6B sind Negativkontrollen für
die entsprechenden Proben in den Spuren 1A bis 6A.
-
Die
Proteinbande bei 24 kd ist deutlich sichtbar.
-
4.1.2. Plasmamembranproteine
-
Eine
Plasmamembranzubereitung wurde hergestellt, wie vorstehend beschrieben
wurde.
-
Die
Plasmamembranen wurden in PBS, pH-Wert 7,4, das 1 % Triton X-100
enthielt, löslich
gemacht und einer SDS-PAGE nach Laemmli unterzogen. Der Transferträger wurde
mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert.
-
Die
Ergebnisse werden in
7 gezeigt.
Spur | Beschreibung |
1A | Plasmamembranen,
10 μg Gesamtproteingehalt |
2A | Plasmamembranen,
5 μg Gesamtproteingehalt |
-
1B
und 2B sind Negativkontrollen für
die entsprechenden Proben in den Spuren 1A und 2A.
-
Die
Proteinbande bei 24 kd ist deutlich sichtbar.
-
4.1.3. Western-Blot von
PBMC-Zellen
-
Um
zu ermitteln, ob das 24 kd große
Protein in normalen Zellen identifiziert werden kann, wurde eine Probe
von peripheren mononucleären
Blutzellen gereinigt, wobei das Verfahren verwendet wurde, das vorstehend
beschrieben wurde, und einem Western-Blot-Verfahren unterzogen,
wie vorstehend beschrieben wurde.
-
Die
Ergebnisse werden in
8 gezeigt.
Spur | Beschreibung |
1/2 | Membranprotein
von MOLT-4-Zellen |
3 | Membranprotein
von PBMC (22 μg/ml) |
4 | Membranprotein
von PBMC (44 μg/ml) |
-
Die
Spuren der Negativkontrollen sind als „-E2-CHO" markiert.
-
4.2. Zelloberflächenexpression
des Rezeptors
-
Unter
der Verwendung des Protokolls, das vorstehend beschrieben wurde,
wurden verschiedene Zellarten, wobei FACScan und Western-Blot-Verfahren
verwendet wurden, auf das Vorliegen des 24 kd großen mutmaßlichen
HCV-Rezeptorproteins
untersucht.
-
Die
Ergebnisse werden nachfolgend dargestellt:
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Artenverteilung des 24 kd großen Proteins
mit der Verteilung der Anfälligkeit
für die
HCV-Infektion übereinstimmt.
-
4.3. Wirkung von Enzymen
auf die Bindung an das 24 kd große Protein
-
4.3.1. Durchflusszytometrie
-
Die
biochemische Natur der Zelloberflächenkomponente (Rezeptor),
welche die Bindung des E2-CHO-Hüllproteins
an MOLT-4-Zellen vermittelt, wurde untersucht. Eine Vorbehandlung
der MOLT-4-Zellen mit V. cholerae-Neuraminidase, die eine α-2,3-Spezifität besitzt,
vermindert nicht die E2-CHO-Bindung.
-
Die
proteinartige Natur des Rezeptors wurde gezeigt, wenn die Zellen,
die mit Proteasen vorbehandelt wurden, ihre Bindungsfähigkeit
für E2-CHO
verloren, während
die Behandlung von Zellen mit Phospholipase keinen Einfluss auf
die Bindung hatte, was darauf hinweist, dass die zellulären Bindungsproteine
nicht über einen
Glycosylphosphatilylinosit-Anker verbunden waren. Die E2-Bindungsstelle
auf MOLT-4-Zellen war empfindlich gegen alle Proteasen, die verwendet
wurden, wobei sowohl Serin-Proteasen wie z.B. Trypsin als auch eine
Thiol-Protease wie z.B. Papain eingeschlossen wurde.
-
Die
Ergebnisse der proteolytischen Behandlung zeigten die Beteiligung
von Membranproteinen bei der Bindung des Hüllproteins und waren, wie nachfolgend
dargestellt wird:
-
-
Die
Zellen (106 ml–1)
wurden für
60 min bei 37°C
in RPMI 1640/Hepes-Medium plus den Enzymen, die vorstehend angezeigt
sind, inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert, in frischem Medium
resuspendiert und mit E2-CHO-Protein (3 μg/ml) inkubiert. Ein gereinigter
monoclonaler anti-E2-CHO-Antikörper
(1,5 μg/ml)
wurde für
den zweiten Schritt verwendet. Ein gereinigter Phycoerythrin-markierter
Kaninchenanti-Maus-Antikörper (5 μg/ml) wurde
als ein Reagens für
den dritten Schritt verwendet. Eine Gesamtzahl von 5000 Zellen pro
Probe wurde mit einem FACScan-Durchflusszytometer
ausgewertet.
-
Die
Enzyme wurden in einer Konzentration verwendet, welche die Lebensfähigkeit
der Zellen nicht beeinflusste, wie durch einen Propidiumjodid-Ausschluss während der
FACS-Analyse gemessen wurde.
-
Die
Fluoreszenz wurde als willkürliche
Einheiten (Kanalanzahl) auf einer logarhitmischen Skala aufgezeichnet
und die mittleren Intensitäten
wurden bestimmt. Die Daten von individuellen Experimenten wurden
mit Bezug auf die Fluoreszenz der ungefärbten Kontrollproben normalisiert
und die Werte wurden als Prozente der Fluoreszenzintensitäten in den
gefärbten
Kontrollproben ausgedrückt.
-
4.3.2. Western-Blot von
MOLT-4/N-Glycosidase F
-
Die
Behandlung mit Peptid-N-Glycosidase F wurde durchgeführt, wobei
die Membranproteine (50 μg) über Nacht
bei 37°C
in Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 25 mM EDTA plus Enzym (50 E/ml)
inkubiert wurden und anschließend
eine 12% SDS-PAGE
durchgeführt
wurde.
-
Um
die Aktivität
des Enzyms N-Glycosidase F (PNGase F) zu zeigen, wurde als Kontrolle
gp120-Polypeptid in dem gleichen Experiment verwendet (die Daten
werden nicht gezeigt).
-
Die
Ergebnisse werden in
9 gezeigt.
Spur | Beschreibung |
1 | +/ve-Kontrolle |
2 | behandelte
und gekochte Membran |
3 | unbehandelte
und gekochte Membran |
4 | behandelte
Membran |
5 | unbehandelte
Membran |
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass durch die Behandlung von Membranherstellungen
von MOLT-4-Zellen mit Peptid-N-Glycosidase F, das alle N-gebundenen Glycane
hydrolysiert, die E2-CHO-Bindung nicht verloren geht.
-
4.4. Wirkung einer reduzierenden
Bedingung auf die Bindung
-
Ein
Western-Blot von MOLT-4- und COS-7-Membranen, die hergestellt wurden,
wie vorstehend beschrieben wurde, wurde unter reduzierenden und
nichtreduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt, um
die Notwendigkeit oder keine Notwendigkeit von Disulfidbrücken in
dem 24 kd großen
Protein durch das Messen der Bindung von E2-CHO an den Transferträger zu etablieren.
-
Die
Transferträger
wurden mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert, wie vorstehend
beschrieben wurde.
-
Die
Ergebnisse werden in
10 gezeigt.
Spur | Beschreibung |
1A | COS-7-Membranen
in nicht reduzierendem SDS-Laemmli-Puffer |
2A | MOLT-4-Membranen
in nicht reduzierendem SDS-Laemmli-Puffer |
3A | COS-7-Membranen
in SDS-Laemmli-Puffer, der 5% β-SH
enthielt |
4A | MOLT-4-Membranen
in SDS-Laemmli-Puffer, der 5% β-SH
enthielt |
-
1B
bis 4B sind Negativkontrollen für
die entsprechenden Proben in den Spuren 1A bis 4A.
-
5. Optimierung
der Reinigung
-
5.1. Immunpräzipitation
-
Die Solubilisierung
von Membranproteinen
-
Eine
Membranherstellung von 400 Millionen MOLT-4-Zellen (Unterklon A2A6)
wurde mit 200 μl PBS-Puffer,
pH-Wert 7,4, der CHAPS 7,5 mM und die nachfolgenden Protease-Inhibitoren
in μl/ml
enthielt, behandelt: PMSF 35, Aprotinin 2, Pepstatin 0,7, Leupeptin
0,5. Nach der Behandlung mit dem vorstehenden Puffer wurde die so
erhaltene Suspension bei 100.000 g für 1 Stunde zentrifugiert und
mit dem klaren Überstand wurden
Immunpräzipitationsexperimente
durchgeführt.
Die endgültige
Proteinkonzentration, die auf dem BCA-Protein-Assay (Pierce, USA)
basiert, betrug 2,7 mg/ml.
-
Inkubation mit dem rekombinanten
E2-Hüll-Protein
-
200 μl der Membranproteinlösung (2,7
mg/ml) in PBS-CHAPS wurden zu 15 μl
der von CHO hergestellten E2-Lösung
(Charge P4) zugegeben. Die Ausgangskonzentration des E2-Proteins
betrug 130 μl/ml
und die endgültige
Konzentration in der Proteinmembranlösung betrug 9,75 μg/ml.
-
Das
Gemisch wurde über
Nacht unter Rühren
bei 4°C
gehalten.
-
Inkubation mit Kaninchen-anti-E2-Antiserum
-
Die
so erhaltene Lösung
wurde in zwei Anteile von 100 μl
aufgeteilt und jeder wurde mit 5 μl
des Präimmun-
und des Postimmun-Antiserums von einem Kaninchen (R #1), das zuvor
mit dem E2-Protein immunisiert wurde, gemischt. Die Endverdünnung des
Antiserums betrug 1:20. Die Inkubation wurde für 1 Stunde bei 4°C durchgeführt.
-
Zugabe von Protein-A-Sepharose
CL-4B
-
Ein
Protein-A-Sepharose CL-4B-Harz (Pharmacia, Schweden) wurde ausgiebig
mit PBS, das 7,5 mM CHAPS mit einem pH-Wert von 7,4 enthielt, gewaschen
und 30 μl
der kompakten Aufschlämmung
(die Kapazität
der Matrix beträgt
20 mg menschliches Ig pro ml der Aufschlämmung) wurden zu jeder 100 μl-Probe, die von dem
vorherigen Schritt erhalten wurde, zugegeben. Die Inkubation wurde
unter Rühren
für 1 Stunde
bei 4°C
durchgeführt.
-
Die
Proben wurden zentrifugiert, um das Harz zu pelletieren, und der Überstand
wurde entfernt, mit Laemmli-Puffer (ohne einem reduzierenden Wirkstoff)
gemischt und für
eine SDS-PAGE aufbewahrt. Das Harz-Pellet wurde zweimal mit 500 μl PBS-CHAPS
gewaschen (jede Waschung 10 min bei 4°C) und das Pellet wurde anschließend mit
50 μl Laemmli-Puffer,
der 5 M Harnstoff enthielt, behandelt. Der so erhaltene Überstand
wurde für
eine SDS-PAGE verwendet.
-
SDS-PAGE und
Immunblot
-
Die
Proben von den vorstehend beschriebenen Schritten, dabei handelt
es sich um den Überstand, der
Material sowohl von Präimmun-
als auch Postimmun-Antiseren
enthält,
das nicht von der Protein-A-Matrix absorbiert wurde (SN), und Material,
das von der Protein-A-Matrix desorbiert wurde (ProtA), wurden auf
einem SDS-PAGE-Gel in einem nicht reduzierenden Puffer und ohne
Erhitzen geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter
Verwendung von Nitrocellulose-Papier
in 20% Methanol-Tris-Glycin-Puffer einem elektrischen Transfer und
anschließend
einer Immunfärbung
unterzogen, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Inkubation mit
dem E2-Protein wurde über
Nacht durchgeführt,
wobei E2-SMC-PC
mit 1,73 μg/ml
in PBS, 0,05% Tween 20, 1 % Milch verwendet wurde.
-
Die
Proben, die auf SDS-PAGE-Gel geladen wurden, waren:
- A) Überstand
(Material, das nicht durch Prot-A zurückgehalten wurde) von Präimmun-Antiserum,
- B) Prot-A desorbiertes Material von Präimmun-Antiserum,
- C) Überstand
von Postimmun-Antiserum und
- D) Prot-A desorbiertes Material von Postimmun-Antiserum.
-
Drei
Reihen dieser Proben wurden auf ein Gel geladen, eine wurde direkt
auf dem Gel gefärbt,
bei den anderen zwei wurde eine Immunfärbung durchgeführt, eine
wurde mit E2, das andere als Negativkontrolle inkubiert.
-
Der
Transferträger
aus Nitrocellulose wurde mit dem rekombinanten E2-CHO SMC-PC-Protein
mit 1,73 μg/ml
inkubiert, gefolgt von dem Überstand
einer 291A2-Hybridomkultur
(die einen monoclonalen Antikörper
enthielt, der Epitope erkannte, die auf E2 exponiert werden, wenn
er an seinen mutmaßlichen
Rezeptor gebunden ist), biotinyliertem polyclonalem anti-Maus-Ig-Antikörper und
Peroxidase markiertem ExtravidinTM (Sigma
Immunochemicals, USA). Bei der Chemilumineszenzfärbung, die mit ECL-Luminol
(Amersham, GB) erhalten wurde, betrug die Expositionszeit 1 Minute.
-
Die
Ergebnisse werden in
11 gezeigt.
Spur | Beschreibung |
1A | Molekulargewichtsstandard |
2A | leer |
3A | Probe,
die mit Prä-Immunserum
von Kaninchen inkubiert wurde,
- Überstand |
4A | Probe,
die mit Prä-Immunserum
von Kaninchen inkubiert wurde,
- Protein-A gebunden |
5A | Probe,
die mit Post-Immunserum von Kaninchen inkubiert wurde,
- Überstand |
6A | Probe,
die mit Post-Immunserum von Kaninchen inkubiert wurde,
- Protein-A
gebunden |
-
Die
Negativkontrollen, die auf der Nitrocellulosemembran verwendet wurden,
wurden mit Überstand von
einer 291A2-Hybridomkultur inkubiert, gefolgt von biotinylierten
polyclonalen Anti-Maus-Ig-Antikörpern und
Peroxidase markiertem Streptavidin. 1B bis 4B entsprechen 3A bis
6A.
-
5.2. Fraktionierung mittels
Ammoniumsulfat
-
Die
Membranen wurden hergestellt, wie in dem Protokoll für Membranherstellung
von MOLT-4-Zellen beschrieben wurde, und wurden in PBS-Puffer, pH-Wert 7,4,
der 8 mM CHAPS enthielt, löslich
gemacht. Die Proteinkonzentration, die auf der Basis einer BCA-Analyse
geschätzt
wurde, lag in einem Bereich von 1,8 bis 2,5 mg/ml.
-
Die
löslich
gemachten Membranen wurden mit einer mit Ammoniumsulfat (AS) gesättigten
Lösung
in einem Volumen gemischt, das ausreichend war, um eine 25% Sättigung
von Ammoniumsulfat zu erhalten (das heißt, die Endkonzentration von
AS beträgt
25% von der gesättigten
Ausgangslösung).
Man ließ die
Probe in schmelzendem Eis für
2 Stunden stehen und zentrifugierte sie anschließend bei 15800 g für 30 Minuten.
-
Der Überstand
wurde mit einer AS gesättigten
Lösung
bis zu einer Endsättigung
von 50% gemischt. Man ließ die
Probe für
2 Stunden auf schmelzendem Eis stehen und filterte sie anschließend auf
einer Spin-XTM Zentrifugenfiltereinheit
(Costar, Cambridge, MA, USA) für
15 Minuten bei 4°C.
-
Die
Präzipitate,
die vorstehend erhalten wurden, wurden in geeigneten Puffern gelöst und wurden
für eine
weitere Behandlung verwendet.
-
Die
Pellets wurden in PBS, pH-Wert 7,4, das 10 M Harnstoff enthielt,
erneut gelöst
und wurden für
ein Laemmli-SDS-PAGE verwendet. Die Volumina der AS-Fraktionen wurden
in einer solchen Weise geladen, dass die Menge des mutmaßlichen
Rezeptors in den unterschiedlichen Proben vergleichbar sein sollte.
-
Der
Transferträger
wurde mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert, wie vorstehend
beschrieben wurde.
-
Die
Ergebnisse werden in
12 gezeigt und zeigen, dass
die Fällung
von p24 in dem Bereich von 33 bis 50% der Sättigung erfolgt.
Spur | Beschreibung |
1A | Startmembranen |
2A | 20%
AS-Fraktion |
3A | 33%
AS-Fraktion |
4A | 43%
AS-Fraktion |
5A | 50%
AS-Fraktion |
6A | 60%
AS-Fraktion |
-
5.3. Hydrophobe Chromatographie
-
1,5
ml der löslich
gemachten Membranen von MOLT-4-Zellen (Proteinkonzentration 2,5
mg/ml) wurden bei einer Sättigung
von 25% Ammoniumsulfat vorfraktioniert und der Überstand von diesem Schritt
wurde auf eine Sättigung
von AS von 50% gebracht. Das so erhaltene Präzipitat wurde in 200 μl PBS, das
Ammoniumsulfat mit einer Sättigung
von 25% enthielt, resuspendiert. Das ungelöste Material wurde durch Zentrifugation
bei 15800 g für
30 Minuten pelletiert.
-
Der
so erhaltene Überstand
wurde mit 200 μl
Phenyl-Sepharose-Matrix (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die zuvor
in PBS, pH-Wert 7,2, das AS mit einer Sättigung von 25% enthielt, äquilibriert
wurde, für
2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Das
ungebundene Material wurde durch Filterung auf Spin-XTM-Zentrifugenfiltereinheiten
(Costar, USA) gewonnen.
-
Die
Matrix der Phenyl-Sepharose wurde zweimal mit 100 μl PBS, 25%
Sättigung
von AS, und einmal mit 300 ml des gleichen Puffers gewaschen. Die
Matrix wurde anschließend
mit PBS, pH-Wert 7,4, (200 μl) eluiert
und anschließend
mit PBS, pH-Wert 7,4, das 20% MeOH enthielt, gewaschen. Zum Schluss
wurde die Matrix mit 40 μl
eines nichtreduzierenden Laemmli-Puffers behandelt.
-
Die
Proben, die Ammoniumsulfat enthielten (das heißt, das ungebundene Material
und das aus der Waschung), wurden gegen 8 M Harnstoff in PBS, pH-Wert
7,4, dialysiert.
-
Mit
allen Proben wurde eine SDS-PAGE-Analyse und ein Western-Blot durchgeführt.
-
5.4. Aceton-Fällung
-
50 μl der Membranen
von MOLT-4-Zellen, die in 8 mM CHAPS in PBS, pH-Wert 7,4 löslich gemacht wurden, wurden
mit 200 μl
Aceton gemischt.
-
Die
Probe wurde bei 15800 g für
15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das
so erhaltene Präzipitat
wurde in nicht reduzierendem Laemmli-Probenpuffer gelöst und für SDS-PAGE und Western-Blot
verwendet. Die Transferträger
wurden mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert, wie vorstehend
beschrieben wurde.
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Die
Ergebnisse der kombinierten Experimente der HIC- und der Aceton-Fällung werden in
13 gezeigt.
Spur | Beschreibung |
1A | Startmembranen
(Gesamtproteingehalt 16 μl) |
2A | Material,
das nicht an der Matrix gebunden war |
3A | Waschfraktion |
4A | Material,
das mit PBS, pH-Wert 7,4, eluiert wurde |
5A | Material,
das mit PBS, pH-Wert 7,4, das 20% Methanol enthielt, eluiert wurde |
6A | Material,
das mit Laemmli-Puffer eluiert wurde |
7A | Membranen,
die in Triton 1 %, PBS, pH-Wert 7,4, (Gesamtprotein 26 μg) eluiert
wurden |
8A | Aceton-Präzipitat
von Probe 7A |
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Die
Proben von 1B bis 8B entsprechen den Proben von 1A bis 8A.
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Diese
Experimente zeigen, dass Ammoniumsulfat gefälltes Material unter geeigneten
Bedingungen wieder gelöst
werden kann und für
eine hydrophobe Interaktionschromatographie verwendet werden kann. Das
mutmaßliche
24 kd große
HCV-Rezeptorprotein bindet an Phenyl-Sepharose und kann von dieser
Matrix gewonnen werden.
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Der
Membranextrakt kann mit Aceton ohne Verlust der Bindungskapazität des mutmaßlichen
HCV-Rezeptors gefällt
werden.
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6. Seguenzierung
und Clonierung
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6.1. Aminosäuresequenz
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Die
Aminosäuresequenz
des 24 kd großen
Proteins kann entweder durch die Ableitung der clonierten DNA oder
durch Mikrosequenzierung des Proteins, das durch eines der Verfahren
hergestellt wurde, die vorstehend beschrieben wurden, ermittelt
werden. Basierend auf dem Molekulargewicht des Proteins (und dem Wissen,
dass es, falls es glycosyliert ist, nur zu einem geringen Ausmaß glycosyliert
ist) wird erwartet, dass das Protein etwa 210–230 Aminosäuren besitzen wird (wobei der
Durchschnitt von 110 Daltons pro Aminosäure angenommen wird).
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6.2. Clonierung und Seguenzierung
der DNA-Sequenz
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Die
DNA-Sequenz des 24 kd großen
Proteins kann durch eine von einer Anzahl von Techniken bestimmt
werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie z.B. die λgt11-„Schrotschuß"-Clonierung, wobei
eine DNA-Bibliothek hergestellt wird, geeigneterweise von einer überexprimierenden
Zelllinie (vergl. vorstehend), und Fragmente von DNA werden in einer
prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle exprimiert, wobei die Produkte
unter Verwendung von Antikörpern
gegen das 24 kd große
Protein oder durch die Bindung an das rekombinante E2-CHO abgesucht
werden.
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Sobald
sie identifiziert ist, kann die DNA, die das 24 kd große Protein
codiert, verwendet werden, um große Mengen des Proteins herzustellen,
das sich, als Ergebnis seiner Bindung an HCV, als nützlich in
einem Assay auf HCV-Infektion oder für die Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung einer HCV-Infektion erweisen kann.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann die DNA verwendet werden, um transgene Tiere herzustellen, die
das 24 kd große
Protein tragen, was anschließend
als Tiermodel für
die HCV-Infektion dienen kann.
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Referenzen
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- 1. Europäische
Patentanmeldung EP-A-0318216
- 2. Europäische
Patentanmeldung EP-A-0388232
- 3. Choo et al., PNAS USA (1991), 88, 2451–2455
- 4. Chien DY et al., PNAS USA (1992), 89, 10011–10015
- 5. Spaete RR et al., Virology (1992), 188, 819–830
- 6. Gething et al., Nature [benötigt vollständige Referenz]
- 7. „Flow
Cytometry" in Methods
of Cell Biology (1990), Bd. 33, Academic Press, San Diego
- 8. Morre' DJ
et al., Methods Enzymol. (1994), 228, 448–450
- 9. Laemmli et al., Nature (1970), 27, 680