DE69008859T2

DE69008859T2 - Modifizierte menschliche anti-rh(d)-antikörper.

Info

Publication number: DE69008859T2
Application number: DE69008859T
Authority: DE
Inventors: David Anstee; Alan Guest; Marion Scott
Original assignee: National Blood Authority
Current assignee: National Blood Authority
Priority date: 1989-09-01
Filing date: 1990-08-31
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2010-09-01
Also published as: AU645263B2; EP0489771A1; GB8919761D0; DE69008859D1; DK0489771T3; CA2065278A1; ATE105570T1; EP0489771B1; WO1991003492A1; AU6185690A; ES2052267T3

Description

Die Erfindung betrifft reduzierte und am S blockierte menschliche monoclonale Antikörper gegen das Rh(D)-Antigen von menschlichen Erythrocyten. Insbesondere betrifft sie solche Antikörper der Subklasse IgG3, die bei einem raschen und direkten Nachweisverfahren des Rh(D)-Antigens verwendet werden können.
Das Rhesus-Blutgruppensystem ist ein hauptsächlicher antigener Bestandteil der Membran der menschlichen Erythrocyten. Von dieser Gruppe ist das Rh(D)-Antigen im Hinblick auf Isoimmunreaktionen von besonderer klinischer Bedeutung. Ein Rh(D-)-Individuum mit anti-Rh(D), das Rh(D+)- Blut erhält, erleidet mit großer Wahrscheinlichkeit eine wesentliche Zerstörung der Erythrocyten (RBC) infolge der Inkompatibilität des Rh(D)-Phänotyps, und somit müssen Blutspender routinemäßig als Rh(D+) oder Rh(D-) klassifiziert werden.
Das Rh(D)-Antigen ist auch für die Erythroleucoblastose von Neugeborenen (HDN) verantwortlich. Dieser Zustand tritt bei neugeborenen Rh(D+)-Kindern von Rh(D-)-Müttern auf, die zuvor gegen das Rh(D)-Antigen als Folge von anti- Rh(D)-TgG-Antikörpern, die die Placenta während der Schwangerschaft durchqueren und eine fötale RBC-Zerstörung verursachen, sensibilisiert wurden. Die Sensibilisierung der Rh(D-)-Mutter gegen das Rh(D)-Antigen tritt oft während der Geburt eines früheren Rh(D+)-Kindes infolge einiger fötaler RBCs, die in den mütterlichen Blutkreislauf eintreten und vom mütterlichen Immunsystem als fremd erkannt werden, auf. Um das Auftreten von HDN zu verringern, ist es in dem Vereinigten Königreich und vielen anderen Ländern Routinepraxis, anti-Rh(D)-Antikörper Rh(D-)-Müttern unmittelbar nach der Geburt eines Rh(D+)-Kindes zu verabreichen, so daß alle Rh(D+)-RBCs, die möglicherweise in den mütterlichen Kreislauf eingetreten sind, rasch entfernt werden (Mollison, P.L. (1983) Blood Transfusion is clinical Medicine, 7. Aufl., Blackwell Scientific, Oxford; Laros Jr., R.K. (1986), "Erythroblastosis Fetalis" " in "Blood Group Disorders in Pregnancy", Kap. 7, S. 103).
Da die Rh(D)-Bluttypisierung so wichtig ist, besteht ein großes Interesse an der Einrichtung einer Technik, die sowohl rasch als auch zuverlässig ist.
Gegenwärtig werden zwei Diagnoseprotokolle routinemäßig verwendet. Bei einem Test verwendet man die indirekte Agglutination mit einem anti-D-IgG. Diese Antikörper sind bekanntlich "unvollständig"; sie können RhD(+ve)-RBCs in einer Kochsalzsuspension nicht agglutinieren. Tradionell wurde dieses Problem durch Zugabe von sogenannten Verstärkern überwunden. Dies sind biologische Polymere, wie Rinderalbumin, oder nicht-biologische Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon oder Ficoll, die die Oberfläche modifizieren und die Agglutination der Zellen durch das IgG-Reagens erlauben. Jedoch führen diese Verstärker manchmal zu einer falsch-positiven Reaktion, indem sie die unspezifische Agglutination von mit IgG umhüllten Erythrocyten hervorrufen, was bei manchen Krankheiten, beispielsweise der autoimmunerkrankungsbedingten hämolytischen Anämie der Fall ist. Folglich muß ein Kontrollreagens, das nur den Verstärker, aber kein anti-D enthält, parallel mit jedem Test bei Verwendung dieses Typs von Reagens laufen gelassen werden, was sowohl für den Hersteller als auch den Anwender kostspielig ist, da bei den Tests lange inkubiert werden muß.
Bei einem alternativen indirekten Agglutinationsverfahren ist ein zweites Reagens, das zur Agglutination der mit anti-D beschichteten RBCs verwendet werden kann, ein Antiimmunglobulinserum (Coomb's Reagens), das der Vernetzung der an verschiedene RBCs gebundenen IgG-Moleküle dient.
Bei dem anderen Test werden IgM-Antikörper gegen Rh(D) verwendet, die infolge ihrer multivalenten Natur direkte Agglutinine sind. Natürlich vorkommende polyclonale anti- D-IgMs besitzen die Nachteile, daß die Agglutinationsreaktion zeitaufwendig ist, und sie sind schwierig zu gewinnen. Einige menschliche monoclonale anti-D-IgMs sind verfügbar und können als Reagentien verwendet werden, aber sie besitzen den Nachteil, daß sie schlecht oder überhaupt nicht mit den Erythrocyten einer bestimmten D-Variante reagieren.
Daher ist es von beträchtlicher medizinischer Bedeutung, daß rasche und zuverlässige Verfahren zur Bluttypisierung gefunden werden, bei denen die Notwendigkeit der Einbringung von Sekundärreagentien vermieden wird. Es wurde gefunden, daß es möglich ist, sowohl die Reaktionszeiten als auch die Genauigkeit der Bluttypisierung zu erhöhen, indem man unvollständige polyclonale anti-D-IgGs in direkte Agglutinine umwandelt. Dies kann durch das Verfahren der Reduktion der Disulfidbindungen an der Gelenkregion des IgG-Moleküls, wie von Romans et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. 74 2531-5, 1977), durchgeführt werden. Die Autoren stellten auch fest, daß der reduzierte Antikörper, der an der Luft reoxidieren gelassen wird, sich nicht länger als direktes Agglutinin verhielt und daß diese Reversion in den unvollständigen Antikörper durch Alkylierung am S verhindert werden konnte. Ihre Ergebnisse legten nahe, daß eine milde Reduktion und Alkylierung von IgG zu einer erhöhten Flexibilität des Moleküls führte, so daß eine interzelluläre Brückenbildung eintreten konnte, wie weiter beschrieben von Michaelsen (Molec. Immunol. 25 639-46, (1988)).
Die US-4 296 090 beschreibt einen reduzierten und am S alkylierten polyclonalen anti-Rh(D)-IgG mit hohem Titer und dessen Verwendung als Reagens zur raschen Bluttypisierung, ohne die Notwendigkeit eines Verstärkers. Jedoch beschreibt keine der zitierten Druckschriften spezifisch die Umwandlung von monoclonalen Antikörper in vollständige Antikörper.
Ein monoclonaler Antikörper ist gegenüber einem polyclonalen IgG dahingehend bevorzugt, daß er einen kontinuierliche Lieferung mit Reagentien zur Bluttypisierung mit übereinstimmenden Eigenschaften erlaubt, wodurch eine größere Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Typisierung gewährleistet wird. Gegenwärtig wurden reduzierte und am S alkylierte Reagentien zur Rh(D)-Bluttypisierung auf polyclonale Antikörper einschließlich aller der IgG-Subklassen 1,2,3 und 4 beschränkt.
Die Erfinder untersuchten nun eine Reihe von 15 monoclonalen anti-D-Antikörpern der Subklassen IgG1 und IgG3, um die Bedeutung der Subklasse auf die Leistungsfähigkeit der reduzierten und alkylierten anti-D-Reagentien zu erforschen, und haben gefunden, daß reduzierte und alkylierte monoclonale IgG3-Antikörper viel effektiver bei der direkten Agglutinierung sind, als reduzierte und alkylierte monoclonale IgG1-Antikörper mit vergleichbarer Wirksamkeit vor der Behandlung. Obwohl die S-Alkylierung ein bequemes Verfahren ist, um die Reoxidation zu normalem IgG zu verhindern, ist klar, daß andere Verfahren der Blockierung am S in gleicher Weise wirksam sind.
So betrifft gemäß einem Aspekt die Erfindung reduzierte und am S blockierte anti-Rh(D)-Antikörper der Subklasse IgG3, bevorzugt monoclonale Antikörper, wobei das Reagens zur raschen Bestimmung des Rh(D)-Status von Blutproben nützlich ist.
Die Reduktion des IgG3-Antikörpers kann unter Verwendung von milden Reduktionsmitteln, die der Reduktion der S-S- Bindungen zu SH dienen, beispielsweise Mercaptanen, wie Dithiothreit, durchgeführt werden. Die Blockierung der durch die Reduktion erzeugten SH-Gruppen kann unter Verwendung geeigneter Reagentien, die normalerweise wasserlöslich sind, durchgeführt werden. Die Blockierungsgruppen umfassen Alkylgruppen (z.B. C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppen), Acylgruppen (z.B. C&sub1;&submin;&sub4;-Alkanoylgruppen) und andere Gruppen, die üblicherweise zur Blockierung oder zum Schutz von Polypeptiden am S verwendet werden, beispielsweise wie von Schroeder, E. und Lübke, K., the Peptides, Bd. 1 und 2, Academic Press, New York und London, 1965 und 1966 beschrieben. Eine bevorzugte am S blockierende Gruppe ist die Gruppe -CH&sub2;CONH&sub2;, die durch Umsetzung des reduzierten IgG3 mit Iodacetamid eingeführt werden kann. Die Blockierungsgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, und im allgemeinen tragen die Alkylgruppen solubilisierende Grupppierungen, wie Carboxyl- oder Carboxamidogruppen.
So betrifft gemäß einem weiteren Gesichtspunkt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper, bei dem man die Disulfidbindungen des Antikörpers zu Sulfhydrylgruppen reduziert, und die so gebildeten Sulfhydrylgruppen am S blockiert.
Die Erfinder haben gefunden, daß reduzierte und am S blokkierte IgG3-Rh(D)-Antikörper den reduzierten und am S blockierten IgG1-Antikörpern in zwei Hauptgesichtspunkten überlegen sind. Zuerst ergeben sie eine viel höhere Trefferquote bei direkten Agglutinationstests, die im wesentlichen denjenigen im indirekten Albumintest gleich oder überlegen sind, während die entsprechenden IgG1 beachtlich niedrige Trefferraten, oft null, ergeben. Zweitens wurde gefunden, daß die reduzierten und am S blockierten IgGs einen sogenannten "Vorzoneneffekt" bei höheren Antikörperkonzentrationen ergeben, der sie bei der Rh(D)-Bluttypisierung unzuverlässig macht; es wurde gefunden, daß sie eine anfängliche Trefferquote in dem direkten Agglutinationstest ergeben, der im Verlauf von wenigen Minuten sich auf einen niedrigeren Wert verringert.
15 monoclonale anti-D-Antikörper wurden untersucht, 6 der Subklasse IgG3, die als A4, A5, A7, A8, E1, E2 bezeichnet werden und 9 der Subklasse IgG1, nämlich A1, B7, B8, B11, B13, E3, E4, E5, E6. Viele dieser Zellinien wurden in der EP-A-8 730 629.7, der WO 89/02442, der WO 89/02600, der WO 89/02443 beschrieben. Die als A7 und B7 bezeichneten monoclonalen Antikörper produzierenden Zellinien wurden bei der European Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, UK, unter den Hinterlegungsnummern 87091606 und 87091603 am 16. September 1987 hinterlegt.
Während monoclonale Antikörper von speziellem Interesse sind, zeigten die Versuche der Erfinder, daß polyclonale anti-D-IgG3-Antikörper bei Reduktion und Alkylierung die gleichen Vorteile gegenüber reduzierten und alkylierten IgG1-Antikörpern zeigen, wie sie von den entsprechenden monoclonalen Antikörpern gezeigt wurden. Polyclonale anti- D-IgG3-Antikörper können durch selektive Affinitätschromatographie von den polyclonales IgG enthaltenden Subklassen 1, 2, 3 und 4 erhalten werden.
Die Überstände der Gewebskultur aus den diese Antikörper produzierenden Zellinien enthalten variierende Konzentrationen an monoclonalem anti-D-Antikörper mit variierender Affinität. Jeder wurde in seinem unbehandelten Zustand nach einer Albuminersatztechnik titriert, bei der Antikörper positive Zellen in einem Medium mit einer hohen Albuminkonzentration agglutinieren. Keine Subklassenkorrelation wurde beobachtet (Tabelle 1). Die Antikörper wurden mit Dithiothreit reduziert, mit Iodacetamid alkyliert und dann als direkte Agglutinine der RBCs in Kochsalzsuspension titriert (Tabelle 1).
Um die Abweichung, die durch Variationen der Antikörperkonzentration und der Affinität verursacht wurde, zu beseitigen, wurden die Antikörper gemäß dem Verhältnis, das zwischen der Trefferquote bei der Titration nach Reduktion und Alkylierung und dem vor einer solchen Behandlung, aber unter Zusatz von Albumin, berechnet wurde, eingeordnet. Die Tabelle 1 zeigt einen sehr klaren Unterschied zwischen IgG3 und IgG1. Die IgG3s ergaben beständig höhere Trefferquoten, die denjenigen, die unter Verwendung des indirekten Albuminverfahrens erhalten wurden, im wesentlichen gleich oder größer als diese waren, während die IgG1s eine viel niedrigere Trefferquote als bei dem indirekten Verfahren (oft null) ergaben. Einzelheiten des Bewertungssystems sind in dem nachstehenden Beispiel 1 angegeben.
Um alle Veränderungen in der Antikörperkonzentration oder Affinität, die durch die Reduktions- und Alkylierungsverfahren verursacht werden können, zu berücksichtigen, wurden die Antikörper auch nach der Behandlung auf ihre Fähigkeit, mit Bromelain behandelte RBCs in Kochsalzlösung zu agglutinieren, getestet. Dieses proteolytische Enzym macht die RBCs durch unvollständige Antikörper agglutinierbar, und daher ist jede Agglutinationsreaktion, die beobachtet wird, unabhängig vom Reduktions- und Alkylierungsverfahren. Eine solche Eingruppierung war unabhängig von der Subklasse (Tabelle 1), obwohl eine andere Reihenfolge als bei dem Albuminersatz unbehandelter Zellen erhalten wurde. Auf ähnliche Weise zeigte das Verhältnis der Trefferquote, bewertet durch Titration, vor Reduktion und Alkylierung (d.h. durch Albuminersatz) gegenüber dem nach Reduktion und Alkylierung (von mit Bromelain behandelten Zellen) keine Korrelation mit der Antikörper-Subklasse. Tabelle 1 Reaktion der monoclonalen Antikörper vor und nach der Reduktion und Alkylierung Trefferquote bei der Titration Antikörper Subklasse Reduziert und alkyliert. Direkte Agglutination Unbehandelt. Albuminersatz Reduziert und alkyliert. Mit Bromelain behandelt Verhältnis R+A/Albumin Subklassendurchschnitt R+A/Albumin Verhältnis Bromelain/Albumin
Die Figur 1, die eine Analyse einiger der monoclonalen Antikörper sowohl vor als auch nach Reduktion und Alkylierung durch eine nicht-reduzierende Polyacrylamidgelelektrophorese und Immunblotting zeigt, bestätigt, daß die Reduktions- und Alkylierungsverfahren effektiv sind. Vor der Reduktion und Alkylierung zeigten alle Antikörper eine Anfärbung der schweren Kette bei einem Molekulargewicht bei 150.000 bis 170.000, was dem intakten IgG entspricht. Alle vier Antikörper zeigten eine vollständige Trennung der schweren Ketten nach Reduktion und Alkylierung, wobei die schwere Kette von IgG1 nun bei einem Molekulargewicht bei 50.000 und die von IgG3 bei etwa 65.000 wandert.
Wie vorstehend angegeben, wurde ein weiterer Unterschied zwischen den IgG-Subklassen gefunden, der für die Nützlichkeit der anti-Rh(D)-IgGs, bei Reduktion und Alkylierung, zur Agglutination von RBCs relevant ist. Es ist Tatsache, daß reduzierte und alkylierte IgG1s zu einem Vorzoneneffekt neigen. Dieser Effekt tritt bei hohen Antikörperkonzentrationen auf und führt zu einer Verringerung der erwarteten Agglutinationsstärke mit fortschreitender Inkubationszeit im direkten Agglutinationstest. In einer experimentellen Versuchsreihe mit Erythrocytenantikörpern werden hohe Agglutinationsgrade von Erythrocyten bei hohen Konzentrationen des Antikörpers erwartet, welche mit zunehmender Verdünnung des Antikörpers abnehmen. Wenn jedoch der Antikörper im Überschuß bezüglich des verfügbaren Antigens auf den Erythrocyten vorhanden ist, kann manchmal ein niedrigerer Agglutinationsgrad bei einer hohen Antikörperkonzentration beobachtet werden. Bei dieser Situation liegt genügend Antikörper vor, um das verfügbare Antigen auf den Erythrocyten durch monovalente Bindung zu sättigen, so daß eine Vernetzung und daher Agglutination nicht eintreten kann. Die Tabelle 2 zeigt die Entwicklung der Vorzonene bei 15minütiger Inkubation bei der direkten Agglutination mit den 15 monoclonalen Antikörpern. Nur einer der IgG3-Antikörper (A8) zeigt eine schwache Vorzone. Im Gegensatz dazu zeigen sieben der neun IgG1 ausgeprägte Vorzonen. Die anderen zwei IgG1 zeigten keine oder eine schwache Reaktion. Einzelheiten des verwendeten Bewertungssystems sind in dem nachstehenden Beispiel 1 angegeben. Tabelle 2 Entwicklung von Vorzonen mit reduziertem und alkyliertem monoclonalem IgG Titration Antikörper Subklasse Inkubationszeit Verdünnung Gesamt
Es ist klar, daß bei der routinemäßigen Bluttypisierung nur eine einzige Verdünnung aus ökonomischen Gründen angemessen ist, so daß ein falscher niedriger Wert infolge der Vorzonenbildung nicht nachgewiesen werden würde.
Bei der routinemäßigen Bluttestung wurde offensichtlich, daß es mehrere Varianten des D-Antigens gibt. Die Bluttypisierung durch Agglutination mit anti-Rh(D) teilt die Bluttypen anhand des offensichtlichen Vorhandenseins/Fehlens von Rh(D)-Antigen in entweder Rh(D+) oder Rh(D-). Jedoch besitzt eine kleine Anzahl von Personen mit offensichtlich Rh(D-)-Blut RBCs, die durch anti-Rh(D) während eines solchen Routinetests nicht direkt agglutiniert werden, die aber reagieren, wenn ein Test zur D-Typisierung unter Verwendung ausgewählter anti-Rh(D)-Reagentien nach dem indirekten Antiglobulintest durchgeführt wird. Die so identifizierten Zellen werden als Du bezeichnet. Die Häufigkeit des Du-Phänotyps beträgt insgesamt etwa 0,2%, 0,6% unter Kaukasiern, und etwa 1,5% aller schwangeren Rh(D-)-Frauen. Mindestens drei verschiedene Mechanismen können für die Expression des Du-Phänotyps verantwortlich sein: (1) erbliches Fehlen eines Teils des vollständigen Rh(D)-Antigens, (2) Gen-Interaktion unter Suppression des Rhesusgens D durch C in der trans-Postion, und (3) ein D-Gen, das ein schwaches Antigen produziert.
In den frühen 1950er Jahren erschienen erstmalig Berichte zum Vorhandensein von anti-Rh(D) bei Individuen des Du- Phänotyps nach Bluttransfusion mit Rh(D+)-Blut oder nach Schwangerschaft, die zur Geburt eines Rh(D+)-Kindes führte. Später wurde offensichtlich, daß bei einigen Menschen, deren Blut als Rh(D+ klassifiziert ist, Teile des Rh(D)-Antigens den RBCs fehlen. Bei Exposition gegenüber Rh(D+)-RBCs, die das vollständige Rh(D)-Antigen tragen, durch Transfusion oder Schwangerschaft, können Personen, die ein unvollständiges Rh(D)-Antigen auf ihren RBCs tragen, ein Alloanti-D gegen den Rh(D)-Antigenteil, der ihnen fehlt, bilden. Das Blut solcher Menschen wird als D-Variante bezeichnet, wenn die RBCs direkt mit den routinemäßigen anti-Rh(D)-Reagentien reagieren, oder Du-Variante, wenn die Zellen nur gemäß der indirekten Antiglobulintechnik reagieren.
Die Beobachtung, daß Alloanti-Rh(D) in Patienten, die Rh(D+)-RBCs bilden, produziert werden können, führten zum allgemeinen Gebrauch des Ausdrucks "D-Mosaik", um das Rh(D)-Antigen in seiner vollständigen nativen Form zu beschreiben. Routinemäßige anti-Rh(D)-Reagentien können im allgemeinen zwischen denjenigen RBCs, denen ein Teil des D-Mosaiks fehlt, und den denjenigen, die alle D-Komponenten besitzen, nicht unterscheiden.
Die Phänotypen der D-Variante wurden von Tippett und Sanger (Vox. Sang. (1962) 7, 9-13) kategorisiert. Dieses System beruht auf der Wechselwirkung von RBCs und dem Serum aus Individuen mit der D(-ve)- und Du-Variante. Die sechs Kategorien (siehe nachstehende Tabelle 3) besitzen Raum zur Erweiterung; Unterteilungen sind bereits in den Kategorien III, IV und V anerkannt. Es wurde gefunden, daß die Kategorien I und II so viele Ähnlichkeiten besitzen, daß sie nun allgemein als eine einzige Untergruppe gelten können. Tabelle 3 Tippett- und Sanger-Kategorien für D- oder Du-positives Blut mit anti-Rh(D) Kategorie Rassenursprung Üblicher Haplotyp¹ Weiß Schwarz Üblicherweise schwarz Meistens schwarz, einige weiß Schwarz und Weiß Fast alle weiß ¹Haplotyp bezeichnet die drei Paare von allelischen Genen, C-c, D-d und E-e, die an sehr eng verknüpften Genorten wirken, die den Rh-Phänotyp der RBCs gemäß dem Fisher- Race-System definieren.
Eine alternative, aber weniger verwendete Klassifizierung von Wiener verwendet die Buchstaben A,B,C,D anstelle der römischen Ziffern. Obwohl keine direkte Korrelation zwischen den zwei Systemen besteht, wird oft angenommen, daß DB und DVI untereinander austauschbar sind.
Obwohl die Häufigkeit der Individuen mit der D- und Du-Variante in der menschlichen Population relativ niedrig ist, ist die Gesamtzahl der Personen mit diesen Bluttypen, die ein gewisses potentielles Risiko einer effektiven anti- Rh(D)-Bildung als Ergebnis der Exposition über Bluttransfusion oder Schwangerschaft gegenüber Nicht-Varianten- Rh(D+)-Zellen besitzen, keineswegs unbedeutend.
Da gefunden wurde, daß es eine Anzahl von Varianten von D(+ve)-Zellen gibt, die nicht immer ein positives Ergebnis ergeben, ist es wünschenswert, daß jedes beliebige Antikörperreagens zur Bluttypisierung solche Varianten beherrschen kann. Im allgemeinen wird daher ein erfindungsgemäßer reduzierter und alkylierter IgG3, zweckmäßigerweise im Gemisch mit einem oder mehreren weiteren monoclonalen anti-D-Antikörpern mit einer oder mehreren zusätzlichen Bindungsspezifitäten, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
Es gibt zwei Typen der Zellen der Variante D(+ve). Zelltypen in niedriger Konzentration mit der Bezeichnung Du sind quantitative Varianten. Sie können nicht alle durch direkte Agglutination mit den gegenwärtig verfügbaren Reagentien nachgewiesen werden. Diese sind entweder IgMs, die in einem Antiglobulintest zum Nachweis dieser Varianten nicht verwendet werden können, da es keine anti-IgM- Komponente bei den verwendeten herkömmlichen Antiglobulinreagentien gibt, oder IgGs, die nur zusammen mit Albumin oder anderen Verstärkern verwendet werden können. So besitzen die erfindungsgemäßen reduzierten und am S blokkierten IgG3-Moleküle den Vorteil, daß sie im direkten Agglutinationstest verwendet werden können, um RhD(+ve)s nachzuweisen, und daß sie dann zur Unterscheidung der Du- Varianten von echten D(-ve)-Varianten in einem in situ-Antiglobulintest verwendet werden können.
Der zweite Typ der RhD(+ve)-Variante ist die qualitative Variante. Das D-Antigen besteht aus verschiedenen Epitopen. Einigen Individuen fehlen einige dieser Epitope, und so besitzen sie ein partielles D-Antigen, aber in einer normalen Konzentration. Weil ihnen ein Teil des D-Antigens fehlt, können sie jedoch einen Antikörper gegen diesen Teil bilden, und bei falscher Typisierung als D-negativ können Zellen mit einer qualitativen D-Variante eine starke Antikörperantwort bei D(-ve)-Individuen hervorrufen.
Die Erfinder erzeugten monoclonale IgG3-Antikörper, die RBCs mit allen bekannten D-Varianten, ausgenommen die Kategorie DVI, für die sie einen monoclonalen IgG1-Antikörper besitzen, erkennen. Es sollte betont werden, daß Zellen mit der DVI-Variante selten sind.
Daher betrifft gemäß einem weiteren Aspekt die Erfindung ein Gemisch aus monoclonalen Antikörpern mit der Fähigkeit zur Erkennung im wesentlichen aller Rh(D)-Varianten, wobei das Gemisch aus einem reduzierten und alkylierten IgG3, der in einem Antiglobulintest alle Varianten außer DVI erkennt, mit einem nicht-reduzierten IgG1 der DVI-Varianten erkennt, besteht. Unter solchen Antikörpern umfassen die besonders bevorzugten A7, A8 und B7.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung dieses Antikörpergemisches, wobei das Verfahren einen direkten Agglutinationstest umfaßt, mit dem alle normalen D(+ve)-Zellen, Dus in "hoher Konzentration" (Grenzlinie) und Varianten außer DVI in einem Analysengang nachgewiesen werden. Irgendwelche negativen Proben werden anschließend einem Antiglobulintest unterworfen, in dem die IgG3- und IgG1-Komponenten Du-Varianten, und die IgG1-Komponente die DVI-Varianten nachweisen.
Wenn die Erythrocyten mit dem Antikörper inkubiert wurden, müssen die Zellen normalerweise vor Zugabe des Antiglobulinreagenses gewaschen werden. Dies hat den Grund darin, daß sonst freie Immunglobuline aus dem den Antikörper enthaltenden Reagens das Antiglobulinreagens neutralisieren und keine Agglutination der Antikörper-beschichteten Zellen eintritt. Bei Verwendung von polyclonalem anti-D zum Nachweis von Dus in einem Antiglobulintest ist es notwendig, die Erythrocyten dreimal nach der Inkubation mit anti-D vor der Zugabe des Antiglobulins zu waschen. Dies hat den Grund darin, daß das polyclonale Reagens hohe Gehalte von Immunglobulinen aus normalem Serum enthält, die mit den Erythrocyten nicht reagieren. Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße monoclonale Mischreagens beträchtliche Vorteile in dieser Hinsicht besitzt, da das gesamte Immunglobulin in diesem Reagens der anti-D-Spezifität angehört, und daher der Hauptteil davon mit den D(+ve)-Zellen reagiert. Wenig freies Immunglobulin bleibt nach der Inkubation zurück.
Die Erfinder haben das erfindungsgemäße reduzierte und alkylierte monoclonale anti-D-Mischreagens mit einem herkömmlichen anti-D-Reagens, das polyclonale anti-D-Antikörper enthält, verglichen, wobei keine, eine und drei Waschungen vor der Zugabe des Antiglobulins durchgeführt wurden. Die Bewertung mittels Titration, die in der nachstehenden Tabelle 4 gezeigt ist, zeigt, daß, während das polyclonale Antikörper enthaltende Reagens drei Waschungen vor der Zugabe des Antiglobulins benötigt, das erfindungsgemäße monoclonale Reagens nur eine Waschung benötigt. Dies verleiht dem erfindungsgemäßen Reagens einen signifikanten Effektivitätsvorteil bei der Testung auf Du. Tabelle 4 Anzahl der Waschungen, die vor der Durchführung der Antiglobulinzugabe bei Verwendung von reduziertem und alkyliertem monoclonalem anti-D-Gemisch benötigt werden Verdünnung des Reagenses Waschungen Reagens* Zelle Gesamt * Reagens - P = polyclonales Reagens; M = R&A monoclonales Mischreagens
Die Wirksamkeit eines solchen Antikörpergemisches ist in Tabelle 5 gezeigt, wobei eine Reihe von Zellen mit bekannter Rh-D-Subklasse verwendet wurde. Die Zellen, die normales Rh-D-Antigen exprimieren, erzielen hohe Trefferquoten mit dem Gemisch bei der direkten Agglutination, während Du- und DVI-Varianten nicht nachgewiesen werden. Jedoch werden diese Varianten bei der indirekten Agglutination mit dem mit dem Antiglobulin vermischten Antikörper (AGT) nachgewiesen. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß diese Varianten in keiner Stufe durch die positive Kontrolle von anti-D-IgM nachgewiesen werden, da dieses Reagens derartige D-Varianten nicht erkennt, und das bei der indirekten Agglutination verwendete Antiglobulinreagens für IgG spezifisch ist. Tabelle 5 Bewertung des Gemisches aus reduziertem und alkyliertem anti-D-IgG3 mit anti-D-IgG1 Trefferquote bei der Titration Durchgang bei 20ºC Zelle T = Testprobe S = positive Standardkontrolle (anti-D-IgM) AB = inertes AB-Serum (negative Kontrolle)
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein pharmazeutisches Präparat bereitgestellt, das mindestens einen erfindungsgemäßen reduzierten und am S blockierten Antikörper zusammen mit mindestens einem pharmazeutischen Träger oder Excipiens zur Verwendung zur passiven Immunisierung einer Mutter mit Rh(D-)- oder Du-Variante nach der Geburt eines Rh(D+)-Kindes zur Verhinderung der Sensibilisierung der Mutter gegen das Rh(D)-Antigen umfaßt. Um ein hochwirksames prophylaktisches Präparat zur Verhinderung der HDN bereitzustellen, kann ein erfindungsgemäßer monoclonaler Antikörper mit einem oder mehreren weiteren anti- Rh(D)-Antikörpern verwendet werden.
Weitere Einzelheiten des Reagens es sind in den nachstehenden nicht-beschränkenden Beispielen angegeben.

Beispiel 1

(i) Monoclonale Antikörper

(a) Zellinien, die die monoclonalen Antikörper produzieren

Alle verwendeten Antikörper stammten aus menschlichen monoclonalen Zellinien, die in Gewebskultur nach Standardverfahren, wie in der EP-A-87 303 629.7, der GB-A-8 722 018, der GB-A-8 722 019 und der GB-8 722 020 beschrieben, gezüchtet wurden.
Die monoclonalen Antikörper der Subklasse IgG3 waren A4, A5, A7, A8, E1, E2 und diejenigen der Subklasse IgG1 waren A1, B7, B8, B11, E3, E4, E5, E6. Die Antikörper A1, A4, A5, A7, A8, B7, B8, B11, B13, E1, E3, E6 stammten von mit dem EBV (Epstein Barr Virus) transformierten menschlichen peripheren Blutlymphocyten, produziert von Kumpel et al (Kumpel, B.M., Poole, G.D. und Bradley, B.A., Brit. J. Haemtol 71, 125-129 (1989)). Die Antikörper E2, E4, E5 stammten von mit menschlichem EBV transformierten Lymphocyten, die mit einer Maus-Myeloma-Zellinie fusioniert worden waren, und wurden von Thompson et al (Thompson, K.M., Hough, D.W., Maddison, P.J., Melamed, M.D. und Huges-Jones, N. J. Immunol. Meth. 94 7-12 (1986)) produziert.

(b) Reduktion und Alkylierung von IgG

Ein gleiches Volumen von gesättigter Ammoniumsulfatlösung wurde zum Überstand einer anti-D-Gewebskultur unter Rühren gegeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter sanftem Rühren stehengelassen. (Alternativ wurde festes Ammoniumsulfat dem Überstand unter starkem Rühren zugesetzt, bis eine Endsättigung an Ammoniumsulfat von 50% erhalten wurde). Das Präparat wurde 10 Minuten bei 3900 g zentrifugiert. Das Präzipitat wurde zweimal mit 50%iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung gewaschen und dann in 1/5 des Ausgangsüberstandsvolumens an 0,5 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0 wiederaufgelöst.
110 ul/ml IgG-Lösung von frisch zubereitetem 0,1 M Dithiothreit (DTT) in 0,5 M Tris/HCl-Puffer wurden zugesetzt. Es wurde vermischt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. 110 ul/ml IgG-Lösung von frisch zubereiteten 0,21 M Iodacetamid (IAA) in dem Tris-Puffer wurden zugesetzt, und es wurde vermischt und 30 Minuten lang bei 4ºC inkubiert. Die so erhaltene Lösung wurde gegen Phosphat- gepufferte Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 (PBS) dialysiert. 30%iges Rinderserumalbumin (BSA) wurde zugesetzt, wodurch eine Endkonzentration an BSA von 2,5% erhalten wurde.

(ii) Serologie

(a) Direktes Agglutinationsverfahren

Fünfzig Mikroliter von dreimal gewaschenen 3%igen Erythrocyten in PBS wurden zu 100 ul der zu testenden Probe in einem 12 x 75 mm Reagensglas gegeben, und das Reagensglas wurde eine Minute bei 37ºC inkubiert und dann sofort eine Minute lang bei 110 g zentrifugiert. Die am Boden zusammengeballten Zellen wurden sachte vom Boden des Reagensglases entfernt, und die Zellen wurden durch sanftes Schütteln resuspendiert. Der Agglutinationsgrad wurde auf einer Skala von 0 bis 6, wobei nur die Grade 1 und 2 mikrokospisch sichtbar waren, bewertet.

(b) Albuminersatzverfahren

Fünfzig Mikroliter von dreimal gewaschenen 3%igen Erythrocyten in PBS wurden zu 100 ul der zu testenden Probe in einem 12 x 75 mm Reagensglas gegeben, und das Reagensglas wurde eine Minute bei 37ºC inkubiert und dann sofort bei 110 g zentrifugiert. Die Reagensgläser wurden schräg gehalten, und 50 ul 30%iges BSA wurde an der Seite der Reagensgläser herablaufen gelassen, um die am Boden zusammengeballten Zellen zu überschichten. Die Reagensgläser wurden weitere 15 Minuten bei 37ºC ohne Vermischen inkubiert, und dann wurde der Agglutinationsgrad wie vorstehend bewertet.

(c) Bromelainbehandlung

0,1 g Bromelain (Hughes & Hughes) wurde zu 20 ml PBS gegeben. Die Suspension wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann 2 Minuten bei 2100 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und auf 100 ml mit PBS aufgefüllt. Die Testerythrocyten wurden in einer Konzentration von 3% in der Bromelainlösung 15 Minuten bei Raumtemperatur suspendiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in einer Konzentration von 3% in PBS resuspendiert. Die mit Bromelain behandelten Erythrocyten wurden dann im direkten Agglutinationsverfahren wie vorstehend verwendet.
Die Proben wurden nach diesen drei Techniken durch Titration (von 1/2 bis 1/1024, Verdünnungen in PBS, enthaltend 2,5% BSA) gegen Zellen der Gruppe OR&sub1;r getestet und unverdünnt gegen Zellen der Gruppe Orr getestet. Die Trefferquote bei der Titration wurde für jeden Antikörper bei jeder Technik durch Addition der Agglutinationsgrade für jede Verdünnung zusammen erhalten.

(d) Elektrophorese und Immunblotting

Proben von IgG vor und nach Reduktion und Alkylierung wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf 3-15%igem Polyacrylamidgelen mit linearen Gradienten unter Verwendung eines diskontinuierlichen Puffersystems (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-684) analysiert. Nach der Elektrophorese wurden die getrennten Proteine auf Nitrocellulose (Towbin et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354) elektrisch geblottet. Sie wurden mit Immunperoxidase bezüglich der schweren Kette von IgG unter Verwendung von mit Peroxidase konjugiertem anti-menschlichem-IgG-Fc (Serotec) und Diaminobenzidin als Substrat angefärbt. Der so erhaltene Blot ist in der beigefügten Figur 1 gezeigt, worin die Bahnen 1 und 2 dem Antikörper E4 (IgG1), die Bahnen 3 und 4 dem Antikörper E5 (IgG1), die Bahnen 5 und 6 dem Antikörper B7 (IgG1) und die Bahnen 7 und 8 dem Antikörper A8 (IgG3) entsprechen. Die Bahnen 1, 3, 5 und 7 sind vor Reduktion und Alkylierung und die Bahnen 2, 4, 6 und 8 nach Reduktion und Alkylierung und die Molekulargewichte (x 1000) sind neben Bahn 1 angegeben.

Beispiel 2

Lösung zur Rh(D)-Typisierung von RBCs

Im allgemeinen ist es bevorzugt, ein Gemisch aus einem monoclonalen anti-Rh(D)-IgG3-Antikörper gemäß der Erfindung (z.B. A8) mit einem weiteren monoclonalen IgG1-Antikörper mit anti-DVI-Aktivität, beispielsweise B7, zu verwenden.

Lösung zum manuellen Gebrauch

Abschließende Gemische, die verwendet werden können, sind
1. 9:1 reduziert und blockiert A8:B7
2. 9:1 reduziert und blockiert A7:B7
Diese Gemische können in allen manuellen Tests zur D- und Du-Typisierung, z.B. im Reagensglas oder auf der Mikrotiterplatte, verwendet werden.

Beispiel 3

Subklassenabhängigkeit der Reduktion und Alkylierung von polyclonalem anti-D-IgG

Die mit der Zusammenstellung monoclonaler Antikörper erhaltenen Ergebnisse sagen voraus, daß die wichtige Komponente der reduzierten und alkylierten polyclonalen anti-D- IgG-Seren IgG3 ist. Frühere Studien von Romans et al (Proc Natl. Acad. Sci. 74, 2531-5 (1977)) und US-A-4 296 090 sprachen die Subklassen der Antikörper nicht an.
Die Erfinder trennten menschliche polyclonale anti-D-IgG in Fraktionen, die an IgG1,2 und 4 reich waren, und IgG3- reiche Fraktionen durch Affinitätschromatographie auf Protein G-Sepharose (die alle IgG-Subklassen bindet) und Protein A-Sepharose (die alle IgG-Subklassen außer IgG3 bindet). Die Reinheit der Fraktionen wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen bewertet, und bezüglich des Gesamtproteins wurde eine Färbung mit Coomassie Blau vorgenommen. Die schweren Ketten von IgG1,2 und 4 besitzen alle das gleiche Molekulargewicht (etwa 50.000), wohingegen die schwere Kette von IgG3 signifikant schwerer ist (etwa 60.000). Die leichten Ketten aller Subklassen besitzen das gleiche Molekulargewicht (27.000). Densitometrische Abtastungen der Gele zeigten, daß die IgG1,2,4-Fraktion keinen nachweisbaren Gehalt an IgG3 enthielt, aber daß die IgG3-Fraktion etwa 30% Verunreinigung mit IgG1,2 oder 4 enthielt.
Die Fraktionen wurden vor und nach der Reduktion und Alkylierung nach den gleichen Verfahren, wie für die monoclonalen Antikörper verwendet wurden, bewertet. Die Trefferquoten bei der Titration für verschiedene Antikörperverdünnungen, die in Tabelle 6 gezeigt sind, zeigen, daß, wie bei den monoclonalen Antikörpern, die IgG3-reichen Fraktionen ein höheres Verhältnis an serologischer Aktivität nach der Behandlung zu der vor der Behandlung als die IgG1,2,4-Fraktionen ergibt.
Die Beobachtungen der Erfinder zur Subklassenabhängigkeit der Leistungsfähigkeit der reduzierten und alkylierten monoclonalen anti-D-IgG-Reagentien gelten daher auch für reduzierte und alkylierte polyclonale anti-D-IgG-Reagentien. Tabelle 6 Reaktionen der polyclonalen Antikörper vor und nach der Reduktion und Alkylierung Trefferquote bei der Titration Verdünnung VERHÄLTNIS FRAKTION TECHNIK Zeit Gesamt ALBUMIN ENZYM DIREKT Verhältnis 1 = R+A/Albumin Verhältnis 2 = R+A/Enzym Verhältnis 3 = R+A/R+A Enzym

Claims

1) Reduzierter und am S blockierter menschlicher Anti- Rh(D)-Antikörper der Subklasse IgG3.

2) Antikörper nach Anspruch 1, der ein monoclonaler Antikörper ist.

3) Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, der eine reduzierte und am S blockierte Form des von der Zellinie ECACC 87091606 produzierten monoclonalen Antikörpers ist.

4) Antikörper nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin die am S blockierenden Gruppen gegebenenfalls substituierte Alkyl- oder Acylreste sind.

5) Antikörper nach Anspruch 4, worin die am S blockierende Gruppe -CH&sub2;CONH&sub2; ist.

6) Anti-Rh(D)-Reagenz, umfassend einen monoclonalen Antikörper nach Anspruch 2 in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Anti-Rh(D)-Antikörpern mit einer oder mehreren zusätzlichen Bindungsspezifitäten.

7) Anti-Rh(D)-Reagenz nach Anspruch 6, umfassend einen monoclonalen Antikörper, der alle Rh(D)-Varianten außer DVI erkennt, und einen nichtreduzierten monoclonalen IgG1-Antikörper mit Anti-DVI-Aktivität.

8) Reagenz nach Anspruch 7, worin der monoclonale IgG1- Antikörper der von der Zellinie ECACC 87091603 produzierte ist.

9) Verfahren zur Rh-Typisierung, worin ein Antikörper nach Anspruch 1 in einem direkten Agglutinationstest verwendet wird.

10) Verfahren zur Rh-Typisierung, worin das Reagenz nach Anspruch 7 in einem direkten Agglutinationstest verwendet wird, und negative Proben anschließend einem Antiglobulintest unterworfen werden, mit dem die Du- und DVI-Varianten nachgewiesen werden.

11) Verfahren zur Rh-Typisierung nach Anspruch 10, worin die Erythrocyten nach dem direkten Agglutinationstest vor dem Antiglobulintest einmal gewaschen werden.

12) Pharmazeutisches Präparat zur Verwendung zur passiven Immunisierung zur Verhütung der Erythroleukoblastose bei Neugeborenen, umfassend mindestens einen Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem physiologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

13) Verfahren zur Herstellung des Antikörpers nach Anspruch 1, wobei man die Disulfidbindungen davon zu Sulfhydrylgruppen reduziert und die so gebildeten Sulfhydrylgruppen am S blockiert.

14) Verfahren nach Anspruch 13, worin das Reduktionsmittel wasserlöslich ist.

15) Verfahren nach Anspruch 13, worin die am S blockierende Gruppe ein gegebenenfalls substituierter Alkyl- oder Acylrest ist.