ES2327316T3 - Sondas, conjuntos de sondas, metodos y kits que se refieren a la deteccion, identificacion y/o enumeracion de bacterias. - Google Patents
Sondas, conjuntos de sondas, metodos y kits que se refieren a la deteccion, identificacion y/o enumeracion de bacterias. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para detectar, identificar y/o cuantificar específicamente bacterias del género Salmonella entre otros organismos detectables con los que puede experimentar reacción cruzada una sonda para las bacterias Salmonella, cuyo método comprende: (a) poner en contacto la muestra, en condiciones de hibridación adecuadas, con una o más sondas detectables adecuadas para detectar, identificar y/o cuantificar bacterias del género Salmonella; (b) poner en contacto la muestra, en condiciones de hibridación adecuadas, con una o más sondas detectables independientemente que son específicas para uno o más de otros organismos detectables con los que la sonda o sondas detectables para las bacterias Salmonella pueden experimentar reacción cruzada, en donde la sonda o sondas detectables independientemente no experimentan por sí mismas reacción cruzada con las bacterias Salmonella; (c) determinar la hibridación de la secuencia de nucleobases de sonda de las sondas detectables y detectables independientemente con sus secuencias de ácidos nucleicos diana, por detección de los complejos de sonda/secuencia diana de la muestra; y (d) determinar la presencia, ausencia y/o número de organismos que están marcados con ambas sondas, la sonda o sondas detectables y la sonda o sondas detectables independientemente, por lo que las bacterias que están marcadas con la sonda o sondas detectables y no con la sonda o sondas detectables independientemente pueden ser determinadas específicamente, detectando, identificando y/o cuantificando específicamente con ello las bacterias del género Salmonella de la muestra.
Description
Sondas, conjuntos de sondas, métodos y kits que
se refieren a la detección, identificación y/o enumeración de
bacterias.
Esta invención se refiere al campo de la
detección, análisis y/o cuantificación a base de sondas, de
organismos en general y, en particular, bacterias del género
Salmonella.
La hibridación de ácidos nucleicos es un
procedimiento fundamental de biología molecular. Los ensayos a base
de sondas sin útiles para la detección, cuantificación y/o análisis
de ácidos nucleicos. Sondas de ácidos nucleicos han sido usadas
durante largo tiempo para analizar muestras y detectar la presencia
de ácidos nucleicos procedentes de bacterias, hongos, virus u otros
organismos, y también son útiles para examinar estados de
enfermedad de base genética o condiciones clínicas de interés. No
obstante. los ensayos a base de sondas han sido lentos en la
consecución de éxito comercial. Esta carencia de éxito comercial es,
al menos en parte, el resultado de dificultades asociadas con la
especificidad, sensibilidad y/o fiabilidad.
Los ensayos de hibridación se presentan
prometedores como medios de examinar números grandes de muestras
para determinar condiciones de interés. En la práctica, sin embargo,
es con frecuencia difícil multiplexar un ensayo de hibridación
dado el requisito de que cada una de las sondas del ensayo, muy
diferentes, deben poner de manifiesto un muy alto grado de
especificidad para un ácido nucleico diana específico con las mismas
condiciones de rigurosidad o similares. Dadas las dificultades en
cuanto a especificidad, sensibilidad y fiabilidad de las sondas de
ácidos nucleicos empleadas en ensayos destinados a detectar un único
ácido nucleico diana, han sido especialmente difíciles de encontrar
métodos sensible y fidedignos para el análisis multiplexado de
muestras.
A pesar de su nombre, el Ácido Nucleico
Peptídico (Peptide Nucleic Acid) (PNA) no es ni un péptido ni un
ácido nucleico ni un ácido. El Ácido Nucleico Peptídico
(PNA) es una poliamida no natural que puede hibridarse con
los ácidos nucleicos (DNA y RNA) con especificidad de secuencia
(Véanse: la Patente de Estados Unidos No. 5.539.082 y la
publicación de Egholm et al., Nature 365:
566-568 (1993)). Al ser una molécula no natural, no
se conoce un PNA sin modificar sea un sustrato para las enzimas que
se conoce que degradan péptidos o ácidos nucleicos. Por
consiguiente, el PNA debe ser estable en muestras biológicas, así
como tener un período de caducidad largo. A diferencia de la
hibridación de ácidos nucleicos, que depende en gran medida de la
fuerza iónica, la hibridación de un PNA con un ácido nucleico es
claramente independiente de la fuerza iónica y está favorecida a
fuerza iónica baja, condiciones que desfavorecen fuertemente la
hibridación de ácidos nucleicos con ácidos nucleicos (Egholm et
al., Nature, página 567). El efecto de la fuerza iónica
sobre la estabilidad y conformación de complejos de PNA ha sido
investigado extensamente (Tomac et al., J. Am. Chem. Soc.
118:5544-5552 (1996)), La discriminación secuencial
es más eficaz para que el PNA reconozca DNA que para que el DNA
reconozca DNA (Egholm et al., Nature, página 566). No
obstante, las ventajas de la discriminación de mutaciones puntuales
con sondas de PNA en comparación con sondas de DNA, en ensayos de
hibridación, parece ser dependiente un tanto de las secuencias
(Nielsen et al., Anti-Cancer Drug Design
8:53-65 (1993) y Weiler et al., Nucl. Acids
Res. 25:2792-2799
(1997)).
(1997)).
Aún cuando ellos se hibridan con ácidos
nucleicos con especificidad secuencial (Véase: Egholm et al.,
Nature, página 567), los PNAs han sido lentos en conseguir éxito
comercial, al menos parcialmente, debido al costo, propiedades
específicas de la secuencia/problemas asociados con la solubilidad y
la auto-agregación (Véanse: Bergman F., Bannwarth,
W y Tam, S., Tett. Lett. 36:6823-6826 (1995),
Haaima, G., Lohse, A., Buchardt, O. y Nielsen, P.E. Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 35:1939-1942 (1996) y Lesnik, E.,
Hassman, F., Barbeau, J., Teng, K. y Weiler, K., Nucleosides and
Nucleotides, 16:1775-1779 (1997) en la pag. 433,
col. 1, In 28 a col. 2, In.3) así como la incertidumbre referente a
interacciones inespecíficas que pudieran tener lugar en sistemas
complejos tales como una célula (Véase la publicación de Good, L.
et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Development
7:431-437 (1997)). Debido a sus propiedades únicas,
está claro que el PNA no es el equivalente de un ácido nucleico
tanto en lo referente a estructura como a función. Por consiguiente,
las sondas de PNA necesitan ser evaluadas para determinar su
comportamiento y confirmar con ello si pueden ser usadas para
detectar específicamente y de modo fidedigno una secuencia diana
particular de un ácido nucleico, especialmente cuando la secuencia
diana existe en una muestra compleja tal como una célula, un tejido
o un organismo.
Esta invención está dirigida hacia un método
para detectar, identificar y/o cuantificar (enumerar)
específicamente bacterias del género Salmonella de una muestra,
entre otros organismos detectables con los que las sondas para las
bacterias del género Salmonella pueden experimentar reacción
cruzada. El método comprende poner en contacto la muestra, en
condiciones de hibridación adecuadas, con una o más sondas adecuadas
para detectar, identificar y/o cuantificar bacterias del género
Salmonella, así como con una o más sondas detectables
independientemente que son específicas para uno o más de otros
organismos detectables con los que las sondas detectables para las
bacterias del género Salmonella pueden experimentar reacción
cruzada, en donde las sondas detectables independientemente no
experimentan por si mismas reacción cruzada con las bacterias del
género Salmonella. La hibridación, en condiciones de hibridación
adecuadas, de la secuencia de nucleobases que sirve de sonda, de
las sondas detectables y detectables independientemente con sus
secuencias diana, se determina después detectando directa o
indirectamente los complejos de sonda/secuencia diana de la muestra.
Después se determina la presencia, ausencia y/o número de
organismos que son teñidos con ambas sondas, las sondas detectable y
la sondas detectables independientemente, de modo que aquellas
bacterias que han sido marcadas solamente con la sonda o sondas
detectables, pueden ser determinadas específicamente con fines de
detección, identificación y/o cuantificación específicas de la
bacterias Salmonella existentes en la muestra. De este modo, se
lleva a cabo una corrección realizada por el carácter inespecífico
de la sonda o sondas escogidas para la detección específica de
bacterias
Salmonella.
Salmonella.
Debido a que este método pueden ser utilizado
para determinar específicamente los organismos que manifiestan
reactividad cruzada con las bacterias Salmonella de interés, esta
invención facilita el uso en un ensayo de sondas de especificidad
menor que óptima, para determinar específicamente bacterias
Salmonella en una muestra de interés. Incluso si la secuencia o
secuencias de las sondas escogidas no son, o no pueden hacerse,
específicas para las bacterias Salmonella que se pretende
determinar, es posible sustraer los organismos que manifiestan
reactividad cruzada, consiguiendo con ello la especificidad deseada.
El único requisito es que la sonda o sondas detectables
independientemente escogidas para detectar el organismo u organismos
inconvenientes, no manifiesten por sí mismas reactividad cruzada
con la bacteria Salmonella de interés.
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a. Tal como se utiliza en esta memoria, el
término "nucleobase" significa aquellos restos heterocíclicos
naturales y no naturales, conocidos comúnmente por los expertos que
utilizan la tecnología de los ácidos nucleicos o que utilizan la
tecnología de los ácidos nucleicos peptídicos. para generar con
ellos polímeros que pueden unirse específicamente por secuencias a
los ácidos nucleicos.
b. Tal como se utiliza en esta memoria, la
expresión "secuencia de nucleobases" significa cualquier
segmento de un polímero que comprende subunidades que contienen
nucleobases. Ejemplos no limitativos de polímeros adecuados o
segmentos de polímeros adecuados incluyen oligodesoxinucleótidos,
oligorribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos, análogos de
ácidos nucleicos, imitaciones de ácidos nucleicos y/o quimeras.
c. Tal como se utiliza en esta memoria, la
expresión "secuencia diana" significa la secuencia de
nucleobases que ha de ser detectada en un ensayo.
d. Tal como se utiliza en esta memoria, el
término "sonda" significa un polímero (por ejemplo, un DNA,
RNA, PNA, quimera o polímero enlazado) que tiene una secuencia de
nucleobases de sonda, destinado a hibridarse específicamente por
secuencias a una secuencia diana de una molécula diana de un
organismo de interés.
e. Tal como se utiliza en esta memoria
"teñido" significa que las bacterias individuales están
marcadas para su detección, identificación y/o cuantificación.
f. Tal como se utiliza en esta memoria, la
expresión "ácido nucleico peptídico" o PNA, significa un
oligómero, un polímero enlazado o un oligómero quimérico que
comprende dos o más subunidades de PNA (restos), incluyendo
cualquiera de los polímeros a los que se hace referencia o se
reivindica como ácidos nucleicos peptídicos en las patentes de
Estados Unidos Nos. 5.539.082, 5.527.675, 5.623.049, 5.714.331,
5.736.336, 5.773.571, 5.786.461, 5.837.459, 5.891.625,
5.972.610 y 5.986.053. La expresión "ácido nucleico peptídico"
ó "PNA" se aplica también a polímeros que comprenden dos o más
subunidades de aquellas imitaciones de ácidos nucleicos que se
describen en las publicaciones siguientes: Diderischen et
al., Tett. Lett. 37:475-478 (1996); Fujii et
al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:637-627 (1997);
Jordan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.
7:687-690 (1997); Krotiz et al., Tett. Lett.
36:6941-6944 (1995); Lagriffoul et al.,
Bioorg. Med. Chem. Lett, 4: 1081-1082 (1994); Lowe
et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1997)
1:539-546; Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin
Trans. 11:547-554 (1997); Lowe et al., J.
Chem. Soc. Perkin Trans. 11:555.560 (1997), Petersen et al.,
Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:793-796 (1996);
Diederischen, U., Bioorganic and Med. Chem. Lett., 8:
165-168 (1998); Cantin et al., Tett. Lett.,
38: 4211-4214 (1997); Ciapetti et al.,
Tetrahedron, 53: 1167-1176 (1997); Lagriffoule et
al., Chem. Eur. J., 3: 912-919 (1997) y la
publicación Peptide-Based Nucleic Acid Mimics
(PENAMs) de Shah et al., según se describe en el
documento
WO96/04000.
WO96/04000.
\newpage
En realizaciones preferidas, un PNA es un
polímero que comprende dos o más subunidades de la fórmula:
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en la que cada J es igual o
diferente y está seleccionado entre el grupo que consiste en H,
R^{1}, OR^{1}, SR^{1}, NHR^{1}, NR^{1}, F, Cl, Br y I.
Cada K es igual o diferente y está seleccionado entre el grupo que
consiste en O, S,
NH y NR^{1}. Cada R^{1} es igual o diferente y es un grupo alquilo que tiene uno a cinco átomos de carbono, que puede contener opcionalmente un heteroátomo o un grupo arilo sustituido o sin sustituir, Cada A está seleccionado entre el grupo que consiste de un enlace sencillo, un grupo de la fórmula -(CJ_{2})_{s}- y un grupo de la fórmula
-(CJ_{2})_{s}C(O)-, en cuyas fórmulas J es como se ha definido y s es un número entero desde uno a cinco. El número entero t es 1 ó 2, y el número entero u es 1 ó 2. Cada L es igual o diferente y está seleccionado, independientemente, entre el grupo que consiste en J, adenina, citosina, guanina, timina, uridina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudoisocitosina, 2-tiouracilo, 2-tiotimidina, otros análogos de nucleobases naturales, otras nucleobases no naturales, restos aromáticos sustituidos o sin sustituir, biotina, fluoresceína y dabcilo. En la realización más preferida, una unidad de PNA consiste en una nucleobase natural o no natural unida al nitrógeno aza de la cadena principal de la N-[2-(aminoetil)]glicina a través de un enlace carbonílico
metilénico.
NH y NR^{1}. Cada R^{1} es igual o diferente y es un grupo alquilo que tiene uno a cinco átomos de carbono, que puede contener opcionalmente un heteroátomo o un grupo arilo sustituido o sin sustituir, Cada A está seleccionado entre el grupo que consiste de un enlace sencillo, un grupo de la fórmula -(CJ_{2})_{s}- y un grupo de la fórmula
-(CJ_{2})_{s}C(O)-, en cuyas fórmulas J es como se ha definido y s es un número entero desde uno a cinco. El número entero t es 1 ó 2, y el número entero u es 1 ó 2. Cada L es igual o diferente y está seleccionado, independientemente, entre el grupo que consiste en J, adenina, citosina, guanina, timina, uridina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudoisocitosina, 2-tiouracilo, 2-tiotimidina, otros análogos de nucleobases naturales, otras nucleobases no naturales, restos aromáticos sustituidos o sin sustituir, biotina, fluoresceína y dabcilo. En la realización más preferida, una unidad de PNA consiste en una nucleobase natural o no natural unida al nitrógeno aza de la cadena principal de la N-[2-(aminoetil)]glicina a través de un enlace carbonílico
metilénico.
g. Tal como se utiliza en esta memoria, el
término "marcador" y la expresión "resto detectable" son
intercambiables y se refieren a restos que pueden estar unidos a
una sonda, un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, haciendo
con ello que la sonda, anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea
detectable mediante un instrumento o un
método.
método.
h. Tal como se utiliza en esta memoria, el
término "quimera" o la expresión "oligómero quimérico"
significa un oligómero que comprende dos o más subunidades
enlazadas que están seleccionadas entre diferentes clases de
subunidades. Por ejemplo, una quimera de PNA/DNA comprendería al
menos dos subunidades de PNA enlazadas a una subunidad, por lo
menos, de ácido 2-desoxirribonucleico; (para
métodos y composiciones ejemplares relacionados con la preparación
de quimeras de PNA/DNA véase el documento WO96/40709). Subunidades
componentes ejemplares de la quimera están seleccionadas entre el
grupo que consiste en subunidades de PNA, subunidades de
aminoácidos naturales y no naturales, subunidades de DNA,
subunidades de RNA y subunidades de análogos o imitaciones de
ácidos nucleicos.
i. Tal como se utiliza en esta memoria, la
expresión "polímero enlazado" significa un polímero que
comprende dos o más segmentos de polímeros que están enlazados por
un engarce. Los segmentos de polímeros que están enlazados formando
el polímero enlazado están seleccionados entre el grupo que consiste
en un oligodesoxinucleótido (DNA), un oligorribonucleótido (RNA),
un péptido, una poliamida, un ácido nucleico peptídico (PNA) y
una
quimera.
quimera.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de oligómeros de ácidos nucleicos
(oligonucleótidos y oligorribonucleótidos) ha llegado a ser
rutinaria. Para una descripción detallada de la síntesis de ácidos
nucleicos véase la publicación de Gait, M.J., Oligonucleotide
Synthesis: a Practical Approach. IRL Pres, Oxford England. Los de
experiencia ordinaria en la técnica podrán reconocer que de ambos
oligonucleótidos, marcados y sin marcar (DNA, RNA y sus análogos
sintéticos) se dispone con facilidad. Estos compuestos pueden ser
sintetizados usando instrumentación y reactivos de que se dispone
en el comercio o pueden adquirirse de firmas comerciales vendedoras
de oligonucleótidos fabricados habitualmente. Las patentes que
discuten diversas composiciones, soportes y metodologías para la
síntesis y marcado de ácidos nucleicos, incluyen las Nos. 5.476.925,
5.453.496, 5.446.137, 5.419.966, 5.391.723, 5.391.667,
5.380.833, 5.348.868, 5.281.701, 5.278.302, 5.262.530,
5.243.038, 5.218.103, 5.204.456, 5.204.455, 5.198.540,
5.175.209, 5.164.491, 5.112.962, 5.071.974,
5.047.524, 4.980.460, 4.923.901, 4.786.724, 4.725.677, 4.659.774, 4.500.707, 4.458.066 y 4.415.732.
5.047.524, 4.980.460, 4.923.901, 4.786.724, 4.725.677, 4.659.774, 4.500.707, 4.458.066 y 4.415.732.
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Métodos de acoplamiento químico de PNAs son bien
conocidos (Véanse las patentes Nos. 5.539.082, 5.527.675,
5.623.049, 5.714.331, 5.736.336, 5,773.571, 5.786.461,
5.837.459, 5.891.625, 5.972.610 y 5.986.053. Compuestos químicos
e instrumentación para realizar el acoplamiento químico automatizado
de unión a soportes, de ácidos nucleicos peptídicos, están
disponibles en la actualidad en el comercio. Ambos tipos de
oligómeros de PNA, marcados y sin marcar, pueden adquirirse,
probablemente, de compañías comerciales vendedoras de oligómeros de
PNA habituales. El acoplamiento químico de un PNA es análogo al de
la síntesis de péptidos en fase sólida, en la que en cada ciclo de
acoplamiento el oligómero posee un término reactivo alquilamino que
es condensado con el elemento de síntesis siguiente que ha des ser
añadido al polímero en crecimiento. Debido a que se utiliza la
química estándar de péptidos, aminoácidos naturales y no naturales
son incorporados rutinariamente en un polímero de PNA. Puesto que
el PNA es una poliamida, posee un extremo C-terminal
(término carboxilo) y un extremo N-terminal
(término amino). Con fines de diseño de una sonda de hibridación
adecuada para unión antiparalela a la secuencia diana (la
orientación preferida) el extremo N-terminal de la
secuencia de nucleobases de sonda del PNA es equivalente del
extremo 5'-hidroxilo-terminal de un
oligonucleótido de DNA ó RNA equivalente.
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Métodos no limitantes, preferidos, para marcar
PNAs están descritos en los documentos US 6.110.676,
WO99/22018, WO99/21881, WO99/49293 y WO99/37670, la sección de ejemplos de esta memoria descriptiva o de otro modo, son bien conocidos en la técnica de la síntesis de PNA y en la síntesis de péptidos,
WO99/22018, WO99/21881, WO99/49293 y WO99/37670, la sección de ejemplos de esta memoria descriptiva o de otro modo, son bien conocidos en la técnica de la síntesis de PNA y en la síntesis de péptidos,
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Ejemplos no limitantes de grupos detectables
(marcadores) adecuados para marcar sondas o anticuerpos, usados en
la práctica de esta invención, podrían incluir un conjugado de
dextrano, un sistema de detección de ácidos nucleicos ramificados,
un cromóforo, un fluoróforo, una marcador de giro, un radioisótopo,
una enzima, un hapteno, un éster de acridinio y un compuesto
quimiluminiscente. Otros reactivos marcadores adecuados y métodos
preferidos de unión podrían ser reconocidos por los expertos en la
técnica de las síntesis de PNA, péptidos o ácidos
nucleicos.
nucleicos.
Los haptenos preferidos incluyen la
5(6)-carboxifluoresceína, el
2,4-dinitrofenilo, la digoxigenina y la biotina.
Los fluorocromos preferidos (fluoróforos)
incluyen la 5(6)-carboxifluoresceína (Flu),
el ácido
6-((7-amino-4-metilcumarin-3-acetil)amino)-hexanoico
(Cou), la 5(y
6)-carboxi-X-rodamina
(Rox), el Colorante Cianina 2 (Cy2), el colorante Cianina 3 (Cy3),
el colorante Cianina 3.5/Cy3.5) el colorante Cianina 5 (Cy5), el
colorante Cianina 5.5 (Cy5.5) el Colorante Cianina 7 (Cy7) y el
Colorante Cianina 9 (Cy9)( los colorantes Cianinas 2, 3, 3.5, 5 y
5.5 pueden adquirirse como ésteres NHS, de Amersham, Arlington
Heights, IL)JOE, Tamara o la serie de colorantes Alexa
(Molecular Probes, Eugene, OR).
Las enzimas preferidas incluyen polimerasas (por
ejemplo, Taq polimerasa, polimerasa de PNA de Klenow, polimerasa de
T7 DNA, Sequenasa, DNA polimerasa 1 y phi29 polimerasa), fosfatasa
alcalina (AP), peroxidasa de rábano picante (HRP) y, lo más
preferible peroxidasa de judías de soja (SBP).
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En esta invención, se lleva a cabo un ensayo de
hibridación multiplexado. En un ensayo multiplexado, numerosas
condiciones de interés sin examinadas simultáneamente. Los análisis
multiplexados se basan en la capacidad de clasificar componentes de
una muestra o los datos asociados con ello, durante o después de
haber sido completado el ensayo. En realizaciones preferidas de la
invención se usan uno o más restos diferentes detectables
independientemente, para marcar dos o más sondas diferentes usadas
en un ensayo. La capacidad para diferenciar y/o cuantificar entre
cada uno de los restos detectables independientemente, proporciona
los medios para multiplexar un ensayo de hibridación puesto que los
datos que están relacionados con la hibridación de cada una de las
sondas marcadas de modo diferente (independientemente) con una
secuencia diana particular, pueden correlacionarse con la presencia,
ausencia o cantidad de cada organismo que se pretende detectar en
la muestra. Por consiguiente, los ensayos multiplexados de esta
invención pueden ser usados para detectar simultáneamente la
presencia, ausencia o cantidad de dos o más organismos existentes
en la misma muestra y en el mismo ensayo.
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Las sondas que se usan para la práctica de esta
invención no necesitan ser marcadas con un resto detectable para
que sean operables dentro de los métodos de esta invención. Es
posible detectar el complejo sonda/secuencia diana formado por
hibridación de la secuencia de nucleobases de sonda con la
secuencia diana, usando un anticuerpo escogido para unirse al
complejo sonda/secuencia diana. Como ejemplo no limitativo, un
complejo PNA/ácido nucleico podría ser detectado usando un
anticuerpo que reaccionara específicamente con el complejo, en
condiciones adecuadas de unión del anticuerpo. Anticuerpos
adecuados para complejos de PNA/ácido nucleico y métodos para su
preparación y uso, figuran descritos en la Solicitud de Patente WIPO
WO95/17430 así como en el documento US 5.612.458. De modo
semejante. anticuerpos para híbridos de DNA/DNA son conocidos en la
técnica y pueden obtenerse y usarse como se describe en el
documento US 5.200.313.
Dada la discusión antes expuesta, se hace
evidente que las sondas detectables y detectables independientemente
que se discuten en esta memoria, pueden seleccionarse para ser de
tipos diferentes de modo que sus híbridos puedan distinguirse
(sonda detectables/secuencia diana diferenciada de la sonda
detectable independientemente/secuencia diana). Sin embargo, la
diferencia entre estos híbridos depende de qué tipo (por ejemplo
DNA, RNA ó PNA) de sonda haya sido escogida para cada una de las
sondas, detectable y detectable independientemente, ya que pueden
usarse anticuerpos específicos, detectables independientemente, para
unirse a las composiciones de sonda/secuencia diana que
difieren.
Por ejemplo, todas las sondas detectables
pueden ser PNA y todas las sondas detectables independientemente
pueden ser DNA o RNA. Todos los complejos de PNA/secuencia diana
podrán ser detectables de este modo usando un anticuerpo detectable
para el complejo de PNA/secuencia diana, pero el complejo de DNA o
RNA/secuencia diana no será detectado usando tal anticuerpo. Sin
embargo, todos los complejos de DNA o RNA/secuencia diana son
detectables independientemente usando un anticuerpo detectable
independientemente para dicho único complejo de DNA o RNA/secuencia
diana. Es importante considerar que el complejo de PNA/secuencia
diana no será detectable usando dicho anticuerpo detectable
independientemente. Por tanto, queda claro que la sonda de esta
invención no necesita ser marcada directamente con restos
detectable para que pueda operar dentro de los métodos (incluyendo
métodos multiplexados) que se describen en esta memoria, en tanto en
cuanto las sondas puedan ser hechas detectables y detectables
independientemente.
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Los marcadores unidos a las sondas "Beacon"
(faros) comprenden un conjunto (al que se alude más adelante como
Set(s)" Beacon") de restos que transfieren energía que
comprenden al menos un donante de transferencia de energía y al
menos un resto aceptador de transferencia de energía. Típicamente el
Set "Beacon" puede incluir un resto donante único y un resto
aceptador único. No obstante, un Set "Beacon" puede contener
más de un resto de donante y/o más de un resto de aceptador. Los
restos de donante y aceptador operan de modo que uno o más restos
de aceptadores acepta la energía transferida desde el uno o más
restos de donante o, de otro modo, apagan la señal que procede del
resto o restos donantes. Aun cuando los fluoróforos anteriormente
indicados (con propiedades espectrales adecuadas) podrían operar
también como aceptadores de transferencia de energía, de
preferencia, el resto aceptador es un resto de apagamiento.
Preferiblemente, el resto de apagamiento es un resto no
fluorescente aromático o heteroaromático. El resto de apagamiento
preferido es el ácido
4-((-4-(dimetilamino)fenil)azo)benzoico
(dabcilo).
(dabcilo).
La transferencia de energía entre los restos de
donante y aceptador de una sonda "Beacon" puede tener lugar
por colisión de los restos estrechamente asociados de un Set
"Beacon" o mediante un proceso no radiativo tal como
transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). Para que
ocurra la FRET, la transferencia de energía entre los restos de
donantes y aceptadores de un Set "Beacon" requiere que los
restos estén próximos en el espacio y que el espectro de emisión
del donante o donantes se solape sustancialmente con el espectro de
absorción del aceptador o aceptadores. (véase la publicación de
Yaron et al., en Anaytical Biochemistry,
95:228-235 (1979) y, en particular, la pag. 232,
col. 1, a la pag. 234, col 1). Alternativamente, la transferencia
de energía mediada por colisión (sin radiación) puede tener lugar
entre restos de donantes y aceptadores muy estrechamente asociados,
tanto si o no el espectro de emisión del resto o restos de
donantes tiene un solapamiento sustancial con el espectro de
absorción del resto o restos de aceptadores (véase la publicación de
Yaron et al., en Analytical Biochemistry,
95:228-235 (1979) y en particular la pag. 229, col.
1, a la pag. 232. col 1). A este proceso se hace referencia como
colisión intramolecular ya que se opina que el apagamiento es
ocasionado por el contacto directo de los restos de donantes y
aceptadores (véase la publicación de Yaron et al., )
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la sonda
"Beacon" auto-indicativa es un "Beacon"
Lineal tal como se describe mas completamente en la Solicitud de
Patente en tramitación junto con la presente, de propiedad común,
USSN 09/179.162, titulada "Métodos, Kits y Composiciones que
pertenecen a Beacons Lineales"
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la sonda
"Beacon" auto-indicativa es un "Beacon"
Molecular de PNA como se describe más completamente en la solicitud
de patente en tramitación junto con la presente USSN 09/179.298,
titulada "Métodos, Kits y Composiciones que pertenecen a Beacons
Moleculares de PNA"
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la sonda
"Beacon" auto-indicativa es una "Beacon"
molecular de ácido nucleico como se describe más completamente en
el documento US 5.925.517 titulado "Sondas, Ensayos y Kits de
oligonucleótidos de conformación doble marcados
detectablemente".
\vskip1.000000\baselineskip
La formación de un híbrido de una sonda
"Beacon" auto-indicativa con una secuencia
diana, puede ser determinada midiendo al menos una propiedad física
de por lo menos un miembro del Set "Beacon" que sea diferente
detectablemente al formarse el complejo de hibridación, en
comparación con el caso en que la sonda "Beacon" existe en
ausencia de secuencia diana. A este fenómeno se alude como la
propiedad auto-indicativa de las sondas
"Beacon". Este cambio de la señal detectable resulta del
cambio de eficacia de la transferencia de energía entre el donante
y el aceptador, ocasionada por hibridación de la sonda
"Beacon" a la secuencia diana. De preferencia, los medios de
detección pueden implicar la medida de la fluorescencia de un
fluoróforo de un donante o un aceptador de un Set "Beacon". Lo
más preferible, el Set "Beacon" puede comprender al menos un
fluoróforo de un donante y al menos un apagador de un aceptador, de
modo que la fluorescencia del fluoróforo del donante puede ser
usada para detectar, identificar o cuantificar la hibridación de la
sonda con la secuencia diana.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, las sondas
auto-indicativas usadas en esta invención son del
tipo descrito en la solicitud de patente WIPO WO97/45539. Las
sondas auto-indicativas descritas en el documento
WO97/45539 difieren principalmente en comparación con las sondas
"Beacon" en que el informador debe reaccionar con el ácido
nucleico para producir una señal. De preferencia, las sondas del
documento WO97/45539, tal como se utilizan en esta invención, son
ácidos nucleicos apropiadamente marcados que producen una señal
detectable por hibridación con la secuencia diana.
\vskip1.000000\baselineskip
En general, se usan espaciadores para reducir al
mínimo los efectos adversos que reactivos marcadores voluminosos
pudieran tener sobre las propiedades de hibridación de las sondas.
Los engarces, típicamente, inducen en la sonda flexibilidad y
alatoriedad o, de otro modo, enlazan dos o más secuencias de
nucleobases de una sonda. Los restos de espaciador/engarce para los
polímeros de nucleobases de esta invención, consisten en uno o más
ácidos aminoalquilcarboxílicos (por ejemplo, el ácido
aminocaproico), la cadena lateral de un aminoácido (por ejemplo la
cadena lateral de lisina u ornitina), aminoácidos naturales (por
ejemplo, glicocola), ácidos aminooxialquílicos (por ejemplo, el
ácido
8-amino-3,6-dioxaoctanocio),
diácidos alquílicos (por ejemplo el ácido succínico), diácidos
oxialquílicos (por ejemplo, el ácido diglicólico) o alquildiaminas
(por ejemplo,
1,8-diamino-3,6-dioxaoctano).
Los restos de espaciador/engarce pueden ser construidos también,
accidental o intencionadamente, para mejorar la solubilidad en agua
de la sonda (véase, por ejemplo, la publicación de Gildea et
al., en Tett. Lett. 39: 7255-7258
(1998)).
(1998)).
Preferiblemente un resto de espaciador/engarce
comprende uno o más compuestos enlazados que tienen la fórmula:
-Y-(O_{m}-CW_{2})_{n})-Z-.
El grupo Y está seleccionado entre el grupo que consiste en: un
enlace sencillo, -(CW_{2})_{p}-,
-C(O)(CW_{2})_{p}-,
-C(S)(CW_{2})_{p}- y
-S(O)_{2}(CW_{2})_{p}. El grupo Z
tiene la fórmula NH, NR^{2}, S u O. Cada W es, independientemente,
H, R^{2}, -OR^{2}-F, Cl, Br ó I; en cuyas
fórmulas cada R^{2} está seleccionado, independientemente, entre
el grupo que consiste en -CX_{3}, -CX_{2}CX_{3},
-CX_{2}CX_{2}CX_{3},
-CX_{2}CX(CX_{3})_{2}, y
-C(CX_{3})_{3}. Cada X es, independientemente, H,
F, Cl, Br ó I. Cada m es, independientemente, 0 ó 1. Cada n, o y p
son, independientemente, números enteros desde 0 a 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica de la hibridación de
ácidos nucleicos podrán reconocer que los factores utilizados
comúnmente pata imponer o regular el rigor de las hibridaciones
incluyen la concentración de formamida (u otros reactivos químicos
de desnaturalización), la concentración salina (es decir, la fuerza
iónica), la temperatura de hibridación, la concentración de
detergente, el pH y la presencia o ausencia de caotropos. Las
condiciones óptimas de rigurosidad para una combinación de una
sonda/secuencia diana, se encuentran con frecuencia mediante la
técnica, bien conocida, de fijar varios de los factores de
rigurosidad antes citados y determinar luego el efecto de variar un
solo factor de rigurosidad. Los mismos factores de rigurosidad
pueden ser modulados para regular con ello la rigurosidad de
hibridación de un PNA con un ácido nucleico, excepto que la
hibridación de un PNA es claramente independientemente de la fuerza
iónica. Las condiciones de rigurosidad óptimas para un ensayo
pueden ser determinadas experimentalmente mediante el examen de
todos los factores de rigurosidad hasta conseguir el grado de
discriminación
deseado.
deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
En general, cuanto más estrechamente
relacionados están los contaminantes de los ácidos nucleicos, que
ocasionan el ruido de fondo, con la secuencia diana, más
cuidadosamente debe ser regulada la rigurosidad. Pueden emplearse
también sondas de bloqueo como medio de mejorar la discriminación
más allá de los límites posibles mediante la simple optimización de
los factores de rigurosidad. Por tanto, las condiciones de
hibridación adecuadas comprenderán condiciones bajo las que se
consiga el grado de discriminación deseado de modo que un ensayo
genere un resultado exacto (dentro de la tolerancia deseada para el
ensayo) y reproducible., Mediante no más que la ayuda de
experimentación de rutina y la descripción que se proporciona en
esta memoria, los expertos de capacidad ordinaria en la técnica
podrán determinar fácilmente las condiciones de hibridación
adecuadas para llevar a cabo los ensayos utilizando los métodos y
composiciones que aquí se describen. Las condiciones de hibridación
in situ adecuadas comprenden condiciones adecuadas para
llevar a cabo un procedimiento operatorio de hibridación in
situ.. Así pues, condiciones adecuadas de hibridación in
situ llegarán a ser evidentes a los expertos de conocimiento
ordinario en la técnica. usando la descripción que aquí se
describe, con o sin experimentación rutinaria
adicional.
adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas de bloqueo son sondas de ácidos
nucleicos o de ácidos no nucleico que pueden ser utilizadas para
suprimir la unión de la secuencia de nucleobases de sonda del
polímero de sonda con una secuencia no diana. Las sondas de bloqueo
preferidas son sondas de PNA (véase: Coull et al., en el
documento US 6.110.676). Típicamente, las sondas de bloqueo están
estrechamente relacionadas con la secuencia de nucleobases de sonda
y comprenden, preferiblemente, una o más mutaciones puntuales
únicas en comparación con la sonda que se pretende detectar en el
ensayo. Se opina que las sondas de bloqueo operan mediante
hibridación con la secuencia no diana formando con ello un complejo
más estable desde el punto de vista termodinámico que está formado
por hibridación entre la secuencia de nucleobases de sonda y la
secuencia no diana. La formación del complejo, más estable y
preferido, bloquea la formación del complejo menos estable, no
preferido, entre la secuencia de nucleobases de sonda y la
secuencia no diana. Por tanto, las sondas de bloqueo pueden ser
usadas con los métodos de esta invención para suprimir la unión de
la sonda de ácido nucleico o de ácido no nucleico con una secuencia
no diana que pudiera encontrarse presente e interferir con el
comportamiento del ensayo. Las sondas de bloqueo son especialmente
ventajosas en la discriminación de mutaciones puntuales únicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleobases de sonda de las
sondas utilizadas en esta invención, es la parte específica de
reconocimiento de la secuencia de la construcción. Por consiguiente,
la secuencia de nucleobases de sonda es una secuencia de
nucleobases destinada a hibridarse con una secuencia diana
específica, en que la presencia, ausencia o cantidad de la
secuencia diana puede usarse para detectar, directa o
indirectamente, la presencia, ausencia o número de microorganismo
de interés de una muestra. Por tanto, con la consideración debida a
los requisitos de una sonda para el formato de ensayo escogido, la
longitud y composición secuencial de la secuencia de nucleobases de
sonda, de la sonda, podrán escogerse, en general, de modo que se
forme un complejo estable con la secuencia diana en condiciones de
hibridación adecuadas.
La secuencia preferida de las nucleobases de
sonda, de las sondas de esta invención que son adecuadas para
detectar bacterias del género Salmonella, comprenden una secuencia
de nucleobases seleccionada entre el grupo que consiste en.
GTG-TTA-AAG-TGA-ACC
(Seq ID No. 1),
AGC-CTT-GAT-TTT-CCG
(Seq ID No. 2) ó
ACC-TAC-GTG-TCA-GCG/Seq
ID No. 3), y sus complementos. Se ha indicado por el Solicitante
que las sondas de PNA seleccionadas para tener estas secuencias de
nucleobases, son altamente específicas para Salmonella al tiempo
que no manifiestan reacción cruzada sustancial con bacterias del
género Citrobacter, estrechamente relacionado, excepto para la Seq
ID No. 1 que pone de manifiesto una pequeña reacción cruzada con
ciertas cepas de bacterias del género
Citrobacter.
Citrobacter.
Esta invención contempla que variaciones de
estas secuencia de nucleobases de sonda identificadas,
proporcionarán también sondas que son adecuadas para la detección
específica de Salmonella al tiempo que todavía discriminan
Citrobacter.
La variaciones comunes incluyen deleciones,
inserciones y desplazamientos del marco del lectura. Adicionalmente,
puede generarse una secuencia de nucleobases de sonda más corta
mediante truncamiento de la secuencia anteriormente identificada.
Alternativamente, si la secuencia de nucleobases de sonda es ácido
nucleico (por ejemplo, DNA ó RNA), típicamente, la secuencia de
nucleobases de sonda tendrá una longitud mayor de 15 nucleobases y
estará diseñada para extender las secuencias de nucleobases antes
identificadas usando la información de la secuencia de rRNA de que
se dispone con facilidad, para determinar la una o más nucleobases
de flanqueo deseadas. En general, no obstante, la secuencia de
nucleobases de sonda tiene, preferiblemente, una longitud de
7-25 subunidades y, lo más preferible, una longitud
de 7-15 subunidades.
Las sondas para usar en esta invención poseen,
por lo general, una secuencia de nucleobases de sonda que es
exactamente complementaria con la secuencia diana. Alternativamente,
podría usarse una secuencia de nucleobases de sonda sustancialmente
complementaria, ya que se ha demostrado que puede obtenerse una
mayor discriminación secuencial cuando se utilizan sondas en las
que existe una o más mutaciones puntuales (desapareamiento de
bases) entre la sonda y la secuencia diana (véase la publicación de
Guo et al., en Nature Biotechnology
15:331-335 (1997)). Por consiguiente, la secuencia
de nucleobases de sonda puede tener solamente una homología de 90%
con las secuencias de nucleobases de sonda anteriormente
identificadas, o sus complementos. Están incluidos los complementos
de la secuencia de nucleobases de sonda ya que es posible generar
una sonda adecuada si la secuencia diana que ha de ser detectada ha
sido amplificada o copiada generando con ello el complemento para
la secuencia diana identificada de la molécula diana, por ejemplo un
cDNA o un cRNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Todavía, en otra realización, están diseñadas
dos sondas para producir en el agregado una secuencia de nucleobases
de sonda que se hibrida con la secuencia diana que se pretende
detectar, generándose con ello una señal detectable, por lo cual,
la secuencia de nucleobases de cada una de las sondas comprende la
mitad o aproximadamente la mitad, del complemento completo para la
secuencia diana. Como ejemplo no limitativo, las secuencias de
nucleobases de las dos sondas podrían ser diseñadas usando el
ensayo que se describe en la Solicitud de Patente Europea 849.363
titulado "Método de identificación de un ácido nucleico usando la
formación de triple hélice de sondas reasociadas
adyacentemente", por H. Orum et al., (véase el documento
EPA 849.363). Composiciones similares que comprenden una sonda de
PNA de triple hélice han sido descritas en la Solicitud de patente
en tramitación junto con la presente, de propiedad común, USSN
09/302.238. Usando esta metodología, las sondas que se hibridan con
la secuencia diana pueden ser marcadas o no, puesto que es el
complejo de sondas formado por la hibridación de extremos
complementarios de las sondas adyacentes, el que se detecta
directamente y no las sondas que se unen directamente a la
secuencia
diana.
diana.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, esta invención usa sondas
adecuadas para detectar bacterias del género Salmonella que poseen
la ventaja de que no experimentan sustancialmente reacción cruzada
con las bacterias del género Citrobacter, estrechamente
relacionadas.
Las características generales (por ejemplo,
longitud, marcadores, secuencias de nucleobases, engarces, etc.) de
las sondas adecuadas para la detección, identificación y/o
cuantificación de bacterias del género Salmonella, han sido
descritas anteriormente en esta memoria. La secuencia de nucleobases
de sonda preferida está seleccionada entre el grupo que consiste
en:
GTG-TTA-AAG-TGA-ACC
(Seq ID No. 1),
AGC-CTT-GAT-TTT-CCG
(Seq. ID no. 2) ó
ACC-TAC-GTG-TCA-GCG
(Seq. ID No. 3). De preferencia, las sondas del conjunto son ácidos
nucleicos peptídicos y, lo más preferible, la secuencia de
nucleobases de sonda consiste en subunidades de PNA sola-
mente.
mente.
Cada una de las secuencias de nucleobases de
sonda preferidas, anteriormente expuestas, se escoge debido a que
ponen de manifiesto una especificidad particular para las bacterias
del género Salmonella. También ponen de manifiesto una reactividad
cruzada particular. La Seq ID No. 1 está diseñada para detectar
aproximadamente la mitad de todas las bacterias Salmonella
conocidas. La Seq. ID No. 1 manifiesta reactividad con solamente
algunas especies de bacterias Citrobacter.
La Seq. ID No. 2 se escoge debido a que detecta
muchas de las bacterias Salmonella que no pueden detectarse usando
la Seq ID No. 1. Así pues, la combinación de Seq. ID Nos. 1 y 2, en
agregación, detecta la mayor parte de las bacterias Salmonella que
se conocen. No obstante, ciertas especies de Salmonella conocidas,
tales como la Salmonella salmenae, no pueden detectarse
usando la combinación de Seq. ID Nos. 1 y 2.
La Seq. ID No. 2, sin embargo, manifiesta
reactividad cruzada con bacterias E. coli (una de las
bacterias de la USP). Debido a que el E. coli es tan común,
es probable que esta secuencia produzca siempre algún resultado
falso positivo a menos que el resultado sea corregido de algún modo
por el contenido de E. coli de la muestra. No obstante, la
presente invención hace posible corregir esta reactividad cruzada
según se describe más adelante en la sección titulada "Métodos de
Detección Correctivos".
La Seq ID No. 3 es la más específica de las
secuencias de nucleobases de sonda antes identificadas. Se opina
que la Seq ID No. 3 no experimenta reacción cruzada ni con las
bacterias del género Citrobacter ni con las bacterias E.
coli. Se opina, asimismo, que la Seq ID No. 3 detecta bacterias
entéricas del género Salmonella, con inclusión de la Salmonella
salmenae. Sin embargo, la Seq ID No. 3 experimenta reacción cruzada
con la bacteria Yersinia enterocolitica muy rara. No obstante, ya
que la Yersinia enterocolitica no es tan común, la incidencia de
obtener un resultado falso positivo es muy baja. Sin embargo, es de
nuevo posible corregir esta reactividad cruzada con el método de la
presente invención según se describe más adelante en la sección
titulada "Métodos de Detección Correctivos".
Las sondas para usar en la presente invención
pueden comprender solamente una secuencia de nucleobases de sonda o
pueden comprender restos adicionales. Ejemplos no limitativos de
restos adicionales incluyen restos detectable (marcadores),
engarces, espaciadores, aminoácidos naturales o no naturales u otras
subunidades de PNA, DNA o RNA. Los restos adicionales pueden ser
funcionales o no funcionales en un ensayo. Sin embargo, en general,
los restos adicionales serán seleccionadas para ser funcionales
dentro del diseño del ensayo en el que ha de usarse la sonda. Las
sondas para usar en esta invención pueden estar sin marcar, pero las
sondas preferidas de esta invención están marcadas con uno o más
restos detectables. En una realización más preferida, se marcan una
o más sondas con dos o más restos detectables independientemente.
Los restos detectables independientemente preferidos, son
fluoróforos detectables independientemente.
En realizaciones preferidas, las sondas se usan
en ensayos de hibridación in situ (ISH) y ensayos de
hibridación in situ con fluorescencia (FISH). La sonda en
exceso usada en un ensayo ISH o FISH debe ser retirada,
típicamente, de modo que el resto detectable de la sonda unida
específicamente pueda ser detectado por encima del ruido de fondo
que resulta de la sonda todavía presente pero sin hibridar. En
general, la sonda en exceso se separa por lavado una vez que la
muestra ha sido incubada con la sonda durante un cierto período de
tiempo. No obstante, el uso de sondas "Beacon" u otra sondas
auto-indicativas es una realización preferida de
esta invención, dado que no existe el requisito de que el exceso
de sonda auto-indicativa haya de ser retirado
completamente desde la muestra (por lavado), dado que genera poco
ruido de fondo o no genera ruido de fondo detectable.
Las sondas pueden ser inmovilizadas,
opcionalmente, en una superficie, incluyendo la inmovilización en
una disposición de sondas. Las sondas pueden ser inmovilizadas en
la superficie usando el procedimiento conocido de reticulación UV.
Más preferiblemente, la sonda es sintetizada sobre la superficie de
un modo adecuado para desprotección, pero no segmentación, desde el
soporte de síntesis (véase la publicación de Weiler, J. et
al., en Hybridization based DNA screening on peptide nucleic
acid (PNA) oligomer arrays., en Nucl. Acids. Res., 25,
14:2792-2799 (Julio, 1997)). En otra realización,
todavía, una o más sondas son enlazadas covalentemente a una
superficie mediante la reacción de un grupo funcional adecuado sobre
la sonda con un grupo funcional de la superficie (véase la
publicación de Lester, A. et al., en "PNA Array
Technology". presentado en la Conferencia de Tecnologías de
Biochips en Annápolis (Octubre, 1997)). Este método es el más
preferido ya que las sondas sobre la superficie serán,
típicamente, altamente purificadas y fijadas usando un procedimiento
químico definido, minimizando o eliminado con ello las
interacciones
inespecíficas.
inespecíficas.
Los métodos para la fijación química de sondas a
superficies implican, en general, la reacción de un grupo
nucleófilo (por ejemplo, un grupo amino o tiol) de la sonda que ha
de ser inmovilizada, con un grupo electrófilo situado sobre el
soporte que ha de modificarse. Alternativamente, el nucleófilo puede
encontrarse presente sobre el soporte y el grupo electrófilo (por
ejemplo, un ácido carboxílico activado) puede estar presente sobre
la sonda. Debido a que el PNA nativo posee un extremo amino
terminal, un PNA no requiere, necesariamente, modificación para
inmovilizarle con ello a una superficie (véase la publicación de
Lester et al., Poster, titulada "PNA Array
Technology").
Las condiciones adecuadas para inmovilizar una
sonda a una superficie son similares, en general, a las condiciones
adecuadas para el marcado del polímero. La reacción de
inmovilización es esencialmente el equivalente del marcado por el
que el marcador es sustituido con la superficie a la que ha de
unirse el polímero.
Numerosos tipos de superficies derivatizadas con
grupos amino, grupos de ácidos carboxílicos, isocianatos,
isotiocianatos y grupos malimido, se encuentran disponibles en el
comercio. El soporte puede ser plano, redondo (por ejemplo, de
forma de bola) o tener cualquier otra configuración geométrica útil.
Ejemplos no limitativos de superficies adecuadas incluyen
membranas, vidrio, vidrio de poro controlado, partículas (bolas) de
poliestireno, y nanopartículas de sílice y de oro.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, esta invención usa
conjuntos de sondas adecuados para detectar, identificar y/o
enumerar bacterias del género Salmonella, que poseen la ventaja de
que no experimentan, sustancialmente, reacción cruzada con
bacterias estrechamente afines del género Citrobacter. Las
características generales y preferidas de las sondas que son
adecuadas para detectar, identificar y/o enumerar bacterias del
género Salmonella, han sido descritas anteriormente en esta
memoria. Los conjuntos de sondas comprenden, preferiblemente, al
menos una sonda que tiene una secuencia de nucleobases de sonda que
es homóloga en un noventa por ciento, por lo menos, con la
secuencia de nucleobases:
GTG-TTA-AAG-TGA-ACC
(Seq ID No. 1),
AGC-CTT-GAT-TTT-CCG
(Seq ID No. 2),
ACC-TAC-GTG-TCA-GCG
(Seq ID No. 3) y sus complementos. De preferencia, las sondas del
conjunto son ácidos nucleicos peptídicos y, lo más preferible, la
secuencia de nucleobases de sonda consiste en subunidades de
PNA
solamente.
solamente.
\newpage
Los conjuntos de sondas pueden comprender
mezclas de sondas de PNA y sondas de ácidos nucleicos, procurando,
sin embargo, que un conjunto comprenda por lo menos una sonda
adecuada para detectar, identificar y/o enumerar bacterias del
género Salmonella, según se ha descrito anteriormente. En
realizaciones preferidas, algunas de las sondas del conjunto son
sondas de bloqueo compuestas de PNA ó ácido nucleico, pero
preferiblemente las sondas de bloqueo son PNA. En otras
realizaciones preferidas, las sondas del conjunto están unidas a un
soporte. Lo más preferible es que todas las sondas de un conjunto
sean PNA.
En realizaciones preferidas, los conjuntos de
sondas comprenden dos o, preferiblemente, tres de las secuencias de
nucleobases de sonda preferidas identificadas anteriormente como Seq
ID Nos. 1-3, para permitir la detección de todas
las bacterias Salmonella que pueden estar presentes en una muestra.
Por ejemplo, las Seq ID nos. 1 y 2, típicamente, están combinadas,
de modo que la mayor parte de las bacterias Salmonella son
detectables, puesto que cada Seq ID No. individual solamente
detecta, aproximadamente, la mitad de las especies de Salmonella
conocidas. Añadiendo la Seq ID No. 3 a la mezcla se aumenta la
intensidad de la señal y también se permite la detección de
bacterias del género Salmonella raras que pudieran no ser
detectables con las Seq ID Nos. 1 y 2. Por consiguiente, se
prefiere la combinación de todas las Seq ID Nos. 1-3
para la detección general de bacterias
Salmonella.
Salmonella.
El conjunto de sondas puede comprender dos o
las tres de las Seq ID Nos. 1-3 a pesar de la
presencia esperada de bacterias con las que se sabe que cada una de
ellas experimenta reacción cruzada, con tal que el resultado puede
ser corregido teniendo en cuenta la presencia de estas bacterias por
el método de la invención, según se describe más adelante en la
sección titulada "Métodos de detección correctivos". De este
modo, las sondas adicionales del conjunto corrigen las deficiencias
de especificidad de las Seq ID Nos. 1-3
identificadas.
Los grupos (arrays) son superficies en la que
han sido inmovilizadas dos o más sondas cada una en una posición
única especificada. Típicamente, la secuencia de nucleobases de
sonda de la sonda inmovilizada es escoge juiciosamente para poder
"interrogar" a una muestra. Debido a que la situación y la
composición de cada una de las sondas inmovilizadas es conocida,
los grupos son útiles, en general, para la detección,
identificación o cuantificación simultáneas de dos o más secuencias
diana que puedan estar presentes en la muestra. Por consiguiente, en
otra realización, dos o más sondas del conjunto son inmovilizadas,
cada una, en diferentes situaciones identificables sobre el grupo
de modo que por hibridación de la sonda con la secuencia diana, la
presencia del híbrido en la posición sobre el grupo puede ser usada
para identificar, detectar y/o enumerar la secuencia diana de
interés.
interés.
Debido a que las sondas de esta invención pueden
ser marcadas con uno o más restos detectables independientemente,
es posible diseñar conjuntos de sondas en los que cada una de las
sondas de un conjunto es detectable independientemente. Fluoróforos
que poseen espectros de excitación y de emisión suficientemente
diferentes, se utilizan con frecuencia como restos detectables
independientemente. Fluoróforos detectables independientemente que
sirven de ejemplo, son derivados de cumarina, fluoresceína y
rodamina.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha indicado anteriormente, esta
invención se refiere a un método para detectar, identificar y/o
cuantificar (enumerar) bacterias del género Salmonella existentes
en una muestra, entre otros organismos detectables, con los que las
sondas para las bacterias Salmonella pueden experimentar reacción
cruzada. A esto se hace referencia también en esta memoria como un
método de detección correctivo.
El método comprende poner en contacto la
muestra, en condiciones de hibridación adecuadas, con una o más
sondas detectables, adecuadas para detectar, identificar y/o
cuantificar bacterias del género Salmonella así como también con
una o más sondas detectables independientemente que son específicas
para uno o más de otros organismos detectables con los que las
sondas detectables para las bacterias de interés pueden experimentar
reacción cruzada, en donde las sondas detectables
independientemente no experimentan reacción cruzada por sí mismas
con las bacterias del género Salmonella.. La hibridación, en
condiciones de hibridación adecuadas, de la secuencia de
nucleobases de sonda de las sondas detectables y detectables
independientemente con sus secuencias diana, se determina después
detectando directa o indirectamente los complejos sonda/secuencia
diana de la muestra. La presencia, ausencia y/o número de
organismos "teñidos" con ambas sondas, las sondas detectables
y las sondas detectables independientemente, se determina luego de
modo que las bacterias teñidas con solo la sonda o sondas
detectables, pueden ser determinadas específicamente con la
finalidad de detección, identificación y/o cuantificación
específicas de las bacterias Salmonella existentes en la muestra. De
este modo, se realiza una corrección debida al carácter
inespecífico de la sonda o sonda escogidas para la detección
específica de las bacterias
Salmonella.
Salmonella.
Debido a que este método puede ser usado para
determinar específicamente los organismos que manifiestan
reactividad cruzada con las bacterias Salmonella, esta invención
facilita el uso de sondas de especificidad menor que la óptima, en
un ensayo efectuado para determinar específicamente las bacterias
del género Salmonella existentes en una muestra de interés..
Incluso si la secuencia o secuencias de las sondas escogidas no son
hechas, o no pueden hacerse, específicas para las bacterias
Salmonella que se pretende determinar, es posible sustraer los
organismos que manifiestan reactividad cruzada consiguiendo con ello
la especificidad deseada. El único requisito es que la sonda o
sondas detectables independientemente, escogidas para detectar el
organismo u organismos inconvenientes, no manifiesten por sí mismos
reactividad cruzada con las bacterias Salmonella de interés.
El Ejemplo 9 de esta memoria descriptiva es un
Ejemplo representativo de un método tal. En este Ejemplo se usan un
microscopio, una cámara CCD y un soporte lógico (software)
apropiado, para analizar las bacterias "teñidas" de la
muestra. La muestra analizada comprende las bacterias siguientes:
S. choleraesuis, S. arizonzae, P. aeruginosa, B. cepatia, S,
aureus y E. coli. La sonda verde utilizada en el ensayo
es el PNA, Flu-2, que comprende la Seq. ID No. 2)
(véase la Tabla 1). Dado que la secuencia de nucleobases de sonda de
la sonda es la Seq. ID No. 2, es de esperar que
Flu-2 experimente reacción cruzada con E.
coli. La sonda roja usada en el ensayo es el PNA,
Cy3-1 (véase la Tabla 1). Como se indica en la Tabla
1, esta sonda es específica del E. coli.
Con referencia a las Figuras
1A-1D, se discute una realización del método. Las
Figuras 1B, 1C y 1D son las imágenes digitales individuales
obtenidas con un microscopio usando cada uno de los filtros azul,
verde y rojo, respectivamente. Estas tres imágenes son combinadas
luego digitalmente para formular la imagen digital compuesta que se
observa en la Figura 1 A. La imagen azul (Figura 1B) muestra todas
las bacterias presentes en la muestra que están teñidas con el
colorante azul general, DAPI. La imagen verde (Figura 1C) muestra
todas las bacterias de la muestra con las que reacciona el PNA,
Flu-2, generando con ello una señal verde
detectable. Dado que las bacterias Salmonella y E. coli
están presentes en la muestra, estas bacterias, ambas, están teñidas
en verde.. La imagen roja (Figura 1D) muestra solamente aquellas
bacterias que reaccionan con la sonda Cy3-1.Puesto
que la sonda de PNA Cy3-1 es específica, solamente
las bacterias E. coli deben teñirse de rojo.
Con referencia a la imagen digital compuesta
presentada en la Figura 1A, todas las bacterias de la muestra se
aprecian o bien en amarillo, verde o azul. El color amarillo que se
observa en la imagen compuesta, es un pseudocolor generado por
ordenador asignado a aquellas zonas de la imagen que son verde y
roja, ambas. Por tanto, las bacterias teñidas en amarillo son las
bacterias E. coli dado que solo es de esperar que las
bacterias E. coli se tiñan con las sondas verde
(Flu-2) y roja (Cy3-1), ambas. La
ausencia de bacterias que son solamente rojas indica que la sonda
Cy3-1 es específica de E. coli y, en general,
no experimenta reacción cruzada con otras bacterias existentes en
la
muestra.
muestra.
Habiendo hecho la corrección para las bacterias
E. coli, las bacterias verdes restantes son, por
consiguiente, las bacterias Salmonella. Como puede apreciarse, la
mayor parte de las bacterias son azules. Esto indica que la sonda
Flu-2 es también específica, ya que no tiñe, en
general, todas las bacterias. Por tanto, la mayor parte de las
bacterias existentes en el campo del microscopio no son E.
coli ni Salmonella. Se aprecia también que la morfología
celular observada es consistente con las identificaciones hechas
basadas en el color de las células.
Aun cuando la metodología que se ha discutido
está basada en el análisis manual de imágenes digitales generadas
por ordenador, el proceso podría ser automatizado usando la
instrumentación y el soporte lógico adecuados, en combinación con
un escáner de diapositivas o un citómetro de flujo. Lo más
preferible es que la instrumentación y el soporte lógico estén
diseñados para realizar automáticamente el método correctivo de la
invención que se describe en esta memoria.
Aun cuando el Ejemplo 9 demuestra solamente una
corrección para el E. coli, no es una limitación del método
correctivo ya que solamente un tipo de reacción cruzada por ensayo
es corregido. Debido a que las sondas y los conjuntos de sondas
pueden ser usados en un formato multiplexado, todos los organismos
que experimentan reacción cruzada pueden ser corregidos,
potencialmente. Por ejemplo, una sonda teñida con Cy3 diseñada para
detectar específicamente la Yersinia enterocolitica, una sonda de
Cy3 diseñada para detectar específicamente la Yersinia
pseudotuberculosis y otra sonda marcada con Cy-3
diseñada para detectar específicamente bacterias Citrobacter,
podría añadirse a la sonda de Cy3-1 aquí descrita y
usada para corregir completamente organismos con los que una mezcla
de sondas marcadas con fluoresceína (véase la Tabla 1, sondas
Flu-1, Flu-2 y Flu-3
como ejemplos) que comprenden las Seq. ID Nos. 1-3,
experimentan reacción cruzada. De este modo, el ensayo sería
altamente específico para bacterias del género Salmonella, en el que
se realiza una corrección para todos los organismos que se sabe
experimentan reacción cruzada con las sondas detectables.
Como se ha discutido anteriormente, las sondas
no necesitan ser marcadas con un resto detectable para que puedan
operar dentro de los métodos correctivos de esta invención, ya que
es posible detectar el complejo de sonda/secuencia diana sin usar
una sonda marcada o una secuencia diana marcada. Por ejemplo, las
sondas detectables y detectables independientemente pueden ser de
tipos diferentes por lo que el complejo de sonda
detectable/secuencia diana puede ser diferenciado en comparación con
el complejo de sonda detectable independientemente/secuencia
diana.
diana.
En realizaciones preferidas, las sondas usadas
en el método correctivo anteriormente descrito, son sondas
"Beacon" auto-indicativas u otras sondas
auto-indicativas. Cuando se usan sondas
auto-indicativas, el método puede ser un ensayo en
tiempo real ya que la sonda en exceso no interfiere sustancialmente
con el análisis de hibridación y por tanto no necesita ser
separada.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos de esta invención son
particularmente útiles para la detección rápida, sensible y
fidedigna de bacterias Salmonella en alimentos, bebidas, agua,
productos farmacéuticos, productos para el cuidado personal,
productos lácteos o muestras medioambientales. El análisis de las
bebidas preferidas incluye soda, agua embotellada, jugos de fruta,
cerveza, vino o licores. Métodos adecuados pueden ser
particularmente útiles para el análisis de materias primas,
equipos, y productos o procesos utilizados para fabricar o almacenar
alimentos, bebidas, agua, productos farmacéuticos, productos para
el cuidado personal, productos lácteos o muestras
medioambientales.
Los métodos de esta invención son
particularmente útiles también para la detección rápida, sensible y
fidedigna de bacterias Salmonella (patógenas) en medios ambiente
químicos. Métodos adecuados son especialmente útiles para el
análisis de muestras clínicas, equipo, instalaciones o productos
usados para tratar seres humanos o animales.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1A es una imagen digital compuesta
obtenida con cada uno de los filtros azul, verde y rojo de una
cámara CCD unida a un microscopio, en la que el amarillo es un
pseudocolor que identifica bacterias visibles en imágenes verdes y
rojas, ambas.
Las Figuras 1B, 1C y 1D son las imágenes
digitales individuales obtenidas con el microscopio usando cada uno
de los filtros azul, verde y rojo, respectivamente, que se usan para
formular la imagen digital compuesta observada en la Figura 1A.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención se ilustra ahora mediante los
ejemplos que siguen, que no están destinados en modo alguno a ser
limitantes
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
A 500 mmol de anhídrido diglicólico en
agitación en 800 ml de diclorometano (DCM) se añadió gota a gota 1,1
moles de bis(2-metoxietil)amina
(Aldrich Chemical). La mezcla de reacción se deja en agitación
durante 2 horas y después se añadió, gota a gota, 280 ml de HCl 6N.
Los contenidos fueron hechos pasar luego a un embudo de separación
y se dejó que se separaran. Se retiró la capa de DCM y la capa
acuosa se extrajo con 100 ml de DCM, Las capas de DCM reunidas se
extrajeron después con 100 ml de solución acuosa al 10% de ácido
cítrico. Se separó luego la capa de DCM, se secó
(Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó, obteniendo 73,8 g (296
mmol; rendimiento, 59%). Se usó después un aparato de destilación
de Kugelrohr para retirar indicios de disolventes (el producto se
calentó a 60ºC y 180 \muM de Hg, aproximadamente, pero no se
destiló).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
A 60 mmol de
Fmoc-aeg-OH (PE Biosystems, Foster
City, CA.) se añadieron 360 ml de agua MilliQ, 180 ml de acetona,
120 mmol de NaHCO_{3} y 60 mmol de K_{2}CO_{3}. Esta solución
se dejo agitar hasta que la totalidad del
Fmoc-aeg-OH se hubo disuelto
(aproximadamente 2 horas) y luego se añadió la solución preparada
como se describe seguidamente.
A 70 mmol del ácido
bis-(2-metoxietil)amidil-diglicólico
se añadieron 120 ml de acetonitrilo anhidro (Fluka Chemical), 240
mmol de N-metilmorfolina (NMM; Fluka Chemical) y 75
mmol de cloruro de trimetilacetilo (Aldrich Chemical). Se dejó
agitar la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos y
después se añadió, gota a gota, a la solución de
Fmoc-aeg-OH que se había preparado
según se ha descrito anteriormente.
Después de agitar las soluciones reunidas
durante 1 hora y de que el análisis por tlc indicara que la reacción
había sido completa, se añadió a la mezcla de reacción HCl 6N hasta
que el pH fue menor que 2 al papel indicador. Después se retiró el
disolvente orgánico por evaporación en vacío. La solución acuosa
restante se hizo pasar después a un embudo de separación y se
sometió a extracción 2 x con 250 ml de acetato de etilo, Las capas
de acetato de etilo reunidas se secaron (Na_{2}SO_{4}), se
filtró y se evaporó obteniendo 41,5 g de un aceite.
Este producto crudo se purificó por
cromatografía en columna usando una fase estacionaria de fase
invertida (C18) y un gradiente de acetonitrilo acuoso para eluir el
producto y separar el ácido piválico. Aun cuando no era visible por
tlc, la elución del ácido piválico se determinó por el olor. El
ácido piválico resultó eluído casi completamente desde la columna
antes de la elución del producto. La elución del producto fue
verificada por tlc. Rendimiento: 26,8 g (47 mmol; 78%). Una
modificación "E" de un PNA o poliamida tiene la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
A menos que se establezca de otro modo, los PNAs
fueron sintetizados usando reactivos de que se dispone en el
comercio e instrumentación obtenida de PE Biosystems, Foster City,
CA. USA. Los PNAs que poseen modificaciones de la subunidad
"E" en el extremo C terminal fueron preparados llevando a cabo
la síntesis que usa soportes de síntesis previamente derivatizados
o llevando a cabo la síntesis que usa el monómero de
Fmoc-"E"aeg-OH (preparado según se ha descrito
anteriormente), y el ciclo estándar de síntesis. Los PNAs que poseen
modificaciones de la subunidad "E" en el extremo
N-terminal fueron preparados llevando a cabo la
síntesis que usa el monómero de Fmoc-"E"aeg-OH
(preparado según se ha descrito anteriormente) y el ciclo estándar
de síntesis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El soporte de la síntesis de trató con una
solución al 25% de piperidina en el seno de DMF, durante
10-15 minutos, a temperatura ambiente. Después del
tratamiento, el soporte de síntesis se lavó y se secó en alto
vacío. Luego el soporte pudo tratarse con el reactivo de
marcado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Después de reacción apropiada con engarces y la
retirada del grupo protector del grupo amino terminal, la resina se
trató con 250 \mul de una solución que contenía
5(6)carboxifluoresceína 0,5M,
N,N'-diisopropilcarbodiimida 0,5M,
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt) 0,5 M en DMF (véase la publicación de Weber et al., en
Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,
8:597-600 (1998). Después del tratamiento, el
soporte de síntesis se lavó y seco en alto vacío. El oligómero del
PNA después fue desdoblado, desprotegido y purificado según se
describe más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Todas las secuencias de PNA están escritas desde
el extremo amino terminal (-N), al extremo carboxilo terminal (C-).
Flu =5(6)-carboxifluoresceína; E se ha
definido anteriormente; y O = ácido
8-amino-3,6-dioxaoctanoico.
El soporte de la síntesis
(Fmoc-PAL-PEG/PS; P/N GEN913384 fue
separado luego desde el cartucho de síntesis, transferido a un
cartucho Ultrafree spin (Millipore Corp., P/N SE3P230J3)) y tratado
con una solución de TFA/m-cresol según las
indicaciones del fabricante. La solución se hizo girar a través del
lecho de soporte y de nuevo el soporte fue tratado con una solución
de TFA/m-cresol. De nuevo la solución se hizo girar
otra vez a través del lecho del soporte. Los eluyentes combinados
(TFA/m-cresol) fueron precipitados después por
adición de 1 ml de éter dietílico, aproximadamente. El precipitado
fue sometido a peletización por centrifugación. El pelet obtenido
se volvió a suspender después en éter etílico y se sometió a
peletización dos veces más. El pelet desecado se resuspendió luego
en solución acuosa de acetonitrilo (ACN) al 20% que contenía TFA al
0,1% (se añadió ACN según se necesitó para disolver el pelet). El
producto se analizó y purificó empleando métodos cromatográficos de
fase
invertida.
invertida.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Usando un kit Qiagen (P/N 75144), se aisló RNA
total (que incluía aproximadamente 80% de rRNA) desde las
diferentes células bacterianas que habían sido cultivadas. La
concentración total del RNA aislado se determinó midiendo la
absorción en 260 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo hibridaciones puntuales sobre
membranas de nilón obtenidas de Gibco-BRL (P/N
14830012). Para el rRNA de cada una de las bacterias cultivada, se
obtuvo una fila de diluciones que contenía al menos 5 manchas,
partiendo de una concentración de aproximadamente 16 \mug/ml de
RNA para la dilución más fuerte y continuando con diluciones
semilogarítmicas en agua tratada (exenta de RNasa) con pirocarbonato
de dietilo (DEPC). Antes de depositar como manchas sobre la
membrana cada uno de los "stocks" de dilución se calentó a
68ºC durante tres minutos. El depósito de manchas produjo una serie
de diluciones semilogarítmicas que contenían, aproximadamente, 16,
5,1, 1,6, 0,52, 0,17 ng...(etc.) de RNA total por mancha. Una vez
secadas al aire las manchas, la membrana fue reticulada por UV y
guardada después en una bolsa de plástico hasta que se usó.
Cuando se usaron, membranas individuales fueron
colocadas en bolsas de plástico y pre-humedecidas
con agua exenta de RNasa. Las membranas fueron prehibridadas en
Tampón de Hibridación (Tris-HCl 20 mM, pH 9,5;
formamida al 50%; Solución de Denhardt 1X (USB, P/N US70468);
monolaurato de sorbitán polioxietilénico (Tween 20, Sigma
P/NP-1379) al 0,7%; y NaCl 100 mM), durante 15
minutos a 50ºC. Todas las sondas marcadas con fluoresceína fueron
diluidas en DMF/H_{2}O (1:1) hasta una concentración de 300
pmol/\mul, aproximadamente, y diluidas después hasta una
concentración final de 5 pmol/ml cada una usando el Tampón de
Hibridación El tampón de prehibridación se retiró de las bolsas y
se añadió a las bolsas tampón de hibridación de nueva aportación que
contenía la sonda o sondas de PNA de interés. Las sondas apropiadas
fueron usadas en una concentración final de 5 pmol/ml cada
una.
una.
La hibridación de las ondas se llevó a cabo a
50ºC durante 1 hora. Los filtros fueron lavados luego 3 veces con
Capso-10.0 (Capso 10 mM (Sigma P/N
C-1254) pH 10,0, EDTA 1 mM) que contenía Tween 20 al
0,2%, a temperatura elevada.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez completados los lavados, las membranas
fueron tratadas con una solución de bloqueo
(Tris-HCl 50 mM, pH 9,0; NaCl 0,5 M; y caseína al
0,5%). La temperatura inicial de la solución era 65ºC, pero la
solución se fue enfriando a medida que tenía lugar el bloqueo, con
agitación, a temperatura ambiente durante 15 minutos. Un conjugado
de anti-fluoresceína-fosfatasa
alcalina (anti-FITC/AP (Fab) de conejo (DAKO A/S,
P/N K0046) se diluyó 1:500 en la solución de bloqueo y las
membranas se dejaron en agitación en esta solución durante 30
minutos, a temperatura ambiente. Luego se lavaron las membranas con
una solución de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 9,0;
NaCl 0,5 M; y Tween 20 al 0,5%) tres veces cada vez durante 5
minutos. Para preparar las membranas para la detección, se llevó a
cabo un enjuagado final (Tris-HCl 10 mM, pH 9,5;
NaCl 10 mM y MgCl_{2} 1 mM). El sustrato quimiluminiscente (CDP
Star, Tropix Corp., P/N MS025) se diluyó (1:500) en una solución
acuosa de sustrato (dietanolamina 0,1M, pH 9,7; y MgCl_{2} 1 mM)
y las membranas fueron sumergidas sin agitar, durante 4 minutos.
Después las membranas fueron colocadas en una bolsa de plástico, el
sustrato en exceso fue retirado por expresión y la bolsa se cerró
herméticamente. Las membranas fueron expuestas a película de rayos
X Fuji-RX durante un período de tiempo entre 1 y
19
minutos.
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de los análisis de hibridaciones
puntuales de RNA (según se ha descrito anteriormente) empleando
como sondas Flu-1, Flu-2 y
Flu-3, se exponen en la Tabla 2. Con referencia a la
Tabla 2, la sonda Flu-1 es específica de
Salmonella choleraesuis. Como se suponía, basándose en la
información de la secuencia de que se disponía, la sonda
Flu-2 no reconoce la citada S. choleraesuis,
las sub-especies de RNA de Salmonella usadas
en la hibridaciones puntuales, pero reacciona con el RNA de E.
coli. La sonda Flu-3 es específica de la S.
choleraesuis.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Cultivos individuales de bacterias, de 3 ml, se
hicieron crecer durante la noche en Caldo de Soja Tripsinado
(Tryptic Soy Broth)(TSB), a 30ºC. El caldo se analizó después
determinando su absorbancia en 600 nm y luego se diluyó con TSB de
nueva aportación hasta que la absorbancia en 600 nm era,
aproximadamente. 0,5 DO/ml. Estas soluciones reserva de cultivo
diluidas se dejaron entonces duplicar 3-4 veces
antes de cosechar. Las células procedentes de un cultivo de 20 ml
fueron peletizadas por centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos,
se volvieron a suspender en 20 ml de PBS, se peletizó de nuevo y se
volvieron a suspender en Tampón de Fijación (paraformaldehído al 4%
en el seno de PBS (Na_{2}HPO_{4} 7 mM; NaH_{2}PO_{4} 3 mM;
NaCl 130 mM). Las bacterias fueron incubadas a temperatura ambiente
durante 30-60 minutos antes de someter a
peletización otra vez (centrifugación a 8000 rpm durante 5
minutos). Después de retirar la solución de fijación, las células
se volvieron a suspender en 20 ml de PBS estéril y se sometió a
peletización por centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos. Las
células fueron resuspendidas en 20 ml de solución acuosa de etanol
al 50%. Las bacterias fijadas fueron usadas luego al cabo de 30
minutos de incubación o almacenadas a -20ºC, opcionalmente, antes
de emplearlas en un experimento.
Para cada una de las muestras preparadas, 100
\mul de las células fijadas en solución acuosa de etanol al 50%
fueron separados y se centrifugo a 8000 rpm durante 2 minutos. Luego
se retiró el etanol de la muestra y el pelet se resuspendió en 100
\mul de PBS estéril y se sometió de nuevo a peletización por
centrifugación a 8000 rpm durante 2
minutos.
minutos.
Se separó el PBS del pelet y las células fueron
resuspendidas en 100 \mul de Tampón de Hibridación
(Tris-HCl 20 mM, pH 9,0; NaCl 100 mM, SDS al 0,5%)
que contenía la sonda apropiada (por ejemplo, Flu-1
a Flu-3) en una concentración de;
Flu-1. Flu-2 (90 pmol/ml) y
Flu-3 (30 pmol/ml). La hibridación se llevó a cabo a
55ºC durante 30 minutos.
Después se centrifugó la muestra a 8000 rpm
durante 2 minutos. Se retiró el tampón de hibridación y las células
se volvieron a suspender en 500 \mul de TE-9,0
estéril (Tris.HCl 10 mM, pH 9,0; EDTA 1 mM). Se dejó en reposo la
solución a 55ºC durante 5 minutos. Después se centrifugó la muestra
a 8000 rpm durante 5 minutos. Entonces se separó el
TE-9,0 del pelet. El lavado con
TE-9,0 se repitió dos veces más.
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Después del lavado final, se volvió a suspender
las células en 100 \mul de TE-9,0. Una parte
alícuota de 2 \mul de esta suspensión de células se colocó sobre
un portaobjetos de vidrio y se dejo secar. A continuación, se
depositó sobre las células secas 1-2 \mul de
Vectashield (Vector Laboratories, P/N H-1000). Se
añadió un cubreobjetos al porta y se fijó su posición usando un par
de gotas de laca de uñas. Las diferentes cepas de bacterías, que
incluían: Citrobacter freundii, Citrobacter youngae, Salmonella
cholerasuis, Salmonella salmenae, Salmonella arizonae, Salmonella
diarizonae, Salmonella houtena, Salmonella bongori, Salmonella
indica, Yersinia enterocolitica, Tersinia pseudotuberculosis,
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
putida, Pseudomonas cepatia, Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus, fueron
fijadas y sometidas a hibridación con cada una de las sondas
Flu-1 a Flu-3 siguiendo el
protocolo descrito. anteriormente. Después de hibridación y lavado,
cada una de las cepas fue salpicada y montada sobre un
portaobjetos de microscopio (véase antes) y se examinó usando un
microscopio de fluorescencia Nikon provisto de un objetivo de
inmersión de 60x, un ocular de 10 x (600 aumentos en total) y un
filtro Omega Optical XF22. La Tabla 2 muestra que las sondas
Flu-1 y Flu-2 se hibridan con
algunas de las subespecies de Salmonella (con
sub-conjuntos diferentes pero que se solapan).
Además, existe alguna reactividad cruzada entre
Flu-2 y las especies de Citrobacter. La sonda
Flu-3 reconoce cada una de las subespecies de
Salmonella, y se hibrida débilmente con la Yersinia
enterocolitica.
Con el fin de interpretar los resultados de la
Tabla 3, debe darse la interpretación que sigue a los valores
contenidos en ella. Un valor de 0 a 1 es una lectura negativa en la
que la autofluorescencia contribuye a alguna señal inespecífica
observada. Un valor de entre 1,5 a 2, indica un resultado débilmente
positivo. Una valor de entre 2,5 a 3, indica un resultado
fuertemente positivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Una mezcla de E. coli, S. aureus, P.
aeruginosa, S. choleraesuis, S. arizonae y P.
cepatia, fijada individualmente según se ha descrito antes, fue
preparada e hibridada en un tubo único con una mezcla de dos
sondas de PNA, Flu-2 y Cy3-1 (véase
la Tabla 1), El protocolo de hibridación que se usó fue el mismo que
se ha descrito en el Ejemplo 8.
Después de hibridación y lavado, las bacterias
fueron salpicadas y montadas sobre un portaobjetos de microscopio
(véase anteriormente). Los portas fueron inspeccionados luego usando
un microscopio de fluorescencia Nikon provisto de un objetivo de
inmersión de 60x y un ocular de 10 x (600 aumentos en total), y
filtros de luz obtenidos de Omega Optical (filtro XF22 (verde),
XF34 (rojo) y XF05 (azul)). Se obtuvieron imágenes digitales
electrónicas de cada porta usando una cámara CCD SPOT y un soporte
lógico obtenido de Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights,
MI (EE.UU.)
Las imágenes digitales obtenidas, todas las
cuales cubrían la misma sección del porta, están presentadas en la
Figura 1A a 1D. Un análisis de estas imágenes ya ha sido descrito en
esta memoria descriptiva.
<110> Boston Probes, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sondas, Conjuntos de Sondas, Métodos
y Kits que se refieren a la Detección, Identificación, y/o
Enumeración de Bacterias
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BP0001-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/235,952
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-09-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Molécula de DNA/RNA
Combinada: Secuencia de Nucleobases de Sonda
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia de Nucleobases de Sonda
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipgtgttaaagt gaacc
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Molécula DNA/RNA
Combinada: Secuencia de Nucleobases de Sonda
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia de Nucleobases de Sonda
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipagccttgatt ttccg
\hfill15
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<210> 3
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<211> 15
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Molécula de DNA/RNA
Combinada: Secuencia de Nucleobases de Sonda
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia de Nucleobases de Sonda
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipacctacgtgt cagcg
\hfill15
Claims (14)
1. Un método para detectar, identificar y/o
cuantificar específicamente bacterias del género Salmonella entre
otros organismos detectables con los que puede experimentar
reacción cruzada una sonda para las bacterias Salmonella, cuyo
método comprende:
(a) poner en contacto la muestra, en condiciones
de hibridación adecuadas, con una o más sondas detectables
adecuadas para detectar, identificar y/o cuantificar bacterias del
género Salmonella;
(b) poner en contacto la muestra, en condiciones
de hibridación adecuadas, con una o más sondas detectables
independientemente que son específicas para uno o más de otros
organismos detectables con los que la sonda o sondas detectables
para las bacterias Salmonella pueden experimentar reacción cruzada,
en donde la sonda o sondas detectables independientemente no
experimentan por sí mismas reacción cruzada con las bacterias
Salmonella;
(c) determinar la hibridación de la secuencia
de nucleobases de sonda de las sondas detectables y detectables
independientemente con sus secuencias de ácidos nucleicos diana, por
detección de los complejos de sonda/secuencia diana de la muestra;
y
(d) determinar la presencia, ausencia y/o
número de organismos que están marcados con ambas sondas, la sonda
o sondas detectables y la sonda o sondas detectables
independientemente, por lo que las bacterias que están marcadas con
la sonda o sondas detectables y no con la sonda o sondas detectables
independientemente pueden ser determinadas específicamente,
detectando, identificando y/o cuantificando específicamente con ello
las bacterias del género Salmonella de la muestra.
2. El método según la reivindicación 1, en el
que las sondas detectables y detectables independientemente están
marcadas con fluoróforos detectables independientemente.
3. El método según la reivindicación 1, en el
que al menos una sonda es un ácido nucleico peptídico.
4. El método según la reivindicación 1, en el
que todas las sondas usadas en el método son ácido nucleico
peptídico.
5. El método según la reivindicación 1, en el
que al menos una sonda está sin marcar.
6. El método según la reivindicación 1, en el
que se usan en el ensayo sondas adicionales, al menos una de las
cuales es una sonda de bloqueo.
7. El método según la reivindicación 1, en el
que las sondas detectables y detectables independientemente son
sondas auto-indicativas.
8. El método según la reivindicación 7, en el
que las sondas auto-indicativas son sondas
"Beacon" auto-indicativas.
9. El método según la reivindicación 1, en el
que las sondas detectables y detectables independientemente están
sin marcar.
10. El método según la reivindicación 1, en el
que la muestra que ha de ser ensayada se toma desde un origen
seleccionado entre el grupo que consiste en un alimento, una bebida,
agua, un producto farmacéutico, un producto para el cuidado
personal, un producto lácteo y el medio ambiente.
11. El método según la reivindicación 1, en el
que la muestra que ha de ser ensayada se toma desde un origen
seleccionado entre el grupo que consiste en una materia prima, un
equipo, una instalación, un producto y un medio ambiente
clínico.
12. El método según la reivindicación 1, en el
que la muestra que ha de ser ensayada se toma desde un proceso
usado para fabricar o almacenar alimentos, bebidas, agua, productos
farmacéuticos, productos para el cuidado personal o productos
lácteos.
13. El método según la reivindicación 1, en el
que la muestra que ha de ser ensayada es una muestra clínica.
14. El método según la reivindicación 1, que
comprende, además, llevar a cabo un lavado para retirar con ello
las sondas en exceso detectables y detectables independientemente,
antes de llevar a cabo la etapa (c).
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