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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von pektinolytischen
Enzymen oder von Polypeptiden mit pektinolytischer Aktivität
zur Behandlung von Obst- oder Gemüsemaische bzw. -pulpe.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von pektinolytischen
Enzymen zur Herstellung von Frucht- oder Gemüsesaft. Wenigstens
eines der Enzyme ist von Trichoderma reesei erhältlich.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung Polypeptidsequenzen
mit pektinolytischer Aktivität mit Eignung für
die Behandlung von Obst- oder Gemüsemaische sowie Polynukleotide,
die für die Polypeptidsequenzen codieren. Insbesondere
betrifft die Erfindung die Verwendung einer Polygalacturonase von
Trichoderma reesei bei der Behandlung von Obst- oder Gemüsemaische,
insbesondere Apfelmaische, sowie die Verwendung des Enzyms zur Herstellung
von Frucht- oder Gemüsesaft, insbesondere Apfelsaft.
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Pektinpolymere
sind wichtige Bestandteile von Pflanzenzellwänden. Pektin
ist das hauptsächliche Strukturpolysaccharid von Frucht-
oder Gemüselamella und -zellwänden. Die Textur
von Obst oder Gemüse hängt von der Menge an und
den Eigenschaften von Pektin ab. Im Allgemeinen enthält
unreifes Obst unlösliches Protopektin, wohingegen reifes
Obst mehr lösliches bzw. löslicheres Pektin enthält.
Pektin ist ein Heteropolysaccharid mit einem Rückgrat,
das aus alternierenden Homogalakturonanen (glatte Regionen bzw. „smooth
regions”) und Rhamnogalakturonanen (haarige Regionen bzw. „hairy
regions”) zusammengesetzt ist. Die glatten Regionen sind
lineare Polymere von 1,4-verknüpfter α-D-Galacturonsäure.
Die Galakturonsäurereste können an der Carboxylgruppe
methylverestert sein.
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Eine
Frucht enthält pektinolytische Enzyme, die am natürlichen
Mazerationsvorgang während und nach der Reifung beteiligt
sind. Industrielle Pektinasen werden bei der Bearbeitung von Obst
und Gemüse in Futtermitteln und Nahrungsmitteln eingesetzt.
In industriellen Verfahren werden Enzyme verwendet, z. B. bei der
Bearbeitung von Obst oder Gemüse, um Pektin zu hydrolysieren
und den Saft bzw. die Saftausbeute zu erhöhen, wenn Obst
oder Gemüse gepresst wird, um die Viskosität zu
verringern, so dass trübe Säfte konzentriert werden
können, oder um Pektin vollständig abzubauen,
so dass Säfte geklärt und konzentriert werden können.
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Frucht-
und Gemüsesäfte, insbesondere Saft, der aus Äpfeln
hergestellt wird, können entweder mittels eines Pressvorgangs
oder mittels Verflüssigungsverfahren hergestellt werden.
Beide Verfahren werden durch die Verwendung von pektinolytischen
Enzymen unterstützt. Grundsätzlich werden die
ganzen Früchte gemahlen und mit pektinolytischen Enzymen
vor dem Pressen behandelt, um die Zellwände zu lockern
und um den freien Fluss bzw. Ablauf des Saftes zu fördern.
Nach dem Pressen wird der Saft üblicherweise erhitzt, was
alle Enzyme in den Säften inaktiviert. Danach wird der
Saft in Klärtanks überführt, wo zusätzliches
Enzym zugegeben wird, um den Saft zu entpektinisieren und um Stärke
vor der Filtration zu hydrolysieren. Anschließend werden
die Enzyme während der späteren Pasteurisation
des Saftes oder im Verdampfer während der Konzentration
inaktiviert. Zum Beispiel ist bei der Produktion von Apfelsaft eine
gewisse Struktur bzw. ein gewisses Gefüge der Maische erforderlich,
um ein gutes Pressergebnis zu erhalten. Pektinasen, die den Abbau
oder die Mazeration von sogenannten unlöslichen Pektinen
provozieren, sind ungünstig, da sie die Feststoffe bzw.
den Feststoffgehalt im Saft erhöhen. Falls die Struktur
vollständig zerstört wird, wird der sogenannte
Apfelmuseffekt („apple sauce effect”) erzielt
und der Saft ist nach dem Pressen sehr trüb. Pektinasen
wirken hauptsächlich auf lösliche Pektine ein
und resultieren folglich in einer niedrigeren Viskosität
des Saft-Assays („juice assay”) und einem sehr
leichten Ablauf. Bei der Herstellung von Pürees bzw. Mark
sind mazerative Eigenschaften bevorzugt.
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Im
Stand Technik sind Obstmaischen/Fruchtsäfte bereits unter
Verwendung pektinolytischer Enzyme, die Pektinasen der glatten und
haarigen Region enthalten, hergestellt worden. Pektinasen der „glatten
Region” („smooth region pectinases”)
umfassen Pektinesterasen (oder Pektinmethylesterasen), Polygalacturonasen und
Pektinlyasen (oder Pektintranseliminasen). Pektinasen der „haarigen
Region” („hairy region pectinases”) umfassen
unter anderem hauptsächlich endo-Arabanasen, Arabinofuranosidasen,
Rhamnogalakturonasen, Arabinogalactanasen. Beide Enzymkategorien
sind in Standardpektinasezubereitungen, die von Aspergillus niger
stammen, vorhanden. Im Verfahren nach dem Stand der Technik wird
die Pektinase während des Zerkleinerns der Äpfel
zugegeben, um eine geeignete Verteilung des Enzyms in der Maische
zu erzielen, da Rühren nicht empfohlen wird. Nach einer
Haltezeit von 30–120 Minuten wird die Maische mittels Horizontal-
oder Bandpresssystemen gepresst. Der erhaltene Saft wird gesiebt,
um grobe Partikel abzutrennen. Danach wird der Saft pasteurisiert
oder seine Aromen werden in einem Vakuumverdampfer abgetrieben („essence-stripped”).
Nach der Rückkühlen auf etwa 48–52°C
findet eine Saftbehandlung zum Entpektinisieren und Abbauen der
Stärke statt. Diese Behandlung dauert etwa 1–2
h, gefolgt von einem Filtrationsverfahren, d. h. Ultrafiltration.
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Pektinasezubereitungen
(Pektinasezusammensetzungen) des Stands der Technik, die aus Pektinasen
der „glatten Region” und der „haarigen
Region” bestehen, sind für derartige beschriebene
Pressverfahren nicht geeignet, da sie die Maische verflüssigen
und hohe Mengen an Feststoffen im Saft bewirken. Die ausschließliche
Anwendung einer spezifischen Polygalacturonase in Kombination mit
einer Esterase für hochverestertes Pektin („high
pectin esterase”) liefert viel bessere Pressergebnisse,
d. h. kürzere Presszyklen, höhere Pressausbeuten
und geringere Feststoffkonzentrationen im Saft. Darüber
hinaus enthält der Saft weniger oder kein verbleibendes
Pektin, was die nachfolgende Entpektinisierung und Filtration verbessert.
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Bei
der Bearbeitung von klaren Säften ist eine zweite Bearbeitungsstufe,
die als „Entpektinisierung” bezeichnet wird, erforderlich,
bei der üblicherweise sowohl Pektinasen der „glatten
Region” als auch der „haarigen Region” verwendet
werden. Im Prinzip ist es notwendig, alle vorhandenen hochmolekularen
Substanzen (hauptsächlich Pektine, Stärke usw.)
abzubauen, um ein optimiertes Ultrafiltrationsverfahren zu erzielen.
Die Pektinasen, die in dem Verfahren des Stands der Technik verwendet
werden, sind nicht zufriedenstellend, was ihre Leistung bzw. ihr
Verhalten bei höheren Temperaturen oder die Qualität
des erhaltenen Saftes anbelangt.
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Gegenwärtig
sind keine Pektinasen verfügbar, die bei höheren
Temperaturen (> 60°C)
aktiv sind. Darüber hinaus sind Pektinasen, die für
die Maischebehandlung verwendet werden, wobei direkt ein klarer
Saft nach dem Pressen ohne verbleibendes Pektin erhalten wird, gegenwärtig
nicht in zufriedenstellender Weise verfügbar. Pektinolytische
Enzyme sind aus dem Stand der Technik bekannt. Aspergillus-Pektinasen
sind zum Beispiel in
WO 94/14952 und
WO 94/14966 offenbart.
Die Druckschrift
Carbohydrate Research 338 (2003), 515–524 beschreibt
die Isolation und Charakterisierung von zwei Polygalacturonase-Isoformen
von Trichoderma reesei (ATCC 26920), die zur Glykosylhydrolase-Familie
28 gehören. Das Enzym ist charakterisiert hinsichtlich
seiner pH- und Temperatureigenschaften. Eine besondere Verwendung
für die genannten Polygalacturonasen wird nicht beschrieben.
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Folglich
bestand im Stand der Technik ein Bedarf an pektinolytischen Enzymen,
die für die Behandlung von Obst- oder Gemüsemaische
geeignet sind, in Hinblick auf eine leichtere Handhabung, was die
Temperatureigenschaften und die Durchführung des Verfahrens
anbelangt.
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Demgemäß ist
es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren
zur Herstellung vom Frucht- oder Gemüsesaft bereitzustellen.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es insbesondere, ein verbessertes
Verfahren zur Herstellung von Obst- oder Gemüsemaische
bereitzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren
soll zu einer besseren Ausbeute und Qualität in Hinblick
auf den am Ende erhaltenen Saft führen. Darüber
hinaus sollte das erfindungsgemäße Verfahren über
einen breiten Bereich von Temperaturen hinweg durchführbar
sein und es sollte auch zu guten Ergebnissen führen, wenn
das Verfahren bei hohen Temperaturen durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren soll die Extrahierbarkeit
oder Abbaubarkeit und somit die Pressfähigkeit der Maische
verbessern. Es soll zu Säften mit einem geringen Gehalt
an verbleibenden Pektinen nach dem Pressen führen, d. h.
die Klarheit der erhaltenen Säfte soll verbessert werden,
und somit sollen arbeitsaufwendige Filtrationen vermieden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren sollte für
unterschiedliche Früchte geeignet sein.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Gene bereitzustellen, die
für pektinolytische Enzyme codieren, sowie die Sequenzen
von Polypeptiden mit pektinolytischer Aktivität, die Eignung
für das oben genannte Verfahren besitzen, bereitzustellen.
Insbesondere sollen die Sequenzen der Erfindung für pektinolytische
Enzyme codieren, die einen breiten Anwendungsbereich aufweisen und
zu Verbesserungen in dem Verfahren der Behandlung von Maische und
der Herstellung von Frucht- oder Gemüsesaft führen.
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Es
ist nun überraschenderweise festgestellt worden, dass Pektinasen
aus Trichoderma reesei eine exzellente Leistung bei der Behandlung
von Obst- oder Gemüsemaische und insbesondere bei der Behandlung einer
Maische aus Früchten, die lösliches oder gering
verestertes Pektin enthalten, zeigt. Insbesondere ist festgestellt
worden, dass die Trchoderma-reesei-Polygalacturonase (PGA1) eine
exzellente Leistung bei Behandlungen von Apfelmaische zeigt. Es
ist überraschenderweise festgestellt worden, dass Trichoderma-reesei-Polygalacturonase
(PGA1) als das einzige Enzym für die Behandlung einer Maische
aus Früchten, die lösliches oder gering verestertes
Pektin enthalten, verwendet werden kann und dass das Verfahren in
günstiger Weise bei erhöhten Temperaturen durchgeführt
werden kann. Es ist ferner festgestellt worden, dass die Trichoderma-reesei-Polygalacturonase
PGA1 in günstiger Weise in Kombination mit weiteren pektinolytischen
Enzymen, wie zum Beispiel Pektinmethylesterasen, Polygalacturonasen,
Pektinlyasen, Pektatlyasen, Arabinofuranosidasen, endo-Arabanasen
oder Rhamnogalacturonasen, verwendet werden kann, um die Behandlung
von Obst maische sogar ausgehend von Früchten, die hochverestertes
oder unlösliches Pektin aufweisen, zu verbessern, wobei
das Verfahren bei einer Temperatur durchgeführt werden
muss, die mit den verwendeten Enzymen kompatibel ist.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von einem oder mehreren pektinolytischen
Enzym(en) zur Behandlung von Obst- oder Gemüsemaische,
wobei wenigstens ein pektinolytisches Enzym von bzw. aus Trichoderma
reesei erhältlich ist. Insbesondere betrifft die Erfindung
die Verwendung einer Polygalacturonase von Trichoderma reesei bei
der Behandlung von Apfelmaische. Darüber hinaus betrifft
die Erfindung das Verfahren zur enzymatischen Behandlung von Obst-
oder Gemüsemaische, das die Stufe des Zugebens von einem
oder mehreren pektinolytischen Enzym(en) umfasst, sowie ein Verfahren
zur Herstellung eines Frucht- oder Gemüsesaftes, umfassend
das Verfahren zur enzymatischen Behandlung von Obst- oder Gemüsemaische,
wobei wenigstens ein pektinolytisches Enzym von Trichoderma reesei
erhältlich ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein
Verfahren zur enzymatischen Behandlung von Apfelmaische, wobei eine
Polygalacturonase von Trichoderma reesei mit SEQ ID NO: 2 verwendet
wird.
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Die
Erfindung betrifft darüber hinaus ein rekombinantes DNA-Molekül,
das bei Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirtszelle für ein Polypeptid mit endo-Polygalacturonaseaktivität
codiert, wobei das rekombinante DNA-Molekül eine DNA-Sequenz
umfasst, ausgewählt aus a) DNA-Sequenzen mit oder umfassend
SEQ ID NO: 1 (pga1), b) DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen
von a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren, c) DNA-Sequenzen,
die einen Grad der Identität von 70% bis 98% zu den Sequenzen
von a) haben, oder d) DNA-Sequenzen, die mit den Sequenzen von a),
b) oder c) aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes verwandt
sind.
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Die
Erfindung betrifft darüber hinaus ein rekombinantes DNA-Molekül,
das bei Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirtszelle für ein Polypeptid mit exo-Polygalacturonaseaktivität
codiert. Das rekombinante DNA-Molekül umfasst eine DNA-Sequenz,
ausgewählt aus a) DNA-Sequenzen mit oder umfas send SEQ
ID NO: 3 (pgx1), b) DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen von
a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren, c) DNA-Sequenzen,
die einen Grad der Identität von 60% bis 98% zu den Sequenzen von
a) haben, oder d) DNA-Sequenzen, die mit den Sequenzen von a), b)
oder c) aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes verwandt
sind.
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Weiterhin
betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das
bei Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle
für ein Polypeptid mit exo-Rhamnogalacturonaseaktivität
codiert, wobei das rekombinante DNA-Molekül eine DNA-Sequenz
umfasst, ausgewählt aus DNA-Sequenzen mit oder umfassend
SEQ ID NO: 5 (rgx1), b) DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen
von a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren, c) DNA-Sequenzen
mit einem Grad der Identität von 60% bis 98% zu den Sequenzen
von a), oder d) DNA-Sequenzen, die mit den Sequenzen von a), b)
oder c) aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes verwandt
sind.
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Die
Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Molekül,
das bei Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirtszelle für ein Polypeptid mit Xylogalacturonaseaktivität
codiert, wobei das rekombinante DNA-Molekül eine DNA-Sequenz
umfasst, ausgewählt aus a) DNA-Sequenzen mit oder umfassend
SEQ ID NO: 7 (xga1), b) DNA-Sequenzen, die mit den Sequenzen von
a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren, c) DNA-Sequenzen
mit einem Grad der Identität von 60% bis 98% zu den Sequenzen
von a), oder d) DNA-Sequenzen, die mit den Sequenzen von a), b)
oder c) aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes verwandt
sind.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, das pektinolytische Aktivität
aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt
aus: a) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 77% Identität, vorzugsweise wenigstens 80%
Identität, bevorzugter wenigstens 85% Identität,
noch bevorzugter wenigstens 90% Identität, noch bevorzugter
wenigstens 95% Identität und noch bevorzugter wenigstens 98%
Identität zu der Sequenz des PGAI-Polypeptids (SEQ ID NO:
2); b) einer Variante von a), umfassend ein Fragment mit pektinolytischer
Aktivität; und c) einem Fragment von a) oder b) mit pektinolytischer
Aktivität.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Polypeptid, das exo-Polygalacturonase-,
exo-Rhamnogalacturonase- oder Xylogalacturonaseaktivität
aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt
aus a) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 60% Identität, vorzugsweise wenigstens 70% Identität,
bevorzugter wenigstens 80% Identität, noch bevorzugter
wenigstens 90% Identität und noch bevorzugter wenigstens
95% Identität zu der Sequenz der Polypeptide SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8, und b) einer Variante von a).
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Für
den Zweck der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „pektinolytisches
Enzym” Pektinasen, Pektinesterasen (oder Pektinmethylesterasen),
Polygalacturonasen, Pektinlyasen (oder Pektintranseliminasen), Pektatlyasen
(oder Pektattranseliminasen), Arabinofuranosidasen, endo-Arabanasen
oder Rhamnogalacturonasen umfassen.
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Wenn
eine Obst- oder Gemüsemaische gemäß der
vorliegenden Erfindung hergestellt wird, wird das fragliche Obst
oder Gemüse zuerst zerkleinert, anschließend wird
die Maische mit dem erfindungsgemäßen pektinolytischen
Enzym behandelt, dann wird die Maische gepresst und der so erhaltene
Saft wird gegebenenfalls pasteurisiert und gegebenenfalls weiter
mit (dem) pektinolytischen Enzym(en) und/oder mit anderen Enzymen,
die für die Führung des Verfahrens geeignet sind,
behandelt. In diesem Zusammenhang sollten die Temperaturcharakteristika
der weiteren Enzyme, die verwendet werden sollen, berücksichtigt
werden, was die gesamte Führung des Verfahrens bei höheren
Temperaturen anbelangt.
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Das
pektinolytische Enzym wird in direkter Weise während oder
nach dem Zerkleinern und in Mengen, die auf dem Fachgebiet üblich
sind, zugegeben. Die bevorzugte Anwendung ist es, eine Pektinasezubereitung, bestehend
aus 50.000– 100.000 PGU/mg, in einer 1- bis 5%-igen Lösung
zu verwenden. Die empfohlene Dosierung des Enzyms ist 50–100
g/t Früchte. Die empfohlene Reaktionstemperatur beträgt
10–30°C, die Reaktionszeit beträgt 30–120
Minuten. Der mittlere pH der Maische beträgt 3,2–3,6.
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Das
pektinolytische Enzym kann in jeder beliebigen Form, die zweckdienlich
ist und mit der Führung des Verfahrens kompatibel ist,
zugegeben werden.
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Das
pektinolytische Enzym wird vorzugsweise als konzentrierte oder verdünnte
flüssige Lösung zugegeben.
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Vorzugsweise
ist das pektinolytische Enzym ein pektinolytisches Enzym, das eine
der Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID
NO: 8 aufweist. Am bevorzugtesten ist die Polygalacturonase von
Trichoderma reesei mit SEQ ID NO: 2.
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Das
oben beschriebene Verfahren ist geeignet für die Behandlung
einer beliebigen Obst- oder Gemüsemaische. Geeignete Früchte
sind ausgewählt aus Äpfeln, Birnen, Trauben, weißen
Trauben, roten Trauben, Beeren und Pflaumen bzw. Zwetschgen. Das
Verfahren ist sowohl für Früchte, die bei kalten
Temperaturen (z. B. 10–30°C) bearbeitet werden,
als auch für Früchte, die bei hohen Temperaturen
(z. B. 50°C) bearbeitet werden, geeignet. Geeignete Gemüse
sind ausgewählt aus Karotten und Tomaten. Andere bearbeitbare
Materialien umfassen Kaffee- oder Kakaobohnen und Pfeffer.
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Die
günstigsten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Obstmaische
eine Apfelmaische ist und das verwendete Enzym Polygalacturonase
von Trichoderma reesei ist. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erhalten,
wenn die Obstmaische eine Maische aus Früchten, die gering
verestertes und lösliches Pektin enthalten, wie Erdbeeren
oder Pflaumen, ist. Es ist festgestellt worden, dass in diesem Falle
ein Saft bei hoher Ausbeute und hoher Qualität durch die
Verwendung von Trichoderma-PGA1 als einziges Enzym erhalten werden
kann. Im Falle von Früch ten, die hochverestertes und/oder
unlösliches Pektin enthalten, kann die Verwendung von zusätzlichen
pektinolytischen Enzymen in dem Verfahren zur Herstellung eines
entsprechenden Saftes notwendig sein.
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Die
Erfindung betrifft auch die DNA- und Proteinsequenzen von neuen
pektinolytischen Enzymen von Trichoderma reesei. Diese Sequenzen
sind eine endo-Polygalacturonase (pga1), eine exo-Polygalacturonase (pgx1),
eine exo-Rhamnogalacturonase (rgx1) und eine Xylogalacturonase (xga1).
Die Sequenzen sind im beiligenden Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:
1 bis SEQ ID NO: 8 angegeben.
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Die
Erfindung betrifft auch Varianten und Derivate dieser DNA-Sequenzen,
solange sie für ein Polypeptid, das die beanspruchte Aktivität
aufweist, codieren. Insbesondere sind von der Erfindung DNA-Sequenzen
umfasst, die mit der jeweiligen Sequenz unter stringenten Bedingungen
hybridisieren. Beispiele für stringente Bedingungen sind
eine Hybridisierung bei 65°C, 18 h in Dextransulfat-Lösung
(GenescreenPlus, Dupont), Waschen der Filter für 30 Minuten,
zuerst mit 6 × SSC, zweimal mit 2 × SSC, dreimal
mit 3 × SSC, mit 0,1% SDS, und danach 0,2 × SSC
bei 65°C (Membrantransfer- und Detektionsverfahren, Amersham).
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Die
Erfindung betrifft vorzugsweise ein Polynukleotid mit einem Grad
der Identität von wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens
80%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90%,
noch bevorzugter wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98%
zu der Sequenz von pga1 (SEQ ID NO: 1).
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Die
Erfindung betrifft vorzugsweise ein Polynukleotid mit einem Grad
der Identität von wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens
70%, bevorzugter wenigstens 75%, noch bevorzugter wenigstens 80%,
noch bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90%,
noch bevorzugter wenigstens 95% und noch bevorzugter wenigstens
98% zu einer der Sequenzen, ausgewählt aus pgx1 (SEQ ID
NO: 3), rgx1 (SEQ ID NO: 5) und xga1 (SEQ ID NO: 7).
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Weiterhin
betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die mit den Sequenzen der
vorliegenden Erfindung aufgrund der Degeneriertheit des genetischen
Codes verwandt sind, sowie alle ihre allelischen Varianten. Die Degeneriertheit
des genetischen Codes kann aus einer natürlichen Degeneriertheit
oder aus einem speziell gewählten Gebrauch des Codons resultieren.
Natürlich vorkommende allelische Varianten können
unter Verwendung von gut bekannten Techniken der Molekularbiologie,
wie zum Beispiel die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Hybridisierungstechniken,
identifiziert werden.
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Eine
DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid gemäß der
vorliegenden Erfindung codiert, kann verwendet werden, um eine beliebige
Wirtszelle, wie zum Beispiel Zellen von Pilzen, Hefe, Bakterien,
Pflanzen oder Säugern, zu transformieren.
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Der
Grad der Identität wird vorzugsweise bestimmt, indem die
Anzahl der Reste der kürzeren Sequenz, die am Vergleich
beteiligt sind und ein „geeignetes” Gegenstück
in der anderen Sequenz haben, detektiert wird. In dieser Hinsicht
ist Homologie als Grad der Identität definiert. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Identität
vorzugsweise auf dem üblichen Weg unter Verwendung von
Standardalgorithmen bestimmt. Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden nur die cDNAs der jeweiligen Proteine für
den Vergleich verwendet und ähnliche, vorzugsweise identische,
Sequenz-Gegenstücke wurden als homologe Sequenzen mittels
bekannter Computerprogramme bestimmt. Ein Beispiel für
ein derartiges Programm ist „Clone Manager Suite”,
ein Programm, das den Programmteil „Align Part” umfasst
und verkauft wird von Scientific & Educational
Software, Durham, NC, USA. Unter der Option „local alignment” bzw. „lokales
Alignment” führt dieses Programm einen Vergleich
von zwei DNA-Sequenzen, wie oben definiert, durch, wobei entweder
die Methode „FastScan – MaxScore” oder
die Needleman-Wunsch-Methode verwendet werden und wobei die Default-Werte
bzw. Standardeinstellungen beibehalten werden. Gemäß der
vorliegenden Erfindung wurde die Programmversion „Clone
Manager 7 Align Plus 5”, die die Funktionen „Compare
Two Sequences/Global/Compare DNA sequences” bzw. ”Vergleiche
zwei DNA-Sequenzen/Global/Vergleiche DNA-Sequenzen” einschließt,
insbesondere zur Bestimmung des Grades der Identität verwendet.
In diesem Falle wurden Algorithmen verwendet, die über
die nachstehenden Quellen zugänglich sind: Hirschberg,
D. S. (1975) A linear space algorithm for computing longest common
subsequences, Commun. Assoc. Comput. Mach. 18: 341–343; Myers,
E. W. and W. Miller. (1988) Optimal alignments in linear space,
CABIOS 4:1, 11–17; Chao, K-M, W. R. Pearson
and W. Miller. (1992) Aligning two sequences within a specified
diagonal band, CABIOS 8:5, 481–487.
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Die
Expression des/der klonierten Gensequenz(en) resultiert in der Produktion
des gewünschten Proteins oder in der Produktion eines Fragments
dieses Proteins. Diese Expression kann auf eine kontinuierliche Weise
in den transformierten Zellen stattfinden oder auf eine kontrollierte
Weise.
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Fragmente
verstehen sich dahingehend, dass sie Teile von Polypeptid- oder
Nukleinsäuremolekülen sind, die lang genug sind,
um die gewünschten enzymatischen Eigenschaften aufzuweisen
oder um für die beschriebenen pektinolytischen Polypeptide
oder ein biologisch aktives Fragment davon zu codieren. Vorzugsweise
sind fragmentierte Sequenzen die jeweiligen reifen Polypeptidsequenzen
ohne eine Signalsequenz.
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Die
Erfindung betrifft auch Polypeptide, die Sequenzen mit einem Grad
der Identität von wenigstens 60%, vorzugsweise wenigstens
70%, bevorzugter wenigstens 80%, noch bevorzugter wenigstens 90%
und am bevorzugtesten wenigstens 95% zu den obigen Polypeptidsequenzen
SEQ ID NOs: 2, 4, 6 oder 8 oder Fragmenten davon oder Teilen davon
aufweisen, solange das Polypeptid die jeweilige pektinolytische
Aktivität beibehält. Vorzugsweise betrifft die
Erfindung ein Polypeptid mit einem Grad der Identität von
wenigstens 77%, vorzugsweise wenigstens 80%, bevorzugter wenigstens
85%, noch bevorzugter wenigstens 90%, noch bevorzugter wenigstens
95% und noch bevorzugter wenigstens 98% zu der Sequenz des PGA1-Polypeptids
(SEQ ID NO: 2).
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Wie
im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Identität” von
Polypeptiden auf die globale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen,
die miteinander von der ersten Aminosäure, die durch das
entsprechende Gen codiert wird, bis zur letzten Aminosäure
verglichen werden. Die Identität der Volllängensequenzen
wird unter Verwendung des „Needleman-Wunsch global alignment”-Programms
aus dem Programmpaket EMBOSS (European Molecular Biology
Open Software Suite; Rice et al., 2000), Version 3.0.0, mit
den folgenden Parametern gemessen: EMBLOSUM62, „Gap penalty” 10.0, „Extend
penalty” 0.5. Der Algorithmus ist beschrieben in Needleman
und Wunsch (1970) Journal of Molecular Biology 48, 443–453.
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Die
Begriffe „Protein”, „Peptid” und „Polypeptid” sollen
austauschbar sein. Ein Polypeptid oder Enzym mit endo-Polygalacturonase-,
exo-Polygalacturonase-, exo-Rhamnogalacturonase- oder Xylogalacturonaseaktivität
bezeichnet ein Enzym, das die genannte Aktivität gemäß etablierter
Assays auf dem Fachgebiet aufweist. Die Erfindung umfasst auch Varianten
der beanspruchten Enzyme, solange sie ihre ursprüngliche
Aktivität beibehalten. Eine Variante gemäß der
vorliegenden Erfindung umfasst Varianten von Polypeptiden, die mittels
Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäure(n)
zum N-terminalen und/oder C-terminalen Ende des nativen Proteins;
Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäure(n)
an einer oder mehreren Stelle(n) im nativen Protein oder Substitution
von einer oder mehreren Aminosäure(n) an einer oder mehreren
Stelle(n) im Enzym abgeleitet werden. Die Herstellung von derartigen
Varianten ist Fachleuten auf dem Gebiet im Allgemeinen gut bekannt.
Varianten von Aminosäuresequenzen von Polypeptiden können
zum Beispiel durch Mutation in der DNA hergestellt werden. Verfahren
der Mutagenese und Veränderungen in der Nukleotidsequenz
sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt (vgl. zum Beispiel
Kunkel,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985),
Kunkel
et al., Methods in Enzymol., 154:367 (1987),
US-Patent Nr. 4,873,192 ,
Walker und
Gaastra, Hrsg., Techniques in Molecular Biology, Mac Millan Publishing
Company, New York (1983)). Verweise auf geeignete Substitutionen
von Aminosäuren, die die biologische Aktivität
des interessierenden Proteins nicht negativ beeinflussen, können
im Modell von
Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence
and Structure, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C. (1978),
gefunden werden. Konservative Substitutionen sind bevorzugt, wie
zum Beispiel das Austauschen einer Aminosäure durch eine
andere mit ähnlichen Eigenschaften.
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Diese
Art von Aminosäuren, die innerhalb einer Gruppe austauschbar
sind, sind in der folgenden Tabelle aufgelistet, jedoch nicht darauf
beschränkt.
| aliphatisch | unpolar | G
A P M |
| I
L V F W |
| polar
und ungeladen | C
S T N Q Y |
| polar und geladen | D
E |
| K
R H |
| aromatisch | | H
F W Y |
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Die
Erfindung betrifft auch isolierte oder im Wesentlichen gereinigte
Nukleinsäurezubereitungen(-Zusammensetzungen) oder Proteinzubereitungen(-Zusammensetzungen).
In dieser Hinsicht bezieht sich ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid/Polypeptid
oder dessen Abschnitt auf ein Polynukleotid oder Polypeptid oder
dessen Abschnitt, das/der isoliert von seiner natürlichen
Umgebung vorkommt. Ein isolierter Abschnitt einer Polynukleinsäure
oder eines Polypeptids kann in gereinigter Form vorkommen oder er
kann in einer nicht nativen Umgebung, wie zum Beispiel einer transgenen
Wirtszelle, vorkommen.
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Die
folgende Erfindung betrifft auch Expressionskassetten, die verwendet
werden können, um einen offenen Leserahmen, der für
ein pektinolytisches Enzym gemäß der Erfindung
codiert, in eine Wirtszelle einzuführen. Sie umfassen vorzugsweise
einen Promotor mit einer Transkriptionsinitiationsregion bzw. Transkriptionsstartregion,
der mit dem offenen Leserahmen der gewünschten DNA-Sequenz
verknüpft ist. Eine derartige Expressionskassette kann
eine Vielfalt von Restriktionsschnittstellen für die Insertion
des offenen Leserahmens und/oder von anderen DNAs, z. B. eine Transkriptionsregulatorregion
und/oder selektierbare Marker gene, umfassen. In der 5'→3'-Richtung
der Transkription umfasst die Expressionskassette einen Promotor
mit einer Transkriptions- und Translationsstartregion, die gewünschte
DNA-Sequenz und eine Translations- und Transkriptionsterminationsregion(en).
Die Expressionskassette ist als solche in einer mikrobiellen Zelle
funktionell. Die Terminationsregion kann bezüglich des
Promotors oder der fraglichen DNA nativ sein oder sie kann aus einer
beliebigen anderen Quelle stammen.
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Der
Begriff „offener Leserahmen” (ORF) bezieht sich
auf die Aminosäuresequenz, die zwischen den Translationsstart-
und -stoppcodons einer codierenden Sequenz codiert ist. Die Begriffe „Startcodon” und „Stoppcodon” beziehen
sich auf eine Einheit aus drei zusammenhängenden Nukleotiden
(Codons) in einer codierenden Sequenz, die den Kettenbeginn und
das Kettenende der Proteinsynthese (mRNA-Translation) spezifizieren.
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Im
Zusammenhang mit einer Nukleinsäure bezieht sich „funktionelle
Verknüpfung” auf eine Verbindung als Teil des
gleichen Nukleinsäuremoleküls in einer geeigneten
Positionierung und mit einer geeigneten Orientierung zum Transkriptionsstart
des Moleküls. DNA, die mit einem Promotor funktionell verknüpft
ist, steht unter der Transkriptionsinitiationsregulation des Promotors.
Codierende Sequenzen können mit einer regulatorischen Sequenz
in Sinnorientierung („sense”) oder Gegensinnorientierung
(„antisense”) verknüpft sein. Unter Bezugnahme
auf Polypeptide bezieht sich „funktionelle Verknüpfung” auf
die Verbindung als Teil des gleichen Polypeptids, d. h. mittels
Peptidylbindungen.
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Gemäß der
vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Promotor verwendet werden. Üblicherweise bezieht
sich „Promotor” auf das Stromaufwärtige
der Nukleotidsequenz in Hinblick auf die codierende Sequenz und
kontrolliert die Expression der codierenden Sequenz durch Erkennung
der RNA-Polymerase und andere Faktoren, die für eine korrekte
Transkription notwendig sind. Der Promotor, der gemäß der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann einen Minimalpromotor
umfassen, d. h. eine kurze DNA-Sequenz aus einer TATA-Box und andere
Se quenzen, die die Transkriptionsstartstelle spezifizieren, an die/den
regulatorische Elemente für die Expression gebunden werden.
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Der
Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung kann
auch eine Nukleotidsequenz einschließen, die einen Minimalpromotor
und regulatorische Elemente umfasst; dieser Minimalpromotor kann
die Expression einer codierenden Sequenz oder funktionellen RNA
kontrollieren.
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Die
Erfindung betrifft auch Vektoren, die die DNA gemäß der
vorliegenden Erfindung einschließen. Diese Vektoren umfassen
ein beliebiges Plasmid, Cosmid, einen beliebigen Phagen und einen
anderen Vektor in einer doppelsträngigen oder einzelsträngigen,
linearen oder zirkulären Form; diese Vektoren könnten
selbst übertragen oder mobilisiert werden und sie können
einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt über eine Integration
in das zelluläre Genom transformieren oder sie treten extrachromosomal
auf (z. B. autonom replizierende Plasmide mit einem Replikationsursprung).
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Die
Konstruktion von Vektoren, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können, ist dem Fachmann aufgrund
der vorstehend genannten Offenbarung (siehe z. B. Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Coldspring
Harbor Laborstory Press, Plainview, N. Y. (1989)) bekannt. Die
Expressionskassette gemäß der vorliegenden Erfindung
kann eine oder mehrere Restriktionsenzymspaltstelle(n) zum Inserieren
der Nukleotidsequenz, die für ein pektinolytisches Enzym
codiert, unter der Regulation einer regulatorischen Sequenz umfassen.
Die Expressionskassette kann auch ein Terminationssignal, funktionell
verknüpft mit dem Polynukleotid, sowie regulatorische Sequenzen,
die für die korrekte Translation des Polynukleotids erforderlich
sind, umfassen.
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Die
Auswahl eines geeigneten Expressionsvektors hängt von den
Wirtszellen ab. Expressionsvektoren für Hefe oder Pilze
können einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor
und Enhancer sowie jede beliebige notwendige Ribosomenbindungsstelle,
Polyadenylierungsstelle, Splicedonor- und -akzeptorstelle, Transkriptionsterminationssequenz
und nicht transkribierte 5'-flankierende Sequenzen umfassen.
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Beispiele
für geeignete Wirtszellen sind: pilzliche Zellen der Gattung
Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Hypocrea, Neurospora, Mucor,
Penicillium, Chrysosporium, Myceliophthora, Fusarium usw., wie zum
Beispiel Hefen der Gattungen Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces,
Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula, Pichia und andere aus dieser
Kategorie. Geeignete Wirtssysteme sind zum Beispiel Pilze, wie Aspergilli,
z. B. Aspergillus niger (ATCC 9142) oder Aspergillus ficuum (NRLL
3135), oder Trichoderma (z. B. Trichoderma reesei QM6a und Derivative
davon) und Hefen, wie Saccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae,
oder Pichia, wie zum Beispiel Pichia pastoris, oder Hansenula, z.
B. H. polymorpha (DSMZ 70277). Derartige Mikroorganismen können
von anerkannten Hinterlegungsstellen erhalten werden, z. B. der
American Type Culture Collection (ATCC), dem Centraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS) [Zentralbüro für Pilzkulturen]
oder der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ) oder einer beliebigen anderen Hinterlegungsstelle.
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Zusätzlich
zu der Verwendung eines speziellen Promotors können andere
Typen von Elementen die Expression von klonierten Genen beeinflussen.
Es wurde gezeigt, dass insbesondere Introns das Potential zur Verstärkung
der Genexpression besitzen.
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Die
Expressionskassette kann auch weitere Elemente umfassen, wie zum
Beispiel Elemente, die durch endogene oder exogene Elemente reguliert
werden können, wie Zinkfingerproteine, einschließlich
natürlich vorkommender Zinkfingerproteine oder chimärer
Zinkfingerproteine.
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Die
Expressionskassette, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, kann auch Enhancer-Elemente oder stromaufwärtige
Promotorelemente umfassen.
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Vektoren,
die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, können auf eine derartige Weise konstruiert sein,
dass sie ein Enhancer-Element umfassen. Somit umfassen die Konstrukte
gemäß der vorliegenden Erfindung das interessierende
Gen zusammen mit einer 3'-DNA-Sequenz, die als Signal zum Terminieren
der Transkription und zum Ermöglichen der Polyadenylierung
der so erhaltenen mRNA wirkt. Eine beliebige Signalsequenz, die
die Sekretion aus dem gewählten Wirtsorganismus ermöglicht,
kann verwendet werden. Die bevorzugtesten Signalsequenzen für
die Sekretion aus filamentösen Pilzen sind die Glukoamylase(glaA)-
oder Phytase-Signalsequenz von Aspergillus niger, die TAKA-Amylase-Signalsequenz
von A. oryzae und die Cellobiohydrolase-I-Signalsequenz von T. reesei
oder Signalsequenzen, die von diesen abgeleitet sind. Alternativ
könnte die Signalsequenz des gewünschten Proteins
verwendet werden.
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Es
ist auch möglich, eine spezielle Leadersequenz zu verwenden,
da die DNA-Sequenz zwischen der Transkriptionsstartstelle und dem
Beginn der codierenden Sequenz, d. h. die nicht translatierte Leadersequenz,
die Genexpression beeinflussen kann. Bevorzugte Leadersequenzen
umfassen Sequenzen, die die optimale Expression der angehängten
Gene steuern bzw. kontrollieren, d. h. sie weisen eine bevorzugte
Konsensusleadersequenz auf, die die mRNA-Stabilität erhöht
oder erhält und eine unzweckdienliche Translationsinitiation
vermeidet. Die Wahl von derartigen Sequenzen ist dem Fachmann auf
dem Gebiet gut bekannt.
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Sobald
die Expressionskassette oder DNA-Sequenz gemäß der
vorliegenden Erfindung erhalten ist, kann sie mittels bekannter
Verfahren in Vektoren inseriert werden, um das codierte Polypeptid
in geeigneten Wirtssystemen zu überexprimieren. Jedoch
können DNA-Sequenzen selbst ebenso zum Transformieren geeigneter
Wirtssysteme der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Überexpression
des codierten Polypeptids zu erhalten.
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Sobald
eine DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung in einer geeigneten
Wirtszelle in einem geeigneten Medium exprimiert wird, kann das
codierte Enzym konzentriert und/oder isoliert werden, und zwar mittels bekannter
Verfahren, entweder aus dem Medium, falls das Enzym in das Medium
sekretiert wird, oder aus dem Wirtsorganismus, falls das Enzym intrazellulär
oder im periplasmatischen Raum auftritt. Bekannte Verfahren zum
Abtrennen der Biomasse und Feststoffe (aus) der Kultur, gefolgt
von Verfahren zum Konzentrieren des Enzyms können zur Produktion
von konzentrierten Enzymlösungen oder als Vorbereitung
auf die Dehydratation des Enzyms verwendet werden.
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Die
Erfindung betrifft auch Zubereitungen bzw. Präparationen,
die das Polypeptid gemäß der Erfindung einschließen.
Im Allgemeinen sind diese Zubereitungen flüssig oder trocken.
Flüssige Zubereitungen umfassen vorzugsweise das Enzym
in einer gereinigten oder angereicherten Form. Jedoch können
Hilfsstoffe bzw. Adjuvantien, wie ein Stabilisator mit Glyzerin,
Sorbit oder Propylenglykol, Borat, Additive, wie Salze, Zucker,
Konservierungsmittel, Mittel zur Einstellung des pH-Werts usw. zugesetzt
werden. Typische flüssige Zubereitungen sind wässrige
oder ölige Suspensionen. Wie im Kontext der vorliegenden
Erfindung verwendet, bezieht sich die „Enzymzubereitung” auf
ein beliebiges Enzymprodukt, das wenigstens ein pektinolytisches Enzym
der Erfindung enthält. Somit kann eine derartige Enzymzubereitung
ein verbrauchtes Kulturmedium oder ein Filtrat sein. Verbrauchtes
Kulturmedium meint das Kulturmedium des Wirts, umfassend die produzierten
Enzyme. Vorzugsweise werden die Wirtszellen nach der Produktion
von dem Medium abgetrennt. Falls gewünscht, können
derartige Zubereitungen sprühgetrocknet, granuliert oder
lyophilisiert sein oder die Zubereitungen können in sonstiger
Weise konzentriert und/oder für die Lagerung stabilisiert
sein. Sofern erforderlich, kann ein gewünschtes Enzym in Übereinstimmung
mit herkömmlichen Verfahren, wie Extraktion, Präzipitation, Chromatographie,
Elektrophorese oder dergleichen, weiter gereinigt werden.
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Es
ist jedoch ein Vorteil der Erfindung, dass das Kulturmedium mit
oder ohne Wirtszellen als Enzymzubereitung an sich, ohne weitere
Reinigung, verwendet werden kann, da das pektinolytische Enzym der
Erfindung in das Kulturmedium sekretiert werden kann und Aktivität
unter den Umgebungsbedingungen des verbrauchter Kulturmediums zeigt.
Derartige Enzymzubereitungen können in sehr wirtschaftlicher
Weise bereitgestellt und verwendet werden, da eine Isolation eines
spezifischen Enzyms aus dem Kulturmedium unnötig ist.
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Zusätzlich
zu dem pektinolytischen Enzym können die Enzymzubereitungen
ein oder mehrere andere(s) Enzym(e) umfassen, das/die zum Beispiel
andere Cellulasen, Amylasen, Lipasen, Proteasen, Hemicellulasen,
Xylanasen, Pektinasen und/oder Oxidasen, wie Laccasen und Peroxidasen,
sein kann/können.
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Zusätzlich
zu dem pektinolytischen Enzym kann die Enzymzubereitung Additive,
wie Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsmittel, Tenside bzw. oberflächenaktive
Mittel und/oder Komponenten des Kulturmediums enthalten. Bevorzugte
Additive sind die, die gewöhnlicherweise in Enzymzubereitungen
verwendet werden, gedacht für die Anwendung, in der die
Enzymzubereitung verwendet wird.
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Trockene
Zubereitungen können gefriergetrocknete, sprühgetrocknete
Zubereitungen, Instant-Zubereitungen bzw. schnelllösliche
Zubereitungen („instantized”), granulierte oder
extrudierte Zubereitungen einschließen, die einzig das
Enzym umfassen können oder Additive, wie Stärke,
Dextrin, Zucker, Mehl, Protein oder Öl, aufweisen.
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Die
beigelegten Figuren sollen die Erfindung detaillierter erläutern:
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1.
Schematische Darstellung der Expressionskassetten, die bei der Transformation
von Trichoderma-reesei-Protoplasten zum Überproduzieren
der Pektinaseproteine verwendet wurden. Die Pektinasegene standen
unter der Kontrolle des T.-reesei-cbh1 (cel7A)-Promotors (p cbh1)
und die Termination der Transkription wurde durch Verwendung der
T.-reesei-cbh1-Terminatorsequenz (t cbh1) sichergestellt. Eingeschlossen
war entweder das amdS-Gen oder das pyr4-Gen als Transformations-Selektionsmarker.
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2A–C)
pH-Abhängigkeiten der aus dem Stand der Technik bekannten
Aspergillus-PG1 (2A), Aspergillus-PG2 (2B)
und der überproduzierten rohen Tri choderma-PGA1-Zubereitung
der Erfindung (2C), bestimmt bei verschiedenen
pH-Werten (40°C, 60 min).
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2D–F)
Temperaturabhängigkeit der aus dem Stand der Technik bekannten
Aspergillus-PG1 (2D), Aspergillus-PG2 (2E)
und der überproduzierten rohen Trichoderma-PGA1-Zubereitung
der Erfindung (2F), bestimmt bei verschiedenen
Temperaturen (2D und 2E: pH
4,5, 2F: pH 5,0, 60 min).
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3.
SDS-PAGE-Analyse des Trichoderma-reesei-PGA1-Proteins. MW: Molekulargewichtsmarker, Bahn
1: Kulturüberstand der Transformante, die Trichoderma-PGA1 überproduziert,
wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Protein-Banden wurden mittels
Färbung mit „Coomassie Brilliant Blue” sichtbar
gemacht. Die Größe der Trichoderma-PGA1 beträgt
etwa 38 kDa.
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4. A) Saftausbeute nach Pressen der enzymbehandelten
Apfelmaischezubereitungen. Eine Dosierung von 100 ppm eines Gemisches,
enthaltend 50.000 PG-Einheiten/mg von einer der Trichoderma-PGA1s
(F050183 und F050200) oder der aus dem Stand der Technik bekannten
Aspergillus-PG1 (Referenz), alle supplementiert mit 2.000 PE-Einheiten/g
A.-niger-Pektinmethylesterase, wurde im Experiment verwendet. Bei
einem der Maischeversuche wurde kein Enzym zugegeben (Leerwert).
Die Enzyminkubationszeit betrug 60 min bei 25°C.
B)
Pressdiagramm, das die Saftausbeute nach jeder Pressstufe zeigt.
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5.
Trübung (gemessen als NTU) des Saftes nach Enzymbehandlung
und Pressen. Eine Dosierung von 100 ppm eines Gemisches, enthaltend
50.000 PG-Einheiten/mg von einer der Trichoderma-PGA1s (F050183
und F050200) oder der aus dem Stand der Technik bekannten Aspergillus-PG1
(Referenz), alle supplementiert mit 2.000 PE-Einheiten/g A.-niger-Pektinmethylesterase,
wurde in dem Experiment verwendet. Bei einem der Maischeversuche
wurde kein Enzym zugegeben (Leerwert). Die Enzyminkubationszeit
betrug 60 min bei 25°C.
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6.
Eine Fotografie der Versuchssäfte nach der Enzymbehandlung
und dem Pressen. Proben von links nach rechts: Leerwert (kein Enzym),
F050183, F050200 und die aus dem Stand der Technik bekannte Aspergillus-PG1
als Referenz.
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7.
Ausbeute (%) an Saft, erhalten aus Pressungen von Maischen verschiedener
Früchte/Gemüse nach Behandlung mit Trichoderma-reesei-PGA1.
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Der
E.-coli-Stamm, der das Plasmid pALK1958 (RF 6249) umfasst, wurde
bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland
am 19. Juli 2006 hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer DSM18450.
Das Plasmid pALK1958 trägt das Trichoderma-pga1-Gen (Tabelle
2) auf einem 1690 bp großen SacII-XhoI-Fragment (einschließlich 305
bp der 3'-Region des Gens), kloniert in einen gleichermaßen
geschnittenen Vektor pBluescript II SK+.
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Die
folgenden nicht einschränkenden Beispiele sollen den Gegenstand
der Erfindung detailliert erläutern.
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BEISPIEL 1: Genomweites Screening von
T. reesei nach pektinolytischen Enzymen
-
Standardverfahren
der Molekularbiologie wurden bei der Isolation und bei Enzymbehandlungen
von DNA (Plasmide, DNA-Fragmente), bei E.-coli-Transformationen
usw. verwendet. Die grundlegenden Verfahren sind in den Standardhandbüchern
der Molekularbiologie beschrieben, z. B. Sambrook et al.
(1989). Molecular cloning, a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laborstory, New York, USA und Sambrook und Russell (2001).
Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laborstory,
New York, USA.
-
Die
Genomdatenbank für Trichoderma reesei (die Anamorphe bzw.
Nebenfruchtform von Hypocrea jecorina) (http://gsphere.lanl.gov/trire1/trire1.home.html)
wurde mit den Sequenzen verschiedener Aspergillus-Pektinasen (Tabelle
1) durchsucht, wobei das Programm TBLASTN (Altschul et al.,
1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403–410)
verwendet wurde.
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Lediglich
eine Suche mit endo-Polygalacturonasen von A. niger, exo-Polygalacturonasen
von A. tubingensis, putativen exo-Rhamnogalacturonasen von A. niger
und endo-Xylogalacturonase von A. tubingensis ergab Treffer mit
signifikanter Ähnlichkeit (weniger als e-20 über
wenigstens 80% ihrer Länge), was in der Identifizierung
von vier verschiedenen offenen Leserahmen resultierte (Tabelle 2).
Die vollständigen codierenden Regionen dieser Sequenzen
wurden von
http://gsphere.lanl.gov/trire1/trire1.home.html erhalten. Tabelle 1. Aspergillus-Pectinasegensequenzen,
die bei der Recherche in der T.-reesei-Genomdatenbank verwendet
wurden.
| Name
des Enzyms | Gene | Eingangs-
bzw. Zugriffsnummer |
| endo-Polygalacturonasen
von A. niger | pgaA
pgaB
pgaC
pgaD
pgaE
pgaI
pgaII | CAB72125
CAB72126
CAA45707
CAB72931
CAA74744
CAA41693
CAA41694 |
| Pektinlyasen von A. niger | pelA
pelB
pelC
pelD | CAA43130
CAA46521
AAW03313
AAA32701 |
| Pektatlyase
von A. niger | plyA | CAC33162 |
| exo-Polygalacturonase
von A. tubingensis | pgaX | CAA68128 |
| (endo)-Xylogalacturonase
von A. tubingensis | xghA | CAC07733 |
| Rhamnogalacturonasen
von A. niger | rhgA
rhgB | CAA63911
CAA63912 |
| exo-Rhamnogalacturonasen
von A. niger | rgxA
rgxB
rgxC | ABD61566
ABD61567
ABD61568 |
| Rhamnogalacturonanlyase
von A. aculeatus | rhgB | 1NKG_A |
| Pektinmethylesterase
von A. aculeatus | pme1 | AAB42153 |
| Pektinmethylesterase
von A. oryzae | pmeA | BAA75474 |
| Pektinmethylesterase
von A. tubingensis | pmeA | P17872 |
| Rhamnogalacturonanacetylesterase
von A. aculeatus | rha1 | CAA61858 |
| Rhamnogalacturonanacetylesterase
von A. niger | rgaeA | CAC41360 |
Tabelle 2. Putative pektinasecodierende
Gene, die ausgehend von der T.-reesei-Genomdatenbank identifiziert wurden.
| Gen | Genmodell/ProtID | Scaffold:
Region (bp) | Identität
(%) |
| pga1 | fgenesh5_pg.C_scaffold_1000682/103049 | 1: 2495262–2496642 | Polygalacturonase
von A. fumigatus, EAL91052; 76% Identität
endo-Polygalacturonase
von A. nidulans, ABF50893; 74% Identität |
| pgx1 | fgenesh5_pg.C_scaffold_33000038/112140 | 33: 88035–89368 | exo-Polygalacturonase
von F. oxysporium, BAE97149; 56% Identität
exo-Polygalacturonase
von A. nidulans, ABF50895; 54% Identität |
| rgx1 | estExt_fgenesh5_pg.C_150014/122780 | 15:
45898–47405 | exo-Rhamnogalacturonase
von A. niger, ABD61567; 42% Identität
exo-Polygalacturonase
von A. fumigatus, EAL86831; 40% Identität |
| xga1 | e_gw1.33.41.1/70186 | 33: 90062–91279 | unbenanntes
Protein von A. oryzae, BAE61127; 54% Identität
Exopolygalacturonase
von A. fumigatus, XP_747488; 53% Identität |
-
Eine
Analyse der abgeleiteten Proteinsequenzen mit InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/, Apweiler
et al., 2000 Bioinformatics 5 16(12): 1145–50)
identifizierte sie als Mitglieder der Glykosidhydrolase-Familie
28 (GH28; InterPro-Eingangsnummer PF00295). Die putativen pektinasecodierenden
Sequenzen von T. reesei zeigen alle eine engste Homologie zu Enzymen
von anderen Pilzen, die am Pektinabbau beteiligt sind (BLAsTP-Recherche,
Altschul et al., 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol.
Biol. 215: 403–410, Tabelle 2) und sie wurden
folglich mit pga1 (endo-Polygalacturonase), pgx1 (exo-Polygalacturonase),
xga1 (Xylogalacturonase) und rgx1 (exo- Rhamnogalacturonase) bezeichnet.
Die Identifizierung wurde weiter mittels einer phylogenetischen
Herangehensweise verifiziert (Mega 3.1, Kumar et al., 2004
MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis
and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics. 5: 150–163).
Drei „nicht-endo-Polygalacturonase”-Sektionen
des phylogenetischen Stammbaums bildeten dadurch vier Zweige. PGX1
wird in einem Zweig gefunden, der auch die bereits charakterisierten
exo-Polygalacturonasen von A. niger, A. tubingensis und Cochliobolus
carbonum enthält. XGA1 weist die stärkste Ähnlichkeit mit
einem kleinen Zweig auf, in dem eine Xylogalacturonanhydrolase von
A. tubingensis das einzige charakterisierte Enzym ist. XGA1 hat
weniger Ähnlichkeit mit den anderen Sequenzen in diesem
Zweig als diese zueinander zeigen, und es ist daher möglich,
dass das T.-reesei-Enzym einige einzigartige Eigenschaften entwickelt
hat. Das gleiche gilt für RGX1, die den höchsten
Grad der Sequenzidentität zu putativen exo-Rhamnogalacturonasen
zeigt. Im korrespondierenden Zweig ist lediglich ein Enzym von A.
niger in Hinblick auf dessen Funktionalität untersucht
worden, ohne den genauen Reaktionsmechanismus zu bestimmen (Martens-Uzunova,
E. S., Zandleven, J. S., Benen, J. A., Awad, H., Kools, H. J., Beldman,
G., Voragen, A. G., Van den Berg, J. A. & Schaap, P. J. (2006) A new group
of exo-acting family 28 glycoside hydrolases of Aspergillus niger
that are involved in pectin degradation, Biochem J. 400, 43–52).
-
BEISPIEL 2: Klonierung der identifizierten
T.-reesei-Pektinasegene
-
Die
pga1-, pgx1-, rgx1- und xga1-Gene wurden ausgehend von genomischer
DNA von T. reesei amplifiziert, wobei das GoTaq
®-System
(Promega, USA) mit 2 mM MgCl
2 und 0.4 μM
sequenzspezifischen Primern, angegeben in Tabelle 3, verwendet wurde.
Die Bedingungen für die PCR-Reaktion waren wie folgt: Eine zweiminütige
anfängliche Denaturierungsstufe bei 95°C, gefolgt
von 28 Zyklen von 1 min bei 95°C, 45 s Anlagerung bzw.
Hybridisierung bei der Primer-spezifischen Temperatur (Tabelle 3_TP),
2 min Verlängerung bei 72°C, und eine abschließende
Verlängerung bei 72°C für 5 min. Die
DNA-Fragmente der erwarteten Größen wurden isoliert
und sie wurden anschließend in dem Vektor pBlueScript II
SK+ (Stratagene, USA) kloniert. Die Inserts wurden mittels Sequenzierung
charakterisiert. Tabelle
3. Die Primer, die zum Amplifizieren der Pektinasegene von T. reesei
verwendet wurden. Die genomische DNA von T. reesei QM9414 wurde
in den PCR-Reaktionen als Matrize verwendet. Die Bezeichnung des Plasmids,
das das amplifizierte Genfragment enthält, ist angegeben.
- (aAnlagerungs-
bzw. Annealingtemperatur, die zum Amplifizieren des Pektinasegens
von T. reesei verwendet wurde.
- (bDie codierende Region des Volllängen-rgx1-Gens
bestand aus zwei Plasmiden.
-
Die
relevante Information auf den Pektinasegenen und die abgeleiteten
Proteinsequenzen sind in Tabelle 4 bzw. Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 4. Zusammenfassung der Pektinasegene
von T. reesei.
| Pectinasegen | Länge
mit Introns (bp)(a | Codierende
Region (bp)(b | Anzahl
der Introns | Länge
der Introns (bp) |
| pga1 | 1381 | 1137 | 4 | 64,
59, 59, 59 |
| pgx1 | 1421 | 1311 | 2 | 50,
57 |
| xga1 | 1218 | 1215 | 0 | |
| rgx1 | 1374 | 1371 | 0 | |
- (aDas STOP-Codon
ist einschlossen.
- (bDas STOP-Codon ist nicht eingeschlossen.
Tabelle 5. Zusammenfassung der abgeleiteten
Pektinasesequenzen von T. reesei. | CBH-Protein | Anzahl
der Aminosäuren (AS) | Länge
der ss NN/HMM(a | Vorhergesagtes
MW (Da, ss nicht eingeschlossen)(b | Vorhergesagter
pl (ss nicht eingeschlossen) | Putative
N-Glykosylierungsstellen(c |
| PGAI | 379 | 21/21 | 36
187 | 5,51 | 3 |
| PGXI | 437 | 22/22 | 45
559 | 5,51 | 12 |
| XGAI | 405 | 18/18 | 40
023 | 7,10 | 8 |
| RGXI | 457 | 17/21 | 48
700(d/48340 | 4,79 | 7 |
- (aDie Vorhersage
der Signalsequenz (ss) wurde unter Verwendung des Programms Signale
V3.0 (Nielsen et al., 1997. Identification of prokaryotic
and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage
sites. Protein Engineering 10: 1–6; Bendtsen
et al., 2004. Improved prediction of signal peptides: Signale 3.0.
J. Mol. Biol. 340: 783–795) erstellt; der NN-Wert
wurde unter Verwendung von neuronalen Netzwerken erhalten und der
HMM-Wert unter Verwendung von „hidden”-Markov-Modellen.
- (bDie vorhergesagte Signalsequenz war
nicht eingeschlossen. Die Vorhersage wurde unter Verwendung des Tools
Compute p1/MW auf dem ExPASy-Server (Gasteiger et al., 2003.
ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and
analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788) erstellt.
- (cDie Anzahl der Sequenzen N-X-S/T.
- (dDie Werte, die bei RGXI markiert sind,
sind nach Deletieren von zwei möglichen Signalsequenzen
gerechnet.
-
Die
Aminosäurereste, die als für die katalytische
Wirkung der endopolygalacturonase II von A. niger entscheidend angegeben
werden (van Santen et al., 1999. 1.68-A crystal structure
of endopolygalacturonase II from Aspergillus niger and identification
of active site residues by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 274:
30474–30480; Armand et al., 2000. The
active site topology of Aspergillus niger endopolygalacturonase II
as studied by site-directed mutagenesis. J Biol Chem. 275: 691–696)
werden ebenso bei PGAI, PGXI und XGAI von T. reesei identifiziert.
Dies weist darauf hin, dass die Pektinaseenzyme von T. reesei ähnliche
katalytische Eigenschaften aufweisen, wie die von A. niger. Zusätzlich
zu der Signatur des aktiven Zentrums, die typisch für GH28-Glykosidhydrolasen
ist, enthalten PGAI, PGXI and XGAI mehrere PbH1-Domänen
(parallele beta-Helix-Wiederholungen), die ebenso bei mehreren Typen
von pektinolytischen Enzymen gefunden werden (Jenkins & Pickersgill,
2001. The architecture of parallel betahelices and related folds.
Prog Biophys Mol Biol. 77: 111–175). Diese Feststellungen
bestätigten die pektinolytischen Merkmale der hierin angegebenen T.-reesei-Gene
weiter.
-
BEISPIEL 3: Überexpression der
Pektinasegene in Trichoderma reesei
-
Für
die Überexpression der Pektinasegene von T. reesei wurden
Expressionsplasmide konstruiert. Die konstruierten Expressionsplasmide
sind in Tabelle 6 aufgelistet. Die pga1-, pgx1-, rgx1- und xga1-Gene
wurden, einschließlich ihrer eigenen Signalsequenzen, genau
mit dem T.-reesei-cbh1 (cel7A)-Promotor fusioniert. Die Transkriptionstermination
wurde durch den T.-reesei-cel7A-Terminator sichergestellt und das
A.-nidulans-amdS-Markergen wurde für die Selektion der
Transformanten verwendet, wie in Paloheimo et al. (2003) High-yield
production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma
reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure.
Appl. Env. Microbiol. 69: 7073–7082, beschrieben.
Die linearen Expressionskassetten (1) wurden
aus den Vektorgrundgerüsten nach NotI-Verdau isoliert und
Protoplasten von T. reesei RF5455 wurden damit transformiert (bei
dem Stamm sind die Gene, die für die zwei hauptsächlichen
Cellulasen CBHI/Cel7A und EGII/Cel5A codieren, deletiert).
-
Das
Expressionsplasmid, das das endogene pyr4-Markengen einschließt,
wurde ebenso für das pga1-Gen konstruiert, indem ein 4,7
kb großes XbaI-HindIII-Genomfragment des T.-reesei-pyr4-Lokus
nach dem cel7A-Terminator in das Plasmid ligiert wurde. Die lineare
Expressionskassette wurde aus dem Vektorgrundgerüst nach
NotI-Verdau isoliert und Protoplasten von T. reesei RF5514 wurden
damit transformiert (bei dem Stamm sind die Gene, die für
die zwei hauptsächlichen Cellulasen CBHI/Cel7A und EGII/Cel5A
codieren, deletiert und der Stamm ist ebenfalls hinsichtlich Pyrimidin
auxotroph).
-
Die
Transformationen wurden durchgeführt, wie in
Penttilä et
al. (1987, A versatile transformation system for the cellulolytic
filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61: 155–164) beschrieben,
mit den in
Karhunen et al. (1993, High frequency one-step
gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction.
Mol. Gen. Genet. 241: 515–522) beschriebenen Modifikationen,
wobei entweder mit Acetamid als einziger Stickstoffquelle (amdS-Markergen)
oder ohne Uridin-Zusatz (pyr4-Markergen) selektiert wurde. Die Transformanten
wurden auf Selektionsplatten über einzelne Konidien selektiert,
bevor sie auf PD zur Sporulation gebracht wurden. Tabelle 6. Die Expressionskassetten, die
zum Überproduzieren von Pektinaseproteinen in Trichoderma
reesei konstruiert wurden. Die insgesamte Struktur der Expressionskassetten
war, wie in Fig. 1 beschrieben. Die klonierten pga1-, pgx1-, rgx1-
und xga1-Gene wurden genau mit dem T.-reesei-cbh1/cel7A-Promotor
fusioniert.
| T.-reesei-Pektinase | Expressionsplasmid | Größe
der Expressionskassette(a | cbh1-Terminator(b |
| PGAI | pALK1967
(amdS(c)
pALK1960 (pyr4(c) | 9,0
kb
10,0 kb | 627
bp (AvaII) |
| PGXI | pALK1968 | 9,2
kb | 627
bp (AvaII) |
| RGXI | pALK1974 | 8,8
kb | 627
bp (AvaII) |
| XGAI | pALK1969 | 8,6
kb | 627
bp (AvaII) |
- (aDie Expressionskassette
für die Transformation von T. reesei wurde aus dem Vektor-Grundgerüst
unter Anwendung eines Verdaus mit NotI isoliert.
- (bDie Zahl der Nukleotide aus der genomischen
cbh1-Terminatorregion nach dem STOP-Codon. Die Restriktionsschnittstelle
am 3'-Ende, die beim Ausschneiden des genomischen Genfragments verwendet
wurde, ist in runden Klammern eingeschlossen.
- (cZwei Expressionsplasmide wurden für
das pga1-Gen konstruiert; das Plasmid pALK1967 umfasste das amdS-Markergen
für die Transformantenselektion und das Plasmid pALK1960
umfasste das pyr4-Markergen.
-
Die
Pektinaseproduktion der Transformanten wurde ausgehend von den Kulturüberständen
der Schüttelkolben-Kulturen (50 ml) analysiert. Die Transformanten
wurden für sieben Tage in einem komplexen Laktose-basierten
Cellulaseinduzierenden Medium (
Joutsjoki et al. 1993. Transformation
of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P
(gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma
reesei. Curr. Genet. 24: 223–228), das mit 5%
KH
2PO
4 gepuffert
war, gezüchtet bzw. kultiviert. Die Polygalacturonaseaktivität
wurde mittels eines viskometrischen Verfahrens unter Verwendung
von Citruspektin (Copenhagen Pectin, X-2955, Dänemark)
als Substrat getestet, wie im Patent
EP
0 388 593 beschrieben. Eine Polygalacturonaseeinheit (PGU)
ist als die Menge an Enzym definiert, die unter Standardbedingungen
eine Verringerung der Viskosität von 15 nPas
–1 bewirkt.
Die Genotypen der gewählten Transformanten wurden bestätigt,
indem Southern Blots verwendet wurden, in die mehrere genomische
Verdaus eingeschlossen waren und bei denen die jeweilige Expressionskassette
als Sonde verwendet wurde. Die Überexpression der PGAI-, PGXI-,
RGXI- und XGAI-Proteine wurde mittels SDS-PAGE mit nachfolgender
Coomassie-Färbung analysiert. Das PGAI-Protein wurde in
T. reesei merklich überproduziert (siehe
3),
wohingegen bei den PGXI-, RGXI- und XGAI-Transformanten keine PGU-Aktivität
oder sichtbare Proteinüberproduktion in der SDS-PAGE detektiert
werden konnte, wobei für diese jedoch gezeigt wurde, dass
sie die Expressionskassette integriert enthalten. Dies legt nahe,
dass in T. reesei sehr geringe Mengen der PGXI-, RGXI- und XGAI-Proteine
produziert werden.
-
Die
gewählten PGAI-Transformanten wurden in Labor-Bioreaktoren
bei 28°C in dem oben angegebenen Medium für 3–4
Tage mit pH-Kontrolle auf 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) kultiviert,
um Material für die Anwendungsversuche zu erhalten. Die Überstände
wurden mittels Zentrifugation und Filtrieren durch Filter vom Typ Seitz-K
150 und EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach,
Deutschland) gewonnen. Zwei Präparationen mit identischen
Enzymprofilen (PGA1+++, CBHI-, EGII-) wurden produziert. F050183
wurde mit der von RF5514 abgeleiteten Transformante produziert und
F050200 mit der von RF5455 abgeleiteten Transformante; die erste
wurde mit dem pyr4-Marker selektiert und die letztere mit dem amdS-Marker.
Somit trägt der erste Stamm lediglich homologe DNA.
-
Beispiel 4: Charakterisierung des PGAI-Enzyms
von T. reesei
-
Das
rohe PGAI-Enzym von T. reesei wurde in Hinblick auf das pH-Optimum
und die thermische Stabilität charakterisiert.
-
Die
pH-Abhängigkeit des überproduzierten T.-reesei-PGAI-Proteins
(Probe F050183) wurde innerhalb eines pH-Bereichs von 3,0–8,0
bestimmt, indem der Probenpuffer durch Mischen von 0,1 M Citronensäure
und 0,2 M Na2HPO4 (beide
supplementiert mit Rinderserumalbumin (BSA), 100 Mikrogramm/ml (Fluka,
Kata lognummer 05470)) mit dem gewünschten pH hergestellt
wurde. Die Aktivität wurde bei dem gewünschten
pH mit 60-minütigen Inkubationen gemessen. Die Ergebnisse
sind in 2A–C dargestellt. Die
Aspergillus-Enzyme weisen ein pH-Optimum von 4,5 auf, wohingegen
die Trichoderma-PGA1 ein geringfügig neutraleres pH-Optimum
bei pH 5,0 aufweist. Die Trichoderma-PGA1 behält noch etwa
70% Aktivität bei pH 5,5 bei, bei welchem bei der Aspergillus-PGA1
lediglich 30% der maximalen Aktivität übrigbleiben.
Die Aspergillus-PG2 verliert ihre Aktivität bei pH 5,5.
-
Die
Temperaturabhängigkeit des überproduzierten Trichoderma-PGAI-Proteins
(Probe F050183) wurde bei pH 5,0 innerhalb des Bereichs von 40°C–75°C
bestimmt und mit den aus dem Stand der Technik bekannten Aspergillus-Enzymen
PG1 und PG2, die jeweils bei ihrem optimalen pH von 4,5 untersucht
wurden, verglichen. Überraschenderweise weist die Trichoderma-PGA1
ein hohes Temperaturoptimum bei etwa 65°C und noch etwa
60% der maximalen Aktivität bei 70°C auf, wohingegen
bei den Aspergillus-Enzymen bei 65°C praktisch keine Aktivität übrigbleibt
(2D–F) und diese ihr Optimum um 50°C
(etwa 15°C niedriger als Trichoderma-PGA1) haben.
-
Kolorimetrisches Verfahren
für die PG-Aktivität
-
Für
die Bestimmungen der pH-Abhängigkeit wurde der Assay bei
dem gewünschten pH des Substrats und des Probenpuffers
bei 40°C für 60 min durchgeführt. Für
die Bestimmungen der Temperaturabhängigkeit wurde der Assay
bei pH 4,5 für die Aspergillus-Proben ('13 und '22) und
bei pH 5,0 für die T.-reesei-PGA1-Probe durchgeführt.
Assays wurden bei der gewünschten Temperatur für
60 min durchgeführt.
- Substrat: 0,7% (G/V) Kaliumpektat
(Fluka, Katalognummer 51186). 0,7 g Substrat wurden in 100 ml heißem Wasser
gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde
der pH-Wert mit Essigsäure oder Natriumhydroxid eingestellt.
- Enzymlösung: Die Enzyme wurden in Probenpuffer verdünnt.
-
PAHBAH-Reagenz:
-
- Stammlösung (5%): 50 g p-Hydroxybenzhydrazid (98%)
(Fluka, Katalognummer 54600) wurden in 1000 ml 0,5 M Salzsäure
gelöst.
- Arbeitslösung: 0,233 g Titriplex III wurden in 30 ml
0,5 M Natriumhydroxid gelöst. 5 ml Stammlösung
wurden zugegeben und mit 0,5 M NaOH auf 50 ml aufgefüllt.
-
Assayvolumina:
| Substrat: | 0,25
ml |
| Enzym: | 0,1
ml |
| PAHBAH: | 0,65
ml |
| | |
| Temperatur
der Farbinkubation: | 80°C |
| Dauer
der Farbinkubation: | 15
min |
-
Probenwert:
-
Substrat
wurde in ein Teströhrchen pipettiert. Die Reaktion wurde
gestartet, indem die Enzymlösung zugegeben wurde. Der Ansatz
wurde gemischt und bei 40°C für 60 min inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Reaktion gestoppt, indem das PAHBAH-Reagenz
zugegeben wurde. Die Proben wurden zur Farbentwicklung für
15 min bei 80°C inkubiert. Anschließend wurden
die Proben für etwa 5 min in einem Eisbad abgekühlt und
zentrifugiert (2 min, 13000 UpM). Die Überstände
wurden photometrisch gegen den Leerwert bei 412 nm vermessen.
-
Leerwert bzw. Blindversuch:
-
Substrat
und PAHBAH-Reagenz wurden gemischt. Nach dem Zugeben der Enzymlösung
wurden die Proben für 60 min bei 40°C und anschließend
für 15 min bei 80°C zur Farbentwicklung inkubiert.
Abkühlung, Zentrifugation und photometrische Messung wurden
durchgeführt, wie bei den Probenwerten.
-
BEISPIEL 5: Herstellung von Apfelsaft
-
Die
zellfreien Kulturüberstände wurden bei der Apfelsaftherstellung
getestet. Zu diesem Zweck wurden Äpfel (Kultivar: Golden
Delicious) gemahlen und 500 g der resultierenden Apfelmaische wurden
in dem Experiment verwendet. Nach der Enzymzugabe wurde die Maische
für 60 min bei Raumtemperatur (25°C) inkubiert
und die Maische wurde anschließend mit einer Laborpresse
(Hafico) gepresst. Die Pressroutine bzw. der Pressablauf war 2 Minuten
bei 50, 100, 150 und 200 bar, gefolgt von 1 Minute bei 300 bar bzw.
400 bar.
-
Zwei
Trichoderma-PGA1-Zubereitungen, F050183 (T. reesei RF5514/pALK1960/#4)
und F050200 (T. reesei RF5455/pALK1967/#4), wurden mit dem aus dem
Stand der Technik bekannten Produkt, das Aspergillus-PGI enthält
(Referenzprobe), verglichen. Alle drei Proben wurden mit Aspergillus-Pektinmethylesterase supplementiert.
Die Polygalacturonaseaktivität wurde mittels eines viskosimetrischen
Verfahrens unter Verwendung von Citruspektin (Copenhagen Pectin,
X-2955, Dänemark) als dem Substrat getestet, wie oben und im
Patent
EP 0 388 593 beschrieben.
Eine Polygalacturonaseeinheit (PGU) ist definiert als die Menge
an Enzym, die unter Standardbedingungen eine Verringerung der Viskosität
von 15 nPas
–1 bewirkt. Eine Dosierung von
100 ppm eines Gemisches von 50.000 PG-Einheiten/mg von einer der
Trichoderma-PGA1s oder der Referenz, bereitgestellt mit 2000 PE-Einheiten/g
(Patent
EP 0 388 593 ),
wurde in dem Experiment verwendet. Bei einem der Maischeversuche
wurde kein Enzym zugegeben (Leerwert).
-
Die
Saftausbeuteergebnisse (4) zeigen,
dass die Trichoderma-PGA1 gleich der oder besser als die Pektinasezubereitung
des Standes der Technik ist. Insbesondere war die Trübung
der mit Trichoderma-PGA1 behandelten Proben überlegen,
d. h. mit Trichoderma-PGA1 behandelte Säfte waren viel
klarer und transparenter, verglichen mit Saft, der mit Aspergillus-PG
des Standes der Technik behandelt wurde (5). Das
Ergebnis ist deutlich sichtbar (6).
-
Ein
Alkoholtest auf verbleibendes Pektin (1 + 1 Volumen von Saft und
absolutem Ethanol) zeigte nach 6-stündiger Inkubation bei
25°C, dass die mit Trichoderma-PGA1 behandelten Säfte
kein verbleibendes Pektin enthielten, wohingegen der mit Aspergillus-PG
behandelte Saft etwas verbleibendes Pektin enthielt. Im Leerwert
wurden beträchtliche Mengen an verbleibendem Pektin gefunden.
-
BEISPIEL 6: Untersuchung von Trichoderma-PGA1
bei der Herstellung von Saft aus verschiedenen Früchten und
Gemüse.
-
Die
Zubereitung F050183 von Trichoderma-PGA1, die wie in Beispiel 3
beschrieben hergestellt worden war, wurde bei der Herstellung von
Saft aus Früchten und Gemüse ohne zugesetzte Pektinmethylesterase getestet.
-
Erdbeeren
und Himbeeren wurden manuell mit einer metallenen Vorrichtung zerdrückt
bzw. zu Maische gemacht. Pflaumen und Karotten wurden mechanisch
mit einem Zerkleinerungsgerät bzw. einem Wolf („mincer”)
zerkleinert. Karotten wurden durch Mikrowellenerhitzen bei 95°C
blanchiert. 1000 g Maische wurden in eine 2000-ml-Flasche eingegeben
und die Temperatur wurde für 20 min eingestellt, bevor
die Enzymlösung zugegeben wurde. Die Reaktionstemperatur
betrug 65°C und die Reaktionszeit 60 min. Nach der Enzymreaktion
wurde ein Zerquetschvorgang („mashing”) durchgeführt
durch Pressen in einer Hafico-Laborpresse, wobei Textilpresstücher
verwendet wurden. Der erhaltene Saft wurde zur Sedimentierung in
einem Imhoff-Kolben gesammelt.
-
Enzym und Dosierung:
-
Die
Dosierung basierte auf einer allgemeinen Empfehlung des Stands der
Technik: 200 ppm bei 30000 PGU/mg korrespondieren mit 6·106 PGU/kg Karotten, Pflaumen, Erdbeeren und
Himbeeren. Die Aktivität der Enzymbereitung FEA 2005027
betrug 10300 PGU/mg. Die Dosierung der Enzymzubereitung FEA 2005027 pro
1000 g Karotten betrug somit 0,58 g. Der Leerversuch war ohne Enzymdosierung.
-
Das
verwendete Pressdiagramm war das Folgende:
1 min füllen – 2
min 0 bar – 2 min 50 bar – 2 min 100 bar – 2
min 150 bar – 2 min 200 bar – 1 min 300 bar – 1 min
400 bar.
-
Die
Trübungsmessung (NTU) wurde mit einem Labor-Trübungsphotometer
vom Typ Dr. Lange LTP5 bei 860 nm durchgeführt. Die Werte
sind als NTU (nephelometrische Trübungseinheiten) auf der
Grundlage des Verfahrens nach
DIN 38404 angegeben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7: Testergebnisse bei der Saftherstellung
aus Himbeeren, Erdbeeren, Pflaumen und Karotten.
| | Saftausbeute
[g] | Saftausbeute
[%] | °Brix | Trübung NTU | Trübung 24
h NTU | Sediment [%] |
| Himbeere,
Leerwert
Himbeere, F050183 | 795
789 | 79,5
78,9 | 9,4
9,4 | 58
50 | 58
52 | 1,0
1,3 |
| Erdbeere,
Leerwert
Erdbeere, F050183 | 803,9
906 | 80,39
90,6 | 6,3
6,3 | 170
183 | 79
56 | 12,2
14,5 |
| Pflaume,
Leerwert
Pflaume, F050183 | 543
764 | 54,3
76,4 | 15
17,2 | 157
143 | 142
124 | 20,0
9,0 |
| Karotten,
Leerwert
Karotten, F050183 | 742
723 | 74,2
72,3 | 9,5
9,5 | 161
150 | 17,8
72 | 8,3
7,7 |
-
Die
obige Tabelle 7 zeigt, dass die Behandlung von Erdbeeren und Pflaumen
mit Trichoderma-PGA1 die Saftausbeute und °Bx (Zuckergehalt)
ohne Pektinesterase und andere pektinolytische Aktivitäten
erhöhte.
-
Die
Ergebnisse sind graphisch in 7 wiedergegeben. 7 zeigt
die Ausbeute an Saft, erhalten aus dem Pressen von Maischen von
verschiedenen Früchten/Gemüse nach Behandlung
mit Trichoderma-reesei-PGA1. Die Ergebnisse sind im Vergleich zu
den jeweiligen Leerwerten dargestellt.
-
Überraschenderweise
ergab Trichoderma-PGA1 überlegene Ergebnisse mit Früchten,
die Pektin, das gering verestert und löslich ist, enthalten.
Auf der Grundlage der oben dargestellten Ergebnisse ist es möglich, die
Behandlung der Fruchtmaische lediglich mit dem Trichoderma-Enzym
PGA1 bei 65°C in einer Stunde ohne zusätzliche
Pektinasen durchzuführen. Dieses überlegene Ergebnis
konnte nicht erwartet werden.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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