DE69624406T2

DE69624406T2 - Verfahren zur Analyse von biologisch aktiven Substanzen

Info

Publication number: DE69624406T2
Application number: DE69624406T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Ichihara; Sanae Okada; Naokazu Sasaki; Osamu Suzuki
Original assignee: Nisshinbo Industries Inc; Nisshin Spinning Co Ltd
Current assignee: Nisshinbo Holdings Inc
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2003-10-23
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: DE69624406D1; EP0747703A3; US5908746A; JP3517031B2; EP0747703B1; EP0747703A2; JPH08334509A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Material zum Nachweisen biologisch aktiver Substanzen wie Nukleinsäuren, Antikörper und Antigene. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren für einen solchen Nachweis.

Hintergrund der Erfindung

In einer Probe vorhandene biologisch aktive Substanzen wie Nukleinsäuren, Antikörper und Antigene werden in bestimmten Bereichen wie bei klinischen Untersuchungen, Nahrungsmitteluntersuchungen und gerichtsmedizinischen Untersuchungen nachgewiesen und identifiziert. Für einen solchen Nachweis und Identifizierung werden verschiedene Verfahren in Abhängigkeit von den jeweiligen Zielsubstanzen verwendet, einschließlich z. B. Nukleiunsäuresonden-Technologien und Enzymimmunoassay-Verfahren.
Der Bereich, in dem Nukleinsäuren nachgewiesen werden, schließt z. B. die Identifizierung mikrobiologischer Arten wie pathogene Mikroorganismen und DNS- Tests in der Gerichtsmedizin ein. Gewöhnlich wird beim Nachweis von Nukleinsäuren eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die zu einer Zielnukleinsäure komplementär ist, verwendet, die mit einem Enzym oder Ähnlichem direkt markiert ist, oder durch ein Hapten oder Ähnliches indirekt markiert ist. Die markierte Nukleinsäure wird mit der Zielnukleinsäure hybridisiert. Die Gegenwart und die Menge der Zielnukleinsäure kann durch das Nachweisen eines hybridisierten markierten Anteils nachdem Entfernen eines nicht-hybridisierten Anteils der markierten Nukleinsäure oder nach der Inaktivierung eines nicht-hybridisierten markierten Anteils bestätigt werden.
Der Bereich, in dem Antigene, Antikörper oder Ähnliches nachgewiesen werden schließt z. B. die Identifizierung mikrobiologischer Arten wie pathogener Mikroorganismen auf die selbe Weise ein wie für die Nukleinsäuren beschrieben, ebenso wie verschiedene klinische Untersuchungen. Ein kompetitives Enzymimmunoassay-Verfahren, das zum Nachweisen von Antigenen und Antikörpern verwendet wird, wird folgendermaßen durchgeführt: Ein Antikörper oder Antigen wird auf der Oberfläche einer festen Phase wie einer Polystyrolperle, einer Mikrotiterplatte oder Röhrchen immobilisiert. Eine bestimmte Menge einer Probelösung wird auf die feste Oberfläche aufgetragen, und dann wird ein Antigen-Enzymkomplex oder ein Antikörper-Enzymkomplex zugegeben. Wenn der Antikörper auf der Oberfläche der festen Phase immoblilsiert ist, stehen das Antigen in der Probe und der Antigen- Enzymkomplex für eine Bindungsreaktion an den Antikörper, der auf der Oberfläche der festen Phase immobilisiert ist, im Wettbewerb. Wenn das Antigen auf der Oberfläche der festen Phase immobilisiert ist, stehen das Antigen in der Probe und das auf der Oberfläche der festen Phase immobilisierte Antigen für eine Bindungsreaktion an den Antikörper-Enzymkomplex im Wettbewerb.
Nachdem eine bestimmte Zeit vergangen ist, werden dann, wenn der Antikörper immobilisiert ist, das Antigen und der Antigen-Enzymkomplex, die nicht an den immobilisierten Antikörper binden, ausgewaschen und entfernt. Wenn das Antigen immobilisiert ist, werden Teile des Antigens aus der Probe, die nicht abreagiert haben, und der Antikörper-Enzymkomplex und ein Bindungsprodukt zwischen dem Antigen in der Probe und dem Antikörper-Enzymkomplex ausgewaschen und entfernt. Das Waschen bei diesem Verfahren wird normalerweise durch Wiederholung eines Waschvorgangs mehrmals bis zu zehn mal durchgeführt. Der Waschvorgang umfasst das Füllen eines Abschnitts der festen Phase mit einer Waschlösung, Verwerfen der Waschlösung, erneutes Füllen des Abschnitts der festen Phase mit einer frischen Waschlösung und erneutes Entfernen der Waschlösung. Dieser Vorgang wird im Allgemeinen als "B/F-Trennung" bezeichnet, was ein essentieller Vorgang bei der Untersuchung ist, die auf dem Prinzip des Enzymimminoassay-Verfahrens beruht.
Im letzten Schritt wird eine färbende Substratlösung für das zum Markieren des Antigens oder des Antikörpers verwendete Enzym zum Abschnitt der festen Phase gegeben, und dann wird durch das verbliebene Enzym eine Farbe ausgebildet. Im Allgemeinen ist das Enzym, das für dieses Verfahren verwendet wird, z. B. Peroxidase, β-Galactosidase und alkalischer Phosphatase. Ein für jedes Enzym geeignetes Substrat wird als Substrat zur Farbentwicklung verwendet. Wenn das Antigen als Ziel in einer großen Menge in der Probenlösung vorliegt, ist die Menge des verbliebenen Antigen-Enzymkomplexes oder des verbliebenen Antikörper-Enzymkomplexes verringert, was zu einer geringen Intensität der Farbentwicklung führt. Die Intensität der Farbentwicklung wird im Allgemeinen unter Verwendung eines Kolorimeters gemessen.
Im einem Sandwich-Enzymimmonoassay-Verfahren, einer anderen Ausführungsform des Enzymimminoassay-Verfahrens, wird ein Antikörper auf der Oberfläche einer festen Phase immobilisiert und eine Probenlösung wird auf die Oberfläche der festen Phase aufgetragen. Nachdem eine bestimmte Zeit vergangen ist, wird ein Teil eines Antigens, der nicht an den Antikörper auf der Oberfläche der festen Phase bindet, ausgewaschen und entfernt. Danach wird eine bestimmte Menge eines Antikörper- Enzymkomplexes zugegeben. Nachdem eine bestimmte Zeit vergangen ist, wird ein Teil des Antikörper-Enzymkomplexes, der nicht an das Antigen auf der Oberfläche der festen Phase bindet, ausgewaschen und entfernt, und dann wird ein färbendes Substrat auf die feste Phase aufgetragen, um eine Farbe zu entwickeln. Die Konzentration des Antigens in der Probe kann quantitativ durch Messung der Intensität der Farbentwicklung bestimmt werden.
Es ist äußerst wichtig, Antikörper, Antigen, Enzym, Nukleinsäure oder Ähnliches auf dar Oberfläche der festen Phase wie einem Röhrchen, einer Mikrotiterplatte, einem Membranfilter und Kugeln bei den oben beschriebenen konventionellen Verfahren wie dem Nukleinsäurenachweisverfahren, dem kompetitiven Enzymimmunoassay- Verfahren und dem Sandwich-Enzymimminoassay-Verfahren zu immobilisieren. Entsprechend würden verschiedene Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen veröffentlicht. Z. B. schließen die bekannten Verfahren für Proteine folgende ein:
(1) ein Verfahren zum chemischen Binden eines Proteins an ein Basismaterial unter Verwendung eines Verknüpfungsagens oder eines Kondensationsagens, wie ein Diazoverfahren, ein Peptidverfahren, ein Alkylierungsverfahren, ein Verfahren zum Binden an ein Basismaterial unter Verwendung eines Verknüpfungsagens und ein Verfahren zum Binden an ein Basismaterial, das auf der Ugi-Reaktion basiert (s. "Immobilized Enzyme", herausgegeben von Ichiro Chibata, Kodansha Scientific (1986), S. 9-41);
(2) ein Verfahren zur Immobilisierung an einem Basismaterial mittels ionischer Bindungen (s. "Immobilized Enzyme", S. 41-43); und
(3) ein Verfahren zur Immobilisierung an einem Basismaterial mittels physikalischer Adsorption (s. "Immobilized Enzyme", S. 43-45):
Bekannte Verfahren für Nukleinsäuren schließen die folgenden ein:
(1) ein Verfahren zum chemischen Binden einer Nukleinsäure, die mit einer eingeführten Modifizierungsgruppe vorliegt, wie z. B. bei der Immobilisierung mittels einer Disulfidbindung zwischen einer Nukleinsäure mit einer Thiolgruppe an ihren 5'-Ende und einem kugelförmigen Basismaterial, an der eine Thiolgruppe beteiligt ist (s. P. J. R. Day, P. S. Flora. J. E. Fox. M. R. Walker, Biochem. J., 278, 735-740 (1991)) (andere in diese Kategorie gehörende Verfahren werden z. B. beschrieben in Soren R. R., Mette R. L., Svend E. R., Anal. Biochem., 198, 138-142 (1991); Jonathan N. K., Joseph L. W., Joseph P. D., Rachel E. M., Mary C., Eugene L. B., Nuleic Acids Res., 15, 2891-2909 (1987), Allan J. M., Jeffrey R. B., Terence W. P., Biochem. J., 191, 855-858 (1980), J. A. Running, M. S. Ureda, BioTechniques, 8, 276-279 (1990); und
(2) ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren durch physikalische Adsorption wie Immobilisierung durch Adsorption an eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran mittels UV-Bestrahlung oder Wärmebehandlung (J. Sambrok, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Moloecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2. Auflage, S. 2.109-2.113 und S. 9.34-9.46) und Immobilisierung durch physikalische Adsorption auf eine Mikroplatte (G. C. N. Parry und A. D. B. Malcom, Biochem. Soc. Trans 17, 230-231 (1989).
Jedoch ist dargelegt worden, dass die konventionellen oben beschriebenen Verfahren Nachteile haben. Z. B. erfordert das auf chemischer Bindung basierende Verfahren spezielle Reagenzien einschließlich z. B. toxischer, wie Azide, Isocyanate und NaBH&sub3;CN. Weiterhin ist es nötig, wenn die Immobilisierung durch eine Peptidbindung durchgeführt wird, eine Aminogruppe entweder in die aktive Substanz oder das Basismaterial einzuführen, und es ist notwendig, eine Carboxylgruppe in die andere einzuführen. Weiterhin ist es nötig, einen Schritt durchzuführen, bei dem beide eingeführte funktionelle Gruppen mit einem Kondensationsreagens behandelt werden, um eine Immobilisierung zu erreichen. Entsprechend ist es unvermeidlich, komplizierte Abläufe durchzuführen.
Im Falle des auf chemischer Bindung basierenden Verfahrens müssen z. B. sowohl im Basismaterial wie auch in der aktiven Substanz Aminogruppen vorhanden sein, um Glutaraldehyd als Verknüpfungsagens verwenden zu können. Entsprechend ist es notwendig, das Basismaterial auszuwählen, weil das Basismaterial selbst die funktionelle Gruppe haben muss. Daraus ergibt sich, dass es schwierig ist, das für die Immobilisierung geeignete Basismaterial auszuwählen. Zusätzlich kann das auf chemischer Bindung basierende Verfahren z. B. schwer für solche verwendet werden, die nur funktionelle Gruppen mit geringer Reaktivität haben (z. B. eine endständige Phosphatgruppe, eine endständige Hydroxylgruppe) wie natürliche DNS und DNS ohne Modifizierungsgruppe. So hat das auf chemischer Bindung basierende Verfahren den Nachteil, dass keine Immobilisierung erreicht werden kann, wenn die aktive Substanz keine aktive funktionelle Gruppe hat.
Andererseits hat die physikalische Adsorption den folgenden Nachteil. Insbesondere die Immobilisierungsmenge wird durch die Adsorptionsleistung des Basismaterial beeinflusst, und die adsorbierte aktive Substanz kann desorbieren. Wenn die aktive Substanz eine Verbindung mit niedriger Molmasse ist (ein Oligomer) wird sie kaum adsorbiert, weil sie mit dem Basismaterial nur schwach wechselwirkt.
Rasmussen et al (Analytical Biochemistry, 198, 138-142, 1991) legt das Binden von DIS an eine Mikrotiterplatte mittels Carbodiimid-vermittelter Kondensation von DNS offen.
Die europäische Patentanmeldung EP-APP0710666 ist nur gemäß Artikel 54(3) des EPÜ anzuführen. Nur biotinylierte DNS, Conjugate aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase, ACTH-Peptide und DNS-Molmassenmarker werden als die immobilisierte biologisch aktive Substanz verwendet.
Wie oben beschrieben gibt es bei der Immobilisierung, die wichtig zum Nachweis von aktiven Substanzen wie Proteinen und Nukleinsäuren ist, immer noch viele Probleme.

Offenlegung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wurde gemacht, um ein Verfahren zum Nachweis biologisch aktiver Verbindungen unter Verwendung eines Materials, das eine hochmolekulare Verbindung mit Carbodiimidgruppen umfasst, die in der Lage sind, biologisch aktive Substanzen bequem, effizient und fest zu immobilisieren, zur Verfügung zu stellen.
Um den oben beschriebenen Gegenstand zu erreichen, nutzt die vorliegende Erfindung eine Kombination charakteristischer Materialien zur Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen, die ein Basismaterial und auf dem Basismaterial eine hochmolekulare Verbindung mit Carbodiimidgruppen umfassen. Um den oben beschriebenen Gegenstand zu erreichen, nutzt die vorliegende Erfindung zur Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen ein charakteristisches Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen, das den Schritt des in Kontaktbringens von Materialien zur Immobilisierung, die ein Basismaterial und eine hochmolekulare Verbindung mit 2 bis 100 Carbodiimidgruppen auf dem Basismaterial einschließen, mit einer Substanz mit hoher Reaktivität mit den Carbodiimidgruppen einschließt.
Carbodiimidderivate mit geringer Molmasse wie Dicyclohexylcarbodiimid und Di-p- Toluylcarbodiimd wurden bis jetzt als dehydrierendes Kondensationsreagens bei der Synthese von Estern und Peptiden breit angewandt. Das Carbodiimidderivat bildet bereitwillig ein Additionsprodukt mit Carboxisäuren, wie in der folgenden Reaktionsformel (allgemeine Formel I) gezeigt wird. Das Additionsprodukt kondensiert mit z. B. Alkoholen, Aminen oder Carbonsäuren und setzt dabei ein Harnstoffderivat frei, um einen korrespondierenden Ester, ein Amid oder Säureanhydrid, respektive, zu bilden (allgemeine Formel II). Entsprechend kann man daran denken, dass solch ein Carbodiimidderivat mit niedriger Molmasse die Fähigkeit haben könnte, zur Immobilisierung aktiver Substanzen verwendet zu werden.
R'CO&sub2;H + RN=C=NR → R'C(=O)OC(NHR)=NR (I)
R'C(=O)OC(NHR)=NR + R"OH → R'C(=O)OR" + RNHCONHR (II)
+ R"NH&sub2; → R'C(=O)NHR" + RNHCONHR (II')
+ R"CO&sub2;H → R'C(=O)OC(=O)R" + RNHCONHR (II")
Jedoch sind die oben beschriebenen Carbodiimidderivate mit niedriger Molmasse Reagenzien, die als Kondensationsagenzien entwickelt wurden, zu denen die Löslichkeit in Lösungsmitteln hinzugefügt wurde. Entsprechend wurde herausgefunden, dass sie leicht desorbieren, und sie können nicht praktisch verwendet werden, indem sie auf das Basismaterial aufgetragen und an der Oberfläche des Basismaterials haften bleiben sollen. So haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ihr Augenmerk auf eine Carbodiimidverbindung mit hoher Molmasse und Carbodiimidgruppen im Molekül gelegt und die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensive Studien durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass eine solche Carbodiimidverbindung nicht nur Reaktivität mit aktiven Substanzen aufweist, sondern gute Haftungseigenschaften bezogen auf unterschiedliche Arten von Basismaterialien hat und daher zum Nachweis einer großen Vielzahl biologisch wichtiger Verbindungen unter der Verwendung immobilisierter Substanzen angewandt werden kann. So wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Insbesondere liegt die Erfindung in einem Verfahren zum Analysieren biologisch aktiver Substanzen, das folgende Schritte umfasst:
Reagieren lassen einer biologisch aktiven ersten Substanz, die auf einem Träger immobilisiert ist, mit einer zweiten Substanz, die in der Lage ist, spezifisch an die erste Substanz zu binden; und
Nachweisen eines nicht gebundenen Teils der zweiten Substanz oder eines gebundenen Teils der zweiten Substanz, der durch Bindung zwischen der ersten und der zweiten Substanz indirekt an den Träger gebunden ist, so dass die erste Substanz oder die zweite Substanz in einer Probe analysiert wird;
wobei der Träger eine Verbindung mit 2 bis 100 Carbodiimidgruppen umfasst und die erste Substanz auf den Träger über die Carbodiimidgruppen gebunden ist, und wobei die besagte erste Substanz keine biotinylierte DNS, ein Konjugat aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase und ein ACTH-Peptidoligomer oder λ-Hind-III-Abbau-DNS- Molmassenmarker ist. Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail beschrieben.

< 1> Träger

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Träger wird zur Verfügung gestellt, um die biologisch aktive Substanz auf einer festen Phase, die die hochmolekulare Verbindung mit Carbodiimidgruppen umfasst, zu immobilisieren. Gewöhnlich wird der Träger zur Verfügung gestellt, indem man ein Basismaterial die hochmolekulare Verbindung mit Carbodiimidgruppen tragen lässt.

(1) Basismaterial

Gas in der vorliegenden Erfindung verwendete Basismaterial dient als Träger zum Immobilisieren der biologisch aktiven Substanz. Im Wesentlichen ist das Material in Wasser oder einem Lösungsmittel oder in beidem unlöslich, und es ist bei Normaltemperatur oder in einem Temperaturbereich in der Nähe davon (0 bis 100ºC) ein Feststoff oder ein Gel, und schließt z. B. Plastik, anorganische hochmolekulare Verbindungen, Metalle, natürliche hochmolekulare Verbindungen und Keramik ein.
Die Plastikmaterialien schließen z. B. Polyethylen, Polystyrol, Polycarbonat, Polypropylen, Polyamid, Phenolharz, Epoxiharz, Polycarbodiimidharz, Polyvinylchlorid, Polyfluorvinyliden, Polyfluoroethylen, Polyimid und Acrylharz ein.
Die anorganischen Verbindungen mit großer Molmasse schließen z. B. Glas, Kristall, Kohle, Silicagel und Graphit ein.
Die Metalle schließen spezifisch Metalle ein, die bei Raumtemperatur fest sind, wie Gold, Platin, Silber, Kupfer, Eisen, Aluminium, Magnete, Paramagnete und Apatit ein.
Die natürlichen hochmolekularen Verbindungen schließen spezifisch z. B. Cellulose, Cellulosederivate, Chitin, Chitosan, Alginsäure und Salze der Alginsäure ein.
Die Keramiken schließen spezifisch z. B. Aluminiumoxid, Siliciumoxid, Siliciumcarbid, Siliciumnitrid und Borcarbid ein.
Das oben beschriebene Basismaterial kann eine bestimmte Gestalt oder Form haben, die z. B. Filme, Platten, Partikel, gegossene Produkte (Kugeln, Bänder, Vertiefungen oder Bänder von Viellochplatten, Röhren, Netze, kontinuierlich ausgebildete Schäume, Membranen, Papier oder Blätter, Nadeln, Fasern, Platten, Objektträger und Gefäße für kultivierte Zellen) und Gummi. Natürlich sind die Größe oder die Abmessungen des Basismaterials nicht spezifisch eingeschränkt.

(2) Hoch-molekulare Verbindung mit Carbodiimidgruppen.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendete hoch-molekulare Verbindung mit Carbodiimidgruppen (im Folgenden, wenn nötig, einfach als Carbodiimidverbindung bezeichnet) schließt z. B. Polycarbodiimid ein, das in Übereinstimmung mit einem im Japanischen Patent mit der Offenlegungsnummer 51-61599 offengelegten Verfahren, einem Verfahren von L. M. Alberino et al. (J. Appl. Polym. Sci., 21, 190 (1990)) oder einem im Japanischen Patent mit der Offenlegungsnummer 2-292316 offengelegten Verfahren hergestellt werden kann. Insbesondere schließt das Carbodiimid diejenigen ein, die aus einer organischen Polyisocyanatverbindung in Gegenwart eines Katalysators (z. B. 3-Methyl-1-phenyl-2-phospholoen-1-oxid) zur Erleichterung der Bildung von Carbodiimid aus Isocyanat, hergestellt werden können.
Die oben beschriebene organische Polyisocyanatverbindung schließt z. B. 4,4- Dicyclohexylmethyldiisocyanat, m-Tetramethylxylylendiisocyanat, 2,4- Toloyldiisocyanat, 2,6-Toloyldisocyanat, ein Gemisch aus 2,4-Toloyldiisocyanat und 2,6-Toloyldisocyanat, rohes Toloyldisocyanat, rohes Methylendiphenyldiisocyanat, 4,4',4"-Triphenylmethylentrüsocyanat, Xyloldiisocyanat, Hexamethylen-1,6-diisocyanat, Lysindiisocyanat, hydriertes Methylendiphenyldiisocyanat, m-Phenyldiisocyanat, Naphthyl-1,5-diisocyanat, 4,4'-Diphenylendiisocyanat, 4,4'-Diphenylmethandiisocyanat, 3,3'-Dimethoxi-4,4'-diphenyldiisocyanat, 3,3'-Dimeththyldiphenylmethan-4,4'- diisocyanat, Isophorondiisocyanat und willkürliche Gemische davon, ein.
Die Polykondensation findet statt, indem die Isocyanatgruppe der beschriebenen Polyisocyanatverbindungen oder der Gemische davon in ein Carbodiimid übergeführt werden. Bei diesem Verfahren kann das Molekulargewicht (Polymerisationsgrad) durch Zugabe einer angemessenen Menge von einem oder mehreren Monoisocyanaten in einem passenden Stadium, so dass das Ende der Carbodiimidverbindung versiegelt wird, angepasst werden. Alternativ kann Monoisocyanat vom Anfang der Polykondensationsreaktion an in angemessener Menge zugegeben werden. Ein solches Monoisocyanat schließt z. B. Phenylisocyanat, (o-, m-, p-)Toloylisocyanat, Dimethylphenylisocyanat, n-Butylisocyanat, Cyclohexylisocyanat und Methylisocyanat ein. Der Polymerisationsgrad kann auch durch Ändern der Konzentration von z. B. der Polyisocyanatverbindung oder der Reaktionsdauer eingestellt werden.
Ein anderes, das Ende schützendes Agens, das nahe zu liegen scheint, kann ebenfalls verwendet werden. Namentlich können die das Ende schützenden Agenzien aus einer Verbindung mit einem Isocyanatende erhalten werden, die unter Verwendung einer Reaktion zwischen etwa einem Mol einer Alkylverbindung mit terminalen funktionellen Gruppen wie -OH, -NH&sub2;, -COOH, -SH und -NH und zwei Mol Diisocyanat leicht hergestellt werden können.
Der Katalysator, der die Bildung des Carbodiimids aus dem organischen Isocyanat erleichtert, kann ein Beispiel aus unterschiedlichen Gruppen sein. Jedoch sind 1- Phenyl-2-phospholen-1-oxid, 3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 1-Ethyl-2- phospholen-1-oxid und 3-Phospholenisomere davon im Hinblick auf die Ausbeute und Ähnliches bevorzugt.
Das Polycarbodiimid wird ohne Lösungsmittel oder in einem unreagtieven organischen Lösungsmittel hergestellt. In der vorliegenden Erfindung kann eine Art von so hergestelltem lackartigem oder festen (pulverförmigen) Polycarbodiimid oder eine Mischung davon verwendet werden. Das Polycarbodiimid kann teilweise verzweigt sein, um die Bindungsfähigkeit bezogen auf das Basismaterial zu vergrößern.
Andere Carbodiimidverbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Carbodiimidverbindungen einer Art ein, die eine durch das Addieren einer Polyoxiethylenkette in ihre Struktur erhaltene hydrophile Eigenschaft haben, wie z. B. in den japanischen Patenten mit der Offenlegungsnummer 63-172718 und 63- 264128 beschrieben.
In allen beliebigen Fällen hat die in der vorliegenden Erfindung verwendete hochmolekulare Carbodiimidverbindung vorzugsweise in ihrem Molekül Carbodiimidgruppen in einer Anzahl von nicht weniger als 2 und nicht mehr als 100. Wenn die Anzahl an Carbodiimidgruppen der hoch-molekularen Carbodiimidverbindung weniger als zwei ist, nämlich 1, ist die Verbindung nur unzurreichend in der Lage, die biologisch aktive Substanz zun Immobilisieren. Im Gegensatz dazu tritt kein Problem bei der Leistung auf, wenn die Anzahl der Carbodiimidgruppen nicht unter 101 beträgt. Jedoch hat in manchen Fällen eine solche Verbindung eine zu hohe Viskosität oder sie kann nicht in Lösung hergestellt werden, was manchmal die Handlingeigenschaften beeinträchtigt, wenn eine solche Verbindung auf dem Basismaterial getragen wird.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete hoch-molekulare Carbodiimidverbindung hat vorzugsweise eine Molmasse in einem Bereich von nicht unter 1000 und nicht über 100 000.
Es wird festgestellt, dass einige aus der organischen Polyisocyanatverbindung in der Gegenwart eines Katalysators zur Erleichterung der Carbodiimidbildung aus Isocyanat hergestellten Polycarbodiimide eine Molmasse von unter 1000 haben. Jedoch kann die Molmasse eines solchen Polycarbodiimids durch Einführung von Polyalkylen, Polyoxialkylen, Polyurethan oder Polyamid an beiden Enden des Polycarbodiimids durch eine Carbamidbindung oder eine Urethanbindung so eingestellt werden, dass sie innerhalb des oben beschriebenen Bereichs liegt.
Wie oben beschrieben, besitzt die Carbodiimidgruppe der hoch-molekularen Carbodiimidverbindung große Reaktivität und sie reagiert mit fast allen aktiven Wasserstoffgruppen von Alkoholen, Aminen, Thiolen, Phenolen und Carboxisäuren. Andere Reaktionen als die oben beschriebene Reaktion des Carbodiimidderivats mit Carboxisäuren sind die folgenden. Z. B. findet die Reaktion mit Alkohol statt, wie in der folgenden Formel (III) dargestellt, und die Reaktion findet mit Aminogruppen statt, wie in der folgenden Formel (IV) dargestellt (s. Frederick Kurzer, K. Douraghi-Zadeh, Chemical Reviews, 67, 117-135 (1967) und Andrew Williams, Ibrahim T. Ibrahim, Chemical Reviews, 81, 599-606 (1981)). Entsprechend verwendet die vorliegende Erfindung diese Reaktivität, um die aktive Substanz auf einem Basismaterial zu im mobilisieren.
C&sub2;H&sub5;OH + C&sub6;H&sub5;N=C=NC&sub6;H&sub5; → C&sub6;H&sub5;NHC(=NC&sub6;H&sub5;)OC&sub2;H&sub5; (III)
RN=C=NR + R'NH&sub2; → RNHC(=NR')NHR (IV)

(3) Herstellung des Trägers

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Träger zum Immobilisieren biologisch aktiver Substanzen auf der festen Phase umfasst das Basismaterial und die vom Basismaterial getragene Carbodiimidverbindung. Die hohe Haftkraft der Carbodiimidverbindung bezogen auf das Basismaterial wird dazu verwendet, dass das Basismaterial die Carbodiimidverbindung tragen kann. Der Ausdruck "tragen" bedeutet hier die Tatsache, dass die Carbodiimidverbindung vom Basismaterial in Wasser oder einem Lösungsmittel nicht abgetrennt oder desorbiert wird.
Optional kann die Carbodiimidverbindung auf einer gesamten Oberfläche des Basismaterials oder auf einem Teil des Basismaterials getragen werden. Eine repräsentative Form des Trägenrs ist ein Lack.
Es ist möglich, als Methode des Auftragens der Carbodiimidverbindung auf das Basismaterial, bekannte Verfahren wie Sprayen, Immersion, Streichen, Aufstempeln, Aufbringen aus der Dampfphase, Lackieren mit einem Filmlackierer, anzupassen.
Der so erhaltene erfindungsgemäße Träger zum Immobilisieren der aktiven Substanz auf der festen Phase ist in der Lage, unterschiedliche aktive Substanzen unter Verwendung der Reaktivität der Carbodiimidgruppe zu immobilisieren.

< 2> Biologisch aktive Substanz

Die biologisch aktive erste Substanz, die auf dem Träger immobilisiert werden soll, schließt z. B. Proteine, Peptide, andere antikörper-bindende Substanzen und Biopolymere wie Nukleinsäuren ein, aber nicht biotinylierte DNS, Konjugate aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase, ACTH-Peptidoligomere oder λ-Hind-III- Abbau-DNS-Molmassenmarker.
Spezifisch schließen das Protein und das Peptid z. B. proteinartige- oder Peptidhormone wie Insulin, ACTH (Adrenocorticotropes Hormon) (aber keine Peptidoligomere davon) und Oxitocin ein; Enzyme oder Vorläufer davon wie Cholinesterase, Amylase und Pepsin, proteinartige Antigene wie Hbs-Antigen und HIV- Antigen und antikörper-bindende Proteine wie Protein A. Die antikörper-bindende Substanz schließt z. B. Hapten mit niedriger Molmasse ein. Die Nukleinsäure schließt z. B. natürliche oder synthetische DNS (einschließlich Oligonucleotide) und RNS, (einschließlich Oligonucleotide) ein.
Spezifisch, z. B., können die folgenden Substanzen genannt werden. Als physiologisch aktive Substanzen mit antimikrobischer Aktivität werden Penizillin, Ampicillin, Cephalosphorin, Kanamycin, Streptomycin, Fradiomycin, Destomycin, Kasugamycin, Tylosin, Erythromycin, Oleandomycin, Spiramycin, Lincomycin, Colistin, Bacitracin, Salinomycin, Monesin, Lasalcoid, Tetracyclin und seine verwandten Substanzen wie Chloramphenical und Virginiamycin erwähnt und als Beispiele gegeben. Als synthetische antimikrobische Substanzen werden die Sulfadroge, Oxolinsäure, Piromidinsäure, Furazolidon und Difurazon genannt und als Beispiel gegeben. Als natürliche Toxine werden im allgemeinen Aflatoxin, T2-Toxin, Zearalenon, Deoxinivalenol, Patulin, Fumonsin, HAT-2, Ochtratoxin, Tetrotoxin, Okadainsäure, Saxitoxin, Gonyautoxin und Botulinustoxin genannt und als Beispiele gegeben. Als synthetische Chemikalien werden allgemeine im Ackerbau eingesetzte Chemikalien genannt und als Beispiel gegeben, wie Dioxin, 2,4-D, Benomyl, Aldicarb, Carbofuran, Methomyl, DDVP, Malathon, Paraquat, Diazinon, Fenitrothion, Endrin, Aldrin und Heptachlor. Als Biochemikalien werden Hemoglobin, α-Fetoprotein, Immunoglobulin, Albumin, Antithrombin, Thrombin, Plasminogen, Ferritin, Thyroglobulin, Gelatine, Chlesterol, Testosteron, Corticosterone, Progesterone, Ergosterol, Estradiol, Cytochrom C, Adrenalin und verschiedene Vitamine genannt und als Beispiele gegeben.
Die biologische Substanz schließt weiterhin Antikörper ein, die an die biologisch aktive Substanz binden können, wie Proteine, Peptide und ähnliche, wie oben beschrieben. Der Antikörper wird z. B. erhalten, indem immunisierbare Tiere einschließlich Säugetiere wie Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Mäuse, Ziegen, Schafe, Pferde und Rinder mit der oben beschriebenen Substanz oder einem Konjugat der oben beschriebenen Substanz und einem Träger zur Immunisierung immunisiert werden. Alternativ wird der Antikörper als ein monoklonaler Antikörper erhalten, der nach der Immunisierung von Mäusen, durch Hybridom aus Lymphocyten der immunisierten Maus und Myelomzellen hergestellt wird.
Andererseits ist die biologisch aktive zweite Substanz ein Protein, Peptid, eine Antigen-Substanz, Nukleinsäure oder eine andere physiologisch aktive Substanz, die spezifisch an die erste Substanz bindet. Das heisst, wenn eine der ersten oder zweiten Substanzen Protein, Nukleinsäure oder eine andere physiologisch aktive Substanz ist, ist die andere ein dazu korrespondierender Antikörper. Wenn eine der Substanzen eine erste Nukleinsäure ist, ist die andere eine zweite Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz, die im Wesentlichen zu einer Nukleotidsequenz der ersten Nukleinsäure komplementär ist. Der Ausdruck "im Wesentlichen komplementär" bezieht sich auf die Tatsache, dass selbst wenn eine oder mehrere Abweichungen vorliegen, jede der Nukleinsäureketten über Wasserstoffbindungen zu einem Doppelstrang hybridisieren kann.
Es wird festgestellt, dass entweder die erste Substanz oder die zweite Substanz als Gegenstand der Analyse verwendet werden kann.

< 3> Analyse der biologisch aktiven Substanz

Die biologisch aktive Substanz wird in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Binden der biologisch aktiven ersten Substanz an den Träger, wie oben beschrieben, reagieren lassen der gebundenen ersten Substanz mit der zweiten Substanz und Nachweisen eines nicht gebundenen Teils der zweiten Substanz oder eines gebundenen Teils der zweiten Substanz, der an den Träger durch Bindung zwischen der ersten und der zweiten Substanz indirekt gebunden ist, durchgeführt.
Die erste Substanz kann auf dem Träger durch in Kontakt bringen des Materials mit der aktiven Substanz immobilisiert werden. Die erste Substanz und die hochmolekulare Carbodiimidverbindung binden kovalent durch die Reaktion zwischen der Carbodiimidgruppe der hochmolekularen Carbodiimidverbindung, die vom Träger getragen wird, und der Hydroxylgruppe, Aminogruppe, Thiolgruppe, Carboxylgruppe oder ähnlichen der ersten Substanz. Als Ergebnis wird die erste Substanz auf dem Träger immobilisiert.
Vorzugsweise wird die erste Substanz mit dem Träger in Wasser oder einem Puffer in Kontakt gebracht, so dass die biologische Aktivität der ersten Substanz erhalten bleibt. Vorzugsweise beträgt die Temperatur während des Kontakts 0 bis 100ºC, so dass die Aktivität der aktiven Substanz ebenfalls nicht beeinträchtigt wird.
Vorzugsweise, um zu verhindern, dass die zweite Substanz oder Ähnliches unspezifisch an den Träger bindet, wird der Träger mit einer Überschussmenge von z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Casein oder Lachsspermien-DNS in Kontakt gebracht, nachdem die erste Substanz auf dem Träger immobilisiert worden ist, so dass freie Carbodiimidgruppen blockiert werden.
Was die wie oben beschrieben erhaltene, auf der festen Phase immobilisierte, aktive Substanz betrifft, so ist die aktive Substanz extrem fest auf dem Träger immobilisiert und wird von Träger nicht abgelöst, selbst wenn er einem Waschverfahren unterzogen wird (z. B. ein Waschverfahren unter Verwendung einer oberflächenativen Substanz) wie sie auf dem Gebiet der Immunoassays häufig verwendet werden. So hat dieses Verfahren ein Gebiet der immunologischen Anwendung eines Trägers, auf dem ein Antikörper oder ein Antigen immobilisiert ist, und ein Gebiet der Anwendung eines Trägers mit einer immobilisierten Nukleinsäure als Diagnoseagens.
Nachdem die erste auf dem Träger immobilisierte Substanz mit der zweiten Substanz zur Reaktion gebracht wurde, wird die zweite an den Träger gebundene Substanz auf die selbe Weise nachgewiesen, wie es bei gewöhnlichen Verfahren für Immunoassays in fester Phase und Nukleinsäurehybridisierung geschieht. Z. B. wird die zweite mit einer Markersubstanz markierte Substanz, wenn die erste Substanz der Gegenstand zum Messen ist, mit der immobilisierten ersten Substanz zur Reaktion gebracht, und die auf dem Träger immobilisierte Markersubstanz wird nachgewiesen oder quantitativ gemessen. So kann ein gebundener Teil der zweiten Substanz nachgewiesen oder quantitativ gemessen werden. Als Ergebnis kann die erste Substanz nachgewiesen oder quantitativ gemessen werden. Statt des Teils der zweiten Substanz, der an die erste Substanz gebunden is, kann mit einem nicht gebundenen Anteil der zweiten Substanz nachgewiesen oder quantitativ gemessen werden.
Wenn die zweite Substanz der Gegenstand zum Messen ist, wird zusätzlich eine bestimmte Menge der zweiten mit einer Markersubstanz markierten Substanz während der Reaktion zwischen der ersten und der zweiten Substanz zum Reaktionssystem gegeben. So kann die Menge der zweiten Substanz in einer Probe indirekt auf der Grundlage einer gebundenen Menge der markierten zweiten Substanz, die an die erste Substanz gebunden ist (Inhibierungsverfahren) gemessen werden.
Alternativ kann die an den Träger gebundene zweite Substanz ebenfalls nachgewiesen werden, indem eine Reaktion einer dritten Substanz erzeugt wird, die die zweite Substanz spezifisch binden kann. Z. B. dann, wenn die zweite Substanz ein Antigen ist und die erste Substanz ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper (primärer Antikörper) für das Antigen ist, wird ein Träger-Antikörper- Antigenkomplex mit einem polyklonalen Antikörper oder einem anderen monoklonalen Antikörper, der ein von dem für den oben beschriebenen Antikörper verschiedenes Epitop (sekundärer Antikörper) enthält, zur Reaktion gebracht, so dass sich ein Träger-Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex bildet, um die dritte Substanz in dem Komplex nachzuweisen. So kann die zweite Substanz nachgewiesen werden (Sandwich-Verfahren). In diesem Verfahren, kann, wenn die dritte Substanz markiert ist, deren Marker nachgewiesen werden. Selbst wenn die dritte Substanz nicht markiert ist, kann eine zusätzliche Substanz, die an die dritte Substanz bindet, verwendet werden, vorausgesetzt, dass die zusätzliche Substanz markiert ist. Z. B. wird in dem zuvor erwähnten Fall der primäre Antikörper in einem Tier hergestellt, das von dem, das zur Herstellung des sekundären Antikörpers verwendet wird, verschieden ist, und der Antikörper gegen Immunoglobulin des für die Herstellung des sekundären Antikörpers verwendeten Tiers wird als dritte Substanz verwendet. Im Falle des Nachweises einer Nukleinsäure wird das Verfahren wie oben beschrieben entwickelt. Es wird nämlich eine erste Nukleinsäure auf dem Träger immobilisiert und eine zweite Nukleinsäure mit Spezifität für die erste Nukleinsäure wird an die erste Nukleinsäure gebunden. Eine dritte Nukleinsäure mit Spezifität für die zweite Nukleinsäure, aber ohne Spezifität für die erste Nukleinsäure, wird an das erhaltene Produkt gebunden. So kann die zweite Nukleinsäure auf der Grundlage der Menge der dritten an den Träger gebundenen Nukleinsäure quantitativ gemessen werden.
Alternativ kann die zweite Substanz auch unter Verwendung eines emulgierenden Trägers gemäß eines allgemeinen Agglutinierungsverfahrens gemessen werden.
Die Markersubstanz schließt z. B. radioaktive Substanzen, fluoreszierende Substanzen, Enzyme, Farbstoffe, chemisch lumineszierende Substanzen und Digoxigenin ein.
Wenn das Markieren unter Verwendung einer radioaktiven Substanz, einer fluoreszierenden Substanz oder eines Farbstoffs erfolgt, kann der Marker direkt durch Messung unter Verwendung eines Szintillationszählers, durch Aussetzen eines Films oder Beobachtung mit bloßem Auge nachgewiesen werden. Wenn ein Enzym verwendet wird, kann ein Substratfarbstoff, der als Ergebnis einer enzymatischen Reaktion eine Farbe entwickelt, verwendet werden, um seine Farbentwicklung nachzuweisen. Solch ein Enzym kann die im Allgemeinen verwendeten einschließen, einschließlich z. B. Peroxidase, β-D-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Lysozym.
Es muss nicht unbedingt notwendig sein, dass die Markersubstanz selbst nachweisbar ist. Zum Beispiel wird, wenn Biotin als Marker verwendet wird, ein mit Avidin oder Streptoavidin konjugiertes Enzym, das spezifisch an Biotin bindet, verwendet. So kann Biotin indirekt nachgewiesen werden.
Nicht abreagierte Substanzen werden entfernt, insbesondere die B/F-Trennung wird nach der Reaktion der ersten und zweiten Substanz und optional der dritten Substanz oder anderen Substanzen durchgeführt. Dieser Vorgang kann auf die selbe Weise durchgeführt werden, auf die gewöhnliche Festphasenimminoassay-Verfahren oder Hybridisierungsverfahren durchgeführt werden. Insbesondere dann, wenn der Träger die Form eines Gefäßes hat, wird ein Vorgang, der Füllen des Trägers mit einer Waschlösung und Verwerfen der Waschlösung umfasst, mehrere Male wiederholt. Wenn der Träger die Form von Partikeln hat, kann ein Vorgang des Suspendierens des Trägers in einer Waschlösung wiederholt werden.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die Immobilisierung auf dem Träger, die zum Nachweisen aktiver Substanzen wie Proteinen und Nukleinsäuren wichtig ist, bequem, effizient und zuverlässig durchgeführt werden.

Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf Beispiele spezifischer erklärt.

Herstellungsbeispiel 1: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (1)

4,4'-Dicyclohexylmethandiisocyanat (117.9 g) und Cyclohexylisocyanat (12.5 g) wurden bei 180ºC vier Tage lang unter einer Stickstoffatmosphäre mit einem Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 1.3 g) miteinander zur Reaktion gebracht, um eine Carbodiimidverbindung zu erhalten (Polymerisationsgrad: 10, durchschnittliche Molmasse: 2400), die bei Raumtemperatur pulverförmig war. Die erhaltene Verbindung (10 g) wurde pipettiert und in Methanol (100 mL) gelöst und ergab eine Lösung einer Carbodiimidverbindung (1).

Herstellungsbeispiel 2: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (2)

Isophorondiisocyanat (19.9 g) und n-Butylisocyanat (2.0 g) wurden bei 180ºC drei Tage lang unter einer Stickstoffatmosphäre mit einem Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 0.2 g) miteinander zur Reaktion gebracht, um eine Carbodiimidverbindung zu erhalten (Polymerisationsgrad: 10 durchschnittliche Molmasse: 1900), die bei Raumtemperatur pulverförmig war. Die erhaltene Verbindung (10 g) wurde verteilt und in Dichlormethan (100 mL) gelöst und ergab eine Lösung einer Carbodiimidverbindung (2).

Herstellungsbeispiel 3: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (3)

Ein Gemisch aus 2,4-Toluylendiisocyanat und 2,6-Toluylendiisocyanat (Mischungsverhältnis 80 : 20, 78.4 g) und Phenylisocyanat (11.9 g) wurden bei 75ºC 24 Stunden lang in Tetrachloroethylen (615 g) unter einer Stickstoffatmosphäre mit einem Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 0.9 g) miteinander zur Reaktion gebracht, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung (3) zu erhalten (Polymerisationsgrad: 10, durchschnittliche Molmasse: 1500.

Herstellungsbeispiel 4: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (4)

4,4'-Dicyclohexylmethandiisocyanat (112.6 g) und Phenylisocyanat (11.9 g) wurden in Tetrahydrofuran (922.7 g) bei 75ºC 16 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre mit einem Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 1.2 g) zur Reaktion gebracht, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung (4) zu erhalten (Polymerisationsgrad: 10, durchschnittliche Molmasse: 2300)

Herstellungsbeispiel 5: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (5)

m-Tetramethylxylylendiisocyanat (700 g) und ein Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 14 g) wurden bei 180ºC 12 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht, um ein Tetramethylxylylencarbodiimid mit Isocyanatende zu erhalten (Polymerisationsgrad: 3) Anschließend wurden das erhaltene Carbodiimid (74.6 g) und Poly(oxyethylen)monoethylether (Polymerisationsgrad 6, 63.6 g) bei 100ºC 48 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Das erhaltene Produkt (10 g) wurde pipettiert und nach und nach wurde bei 50ºC destilliertes Wasser (90 g) zugegeben, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung (5) zu erhalten (durchschnittliche Molmasse: 1400)

Herstellungsbeispiel 6: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (6)

4,4'-Diphenylmethandiisocyanat (162 g) wurden in Tetrahydrofuran (886 g) unter Rückfluss 7 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre mit einem Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 0.33 g) zur Reaktion gebracht, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung (6) zu erhalten (Polymerisationsgrad: 60, durchschnittliche Molmasse: 13000, Polymerkonzentration: 95 Gew.-%)

Herstellungsbeispiel 7: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (7)

m-Tetramethylxylylendiisocyanat (700 g) und ein Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 14 g) wurden bei 180ºC 18 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht, um ein Tetramethylxylylencarbodiimid mit Isocyanatende zu erzeugen (Polymerisationsgrad: 4). Anschließend wurden das erhaltene Carbodiimid (50.2 g) und 2- Dimethylaminoethanol (8.9 g) bei 80ºC 24 Stunden lang zur Reaktion gebracht, dann wurde Methyl-p-tolulsulfonat (18.6 g) dazu gegeben, und man lies eine Stunde lang reagieren. Nach und nach wurde destilliertes Wasser (699.3 g) dazugegeben, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung 7 zu erzeugen (durchschnittliche Molmasse: 1600, Polymerkonzentration: 10 Gew.-%).

Herstellungsbeispiel 8: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (8)

Isophorondiisocyanat (20 g) und ein Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1- phenyl-2-phospholen-1-oxid, 0.2 g) wurden bei 180ºC 18 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht, um ein Isophoroncarbodiimid mit Isocyanatende zu erzeugen (Polymerisationsgrad: 4) Anschließend wurden das erhaltene Carbodiimid (7.56 g) und 3-Dimethylaminopropylamin (2.04 g) bei 80ºC eine Stunde lang zur Reaktion gebracht, dann wurde Methyl-2-toluylsulfonat (3.72 g) dazugegeben und man ließ eine Stunde lang reagieren. Nach und nach wurde destilliertes Wasser (120 g) dazugegeben, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung 8 zu erzeugen (durchschnittliche Molmasse: 1400, Polymerkonzentration: 10 Gew.-%).

Herstellungsbeispiel 9: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (9)

4,4'-Dicyclohexylmethandiisocyanat (117.9 g) und ein Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 1.2 g) wurden bei 180ºC 8 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht, um ein Dicyclohexylcarbodiimid mit Isocyanatende zu erzeugen (mittlerer Polymerisationsgrad: 2.4) Anschließend wurden das erhaltene Carbodiimid (7.85 g) und Poly(oxiethylen)monomethylether (Polymerisationsgrad: etwa 6, 5.92 g) bei 100 ºC 48 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Nach und nach wurde destilliertes Wasser (124 g) dazugegeben, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung 9 zu erzeugen (durchschnittliche Molmasse: 1300, Polymerkonzentration: 10 Gew.-%).

Herstellungsbeispiel 10: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (10)

4,4'-Dicyclohexylmethandiisocyanat (15 g) und ein Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 0.1 g) wurden in Tetrahydrofuran (145 g) bei 75ºC 8 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht, um ein Diphenylmethancarbodiimid mit Isocyanatende zu erzeugen (Polymerisationsgrad: 5) Anschließend wurde Poly(oxiethylen)monomethylether (Polymerisationsgrad 10, 9.44 g) zu der erhaltenen Carbodiimidlösung gegeben und bei 75ºC 48 Stunden lang zur Reaktion gebracht, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung 10 zu erzeugen (durchschnittliche Molmasse: 2100, Polymerkonzentration: 10 Gew.-%).

Herstellungsbeispiel 11: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (11)

Ein Gemisch aus 2,4-Tolylendiisocyanat und 2,6-Tolylendiisocyanat (Mischungsverhältnis: 80 : 20, 13.9 g) und ein Katalysator zur Carbodiimidbildung (3- Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 0.1 g) wurden in Tetrahydrofuran (150 g) bei 75ºC 8 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht, um ein Tolylencarbodiimid mit Isocyanatende zu erzeugen (Polymerisationsgrad: 4) Anschließend wurde Natriumhydropropansulfonat (1.62 g) zu der erhaltenen Carbodiimidlösung gegeben und man ließ 24 Stunden lang bei 75ºC reagieren, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung 11 zu erhalten (durchschnittliche Molmasse: 1000, Polymerkonzentration: 10 Gew.-%).

Herstellungsbeispiel 12: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (12)

4,4-Diphenylmethandiisocyanat (24 g) und Polyethylenglycol (durchschnittliche Molmasse 400, 20 g) wurden zu Tetrahydrofuran (440 g) gegeben, um eine Reaktion durchzuführen. Anschließend wurde ein Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl- 1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 0.2 g) bei 75ºC 48 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung 12 zu erhalten (durchschnittliche Molmasse: 5300, Polymerkonzentration: 10 Gew.-%).

Herstellungsbeispiel 13: Herstellung einer Lösung einer Carbodiimidverbindung (13)

4,4-Dicyclohexylmethandiisocyanat (52.4 g) und 1,4-Diaminobutan (8.8 g) wurden zu Tetrahydrofuran (620 g) gegeben, um zu reagieren. Anschließend wurde ein Katalysator zur Carbodiimidbildung (3-Methyl-1-phenyl-2-phospholen-1-oxid, 0.5 g) bei 75ºC 48 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht, um eine Lösung einer Carbodiimidverbindung 13 zu erhalten (durchschnittliche Molmasse: 3700, Polymerkonzentration: 10 Gew.-%).

Beispiel 1: Nachweis von auf einer Mikroplatte mit Kohleüberzug immobilisierten DNS unter Verwendung markierter DNS

(1) Immobilisierung eines DNS-Oligomers auf einer Mikroplatte

Ein eingefangenes DNS-Oligomer (SEQ ID NO: 1) und ein biotinyliertes Sonden-DNS- Oligomer (SEQ ID NO: 2) wurden unter Verwendung eines DNS-Synthetisierers (hergestellt von Millipore, Cyclone Plus DNS/RNA-Synthesizer) synthetisiert. Biotin wurde am 5'-Ende der Sonde unter Verwendung von Biotinphosphoamidit (hergestellt von Millipore) während der Synthese des DNS-Oligomers eingeführt.
Ein Aliquot (0.1 mL) der Carbodiimidlösung 1 wurde verteilt und in jede der Vertiefungen einer Mikroplatte aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen gegeben, die bei 60 ºC eine Stunde lang inkubiert wurde. Nach dem Entfernen der Lösung wurde jede der Vertiefungen gut mit Ethanol gewaschen. Nach 30-minütigem Trocknen bei 60ºC wurde eine wässrige Lösung des eingefangenen 30-mer (10 pmol/100 uL, 100 uL) in jede der Vertiefungen gegeben und die Platte eingeschweisst. Die Immobilisierung wurde eine Stunde lang in einem Inkubator bei 37ºC durchgeführt.
Andererseits wurde ein Oligonukleotid (SEQ ID NO: 3), das keinerlei Komplementarität zu der Sonde zeigte, zur Kontrolle hergestellt und auf die selbe Art wie oben beschrieben, immobilisiert.

(2) Nachweis des eingefangenen Oligonucleotids durch Hybridisierung

Eine Prähybridisierungs-Lösung (100 uL/Vertiefung) wurde zu der Platte gegeben, auf der das eingefangene Oligonucleotid (SEQ ID NO: 1) oder das Kontroll-DNS- Oligonukleotid immobilisiert worden waren. Die Platte wurde eingeschweisst und zwei Stunden lang in einem Inkubator bei 42ºC gelassen Die Prähybridisierungs-Lösung hatte eine Zusammensetzung, die 5 · SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M Natriumcitrat), 5 · Denhardts Lösung (0.02% Ficoll, 0.02% BSA-Fraktion V, 0.02% Polyvinylpyrrolidon), 25 mM Natriumphosphat (pH 6.6), 50% Formamid und 0.5 mg/mL denaturierte Lachsspermien-DNS umfasste.
Die Lösung in jeder der Vertiefungen wurde unter Verwendung einer Pipette aufgesaugt und entfernt. Eine Hybridisierungslösung (100 uL/Vertiefung) zu der die Sonde zugegeben worden war, wurde in die Vertiefung gegeben und die Platte wurde eingescheißt. Es wurde 15 Stunden lang in einem Inkubator bei 42ºC eine Reaktion durchgeführt. Die Hybridisierungslösung hatte eine Zusammensetzung, die folgendes umfasste: 5 · SSC, 1 · Denhardts Lösung, 25 mM Natriumphosphat (pH 6.6), 45% Formiat, 0.2 mg/mL denaturierte Lachsspermien-DNS und 10% Dextransulfat.
Die Sonde wurde 5 Minuten lang bei 70ºC behandelt, schnell fünf Minuten lang mit Eis gekühlt und zu der Hybridisierungslösung gegeben, so dass sich 1, 10 oder 100 pMol/Vertiefung ergaben.
Nach der Hybridisierung wurde die Lösung in der Vertiefung aufgesaugt und entfernt, und es wurde 1 · SSC (300 uL/Vertiefung) zugegeben, gefolgt von fünfminütigem stehen lassen bei Raumtemperatur. Dieser Vorgang wurde zwei weitere Male durchgeführt, um die Sonde, die nicht spezifisch adsorbiert worden war, zu entfernen.

(3) Nachweis

SSC in der Vertiefung wurde aufgesaugt und entfernt, und Puffer A (0.2 M Natriumchlorid, 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% Triton X-100) enthaltende 3% BSA wurde in die Vertiefung gegeben (300 uL/Vertiefung), um 30 Minuten lang bei Raumtemperatur die Blockierung zu bewirken. Die Lösung in der Vertiefung wurde aufgesaugt und entfernt und eine Lösung von Streptoavidin-alkalische Phosphatase- Konjugat (hergestellt von Gibco BRL, zubereitet durch 5000-faches Verdünnen einer Vorratslösung mit Puffer A) wurde in die Vertiefung zugegeben (100 uL/Vertiefung), um bei, Raumtemperatur 30 Minuten lang eine Reaktion durchzuführen. Die Konjugatlösung wurde aufgesaugt und entfernt und Puffer A wurde in die Vertiefung zugegeben (300 uL/Vertiefung), anschließend ließ man 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dieser Vorgang wurde weitere zwei Mal durchgeführt, um einen Teil des Konjugats, der nicht an Biotin gebunden hatte, zu entfernen. Eine pNpp-Lösung wurde in die Vertiefung gegeben (100 uL/Vertiefung), um bei 30ºC 30 Minuten lang zu reagieren. Die pNpp-Lösung hatte eine Zusammensetzung, die 50 mM Natriumtetraborat (pH 10.0), 5 mM Magnesiumchlorid und 5 mM Dinatrium-p- nitrophenylphosphatat umfasste.
Nach der Reaktion wurde die Enzymreaktion durch Zugabe einer wässrigen Lösung von 0.1 N Natriumhydroxid abgestoppt. Unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts wurde die Absorption einer jeden Vertiefung bei 405 nm gemessen. Das Ergebnis der Messung war, dass die Platte, auf der das Oligomer immobilisiert worden ist, das keine Komplementarität hatte (SEQ ID NO: 3), die selbe Absorption wie der Hintergrund hatte, während die Platte, auf der das Eingefangene immobilisiert worden war, einen Absorptionswert lieferte, der einen signifikanten Unterschied vom Hintergrund aufwies. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 dargestellt

Tabelle 1

Eingefangene DNS Absorptionswert A&sub4;&sub0;&sub5;
SEQ ID NO: 1 1.54
SEQ ID NO: 3 0.05
(Hintergrund 0.05)

Beispiel 2: Nachweis von auf Polystyrolkugeln mit Kohleüberzug immobilisierter M13- DNS unter Verwendung markierter M13-DNS

(1) Immobilisierung von eingefangener DNS auf Kugeln

Um die mit Carbodiimid überzogenen Kugeln zu erhalten, wurden Polystyrolkugeln (5 g) 30 Minuten lang in die Carbodiimidlösung 2 (100 mL) gelegt, dann wurden sie 3 Stunden lang bei 60ºC getrocknet. Die mit Carbodiimid überzogenen Kugeln (1 g) wurden in sterilisiertem destillierten Wasser (10 mL) suspendiert. Thermisch denaturierte M13-RF-DNS oder pBR322-DNS wurde zu der Suspension gegeben, so dass eine Konzentration von 100 ng/mL erhalten wurde. Die Immobilisierung wurde zwei Stunden lang unter Schütteln bei 37ºC durchgeführt. Die Kugeln wurden mit 500 mL destilliertem Wasser unter Verwendung eines Filters gewaschen, und sie wurden an Luft getrocknet.

(2) Hybridisierung

Die an Luft getrockneten Kugeln (100 mg) wurden gewogen und in ein Einweggefäß mit einem Volumen von 1.5 mL überführt, in das die in Beispiel 1 hergestellte Prähybridisierungs-Lösung (/ml) zugegeben wurde, gefolgt von zweistündigem Stehenlassen bei 42 00 Die Kugeln wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, die in Beispiel 1 hergestellte Hybridisierungslösung (1 mL) wurde zugegeben und die Kugeln wurden gut suspendiert. Der selbe Vorgang wurde zwei weitere Male durchgeführt. Die Hybridisierungslösung (1 mL) wurde zugegeben und die Kugeln wurden gut suspendiert. M13-ssDNS, die unter Verwendung von Photobiotin (hergestellt von VECTOR) biotinmarkiert worden war, wurde thermisch denaturiert und dann zugegeben, so dass eine Konzentration von 1 ug/mL erhalten wurde (pBR322, in das Biotin mittels des selben Markierungsverfahrens eingeführt worden war, wurde als Kontrolle verwendet). Die Reaktion wurde 15 Stunden lang unter Schütteln bei 42ºC durchgeführt.
Die Kugeln wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Überstand wurde entfernt und 2 · SSC (1 mL) wurde zugegeben. Die Kugeln wurden gut suspendiert und anschließend 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dieser Vorgang wurde zwei weitere Male wiederholt. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren entfernt und 0.2 · SSC (1 mL) wurde zugegeben. Die Kugeln wurden gut suspendiert, und anschließend 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dieser Vorgang wurde zwei weitere Male wiederholt. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren entfernt und 0.16 · vorher auf 50ºC erwärmtes SSC (1 mL) wurde zugegeben. Die Kugeln wurden gut suspendiert, und anschließend 10 Minuten lang bei 50ºC stehen gelassen. Dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt.
Der Überstand wurde durch Zentrifugieren entfernt und eine in Beispiel 1 hergestellte, 3% BSA enthaltende Pufferlösung A wurde zugegeben, anschleißend wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren entfernt und eine 1000-fach mit Puffer A verdünnte Lösung von Streptoavidin und alkalischer Phosphatase (hergestellt von Gibco BRL, 1 mL) wurde zugegeben. Die Kugeln wurden gut suspendiert und anschließend 30 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren entfernt und dann wurde Puffe A (1 mL) zugegeben. Die Kugeln wurden gut suspendiert, bevor sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen wurden. Der selbe Vorgang wurde zwei weitere Male durchgeführt.
Der Überstand wurde durch Zentrifugieren entfernt, Boratpuffer (50 mM Natriumtetraborat (pH 10.0), 0.5 mM Magnesiumchlorid, 1 mL) wurde zugegeben und die Kugeln wurden suspendiert. Dieser Vorgang wurde zwei weitere Male wiederholt. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren entfernt und die in Beispiel 1 hergestellte pNpp-Lösung (400 uL) wurde zugegeben. Die Kugeln wurden gut suspendiert. Man ließ 30 Minuten lang bei 30ºC reagieren und dann wurde eine wässrige Lösung von 0.1 N Natriumhydroxid (800 uL) zum Stoppen der Reaktion zugegeben. Die Absorption bei 405 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen.
Gas Ergebnis war, dass bei den Kugeln, auf denen pBR322 immobilisiert worden war, keine Absorption gemessen wurde. Andererseits wurde für die Kugeln, auf denen M13-DNS immobilisiert worden war, ein Wert erhalten, der sich von Hintergrund deutlich unterschied. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 dargestellt

Tabelle 2

Sonden-DNS Absorptionswert (A&sub4;&sub0;&sub5;)
M13 ssDNS 0.96
pBR322-DNS 0.05
(Hintergrund 0.05)

Beispiel 3: Nachweis von auf denaturierter Cellulosemembran mit Kohleüberzug immobilisiertem DNS-Oligomer unter Verwendung markierter M13-DNS

(1) Immobilisierung des DNS-Oligomers

Ein denaturiertes Cellulosefilter wurde 10 Sekunden lang mit der Carbodiimidlösung 3 getränkt und dann 30 Minuten lang bei 60ºC getrocknet. Das Filter wurde auf ein Filterpapier gelegt, auf das eine wässrige Lösung eines DNS-Oligomers (40-mer, SEQ ID NO: 4) und eine wässrige Lösung eines DNS-Oligomers (40-mer, SEQ ID NO: 5) getupft worden waren. Das DNS-Oligomer (40-mer, SEQ ID NO: 4) hatte eine Sequenz; die zu einem multiplen Klonbereich der M13-DNS, die auf die selbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert wurde, komplementär war. Das DNS-Oligomer (40-mer, SEQ ID NO: 5) hatte zur M13-DNS keine Komplementarität. Die wässrigen Lösungen wurden in einer Menge von 1 uL, respektive als um das 10-fache verdünnte Lösungen zwischen 1 ng und 1 fg getupft. Das Filter wurde 15 Minuten bei 37ºC gelassen, um die DNS-Oligomere zu immobilisieren.

(2) Hybridisierung

Die denaturierte Cellulosemembran mit Kohleüberzug mit den darauf immobilisierten Oligomeren wurde in einen Hybridisierungsbeutel gegeben (hergestellt von den Bethesta Research Laboratories), in den die in Beispiel 1 hergestellte Prähybridisierungs-Lösung zugegeben wurde (0.08 mL/cm² Membran). Der Hybridisierungsbeutel wurde unter Verwendung eines Folienschweißgerätes verschlossen und anschließend zwei Stunden lang bei 42ºC belassen. Die Membran wurde aus dem Hybridisierungsbeutel genommen und in einen neuen Hybridisierungsbeutel gegeben. Die in Beispiel 1 hergestellte, mit thermisch denaturiertem Biotin biotinmarkierte M13-RF-DNS enthaltende Hybridisierungslösung (hergestellt von VECTOR) (100 ng/mL) wurde in den Beutel zugegeben (0.03 mL/cm²). Der Hybridisierungsbeutel wurde unter Verwendung eines Schweißgerätes verschlossen und anschließend 15 Stunden lang bei 42ºG belassen. Die Membran wurde aus dem Hybridisierungsbeutel genommen und in eine Schale mit 2 · SSC in einer Menge, die ausreichte, die Membran zu tränken, gegeben. Die Schale wurde fünf Minuten lang langsam bei Raumtemperatur geschüttelt. Dieser Vorgang wurde nochmals durchgeführt. Danach wurde die Membran in eine Schale gegeben, die mit einer ausreichenden Menge auf 40ºC erwärmte 0.2 · SSC gefüllt war, die fünf Minuten lang bei 40ºC langsam geschüttelt wurde. Dieser Vorgang wurde zwei weitere Male durchgeführt. Die Membran wurde in eine mit 2 · SSC gefüllte Schale überführt und gut gewaschen.

(3) Nachweis

Die Membran wurde in einen neuen Hybridisierungsbeutel gegeben, in den 3% BSA enthaltender Puffer A zugegeben wurde (1 mL/cm²). Der Hybridisierungsbeutel wurde unter Verwendung eines Folienschweißgeräts verschlossen und anschließend 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gelassen. Die Membran wurde aus dem Hybridisierungsbeutel genommen und in einen neuen Hybridisierungsbeutel überführt, in den eine Lösung von Streptoavidin-alkalische Posaphatase-Konjugat (hergestellt von Gibco BRL, 1000-fach mit Puffer A verdünnt) (0.1 mL/cm²) gegeben wurde. Der Hybridisierungsbeutel wurde unter Verwendung eines Folienschweißgerätes zugeschweißt und anschließend 30 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen. Die Membran wurde aus dem Hybridisierungsbeutel herausgenommen und in eine Schale überführt, die mit einer ausreichenden Menge Puffer gefüllt war, um sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln zu waschen. Dieser Vorgang wurde zwei weitere Male wiederholt.
Die Membran wurde in einen neuen Hybridisierungsbeutel gegeben, in den eine Lösung eines farbentwickelnden Substrates zugegeben wurde (0.1 mL/cm²). Der Hybridisierungsbeutel wurde unter Verwendung eines Folienschweißgerätes zugeschweißt und anschließend solange bei Raumtemperatur belassen, bis Signale in angemessenem Ausmaß erhalten wurden. Die Zusammensetzung des farbentwickelnden Substrats war folgendermaßen: Es wurden eine Lösung von BCIP (50 mg 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat/900 mL Dimethylformamid; 3.2 uL) und eine NTB-Lösung (50 mg Nitroblautetrazolium/1.8 mL 70% Ethanol, 6.4 uL) zu einer Lösung (1 mL) aus 0.1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9.5), 0.1 M NaCl und 50 mM Magnesiumchlorid gegeben.
Nachdem ausreichend Starke Signale erhalten wurden, wurde die Membran mit 0.2 M EDTA-Puffer (pH 8.0) gewaschen, um die Farbentwicklungsreaktion anzuhalten. Als Ergebnis wurden Signale nur an den Stellen erhalten, an denen das zu M13-DNS komplementäte Oligomere immobilisiert gewesen war. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 dargestellt Tabelle 3
++: deutlich sichtbar, +: sichtbar, -: unsichtbar

Beispiel 4: Nachweis von auf kohlenstoffbeschichteter Mikroplatte immobilisiertem DNS-Oligomer unter Verwendung einer Zweistufen-Hybridisierung

(1) Immobilisierung des DNS-Oligomers

Das zur M13 ssDNS komplementäre eingefangene DNS-Oligomer (40 mer, SEQ ID NO: 4) wurde entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Ablauf immobilisiert.

(2) Hybridisierung

Die Prähybridisierungs-Lösung (100 ul) wurde in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde eingeschweißt, gefolgt von 2-stündigem Stehenlassen bei 42ºC. Die Lösung in jeder Vertiefung wurde unter Verwendung einer Pipette aufgesaugt und entfernt. Eine wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitete Hybridisierungslösung 1, die thermisch denaturierte M13 ssDNS (100 ng/mL) enthielt (pBR322 wurde zu einem Kontrollsystem gegeben), und ein biotinyliertes, zur thermisch denaturierten M13 ssDNS komplementäres DNS-Oligomer (40 mer) (das keine Komplementarität zu dem auf der Platte immobilisierten eingefangenen Oligomer hatte, SEQ ID NO: 6), das wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert wurde und dessen 5'-Ende biotinmarkiert war, wurde in die Vertiefung gegeben (1 ug/mL, 100 ug/Vertiefung). Die Platte wurde eingeschweißt und anschließend 15 Stunden lang bei 42ºC stehen gelassen.
Die Lösung wurde aus jeder Vertiefung aufgesaugt und entfernt. 1 · SSC wurde in die Vertiefungen gegeben (200 uL/Vertiefung), anschließend wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dieser Vorgang wurde zwei weitere Mal wiederholt.

(3) Nachweis

Der Nachweis wurde entsprechend des selben Verfahrens, wie es in Beispiel 1 (3) beschrieben wurde, durchgeführt. Als Ergebnis wurde in dem System, in dem M13 ssDNS verwendet worden war, ein Absorptionswert erhalten, der sich vom Hintergrund deutlich unterschied. Andererseits wurde im System, in dem pBR322 zur Kontrolle verwendet worden war, kein signifikanter Unterschied vom Hintergrund beobachtet. Das Ergebnis ist in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4

DNS Absorptionswert (A&sub4;&sub0;&sub5;)
M13 ssDNS 0.54
BR322 DNS 0.05

Beispiel 5: Nachweis von auf kohlestoffbeschichtetem aufgedampftem Aluminiumfilm immobilisiertem IgG unter Verwendung von markiertem Anti-IgG

(1) Immobilisierung von IgG auf einer Metallplatte

Aluminium wurde mit einer Dicke von 2000 Ångstrom auf einem Glassubstrat abgeschieden, um einen aufgedampften Film zu erhalten. Drei Tupfen einer Kaninchen-IgG-Lösung (1% Gelatine, 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5), 0.5 M NaCl) wurden auf den aufgedampften Film aufgetupft, der mit irgendeiner Lösung der Carbodiimidverbindungen 1-4, 6 und 10-13 unter Verwendung eines Schleuderbeschichters beschichtet war, und auf den aufgedampften nicht beschichteten Aluminiumfilm mit der respektiven Lösung einer Carbodiimidverbindung, gefolgt von einer zehnminütigen Immobilisierung bei Raumtemperatur. Diese aufgedampften Aluminiumfilme wurden dreimal jeweils zehn Minuten lang mit einer Waschlösung 1 (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 0.05% Tween 20) gewaschen.

(2) Nachweis von Kaninchen-IgG mittels Antigen-Antikörper-Reaktion

(a) Blockieren

Blockieren wurde bei 25ºC 30 Minuten lang in einer Blockierlösung (3% Gelatine, 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5), 0.5 M NaCl) durchgeführt.

(b) Antigen-Antikörper-Reaktion

Die Inkubation wurde zwei Stunden lang bei 37ºC in einer Lösung eines mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-Kaninchen-Ziegen-IgG (1% Gelatine, 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 0.05% Tween 20) durchgeführt. Antikörper, der nicht abreagiert hatte, wurde entfernt, indem drei mal jeweils 10 Minuten lang mit der Waschlösung 1 gewaschen wurde, gefolgt von Ersetzen durch eine Waschlösung 2 (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5), 0.5 M NaCl).

(c) Farbentwicklung

Eine BCIP-Lösung (50 mg 5-Bromo-4-chloro-3-indolyphosphat, 900 mL Dimethylformamid, 3.2 uL) wurde mit einer NTB-Lösung (50 mg Nitroblautetrazolium, 1.8 mL 70% Ethanol, 6.4 uL) vermischt, um eine Lösung zu erhalten, die als Substrat zu einem Puffer (0.1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9.5), 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl&sub2;, 1 mL) gegeben wurde, gefolgt von einer dreistündigen Farbentwicklung bei Raumtemperatur. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

Carbodiimidlösung Ergebnis der Farbentwicklung
Keine -
1 +
2 +
3 +
4 +
6 +
10 +
11 +
12 +
13 +
+: Farbentwicklung, -: keine Farbentwicklung

Beispiel 6: Sandwich ELISA unter Verwendung einer kohlenstoffbeschichteten Platte

(1) Immobilisierung von IFNy auf der Mikroplatte

Die Carbodiimidverbindung wurde auf die selbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, beschichtet, um eine 96-Loch Mikrotiterplatte aus Polystyrol zu präparieren, auf die eine Lösung von 1 ug/uL antihuman Interferon-γ-Antikörper (IFNγ) (10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl) pipettiert und in einer Menge von 100 uL pro einzelnem Loch gegebenen wurde, gefolgt von stehen lassen über Nacht bei 4 ºC. Nicht-adsorbierter Antikörper wurde mittels fünfmaligem Waschen jeweils fünf Minuten lang mit einer Waschlösung 1 (Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.05% Tween 20) entfernt,.

(2) Blockieren

Eine Blockierungs-Lösung (3% Magermilch, 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl) wurde pipettiert und in einer Menge von 300 uL pro Loch gegeben, um bei 25ºC 30 Minuten lang die Blockierung durchzuführen.

(3) Antigen-Antikörper-Reaktion

Es wurden mit einem Puffer (1% Magermilch, 10 mM Nafriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl) Standardlösungen hergestellt, so dass 400 pg, 200 pg, 100 pg, 50 pg, 25 pg und 12.5 pg IFNγ enthalten waren, die in einer Menge von 100 uL, respektive, auf die Mikrotiterplatte gegeben wurden, auf der der antihumane IFNγ-Antikörper wie unter Punkt 1 beschrieben immobilisiert worden war. Die Platte wurde eingeschweißt und dann bei 37ºC 2 Stunden lang inkubiert. Antigen, das nicht abreagiert hatte, wurde entfernt, indem man fünf Mal jeweils fünf Minuten lang mit der Waschlösung 1 wusch.
Als Nächstes wurde eine Lösung eines mit alkalischer Phosphatase markiertem Anti- IFNγ-Antikörper (1% Magermilch, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl) in einer Menge von 100 uL pro einzelner Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde eingeschweißt und es folgte eine Inkubation bei 37ºC zwei Stunden lang. Antikörper, der nicht abreagiert hatte, wurde entfernt, indem man fünf Mal jeweils fünf Minuten lang mit der Waschlösung 1 wusch.

(4) Farbentwicklung

Eine pNpp-Lösung wurde auf die selbe Weise hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, und in einer Menge von 100 uL pro einzelner Vertiefung zugegeben. Es wurde bei 30ºC 25 Minuten lang eine Reaktion durchgeführt. Danach wurde die Farbentwicklung durch Zugabe von 100 uL 0.1 N NaOH pro Vertiefung gestoppt. Die Dichte der entstandenen Farbe wurde unter Verwendung eines Mikroplatten- Lesegerätes gemessen, das auf eine Absorptionswellenlänge von 405 nm eingestellt war. Das Ergebnis ist in Tabelle 6 dargestellt Tabelle 6
(Hintergrund: 0.05)

Beispiel 7: Nachweis von humanem Plasminogen basierend auf einem Agglutinationsverfahren unter Verwendung von emulsivem kohlenstoffbeschichtetem Polystyrol-Latex (1)

(1) Immobilisierung eines anti-humanen Plasminogen-Antikörpers auf kohlenstoffbeschichtetem Polystyrol-Latex

Ein Polystyrol-Latex, der Partikel mit einem Durchmesser von 0.15 um umfasst, die mit der Lösung der Carbodiimidverbindung 3 beschichtet sind, wurde so hergestellt, das er eine Konzentration von 1 Gew.-% in 50 mM Boratpuffer (pH 8.5) hatte. Diese Lösung wurde pipettiert (1 mL) und ihre Temperatur auf 37ºC gehalten. Anschließend wurde anti-humaner Plasminogenantikörper (300 ug) zugegeben, gefolgt von einstündigem Schütteln bei 37ºC. Diese Lösung wurde bei 4ºC eine Stunde lang bei 18000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen.

(2) Blockieren

In einer Lösung aus 3% Rinderserumalbumin und 50 mM Boratpuffer (pH 8.5) wurde das Präzipitat suspendiert, gefolgt von einstündigem Schütteln bei 37ºC. Diese Lösung wurde bei 4ºC eine Stunde lang bei 18000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen. Das Präzipitat wurde in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4) suspendiert, um eine Lösung mit einer Konzentration von 0.5 Gew.-% zu erhalten.

(3) Messung der Änderung der Absorption durch die Agglutinationsreaktion

Eine Lösung von humanem Plasminogen (10 mg/mL, 50 uL) (3% Rinderserumalbumin, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl) und der Latex-Lösung (50 uL) mit dem immobilisierten anti-humanen Plasminogen, die wie unter den Punkten (1) und (2) beschrieben hergestellt wurde, wurde zu 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4) gegeben, der 150 mM NaCl (400 uL) enthielt, und vermischt. Die Änderung der Absorption dieser Lösung bei einer Wellenlänge von 660 nm wurde zwischen 30 und 120 Sekunden nach dem Start der Reaktion gemessen. Es wurde als Kontrolle auf die selbe Weise, wie oben für 10 mg/mL einer humanen Transferrin-Lösung (3% Rinderserumalbumin, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl) beschrieben, ein Test durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7

Größe der Veränderung des Absorptionswertes (A&sub6;&sub6;&sub0;)
Plasminogen 0.52
Transferrin 0.005

Beispiel 8: Nachweis von humanem Plasminogen basierend auf einem Agglutinationsverfahren unter Verwendung von emulsivem kohlenstoffbeschichteten Polystyrol-Latex (2)

(1) Immobilisierung eines anti-humanen Plasminogen-Antikörpers auf kohlenstoffbeschichtetem Polystyrol-Latex vom C-Typ

Ein Polystyrol-Latex, der Partikel mit einem Durchmesser von 0.15 um umfasst, die mit der Lösung der Carbodiimidverbindung 9 beschichtet sind, wurde so hergestellt, das er eine Konzentration von 1 Gew.-% in 50 mM Boratpuffer (pH 8.5) hatte. Diese Lösung wurde pipettiert (1 mL) und ihre Temperatur auf 37ºC gehalten. Anschließend wurde anti-humaner Plasminogenantikörper (300 ug) zugegeben, gefolgt von einstündigem Schütteln bei 37ºC. Diese Lösung wurde bei 4ºC eine Stunde lang bei 18000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen.

(2) Blockieren

(3) Messung der Änderung der Absorption durch die Agglutinationsreaktion

Eine Lösung von humanem Plasminogen (10 mg/mL, 50 uL) (3% Rinderserumalbumin, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl) und der Latex-Lösung (50 uL) mit dem immobilisierten anti-humanen Plasminogen, die wie unter den Punkten (1) und (2) beschrieben, hergestellt wurde, wurde zu 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4) gegeben, der 150 mM NaCl (400 uL) enthielt, und vermischt. Die Änderung der Absorption dieser Lösung bei einer Wellenlänge von 660 nm wurde zwischen 30 und 120 Sekunden nach dem Start der Reaktion gemessen. Es wurde als Kontrolle auf die selbe Weise wie oben beschrieben ein Test mit 10 mg/mL einer humanen Transferrin-Lösung durchgeführt (3% Rinderserumalbumin, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl). Das Ergebnis ist in Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8

Größe der Veränderung des Absorptionswertes (A&sub6;&sub6;&sub0;)
Plasminogen 0.55
Transferrin 0.005

Beispiel 9: Nachweis von DNS basierend auf einem Agglutinationsverfahren unter Verwendung von emulsivem kohlenstoffbeschichteten carboxylartigen Polystyrol-Latex

(1) Immobilisierung von M13 mp18ss auf kohlenstoffbeschichtetem Polystyrol- Latex vom C-Typ

Ein Carboxylgruppen enthaltender Polystyrol-Latex, der Partikel mit einem Durchmesser von 0.15 um umfasst, die mit der Lösung der Carbodiimidverbindung 11 beschichtet sind, wurde so hergestellt, das er eine Konzentration von 1 Gew.-% in 50 mM Boratpuffer (pH 8.5) hatte. Diese Lösung wurde pipettiert (0.5 mL) und ihre Temperatur auf 37ºC gehalten. Anschließend wurden 20 ug/mL einer M13 mp18ss- Lösung (0.5 mL) zugegeben, gefolgt von zweistündigem Schütteln bei 37ºC. Diese Lösung wurde bei 4ºC eine Stunde lang bei 18000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen.

(2) Prähybridisierung

In einer Prähybridisierungs-Lösung (5 · SSC, 5 · Denhardts Lösung, 25 mM Phosphatpuffer (pH 6.6), 50% Formamid, 0.5 mg/mL denaturierte Lachsspermien- DNS) wurde das Präzipitat suspendiert, gefolgt von einstündigem Schütteln bei 42ºC. Diese Lösung wurde bei 4ºC eine Stunde lang bei 18000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen. Das Präzipitat wurde in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4) suspendiert, um eine Lösung mit einer Konzentration von 0.5 Gew.-% zu erhalten.

(3) Hybridisierung

Eine Hybridisierungslösung (5 · SSC, 1 · Denhardts Lösung, 25 mM Phosphatpuffer (pH 6.6), 45% Formamid, 0.2 mg/mL denaturierte Lachsspermien-DNS, 20 ng/mL M13 mp18 RF, 200 uL) wurde zu der Latex-Lösung (200 uL) gegeben, die wie unter den Punkten (1) und (2) beschrieben, hergestellt worden war, gegeben, und vermischt, gefolgt von zweistündigem Schütteln bei 42ºC. Es wurde eine Kontrolle zur Verfügung gestellt, indem 20 ng/mL M13 mp18 RF in der Hybridisierungslösung durch pBR322 ersetzt wurden, und es wurde auf die selbe Weise wie oben beschrieben zur Reaktion gebracht.

(4) Messung der Änderung der Absorption durch die Agglutinationsreaktion

Um die Änderung der Absorption der Lösung bei einer Wellenlänge von 550 nm zu messen, wurde die Absorption unmittelbar nach dem Beginn der Reaktion, und zwei Stunden nach dem Reaktionsbeginn gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 9 dargestellt.

Tabelle 9

DNS Größe der Veränderung des Absorptionswertes (A&sub5;&sub5;&sub0;)
M13 m18ss 0.36
pBR322 0.001

Beispiel 10: Nachweis von humanem Plasminogen basierend auf einem Agglutinationsverfahren unter Verwendung von emulsivem kohlenstoffbeschichteten Latex

(1) Immobilisierung von anti-humanem Plasminogenantikörper auf kohlenstoffbeschichtetem Latex

Ein Polystyrol-Latex, der Partikel mit einem Durchmesser von 0.15 um umfasst, die mit der Lösung der Carbodiimidverbindung 3 beschichtet sind, wurde so hergestellt, das er eine Konzentration von 1 Gew.-% in 50 mM Boratpuffer (pH 8.5) hatte. Diese Lösung wurde pipettiert (1 mL) und ihre Temperatur auf 37ºC gehalten. Anschließend wurde anti-humanes Plasminogen (300 ug) zugegeben, gefolgt von einstündigem Schütteln bei 37ºC. Diese Lösung wurde bei 4ºC eine Stunde lang bei 18000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen.

(2) Blockieren

(3) Messung der Änderung der Absorption durch die Agglutinationsreaktion

Eine Lösung von humanem Plasminogen (10 mg/mL, 50 uL) (3% Rinderserumalbumin, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl) und die Latex-Lösung (50 uL) Latex-Lösung (50 uL) mit dem immobilisierten anti-humanen Plasminogenantikörper, die wie unter den Punkten (1) und (2) beschrieben, hergestellt wurde, wurde zu 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4) gegeben, der 150 mM NaCl (400 uL) enthielt, und vermischt. Die Änderung der Absorption dieser Lösung bei einer Wellenlänge von 660 nm wurde zwischen 30 und 120 Sekunden nach dem Start der Reaktion gemessen. Es wurde als Kontrolle auf die selbe Weise wie oben beschrieben ein Test mit 10 mg/mL einer humanen Transferrin-Lösung durchgeführt (3% Rinderserumalbumin, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl). Das Ergebnis ist in Tabelle 10 dargestellt.

Tabelle 10

Größe der Veränderung des Absorptionswertes (A&sub6;&sub6;&sub0;)
Plasminogen 0.62
Transferrin 0.005

Beispiel 11: Nachweis von DNS basierend auf einem Agglutinationsverfahren unter Verwendung von emulsivem kohlenstoffbeschichteten Latex

(1) Immobilisierung von M13 mp18ss auf kohlenstoffbeschichtetem Latex

Ein Polystyrol-Latex, der Partikel mit einem Durchmesser von 0.15 um umfasst, die mit der Lösung der Carbodiimidverbindung 3 beschichtet sind, würde so hergestellt, das er eine Konzentration von 2 Gew.-% in 50 mM Boratpuffer (pH 8.5) hatte. Diese Lösung wurde pipettiert (0.5 mL) und ihre Temperatur auf 37ºC gehalten. Anschließend wurden 20 ug/mL einer M13 mp18ss-Lösung (0.5 mL) zugegeben, gefolgt von zweistündigem Schütteln bei 37ºC. Diese Lösung wurde bei 4ºC eine Stunde lang bei 18000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen.

(2) Prähybridisierung

(3) Hybridisierung

Eine Hybridisierungslösung (5 · SSC, 1 · Denhardts Lösung, 25 mM Phosphatpuffer (pH 6.6), 45% Formamid, 0.2 mg/mL denaturierte Lachsspermien-DNS, 20 ng/mL M13 mp18 RF, 200 uL) wurde zu der Latex-Lösung (200 uL) gegeben, die wie unter den Punkten (1) und (2) beschrieben, hergestellt worden war, und vermischt, gefolgt von zweistündigem Schütteln bei 42ºC. Es wurde eine Kontrolle zur Verfügung gestellt, indem 20 ng/mL M13 mp18 RF in der Hybridisierungslösung durch pBR322 ersetzt wurden, und es wurde auf die selbe Weise wie oben beschrieben zur Reaktion gebracht.

(4) Messung der Änderung der Absorption durch die Agglutinationsreaktion

Um die Änderung der Absorption der Lösung bei einer Wellenlänge von 550 nm zu messen, wurde die Absorption unmittelbar nach dem Beginn der Reaktion und zwei Stunden nach Reaktionsbeginn gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 11 dargestellt.

Tabelle 9

DNS Größe der Veränderung des Absorptionswertes (A&sub5;&sub5;&sub0;)
M13 m18ss 0.33
pBR322 0.001

Beispiel 12: ELISA-Nachweis eines auf einem kohlenstoffbeschichtetem PET-Film immobilisierten Oligopeptids

(1) Immobilisierung von humanem ACTH auf einen kohlenstoffbeschichtetem PET- Film

Drei Tupfen humaner ACTH-Lösung (10 mM HEPES (pH 7.0)) wurden jeweils auf einen PET-Film, der mit irgendeiner der Lösungen der Carbodiimidverbindungen 1-4, 6 und 10 bis 13 beschichtet war, und auf einen nicht mit der Lösung der Carbodiimidverbindung beschichteten PET-Film getupft, gefolgt von einer zehnminütigen Immobilisierung bei Raumtemperatur.

(2) Nachweis von humanem ACTH mittels Antigen-Antikörper-Reaktion

(a) Blockieren

(b) Antigen-Antikörper-Reaktion

Die Inkubation wurde zwei Stunden lang bei 37ºC in einer Lösung eines mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-ACTH-Ziegen-IgG (1% Gelatine, 20 mM Tris- HCl-Puffer (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 0.05% Tween 20) durchgeführt. Antikörper, der nicht abreagiert hatte, wurde entfernt, indem drei Mal jeweils 10 Minuten lang mit der Waschlösung 1 gewaschen wurde, gefolgt von Ersetzen durch die Waschlösung 2 (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.5), 0.5 M NaCl).

(c) Farbentwicklung

Eine BCIP-Lösung (50 mg 5-Bromo-4-chloro-3-indolyphosphat, 900 mL Dimethylformamid, 3.2 uL) wurde mit einer NTB-Lösung (50 mg Nitroblautetrazolium, 1.8 mL 70% Ethanol, 6.4 uL) vermischt, um eine Lösung zu erhalten, die als Substrat zu einem Puffer (0.1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9.5), 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl&sub2;, 1 mL) gegeben wurde, gefolgt von einer dreistündigen Farbentwicklung bei Raumtemperatur. Das Ergebnis ist in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12

Sequenz-Liste

(1) Allgemeine Informationen

(i) Anmelder: Nisshinbo Industries Inc.
(ii) Titel der Erfindung: Verfahren zum Analysieren biologisch aktiver Substanzen
(iii) Anzahl der Sequenzen: 6
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adresse:
(B) Straße:
(C) Stadt:
(D) Land:
(E) Postleitzahl:
(v) Computerlesbare Form:
(A) Art des Mediums: Floppy Disk
(B) Computer: IBM-PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software:
(vi) Daten der vorliegenden Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Anmeldedatum:
(C) Klasse:
(vii) Daten der früheren Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Anmeldedatum:
(viii) Information über den Vertreter:
(A) Name:
(B) Registriernummer:
(ix) Telekommunikationsinformationen:
(A) Telefonnummer:
(B) Telefax:
(2) Informationen zu SEQ ID NO: 1:
(i) Sequenzkennzeichen
(A) Länge: 30
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: andere....synthetische DNS (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1
(2) Informationen zu SEO ID NO: 2:
(i) Sequenzkennzeichen
(A) Länge: 30
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: andere....synthetische DNS (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2
(2) Informationen zu SEQ ID NO: 3:
(i) Sequenzkennzeichen
(A) Länge: 30
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: andere....synthetische DNS (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3
(2) Informationen zu SEQ ID NO: 4:
(i) Sequenzkennzeichen
(E) Länge: 30
(F) Art: Nukleinsäure
(G) Strangart: Einzelstrang
(H) Topologie: linear
(ii) Molekülart: andere....synthetische DNS (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 4
(2) Informationen zu SEO ID NO: 5:
(i) Sequenzkennzeichen
(I) Länge: 30
(J) Art: Nukleinsäure
(K) Strangart: Einzelstrang
(L) Topologie: linear
(iii) Molekülart: andere....synthetische DNS (xii) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 5
(2) Informationen zu SEQ ID NO: 6:
(i) Sequenzkennzeichen
(A) Länge: 30
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangart: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(iv) Molekülart: andere....synthetische DNS (xiii) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 6

Claims

1. Verfahren zum Analysieren biologisch aktiver Substanzen, das folgende Schritte umfasst:

Reaktion einer biologisch aktiven ersten Substanz, die auf einem Träger immobilisiert ist, mit einer zweiten Substanz, die spezifisch an die erste Substanz binden kann; und

Nachweisen eines nicht gebundenen Anteils der zweiten Substanz oder eines gebundenen Anteils der zweiten Substanz, die bei der Bindung zwischen der ersten und der zweiten Substanz indirekt an den Träger gebunden wurde, so dass die erste Substanz oder die zweite Substanz in einer Probe analysiert wird;

wobei der besagte Träger eine Verbindung mit 2 bis 100 Carbodiimidgruppen umfasst, und die besagte erste Substanz auf dem Träger über die Carbodiimidgruppen immobilisiert ist, und wobei die besagte erste Substanz nicht biotinylierte DNS, ein Streptavidin-alkalinphosphatasekonjugat, ein ACTH- Peptidoligomer oder λ-Hind-III-abbauende DNS-Molmassen-Marker ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die mit einer Markersubstanz markierte zweite Substanz darüber hinaus zum Reaktionssystem gegeben wird, wenn die erste Substanz mit der zweiten Substanz reagiert hat.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem eine dritte Substanz, die spezifisch an die zweite Substanz binden kann, nachdem die erste Substanz mit der zweiten Substanz reagiert hat, zur Reaktion gebracht wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die besagte dritte Substanz mit einer Markersubstanz markiert ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die besagte erste Substanz eine erste Nukleinsäure ist, und die besagte zweite Substanz eine zweite Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz ist, die im Wesentlichen komplementär zu einer Nukleotidsequenz der ersten Nukleinsäure ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die besagte erste Substanz ein erstes Protein, Peptid oder eine andere antikörperbindende Substanz ist, und die besagte zweite Substanz ein zweites Protein, Peptid oder eine andere antikörperbindende Substanz ist, die spezifisch an das erste Protein, Peptid oder die andere antikörperbindende Substanz bindet, wobei die besagte erste Substanz nicht biotinylierte DNS, ein Streptavidin-alkalinphosphatasekonjugat, ein ACTH-Peptidoligomer oder λ-Hind-III-abbauende DNS-Molmassen-Marker ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der besagte Träger emulsionsbildend ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die besagte Verbindung, die Carbodiimidgruppen hat, eine Molmasse von nicht unter 1000 und nicht über 100 000 hat.

9. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die besagte Markersubstanz aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus radioaktiven Substanzen, fluoreszierenden Substanzen, Enzymen, Farbstoffen, chemisch lumineszierenden Substanzen, Biotin, Avidin, Streptoavidin und Digoxigenin besteht.

10. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem die besagte Markersubstanz aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus radioaktiven Substanzen, fluoreszierenden Substanzen, Enzymen, Farbstoffen, chemisch lumineszierenden Substanzen, Biotin, Avidin, Streptoavidin und Digoxigenin besteht.