JP2000146971A - 生物学的活性物質の固定化用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質、核酸などの活性物質を、簡便、
効率的にかつ強固に担体に結合させる。 【解決手段】 表面にイソシアネート基を有する基材を
生物学的に活性な物質を固定するための担体とし、この
担体を、担体に固定化された生物学的に活性な第１の物
質と、この第１の物質に特異的に結合し得る第２の物質
とを反応させ、前記第１の物質と第２の物質との結合を
介して担体に間接的に結合した第２の物質又は結合しな
い第２の物質を検出することにより、試料中の第１の物
質又は第２の物質を分析する方法に用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸、抗体、抗原
など生物学的に活性な物質を固定するための担体及びそ
の製造方法並びにこれを用いた生物学的に活性な物質の
固定化方法及び分析方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査、食品検査、法医学検査などの
分野において、検体中に存在する核酸、抗体、抗原など
生物学的に活性な物質を検出、同定する方法として、目
的物質に応じて核酸プローブ法、酵素免疫測定法などが
用いられている。

【０００３】核酸を検出する分野としては、病原微生物
などの菌種同定、法医学におけるＤＮＡ鑑定などがあ
る。核酸の検出においては、通常、標的となる核酸と相
補的な配列を有する核酸を用い、このものを酵素などで
直接、またはハプテンなどを介して間接的に標識する。
この標識核酸と標的となる核酸をハイブリダイズさせ
る。ハイブリダイズしなかった標識核酸を除くかまたは
標識部分を不活性化したのちに、標識部分を検出する事
により標的核酸の存在及び量を確認できる。

【０００４】また、抗原、抗体などを検出する分野とし
ては、核酸と同様に病原微生物などの菌種同定の他、種
々の臨床検査などがある。抗原、抗体の検出に用いられ
る酵素免疫測定法の１態様である競合的酵素免疫測定法
は、次のようにして行われる。ポリスチレンビーズ、マ
イクロタイタープレート、チューブなどの固相表面に抗
体または抗原を固定化し、固相表面に一定量の検体溶液
を添加した後、抗原酵素複合体または抗体酵素複合体を
加える。固相表面に抗体を固定化した場合には、検体中
の抗原と抗原酵素複合体とが固相表面に固定化された抗
体との結合反応において競合し、固相表面に抗原を固定
化した場合には、検体中の抗原と固相表面に固定化され
た抗原とが抗体酵素複合体と結合反応で競合させる。

【０００５】一定時間経過後に、抗体を固定化した場合
には、固定化抗体に結合していない抗原および抗原酵素
複合体を洗浄し除去する。また、抗原を固定化した場合
には、未反応の検体中の抗原、抗体酵素複合体および検
体中の抗原と抗体−酵素複合体との結合物を洗浄し除去
する。このときの洗浄は、洗浄液を固相部に満たしたの
ち、洗浄液を捨て、再び固相部に洗浄液を満たして捨て
るという洗浄操作を通常数回から十回程度繰り返す。こ
の操作を一般にＢ／Ｆ分離と呼び、酵素免疫測定法を原
理とする検査では必須の操作である。

【０００６】最後に、抗原又は抗体の標識に用いた酵素
に対する発色基質液を固相部に加えて、残存する酵素に
より発色させる。このとき用いる酵素はペルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ
などが一般的である。発色に用いる基質はそれぞれの酵
素に適したものを用いる。検体液中に標的となる抗原が
多く存在すれば残存する抗原酵素複合体あるいは抗体酵
素複合体の量が減り、結果として発色強度が弱くなる。
発色強度は一般的に比色計を用いて測定する。

【０００７】また、酵素免疫測定法の他の態様であるサ
ンドイッチ酵素免疫測定法では、抗体を固相表面に固定
化し、固相表面に検体液を加える。一定時間経過後、固
相表面の抗体に結合していない抗原を洗浄し除去する。
次いで抗体酵素複合体を一定量加える。一定時間経過
後、固相表面の抗原に結合していない抗体酵素複合体を
洗浄除去したのち、固相表面に発色基質を加えて発色さ
せる。この発色強度を測定することにより、検体液中の
抗原濃度を定量することが可能になる。

【０００８】上述のように従来の核酸の検出法、競合的
酵素免疫法、サンドイッチ酵素免疫法などにおいては、
チューブ、マイクロタイタープレート、メンブランフィ
ルター、ビーズなどの固相表面に抗体、抗原、酵素、核
酸などを固定化することが非常に重要である。そのた
め、生物学的活性物質を固定化する種々の方法が公表さ
れている。たとえば、タンパク質では、 ジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試薬によ
る基材結合法やＵｇｉ反応による基材結合法などのよう
な、タンパク質を架橋剤や縮合剤等を用いて基材に化学
結合させる方法（「固定化酵素」［千畑一郎 編、講談
社サイエンティフィク（１９８６）］第９−４１ページ
参照）、 イオン結合により基材に固定する方法（「固定化酵
素」第４１−４３ページ参照）、 物理吸着により基材に固定する方法（「固定化酵素」
第４３−４５ページ参照）、 などが知られている。

【０００９】また核酸では、 ５’末端にチオール基を有する核酸とチオール基を含
むビーズ状基材間のジスルフィド結合による固定（P.J.
R.Day, P.S.Flora, J.E.Fox, M.R.Walker, Biochm. J.,
278, 735-740 (1991)参照）などのような修飾基を導入
した核酸を化学結合させる方法（尚、この範疇に属する
他の方法については、Soren R.R., Mette R.L., Svend
E.R., Anal. Biochm., 198, 138-142 (1991), Jonathan
N.K., Joseph L.W., Joseph P.D., Rachel E.M., Mary
C., Eugene L.B., Nucleic Acids Res..15, 2891-2909
(1987), Allan J.M., Jeffrey R.B., Terence W.P., B
iochem. J., 191, 855-858 (1980), J.A.Running, M.S.
Urdea, BioTechniques, 8,276-279 (1990)などに記載さ
れている。）、 核酸を、ＵＶ照射あるいは加熱処理によりニトロセル
ロースまたはナイロン膜上に吸着固定（J.Sambrok, E.
F.Fritsch and T.Maniatis, Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory Pres, Second Edition, pag
e 2.109-2.113 and page 9.34-9.46）したり、マイクロ
プレート上に物理吸着させ固定（G.C.N.Parry and A.D.
B.Malcolm, Biochm. Soc. Trans., 17, 230-231 (198
9)）するなどの物理吸着で固定する方法、 ポリカルボジイミドコート基材を用いて固定化する方
法（特開平８−２３９７５号公報、特開平８−３３４５
０９号公報）、 などが知られている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ような従来方法には難点のあることが指摘されていた。
例えば、化学結合による方法では、特殊試薬が必要なば
かりか、例えばペプチド結合を介して固定化しようとす
る場合は、活性物質あるいは基材のどちらか一方にアミ
ノ基を、残る片方にはカルボキシル基を導入する必要が
あり、さらに、導入された官能基同士を縮合試薬で処理
して固定化する工程を経なければならないというよう
に、操作が複雑となることを避けられない。

【００１１】また化学結合では、例えばグルタルアルデ
ヒドを架橋剤として使用するには、基材と活性物質の双
方にアミノ基が存在せねばならないというように、基材
自体に官能基が必要なために基材の選択が必要となる結
果、固定に適した基材の選択が困難になり、加えて、た
とえば天然のＤＮＡや修飾基を持たない合成ＤＮＡなど
の反応性の乏しい官能基（末端リン酸基、末端ヒドロキ
シル基等）しか有しないものについては化学反応による
方法を用いることが困難であるというように、活性物質
に活性官能基が無い場合は固定できないという難点があ
る。

【００１２】一方、物理吸着には、基材の吸着性能に固
定化量が左右されたり、吸着した活性物質が脱離しやす
く、活性物質が低分子（オリゴマー）の場合、基材との
相互作用が弱いため、吸着しにくいという難点がある。

【００１３】また、基材表面をポリカルボジイミドで被
覆する方法では、使用条件によっては、基材とポリカル
ボジイミドとの熱膨張率の相違や摩擦などによる皮膜の
剥がれがおき、これが固定量の低下や、検出結果のバラ
ツキの原因となった。

【００１４】以上のようにタンパク質、核酸などの活性
物質の検出において重要な固定化には多くの問題点を残
している。本発明は、簡便、効率的にかつ強固に生物学
的に活性な物質を固定できる担体および、それを用いて
生物学的に活性な化合物を検出する方法を提供するため
になされたものである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を続けた結果、表面にイソシ
アネート基を有する溶剤不溶性の基材を担体として、そ
の表面にイソシアネート基を介して生物学的に活性な物
質を固定させれば、担体の形状に関わらず簡便かつ効率
的に活性物質を固定化することができ、さらに、この様
な担体を用いれば、担体に固定した活性物質を利用する
種々の生物学的に重要な物質の検出が高感度かつ高精度
で行えることを見いだし本発明の完成に至った。

【００１６】すなわち本発明は、表面にイソシアネート
基を有する溶剤不溶性の基材からなる生物学的に活性な
物質を固定するための担体である。本発明の担体として
具体的には、溶剤不溶性の基材表面にイソシアネート基
を有する化合物が共有結合を介して担持された生物学的
活性物質の固定化用担体を挙げることができる。

【００１７】本発明の担体に用いる溶剤不溶性の基材の
材質として、具体的には、プラスチック、無機高分子、
金属、天然高分子およびセラミックから選ばれる１種ま
たは２種以上が挙げられる。

【００１８】また、本発明は２個以上のイソシアネート
基を有するまたは１個以上のイソシアネート基と１個以
上のイソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲン原
子を有する化合物を、表面にイソシアネート基と共有結
合可能なまたは前記イソシアネート基以外の官能基もし
くはハロゲン原子と共有結合可能な官能基を有する溶剤
不溶性の基材の官能基に、前記化合物の有するイソシア
ネート基の少なくとも１個を残して共有結合させる工程
を含む、表面にイソシアネート基を有する溶剤不溶性の
基材からなる生物学的に活性な物質を固定するための担
体の製造方法を提供する。

【００１９】さらに、本発明は表面にイソシアネート基
を有する溶剤不溶性の基材からなる生物学的に活性な物
質を固定するための担体に、イソシアネート基と反応性
を有する生物学的に活性な物質を接触させることを特徴
とする生物学的に活性な物質の固定化方法を提供する。

【００２０】本発明の固定化方法における生物学的に活
性な物質として具体的には、タンパク質、ペプチド、そ
の他の抗体結合性物質および核酸から選ばれる１種また
は２種以上が挙げられる。

【００２１】本発明はさらに、担体に固定化された生物
学的に活性な第１の物質と、この第１の物質に特異的に
結合し得る第２の物質とを反応させ、前記第１の物質と
第２の物質との結合を介して担体に間接的に結合した第
２の物質又は結合しない第２の物質を検出することによ
り、試料中の第１の物質又は第２の物質を分析する方法
において、前記担体として、表面にイソシアネート基を
有する溶剤不溶性の基材からなる生物学的に活性な物質
を固定するための担体を用い、前記第１の物質はイソシ
アネート基を介して担体に固定化されることを特徴とす
る、生物学的に活性な物質の分析法を提供する。

【００２２】本発明の分析法において、第１の物質、第
２の物質の組み合わせとして具体的には、第１の物質が
核酸であり、第２の物質がこの核酸の塩基配列に実質的
に相補的な塩基配列を有する核酸である組み合わせ、第
１の物質がタンパク質、ペプチドまたはその他の抗体結
合性物質であり、第２の物質がこれに特異的に結合し得
るタンパク質、ペプチドまたはその他の抗体結合性物質
である組み合わせ等が挙げられる。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。 ＜１＞担体およびその製造方法 本発明の担体は、生物学的に活性な物質を固定化するた
めの担体であり、表面にイソシアネート基を有する溶剤
不溶性の基材からなることを特徴とする。

【００２４】（１）基材 本発明の生物学的に活性な物質を固定化する担体に用い
られる基材は、前記担体の支持体としての役割を果たす
ものであって、溶剤不溶性である。詳細には、本発明に
用いる基材は、後述の様に表面にイソシアネート基が導
入され、ついで、担体として生物学的に活性な物質を固
定化し、さらに、活性物質を固定した状態で生理化学的
な生産、分析等に供されるが、これらの各過程で用いら
れる水性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性
である。本発明に用いる基材は、上記の様に溶剤不溶性
であって、基本的には、常温もしくはその付近の温度範
囲内（０〜１００℃）で固体又はゲル状であるものであ
れば特に制限されない。この様な担体基材の材質とし
て、具体的には、プラスチック、無機高分子、金属、天
然高分子、セラミック等が挙げられる。

【００２５】プラスチックとして具体的には、ポリエチ
レン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレ
ン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリ
カルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニ
リデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミドおよびアクリ
ル樹脂などが、無機高分子としては、ガラス、水晶、カ
ーボン、シリカゲル、およびグラファイト等が、金属と
しては、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、
パラマグネットおよびアパタイト等の常温固体金属が、
天然高分子としては、セルロース、セルロース誘導体、
キチン、キトサン、アルギン酸およびアルギン酸塩等
が、セラミックとしては、アルミナ、シリカ、炭化ケイ
素、窒化ケイ素および炭化ホウ素等などを例示すること
ができる。

【００２６】上記基材の形状としては、例えば、フィル
ム、平板、粒子、成型品（ビーズ、ストリップ、マルチ
ウェルプレートのウェルまたはストリップ、チューブ、
メッシュ、連続発砲フォーム、膜、紙、針、ファイバ
ー、プレート、スライドおよび細胞培養容器）、ラテッ
クスを挙げることができ、またその大きさについては、
当然であるが特に制限はない。

【００２７】（２）担体の製造 本発明の生物学的に活性な物質を固定化するための担体
は、上記溶剤不溶性の基材の表面にイソシアネート基を
有するものである。この様な本発明の担体を得るには、
例えば、担体とした際に生物学的に活性な物質を固定化
するためのイソシアネート基を上記基材表面に適当な手
段によって直接導入する方法や、イソシアネート基を有
する皮膜性の化合物を被覆等の手段によって上記基材表
面に担持させる方法、イソシアネート基を有する化合物
を上記基材表面に共有結合を介して担持させる方法等が
挙げられる。

【００２８】例えば、上記方法の内でも、イソシアネー
ト基を有する皮膜性の化合物を被覆等によって基材表面
に担持させる方法として、具体的には、イソシアネート
基を有する皮膜性の化合物を必要に応じて適当な溶媒に
溶解し、得られた溶液をスプレー、浸漬、ブラッシン
グ、スタンプ、蒸着、フィルムコーター等の方法によっ
て基材表面の一部または全体に塗布し、さらに必要に応
じて乾燥させることで、被覆を施す等の手段が挙げられ
る。また、この様にして基材表面に被覆が可能なイソシ
アネート基を有する化合物として、具体的には、末端に
イソシアネート基を有するポリカルボジイミド類や、例
えば、イソシアネートプロピルトリエトキシシラン等の
イソシアネート基を有するトリアルコキシシラン等が挙
げられる。

【００２９】また、基材表面に共有結合によりイソシア
ネート基を有する化合物を担持させる方法として、具体
的には、イソシアネート基とそれ以外に基材表面に共有
結合するための官能基を有する化合物を、表面に前記化
合物が有する官能基と共有結合可能な官能基を有する基
材の官能基に、適当な方法によって共有結合させる方法
等が挙げられる。この様にして得られる本発明の、共有
結合によりイソシアネート基を有する化合物が溶剤不溶
性の基材表面に担持されてなる担体は、イソシアネート
基を有する化合物が共有結合を介して強固に基材表面に
担持されているものであり、耐久性等に優れる担体であ
る。

【００３０】さらに、上記共有結合によりイソシアネー
ト基を有する化合物を基材表面に担持させる方法とし
て、より具体的には、以下に説明する本発明の製造方法
を挙げることができる。

【００３１】本発明の製造方法は、表面にイソシアネー
ト基を有する溶剤不溶性の基材からなる生物学的に活性
な物質を固定するための担体を製造する方法であって、
２個以上のイソシアネート基を有するまたは１個以上の
イソシアネート基と１個以上のイソシアネート基以外の
官能基もしくはハロゲン原子を有する化合物（以下、単
に「イソシアネート化合物」ということがある）を、表
面にイソシアネート基と共有結合可能なまたは前記イソ
シアネート基以外の官能基もしくはハロゲン原子と共有
結合可能な官能基を有する溶剤不溶性の基材の官能基
に、前記化合物の有するイソシアネート基の少なくとも
１個を残して共有結合させる工程を含むことを特徴とす
るものである。

【００３２】上記本発明の製造方法に用いるイソシアネ
ート化合物のうち、分子内に２個以上のイソシアネート
基を有する化合物として、具体的には、ヘキサメチレン
ジイソシアネート、トルエンジイソシアネート、テトラ
メチルキシレンジイソシアネート、ナフタレンジイソシ
アネート等が挙げられる。

【００３３】また、分子内に１個以上のイソシアネート
基と１個以上のイソシアネート基以外の官能基あるいは
ハロゲン原子を有する化合物のイソシアネート基以外の
官能基として、具体的には、水酸基、アミノ基、イミノ
基、カルボキシル基等の官能基が挙げられ、この様なイ
ソシアネート化合物として、具体的には、イソシアン酸
クロロメチルエステル、イソシアン酸クロロエチルエス
テル等が挙げられる。

【００３４】本発明の製造方法に用いる、表面にイソシ
アネート基と共有結合可能なまたは上記化合物の有する
イソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲン原子と
共有結合可能な官能基を有する溶剤不溶性の基材として
は、例えば、上記＜１＞（１）で説明した基材表面に前
記共有結合可能な官能基を導入した溶剤不溶性の基材が
挙げられる。導入される官能基としては、イソシアネー
ト基と共有結合可能な官能基または上記化合物が有する
イソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲン原子と
共有結合可能な官能基であれば特に制限されないが、具
体的には、水酸基、イミノ基、アミノ基、カルボキシル
基等が挙げられる。これら官能基は、上記イソシアネー
ト化合物の有する官能基に応じて適宜選択され、基材表
面に導入される。

【００３５】また、溶剤不溶性基材表面にこの様な官能
基を導入する方法については、基材の材質や導入する官
能基によって適当な方法が適宜選択される。さらに、官
能基を導入するのは、基材表面の全体であってもよい
し、一部であってもよい。

【００３６】例えば、ガラス基材の表面全体にアミノ基
を導入するには、３−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン等のアミノ置換オルガノアルコキシシランを適当な溶
媒に溶解して得られた溶液に７０〜８０℃程度の温度条
件下でガラス基材を概ね２〜３時間浸漬した後、これを
取り出して溶液を水洗しさらに、１００〜１２０℃程度
で約４〜５時間加熱乾燥すればよい。

【００３７】また、ガラス基材にアミノ基以外の官能基
を導入する場合や、基材がガラス以外の材料からなる場
合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に
種々の官能基を導入することは、従来より一般に行われ
ていることであり、その方法も公知であるので、この様
な公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を行う
ことができる。

【００３８】さらに、上記＜１＞（１）で挙げた基材の
うちでもプラスチック基材のなかには、基材表面に既に
上記のような官能基を有するものもあり、この場合には
基材表面に官能基を導入することなしに、これをそのま
ま本発明の製造方法に用いることが可能である。また、
この様なプラスチック基材であってもさらに官能基を導
入して本発明に用いることも可能である。

【００３９】本発明の製造方法においては、上記の様に
して得られる２個以上のイソシアネート基を有するまた
は１個以上のイソシアネート基と１個以上のイソシアネ
ート基以外の官能基もしくはハロゲン原子を有する化合
物と、表面にイソシアネート基と共有結合可能なまたは
前記イソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲン原
子と共有結合可能な官能基を有する溶剤不溶性の基材を
適当な条件下で反応させ、前記基材表面の官能基に前記
化合物を前記化合物の有するイソシアネート基の少なく
とも１個を残して共有結合させる。つまり、前記化合物
が１個以上のイソシアネート基と１個以上のイソシアネ
ート基以外の官能基もしくはハロゲン原子を有する化合
物である場合には、イソシアネート基以外の官能基もし
くはハロゲン原子が共有結合に供する様な反応条件で反
応を行えばよい。また、官能基としてイソシアネート基
のみを有する化合物を用いる場合には、イソシアネート
基の全てが共有結合に供されることのないような条件で
反応を行えばよい。

【００４０】このようにして得られる本発明の表面にイ
ソシアネート基を有する溶剤不溶性の基材からなる生物
学的に活性な物質を固定化するための担体は、イソシア
ネート基の反応性を利用して、様々な活性物質を固定す
ることができるものである。また、イソシアネート基の
反応性を示す例としては、下記（Ｉ）に示す水酸基との
反応、下記（II）に示すアミノ基との反応等が挙げられ
る。

【００４１】

【化１】 ＜２＞生物学的に活性な物質およびその担体への固定化 （１）生物学的に活性な物質 本発明の担体に固定化する生物学的に活性な物質として
は、イソシアネート基と共有結合可能な官能基を有する
ものであれば特に制限されないが、例えば、タンパク
質、ペプチド若しくはその他の抗体結合性物質、核酸な
どの生体高分子等を挙げることができる。

【００４２】具体的には、タンパク質、ペプチドとして
は、インシュリン、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモ
ン）、オキシトシン等のタンパク質ホルモンもしくはペ
プチドホルモン、コリンエステラーゼ、アミラーゼ、ペ
プシン等の酵素又はその前駆体、ＨＢｓ抗原、ＨＩＶ抗
原等のタンパク質抗原、プロテインＡのような抗体結合
性タンパク質などが、抗体結合性物質としては低分子量
のハプテンが、核酸としては天然又は合成のＤＮＡ（オ
リゴヌクレオチドを含む）もしくはＲＮＡ（オリゴヌク
レオチドを含む）が挙げられる。

【００４３】さらに、本発明に用いられる生物学的に活
性な物質として具体的には、次のような化合物も例示可
能である。抗菌性を有する生理活性物質、例えばペニシ
リン、アンピシリン、セファロスポリン、カナマイシ
ン、ストレプトマイシン、フラジオマイシン、デストマ
イシン、カスガマイシン、タイロシン、エリスロマイシ
ン、オレアンドマイシン、スピラマイシン、リンコマイ
シン、コリスチン、バシトラシン、サリノマイシン、モ
ネンシン、ラサロシド、テトラサイクリンおよびその類
縁物質、クロラムフェニコール、バージニアマイシンな
ど。合成抗菌剤としてはサルファ剤、オキソリン酸、ピ
ロミド酸、フラゾリドン、ジフラゾンなどが挙げられ、
天然毒素全般としてはアフラトキシン、Ｔ２トキシン、
ゼアラレノン、デオキシニバレノール、パツリン、フモ
ニシン、ＨＴ−２、オクラトキシン、テトロドトキシ
ン、オカダ酸、サキシトシン、ゴニオトキシン、ボツリ
ヌス毒素などが挙げられ、合成化学品としては農薬全
般、例えばダイオキシン、２，４−Ｄ、ベミノル、アル
ディカルブ、カルボフラン、メソミル、ＤＤＶＰ、マラ
ソン、パラコート、ダイアジノン、フェニトロチオン、
エンドリン、アルドリン、ヘプタクロルなどが挙げられ
る。また、生体化学物質全般としてはヘモグロビン、α
−フェトプロテイン、免疫グロブリン、アルブミン、ア
ンチトロンビン、トロンビン、プラスミノーゲン、フェ
リチン、チログロブリン、ゼラチン、コレステロール、
テストステロン、コルチコステロン、プロゲステロン、
エルゴステロール、エストラジオール、チトクロムＣ、
アドレナリン、各種ビタミン等が挙げられる。

【００４４】また、上記タンパク質、ペプチド、その他
の生物学的に活性な物質に結合し得る抗体が挙げられ
る。該抗体は、例えば上述の物質又は免疫用担体との結
合物を、免疫動物例えばラット、モルモット、ウサギ、
マウス、ヤギ、ヒツジ、馬、牛などの哺乳類に免疫して
得るか、マウスに免疫後そのリンパ球とマウスミエロー
マ細胞とのハイブリドーマが生産するモノクローナル抗
体として得られる。

【００４５】（２）担体への固定化 上記本発明の表面にイソシアネート基を有する溶剤不溶
性の基材からなる生物学的に活性な物質を固定するため
の担体に、上記生物学的に活性な物質を固定するには、
前記担体のイソシアネート基と生物学的に活性な物質が
反応する様な適当な条件下で、前記担体と生物学的活性
物質とを接触させればよい。具体的には、両者の接触
は、固定される生物学的活性物質の活性が維持されるよ
うに、通常は水またはバッファー中で行うことが好まし
く、また、接触の際の温度としてはやはり固定される生
物学的活性物質の活性が損なわれないように、概ね０〜
１００℃とすることが好ましい。さらに、固定される生
物学的活性物質の種類等により最適な条件が適宜選択可
能である。

【００４６】この様にして得られる固定化生物学的活性
物質は、前記生物学的活性物質が担体に非常に強固に担
持されたものであり、イムノアッセイの分野で広く使用
されている洗浄法（界面活性剤を用いた洗浄法）によっ
ても脱離することがなく、固定化酵素の生理化学工業的
利用、抗体あるいは抗原固定担体の免疫学的利用、核酸
固定担体の診断薬としての利用等の広い利用分野を有し
ている。

【００４７】（３）生物学的に活性な物質の分析法 本発明の担体は、具体的には、以下の分析法に用いるこ
とにより効果を発揮することができる。

【００４８】すなわち、本発明の表面にイソシアネート
基を有する溶剤不溶性の基材からなる生物学的に活性な
物質を固定するための担体は、担体に固定化された生物
学的に活性な第１の物質と、この第１の物質に特異的に
結合し得る第２の物質とを反応させ、前記第１の物質と
第２の物質との結合を介して担体に間接的に結合した第
２の物質又は結合しない第２の物質を検出することによ
り、試料中の第１の物質又は第２の物質を分析する方法
に、前記担体として用いることが可能である。この際、
前記第１の物質はイソシアネート基を介して担体に固定
化されるものである。

【００４９】上記生物学的に活性な第１の物質として
は、上記＜２＞（１）で説明した生物学的に活性な物質
と全く同じものを挙げることができる。一方、生物学的
に活性な第２の物質は、上記のような第１の物質と同様
のタンパク質、ペプチド、抗原性物質、核酸、その他の
生理活性物質であって、第１の物質に特異的に結合する
ものである。すなわち、例えば、第１の物質と第２の物
質の一方がタンパク質、核酸又はその他の生理活性物質
である場合には、他方はそれに対する抗体であり、一方
の物質が核酸である場合には、他方はその核酸の塩基配
列に実質的に相補的な塩基配列を有する核酸である。こ
こで実質的に相補的とは、１又は２以上のミスマッチが
あっても、各々の核酸が水素結合によってハイブリダイ
ズし、２本鎖を形成することができることをいう。

【００５０】尚、分析対象は、第１の物質であっても、
第２の物質であってもよい。本発明による生物学的に活
性な物質の分析法は、上記のようなた生物学的に活性な
第１の物質を前記担体に結合させ、これと第２の物質と
を反応させ、第１の物質と第２の物質との結合を介して
担体に間接的に結合した第２の物質又は結合しない第２
の物質を検出することにより、行われる。

【００５１】第１の物質を担体に固定するには、担体と
活性物質とを接触させれば良く、担体が基材表面に有す
るイソシアネート基と、第１の物質が有する水酸基、ア
ミノ基、チオール基、カルボキシル基等との反応によ
り、第１の物質はイソシアネート化合物と共有結合す
る。その結果、第１の物質は担体に固定化される。

【００５２】第１の物質と担体との接触は、上記＜２＞
（２）で説明したのと同様であり、第１の物質の生物学
的活性が維持されるように、水あるいはバッファー中で
行うことが好ましく、また、接触の際の温度としては、
やはり活性物質の活性が損なわれないように、０〜１０
０℃とすることが好ましい。

【００５３】尚、担体へ第２の物質等が非特異的に結合
することを防ぐために、第１の物質を担体に固定化した
後に、過剰量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイ
ン、サケ***ＤＮＡ等を担体に接触させ、フリーのイソ
シアネート基をブロックしておくことが好ましい。

【００５４】担体に固定化された第１の物質と第２の物
質とを反応させた後、担体に結合した第２の物質を検出
するには、通常の固相のイムノアッセイ、核酸のハイブ
リダイゼーション法と同様に行えばよい。例えば、第１
の物質が測定対象である場合には、標識物質で標識して
おいた第２の物質を固定化された第１の物質と反応さ
せ、担体に固定化された標識物質を検出又は定量するこ
とにより、結合した第２の物質を検出又は定量すること
ができる。その結果、第１の物質を検出又は定量するこ
とができる。第１の物質に結合した第２の物質のかわり
に、結合しなかって第２の物質を検出、定量してもよ
い。

【００５５】また、第２の物質が測定対象である場合に
は、第１の物質と第２の物質とを反応させる際に、反応
系に標識物質で標識された第２の物質をさらに加え、第
１の物質に結合した標識された第２の物質の結合量によ
り、間接的に試料中の第２の物質の量を定量することが
できる（阻害法）。

【００５６】さらに、担体に結合した第２の物質の検出
は、第２の物質に特異的に結合し得る、第３の物質を反
応させることによっても行うことができる。例えば、第
２の物質が抗原であり、第１の物質がこの抗原に対する
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（第１抗
体）である場合、担体−抗体−抗原複合体に、ポリクロ
ーナル抗体又は前記モノクローナル抗体とエピトープが
異なる他のモノクローナル抗体（第２抗体）を反応さ
せ、担体−抗体−抗原−抗体複合体を形成させ、複合体
中の第３の物質を検出することにより、第２の物質を検
出することができる（サンドイッチ法）。このとき、第
３の物質が標識されている場合にはその標識を検出すれ
ばよく、標識されていない場合であっても、さらに第３
の物質に結合する物質を用い、これを標識しておいても
よい。例えば、上記の例では第１抗体と第２抗体とを別
の動物で調製し、第２抗体の調製に用いた動物のイムノ
グロブリンに対する抗体を第３の物質とする。また、核
酸の場合も同様に、担体に固定化した第１の核酸にこれ
に特異性を有する第２の核酸を結合させ、さらに第２の
核酸に特異性を有し第１の核酸に特異性を有しない第３
の核酸を結合させ、担体に結合した第３の核酸の量から
第２の核酸を定量することができる。

【００５７】また乳濁状の担体を用いて、一般的な凝集
法により、第２の物質を検出することもできる。標識物
質としては、放射性物質、蛍光物質、酵素、色素、化学
発光物質、ジゴキシゲニン等が挙げられる。放射性物
質、蛍光物質、色素で標識した場合には、標識はシンチ
レーションカウンターによる測定、フィルムへの露光あ
るいは肉眼観察により、直接検出することができる。酵
素を用いた場合には、酵素反応により発色または発光す
る基質色素を用い、その発色または発光を検出すればよ
い。このような酵素は、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチー
ムなど一般的に用いられるものでよい。

【００５８】また、必ずしも標識物質自体が検出するこ
とができないものであってもよい。例えば標識物質とし
てビオチンを用いた場合には、これに特異的に結合する
アビジン又はストレプトアビジンを結合させた酵素等を
用いることにより、間接的に検出することができる。

【００５９】第１の物質と第２の物質、さらに必要に応
じて第３の物質又はその他の物質を反応させた後に未反
応の物質を除去、すなわちＢ／Ｆ分離するには、通常の
固相イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション法と同様
に行えばよい。すなわち、担体が容器状である場合に
は、担体に洗浄液を満たしたのち、洗浄液を捨てるとい
う操作を度繰り返す。担体が粒子である場合には、洗浄
液に担体を懸濁する操作を繰り返せばよい。

【００６０】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。

【００６１】

【実施例１】 イソシアネート化スライドガラスに固定
したＤＮＡの標識ＤＮＡによる検出 （１）アミノ化スライドガラスの作製 蒸留水１８０ｍｌに１０％（ｖ／ｖ）３−アミノプロピ
ルトリエトキシシラン／エタノール溶液２０ｍｌを加え
よく撹拌した。そこに６ＮのＨＣｌを加えｐＨ３〜４に
調整した後、スライドガラス１５枚を浸漬し、７５℃で
２時間加熱処理した。加熱処理終了後、スライドガラス
を溶液から引き上げ、蒸留水でよく洗い流した後、１１
５℃で４時間加熱乾燥しアミノ化スライドガラスを得
た。

【００６２】（２）イソシアネート化スライドガラスの
作製 ヘキサメチレンジイソシアネートの２．５％クロロホル
ム溶液に上記で得られたアミノ化スライドガラス１５枚
を浸漬し、すぐに引き上げた。次いで、クロロホルム２
００ｍｌによる１０分間の洗浄を２回行った後、４０℃
で２時間乾燥してイソシアネート化スライドガラスを得
た。

【００６３】（３）イソシアネート化スライドガラス上
へのＤＮＡオリゴマーの固定 ＤＮＡ合成機によりキャプチャーオリゴヌクレオチド及
びビオチン化オリゴヌクレオチドを合成した。プローブ
は、ＤＮＡオリゴマー合成の際にビオチンフォスフォル
アミダイトを用いて、ビオチンを５’末端に導入した。

【００６４】上記で得られたイソシアネート化スライド
ガラス上にキャプチャー水溶液の希釈系列（１ｐｍｏｌ
／μｌ、１００ｆｍｏｌ／μｌ、１０ｆｍｏｌ／μｌ、
１ｆｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌドットし３７℃の
インキュベーターで１５分間固定化した後、水で洗浄し
乾燥した。

【００６５】一方、コントロールとして上記プローブと
全く相補性を示さないオリゴマーも同様に固定化した。 （４）ハイブリダイゼーション キャプチャーオリゴヌクレオチド又はコントロールＤＮ
Ａオリゴマーを固定化したイソシアネート化スライドガ
ラスにプレハイブリダイゼーション溶液５０μｌをふり
かけ、パラフィルムで覆って、４２℃のインキュベータ
ーに入れ３０分間加温した。プレハイブリダイゼーショ
ン溶液の組成は、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，
０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５×Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．０２％ フィコー
ル，０．０２％ ＢＳＡフラクションＶ，０．０２％
ポリビニルピロリドン）、２５ｍＭ リン酸ナトリウム
（ｐＨ６．６）、５０％フォルムアミド、０．５ｍｇ／
ｍｌ変性サケ***ＤＮＡである。

【００６６】次にパラフィルムを取り除き、プレハイブ
リダイゼーション溶液を軽く吸い取った後、プローブを
加えたハイブリダイゼーション溶液５０μｌをふりか
け、パラフィルムで覆って、４２℃のインキュベーター
に入れ一晩加温した。ハイブリダイゼーション溶液の組
成は、１ｐｍｏｌプローブ、５×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２５ｍＭリン酸ナト
リウム（ｐＨ６．６）、４５％フォルムアミド、０．２
ｍｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡ、１０％デキストラン硫
酸である。

【００６７】ハイブリダイゼーション後に、パラフィル
ムを取り除き、ハイブリダイゼーション溶液を軽く吸い
取った後、以下の３段階の条件でポストハイブリダイゼ
ーション洗浄を行い非特異的に吸着したプローブを除去
した。

【００６８】＜ポストハイブリダイゼーション洗浄条件
＞ 第１段階：２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ；室温、５分間、２
回 第２段階：０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ；４２℃、５分
間、２回 第３段階：２×ＳＳＣ；室温、５分間、１回 （５）検出 ３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、
０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．０５％トライ
トンＸ−１００）５０ｍｌに、上記ポストハイブリダイ
ゼーション洗浄後のスライドガラスを浸漬し、室温で３
０分間ブロッキングを行なった。次に、これらをストレ
プトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート
溶液（緩衝液Ａで原液を５０００倍希釈したもの）５０
ｍｌに浸漬し、室温で３０分間反応させた。次いで、緩
衝液Ａ５０ｍｌに浸漬し、室温で５分間放置した。これ
を２回繰り返し、ビオチンと結合しなかったコンジュゲ
ートを除去した。

【００６９】次に、緩衝液Ｂ（０．１Ｍ塩化ナトリウム
／０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ９．５／５０ｍｌ塩化マグ
ネシウム）５０ｍｌで１回置換した。最後に、基質溶液
（緩衝液Ｂの５０ｍｌ＋ＢＣＩＰ溶液（５０ｍｇ５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／９０
０ｍｌジメチルホルムアミド）１７．５μｌ＋ＮＢＴ液
（５０ｍｇニトロブルーテトラゾリウム／１．８ｍｌ７
０％エタノール）３５μｌ）に浸漬し、室温で３時間放
置し、発色反応を行った結果、相補的な配列を持つキャ
プチャーのみにおいて１ｐｍｏｌ／μｌ〜１０ｆｍｏｌ
／μｌまでの濃度でシグナルが得られた。

【００７０】

【実施例２】上記実施例１においてイソシアネート化ス
ライドガラスを作製する際にヘキサメチレンジイソシア
ネートの代わりにトルエンジイソシアネートを用いたこ
とを除いては、上記実施例１と全く同様の操作を行っ
た。結果は、実施例１と同様、相補的な配列を持つキャ
プチャーのみにおいて１ｐｍｏｌ／μｌ〜１０ｆｍｏｌ
／μｌまでの濃度でシグナルが得られた。

【００７１】

【実施例３】上記実施例１においてイソシアネート化ス
ライドガラスを作製する際にヘキサメチレンジイソシア
ネートの代わりにテトラメチルキシレンジイソシアネー
トを用いたことを除いては、上記実施例１と全く同様の
操作を行った。結果は、実施例１と同様、相補的な配列
を持つキャプチャーのみにおいて１ｐｍｏｌ／μｌ〜１
０ｆｍｏｌ／μｌまでの濃度でシグナルが得られた。

【００７２】

【実施例４】上記実施例１においてイソシアネート化ス
ライドガラスを作製する際にヘキサメチレンジイソシア
ネートの代わりにナフタレンジイソシアネートを用いた
ことを除いては、上記実施例１と全く同様の操作を行っ
た。結果は、実施例１と同様、相補的な配列を持つキャ
プチャーのみにおいて１ｐｍｏｌ／μｌ〜１０ｆｍｏｌ
／μｌまでの濃度でシグナルが得られた。

【００７３】

【比較例】 カルボジイミド化スライドガラスに固定し
たＤＮＡの標識ＤＮＡによる検出 （１）カルボジイミド化スライドガラスの作製 ４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１
１７．９ｇとシクロヘキシルイソシアネート１２．５ｇ
をカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニル−
２−ホスホレン−１−オキシド）１．３ｇと共に窒素雰
囲気下、１８０℃で４日間反応させ、室温で粉末状のカ
ルボジイミド化合物（重合度１０、数平均分子量２４０
０）を得た。これを１０ｇ取りジクロロメタン２００ｍ
ｌに溶解させ、カルボジイミド化合物溶液を得た。

【００７４】このカルボジイミド化合物溶液２００ｍｌ
に上記実施例１の（１）と同様の方法で得られたアミノ
化スライドガラス１５枚を浸漬し、すぐに引き上げて、
６０℃で１時間加熱乾燥した。加熱乾燥後、ジクロロメ
タン２００ｍｌで１０分間の洗浄を２回行った後、４０
℃で２時間乾燥してカルボジイミド化スライドガラスを
得た。

【００７５】なお、この方法で得られるカルボジイミド
化ガラスは、生物学的に活性な物質を固定するための担
体として本発明者らが発明したものであり、これを用い
れば前記物質の固定が効率的かつ強固に行えることが本
発明者らにより確認されている。

【００７６】（２）カルボジイミド化スライドガラス上
へのＤＮＡの固定とその検出 次いで、上記実施例１の（３）以降の操作においてイソ
シアネート化スライドガラスの代わりに上記で得られた
カルボジイミド化スライドガラスを用いた以外は、上記
実施例１の（３）以降と全く同様の操作を行った。結果
は、相補的な配列を持つキャプチャーのみにおいて１ｐ
ｍｏｌ／μｌ〜１００ｆｍｏｌ／μｌまでの濃度でシグ
ナルが得られた。

【００７７】これらの結果から、本発明の生物学的に活
性な物質を固定化するための担体は、カルボジイミド化
スライドガラスと同等かそれ以上に、生物学的に活性な
物質を効率よく固定化することが可能であり、また、こ
れを用いて生物学的に活性な物質の検出を行えば感度の
よい検出が行えることがわかる。

【００７８】

【発明の効果】本発明により、タンパク質、核酸などの
活性物質の検出において重要な担体への固定化を、簡
便、効率的にかつ強固に行うことができる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/545 33/547 33/547 33/551 33/551 33/553 33/553 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 松村 嘉之 東京都足立区西新井栄町１−18−１日清紡 績株式会社東京研究センター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA01 BA07 BA31 BA80 HA14 HA15 4B033 NA22 NA43 NA45 NB04 NB27 NB33 NB43 NB63 NC03 NC12 ND05 4B063 QA01 QQ42 QR13 QR32 QR55 QR56 QR58 QR84 QS34 4H045 AA20 AA30 BA60 DA75 DA86 EA50 FA44 FA81

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面にイソシアネート基を有する溶剤不
   溶性の基材からなる生物学的に活性な物質を固定するた
   めの担体。
2. 【請求項２】 溶剤不溶性の基材表面にイソシアネート
   基を有する化合物が共有結合を介して担持されたことを
   特徴とする請求項１記載の担体。
3. 【請求項３】 前記基材の材質がプラスチック、無機高
   分子、金属、天然高分子およびセラミックから選ばれる
   ことを特徴とする請求項１または２記載の担体。
4. 【請求項４】 ２個以上のイソシアネート基を有するま
   たは１個以上のイソシアネート基と１個以上のイソシア
   ネート基以外の官能基もしくはハロゲン原子を有する化
   合物を、表面にイソシアネート基と共有結合可能なまた
   は前記イソシアネート基以外の官能基もしくはハロゲン
   原子と共有結合可能な官能基を有する溶剤不溶性の基材
   の官能基に、前記化合物の有するイソシアネート基の少
   なくとも１個を残して共有結合させる工程を含む、表面
   にイソシアネート基を有する溶剤不溶性の基材からなる
   生物学的に活性な物質を固定するための担体の製造方
   法。
5. 【請求項５】 表面にイソシアネート基を有する溶剤不
   溶性の基材からなる生物学的に活性な物質を固定するた
   めの担体に、イソシアネート基と反応性を有する生物学
   的に活性な物質を接触させることを特徴とする生物学的
   に活性な物質の固定化方法。
6. 【請求項６】 生物学的に活性な物質がタンパク質、ペ
   プチド、その他の抗体結合性物質および核酸から選ばれ
   る請求項５記載の固定化方法。
7. 【請求項７】 担体に固定化された生物学的に活性な第
   １の物質と、この第１の物質に特異的に結合し得る第２
   の物質とを反応させ、前記第１の物質と第２の物質との
   結合を介して担体に間接的に結合した第２の物質又は結
   合しない第２の物質を検出することにより、試料中の第
   １の物質又は第２の物質を分析する方法において、 前記担体として、表面にイソシアネート基を有する溶剤
   不溶性の基材からなる生物学的に活性な物質を固定する
   ための担体を用い、前記第１の物質はイソシアネート基
   を介して担体に固定化されることを特徴とする、生物学
   的に活性な物質の分析法。
8. 【請求項８】 前記第１の物質は核酸であり、第２の物
   質はこの核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を
   有する核酸である請求項７記載の分析法。
9. 【請求項９】 前記第１の物質はタンパク質、ペプチド
   またはその他の抗体結合性物質であり、第２の物質はこ
   れに特異的に結合し得るタンパク質、ペプチドまたはそ
   の他の抗体結合性物質である請求項７記載の分析法。