DE69606882T2

DE69606882T2 - Verwendung von nadph-oxidase-inhibitoren zur herstellung eines arzneimittels zur vorbeugung der arteriosklerose

Info

Publication number: DE69606882T2
Application number: DE69606882T
Authority: DE
Inventors: James A. Holland; David K. Johnson
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1995-11-27
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 2000-08-17
Anticipated expiration: 2016-11-28
Also published as: WO1997019679A3; US5902831A; CA2238098C; EP0914821A3; CA2238098A1; AU1085997A; DE69606882D1; ES2144792T3; US5763496A; GR3033067T3; EP0861070A2; WO1997019679A2; EP0914821A2; ATE189957T1; EP0861070B1; JPH11507946A; JP2003176224A

Description

Beschreibung

Hintergrund der Erfindung

Die Atherosklerose mit den Folgeerscheinungen Herzanfall, Schlag und peripheren Gefäßerkrankungen stellt in den Vereinigten Staaten mit über 800000 Todesfällen pro Jahr die Haupttodesursache dar. Mit Ausnahme von Unfällen, Selbstmorden und Morden sind Atherosklerose-Krankheiten für nahezu 50% aller Todesfälle verantwortlich.
Epidemiologische Studien zeigen, daß die Betroffenen einen erhöhten "Low Density Lipoprotein" (LDL)-Spiegel im Blut aufweisen. LDL befördert Cholesterin von der Leber zu den Körpergeweben. Ein erhöhter Cholesterinspiegel (Hypercholesterinämie) geht gewöhnlich mit einem Anstieg des LDL-Spiegels einher. Hohe Cholesterinspiegel im Blut, insbesondere von LDL-Cholesterin, erhöhen das Risiko für koronare Herzerkrankungen (KHE), während eine Senkung des Gesamtcholesterin- und LDL-Cholesterinspiegels das KHE-Risko herabsetzt.
Viele pharmazeutische Mittel sind zur Behandlung und Vorbeugung von Atherosklerose und deren Komplikationen entwickelt worden, indem anomal hohe Blut-LDL-Spiegel bekämpft oder die Cholesterin-Spiegel gesenkt wurden. Unter den am meisten bekannten Mitteln dieser Art sind Nicotinsäure, Clofibrat, das Natriumsalz von Dextrothyroxin, Neomycin, β-Sitosterin, Probucol, Cholestyramin und HMG-CoA-Reductase-Inhibitoren, wie Lovastatin und Simvastatin. Die Zweckdienlichkeit dieser Mittel ist jedoch wegen des häufigen Auftretens akuter Nebenwirkungen begrenzt. Solche Nebenwirkungen können eine intensive Rötung der Haut, Juckreiz, Magen-Darm-Reizung, Leberschädlichkeit, Herzrhythmusstörungen, Übelkeit, Gewichtsverlust, Haarausfall, Impotenz, Bauchschmerzen, Durchfall, Eosinophilie, Hautausschlag, Schmerzen im Bewegungsapparat, verschwommenes Sehen, leichte Anämie, verminderter Leukocytengehalt, gesteigertes Auftreten von Gallensteinen, Verstopfung und Impaktion sein. Darüber hinaus besteht nur ein teilweiser Zusammenhang zwischen einer Senkung des Serumcholesterins und einem Rückgang der Atherosklerose. Nicht alle an Atherosklerose erkrankten Patienten weisen einen hohen Cholesterinspiegel auf und nicht alle Patienten mit hohem Cholesterinspiegel sind an Atherosklerose erkrankt.
Die Pathobiologie der Atherosklerose weist darauf hin, daß hauptsächlich das Gefäßendothelium darin verwicket ist. Eine Störung des Endotheliums ohne das offensichtliche Absterben oder den Verlust von Endothelzellen mit einer anschließenden Veränderung der Durchlässigkeit des Endothels für verschiedene Blutstoffe stellt ein wichtiges Kennzeichen bei der Entwicklung von atherosklerotioschen Wunden dar. Im Blut enthaltene Stoffe dringen dann durch dieses Endothelgewebe und häufen sich in der Intima der Arterienwand an. Selbst ein nur mäßiger Anstieg in der Durchlässigkeit des Endotheliums (Hyperpermeabilität) ist begleitet von einem signifikanten Anstieg im Vorkommen atherosklerotischer Ereignisse.
Ein Mechanismus, nach welchem Gefäß-Hyperpermeabilität in Gegenwart eines intakten Endothels in Erscheinung treten kann, ist eine gesteigerte Endothel-Endozytose infolge einer Störung des Endotheliums. Das Endothelium kann durch verschiedene Bedingungen gestört werden, einschließlich einem hohen Gehalt an "Low Density Liopoprotein" (LDL) im Blut und von Scherkräften, wie sie bei Bluthochdruck auftreten. Auch Diabetes mellitus und Rauchen können eine Störung des Endotheliums hervorrufen. Ich führte Untersuchungen durch, in denen Endothelzellen (EC) des Menschen über längere Zeiträume hohen LDL- Konzentrationen (bis zu 330 mg/dl Cholesterin) ausgesetzt wurden. Wie beispielsweise durch die Stabilität der Zellzählung gezeigt wurde, wiesen die Ergebnisse darauf hin, daß bei Menschen ein Absterben und ein Verlust an ECs während des Fortschreitens der endothelialen Plaquebildung durch LDL nicht auftrat.
Anfangs tritt eine Störung des Endotheliums auf, was dazu führt, daß eine Endocytose und LDL-Änhäufung im unter dem Endothel liegenden Raum auftritt. Somit wird eine erhöhte EC-Endocytose induziert, wenn die ECs hohen LDL-Spiegeln ausgesetzt werden. Die Untersuchungen zeigen, daß es für eine übertriebene Endocytose nötig ist, die ECs LDL in Konzentrationsbereichen auszusetzten, von denen man aus epidemiologischen Untersuchungen her glaubt, daß sie atherogen sind (z. B. Endothelzellen > 140 mg/dl LDL- Cholesterin ausgesetzt). Eine weiter Haupterkenntnis ist, daß, wenn sich erst einmal eine erhöhte Endocytose eingestellt hat, sie dies auch bleibt. Solch eine andauernde Veränderung im funktionellen Zustand von ECs stimmt mit dem Konzept einer Endothelstörung oder Gefäß-Hyperpermeabilität überein.
Die Endocytose stellt ein fundamentales, offensichtlich ubiquitäres Zellgeschehen dar. Während der Endocytose wird ein Segment der Plasmamembran nach innen gestülpt und bildet ein Vesikel, das ins Cytoplasma wandert. Dieses Vesikel kann sich am Materialtransport durch die Zelle über Transcytose beteiligen. Der einer Endocytose zugrundeliegende Regulationsmechanismus wird noch nicht vollständig verstanden, aber viele Untersuchungen weisen darauf hin, daß reaktive Sauerstoffspezies, wie z. B. H&sub2;O&sub2; und O&sub2;&supmin;, die erhöhte EC-Endocytose regulieren. Als Nebenprodukte des normalen Zell-Metabolismus werden von den Zellen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt. Gestörte Endothelzellen erhöhen die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies über die Aktivierung der Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH)-Oxidase.
NADPH-Oxidase ist ein Enzym, das in Leukocyten gut charakterisiert worden ist, jedoch ist zuvor noch keine leukocytenartige NADPH-Oxidase in Endothelzellen identifitiert worden. Ich habe nachgewiesen, daß es in Endothelzellen vorkommt. Eine Aktivierung der NADPH- Oxidase hat eine Übertragung von Elektronen von NADPH auf Sauerstoff zur Folge, wodurch eine reaktive Sauerstoffspezies (ROS), wie z. B. O&sub2;&supmin; und H&sub2;O&sub2;, erzeugt wird. Die aktive Form der Oxidase ist ein Komplex, der sich aus membrangebundenen Proteinen zusammensetzt, unter denen sich Cytochrom b&sub5;&sub5;&sub8; (zusammengesetzt aus gp 91[phox] und p 22[phox]) und Komponenten des Cytosols befinden, von denen drei charakterisiert worden sind, nämlich p 47[phox], p 67[phox] und ein GTP-bindendes Protein mit niedrigem Molekulargewicht. Cytochrom b558 besteht aus einem Polypeptid von 22 kD, welches fest an ein glykosyliertes Polypeptid von 91 kD gebunden ist. Das glykosylierte Polypeptid von 91 kD ist ein integrales Membranprotein, das als Anker für das Polypeptid von 22 kD dient.
Es ist bekannt, daß erbliche Anomalien des NADPH-Oxidase-Enzym-Komplexes zu progressiver septischer Granulomatose (Chronic Granulomatous Disease; CGD) führen, einer angeborenen Krankheit, bei welcher Leukocyten nicht befähigt sind, reaktive Sauerstoffspezies als Reaktion auf Mikroorganismen zu bilden. Mit Studien an CGD-Kranken mit ungenügender oder fehlender NADPH-Oxidase-Aktivität konnte gezeigt werden, daß es genetische Varianten für die NADPH-Oxidase gibt. Allerdings hat es noch keine Untersuchungungen zum Nachweis genetischer Varianten für NADPH-Oxidase gegeben, bei welchen übermäßige Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies gebildet werden. Falls es solche Varianten gibt und sie in unserer Bevölkerung vorkommen, dann können Leute, die diese genetischen Varianten geerbt haben, in größerer Gefahr für einen Herzanfall, einen Schlag oder eine periphere Gefäßerkrankung sschweben.
Das membrangebundene Enzym NADPH-Oxidase liegt in ruhenden Zellen in inaktiver Form vor. Nach Störung einer Zelle ordnet sich der Enzymkomplex um und wird in den aktiven Zustand überführt, was die verstärkte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies bewirkt (oxydative Explosion). Untersuchungen zur Beschreibung des Aktivierungsmechanismus für die NADPH-Oxidase zeigen, daß ungesättigte Fettsäuren, am wirksamsten die Arachidonsäure, direkt die NADPH-Oxidase aktivieren. Um festzustellen, ob Arachidonsäure die in Endothelzellen gefundene NADPH-Oxidase aktiviert, wurden Untersuchungen durchgeführt, in welchen Zellen direkt steigenden Konzentrationen von Arachidonsäure ausgesetzt und dann die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies ermittelt wurden. Für diese Untersuchungen wurden ECs mit 1 bis 25 uM Arachidonsäure inkubiert und die H&sub2;O&sub2;-Produktion gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß Arachidonsäure sowohl in ECs eine H&sub2;O&sub2;-Bildung induziert als auch eine höhere Endocytoserate in ECs hervorruft.
Eine Erklärung für den Zusammenhang von hohem LDL-Wert und Atherosklerose auf der Grundlage der obigen Information ist, daß unter der Einwirkung von hohen LDL-Werten die Aktivierung von Phospholipase A&sub2; gefördert wird. Bei einem intrazellulären Schwellenwert wird die NADPH-Oxidase von der freien Arachidonsäure im Cytosol vom inaktiven in den aktiven Zustand überführt.
Die Ergebnisse aus meinen Untersuchungen zeigen, daß reaktive Sauerstoffspezies eine erhöhte Endocytoserate bewirken, ein charakteristisches merkmal für Atherosklerose, und daß die NADPH-Oxidase die zelluläre Hauptquelle ist. Obwohl behauptet wird, daß NADPH- Oxidase-Inhibitoren bei der Behandlung von Entzündungen wirksam sind, wurden sie bisher noch nicht für eine Behandlung von Krankheiten, wie z. B. Atherosklerose, vorgeschlagen, deren Anfangsstadium durch eine erhöhte Endocytoserate und übermäßige Gefäßdurchlässigkeit gekennzeichnet ist. Beispielsweise wird in der europäischen Patentanmeldung 551 662 die Verwendung von NADPH-Oxidase-Inhibitoren zur Kontrolle von akuten und chronischen Entzündungen der Atemwege, Gelenke und Blutgefäße offenbart. Solche Entzündungen der Gefäße beinhalten solche Arteriosklerosearten, welche von einer Entzündung herrühren, die europäische Anmeldung nimmt jedoch keinen Betug auf Atherosklerose, weil Atherosklerose durch eine Stoffwechselbefindlichkeit und nicht von einer Entzündung ausgelöst wird.
Die Verwendung von 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon (Trivialname: Apocynin) als NADPH-Oxidase-Inhibitor ist bekannt und wurde zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen vorgeschlagen. Apocynin ist ein natürlich vorkommendes Phenol, das aus der Wurzel von Picrorhiza kurroa isoliert wird, einer Pflanze, welche im Himalaya-Gebirge wächst. Extrakte aus Picrorhiza kurroa sind in der traditionellen Medizin in Südostasien zur Behandlung von mit einer Entzündung einhergehenden Krankheiten sowie zur Behandlung einer Vielzahl von Beschwerden, wie Leber- und Lungenerkrankungen, Fieber, Hautverletzungen, Wurminfektionen, rheumatischen Beschwerden, Harnwegserkrankungen, Herzinsuffizienz sowie Schlangen- und Skorpionbissen eingesetzt worden. In einer Schrift jüngeren Datums [Engels und Mitarb., FEBS Lett., 305, 154-56 (1992) wird vorgeschlagen, daß Apocynin auch zur Vorbeugung gegen Thrombose eingesetzt werden kann. Weder für Apocynin noch für einen anderen NADPH-Oxidase-Inhibitor wurde jedoch gezeigt, daß sie gegen Artherosklerose oder übermäßige Gefäßdurchlässigkeit, die auf erhöhte EC-Endocytose und hohe LDL-Konzentrationen zurückzuführen sind, vorbeugend wirksam sind.
Ein Verfahren, das gegen Atherosklerose und die damit einhergehenden Krankheiten vorbeugt und diese behandelt, auf welches die meisten Patienten ansprechen und das keine die Patienten abschreckende Nebenwirkungen aufweist, würde einen wesentlichen Fortschritt bei der Überwindung einer Haupttodesursache in diesem Lande darstellen. Ein Verfahren, in dem ein leicht zu bekommendes bereits am Menschen eingesetztes Medikament verwendet wird, würde zusätzliche bedeutende Vorteile bei der Vorbeugung und Behandlung der Atherosklerose und damit verwandter Erkrankungen darstellen. Darüber hinaus ist ein diagnostisches Verfahren zur Vorhersage einer potentiellen Artherosklerosegefahr für Patienten höchst wünschenswert.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die überraschende Entdeckung der wirksamen Verwendung eines NADPH-Oxidase-Inhibitors für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Vorbeugung von Artherosklerose bei Säugern.
Die vorliegende Erfindung betrifft den Gegenstand der Ansprüche.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der NADPH-Oxidase-Inhibitor eine Verbindung der Formel
in welcher R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe H, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl sowie substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl und Alkinyl.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat der NADPH-Oxidase- Inhibitor die Formel
oder ein Tautomer davon, in welcher R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe H, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl sowie substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl und Alkinyl.
In einer bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung weist der NADPH-Oxidase-Inhibitor die Formel I, II oder III auf, worin R¹ und R² jeweils für Methyl stehen und R³ durch H repräsentiert wird.
Verbindungen der Formel I sind weitestgehend käuflich zu erwerben. Solche Verbindungen, die nicht käuflich sind, lassen sich auf herkömmliche Art und Weise mittels Friedels-Crafts- Acylierung eines geeigneten Phenols oder geschützten Phenols, mittels Lithiumaryl-Addition eines geschützten Phenols an die geeignete Carboxylsäure oder mittels Cadmiumaryl- Addition an ein Säurechlorid und nachfolgender Abspaltung der Schutzgruppen sowie mittels jeden bekannten Verfahrens zur Herstellung von Ketonen herstellen.
Andere Verbindungen der Formel II lassen sich analog mittels oxydativer Dimerisierung des geeigneten Phenols herstellen. Alle diese Verbindungen werden leicht und reversibel mittels Oxidation unter Verwendung herkömmlicher Oxidationsmittel, wie z. B. Wasserstoffperoxid, zum entsprechenden Chinon oxidiert.
Von übermäßiger Gefäßdurchlässigkeit herrührende Leiden umfassen Atherosklerose und der Atherosklerose verwandete Erkrankungen, einschließlich Herzanfall, Schlag und periphere Gefäßerkrankungen. Verbindungen der Formel I, II oder III sind besonders gut zur Behandlung und Vorbeugung von Atherosklerose geeignet. Unter den Begriffen "Vorbeugung" und "Behandlung" soll nicht verstanden werden, daß die Krankheit oder das Leiden völlig verschwunden sind, sondern lediglich, daß eher eine bestimmte Besserung eintritt, d. h. daß der normale Krankheitsverlauf ganz wesentlich zurückgedrängt wird, so daß sich eine Verbesserung im Vergleich mit der sonst zu erwartenden Symptomatik klinisch erfassen läßt.
In einer anderen Ausführungsart betrifft die Erfindung ein Verfahren, um bei Patienten die Gefahr für eine Krankheit, z. B. für Atherosklerose, vorherzusagen, die von übermäßiger Durchlässigkeit des Endothels herrührt. Das Verfahren umfaßt die Identifizierung eines Patienten mit erhöhter NADPH-Oxidase-Aktivität. Unter erhöhter NADPH-Oxidas-Aktivität im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine Aktivität definiert, die über 10% des in Paarvergleichen gefundenen Bereichs liegt. Eine solche Identifizierung erfolgt vorzugsweise durch Bestimmung der NADPH-Oxidase-Aktivität in weißen Blutzellen (polymorphkernige Leukocyten) des Patienten. Die NADPH-Oxidase-Aktivität in polymorphkernigen Leukocyten (PMKL) läßt sich mittels Durchflußzytometrie mit Hilfe von 2,7- Dichlorfluoresceindiacetat als Indikator bestimmen. Nach der Identifizierung eines solchen Patienten kann die Verabreichung eines NADPH-Oxidase-Inhibitors, wie z. B. Apocynin, zur Vorbeugung und Behandlung von Atherosklerose und verwandter Erkrankungen angezeigt sein.
In jeder Ausführungsform der Erfindung soll ein NADPH-Oxidase-Inhibitor Verbindungen enthalten, welche selbst NADPH-Oxidase-Inhibitoren sind sowie Verbindungen, die hierzu im Stoffwechsel Vorläufersubstanzen (d. h. Prodrugs) darstellen. Das Wirkprinzip besteht in der Hemmung der NADPH-Oxidase infolge der Verwendung der jeweiligen Verbindung.

Definitionen

Die folgenden Begriffe haben durchwegs die angezeigte Bedeutung:
Unter "Alkyl" sollen lineare, verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffreste oder Kombinationen davon verstanden werden. "Niederalkyl" bedeutet Alkyl-Gruppen mit 1 bis 8 C-Atomen. Beispiele für Niederalkyl-Gruppen sind die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, s- und t-Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Octyl-, Cyclopropylethyl-, Bornyl-Gruppe. Bevorzugte Alkyl-Gruppen sind solche mit C&sub2;&sub0; oder darunter.
"Cycloalkyl" ist ein Unterbegriff von Alkyl und umfaßt cyclische Kohlenwasserstoff-Gruppen von 3 bis 8 Kohlenstoffatomen. Beispiele für niedrige Cycloalkyl-Gruppen sind c-Propyl, c- Butyl-, c-Pentyl, Norbornyl.
"Heterocycloalkyl" bedeutet eine Cycloalkyl-Gruppe, in welcher eine bis zwei Methylen (CH&sub2;)-Gruppen durch ein Heteroatom, wie z. B. NR (mit R = H oder Alkyl), S oder dergl. ersetzt ist. Beispiele für eine Heterocycloalkyl-Gruppe sind Tetrahydrofuranyl, Piperidin, Dioxanyl.
"Alkenyl" umfaßt ungesättigte C&sub2;&submin;&sub8;-Kohlenwasserstoffe von linearer, verzweigter oder cyclischer (C&sub5;&submin;&sub6;) Konfiguration sowie Kombinationen davon. Beispiele für Alkenyl-Gruppen sind die Vinyl-, Allyl-, Isopropenyl-, Pentenyl-, Hexenyl-, c-Hexenyl-, 1-Propenyl-, 2- Butenyl- 2-Methyl-2-butenyl-Gruppe.
"Alkinyl" umfaßt C&sub2;&submin;&sub8;-Kohlenwasserstoffe von linearer oder verzweigter Konfiguration sowie Kombinationen davon mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung. Beispiele für Alkinyl-Gruppen sind Ethin, Propin, Butin, Pentin, 3-Methyl-1-butin, 3,3- Dimethyl-1-butin.
"Aryl" und "Heteroaryl" umfassen einen 5- bis 6-gliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring mit 0 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe O, N und S; ein bicyclisches 9- oder 10-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem mit 0 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe O, N und S; oder ein tricyclisches 13- oder 14-gliedriges aromatisches oder heteroaromatisches Ringsystem mit 0 bis 3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe O, N und S; wobei jeder dieser Ringe wahlweise mit 1-3 Niederalkyl, substituiertem Alkyl, substituiertem Alkinyl, =O, -NO&sub2;, Halogen, Hydroxy, Alkoxy, -OCH(COOH)&sub2;, Cyano, -NR&sup4;R&sup4; (worin R&sup4; unabhängig voneinander H, Niederalkyl oder Cycloalkyl sind, und -R&sup4;R&sup4; zur Ausbildung eines cyclischen Ringes mit N miteinander verbunden sein können), Acylamino, Phenyl, Benzyl, Phenoxy, Benzyloxy, Heteroaryl oder Heteroaryloxy substituiert sein kann; wobei jede dieser Phenyl-, Benzyl-, Phenoxy-, Benzyloxy-, Heteroaryl- und Heteroaryloxy-Gruppen wahlweise mit 1-3 Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Niederalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Cyano, Phenyl, Benzyl, Benzyloxy, Carboxamido, Heteroaryl, Hetroaryloxy, -NO&sub2; und -NR&sup4;R&sup4; substituiert sein kann. Die aromatischen 6- bis 14-gliedrigen carbocyclischen Ringe umfassen beispielsweise Imidazol, Pyridin, Indol, Thiophen, Benzopyranon, Thiazol, Furan, Benzimidazol, Chinolin, Isochinolin, Cinoxalin, Pyrimidin, Pyrazin, Tetrazol und Pyrazol.
"Alkoxy" betrifft Gruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen von gerader, verzweigter oder cyclischer Konfiguration sowie Kombinationen davon. Beispiele hierfür sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Cyclopropyloxy, Cyclohexyloxy.
"Acylamino" betrifft Gruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen von gerader, verzweigter oder cyclischer Konfiguration sowie Kombinationen davon. Beispiele hierfür sind Acetylamino, Butylamino, Cyclohexylamino.
"Halogen" steht für F, Cl, Br oder J.
"Arylalkyl" steht für einen Aryl-Ring mit angeheftetem Alkyl-Rest. Beispiele hierfür sind Benzyl, Phenethyl.
"Heteroarylalkyl" steht für einen Heteroaryl-Ring mit angeheftetem Alkyl-Rest. Beispiele hierfür sind Pyridinylmethyl, Pyrimidinylethyl.
"Substituierter" Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl oder Alkinyl betrifft einen Alkyl-, Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Rest, in welchem bis zu 3 H- Atome eines jeden C-Atoms durch Halogen, Hydroxy, Niederalkoxy, Carboxy, Carboalkoxy, Carboxamido, Cyano, Carbonyl, -NO&sub2;, -NR&sup5;R&sup5; (in welchem R&sup5; für H, Alkyl oder Arylalkyl steht), Alkylthio, Sulfoxid, Sulfon, Acylamino, Amidino, Phenyl, Benzyl, Heteroacyl, Phenoxy, Benzyloxy, Heteroaryloxy und substituiertes Phenyl, Benzyl, Heteroaryl, Phenoxy, Benzyloxy oder Heteroaryloxy ersetzt sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Diese und andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung lassen sich aus der folgenden genauen Beschreibung im Kontext mit den anliegenden Zeichnungen entnehmen.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte aus der Fluoreszenzspektroskopie, bestimmt als "ILIGV" pro Zelle für vier Testgruppen von Endothelzellen; gezeigt wird die Wirkung von Apocynin auf die bei hoher Konzentration von LDL erfolgende Induktion der Peroxidproduktion von Endothelzellen;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Fluoreszenz pro 10&sup5; Zellen für 4 Testgruppen von Endothelzellen; gezeigt wird die Wirkung von Apocynin auf die bei hoher Konzentration von LDL erfolgende Induktion der Endocytose bei Endothelzellen;
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der optischen Dichte aus der Fluoreszenzspektroskopie, bestimmt als "ILIGV" pro Zelle für vier Testgruppen von Endothelzellen; gezeigt wird die Wirkung von Apocynin auf die durch Arachidonsäure erfolgende Induktion der Peroxidproduktion von Endothelzellen;
Fig. 4 ist die gedruckte Reproduktion einer Mikrophotographie eines Ausschnitts der Bauchschlagader eines mit einer Diät von hohem Cholesteringehalt gefütterten Kaninchens;
Fig. 5 ist die gedruckte Reproduktion einer Mikrophotographie eines Ausschnitts der Bauchschlagader eines mit einer Diät von hohem Cholesteringehalt gefütterten Kaninchens, dem erfindungsgmäß Apocynin verabreicht wurde;
Fig. 6 ist ein Balkendiagramm und zeigt den prozentualen Zuwachs der H&sub2;O&sub2;- Produktion (d. h. die Erhöhung der Oxidase-Aktivität) für jeweils 22 Patienten mit Atherosklerose gegenüber einem Paarvergleich.
Fig. 7 ist die gedruckte Reproduktion eines Western-Blots der Cytosol- und Membranfraktionen aus Endothelkontrollzellen, Endothelzellen, die PMA ausgesetzt wurden und Endothelzellen, die PMA ausgesetzt und mit 100 ug/ml Apocynin behandelt wurden; zu erkennen ist das Fehlen von p47[phox] in der Membranfraktion; und
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, in welcher in Gegenwart und Abwesenheit von Apocynin und gereinigtem Apocynin-Dimer die Erzeugung von O&sub2;&supmin; durch Schallwellenbehandlung von Endothelzellen aus ganzen Zellen als Reaktion auf Arichidonsäure gezeigt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft den Gegenstand der Ansprüche.
Während man glaubt, daß viele der bekannten NADPH-Oxidase-Inhibitoren über eine Wechselwirkung mit dem vereinigten aktiven Komplex wirken, soll der hier verwendete Begriff NADPH-Oxidase-Inhibitor nicht auf einen bestimmten Mechanismus festgelegt werden. Jede Substanz, welche die von NADPH-Oxidase katalysierte Bildung von reaktiven Sauerstoffapezies zu hemmen vermag, fällt unter den Begriff "NADPH-Oxidase-Inhibitor".

In vitro-Experimente mit Apocynin

Die Experimente wurden in vitro unter Verwendung von Kultursystemen aus Endothelzellgewebe mit hoher LDL-Konzentration durchgführt. Endothelzellen wurden aus menschlichen Nabelschnurvenen isoliert und unter Zusatz von LDL -Medium in Reagenzgläser gegeben. Die Verbindungen und Chemikalien für die Gewebskulturen sind zu kaufen und wurden von Sigma, Worthington, and Gibco erworben. LDL wurde aus menschlichem Blutplasma isoliert. Apocynin kann von Carl Roth GmbH (Deutschland) bezogen werden.
Es wurden Untersuchungungen unter Verwendung von Apocynin durchgeführt, um die NADPH-Oxidase-Aktivierung zu hemmen und damit eine erhöhte Endocytose zu verhindern. Apocynin tritt mit einem funktionellen NADPH-Oxidase-Enzymkomplex insgesamt in Wechselwirkung. Für die Untersuchungen mit Apocynin wurden ECs mit 240 mg/dl LDL- Cholesterin in Gegenwart und Abwesenheit von 100 ug/ml Apocynin inkubiert. Wie in den Fig. 1 und 2 wiedergegeben, hemmt Apocynin wirksam (1) die Induktion der H&sub2;O&sub2;&supmin; Produktion sowie (2) mit hohen LDL-Konzentrationen einhergehende Änderungen der Endocytose.
Wie oben beschrieben, wird die NADPH-Oxidase in ECs direkt von Arachidonsäure aktiviert, indem es die H&sub2;O&sub2;-Erzeugung in ECs induziert; werden ECs der Arachidonsäure ausgesetzt, wird dadurch eine Erhöhung der Endocytoserate bei ECs noch beschleunigt.
Eine weitere Unterstützung dafür, daß die von Arachidonsäure induzierte oxidative Explosion sich aus Aktivierung der NADPH-Oxidase ergibt, erschließt sich aus den Ergebnissen der folgenden Untersuchung, in welcher Apocynin zur Blockierung der NADPH-Oxidase- Aktivierung eingesetzt wurde. ECs wurden mit 10 uM Arachidonsäure in Gegenwart und Abwesenheit von 100 ug/ml Apocynin inkubiert. Fig. 3 zeigt, daß Apocynin die von Arachidonsäure induzierte H&sub2;O&sub2;-Bildung in ECs deutlich reduziert.
Es konnte gezeigt werden, daß es eine Lag-Zeit von ca. zwei Minuten gibt, bevor Apocynin zur Hemmung der NADPH-Oxidase-Aktivität zu wirken beginnt. Diese Verzögerung kommt von der Zeit, die erforderlich ist, daß Apocynin in einer chemischen Reaktion unter Mitwirkung des ROS und Peroxidase zu einem aktiven Produkt verstoffwechselt wird. Im Anschluß an diese Verzögerung ist die ROS-Produktion in der Zelle nahezu vollständig gehemmt.
Als aktives Stoffwechselprodukt des Apocynins wurde ein Dimer mit chinonähnlicher Struktur identifiziert, das aus der Oxidation des Stoffwechsels stammt. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die von der Beschallung von ECs hervorgerufene ROS- Produktion in Reaktion auf Arachidonsäure in Gegenwart und Abwesenheit des gereinigten Apocynin-Dimers zu erforschen. Wie in Fig. 8 wiedergegeben, gab es keine Lag-Zeit für die nahezu vollständige Hemmung der ROS-Bildung in Gegenwart des gereinigten Apocynin- Dimers. Dimerisierung von Apocynin

Synthese und Isolierung des Apocynin-Dimeren

I. Synthese

Eine wässrige Lösung von 0,02 mg/ml Apocynin wird zubereitet, indem 10 mg Apocynin in 500 ml destilliertem Wasser aufgelöst werden. Die Endmolarität der Lösung ist 1,2 10&supmin;&sup4; M. Eine 3% (m/m) H&sub2;O&sub2;-Lösung wird zubereitet, indem 1 ml 30% H&sub2;O&sub2; (m/m, 9,8 M) mit destilliertem Wasser auf 10 ml verdünnt werden. Die Endmolarität der Lösung ist 0,98 M. Eine Lösung von 0,1 mg/ml Meerrettichperoxidase (MRP) wird zubereitet, indem 5 mg feste MRP in 50 ml destilliertem Wasser gelöst werden.
100 ml der Apocynin-Lösung von 0,02 mg/ml wird mit 100 ul (abgemessen mit einer Mikropipette) der MRP-Lösung von 0,1 mg/ml in einem reinen, trockenen Erlenmeyerkolben vereinigt. Mit Hilfe eines Magnetfischrührers wird die Lösung leicht gerührt. Durch Zugabe von 24 ul (abgemessen mit einer Mikropipette) der 3% H&sub2;O&sub2;-Lösung wird die Reaktion gestartet. Nach 10 Sekunden wird die Reaktionsmischung durch Zugabe von 1,5 ml 0,1 M Na&sub2;S&sub2;O&sub3; desaktiviert. Die Lösung wird sodann 2 Minuten lang heftig gerührt und am Ende dann das pH der Lösung durch Zugabe von 5 Tropfen 3 M H&sub2;SO&sub4; auf 3 bis 4 gesenkt.
Die desaktivierte Reaktionsmischung wird dann in zwei Anteile von 50 ml aufgeteilt. Jeder Anteil wird zweimal mit Diethylether (2 · 15 ml) extrahiert und die Ertherphasen vereinigt. Die vereinigten Etherextrakte werden 10 Minuten über einer Mindestmenge von wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und dann gefiltert. Der Ether wird im Rotationsverdampfer abgezogen und das erhaltene Produkt, vor allem eine Mischung aus Apocynin und Apocynin-Dimer, in CDCl&sub3; für eine Analyse mittels ¹H-NMR-Spektroskopie aufgenommen.

II. Isolierung

Nach Analyse mittels ¹H-NMR wird das CDCl&sub3; im Rotationsverdampfer abgezogen und die Rohproduktmischung in einem minimalen Volumen Methanol für die HPLC (< 1 ml) gelöst. Bei Vorkommen suspendierter Teilchen wird, vor dem Auftragen auf die HPLC-Säule, ein Spritzenfilter mit Nylonmembran zum Filtern der Lösung verwendet. Zu Isolierung des Dimeren wird im präparativen Betrieb eine mit einem UV-Detektor ausgestattete Reversedphase-HPLC-Säule (C 18) eingesetzt. Die mobile Phase ist ein Methanol : Acetat (50 : 50)- Puffer (pH=4) und zum Nachweis wird eine Wellenlänge von 260 nm benutzt.
Methanol wird aus der das Dimer enthaltenden gesammelten Präparatelösung (10 bis 20 ml) im Rotationsverdampfer abgezogen (ca. 1 Stunde).
Eine Filterkartusche für Festphasenextraktion (Alltech C 18 500mg - 3 ml) wird vorbereitet, indem 10 ml Methanol für HPLC gefolgt von 10 ml destilliertem Wasser durch den Filter gezogen werden. Sodann gibt man die gestrippte Präparatelösung über den Filter gefolgt von 4 ml destilliertem Waschwasser. Den Filter läßt man ca. 10 Minuten trocknen, dann werden gleiche Anteile von Methanol für HPLC über die Säule gegeben und gesammelt (5 · 5 ml). Das Methanol wird im Rotationsverdampfer abgezogen und das isolierte Dimer in 3 ml CDCl&sub3; aufgenommen. Das Dimer wird sodann mittels ¹H-NMR-Spektroskopie analysiert. Redoxreaktion für das Dimere des Apocynins
Obwohl der Anmelder nicht darauf festgelegt zu werden wünscht, scheint das Apocynin doch ein Stoffwechselvorläufer für die Spezies zu sein, welche die NADPH-Oxidase aktiv hemmt.
Um weiter Einsicht in den Mechanismus der NADPH-Oxidase-Aktivierung zu erhalten, wurden zusätzliche Untersuchungen angestellt. Das Zellenzym Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) hydrolysiert Phospholipide der Membran, wodurch in der Zelle Arachidonsäure freigesetzt wird. Eine Hemmung von PLA&sub2; durch deren Antagonisten p-Bromphenacylbromid (BPB) unterdrückt die Erhöhung an frei im Cytosol vorkommender Arachidonsäure und begrenzt diesen Second-messenger für die Aktivierung der NADPH-Oxidase. Somit führt eine Hemming der PLA&sub2; zur Blockierung der NADPH-Oxidase-Aktivierung in LDL-ECs. In diesen Untersuchungen wurden ECs 240 mg/dl LDL-Cholesterin mit und ohne 10 uM BPB ausgesetzt. BPB verminderte deutlich die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in LDL-ECs.
PLA&sub2; ist ein Ca²&spplus;-abhängiges Enzym. Ca²&spplus; wird auch in intakten Zellen für eine Aktivierung der NADPH-Oxidase benötigt. Die PLA&sub2;-vermittelte Freisetzung von Arachidonsäure verläuft parallel zur Ca²&spplus;-Konzentration außerhalb der Zelle. Es wurden Untersuchungen angestellt, um zu ermitteln, ob LDL-ECs einen erhöhten Ca²&spplus;-Zustrom aufweisen. In diesen Untersuchungen wurden ECs mit steigenden LDL-Konzentrationen (30 bis 240 mg/dl Cholesterin) inkubiert und der Ca²&spplus;-Zustrom in die Zelle, wie in J. Clin. Invest., 82, 2045- 2055(1988) beschrieben mit einem &sup4;&sup5;Ca²&spplus;-Uptake Assay gemessen. Es wurde gefunden, daß LDL-ECs eine dosisabhängige Erhöhung des Ca²&spplus;-Zustroms in die Zelle bewirken. Werden ECs H&sub2;O&sub2; ausgesetzt, kann LDL den Ca²+-Zustrom induzieren, wodurch die Zelle für Ca²&spplus; durchlässig gemacht wird und einen Anstieg der Ca²&spplus;-Konzentration innerhalb der Zelle zur Folge hat.
Die obigen in vitro-Untersuchungen zeigten, daß atherogene LDL-Spiegel eine erhöhte Endocytose an ECs induzieren und daß, vorzugsweise von NADPH-Oxidase produzierte, reaktive Sauerstoffspezies eine erhöhte Endocytose an ECs auslösen. Ohne sich auf eine besondere Theorie festlegen zu lassen, kann man auf Grundlage der obigen in vitro- Untersuchungen die Hypothese aufstellen, daß von aktivierter NADPH-Oxidase in ECs gebildete reaktive Sauerstoffspezies durch erhöhte Endocytose in ECs eine von einem erhöhten Cholesteringehalt induzierte übermäßige Gefäßdurchlässigkeit regulieren.
Unter Einfluß hoher Konzentrationen an LDL wird anfangs die Phospholipase A&sub2;-Aktivität aktiviert, was aus Phosphpolipiden Arachidonsäure freisetzt. Freie Arachidonsäure im Cytoplasma wandelt bei einem Schwellenwert eine inaktive genetische Variante der NADPH- Oxidase in die aktive Form um. Diese genetische NADPH-Oxidase-Variante erzeugt höhere Mangen an reaktiven Sauerstoffspezies, welche die Zellmembran stören und für eine erhöhte PLA&sub2;-Aktivierung sorgen. Die PLA&sub2;-Aktivierung wird weiter durch den von reaktiven Sauerstoffspezies vermittelten Ca²&spplus;-Zustrom in die Zelle erhöht. Die aus Membranphospholipiden freigesetzte Arachidonsäure steigert deutlich die Rekrutierung und das Zusammentreten des NADPH-Oxidase-Enzymkomplexes. Die mehrfachen, membrangebundenen, zusammengetretenen Enzymkomplexe erzeugen außerordentlich große Mengen der reaktiven Sauerstoffspezies O²&supmin; und H&sub2;O&sub2;. Diese reaktiven Sauerstoffspezies erhöhen die Membranfluidität und erniedrigen die Aktivierungsenergie für Endocytose. Die Kombination dieser von LDL induzierten Zellereignisse haben eine gesteigerte Endocytose bei ECs, eine übermäßige Gefäßdurchlässigkeit und über Transcytose einen erhöhten Transport durch die Zelle zur Folge.
Somit verhindert z. B. die Hemmung der NADPH-Oxidase-Aktivierung mit Apocynin eine gesteigerte Endocytose bei ECs und senkt eine übermäßige Gefäßdurchlässigkeit.
Ohne uns auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, halten wir für möglich, daß eine Hemmung der NADPH-Oxidase durch das Apocynin-Dimere bei der Unterbrechung der Elektronentransportkette beim NADPH-Oxidase-Aktivierungsprozeß mitwirken kann. Die NADPH-Oxidase-Aktivierung erfordert eine Kopplung der Elektronentransportkette zwischen Ubichinon (Coenzym Q) und Cytochrom b. Ein oxidiertes Dimer mit einem niedrigeren Reduktionspotential als Ubichinon würde dann die Elektronentransportkette blockieren.

Experimente mit Apocynin in vivo

Um die vorstehende Hypothese zu prüfen, wurden in vivo-Untersuchungen durchgeführt, welche auf die Wirkung der NADPH-Oxidase-Hemmung auf übermäßige Gefäßdurchlässigkeit abzielten, wobei ein Kaninchen-Modell mit erhöhtem Cholesteringehalt eingesetzt wurde. Weiße, männliche Neu Seeland-Kaninchen wurden auf 1% Cholesterindiät mit (n = 5) und ohne (n = 5) 200 mg/ml Apocynin-Zusatz zum Trinkwasser gesetzt. Einen Monat nach Beginn der Fütterung wurden die Tiere eine Minute vor ihrer Tötung mit Meerrettichperoxidase (MRP) als Durchlässigkeitsindikator infundiert. Die Aorten wurden herausgeschnitten, geöffnet und mit Nadeln an einem Seziertische befestigt. Eine grobe Inaugenscheinnahme zeigte bereits, daß die Aorten von Kaninchen mit der 1% Cholesterindiät ohne Behandlung mit Apocynin typische diffuse, frühe atherosklerotische Wunden aufwiesen. Im Gegensatz dazu wurden in den Aorten der mit Apocynin behandelten Kaninchen mit erhöhtem Cholesteringehalt keine Wunden beobachtet. Daraufhin wurden die Aorten Diaminobenzidin und H&sub2;O&sub2; ausgesetzt, wobei sich ein brauner Reaktionsniederschlag an den Stellen hoher MRP-Konzentrationen bildete. Die Aorten der Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert ohne Apocynin-Behandlung wiesen deutliche, diffuse Bereiche mit hohen MRP-Konzentrationen auf. Jedoch zeigten Aorten von Apocynin behandelten Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert übereinstimmend wenige MRP-positive Bereiche, mit einem Muster ähnlich dem von mit Standardfutter gefütterten Kaninchen. Die Gesamtserumcholesterinspiegel von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert mit und ohne Apocynin-behandlung waren einander vergleichbar.
Es wurde auch eine dreimonatige Untersuchung an weißen, männlichen Neu-Seeland- Kaninchen durchgeführt, an die eine 1% Cholesterindiät mit 30 ug/ml (n = 2), 200 ug/ml (n = 2), 400 ug/ml (n = 2), 800 ug/ml (n = 2) und ohne (n = 2) Apocyninzusatz zum Trinkwasser verfüttert wurden. Nach drei Monaten wurden die Tiere getötet und ihre Aorten wie oben beschrieben untersucht. Eine Inaugenscheinnahme zeigte, daß die Aorten bei Kaninchen mit der 1% Cholesterindiät ohne Behandlung mit Apocynin im Bereich von 60% der Aortenoberfläche mit atherosklerotischen Plaques bedeckt waren. Im Gegensatz dazu wurde eine dosisabhängige Abnahme von Wunden an den Aorten von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert mit Apocynin-Behandlung beobachtet. Bei Tieren, die mit einer über 200 g/ml liegenden Dosis Apocynin behandelt wurden, ging die mit Plaques bedeckte Aortenoberfläche auf unter 8% zurück. Die Gesamtserumcholesterinspiegel von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinwert mit und ohne Apocynin-behandlung waren bei ca. 1000 mg/dl miteinander vergleichbar.
Es wurde eine morphologische Untersuchung des Aortenendothels an den Kaninchen aus den obigen ein- und dreimonatigen Untersuchungen durchgeführt. Zufällige Gewebsproben wurden aus den Thorax- und Abdominalaorten von Kaninchen mit erhöhtem Cholesteringehalt und von solchen Kaninchen mit erhöhtem Cholesteringehalt und Apocynin- Behandlung entnommen. Von den Gewebsproben wurden Dünnschnitte angefertigt und für eine mikroskopischen Untersuchung weiterbehandelt. Die Untersuchung von elektronenmikroskopischen und lichtmikroskopischen Aufnahmen von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinspiegel ohne Apocyninbehandlung zeigten häufige und diffuse vaskuläre Veränderungen, wie sie für Atherosklerose charakteristisch sind. Fig. 4 ist eine repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme. Im Gegensatz dazu zeigte die Untersuchung an mehreren Gewebsproben von Kaninchen mit erhöhtem Cholesterinspiegel mit Apocyninbehandlung nur wenige Anzeichen für vaskuläre Veränderungen. Fig. 5 ist eine repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme hierfür. Auf ähnliche Weise wurde die Wirkung der NADPH-Oxidase-Hemmung auf das Endothel von Koronararterien untersucht. Es wurde gefunden, daß die Koronararterie wie die Abdominalaorta für Atherosklerose charakteristische Veränderungen aufwies und daß diese Veränderungen bei Behandlung mit Apocynin weniger waren.
Als experimenteller Beweis dafür, daß Apocynin eine übermäßige Gefäßdurchlässigkeit durch Verhinderung der Endocytose bei ECs reduzieren, wurde die Zahl der Endocytosevesikel auf ECs auf der Licht- und Schattenseite von elektronenmikroskopischen Aufnahmen als ungefähres Maß für eine Endocytose-Aktivität ausgezählt. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von 50 zufällig ausgewählten Aortenzellen von Kaninchen mit erhöhtem Cholesteringehalt mit und ohne Apocynin-Behandlung wurden mit 35000-facher Vergrößerung aufgenommen. Endocytosevesikel wurden auf den Licht- und Schattenseiten der Zellen ausgezählt. Ausgezählt wurden solche Vesikel, die sich in der Plasmamembran bildeten oder klar erkennbar an der Membran anhafteten. Es wurde eine deutliche Abnahme der Zahl der Endocytosevesikel an Apocynin behandelten Tieren beobachtet, was darauf schließen läßt, daß die Wirkung von Apocynin so ist, daß es eine Zunahme der Endocytose verhütet.

Nebenwirkungen

Mit Apocynin drei Monate lang behandelte Kaninchen zeigten keine offenkundigen Krankheitsanzeichen. Die Gewichtszunahme von drei Monate lang mit Apocynin behandelten Kaninchen war mit derjenigen von nicht mit Apocynin behandelten Tieren vergleichbar.
Es wäre zu erwarten gewesen, daß Apocynin die Anfälligkeit gegenüber Infektionen erhöhte, da die weißen Blutzellen NADPH-Oxidase zur Erzeugung von ROS verwenden, um damit Bakterien abzutöten. Es wurde jedoch keine Zunahme für die Anfälligkeit gegenüber Infektionen bei den weißen, männlichen Neu Seeland-Kaninchen beobachtet.
Eine weitere theoretische Nebenwirkung von Apocynin könnte sich möglicherweise aus einer Hemmung der Zellproliferation ergeben. Einige Gewebe des Körpers, darunter das Knochenmark und die Gastrointestinalzellen, haben höhere Zellproliferationsraten. Zellwachstumsstudien zeigten die dosisabhängige Wirkung von Apocynin auf die Proliferation von Endothel- und glatten Muskelzellen. Bei 100 ug/ml Apocynin war die Zellproliferationsrate minimal, eine Inaugenscheinnahme der Zellen ergab jedoch für die untersuchten Apocynin-Konzentrationen keinen Hinweis auf eine Beschädigung der Zelle oder gar für deren Tod. Somit ist Apocynin bei Konzentrationen, welche die ROS-Bildung hemmen, höchst wirksam bei der Unterdrückung der Zellproliferation.

Schlußfolgerung

Die obigen in vitro- und in vivo-Untersuchungen zeigen, daß sich durch die Verabreichung von NADPH-Oxidase-Inhibitoren, wie z. B. Apocynin, mit einer übermäßigen Durchlässigkeit von Endothelzellen einhergehende Erkrankungen, einschließlich der Atherosklerose und damit verwandter Krankheiten, verhindern und behandeln lassen. Zusätzlich zur Verhinderung von Atherosklerose können NADPH-Oxidase-Inhibitoren, wie z. B. Apocynin, nützlich bei der Verhinderung und Behandlung der folgenden Zustände sein, indem sie die Membrandurchlässigkeit und die damit assoziierte Zellproliferation herabsetzen: Arthritis, Krebs, Sepsis; Gewebeschwellung nach einem Schlag oder Myocard-Infarkt und Verletzung bei Reperfusion; Atemnotsyndrom im Erwachsenenalter (ARDS = Adult Respiratory Distress Syndrome); bösartige Geschwülste; Gewebsveränderungen nach Transplantation; Gefäßentzündungen; Asthma und Diabetes mellitus.
Die beim Menschen einzusetzende optimale Dosis für den NADPH-Oxidase-Inhibitor, wie z. B. Apocynin, variiert in Abhängigkeit von der Schwere und Art des zu behandelnden Zustands, dem Weg der Verabreichung, dem Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten sowie von jeder anderen medikamentösen Behandlung des jeweiligen Patienten oder dem Vorkommen einer ernsten Komplikation beim zu behandelnden Patienten. Auch die Dosis und die Häufigkeit der Verabreichung ändert sich entsprechend dem individuellen Ansprechen des Patienten. Im allgemeinen liegt der Bereich für die tägliche Gesamtdosis für Apocynin bei den obigen Bedingungen 10 bis 45 mg/kg/Tag; für einen Durchschnittsmenschen liegt die tägliche Gesamtdosis bei ca. 500 bis 3000 mg, vorzugsweise in Teildosen. Bei einer Behandlung des Patienten sollte die Therapie bei niedrigeren Dosen, etwa bei ca. 200 bis 500 mg, beginnen und je nach nach dem globalen Ansprechen des Patienten bis auf 1000 mg gesteigert werden. Es ist weiterhin zu empfehlen, daß Patienten über 65 Jahre und solche mit geschwächter Nieren- oder Leberfunktion zunächst kleinere Dosen einnehmen und daß sie auf Grundlage der individuellen Reaktion(en) und Blutspiegel titriert werden. In einigen Fällen ist es notwendig, Dosierungen außerhalb dieser Bereiche einzusetzen, wie der Faschmann leicht erkennen kann. Desweiteren sei darauf verwiesen, daß der Kliniker oder behandelnde Arzt weiß, wie und wann er die Therapie in Verbindung mit der individuellen Reaktion eines Patienten zu unterbrechen, einzustellen oder zu beenden hat. Die Begriffe "eine therapeutisch wirksame Menge" und "eine zur Verhinderung ausreichende Menge" werden von den oben beschriebenen Mengenangaben für die Bereiche und das Muster für die Verabreichungshäufigkeit umfaßt.
Jeder Verabreichungsweg läßt sich einsetzen, um den Patienten mit einer wirksamen Dosis Apocynin zu versorgen. Beispielsweise lassen sich eine orale, rectale, parenterale (subkutan, intramuskulär, intravenös), transdermale Verabreichung oder eine Verabreichung als Aerosol oder eine andere Form einsetzen. Die orale Gabe ist bevorzugt.

Untersuchungen zur Vorhersage des Risikos bei Atherosklerose

Falls eine erhöhte Endocytose vor allem eher einen Defekt der Endothelzellen zur Folge hat als einen artherogenen LDL-Typ, dann ließe sich erklären, warum bestimmte Leute mit im allgemeinen mit Atherosklerose einhergehenden Plasma-LDL-Spiegeln keine Atherosklerose oder verwandte Erkrankungen ausbilden. Die EC-Defekt-Hypothese würde auch nahelegen, daß Atherosklerosepatienten ganz allgemein eine gewisse Erhöhung der NADPH-Oxidase- Aktivität aufweisen.
Um die Hypothese zu testen, wurden 92 EC-Experimente mit hohem LDL-Spiegel an isolierten Zellen von 92 getrennten menschlichen Nabelschnüren in vitro durchgeführt. Zusätzlich wurden allgemein an isolierten ECs aus zwei oder mehr menschlichen Quellen wöchentlich aus verschiedenen menschlichen Quellen isolierte LDL-Präparationen eingesetzt, womit sich die Wirkung von LDL analysieren ließ. Endothelzellen aus der gleichen Nabelschnur verfügten über ähnliche Endocytoseaktivität, wenn sie hohen LDL-Spiegeln ausgesetzt wurden. Im Gegensatz dazu reagieren ECs aus unterschiedlichen Nabelschnurquellen unterschiedlich, und zwar von keiner Änderung der Endocytose bis hin zu einem 200 bis 300% Anstieg der Endocytoseaktivität im Vergleich mit Kontrollzellen.
Wenn sie einer hohen LDL-Konzentration ausgesetzt wurden, wurde in 52% der untersuchten isolierten ECs ein breites Spektrum an Veränderungen im Hinblick auf den Grad der Reaktion induziert, mit Endocytose-Anstiegen von 5 bis 300%. Diese in vitro-Beobachtung korreliert mit epidemiologischen Untersuchungen, welche zeigen, daß die von der Artheroskleose und verwandeten Krankheiten hervorgerufene Sterblichkeit bei ungefähr 50% der Bevölkerung auftritt.
Falls es im Gegensatz zu der EC-Hypothese einen atherogenen LDL-Typ gibt, wäre zu erwarten, daß isolierte ECs aus einer Vielzahl menschlicher Quellen ähnliche Reaktionen zeigen würden, wenn sie der gleichen LDL-Präparation ausgesetzt wurden. Isolierte ECs wurden als zu keiner Reaktion (0 bis 5% Endocytose-Anstieg) oder zu einer Reaktion befähigt (5 bis 300% Endocytose-Anstieg) eingestuft und analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß nur 53% alle isolierten ECs, wenn sie der gleichen LDL-Präpation ausgesetzt wurden, entweder reagiem oder nicht reagieren. Die Bedeutung dieses Befunds liegt darin, daß er die Wahrscheinlichkeit nahelegt, daß die erhöhte Endocytoserate eher einen EC-Defekt mit sich bringt als einen atherogenen LDL-Typ. Somit scheinen LDL-Spiegel die erhöhte Endocytoserate zu aktivieren.
Dieser Befund kann erklären, warum bestimmte Leute mit allgemein mit Atherosklerose assoziierten Plasma-LDL-Spiegeln keine Atherosklerose oder verwandte Krankheiten zeigen und führt zu der erfindungsgemäßen Methode zur Vorhersage des Atheroskleroserisikos für eine Person. Durch die Identifizierung eines Patienten mit erhöhter NADPH-Oxidase- Aktivität läßt sich ein erhöhtes Atheroskleroserisiko voraussagen. Bei solcherart identifizierten Patienten kann dann die Verabreichung von Apocynin oder anderer NADPH- Oxidase-Inhibitoren zur Vorbeugung gegen Atherosklerose und verwandte Krankheiten angezeigt sein.
Falls in der menschlichen Bevölkerung genetische Varianten von NADPH-Oxidase oder von an dessen Aktivierung beteiligten Enzymen vorkommen und einige dieser Varianten außerordentlich hohe Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies bilden, könnte dies mit klinischer Atherosklerose korreliert sein. Untersuchungen am Menschen wurden daher unternommen. In diesen Studien wurde die NADPH-Oxidase-Aktivität von polymorphkernigen (PMK) Leukozyten von Personen mit in der Familie klinisch dokumentierten Fällen von Atherosklerose oder verwandten Krankheiten mit solchen verglichen, wo in der Familie keine derartige Erkrankung auftrat. Freiwillige, deren medizinische und krankheitsbezogene Familiengeschichte genau recherchiert wurde, spendeten Proben venösen Blutes. Die PMK-NADPH-Oxidase-Aktivität wurde mittels Durchflußzytometrie mit einer Fluoreszenz-Sonde unter Verwendung von 2,7- Dichlorfluorescindiacetat als Indikator gemessen. Die NADPH-Oxidase-Aktivität wurde bestimmt, indem die Fluoreszenzmessungen aus dem mit PMK versperrten Fenster herangezogen wurden. Für diese Untersuchungen wurden 22 Personen mit entweder klinisch dokomentierter Atherosklerosegeschichte in der Familie mit 11 Personen (Kontrolle) verglichen, in deren Familie keine Atherosklerose bekannt war.
Die in Fig. 6 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß die 22 Personen gegnüber den Kontrollpersonen eine beträchtlich erhöhte NADPH-Oxidase-Aktivität aufwiesen. (Signifikanzniveau des Tests: P < 0,07). Die Befunde legen nahe, daß es genetische Varianten der NADPH-Oxidase (oder von bei dessen Aktivierung beteiligten Enzymen) gibt, und daß Personen mit diesen genetischen Varianten einer größer Gefahr für Atherosklerose oder verwandte Krankheiten ausgesetzt sind.

Claims

1. Verwendung eines NADPH-Oxidase-Inhibitors für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in der Therapie von Störungen, die durch eine LDL-Ansammlung im Subendothelial- Raum charakterisiert sind, die sich aus einer endothelialen Hyperpermeabilität ergibt, wobei der Inhibitor:

(a) eine Verbindung der Formel:

oder

(b) eine Verbindung der Formel:

oder ein Tautomer davon ist, wobei R¹, R² und R³ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, und substituiertem Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl und Alkynyl besteht.

2. Verwendung eines Inhibitors der p47[phox]-Translokation an Endothelzell-gp91[phox] und -p22[phox] membrangebundene NADPH-Oxidase-Bestandteile, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in der Therapie von Störungen, die durch eine LDL-Ansammlung im subendothelialen Raum charakterisiert sind, die sich aus einer endothelialen Hyperpermeabilität ergibt, mit dem Vorbehalt, daß die Verwendung von Lovastatin und Compactin ausgeschlossen ist.

103. Verwendung nach Anspruch 2, bei der der Translokatiors- Inhibitor eine Verbindung der Formel:

oder

oder ein Tautomer davon ist, wobei R¹, R² und R³ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und substituiertem Alkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Alkenyl und Alkynyl besteht.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, bei der R¹ und R² jeweils Methyl und R³ H ist.