DE69602369T2 - Verfahren zur herstellung von sulfatierten polysacchariden - Google Patents
Verfahren zur herstellung von sulfatierten polysaccharidenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft den Erhalt von sulfatierten Polysacchariden niedriger Molmasse durch Depolymerisierung von Fucanextrakten aus Phaeophyceen.
- Fucane sind sulfatierte Polysaccharide, die in den Zellwänden von Braunalgenthalli vorhanden sind. Der durch saure Extraktion erhaltene Fucanrohextrakt der Thalli besteht aus einer heterogenen Population von Molekülen erhöhter mittlerer Molmasse (100.000 bis 800.000 g/mol), bei denen es sich hauptsächlich um Polymere von α-1,2-L- Fucose-4-sulfat handelt. Die Fucane enthalten jedoch ebenso einen nicht zu vernachlässigenden Anteil anderer Bestandteile, insbesondere Uronsäureketten, und neutrale Zucker, wie z. B. D-Xylose, und D-Galactose und D-Mannose.
- Die Fucane besitzen verschiedene Eigenschaften, die ihre Nutzung als Quelle neuer therapeutisch aktiver Prinzipien besonders interessant werden lassen. Es wurde infolgedessen gezeigt, daß sie anti-koagulierende, antithrombotische [T. NISHINO et T. NAGUMO, Carbohydr. Res. 229, S. 355-362 (1992); europäische Patentanmeldung EP 0 403 377; S. COLLIEC et al., Thromb. Res. 64, S. 143-154 (1991); S. SOEDA et al., Thromb. Res. 72, S. 247-256 (1993); ] antivirale [M. BABA et al., J. AIDS, 3, S. 493- 492, (1990)]; antiangiogene [R. HAHNENBERGER und A. M. JACKOBSON, Glycoconjugate J., 8, 350-353 (1991)] und antikomplementäre [C. BLONDIN et al., Molecular Immunology, 31, S. 247-253 (1994)] Aktivitäten besitzen. Es wurde ebenso beobachtet, daß sie als Modulatoren der cellulären Adhäsion [C. G. GLABE et al., J. Cell Sci. 61, S. 475-490 (1983)], der Gewinnung von Wachstumsfaktoren [D. A. BELFORT et al., J. Cell Physiol. 157, S. 184-189 (1993)], der Proliferation von Tumorzellen [M. ELLOUALI et al., Anti cancer Research, 13, S. 2011-2020 (1993); D. R. COOMBE et al., Int. J. Cancer, 39, S. 82-90 (1987)] wirken können und die Interaktionen zwischen Spermium/Ei bei verschiedenen Arten blockieren können [M. C. MAHONY et al., Contraception, 48, S. 277-289 (1993); M. C. MAHONY et al., Contraception, 44, S. 657-665 (1991)].
- Trotz ihres möglichen Interesses und obwohl bestimmte ihrer Eigenschaften (z. B. ihre Anti- Koagulationsaktivität) seit langem bekannt sind, wurden die Rohfucane in der Therapie aufgrund ihrer hohen Molmasse und ihrer Heterogenität, die zu einer schlechten Löslichkeit führte, was die Charakterisierung der aktiven Präparationen und ihr reproduzierbares Gewinnen sehr schwierig werden läßt, nicht verwendet.
- Im Zuge der vorherigen Arbeiten entwickelte die Arbeitsgruppe der Erfinder ein schonendes Lyseverfahren von Rohfucan durch saure Hydrolyse (europäische Patentanmeldung 0 403 377), gefolgt von einer Fraktionierung durch Gelfiltration, was es ermöglicht, Polysaccharidfraktionen mit einer Molmasse kleiner oder gleich 20.000 g/mol zu erhalten. Diese Fraktionen besitzen die Eigenschaften von Rohfucan, wie z. B. die Anti-Koagulationsaktivität und die antikomplementäre Aktivität.
- Mit der sauren Hydrolyse, gefolgt von der Fraktionierung, können die Fraktionen mit geringen Molmassen jedoch lediglich nur mit schlechter Ausbeute erhalten werden (≤10% des Ausgangs-Rohfucans); außerdem zeigt die Charakterisierung der durch saure Hydrolyse erhaltenen Fraktionen eine große Heterogenität der Polysaccharide in Bezug auf die Masse, wie auch in Bezug auf die chemische Zusammensetzung.
- Im übrigen wurde gezeigt, daß es möglich ist, Polysaccharidfraktionen niedriger Molmasse und konstanter Zu sammensetzung, ausgehend von Heparin oder Dermatansulfat, zu erhalten, indem eine radikalische Depolymerisation durchgeführt wird [VOLPI et al. J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 662, S. 13-20 (1993); Anal. Biochem. 200, S. 100-107 (1992)]. Die Reaktion erfolgt durch die Bildung freier Radikale, die durch eine Reaktion eines Metallions (Cu²&spplus; oder Fe³&spplus;) mit Wasserstoffperoxid erzeugt werden [G. VAN DEDEM und J. I. NIELSEN, Pharmeuropa, 3, S. 202-218 (1990)]. Die freien Radikale sind sehr reaktiv und können bei neutralem pH die Polysaccharide effizienter abbauen als die saure Hydrolyse.
- Die Erfinder versuchten, die radikalische Depolymerisation einer Fucanfraktion mit hoher Molmasse (HMWF) durch die Wirkung von Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Kupferacetat durchzuführen. Die ersten durchgeführten Versuche, die in Übereinstimmung mit dem von VOLPI et al. beschriebenen Protokoll durchgeführt wurden, führten zum Erhalt von Fraktionen mit Molmassen unterhalb von 20.000 g/mol und mit konstanten Zusammensetzungen.
- Zum Erhalt von Fraktionen mit Molmassen unterhalb von 10.000 g/mol ist es jedoch notwendig, das Produkt der radikalischen Depolymerisation durch sterischen Ausschluß zu fraktionieren, mit der Folge eines Verlustes an Produkt im Bereich von 50%.
- Die Erfinder haben mittlerweile ein neues Verfahren der radikalischen Depolymerisation entwickelt, das es ermöglicht, in einer einzigen Stufe, ausgehend von Rohfucan, und mit guter Ausbeute homogene Fraktionen mit einer Molmasse niedriger als 10.000 g/mol zu erhalten, ohne daß es notwendig ist, eine komplementäre Fraktionierung mittels sterischen Ausschlusses vorzunehmen.
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalt von sulfatierten Polysacchariden durch radikalische Depolymerisation, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man:
- a) einem Volumen V1 eines Reaktionsgemisches, umfassend ein Rohfucan aus Phaeophyceen in einer Konzentration zwischen 5 mg/ml und 100 mg/ml und in Gegenwart eines Metallkatalysators, ein Volumen V2 einer Lösung aus Wasserstoffperoxid in einer Konzentration zwischen 5% und 30% zusetzt, wobei der Zusatz kontinuierlich unter Rühren für 0,5 Stunden bis 10 Stunden mit einer Zugabemenge pro Minute zwischen V1/1000 und V1/10 erfolgt und das Reaktionsgemisch bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 durch kontinuierliche Zugabe von Natronlauge und bei einer Temperatur zwischen 40 und 70ºC gehalten wird.
- b) Man die aus dieser Depolymerisation hervorgehenden Polysaccharide isoliert.
- [0012] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Rohfucan aus Phaeophyceen in dem Reaktionsgemisch in einer Konzentration zwischen 10 mg/ml und 50 mg/ml vorhanden.
- [0013] Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform verwendet man eine Wasserstoffperoxidlösung in einer Konzentration zwischen 5% und 20%, vorzugsweise im Bereich von 9 bis 10% und in einer Menge zwischen V1/50 und V1/500, vorzugsweise in der Größenordnung von V1/100.
- [0014] Die Metallkatalysatoren, die zur Durchführung der Erfindung verwendet werden können, sind z. B. diejenigen, die in dem europäischen Patent 221 977 von OPOCRIN SpA. LABORATORIO FARMACOBIOLOGICO erwähnt werden.
- [0015] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Metallkatalysator in dem Reaktionsgemisch in einer Konzentration zwischen 0,01 und 0,1 M, vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,05 M vorhanden.
- [0016] Das erfindungsgemäße radikalische Depolymerisationsverfahren ermöglicht es in einer einzigen Stufe ohne präparative Fraktionierung durch sterische Ausschlußchromatographie und in guter Ausbeute homogene Polysaccharidfraktionen einer Molmasse kleiner oder gleich 10.000 g/mol zu erhalten.
- [0017] Im Rahmen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird unter "homogener Fraktion" eine Fraktion verstanden, die bei sterischer Hochleistungsausschlußchromatographie einen einzigen Hauptpeak zeigt, der eine Hauptpopulation in der Fraktion darstellt; der Polydispersionsindex, der ausgehend von dem so erhaltenen Peak berechnet wird, ergibt einen Wert zwischen 1 und 2.
- [0018] Vorzugsweise umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren außerdem eine Stufe der Ionenaustauschchromatographie, die entweder vor oder nach der radikalischen Depolymerisation durchgeführt wird, und bei welcher man die Fraktion gewinnt, die, wenn die Chromatographie mit einer DEAE- Sepharose-CL6B-Säule (PHARMACIA) durchgeführt wird, bei einer Ionenstärke eluiert wird, die einer Konzentration von NaCl größer als 0,8 M, vorzugsweise gröber als 1 M, entspricht.
- [0019] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die Polysaccharidfraktionen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren, das wie oben definiert wurde, gewonnen werden können.
- [0020] Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beschreibungsergänzung besser verstanden werden, die sich auf ein Beispiel zum Erhalt von sulfatierten Polysacchariden, ausgehend von Fucanextrakten von Braunalgen unter Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht.
- [0021] Drei Fucanpräparationen wurden als Ausgangsmaterial ausgetestet; sie werden mit den folgenden Abkürzungen bezeichnet:
- FS: Präparation von Fucoidan aus Fucus vesiculosus, das von SIGMA FRANKREICH vertrieben wird.
- EA: Saurer Extrakt, der ausgehend von Ascophyllum nodosum mit dem von S. COLLIEC et al. [Phytochemistry, 35, S. 697-700 (1994)] beschriebenen Protokoll erhalten wurde.
- P1: Fraktion hoher Molmasse, die durch saure Behandlung von EA erhalten wurde, die in der europäischen Patentanmeldung 403 377 (Seite 13, Beispiel 1, b) A) beschrieben wurde.
- [0022] 600 mg Fucan und 80 mg Kupferacetatmonohydrat (0,02 M) werden in 20 ml bidestilliertem Wasser in einem Reaktor, der bei 60ºC gehalten wird, gelöst. Eine 9%- Vol./Vol.)-Wasserstoffperoxidlösung wird mit einer Zugabe von 12 ml pro Stunde zugesetzt, und der pH wird auf einem Wert von 7,5 durch kontinuierliche Zugabe von 2 M NaOH gehalten. Die Reaktion wird nach 5 Stunden beendet. Der pH wird auf einen Wert von 5 mit Essigsäure eingestellt, und dann wird das chelatbildende Harz CHELEX® 100 (BIORAD) zugefügt, um das Kupfer, das das Medium kontaminiert, zu eliminieren. Nach Neutralisation mit 0,1 M Natronlauge wird die Lösung entsalzt und lyophilisiert.
- [0023]
- - Die Molmassen von verschiedenen Fucanfraktionen wurden durch sterische Hochleistungsausschlußchromatographie (HPSEC) in 0,15 M NaCl, 0,05 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7, unter Verwendung einer LI-CROSPHER®-Si300-(MERCK- CLEVENOT)-Säule und einer HEMASEC®-BIO40-(ALLTECH)- Säule bestimmt. Die Säulen wurden mit den folgenden Polysaccharid-Standards kalibriert: Pullulane: 853.000-5800 g/mol (POLYMER LABORATORIES, INTERCHIM), Dextran: 1500 g/mol und Melezitose: 522 g/mol (FLUKA), Saccharose: 342 g/mol und Glucose: 180 g/mol (SIGMA). Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Software CHROMSTAR® BRUKER [vertrieben von MERK] analysiert.
- - Der Fucosegehalt wurde durch die Cystein-H&sub2;SO&sub4;-Methode bestimmt [Z. DISCHE, Method Biochem. Anal. 2, S. 313- 358 (1955)].
- - Der Gehalt an Uronsäuren wurde unter Verwendung einer Modifikation der m-Hydroxydiphenyl-H&sub2;SO&sub4;-Methode [T. M. C. C. FILISETTI-COZZI und N. C. CARPITTA, Anal. Biochem., 197, S. 157-162 (1991)] und unter Verwendung von Glucuronsäure als Standard bestimmt. Die Störung durch neutrale Hexosen wurde unter Verwendung von Kaliumsulfamat und durch Verwendung von Kontrollen, die alle Reagentien mit Ausnahme von m- Hydroxydiphenyl enthalten, verhindert.
- - Der Gehalt der Fraktionen an Sulfat wurde durch Elementaranalyse von Schwefel (S%) und unter Verwendung der folgenden Beziehung bestimmt: Prozentsatz an Sulfatgruppen (%) = 3,22 · S%.
- - Stickstoff wurde durch Elementaranalyse quantifiziert. Die gefundenen Mengen sind immer sehr schwach, und es wurde keinerlei Spur des Vorhandenseins sowohl von Proteinfragmenten als auch Aminosäuren oder Zuckern, die Stickstoff enthalten, gefunden. Folglich sind die Quantifizierungsergebnisse als reiner Stickstoff (g/100 g) angegeben.
- - Die Zuckerzusammensetzung wurde durch Gasphasenchromatographie bestimmt.
- - Die Anti-Koagulationsaktivität einer jeden Fucanprobe wurde durch TCA-Messung (Zeit des aktivierten Cephalins) unter Verwendung des TCA-(ORGANON TEKNIRA)-Kits gemessen.
- [0024] 100 ul Kontrollpuffer oder eine Heparinlösung mit verschiedenen Verdünnungen (0 bis 1 ug/ml) (H410, Choay- Institut, SANOFI, 170 IE/mg) oder Fucanverdünnungen (0 bis 50 ug/ml) werden mit 100 ul Plasma, das wenig Blutplättchen (PPP) enthält, und 100 ul TCA-Reagens gemischt. Das Gemisch wird während 3 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Zeit zur Bildung von Blutklümpchen wird nach Zugabe von 100 ul einer CaCl&sub2;-Lösung (25 mM) gemessen.
- [0025] Drei Degradationen wurden unter den gleichen Bedingungen nach dem oben beschriebenen Protokoll, ausgehend von P1, EA und FS, durchgeführt.
- [0026] Mehrere Entnahmen wurden im Verlauf der Depolymerisation entnommen und durch HPSEC analysiert.
- [0027] Die Chromatographieprofile im Laufe der Zeit werden in Fig. 1 dargestellt. Nach 30 Minuten erhält man eine Fraktion einer Molmasse von 66.000 g/mol (Fig. 1A). Die ses Produkt ist jedoch nicht ausreichend homogen (Schulter bei 19.000 g/mol). Zwischen 60 und 300 Minuten entwickeln sich die Polysaccharide auf ein Produkt einer Molmasse von 9000 g/mol zu, das diesesmal ein homogenes Chromatographieprofil besitzt (Fig. 1H).
- [0028] Die Ergebnisse sind in der Tabelle I unten zusammengefaßt. Die am Ende von 300 Minuten erhaltenen Fraktionen, ausgehend von P1, EA und FS, werden als DRP1, DREA bzw. DRFS bezeichnet.
- [0029] Der Gehalt an Uronsäuren der Fraktionen aus der Depolymerisation ist verringert, wohingegen der Fucosegehalt wenig variiert (Tabelle I). Im Gegensatz dazu erhöht sich der Sulfatgehalt von DRP1 und DRFS in starker Weise, bleibt jedoch im Falle von DREA konstant. Tabelle I
- ND: nichtbestimmt (zu heterogene Fraktion)
- Mc: Molmasse, die chromatographisch an der Spitze des Gipfels bestimmt wurde.
- p: mittlere Molmasse, ausgedrückt als Gewicht
- n: mittlere Molmasse, ausgedrückt als Zahl.
- [0030] Das Ausgangsmaterial ist ein saurer Extrakt EA, der wie der im Beispiel 1 verwendete saure Extrakt erhalten wurde.
- [0031] 4,5 g Rohfucan EA werden in 150 ml einer Lösung von 0,02 M Kupferacetatmonohydrat in einem Reaktor, der auf 60ºC gehalten wird, gelöst. Eine 9% -(Vol./Vol.)-Wasserstoffperoxidlösung wird in einer Geschwindigkeit von 1,5 ml pro Minute während 5 Stunden zugegeben. Der pH wird durch kontinuierliche Zugabe von 2 N NaOH auf einem Wert von 7,5 gehalten. Der pH wird auf einen Wert von 5 mit Essigsäure eingestellt, und dann wird das chelatbildende Harz CHELEX® 100 (BIORAD) zugegeben, um kontaminierendes Kupfer aus dem Medium zu entfernen. Nach Neutralisation durch 0,1 M Natronlauge wird die Lösung entsalzt und lyophilisiert.
- [0032] Die Ergebnisse der Depolymerisationsreaktion sind in den unten gezeigten Tabellen II und III zusammengefaßt. Das Depolymerisationprodukt wird mit EADR bezeichnet. TABELLE II TABELLE III
- Die Gehalte an Uronsäure, Fucose, -SO&sub3;Na und Stickstoff werden in g/100 g ausgedrückt; Mc wird in G/mol ausgedrückt; die Anti-Koagulationsaktivität wird in IE/mg ausgedrückt.
- [0033] 1 g EADR wurde durch Ionenaustauschchromatographie auf einer DEAE-SEPHAROSE®-CL6B(PHARMACIA)-Säule (2,6 · 5 · 40 cm) fraktioniert.
- [0034] Die Elution erfolgte in einer Geschwindigkeit von 1,6 ml/min. zuerst mit Wasser, dann mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 bis 2 M). Die Elution wurde mit Hilfe eines konduktrimetrischen Detektors (IBF) verfolgt; die Fig. 2 zeigt ein Elutionsprofil.
- [0035] Zwei Fraktionen (EADREI1 und EADREI2), die dem Teil entsprechen, der durch Elution des NaCl-Gradienten bei Ionenstärken entsprechend 0,75 M NaCl bzw. 1,5 M NaCl erhalten wurde, wurden gesammelt.
- Die Charakteristika dieser Fraktionen sind in der folgenden Tabelle IV gezeigt. Die Gehalte an Uronsäure, Fucose, -SO&sub3;Na und Stickstoff sind in g/100 g angegeben, Mc ist in g/mol angegeben; die Anti-Koagulationseigenschaft ist in IE/mg ausgedrückt. TABELLE IV
- [0036] Die EADREI1-Fraktion, die bei schwacher Ionenstärke gesammelt wurde, zeigt einen erhöhten Gehalt an Uronsäuren und eine relativ schwache Anti-Koagulationsaktivität. Im Gegensatz dazu ist EADREI2 in Bezug auf Sulfatgruppen und Fucose reicher, und ihre Anti-Koagulationsaktivität ist stärker.
- [0037] Die DREA- und Q3-Fraktionen wurden beide, ausgehend von einer Rohfucan-EA-Präparation, erhalten.
- [0038] Die Fraktion DREA wurde durch das erfindungsgemäße radikalische Depolymerisationsverfahren unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen erhalten.
- [0039] Die Q3-Fraktion wurde durch saure Hydrolyse (H&sub2;SO&sub4; 1 N, 45ºC, 90 Minuten) von Rohfucan-EA erhalten.
- [0040] Die Charakteristika dieser Fraktionen sind in der folgenden Tabelle V angegeben. TABELLE V
Claims (6)
1) Verfahren zum Erhalt von sulfatierten
Polysacchariden durch radikalische Depolymerisation, dadurch
gekennzeichnet, daß man:
a) einem Volumen V1 eines Reaktionsgemisches,
umfassend ein Rohfucan aus Pheophyceen, in einer Konzentration
zwischen 5 mg/ml und 100 mg/ml und in Gegenwart eines
Metallkatalysators ein Volumen V2 einer Lösung aus
Wasserstoffperoxid in einer Konzentration zwischen 5% und 30% zusetzt,
wobei die Zusetzung kontinuierlich unter Rühren für 0,5 Stunden
bis 10 Stunden mit einer Zugabemenge pro Minute zwischen
V1/1000 und V1/10 erfolgt, und das Reaktionsgemisch bei einem
pH-Wert zwischen 6 und 8 durch kontinuierliche Zugabe von
Natronlauge und bei einer Temperatur zwischen 40 und 70ºC
gehalten wird,
b) man die aus dieser Depolymerisation hervorgehenden
Polysaccharide isoliert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Rohfucan in dem Reaktionsgemisch in
einer Konzentration zwischen 10 mg/ml und 50 mg/ml vorhanden
ist.
3) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung aus
Wasserstoffperoxid in einer Konzentration zwischen 5% und 20%
und in einer Menge zwischen V1/50 und V1/500 verwendet.
4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß der Metallkatalysator in
dem Reaktionsgemisch in einer Konzentration zwischen 0,01 und
0,1 M vorhanden ist.
5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß es weiterhin eine Stufe der
Ionenaustauschchromatographie umfaßt, die entweder vor oder
nach der radikalischen Depolymerisation durchgeführt werden
kann und an deren Ende die Fraktion isoliert wird, die, wenn
die Chromatographie über eine DEAE-Sepharose-CL6B-Säule
durchgeführt wird, bei einer Ionenstärke entsprechend einer
NaCl-Konzentration über 0,8 M, bevorzugt über 1 M, eluiert
wird.
6) Polysaccharidfraktion mit einer Molmasse von
kleiner oder gleich 10000 g/mol, dadurch
gekennzeichnet, daß sie durch das radikalische
Depolymerisationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhalten werden kann.
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