DE69534895T2 - Polynukleotide enthaltende mittel - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen von Poly(Nucleinsäure)Polymeren, wie bspw. RNA- oder DNA-Polymere, und Block-Copolymere von Alkylethern. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Poly(Nucleinsäuren) mit einem Polykation komplexiert. Die Poly(Nucleinsäure) wird durch den Komplex stabilisiert und in dem Komplex wird die Permeabilität durch Zellmembranen erhöht. Folglich sind die Komplexe gut zur Verwendung als Vehikel geeignet, um Nucleinsäuren in das Innere von Zellen zu bringen.
  • Die Verwendung von „Gegensinn"-Poly(Nucleinsäuren) zur Behandlung von genetischen Krankheiten, Zellmutationen (einschließlich Krebs-verursachende oder -fördernde Mutationen) und viralen Infektionen hat weit reichende Aufmerksamkeit erlangt. Für dieses Behandlungswerkzeug wird angenommen, dass es auf der einen Seite durch Bindung an „Sinn"-Stränge von mRNA wirkt, die für ein Protein codieren, für das vermutet wird, dass dieses in die Entstehung des zu behandelnden Krankheitsstatus involviert ist, wodurch die Translation der mRNA in das unerwünschte Protein gestoppt oder inhibiert wird. Auf der anderen Seite zielt die Bindung der Gegensinn-Polynucleotide auf die genomische DNA ab (wodurch eine Triple-Helix gebildet wird), um bspw. die Transkription zu inhibieren. Vergleiche Helene, Anti-Cancer Drug Design, 6:569 (1991). Nachdem die Sequenz der zu bindenden mRNA bekannt ist, kann ein Gegensinn-Molekül konstruiert werden, das an den Sinn-Strang durch die Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung bindet; eine Duplexstruktur analog zu der DNA-Doppelhelix wird gebildet; Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA, Erikson und Ixzant, Hrsg., Raven Press, New York, 1991; Helene, Anti-Cancer Drug Design, 6:569 (1991); Crooke, Anti-Cancer Drug Design, 6:809. Eine große Hürde, um diese Technologie voll zu nutzen, betrifft das Problem, in die Zellen wirksam eine ausreichende Anzahl von Gegensinn-Molekülen einzubringen, um wirksam mit der Translation der Ziel-mRNA oder der Funktion der DNA zu interferieren.
  • Bei einem Verfahren, das genutzt wird, um dieses Problem zu bewältigen, wird das 5'- oder das 3'-Ende des Gegensinn-Poly(Nucleinsäure)-Moleküls mit hydrophoben Substituenten kovalent modifiziert. Diese modifizierten Nucleinsäuren bewirken im Allgemeinen den Zugang zu dem Inneren der Zelle mit größerer Effizienz. Siehe z.B. Kabanov et al., FEBS Lett., 259:327 (1990); Boutorin et al., FEBS Lett., 23:1382-1390, 1989; Shea et al., Nucleic Acids Res., 18:3777-3783, 1990. Zusätzlich wurde das Phosphatrückgrat der Gegensinn-Moleküle modifiziert, um die negative Ladung zu entfernen (siehe bspw. Agris et al., Biochemistry, 25:6268 (1986); Cazenave und Helene in Antisense Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications, Mol und Van der Krol, Hrsg., Seite 47 ff., Marcel Dekker, New York, 1991), oder es wurden die Purin- oder Pyrimidinbasen modifiziert (siehe z.B. Antisense Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications, Mol und Van der Krol, Hrsg., Seite 47 ff., Marcel Dekker, New York, 1991; Milligan et al. in Gene Therapy For Neoplastic Diseases, Huber und Laso, Hrsg., Seite 228 ff., New York Academy of Sciences, New York, 1994). Andere Ansätze, um die Hürde betreffend die Zellpenetration zu bewältigen, umfassen das Einbringen der Gegensinn-Poly(Nucleinsäure)-Sequenz in einen Expressionsvektor, der in niedriger Kopienzahl in die Zelle eingebracht werden kann, der jedoch, wenn in der Zelle vorhanden, die zelluläre Maschinerie auf die verstärkte Synthese von beträchtlichen Mengen von Gegensinn-Polynucleinmolekülen ausrichten kann. Siehe bspw. Farhood et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 716:23 (1994). Diese Strategie beinhaltet die Verwendung von rekombinanten Viren, die eine Expressionsstelle aufweisen, in die die Gegensinn-Sequenz inkorporiert wurde. Siehe bspw. Boris-Lawrie und Temin, Ann. N.Y. Acad. Sci., 716:59 (1994).
  • Andere haben versucht, die Membranpermeabilität durch Neutralisieren der negativen Ladungen auf den Gegensinn-Molekülen oder anderen Nucleinsäuremolekülen mit Polykationen zu erhöhen. Siehe bspw. Kabanov et al., Soviet Scientific Reviews, Vol. 1, Teil 2, 1992; Kabanov et al., Bioconjugate Chemistry, 4:448 (1993); Wu und Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Behr et al., Proc. Natl. Acad Sci U.S.A., 86:6982-6986, 1989.
  • Es versteht sich, dass die Gegensinn-Poly(Nucleinsäure)-Moleküle nicht die einzige Art von Poly(Nucleinsäure)-Molekülen ist, die nutzbringend für zelluläre Membranen permeabler gemacht werden kann. Um Expressionssysteme für rekombinantes Protein zu schaffen, muss die Expressions-steuernde Nucleinsäure durch die Membran und in die eukaryotische oder prokaryotische Zelle transportiert werden, die das gewünschte Protein produzieren soll. Für die Gentherapie versuchen Mediziner in eine oder mehrere Zelltypen eines Organismus einen DNA-Vektor einzubringen, der in der Lage ist, die Synthese auf ein Protein auszurichten, das der Zelle fehlt oder das für die Zelle oder den Organismus nützlich ist, wenn es in größeren Mengen exprimiert wird. Die Verfahren zum Einbringen von DNA, um zu bewirken, dass eine Zelle ein neues Protein, Ribozym oder eine größere Menge eines Proteins oder Ribozyms produziert, werden „Transfektions"-Verfahren genannt. Siehe allgemein Neoplastic Diseases, Huber und Lazo, Hrsg., New York Academy of Science, New York, 1994; Feigner, Adv. Drug Deliv. Rev., 5:163 (1990); McLachlin, et al., Progr. Nucl. Acids Res. Mol. Biol., 38:91 (1990); Karlsson, S. Blood, 78:2481 (1991); Einerhand und Valerio, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 177:217-235 (1992); Makdisi et al., Prog. Liver Dis., 10:1 (1992); Litzinger und Huang, Biochim. Biophys. Acta, 1113:201 (1992); Morsy et al., J.A.M.A., 270:2338 (1993); Dorudi et al., British J. Surgery, 80:566 (1993).
  • Einige der oben diskutierten Verfahren zur Erhöhung der Zellpenetration durch Gegensinn-Poly(Nucleinsäuren) sind allgemein anwendbare Verfahren, bei denen eine Vielzahl von Poly(Nucleinsäuren) in Zellen eingebracht wird. Andere allgemeine Verfahren beinhalten die Calciumphosphatpräzipitation von Poly(Nucleinsäuren) und Inkubation mit Zielzellen (Graham und Van der Eb, Virology, 52:456, 1983), die Co-Inkubation von Po ly(Nucleinsäuren), DEAE-Dextran und Zellen (Sompayrac und Danna, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575, 1981), Elektroporation von Zellen in Gegenwart von Poly(Nucleinsäuren) (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:7161-7165, 1984), das Einbringen von Nucleinsäure in Virushüllen, um Transfektionsvehikel zu schaffen (Gitman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:7309-7313, 1985), und das Inkubieren von Zellen mit Poly(Nucleinsäure), die in Liposomen eingebracht wurde (Wang und Huang, Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7851-7855, 1987).
  • Ein weiteres Problem der Zufuhr von Poly(Nucleinsäure) in eine Zelle betrifft die extreme Empfindlichkeit von Poly(Nucleinsäuren), insbesondere Ribonucleinsäuren, gegenüber Nucleaseaktivität. Dieses Problem betrifft insbesondere Bemühungen, Ribonucleinsäuren als Gegensinn-Oligonucleotide zu verwenden. Dementsprechend ist es wünschenswert, Verfahren zum Schutz von Poly(Nucleinsäure) gegenüber Nucleaseaktivität bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung wird unten unter Bezugnahme auf die Fragmentkonstanten beschrieben, die von Hansch und Leo entwickelt wurden. Siehe Hansch und Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, New York, Seiten 320–325. Diese Konstanten wurden dazu entwickelt, um den Beitrag eines Teils eines Moleküls zu der Neigung des Moleküls abzuschätzen, sich zwischen den Phasen zu verteilen, die von Octanol-Wasser-Mischungen gebildet werden. Diese Konstanten werden im Allgemeinen als Hansch-Leo-Fragmentverteilungskon stanten bezeichnet (hier im Folgenden „Hansch-Leo-Fragmentkonstanten").
  • Die Erfindung betrifft in einer ersten Ausführungsform eine Polynucleotidzusammensetzung, die Folgendes aufweist, nämlich:
    • (a) ein Polynucleotid oder Derivat; und
    • (b) weniger als 5 % (w/v) eines Polyether-Block-Copolymers, das ein A-Typ-Segment und B-Typ-Segment aufweist, wobei das A-Typ-Segment ein lineares Polymersegment mit relativ hydrophilem Charakter aufweist, dessen sich wiederholende Einheiten zu einer durchschnittlichen Hansch-Leo-Fragmentkonstante von –0,4 oder weniger beitragen, und Molekulargewichtsbeiträge von 30 bis 500 haben, wobei das B-Typ-Segment ein lineares Polymersegment von relativ hydrophobem Charakter aufweist, dessen sich wiederholende Einheiten zu einer durchschnittlichen Hansch-Leo-Fragmentkonstante von –0,4 oder mehr beitragen und Molekulargewichtsbeiträge von 30 bis 500 haben, wobei zumindest 80 % der Bindungen, die die sich wiederholenden Einheiten für jedes der Polymersegmente verbinden, eine Etherbindung aufweisen; wobei (i) die Zusammensetzung kein Gel bildet; und (ii) die Zusammensetzung Micellen mit einem Durchmesser von 10 nm bis 100 nm bildet. In einer bevorzugten ersten Ausführungsform ist das Block-Copolymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymeren der Formeln
      Figure 00060001
      wobei A und A' lineare A-Typ-Polymersegmente sind, B und B' lineare 8-Typ-Polymersegmente, und R1, R2, R3 und R4 entweder Block-Copolymere der Formeln (I), (II) oder (III) oder Wasserstoff sind, und L eine Bindungsgruppe ist, mit der Maßgabe, dass nicht mehr als zwei der Reste R1, R2, R3 oder R4 Wasserstoff sind. In einer weiteren bevorzugten ersten Ausführungsform der Erfindung weist die Polynucleotidzusammensetzung ferner ein polykationisches Polymer auf, das eine Vielzahl von kationischen, sich wiederholenden Einheiten aufweist.
  • Die Zusammensetzung stellt ein effizientes Vehikel bereit, um Polynucleotide in eine Zelle einzubringen. Dementsprechend betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zum Einbringen einer Poly(Nucleinsäure) in Zellen, bei dem die Polynucleotidzusammensetzung gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung verwendet wird.
  • Polymere der Formeln (I), (II), (III) oder (IV) können auch miteinander oder entweder zusätzlich oder alternativ mit einem oder mehreren der Polymere der Formeln (V-a oder b), (VI-a oder b), (VII-a oder b) und (VIII-a oder b) und/oder mit Polynucleotidderivaten der Formeln (IX-a, b, c oder d), (XI), (XII) oder (XIII), wie durch die folgende Formel definiert, gemischt werden, um ein effizientes Vehikel zum Befördern von Poly(Nucleinsäure) in das Innere von Zellen bereitzustellen:
    Figure 00070001
    wobei A, A' und B wie oben beschrieben definiert sind, wobei R und R' Polymersegmente sind, die eine Vielzahl von kationischen, sich wiederholenden Einheiten aufweisen, wobei jede kationische, sich wiederholende Einheit in einem Segment gleich oder zu einer anderen Einheit in dem Segment unterschiedlich sein kann. Die Polymere gemäß diesem Aspekt können als „Polyether/Polykation"-Polymere bezeichnet werden. Die R- und R'-Blöcke können als „R-Typ"-Polymersegmente oder -Blöcke bezeichnet werden; und
    Figure 00080001
    wobei pN ein Polynucleotid mit einer 5'-nach-3'-Orientierung darstellt und A, A', B und B' Polyethersegmente sind, wie oben beschrieben.
  • Vorzugsweise weisen solche Polynucleotidderivate ein Polynucleotidsegment, ein R-Typ-Segment und zumindest ein A-Typ- oder ein B-Typ-Segment auf.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das Polykationpolymer ein Polyether-Polykation-Copolymer auf, das ein Polymer, ein Polyethersegment und ein Polykationsegment aufweist, das eine Vielzahl von kationischen, sich wiederholen den Einheiten der Formel -NH-R0 aufweist, wobei R0 eine geradkettige aliphatische Gruppe von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, die substituiert sein kann, wobei die Polyethersegmente zumindest ein A-Typ- oder B-Typ-Segment aufweisen. Gemäß einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform weist das Polykationpolymer ein Polymer gemäß der folgenden Formeln auf, nämlich:
    Figure 00090001
    wobei A, A' und B wie oben beschrieben definiert sind, wobei R und R' Polymersegmente sind, die eine Vielzahl von kationischen, sich wiederholenden Einheiten der Formel -NH-R0- aufweisen, wobei R0 eine geradkettige aliphatische Gruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, die substituiert sein kann. Jede sich wiederholende Einheit -NH-R0- in einem R-Typ-Segment kann gleich sein oder gegenüber einer anderen sich wiederholenden Einheit -NH-R0- in dem Segment verschieden sein.
  • In einer weiteren Ausführungsform weist das polykationische Polymer eine Vielzahl von sich wiederholenden Einheiten der Formel:
    Figure 00090002
    auf, wobei R8 Folgendes ist, nämlich:
    • (1) -(CH2)n-CH(R13)-, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, und R13 Wasserstoff, Cycloalkyl mit 3–8 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen oder (CH2)mR14 ist, wobei m eine ganze Zahl von 0 bis etwa 12 ist, und R14 ein lipophiler Substituent mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen ist;
    • (2) eine carbocyclische Gruppe mit 3–8 Ringkohlenstoffatomen, wobei die Gruppe bspw. Cycloalkyl oder aromatische Gruppen sein kann, wobei ein Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino beinhaltet, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome, Amino-, Sulfonyl-, Hydroxy-, Carboxy-, Fluoro- oder Chlorosubstituenten aufweist; oder
    • (3) eine heterocyclische Gruppe mit 3–8 Ringatomen, die Heterocycloalkyl oder heteroaromatische Gruppen beinhalten kann, die 1–4 Heteroatome beinhalten können, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Mischungen hieraus, und die ein Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Amino, Sulfonyl, Hydroxy, Carboxy, Fluoro- oder Chlorosubstituenten beinhalten könnten.
  • R9 ist eine geradkettige aliphatische Gruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, und R10, R11 und R12 sind unabhängig Wasserstoff, eine Alkylgruppe von 1–4 Kohlenstoffatomen. R9 weist vorzugsweise 2–10, weiter bevorzugt 3–8 Kohlenstoffatome auf. R14 beinhaltet vorzugsweise eine interkalierende Gruppe, die vor zugsweise eine Acridin- oder Ethidiumbromidgruppe ist. Die Anzahl solcher sich wiederholender Einheiten in dem Polymer beträgt vorzugsweise 3 bis 50, weiter bevorzugt 5 bis 20. Diese Polymerstruktur kann in weitere Ausführungsformen der Erfindung als ein R-Typ-Segment oder ein polykationisches Polymer inkorporiert werden. Die Enden dieses Polymers können mit einem Lipidsubstituenten modifiziert sein. Die Monomere, die dazu verwendet werden, um Polymere dieser Ausführungsform zu synthetisieren, sind dazu geeignet, um als Monomere in einen DNA-Synthesizer eingespeist zu werden, wie unten beschrieben. Folglich kann das Polymer sehr spezifisch synthetisiert werden. Ferner kann die zusätzliche Inkorporation von Polynucleotidsequenzen, Polyetherblöcken und lipophilen Substituenten durch Verwendung der modernen Automation erfolgen, die für Polynucleotidsynthesen entwickelt wurde. Diese Ausführungsform umfasst ebenso dieses Verfahren zur Synthese eines polykationischen Polymers.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Der Polymerisationsgrad der hydrophilen (A-Typ)-Blöcke oder der hydrophoben (B-Typ)-Blöcke der Formeln (I)–(XIII) kann vorzugsweise bei 5 bis 400 liegen. Weiter bevorzugt liegt der Polymerisationsgrad bei 5 bis 200, noch mehr bevorzugt bei 5 bis 80. Der Polymerisationsgrad der R-Typ-Polykationblöcke kann vorzugsweise bei 2 bis 300 liegen. Weiter bevorzugt liegt der Polymerisationsgrad bei 5 bis 180, und noch mehr bevorzugt bei 5 bis 60. Der Polymerisationsgrad des polykationischen Polymers kann vorzugsweise bei 10 bis 10.000 liegen. weiter bevorzugt liegt der Polymerisationsgrad bei 10 bis 1.000, noch mehr bevorzugt bei 10 bis 100.
  • Die sich wiederholenden Einheiten, die die Blöcke aufweisen, haben für die A-Typ-, B-Typ- und R-Typ-Blöcke im Allgemeinen ein Molekulargewicht, das bei 30 bis 500, vorzugsweise bei 30 bis 100, und noch mehr bevorzugt bei 30 bis 60 liegt. Im Allgemeinen sind in jedem der A-Typ- oder B-Typ-Blöcke zumindest 80 % der Bindungen zwischen den sich wiederholenden Einheiten Etherbindungen, vorzugsweise sind zumindest 90 % Etherbindungen, weiter bevorzugt sind zumindest 95 % Etherbindungen. Etherbindungen umfassen für die Zwecke dieser Anmeldung glycosidische Bindungen (d.h. Zuckerbindungen). Gemäß einem Aspekt sind jedoch einfache Etherbindungen bevorzugt.
  • Vorzugsweise haben alle sich wiederholenden Einheiten, die A-Typ-Blöcke aufweisen, eine Hansch-Leo-Fragmentkonstante von kleiner als –0,4, weiter bevorzugt von kleiner als –0,5, und noch mehr bevorzugt von kleiner als –0,7. Vorzugsweise haben alle sich wiederholende Einheiten, die B-Typ-Blöcke aufweisen, eine Hansch-Leo-Fragmentkonstante von –0,30 oder mehr, weiter bevorzugt von –0,20 oder mehr.
  • Die Polynucleotidkomponente (pN) der Formeln (IX) bis (XIII) weist vorzugsweise 5 bis 1.000.000 Basen, weiter bevorzugt 5 bis 100.000 Basen, noch mehr bevorzugt 10 bis 10.000 Basen auf.
  • Die polykationischen Polymere und die R-Typ-Blöcke haben einige positiv ionisierbare Gruppen und eine positive Nettoladung bei physiologischem pH. Die Polyether/Polykationen-Polymere der Formeln (V)–(VIII) können auch als polykationische Polymere dienen. Vorzugsweise weisen die polykationischen Polymere und R-Typ-Blöcke zumindest 3 positive Ladungen, weiter bevorzugt zumindest 6, und noch mehr bevorzugt zumindest 12 positive Ladungen bei physiologischem pH auf. Ebenfalls bevorzugt sind Polymere oder Blöcke, die bei physiologischem pH positive Ladungen mit einem ungefähren Abstand zwischen den Ladungen von 3 Å bis 10 Å aufweisen. Am meisten ist bevorzugt, wenn die Abstände durch sich wiederholenden Einheiten von Aminopropylen, oder durch sich wiederholenden Einheiten von Mischungen aus Aminopropylen und Aminobutylen geschaffen werden. Dementsprechend sind polykationische Segmente, die eine sich wiederholende Einheit (NHCH2CH2CH2) oder eine Mischung aus sich wiederholenden Einheiten (NHCH2CH2CH2) und (NHCH2CH2CH2CH2) verwenden, bevorzugt.
  • Polyether/Polykationpolymere der Formeln (V)–(VIII), die eine sich wiederholende Einheit -NH-R0- aufweisen, sind ebenfalls bevorzugt. R0 ist vorzugsweise ein Ethylen, Propylen, Butylen oder Pentylen, das modifiziert sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet in zumindest einer der sich wiederholenden Einheiten R0 eine DNA-interkalierende Gruppe, wie bspw. eine Ethidiumbromidgruppe. Solche interkalierenden Gruppen können die Affinität des Polymers zu einer Nucleinsäure erhöhen. Bevorzugte Substitutionen an R0 umfassen ein Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffen, Hydroxy, Hydroxyalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, eine Alkylcarbonylgruppe mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl, wobei das Alkoxy 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkoxycarbonylalkyl, wobei das Alkoxy und Alkyl jeweils unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkylcarboxyalkyl, wobei jede Alkylgruppe 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Aminoalkyl, wobei die Alkylgruppe 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkylamino oder Dialkylamino, wobei jede Alkylgruppe unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Chloro, Chloroalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Fluoro, Fluoroalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Cyano oder Cyanoalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Carboxylgruppe. Weiter bevorzugt ist R0 ein Propylen oder Butylen.
  • Polymere gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung werden beispielhaft durch die Block-Copolymere dargestellt, die die folgenden Formeln aufweisen:
    Figure 00140001
    oder
    Figure 00140002
    oder
    Figure 00150001
    oder
    Figure 00150002
    in denen x, y, z, i und j Werte von 5 bis 400 haben, vorzugsweise von 5 bis 200, weiter bevorzugt von 5 bis 80, und wobei für jedes R1-, R2-Paar gilt, dass eines Wasserstoff und das andere eine Methylgruppe ist. Die Formeln (XIV) bis (XVI) sind insofern grob vereinfacht, als dass in der Praxis die Orientierung der Isopropylenradikale innerhalb des B-Blockes zufällig ist. Diese zufällige Orientierung ist in der Formel (XVII) angegeben, die vollständiger ist. Solche Poly(oxyethylen)-Poly(oxypropylen)-Verbindungen wurden beschrieben von Santon, Am. Perfumer Cosmet., 72(4):54-58 (1958); Schmolka, Loc. cit. 82(7):25-30 (1967); Non-ionic Surfectents, Schick, Hrsg. (Dekker, NY, 1967), Seiten 300–371. Einige dieser Verbindungen sind unter solchen generischen Handelsnamen kommerziell verfügbar, wie „Poloxamers", „Pluronics" und „Synperonics". Pluronische Polymere innerhalb der B-A-B-Formel werden oft als „revertierte" Pluronics, „Pluronic R" oder „Meroxapol" bezeichnet. Das „Polyoxamin"-Polymer der Formel (XVII) ist bei BASF (Wyandotte, MI) unter dem Handelsnamen TetronicTM erhältlich. Die Reihenfolge der Polyoxyethylen- und Polyoxypropylen-Blöcke, die in der Formel (XVII) dargestellt ist, kann umgedreht werden, wodurch Tetronic RTM hergestellt wird, das ebenfalls bei BASF erhältlich ist. Siehe Schmolka, J. Am. Oil Soc., 59:110 (1979). Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Block-Copolymere können auch mit hydrophilen Blöcken konstruiert werden, die eine zufällige Mischung aus sich wiederholenden Einheiten von Ethylenoxid und Propylenoxid aufweisen. Um den hydrophilen Charakter des Blocks zu erhalten, überwiegt Ethylenoxid. Gleichermaßen kann der hydrophobe Block eine Mischung aus sich wiederholenden Einheiten von Ethylenoxid und Propylenoxid sein. Solche Block-Copolymere sind bei BASF unter dem Handelsnamen PluradotTM erhältlich.
  • Das Diamin-gekoppelte Pluronic der Formel (XVII) kann ebenfalls ein Mitglied der Familie der Diamin-gekoppelten Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polymere der Formel
    Figure 00160001
    sein, wobei die gestrichelten Linien symmetrische Kopien des Polyethers repräsentieren, die sich weg von dem zweiten Stickstoff erstrecken, R* ein Alkylen mit 2–6 Kohlenstoffen, ein Cycloalkylen mit 5–8 Kohlenstoffen oder Phenylen ist, wobei für R1 und R2 Folgendes gilt, nämlich dass entweder (a) beide Reste Wasserstoff sind, oder (b) ein Rest Wasserstoff und der andere Rest Methyl ist, wobei im Falle, dass sowohl R3 als auch R4 Wasserstoff sind, ein Rest von R5 und R6 Wasserstoff und der andere Rest Methyl ist, und, für den Fall, dass ein Rest von R3 und R4 Methyl ist, dann beide Reste von R5 und R6 Wasserstoff sind.
  • Für einen Fachmann wird im Lichte der hier geführten Diskussion ersichtlich, dass, selbst wenn die Ausführung der Erfindung auf bspw. Poly(oxyethylen)-Poly(oxypropylen)-Verbindungen beschränkt wird, die obigen beispielhaften Formeln zu einschränkend sind. Ein wichtiges Merkmal ist, dass die durchschnittliche Hansch-Leo-Fragmentkonstante der Monomere in einem A-Typ-Block –0,4 oder weniger beträgt.
  • Demnach müssen die Einheiten, die den ersten Block bilden, nicht ausschließlich aus Ethylenoxid bestehen. Gleichermaßen muss nicht der gesamte B-Typ-Block ausschließlich aus Propylenoxideinheiten bestehen. Anstelle dessen können die Blöcke andere Monomere als jene beinhalten, die in den Formeln (XIV) bis (XVII) definiert sind, solange die Parameter der ersten Ausführungsform eingehalten werden. Demnach kann im einfachsten Fall zumindest eines der Monomere in Block A mit einer wie zuvor beschriebenen Seitenkettengruppe substituiert sein.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Polynucleotidkomplex, der ein Block-Copolymer mit zumindest einer der Formeln (I) bis (XIII) aufweist, wobei der A-Typ- und B-Typ-Block im Wesentlichen aus sich wiederholenden Einheiten der Formel -O-R5 besteht, wobei R5 Folgendes ist, nämlich:
    • (1) -(CH2)n-CH(R5)-, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist und R5 Wasserstoff ist oder Cycloalkyl mit 3–8 Kohlenstoff atomen, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoff atomen, Phenyl, Alkylphenyl, wobei der Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Hydroxy, Hydroxyalkyl, wobei der Alkylrest 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl, wobei der Alkoxy 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkoxycarbonylalkyl, wobei der Alkoxy und Alkyl jeweils unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkylcarboxyalkyl, wobei jede Alkylgruppe 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Aminoalkyl, wobei die Alkylgruppe 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkylamin oder Dialkylamino, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Mono- oder Di-Alkylaminoalkyl, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Chloro, Chloroalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Fluoro, Fluoroalkyl, wobei der Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Cyano oder Cyanoalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, oder Carboxyl;
    • (2) eine Carboxylgruppe mit 3–8 Ringkohlenstoffatomen, wobei die Gruppe bspw. Cycloalkyl- oder aromatische Gruppen sein kann und welche ein Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylamino mit 1–6 Kohlenstoff atomen, Dialkylamino beinhalten kann, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Amino-, Sulfonyl-, Hydroxy-, Carboxy-, Fluoro- oder Chlorosubstitutionen, oder
    • (3) eine heterocyclische Gruppe mit 3–8 Ringatomen, die Heterocycloalkyl- oder heteroaromatische Gruppen beinhalten kann, die 1–4 Heteroatome beinhalten können, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Mischungen hieraus, und die ein Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino enthalten kann, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Amino-, Sulfonyl-, Hydroxy-, Carboxy-, Fluoro- oder Chlorosubstitutionen.
  • Vorzugsweise ist n eine ganze Zahl von 1 bis 3. Die carbocyclischen oder heterocyclischen Gruppen, die R5 aufweisen, weisen vorzugsweise 4–7 Ringatome, weiter bevorzugt 5–6 auf. Heterocyclen beinhalten vorzugsweise 1–2 Heteroatome, weiter bevorzugt weisen die Heterocyclen ein Heteroatom auf. Vorzugsweise ist der Heterocyclus ein Kohlenhydrat oder ein Kohlenhydratanalogon. Für einen Fachmann ist ersichtlich, dass die Monomere, die erforderlich sind, um diese Polymere herzustellen, in synthetischer Form verfügbar sind. In einigen Fällen erfordert die Polymerisierung der Monomere die Verwendung von geeigneten Schutzgruppen, was von einem Fachmann erkannt werden wird. Im Allgemeinen weisen die A- und B-Typ-Blöcke zumindest 80 % sich wiederholende Einheiten -OR5- auf, weiter bevorzugt zumindest 90 %, und noch mehr bevorzugt zumindest 95 %.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Polynucleotidkomplex, der ein Block-Copolymer aufweist, mit einer der Formeln (I) bis (XIII), wobei der A-Typ- und B-Typ-Block im Wesentlichen aus sich wiederholenden Einheiten der Formel -O-R7- besteht, wobei R7 eine C1 bis C6-Alkylgruppe ist.
  • Die Hansch-Leo-Schätzung des Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (P) für ein organisches Molekül wird über die folgende Formel berechnet: Log P = Σanfn + ΣbmFm wobei die fn-Werte den Fragmentkonstanten für die verschiedenen Gruppen in dem Molekül sind, die an-Werte der Anzahl eines beliebigen Gruppentyps in dem Molekül, die Fm-Werte den Faktoren für bestimmte molekulare Eigenschaften, wie bspw. Einzelbindungen oder Doppelbindungen, und die bm-Werte der Anzahl von beliebigen solchen molekularen Eigenschaften entsprechen. Z.B. wäre die Hansch-Leo-Fragmentkonstante für eine sich wiederholende Ethylenoxideinheit (-CH2CH2O-) die Folgende: 2fC + 4fH + fO + (4 – 1)Fb = 2(0,20) + 4(0,23) + (–1,82) + 3(–0,12) = –0,86
  • Die Hansch-Leo-Fragmentkonstante für eine sich wiederholende Propylenoxideinheit (-CH2CHCH3)O-) wäre die Folgende: 2fC + fCH3 + 3fH + fO(4 – 1)Fb = 2(0,2) + 0,89 + 3(0,23) + (–1,82) + 3(–0,12) = –0,2
  • Für einen Fachmann versteht sich, dass der Hansch-Leo-Ansatz zum Schätzen der Verteilungskonstanten, in dem die Hansch-Leo-Fragmentkonstanten verwendet werden, nicht zu der genauen empirischen Verteilungskonstante führt. Siehe Hansch und Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, New York, 1979; James, Solubility and Related Properties, Marcel Dekker, New York, 1986, Seiten 320–325. Allerdings ist der Ansatz genau genug, um die Hydrophobizitätseigenschaften des polymeren Zufuhrvehikels zu definieren.
  • Bei der Poly(Nucleinsäure)-Verbindung der Zusammensetzung kann es sich um eine große Vielfalt von Poly(Nucleinsäure)-Molekülen handeln. Diese beinhalten natürliche und synthetische DNA- oder RNA-Moleküle und Nucleinsäuremoleküle, die kovalent modifiziert wurden (um Gruppen zu inkorporieren, einschließlich lipophile Gruppen, photoinduzierte quervernetzende Gruppen, alkylierende Gruppen, organometallische Gruppen, interkalierende Gruppen, lipophile Gruppen, Biotin, fluoreszierende und radioaktive Gruppen, und Gruppen, die das Phosphatrückgrat modifizieren). Solche Nucleinsäuremoleküle, können, u.a., Gegensinn-Nucleinsäuremoleküle, Gen-codierende DNA (üblicherweise einschließlich einer geeigneten Promotor-Sequenz), Ribozym-Oligonucleotid-α-Anomere, Ethylphosphotriester-Analoga, Alkylphosphomate, Phosphorothionat- und Phosphorodithionatoligonucleotide und dergleichen sein. In der Tat kann die Nucleinsäurekomponente eine beliebige Nucleinsäure sein, die vorteilhafterweise in eine Zelle mit größerer Effizienz transportiert oder gegenüber degradierenden Vorgängen stabilisiert oder hinsichtlich ihrer Bioverteilung nach der Verabreichung an ein Tier verbessert werden kann.
  • Beispiele von nützlichen Polymeren gemäß den Formeln (V) bis (VIII) beinhalten das Poly(oxyethylen)-poly-(L-lysin)-Diblock-Copolymer der folgenden Formel:
    Figure 00220001
    wobei i eine ganze Zahl von 5 bis 100 ist, und j eine ganze Zahl von 4 bis 100 ist. Ein zweites Beispiel ist das Poly(oxyethylen)-poly-(L-alanin-L-lysin)-Diblock-Copolymer der Formel:
    Figure 00220002
    wobei i eine ganze Zahl von 5 bis 100 ist, und j eine ganze Zahl von 4 bis 100 ist. Ein drittes Beispiel ist das Poly(oxyethylen)-poly(propylenimin/butylenimin)-Diblock-Copolymer der folgenden Formel:
    Figure 00220003
    wobei i eine ganze Zahl von 5 bis 200 ist, und j ist eine ganze Zahl von 1 bis 10. Ein viertes Beispiel ist das Poly(oxy ethylen)-poly(N-ethyl-4-vinylpyridinum-bromid)(„pOE-pEVP-Br") der Formel:
    Figure 00230001
    wobei i eine ganze Zahl von 5 bis 100 ist und j eine ganze Zahl von 10 bis 500 ist. Ein weiteres Beispiel ist das Polymer der Formel: CH3O-(CH2CH2O)iCO[(NH(CH2)3)2NH(CH2)4]j-(NH(CH2)3)2-NHCO-O-(CH2CH2O)k-CH3 (XXII),wobei i eine ganze Zahl von 10 bis 200 ist, j ist eine ganze Zahl von 1 bis 8 und k ist eine ganze Zahl von 10 bis 200. Ein weiteres Beispiel ist das Polymer der Formel: H-Gj-(NH(CH2)3)2-N-NH-CO-O-(CH2CH2O)iCO-Gm-(NH(CH2)3)2-NH2 (XXIII),wobei „G" Folgendes aufweist, nämlich -(NH(CH2)3)3-CH2NH2-, i und j entsprechen der Definition für die Formel (XVIII) und m ist eine ganze Zahl von 1 bis 8.
  • Die in der Erfindung verwendeten Block-Copolymere bilden Micellen mit einem Durchmesser von 10 nm bis 100 nm. Micellen sind supramolekulare Komplexe aus bestimmten amphiphilen Molekülen, die sich in wässrigen Lösungen auf Grund von Mikrophasentrennung der nicht-polaren Anteile der Amphiphilen bilden. Micellen bilden sich, wenn die Konzentration für eine gegebene Temperatur eine kritische micellare Konzentration („CMC") erreichen, die für das Amphiphil charakteristisch ist. Solche Micellen beinhalten im Allgemeinen 10 bis 300 Block-Copolymere. Durch das Variieren der Größen der hydrophilen und hydrophoben Anteile des Block-Copolymers kann die Neigung der Copolymere, unter physiologischen Bedingungen Micellen zu bilden, variiert werden. Die Micellen haben einen dichten Kern, der durch die wasserunlöslichen, sich wiederholenden Einheiten der B-Blöcke und ladungsneutralisierten Nucleinsäuren gebildet wird, und eine hydrophile Hülle, die von den A-Blöcken gebildet wird. Die Micellen haben in Lösung Translations- und Rotationsfreiheit, und Lösungen, die Micellen enthalten, haben niedrige Viskosität, ähnlich wie Wasser. Die Micellenbildung findet typischerweise bei Copolymerkonzentrationen von 0,001 bis 5 % (w/v) statt. Im Allgemeinen ist die Konzentration von polykationischen Polymeren und Polynucleinsäure niedriger als die Konzentration von Copolymeren in den Polynucleotidzusammensetzungen, vorzugsweise zumindest zehnfach, weiter bevorzugt zumindest fünfzigfach niedriger.
  • Bei höheren Konzentrationen bilden einige der in der Erfindung verwendeten Block-Copolymere Gele. Diese Gele sind Viskosesysteme, in denen die Translations- und Rotationsfreiheit der Copolymermoleküle durch ein kontinuierliches Netzwerk von Interaktionen unter den Copolymermolekülen eingeschränkt ist. In den Gelen kann die Mikrosegregation der sich wiederholenden Einheiten des B-Blocks stattfinden oder auch nicht. Um die Formation von Gelen zu verhindern, liegen die Polymerkonzentrationen (sowohl für die Block-Copolymere als auch für die Polyether/Polykationen-Polymere) unterhalb von 5 %.
  • Wenn die Polynucleotidzusammensetzung kationische Komponenten beinhaltet, assoziieren die Kationen mit den Phosphatgruppen des Polynucleotids, neutralisieren die Ladung an den Phosphatgruppen und machen die Polynucleotidkomponente hydrophober. Die Neutralisierung wird vorzugsweise durch Kationen auf den R-Typ-Polymersegmenten oder auf den polykationischen Polymeren bereitgestellt. Die Phosphatladung kann jedoch auch durch chemische Modifikation oder durch Assoziation mit einem hydrophoben Kation neutralisiert werden, wie bspw. N-[1-(2,3-Dioleyloxy)-N,N'-3-methylammoniumchlorid]. Es wird vermutet, dass in wässriger Lösung die ladungsneutralisierten Polynucleotide zur Bildung von supramolekularen, micellenähnlichen Partikeln beitragen, die als „Polynucleotidkomplexe" bezeichnet werden können. Der hydrophobe Kern oder der Komplex weist die ladungsneutralisierten Polynucleotide und die B-Typ-Copolymerblöcke auf. Die hydrophile Hülle weist die A-Typ-Copolymerblöcke auf. Die Größe des Komplexes variiert von 10 nm bis 100 nm im Durchmesser. In bestimmten Zusammenhängen ist es zweckmäßig, den Komplex von nicht-inkorporierten Komponenten zu isolieren. Dies kann bspw. durch Gelfiltrations-Chromatographie erfolgen.
  • Das Verhältnis der Komponenten der Polynucleotidzusammensetzung ist ein wichtiger Faktor zur Optimierung der effektiven Transmembranpermeabilität der Polynucleotide in der Zusammen setzung. Dieses Verhältnis kann. identifiziert werden als das Verhältnis φ, welches das Verhältnis von positiv geladenen Gruppen zu negativ geladenen Gruppen in der Zusammensetzung bei physiologischem pH wiedergibt. Wenn φ < 1 ist, enthält der Komplex nicht-neutralisiertes Phosphat aus dem Polynucleotid. Es wird angenommen, dass die Abschnitte des Polynucleotides, die an die nicht-neutralisierten Ladungen angrenzen, einen Teil der Hülle eines Polynucleotidkomplexes ausmachen. Dementsprechend gilt, wenn φ > 1 ist, dann weist das polykationische Polymer oder R-Typ-Segment nicht-neutralisierte Ladungen auf und die nicht-neutralisierten Abschnitte falten sich derart, dass diese einen Teil der Hülle des Komplexes bilden. Im Allgemeinen variiert φ zwischen 0 (wo es keine kationischen Gruppen gibt) und 100, vorzugsweise rangiert φ von 0, 01 bis 50, weiter bevorzugt von 0,1 bis 20. φ kann variiert werden, um die Effizienz des Transmembrantransportes zu erhöhen, und, wenn die Zusammensetzung Polynucleotidkomplexe aufweist, um die Stabilität des Komplexes zu erhöhen. Variationen von φ können auch die Bioverteilung des Komplexes nach der Verabreichung in ein Tier beeinflussen. Das optimale φ hängt, u.a., (1) von dem Kontext ab, in dem die Polynucleotidzusammensetzung verwendet wird, (2) von den spezifischen verwendeten Polymeren und Oligonucleotiden, (3) von den Zellen oder Geweben, auf die abgezielt wird, und (4) von der Verabreichungsform.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird angenommen, dass die Fähigkeit des Konjugates, eine Micelle zu bilden, mit bestimmten wünschenswerten Eigenschaften korreliert, wie bspw. der Fähigkeit, sich in wässrigen und nicht-wässrigen Medien zu lösen, wobei die Lösungseigenschaften den Transmembrantransport fördern. Es wird angenommen, dass die Fähigkeit eines Block-Copolymers, Micellen bilden zu können, mit dem Vorhandensein von hydrophoben und hydrophilen Polymerblöcken korreliert. Hydrophobe Blöcke werden durch B-Typ-Blöcke und Polynucleotidsegmente, die ladungsneutralisiert sind, mit polykationischen Polymeren, R-Typ-Blöcken oder bestimmten hydrophoben nichtpolymere Kationen bereitgestellt. Hydrophile Blöcke werden durch A-Typ-Blöcke bereitgestellt und, zu einem gewissen Maß, durch Polynucleotidsegmente, die unvollständig durch solche ionischen Spezies neutralisiert sind, die Hydrophobizität verleihen. Die Block-Copolymere der Erfindung beinhalten vorzugsweise einen A-Typ-Block, der dazu dient, die Löslichkeit zu erhöhen und Interaktionen mit Nicht-Zielmolekülen und -Zellen zu reduzieren.
  • Unter manchen Umständen ist es wünschenswert, durch nicht-kovalente Bindung zielausrichtende Moleküle zu inkorporieren. Siehe z.B. Kabanov et al., J. Controlled Release, 22:141 (1992). Die zielausrichtenden Moleküle, die an die Zusammensetzung gebunden sein können, weisen typischerweise eine zielausrichtende Gruppe auf, die Affinität zu einer zellulären Stelle und eine hydrophobe Gruppe aufweist. Das zielausrichtende Molekül bindet spontan an den Polynucleotidkomplex und wird daran durch die hydrophobe Gruppe „verankert". Diese zielausrichtenden Addukte umfassen typischerweise 10 % oder weniger der Copolymere in einer Zusammensetzung.
  • In dem zielausrichtenden Molekül kann die hydrophobe Gruppe, u.a., eine Lipidgruppe, wie bspw. eine Fettacylgruppe, sein. Alternativ kann es ein Block-Copolymer oder ein anderes natürliches synthetisches Polymer sein. Die zielausrichtende Gruppe des zielausrichtenden Moleküls weist häufig einen Antikörper auf, typischerweise mit Spezifität für ein bestimmtes Zelloberflächenantigen. Es kann sich außerdem bspw. um ein Hormon handeln, das eine spezifische Interaktion mit einem Zelloberflächenrezeptor zeigt, oder um ein Medikament, das einen Zelloberflächenrezeptor hat. Bspw. können Glycolipide dazu dienen, um auf einen Polysaccharidrezeptor abzuzielen. Es ist zu erwähnen, dass das zielausrichtende Molekül an jeden beliebigen der hier identifizierten Polymerblöcke, einschließlich R-Typ-Polymerblöcke, und an die polykationischen Polymere gebunden sein kann. Die zielausrichtenden Moleküle können bspw. kovalent an die -OH-Endgruppen der Polymere der Formeln XVIII, XIX, XX und XXI, die -NH2-Endgruppen der Polymere der Formeln XVIII (vorzugsweise die ε-Aminogruppe des terminalen Lysyl-Restes), XX oder XXIII, oder die -COOH-Endgruppe der Polymere der Formeln XVIII und XIX gebunden sein. Festzuhalten ist, dass zielausrichtende Moleküle dazu verwendet werden können, um den intrazellulären Transport der Polynucleotidzusammensetzung zu fördern, bspw. den Transport zu dem Nucleus, bspw. durch Verwendung der fusogenen Peptide als zielausrichtende Moleküle, die beschrieben sind von Soukchareun et al., Bioconjugate Chem. 6, 43, 1995, oder von Arar et al., Bioconjugate Chem. 6, 43, 1995, von karyotypischen Peptiden oder anderen biospezifischen Gruppen, die einen ortsgerichteten Transport in eine Zelle vermitteln (insbesondere den Austritt aus Endosomen-Kompartimenten in das Cytoplasma oder den Transport zum Nucleus).
  • Die Polynucleotidkomponente der Zusammensetzung der Erfindung kann ein beliebiges Polynucleotid sein, sie ist jedoch vorzugsweise ein Polynucleotid mit zumindest 3 Basen, weiter bevorzugt mit zumindest 5 Basen. Die geeigneten Polynucleotide beinhalten virale Genome und Viren (einschließlich die virale Lipid- oder Proteinhülle). Viren sind besonders geeignet für eine Verwendung im Zusammenhang mit der ersten, dritten oder fünften Ausführungsform der Erfindung. Die Begriffe „Poly(Nucleinsäure)" und „Polynucleotid" werden austauschbar verwendet. Ein Oligonucleotid ist ein Polynucleotid. DNA und RNA sind Polynucleotide.
  • Ein Polynucleotidderivat ist ein Polynucleotid, das einen oder mehrere Teile aufweist, wobei (i) die Teile abgespalten, inaktiviert oder auf andere Weise transformiert sind, so dass das resultierende Material als ein Polynucleotid dienen kann, oder (ii) wobei durch das Teil nicht verhindert wird, dass das Derivat als ein Polynucleotid dient.
  • Polynucleotidfunktionen beinhalten eine oder mehrere der folgenden Funktionen: Bindung an ein anderes Polynucleotid, wodurch eine Transfektion erfolgt, reprimiert wird, Ausrichtung der Synthese eines Proteins, Inkorporation in eine RNA oder DNA oder ein Genom, Wirkung als ein Ribozym und dergleichen.
  • Bei dem Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Copolymer stehen die hydrophilen/hydrophoben Eigenschaften und die Eigenschaften des Block-Copolymers hinsichtlich der Bildung von Micellen bis zu einem bestimmten Maß in Bezug zu dem Wert des Verhältnisses n. Das Verhältnis n ist definiert wie folgt: n = (|B|/|A|) × (b/a) = (|B|/|A|) × 1,32, wobei |B| und |A| der Anzahl der sich wiederholenden Einheiten in den hydrophoben bzw. hydrophilen Blöcken des Copolymers entspricht, und b und a sind die Molekulargewichte für die jeweiligen, sich wiederholenden Einheiten. Der Wert von n liegt typischerweise bei 0,2 bis 9,0, weiter bevorzugt bei 0,2 bis 1,5. Wenn Mischungen von Block-Copolymeren verwendet werden, ist n das gewichtete Mittel von n für jedes beitragende Copolymer, wobei das Mitteln auf den Gewichtsanteilen der Komponenten-Copolymere basiert. Wenn andere Copolymere als Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Copolymere verwendet werden, können ähnliche Ansätze entwickelt werden, um die hydrophoben/hydrophilen Eigenschaften eines Mitgliedes der Klasse von Polymeren mit den Eigenschaften des anderen Mitglieds der Klasse in Bezug zu setzen.
  • Die Polynucleotidzusammensetzungen der Erfindung können oral, topisch, rektal, vaginal, über die Atemwege durch Verwendung eines Aerosols, oder parenteral, d.h. intramuskulär, subkutan, intraperitoneal oder intravenös verabreicht werden. Die Polynucleotidzusammensetzungen können allein verabreicht werden oder sie können mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten gemäß dem Standard in der pharmazeutischen Praxis verabreicht werden. Für die orale Verabreichungsform können die Polynucleotidzusammensetzungen in Form von Tabletten, Kapseln, Lutschtabletten, Pastillen, Pulvern, Sirups, Elixieren, wässrigen Lösungen und Suspensionen und dergleichen verwendet werden. Im Falle von Tabletten können Träger verwendet werden, die Lactose, Natriumcitrat und Salze der Phosphorsäure enthalten. Verschiedene Sprengmittel, wie bspw. Stärke, und Gleitmittel, wie bspw. Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk werden üblicherweise in Tabletten verwendet. Zur oralen Verabreichung in Kapselform sind nützliche Verdünnungsmittel Lactose und Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wässrige Suspensionen zur oralen Verwendung erforderlich sind, können die Polynucleotidzusammensetzungen mit Emulgatoren und suspendierenden Agenzien kombiniert werden. Sofern gewünscht, können bestimmte Süßstoffe und/oder Aromastoffe hinzu gegeben werden. Zur parenteralen Verabreichung werden üblicherweise sterile Lösungen des Konjugates hergestellt, und der pH der Lösungen wird passend eingestellt und gepuffert. Zur intravenösen Verwendung sollte die Konzentration der gelösten Substanz kontrolliert werden, um die Präparation isotonisch zu machen. Zur okularen Verabreichung können Salben oder Tropfenflüssigkeiten durch im Stand der Technik bekannte okulare Zufuhrsysteme zugeführt werden, wie bspw. durch Applikatoren oder Augentropfer. Solche Zusammensetzungen können Mukomimetika, wie bspw. Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Hydroxypropylmethylcellulose oder Poly(vinylalkohol), Konservierungsstoffe, wie bspw. Sorbinsäure, EDTA oder Benzylchroniumchlorid, und die üblichen Mengen von Verdünnungsmitteln und/oder Trägern beinhalten. Zur Lungenverabreichung werden die Verdünnungsmittel und/oder Träger danach ausgesucht, dass diese geeignet sind, die Bildung eines Aerosols zu ermöglichen.
  • Beispiel 1 – Transfektionseffizienzen – Komplex der ersten Ausführungsform
  • Bei diesem Experiment wird versucht, das Plasmid pβ-Gal in NIH-3T3-Zellen, eine Maus-mamory-Tumorzelllinie, einzubringen. Das Plasmid pβ-Gal weist das Plasmid pUC19 auf (zu beziehen bei dem Institut für Genbiologie, Russische Akademie der Wissenschaften), in das ein Hybrid einer eukaryotischen Transkripti onseinheit und eine E. coli-β-Galactosidase inkorporiert wurde. Mit diesem Plasmid kann die Effizienz der Zellaufnahme durch Messung der aus den behandelten Zellen extrahierbaren β-Galactosidaseaktivität gemessen werden. Das verwendete Copolymer war ein Triblock-Copolymer der Formel (XIV), wobei x + z 51 war und y war 39 (im Folgenden „Pluronic A"). Das verwendete Polykation war Poly(N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid) („pEVP-Br"). Eine Lösung mit 10 μg/ml von pβ-Gal (überwiegend „supercoiled") wurde in einer Lösung von PBS, enthaltend 10 mg/ml von Pluronic A und 45 μg/ml von pEVP-Br, hergestellt. Diese Mengen wurden berechnet, um ein Verhältnis von basischen Gruppen der Polykationen zu Plasmidphosphatgruppen von etwa 10 bereitzustellen. Das Verhältnis von Pluronic A zu DNA war etwa 104. Die Stammpräparation wurde filtersterilisiert und ein Teil wurde zehnfach mit serumfreien Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium („DMEM") verdünnt, so dass die Konzentration von pβ-Gal 1 μg/ml betrug. Die Lösung wurde bezeichnet als „Pluronic A-Transfektionsmedium".
  • Die NIH 3T3-Zellen wurden als Monolayerkultur bei 37°C unter 5 % CO2 wachsen gelassen, wobei ein DMEM-Medium enthaltend 2 mM Glutamin und 10 % fötales Kälberserum („FCS") verwendet wurde. Die Zellen wurden in Monolayerkultur wachsen gelassen, abgeschabt und für das Verfahrensprotokoll durch dreimaliges Waschen mit frischem Medium präpariert.
  • Aliquote der gewaschenen Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren transformiert werden sollten, wurden bei einer Konzentration von 106 Zellen/ml in Pluronic A-Transfektionsmedium suspendiert. Die suspendierten Zellen wurden für 2 Stun den bei 37°C und unter 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden dann mit frischem Medium gewaschen und erneut ausplattiert.
  • Aliquote der Zellen, die durch Calciumphosphatpräzipitation transfiziert werden sollten, wurden so transfiziert, wie dies von Promega aus Madison, Wisconsin, in ihrem Manuskript Profection Mammalian Transfection Systems, Technical Manual, 1990, empfohlen wird. Konkret wurde pβ-Gal mit 0,25 M CaCl2 gemischt. Die Mischung wurde mit einem gleichen Volumen von 2 × HBS (Heng's buffer salt, zu beziehen von Gibco, Grand Island, New York) gemischt, um eine Mischung zu schaffen, die 1 μg/ml pβ-Gal enthält. Die trübe Mischung wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert und anschließend auf die Zellen angewendet. Die suspendierten Zellen wurden für 2 Stunden bei 37°C und unter 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden dann mit frischem Medium gewaschen und erneut ausplattiert.
  • Die erneut ausplattierten Zellen wurden für 48 Stunden in DMEM-Medium enthaltend 10 % FCS inkubiert. Während der Inkubation wurde das Medium nach 16 Stunden durch frisches Medium ersetzt. Nach 48 Stunden der Inkubation wurden die Zellen für jede Inkubation durch Schaben eingesammelt, mit PBS gewaschen und in 100 μl von 0,2 M Tris-HCl (pH 7,4) resuspendiert. Die Zellen wurden mit verschiedenen Einfrier-/Auftauzyklen lysiert und bei einem Überschuss von 6.000 x/g zentrifugiert. 50 μl des Überstandes wurden aus jedem Lysatröhrchen entfernt und mit 50 μl einer Lösung von 0,1 mM 4-Methyl-umbelliferril-β-D-galactopiranisid (dem Substrat), 0,1 M Natriumphosphat (pH 7,4) gemischt. Jede Mischung wurde für 20 min bei 37°C inkubiert, um zu ermöglichen, dass eventuell vorhandene β-Galactosidase auf das Substrat wirkt. 50 μl von 0,4 M Glycin, pH 10,5, wurden hinzu gegeben, um die β-Galactosidase-Reaktion zu beenden. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde durch das Vorhandensein von Methylbelliferon angezeigt, was über Fluoreszenzspektrometrie gemessen werden kann (λex = 365 nm, λ = 450 nm). Die Ergebnisse waren:
    Figure 00340001
  • Beispiel 2 – Transfektionseffizienzen – Komplex der ersten Ausführungsform
  • In diesen Experimenten wurden die Transfektionseffizienzen mit MDCK-Zellen (die aus Hundenieren stammen) untersucht. Erneut war pβ-Gal das Indikatorpolynucleotid. Die Polykationenkomponente des Polynucleotids wies ein Copolymer aus N-Ethyl-4-vinylpyridiniumbromid bzw. N-Cetyl-4-vinylpyridiniumbromid auf, wobei die Monomere in einem molaren Verhältnis von 97:3 inkorporiert wurden (hier im Folgenden „pEVP-co-pCVP-Br"). Das Block-Copolymer wies ein Triblock-Copolymer der Formel (XIV) auf, wobei x + z 18 waren und y 23 war (hier im Folgenden „Pluronic B"). Eine Pluronic B-Transfektionslösung von 1 μg/ml pβ-Gal, 3 μg/ml pEVP-co-pCVP-Br, und 1 % (w/v) Pluronic B wurde in Beispiel 1 hergestellt. Das Verhältnis der basischen Gruppen des Polykations zu Nucleotidphosphaten war etwa 7. Das Gewichtsverhältnis von Pluronic B zu pβ-Gal war etwa 5 × 103.
  • MDCK-Zellen wurden mit 8–105 Zellen pro Platte auf 90 mm-Platten ausplattiert und über Nacht in serumenthaltendem Wachstumsmedium inkubiert. Das serumenthaltende Medium wurde dann durch serumfreies Medium ersetzt, und die Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 für 24 Stunden inkubiert. Für die mit dem Polynucleotidkomplex zu behandelnden Zellen wurde das Medium dann durch 5 ml Pluronic B-Transfektionslösung ersetzt. Die Zellen wurden bei vorsichtigem Schütteln bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. In Kontrollexperimenten wurden die Zellen mit dem Polynucleotidkomplex transfiziert, das Medium wurde dann durch 5 ml Pluronic B-Transfektionslösung ersetzt. Die Zellen wurden bei leichtem Schütteln bei 37°C und 5 % CO2 für 2 Stunden inkubiert. In Kontrollexperimenten wurden die Zellen mit dem wie oben beschriebenen Calciumphosphatverfahren transfiziert (außer, dass ausplattierte Zellen, nicht suspendierte Zellen, transfiziert wurden).
  • Nach der Behandlung mit Pluronic B-Transfektionslösung oder Calciumphosphat wurden die Zellen fünf bis sechs Mal mit frischem Medium gewaschen. Sie wurden dann in DMEM enthaltend 10 % FCS für 48 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Nach den ersten 16 Stunden dieser Inkubation wurde das Medium ersetzt. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen, von ihren Platten durch Trypsinierung entfernt und erneut mit PBS gewaschen. Die β-Galactosidase wurde, wie für das Beispiel 1 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00360001
  • Beispiel 3 – Transfektionsexperimente – Komplex der ersten Ausführungsform
  • In diesen Experimenten wurden die Transfektionseffizienzen mit Ovarzellen aus dem Chinesischen Hamster (CHO) untersucht. Die Polynucleotidkomponente des Polynucleotidkomplexes war pβ-Gal. Die Polykationenkomponente wies pEVP-Br auf. Das Block-Copolymer wies ein Octablock-Copolymer der Formel (XVII) auf, wobei i gleich 10 war und j gleich 12 war (im Folgenden „Pluronic C", erhältlich bei BASF). Eine Pluronic C-Transfektionslösung von 1 μg/ml pβ-Gal, 4 μg/ml pEVP-Br und 1 % (w/v) Pluronic C wurde hergestellt, wie in Beispiel 1. Das Verhältnis der basischen Gruppen zu Nucleotidphosphaten war 10. Das Gewichtsverhältnis von Pluronic C zu pβ-Gal war 103. Das Transfektionsprotokoll war das gleiche, das in Beispiel 2 verwendet wurde. Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00370001
  • Referenzbeispiel 4 – Bakterielle Transformation – Komplex der zweiten Ausführungsform
  • In diesen Experimenten wurden die Transformationseffizienzen unter Verwendung des MC5-Stammes von Bacillus subtilus untersucht. Die Polynucleotidkomponente des Polynucleotidkomplexes war das Plasmid pBC16, ein Plasmid, das für Tetracyclinresistenz codiert. Ein Block-Copolymer gemäß der Formel (VI) wurde verwendet. Insbesondere war das Block-Copolymer ein Poly(oxyethylen)-oly((N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid) der Formel (XXI), wobei i 44 war und j 20 war. Eine Stammlösung des Polynucleotidkomplexes der zweiten Ausführungsform wurde in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Transfektionslösungen hergestellt. Das Verhältnis der basischen Gruppen des Copolymers zu DNA-Phosphaten in der Lösung war 0,2. Die Bakterien wurden in Spizizen II, einem Transformationsmedium, suspendiert (siehe Spizizen, F.N.A.S.., U.S.A. 44:1072 (1958)), und Aliquote der Zellen wurden in variierenden Konzentrationen von entweder Polynucleotidkomplex oder freiem PBC16 inkubiert. Die Zellen wurden mit dem Komplex oder freier DNA für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf Agarmedium, enthaltend 10 mg/ml Tetracyclin, ausplattiert. Die Ergebnisse, gemessen über die Anzahl von Tetracyclinresistenten Kolonien, die unter den jeweiligen experimentellen Bedingungen produziert wurden, waren die Folgenden:
    Figure 00380001
  • Beispiel 5 – Schutz gegenüber Nuclease
  • Für dieses Beispiel wurde ein Komplex aus dem Plasmid pTZ19 und einem Diblock-Copolymer der Formel (XXI) (Poly(oxyethylen)-poly((N-ethyl-4-vinylpyridiniumbromid), wobei i 44 war und j 20 war) gebildet. Die Lösung des in PBS gelösten Polynucleotidkomplexes enthielt etwa 4 μg/ml des Plasmides und 20 μg/ml des Diblock-Copolymers. Diese Mengen resultierten in einem Verhältnis von Basengruppen in dem Polykation-Block zu DNA-Phosphatgruppen von 5. Für die Kontrollinkubationen wurde eine äquivalente Menge von freiem Plasmid in Puffer gelöst. PVUII-Nuclease wurde zu den Lösungsproben enthaltend freie DNA oder Polynucleotidkomplex hinzu gegeben, und die Menge von unverdauter, zirkulärer Plasmid-DNA wurde nach verschiedenen Verdauungszeiten durch Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel bestimmt. Siehe Kabanov et al., Biopolymers, 31:1437-1443 (1991). Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00390001
  • Beispiel 6 – Oligonucleotidstabilisierung
  • Für dieses Beispiel wurde ein Komplex enthaltend ein Oligonucleotid präpariert, das komplementär zu der Transkriptionsinitiationsstelle des HIV-1-tat-Genes („Anti-tat", aufweisend GGCTCCATTTCTGCTC) war, wozu das Diblock-Copolymer der Formel (XIX) (Polyoxyethylen-poly(L-alanin-L-lysin), wobei i 44 ist und j 8 ist, verwendet wurde. Der Oligonucleotidkomplex wurde in PBS-Puffer (pH 7,0) mit einer Konzentration von 0,75 OD260/μl Oligonucleotid hergestellt. Das Verhältnis von Imino- und Aminogruppen des Polykations zu Polynucleotidphosphatgruppen war etwa 50. Die Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bildung des Komplexes zu ermöglichen. Dann wurde der Komplex durch Gelfiltrations-Chromatographie auf Sephadex G-25 unter Verwendung von 0,05 M NaCl als Elutionsmittel gereinigt. Die resultierende Lösung des Komplexes zeigte eine Konzentration von 0,11 OD260/μl von Oligonucleotid. Eine vergleichbare Lösung von nicht-komplexiertem Oligonucleotid wurde hergestellt. Ein Aliquot von Mausblutplasma (10 μl) wurde mit einem gleichen Volumen von Oligonucleotidkomplexlösung oder einer Lösung von freien Oligonucleotiden gemischt. Die Proben wurden bei 37°C für verschiedene Zeiträume inkubiert. Um die Reaktion der Oligonucleotide mit den Enzymen in dem Plasma zu stoppen, wurden die Proben mit Wasser verdünnt und mit einer wassergesättigten Mischung aus Phenol:Chloroform (1:1) gemischt. Die wässrige Phase der Extraktion wurde isoliert, und das darin enthaltene Oligonucleotid wurde mit 3 % Lithiumperchlorat präzipitiert. Das Präzipitat wurde mit Aceton gewaschen und dann in 100 μl Wasser gelöst. Das Vorhandensein von degradiertem Oligonucleotid wurde durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung einer C18-Silasorb-Säule (4 × 90 mm, Gilson, Frankreich) und einem Gradient von Acetonitril in 0,05 M Triethylammoniumacetat (pH 7) als Elutionsmittel bestimmt. Die Ergebnisse waren wie folgt:
    Figure 00400001
  • Beispiel 7 – Oligonucleotidstabilisierung
  • In diesem Beispiel wurde die Stabilität des in Beispiel 6 beschriebenen Oligonucleotides untersucht, wenn dieses mit einem Diblock-Copolymer der Formel (XX) (Polyoxyethylen-polypropylenimid/Butylenimin, wobei i 44 ist und j 4–8) komplexiert ist, wurde untersucht. Die gleichen Methoden, die in Beispiel 6 verwendet wurden, wurden in diesem Beispiel verwendet, außer dass die Oligonucleotidkonzentration etwa 0,13 OD260/μl war. Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00410001
  • Beispiel 8 – Effizienzen der Inkorporation von Gegensinn-Molekül in die Zelle
  • In diesem Experiment wurde die Effizienz von „Anti-MDR", einem Gegensinn-Molekül, das eine 17-Oligonucleotidkette der Sequenz CCTTCAAGATCCATCCC aufweist, die komplementär ist zu den Positionen 422–438 der mRNA, die für das MDR1-Genprodukt codiert, bezüglich des Aufhebens der Mehrfachwirkstoffresistenz in SKVLB-Zellen untersucht. SKVLB-Zellen sind solche Zellen mit einer Multiresistenz gegen Wirkstoffe, die sich von einer Ovarkrebszelllinie ableiten. Das MDR1-Gen wurde als dasjenige identifiziert, das für die Multiwirkstoffresistenz von SKVLB-Zellen verantwortlich ist. Endikott und Ling, Ann. Rev. Biochem., 58:137 (1989). Insbesondere wurde die Effizienz des Anti-MDR-Oligonucleotids in dem Polynucleotidkomplex der Erfindung und im freien Zustand miteinander verglichen. Als Kontrollen wurde ebenfalls die freie und komplexierte Form des oben beschriebenen Anti-tat-Oligonucleotides verwendet. Die Polynucleotidkomplexe wurden mit den Diblock-Copolymeren der Formel (XX) (Polyoxyethylen-polypropylenimin/Butylenimin, wobei i 44 war und j 9–10 war) gebildet. Die Komplexe wurden mit den Verfahren hergestellt, die in Beispiel 6 beschrieben sind. Die Oligonucleotidkonzentration in dem Komplex oder im freien Zustand war 0,17 OD260/μl. Das Copolymer lag in einer Konzentration vor, die ausreichend ist, um ein Verhältnis von Imino- und Aminogruppen des Polykation-Blockes zu Oligonucleotidphosphatgruppen von 10 zu definieren.
  • Die SKVLB-Zellen wurden für 3 Tage bei 37°C unter 5 % CO2 in Gegenwart von freien oder komplexierten Oligonucleotiden inkubiert (bei einer Konzentration von 20 μM basierend auf dem Oligonucleotidgehalt). Alle 12 Stunden wurde frisches Medium einschließlich freien und komplexierten Oligonucleotiden hinzu gegeben.
  • Die Daunomycin-Cytotoxizität (IC50) in Bezug auf die wie oben beschrieben behandelten Zellen wurde unter Verwendung des Verfahrens nach Alley et al., Cancer Res., 48:589-601 gemessen. Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00420001
  • Beispiel 9 – Gegensinn-Oligonucleotid, das zur Inhibition von Herpes-Virus konstruiert ist
  • In diesem Experiment wurde eine 12-Oligonucleotidkette verwendet, die an ihrem 5'-Ende mit Undecylphosphatsubstituent und an ihrem 3'-Ende mit einer Acridingruppe kovalent modifiziert wurde. Diese Oligonucleotidmodifizierung ist beschrieben in Cho-Chung et al., Biochemistry Int., 25:767-773 (1991). Die verwendete Oligonucleotidsequenz CGTTCCTCCTGU war komplementär zu der Splice-Stelle bei 983 bis 994 des Herpes-Simplex-Virus 1 („HSV-1"). Als eine Kontrolle wurde eine äquivalent modifizierte Sequenz (AGCAAAAGCAGG) verwendet, die komplementär zu der RNA war, die von dem Influenzavirus produziert wird. Die Oligonucleotide wurden mit HSV-1 infizierten Zellen entweder im komplexierten oder im freien Zustand verabreicht. Wenn ein Komplex verwendet wurde, wurde der Komplex mit dem Diblock-Copolymer der Formel (XIX) (Polyoxyethylen-poly(L-alanin-L-lysin, wobei i gleich 44 und j gleich 8 war) gebildet. Die Oligonucleotidkomplexe wurden wie in Beispiel 6 beschrieben gebildet.
  • Nierenzellen des Afrikanischen Krallenaffens („Velo"-Zellen) wurden mit dem HSV-1-Virus (Stamm L2, erhalten von dem Museum von Virusstämmen, D. I. Ivanovskii, Inst. of Virol., Russische Föderation), infiziert, wie von Vinogradov et al., BBRC, 203:959 (1994) beschrieben. Die infizierten Zellen wurden mit PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurde frisches RPMI-1640-Medium, enthaltend 10 % fötales Kälberserum, und freies oder komplexiertes Oligonucleotid zu den Zellen hinzu gegeben. Die Zellen wurden dann bei 37°C und 5 % CO2 für 24 Stunden inkubiert. Die HSV-1-Infektiosität des Zellmediums wurde dann unter Verwendung des „Patch"-Generierungsverfahrens bestimmt, wie beschrieben in Virology, A Practical Approach, Mahy, Hrsg., IRL Press, Washington, DC, 1985. Bei der Verwendung variierender Konzentrationen von Oligonucleotid waren die Ergebnisse die Folgenden:
    Figure 00440001
  • Beispiel 10 – Gegensinn-Oligonucleotid, das zur Inhibition von Herpes-Virus konstruiert ist
  • Wenn nicht anders angegeben, werden in diesem Beispiel die gleichen Verfahren verwendet, die in Beispiel 9 verwendet wurden. Bei den verwendeten Zellen handelt es sich um BHK-Zellen, einer Nierenzelllinie des Chinesischen Hamsters. Wenn die komplexierte Form der Oligonucleotide verwendet wurde, wurde der Komplex mit dem Diblock-Copolymer der Formel (XVII) (Polyoxyethylen-Poly-L-lysin), wobei i 44 war und j 30 war) gebildet, wobei das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren verwendet wurde. Die Konzentration der Stammlösung des Komplexes war 0,09 OD260/μl. Das Verhältnis der Imino- und Aminogruppen des Polykationblockes zu Oligonucleotidphosphaten war 10. Die Oligonucleotide, in komplexierter oder freier Form, wurden den Zellen mit einer Konzentration von 3,0 μM verabreicht. Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00450001
  • Beispiel 11 – In vivo-Inhibition von HSV
  • Polynucleotidkomplexe aus dem Block-Copolymer der Formel (XVII) (Polyoxyethylen-poly-L-lysin, wobei i 44 war und j 30 war) und den Anti-HSV- und Anti-Influenza-Oligonucleotiden wurden unter Verwendung der in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren gebildet. Die Konzentration der Stammlösungen der Komplexe war 0,9 OD260/μl. Das Verhältnis von Imino- und Aminogruppen des Polykationblockes zu Oligonucleotidphosphaten war 10.
  • Weiße Inzuchtmäuse (Körpergewicht 6 bis 7 g) wurden mit HSV-1 (Stamm C1 des Belorussian Res. Inst. of Epidemiol. & Microbiol., Minsk) durch intraperitoneale Injektion von 30 μl einer Virussuspension (Titer: 10–7 LD50/ml) infiziert. Entweder wurde Anti-HSV-Komplex, Anti-Influenza-Komplex, freier Anti-HSV oder freier Anti-Influenza in die Schwanzvene einer jeden Maus jeweils 2, 12, 24, 48 oder 72 Stunden nach der Infektion injiziert. Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00460001
  • Beispiel 12 – Lebenszeit des Polynucleotidkomplexes im Plasma
  • Ein 32P-markiertes 17-mer (GGCTCCATTTCTTGCTC), das komplementär zu der Transkriptionsinitiationsstelle des HIV-1-tat-Genes ist, wurde in diesem Beispiel verwendet. Das Oligonucleotid wurde an seinem 5'-Ende mit Cholesterol modifiziert, wie beschrieben in Boutorin et al., Bioconjugate Chemistry, 2: 350–356 (1990). Ein Polynucleotidkonjugat des Oligonucleotides wurde mit dem Block-Copolymer der Formel (XX) (Polyoxyethylenpoly(propylenimin/Butylenimin), wobei i 44 war und j war 9–10) gebildet. Die Konzentration der Stammlösung des Komplexes (gelöst in PBS) war 0,18 OD260/μl. Das Verhältnis von Imino- und Aminogruppen des Polykationblockes zu Oligonucleotidphosphaten war 50.
  • Männliche C57/B1/6-Mäuse (Gewicht: 20–24 g; erhalten von dem Russischen Forschungszentrum für molekulare Diagnostik und Therapie, Moskau) erhielten 50 μl von Anti-HIV-Konjugat oder von freiem Anti-HIV, bei 0,18 OD260/μl in PBS gelöst, intravenös injiziert. Zu definierten Zeiten nach den Injektionen wurden Blutproben aus der Schwanzvene entnommen und die Tiere wurden getötet. Die Menge von radioaktivem Material in Blut- oder Gewebeproben wurde durch Flüssigszintillationszählung (nach geeigneten Solubilisierungen) bestimmt. Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00470001
  • Beispiel 13 – Synthese des kationischen Block-Copolymers
  • 1,4-Dibromobutan (5,4 g, 25 mmol, von Aldrich Co., Milwaukee, WI) wurde zu einer Lösung von N-(3-Aminopropyl)-1,3- propandiamin (6,55 g, 50 mmol, von Aldrich Co.) hinzu gegeben, das in 100 ml von 1,4-Dioxan gelöst war. Diese Reaktionsmischung wurde bei 20°C für 16 Stunden geschüttelt. Das Produkt dieser Reaktion präzipitiert spontan aus der Lösung als Hydrobromidsalz. Dieses präzipitierte erste Intermediat wurde gesammelt und zweimal durch Rota-Evaporation aus einer Lösung von 10 % Triethylamin in Methanol getrocknet. Dieses Evaporationsverfahren war effektiv, um wesentliche Mengen des Bromidsalzes zu entfernen. Das erste Intermediat wurde in 50 ml von 1,4-Dioxan gelöst und reagierte mit 2,7 g (12,5 mmol) von 1,4-Dibromobutan. Die Reaktion wurde erneut für 16 Stunden bei 20°C fortgeführt und das resultierende zweite Intermediat wurde wie oben beschrieben gewonnen und getrocknet. Das zweite Intermediat wurde mit Essigsäure auf einen pH von 7–8 neutralisiert und durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 unter Verwendung eines wässrigen Elutionsmittels gereinigt. Drei Hauptpolyminfraktionen wurden erhalten, die apparente Molekulargewichte von 1060, 700 bzw. 500 hatten.
  • Poly(oxyethylenglycol) (1,5 g, M.W. 1500, von Fluka) wurde in 8 ml von 1,4-Dioxan gelöst und reagierte mit 0,17 g (1 mmol) von N,N'-Carbonylimidazol (Aldrich Co.) bei 20°C für 3 Stunden. Die Reaktionsmischung wurde in zwei Teile geteilt. Jeder Teil wurde mit 4 ml einer 10 %igen (w/v) Lösung entweder der 1060 MW- oder 700 MW-Polyiminfraktion gemischt, wobei die Lösung ferner 0,1 N NaOH enthielt. Die Mischung wurde für 16 Stunden bei 20°C geschüttelt. Aus dieser Mischung wurden Block-Copolymere der Formeln (XX) und verschiedener MW-Bereiche durch Gelfiltration isoliert.
  • Beispiel 14 – Synthese des kationischen Block-Copolymers
  • 0,5 g eines Succinimidylcarbonates von Methoxy-PEG (MW 5000, Shearwater Polymers, Inc., USA) wurden in 1,4-Dioxan gelöst. Diese Dioxanlösung wurde zu einer wässrigen Lösung enthaltend 0,2 g des oben beschriebenen 1060 MW Polyimidinpolymers hinzu gegeben, dessen wässrige Lösung ferner 0,01 N NaOH enthielt. Diese Reaktionsmischung wurde bei 20°C für 16 Stunden geschüttelt. Ein Polymer der Formel (XXII) wurde aus der Reaktion durch Gelfiltration isoliert.
  • Beispiel 15 – Synthese des kationischen Block-Copolymers
  • 1,5 g des Poly(oxyethylenglycols) (MW 8000, Fluka) wurden in 8 ml 1,4-Dioxan gelöst. 0,34 g (2 mmol) von N,N'-Carbonylimidazol (Aldrich Co.) wurden zu der Lösung hinzu gegeben und für 3 Stunden bei 20°C reagieren gelassen. 8 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,01 N NaOH und 15 % (w/v) des oben in Beispiel 13 beschriebenen 500 MW-Polyimidinpolymers, wurden dann zu der ersten Reaktionsmischung hinzu gegeben. Die resultierende Mischung wurde für 16 Stunden bei 20°C unter Schütteln reagieren gelassen. Ein Polymer der Formel (XXIII) wurde aus der zweiten Reaktionsmischung durch Gelfiltration isoliert.
  • Beispiel 16 – Konjugatsynthese mit Oligonucleotid
  • Ein 12-mer-Oligonucleotid 5'-CGTTCCTCCTGU („Oligo A"), das komplementär zu der Splice-Stelle (Positionen 983–994 in dem viralen Genom) der frühen mRNA des Typ 1 Herpes-Simplex-Virus („HSV-1") war, wurde unter Verwendung eines 380B-02-DNA- Synthesizers (Applied Biosystems, CA) synthetisiert. Der Synthesizer verwendete Phosphoramididchemie und einen Synthesezyklus von 8 Minuten. Die Zyklusbedingungen und die Präparation des Rohproduktes erfolgte gemäß der Empfehlung von Applied Biosystems. Das rohe Oligo A, das aus der Synthese erhalten wurde, wurde aus einer 1 M LiCl-Lösung (0,5 ml) mit Aceton (2 ml) präzipitiert. Das Präzipitat wurde in Triethylammoniumacetatpuffer gelöst und durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie auf einer Silasorb-C18-Säule (9 × 250 mm, Gilson, Frankreich), gebildet mit einem Acetonitrilgradienten in einem 20 mM TEAA-Puffer (pH 8,5), gereinigt.
  • Der 3'-Terminus des gereinigten Oligo A wurde mit Periodat oxidiert, um ein Aldehyd zu schaffen und durch reduktive Alkylierung mit einem Hexamethylendiaminlinker konjungiert, wodurch ein Aminderivat geschaffen wurde. Siehe Che-Chung et al., Biochem. Internat., 25:767 (1991); Vinogradov et al., BBRC, 203:959 (1994). Das „Pluronic A", ein Block-Copolymer der Formel (XIV) (x = 25, y + 38, z = 25) wurde entsprechend oxidiert, um terminale Aldehyde zu schaffen. Das Aminderivat (1 mg) wurde in 100 μl eines 0,1 M Boratpuffers (pH 9,0) gelöst und mit 2 mg des Pluronic A-Derivats gemischt. 1,5 mg von Natriumcyanoborohydrid wurde zu der Mischung hinzu gegeben, um die zwischen den Amin- und Aldehydgruppen gebildeten Schiff'schen Basen zu reduzieren. Diese Reaktion wurde für 12 Stunden bei 4°C zugelassen. Das polymerische Produkt dieser Reaktion wurde durch Gelfiltrations-Chromatographie auf Sephadex LH-20 isoliert, wobei 90 %iges wässriges Isopropanol als Elutionsmittel verwendet wurde. Das so erhaltene Konjugat wird hier als „Oligo A-Konjugat" bezeichnet.
  • Beispiel 17 – Der Effekt des Oligo A-Konjugates auf die Virusproduktion
  • Oligo A und Oligo A-Konjugat wurden getrennt in RPMI 1640-Medium (ICN, Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA) mit einer Endkonzentration von 0,2 mM (basierend auf der Oligonucleotidabsorption) gelöst. Diese Stammlösungen wurden dann durch 0,22-μm-Filter filtriert, um jegliche beliebige bakterielle oder Pilzkontamination zu entfernen.
  • Monolayer von Vero-Zellen wurden für 1 Stunde bei 37°C in serumfreiem RPMI 1640 zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von Oligo A oder Oligo A-Konjugat inkubiert. Die noch an die Oligonucleotide exponierten Monolayer wurden dann mit einer Plaque-bildenden Einheit pro kultivierter Zelle von HSV-1, Stamm L2 (aus dem Museum für Virusstämme des D. I. Ivanovskii Institut für Virologie, Russische Akademie der Wissenschaften, Russische Föderation) infiziert. Diese Infektionsmethode wurde in Vinogradov et al., BBRC, 203:959 (1994), beschrieben. 8 Stunden nach der Exposition an das Virus und die Oligonucleotide wurde das Medium auf den Zellen durch frisches Medium, enthaltend 10 % FCS, ersetzt. Das Medium wurde 22 und 39 Stunden nach der infektiösen Inkubation von den Zellen gesammelt, und der Virustiter in dem gesammelten Medium wurde bestimmt, wie beschrieben in Virology, A Practical Approach, Mahy, Hrsg. IRL Press, Oxford Univ. Press, Washington, DC, 1985). Die Ergebnisse waren die Folgenden:
    Figure 00520001
  • Beispiel 18 – Synthese eines Phosphonatmonomers
  • 40 mmol von Butanediol-1,3 (Merck), gelöst in 50 ml wasserfreiem Pyridin (Aldrich), wurden mit 20 mmol 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (Sigma) für 1,5 Stunden bei 20°C reagieren gelassen. Die Reaktion wurde unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Platten (Merck), entwickelt mit Chloroform:Methanol (95:5), verfolgt. Der Rf des Produktes war 0,6. Das Reaktionsgemisch wurde zu 200 ml einer 8 %igen wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat hinzu gegeben und das Produkt wurde mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde im Vakuum evaporiert und das resultierende ölige erste Intermediat wurde in der nächsten Synthesestufe verwendet.
  • 12 mmol des ersten Intermediates wurden in 30 ml wasserfreiem 1,4-Dioxan, enthaltend 3,14 ml (18 mmol) von Diisopropylenethylamin (Aldrich), gelöst. 18 mmol von Salicylchlorophosphit (Sigma), gelöst in 10 ml von wasserfreiem 1,4-Dioxan, wurden in kleinen Anteilen unter einer inerten Argonatmosphäre zu der Diisopropylethylaminlösung hinzu gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für I Stunde bei 20°C inkubiert. Die Reaktion wurde wie oben beschrieben durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Der Rf des Produktes war 0,05. 10 ml Wasser wurden zu der Reaktionsmischung hinzu gegeben. Nach 30 min wurde das Lösungsmittel evaporiert. Das Produkt wurde in 100 ml Chloroform gelöst und die erhaltene Lösung wurde schrittweise mit (1) 100 ml einer 8 %igen wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat, (2) 100 ml einer 0,2 M Triethylammoniumacetatlösung (pH 7,2), und (3) 100 ml Wasser gewaschen. Das organische Lösungsmittel wurde evaporiert und der ölige Rückstand enthaltend das Phosphonatmonomer wurde durch Chromatographie auf einer Silicagel-Säule gereinigt, wozu ein schrittweiser Gradient von (1) Chloroform, (2) 3 % Methanol in Chloroform und (3) 6 % Methanol in Chloroform verwendet wurde. Die Ausbeute des Monomers war 4,1 g (= 7,3 mmol, 63 %). Das Produkt weist die folgende Struktur auf:
    Figure 00540001
    wobei DMT eine Dimethoxytritylgruppe repräsentiert, und kann als „Prosphonat Monomer A" bezeichnet werden.
  • Beispiel 19 – Synthese des Polykations BDP
  • Eine 0,05 M Lösung des Phosphonat Monomers A in wässriger Pyridin:Acetonitril-Mischung (1:1) wurde in Position 6 des DNA-Synthesators (Modell 380-B02, Applied Biosystems, CA) platziert. Eine 2 %ige Lösung von Adamantoilchlorid (Sigma) in der Mischung Acetonitril:Pyridin (95:5) wurde als ein kondensierendes Agens verwendet. Die Synthese wurde unter Verwendung des für ein H-Phosphonatzyklus modifizierten Programms (Sinha und Striepeke in: Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Eckstein Hrsg. IRL Press, Oxford, New York – Tokyo, Seite 185 (1991)), durchgeführt und die DMT-Gruppe wurde nach Abschluss der Synthese konserviert. Als erste Einheit während der Polymersynthese wurde Adenosin (4 μmol), immobilisiert auf einem Standard-CPG-500 festen Träger, verwendet (Vinogradov et al., BBRC, 203, 959 (1994)). Der Synthesizer wurde programmiert, um 15 sich wiederholende Einheiten von Phosphonat Monomer A zu dem Adenosinmonomer hinzu zu geben. Nach sämtlichen Syntheseschritten wurden die H-Phosphonatgruppen auf dem immobilisierten Substrat mit der Lösung von 104 mg von Hexamethylendiamin (Sigma) in 0,6 ml einer Mischung von wässrigem Pyridin:CCl4 (5:1) oxidiert, was für 15 min bei 20°C erfolgte, anschließend wurde der Träger mit der Pyridin:Acetonitril-Mischung (1:1) gewaschen. Das Entblocken und die Entfernung der Kappe erfolgte durch Ammonolyse (Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, Eckstein Hrsg. IRL Press, Oxford, New York – Tokyo, 1991). Das Produkt wurde durch HPLC unter Verwendung einer Silasorb C16-Säule (9 × 250 mm, Gilson, Frankreich) in dem Acetonitrilgradienten (0–80 %) gereinigt. Der Peak, enthaltend das dimethoxytritylierte Produkt, wurde gesammelt, das Lösungsmittel wurde evaporiert und der Rückstand wurde mit 80 %iger Essigsäure behandelt (20 min). Die Essigsäure wurde evaporiert und das Polykation wurde erneut durch HPLC gereinigt. Die Ausbeute von 15-mer (gerechnet in Bezug auf Phosphonat Monomer A) betrug 50 % (2,2 μmol). Dies schuf ein Polymer gemäß der Formel A. Das Polymer wird nachfolgend als „BDP" bezeichnet.
  • Beispiel 20 – Festphasensynthese des Diblock-Copolymers Polyoxyethylen-BDP
  • Dimethoxytrityl-Polyethylenoxid-H-Phosphonat wurde, wie in Beispiel 18 beschrieben, unter Verwendung von Polyethylenglycol (1500 MW von Fluka), anstelle von Butandiol-1,3, synthetisiert. Das BDP-Polykation wurde, wie in Beispiel 19 beschrieben, synthetisiert, außer dass in der letzten Stufe des Kettenwachstums Dimethoxytrityl-Polyethylenoxid-H-Phosphonat als letzter Baustein eingebracht wurde. Die H-Phosphonatgruppen des Block-Copolymers wurden wie in Beispiel 19 unter Verwendung von Tetramethylendiamin (Sigma) anstelle von Hexamethylenadiamin oxidiert, was in der Bildung von Phosphoamidbindungen zwischen den Diaminen und den Phosphaten des Rückgrates resultierte.
  • Beispiel 21 – Festphasensynthese des Oligonucleotid-BDP-Diblock-Copolymers
  • Ein Diblock-Copolymer umfassend 12-mer Oligonucleotide 5'-GGTTCCTCCTGU (Oligo A, komplementär zu der Splice-Stelle der frühen RNA von Typ 1 Herpes-Simplex-Virus (HSV-1) (Vinogradov et al., BBRC, 203, 959 (1994)) und das BDP-Polymer wurden in einem DNA-Synthesator synthetisiert. Das erste BDP-Polymer wurde, wie in Beispiel 19 beschrieben, synthetisiert, außer dass es nicht von dem Träger entfernt wurde. Anschließend wurde die Oligonucleotidkette schrittweise auf dem BDP-polykationischen Polymer synthetisiert, das mit dem Feststufenträger verbunden war, wozu die Standard-Phosphoramiditchemie verwendet wurde, wie beschrieben in Vinogradov et al., BBRC, 203, 959 (1994). Die H-Phosphonatgruppen des Diblock-Copolymers wurden, wie in Beispiel 19 beschrieben, oxidiert, wozu Tetramethylendiamin (Sigma) anstelle von Hexamethylendiamin verwendet wurde.
  • Beispiel 22 – Der Effekt des Oligonucleotid-BDP-Diblock-Copolymers auf das Viruswachstum
  • Das Experiment wurde exakt, wie in Beispiel 17 beschrieben, durchgeführt, außer dass (1) das Oligonucleotid-BDP-Copolymer aus Beispiel 21 verwendet wurde, und (2) eine einzige Konzentration von Oligonucleotid-BDP-Copolymer (Konjugat) verwendet wurde (4 μM).
  • Figure 00570001
  • Beispiel 23 – Verstärkung der HSV-Infektion
  • Monolayer von Vero-Zellen wurden mit einer Multiplizität von 0,1 PFU/Zelle mit dem Virus, wie in Beispiel 9 beschrieben, infiziert. Variierende Konzentrationen von Polykationen-BDP (wie in Beispiel 19 beschrieben synthetisiert) wurden vor der Infektion zu dem Virus hinzu gegeben. Der Titer an infektiösem Virus (PFU/ml) wurde 24 Stunden nach der Infektion auf Monolayern von Vero-Zellen bestimmt (Beispiel 9). Sämtliche Experimente wurden in Dreifachansätzen durchgeführt. Die bestimmten Variationen in den infektiösen Titern waren kleiner als 25 %. Die Ergebnisse des Experimentes sind unten dargestellt.
  • Figure 00570002

Claims (14)

  1. Polynucleotidzusammensetzung, die Folgendes aufweist, nämlich: (a) ein Polynucleotid oder ein Polynucleotidderivat; und (b) weniger als 5 % (w/v) eines Polyetherblockcopolymers, das ein A-Typ-Polymersegment aufweist, welches ein lineares Polymersegment aufweist, dessen sich wiederholende Einheiten zu einer durchschnittlichen Hansch-Leo-Fragmentkonstante von –0,4 oder weniger beitragen und Molekulargewichtsbeiträge von 30 bis 500 haben, und das ein B-Typ-Polymersegment aufweist, welches ein lineares Polymersegment aufweist, dessen sich wiederholende Einheiten zu einer durchschnittlichen Hansch-Leo-Fragmentkonstante von –0,4 oder mehr beitragen und Molekulargewichtsbeiträge von 30 bis 500 haben, und wobei zumindest 80 % der Bindungen, die die sich wiederholenden Einheiten für jedes der Polymersegmente verbinden, eine Etherbindung aufweisen; wobei (i) die Zusammensetzung kein Gel bildet; und (ii) die Zusammensetzung Micellen mit einem Durchmesser von 10 nm bis 100 nm bildet.
  2. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Blockcopolymer ausgewählt ist aus der Gruppe von Blockcopolymeren bestehend aus:
    Figure 00580001
    wobei A und A' lineare A-Typ-Polymersegmente sind, wobei B und B' lineare B-Typ-Polymersegmente sind, und wobei R1, R2, R3 und R4 (1) Blockcopolymere der Formeln (I), (II) oder (III) oder (2) Wasserstoff sind, und L eine Bindungsgruppe ist, mit der Maßgabe, dass nicht mehr als zwei der Reste R1, R2, R3 oder R4 Wasserstoff sind, und Mischungen hiervon.
  3. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei 90 % der Bindungen, die die sich wiederholenden Einheiten für jedes der Polymersegmente verbinden, Etherbindungen aufweisen.
  4. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die sich wiederholenden Einheiten für jedes Polymersegment ein Molekulargewicht von 30 bis 100 haben.
  5. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 4, wobei 90 % der Bindungen, die die sich wiederholenden Einheiten für jedes Polymersegment verbinden, Etherbindungen aufweisen.
  6. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei 95 % der Bindungen, die die sich wiederholenden Einheiten für jedes Polymersegment verbinden, Etherbindungen aufweisen.
  7. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 6, wobei alle der sich wiederholenden Einheiten, die die Blöcke B oder B' aufweisen, Hansch-Leo-Fragmentkonstanten von –0,30 oder mehr haben.
  8. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 7, wobei alle der sich wiederholenden Einheiten, die die Blöcke A oder A' aufweisen, Hansch-Leo-Fragmentkonstanten von –0,4 oder weniger haben.
  9. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die sich wiederholenden Einheiten für jedes Polymersegment im Wesentlichen aus sich wiederholenden Einheiten der Formel -O-R5 bestehen, wobei R5 Folgendes ist, nämlich: (1) -(CH2)n-CH(R6)-, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist und R6 Folgendes ist, nämlich: Wasserstoff, Cycloalkyl mit 3–8 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Alkylphenyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Hydroxy, Hydroxyalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, eine Alkylcarbonylgruppe mit 2–7 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl, wobei das Alkoxy 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkoxycarbonylalkyl, wobei das Alkoxy und Alkyl jeweils unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweisen, Alkylcarboxyalkyl, wobei jede Alkylgruppe 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Aminoalkyl, wobei die Alkylgruppe 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Alkylamin oder Dialkylamino, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Mono- oder Di-Alkylaminoalkyl, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Chloro, Chloroalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Fluoro, Fluoroalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Cyano, Cyanoalkyl, wobei das Alkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, oder Carboxyl; (2) eine carbocyclische Gruppe mit 3–8 Ringkohlenstoffatomen, die Folgendes einschließen können, nämlich: Alkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Amino, Sulfonyl, Hydroxy, Carboxy, Fluoro- oder Chlorosubstituenten, oder (3) eine heterocyclische Gruppe mit 3–8 Ringatomen, die Folgendes einschließen können, nämlich: Heterocycloalkyl oder heteroaromatische Gruppen, die Folgendes einschließen können, nämlich: 1–4 Heteroatome, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Mischungen hierzu, und die Folgendes einschließen können, nämlich: Alkyl mit 1–6 Kohlenstoff atomen, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Alkylamino mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Dialkylamino, wobei jedes Alkyl unabhängig 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, Amino, Sulfonyl, Hydroxy, Carboxy, Fluoro- oder Chlorosubstituenten.
  10. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 9, wobei alle der sich wiederholenden Einheiten, die die Blöcke B oder B' aufweisen, Hansch-Leo-Fragmentkonstanten von –0,30 oder mehr haben.
  11. Polynucleotidzusammensetzung nach Anspruch 10, wobei alle der sich wiederholenden Einheiten, die die Blöcke A oder A' aufweisen, Hansch-Leo-Fragmentkonstanten von –0,4 oder weniger haben.
  12. Polynucleotidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Polyetherblockcopolymer ausgewählt ist aus Blockcopolymeren mit den Formeln:
    Figure 00620001
    in denen x, y, z, i und j Werte von 5 bis 400 haben, und wobei für jedes R1,R2-Paar ein Rest Wasserstoff und der andere Rest eine Methylgruppe ist.
  13. Polynucleotidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Polyetherblockcopolymer ein Diamin-gebundenes Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polymer mit folgender Formel ist:
    Figure 00630001
    wobei die gestrichelten Linien symmetrische Kopien des Polyethers repräsentieren, die sich weg von dem zweiten Stickstoff erstrecken, R* ein Alkylen mit 2–6 Kohlenstoffen, ein Cycloalkylen mit 5–8 Kohlenstoffen oder Phenylen ist, wobei für R1 und R2 Folgendes gilt, nämlich dass entweder (a) beide Reste Wasserstoff sind, oder (b) ein Rest Wasserstoff und der andere Rest Methyl ist, wobei für R3 und R4 Folgendes gilt, nämlich dass entweder (a) beide Reste Wasserstoff sind, oder (b) ein Rest Wasserstoff und der andere Rest Methyl ist, wobei im Falle, dass sowohl R3 als auch R4 Wasserstoff sind, ein Rest von R5 und R6 Wasserstoff und der andere Rest Methyl ist, und, für den Fall, dass ein Rest von R3 und R4 Methyl ist, dann beide Reste von R5 und R6 Wasserstoff sind.
  14. Polynucleotidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Zusammensetzung ferner eine kationische Komponente aufweist.
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Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380536A (en) 1990-10-15 1995-01-10 The Board Of Regents, The University Of Texas System Biocompatible microcapsules
US6933286B2 (en) * 1991-03-19 2005-08-23 R. Martin Emanuele Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
WO2003011008A2 (en) * 2001-07-31 2003-02-13 Cyrx Corporation Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
US20020123476A1 (en) * 1991-03-19 2002-09-05 Emanuele R. Martin Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
US6277410B1 (en) 1992-10-08 2001-08-21 Supratek Pharma Inc. Copolymer compositions for oral delivery
US6093391A (en) * 1992-10-08 2000-07-25 Supratek Pharma, Inc. Peptide copolymer compositions
US6153193A (en) * 1993-04-28 2000-11-28 Supratek Pharma Inc. Compositions for targeting biological agents
US6290991B1 (en) 1994-12-02 2001-09-18 Quandrant Holdings Cambridge Limited Solid dose delivery vehicle and methods of making same
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US6353055B1 (en) * 1994-11-18 2002-03-05 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions
US6359054B1 (en) * 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US6743779B1 (en) * 1994-11-29 2004-06-01 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods for delivering compounds into a cell
JP2690276B2 (ja) * 1995-01-10 1997-12-10 科学技術振興事業団 静電結合型高分子ミセル薬物担体とその薬剤
US6040295A (en) 1995-01-13 2000-03-21 Genemedicine, Inc. Formulated nucleic acid compositions and methods of administering the same for gene therapy
US6265389B1 (en) 1995-08-31 2001-07-24 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Microencapsulation and sustained release of oligonucleotides
GB2324534B (en) * 1996-01-06 2000-05-10 Danbiosyst Uk Composition for delivery of nucleic acid to a cell
GB9600272D0 (en) * 1996-01-06 1996-03-06 Univ Nottingham Polymers
EP0935415B1 (de) * 1996-05-01 2006-11-22 Imarx Pharmaceutical Corp. In vitro verfahren zum einbringen von nukleinsäuren in eine zelle
WO1997045069A1 (en) * 1996-05-29 1997-12-04 Cell Genesys, Inc. Cationic polymer/lipid nucleic acid delivery vehicles
EP0934082B1 (de) * 1996-10-23 2002-07-17 SKW Trostberg Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von biologisch aktiven polymernanopartikel-nucleinsäure-konjugaten
US5908845A (en) * 1996-10-30 1999-06-01 Segev; David Polyether nucleic acids
GB9623051D0 (en) * 1996-11-06 1997-01-08 Schacht Etienne H Delivery of DNA to target cells in biological systems
CA2298061A1 (en) * 1997-08-01 1999-02-11 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US6221425B1 (en) 1998-01-30 2001-04-24 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Lubricious hydrophilic coating for an intracorporeal medical device
EP0963758A3 (de) * 1998-05-07 2000-03-22 Universiteit Gent Synthetische polyamiosaure Komplexen zur Verabreichung von Nukleinsäuren zur Zielzellen
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
US7375096B1 (en) * 1998-12-04 2008-05-20 California Institute Of Technology Method of preparing a supramolecular complex containing a therapeutic agent and a multi-dimensional polymer network
GB9913359D0 (en) 1999-06-09 1999-08-11 Cancer Res Campaign Tech Polymer modified biological elements
US6348583B1 (en) * 1999-08-30 2002-02-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Poly(ether-thioether), poly(ether-sulfoxide) and poly(ether-sulfone) nucleic acids
CN101011584A (zh) * 1999-12-28 2007-08-08 诺瓦提斯公司 获得持续的转基因表达的方法
EP1242609A2 (de) * 1999-12-30 2002-09-25 Novartis AG Neue kolloidale synthetische vektoren zur gentherapie
WO2001065911A2 (en) * 2000-03-03 2001-09-13 Valentis, Inc. Improved poloxamer and poloxamine compositions for nucleic acid delivery
US6875748B2 (en) * 2000-04-21 2005-04-05 Vical Incorporated Compositions and methods for in vivo delivery of polynucleotide-based therapeutics
US7256180B2 (en) 2000-04-28 2007-08-14 Supratek Pharma Inc. Compositions and methods for inducing activation of dendritic cells
US20020042388A1 (en) * 2001-05-01 2002-04-11 Cooper Mark J. Lyophilizable and enhanced compacted nucleic acids
AU2001270147A1 (en) * 2000-06-23 2002-01-08 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine adjuvants and formulations containing cationic surfactants, and methods of use
EP1309650A2 (de) 2000-08-18 2003-05-14 University Of North Carolina At Chapel Hill Zusammensetzungen von nukleinsäuren, die schmelzphasen ausbilden und verfahren zur verwendung
CA2422524A1 (en) 2000-09-25 2002-03-28 Motoyuki Yamashita Pei: dna vector formulations for in vitro and in vivo gene delivery
CA2436665C (en) 2001-01-29 2012-01-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid derivatives
US7151139B2 (en) * 2001-04-23 2006-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Antimicrobial polymeric surfaces
WO2002085542A1 (en) * 2001-04-23 2002-10-31 Massachusetts Institute Of Technology Antimicrobial polymeric surfaces
US9089407B2 (en) 2001-04-23 2015-07-28 Massachusetts Institute Of Technology Antibacterial coatings that inhibit biofilm formation on implants
US6939564B2 (en) * 2001-06-08 2005-09-06 Labopharm, Inc. Water-soluble stabilized self-assembled polyelectrolytes
US7094810B2 (en) * 2001-06-08 2006-08-22 Labopharm, Inc. pH-sensitive block copolymers for pharmaceutical compositions
US20030138407A1 (en) * 2001-11-02 2003-07-24 Patrick Lu Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
FR2835749B1 (fr) 2002-02-08 2006-04-14 Inst Nat Sante Rech Med Composition pharmaceutique ameliorant le transfert de gene in vivo
US8088388B2 (en) * 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
ATE486613T1 (de) * 2002-03-07 2010-11-15 Biocompatibles Uk Ltd Mit nucleinsäure complexierte block-copolymere
US20040102608A1 (en) * 2002-05-13 2004-05-27 Cornell Research Foundation, Inc. Multiblock copolymers having improved mechanical properties
AR037006A1 (es) * 2002-06-20 2004-10-20 S I G Sist S De Identificacion Marcador de objetos a identificar consistente en al menos un fragmento de adn.
MX367615B (es) 2002-09-06 2019-08-28 Cerulean Pharma Inc Polimeros a base de ciclodextrina para el suministro de agentes terapeuticos.
EP1578193A4 (de) * 2002-12-23 2011-06-15 Vical Inc Gefriertrocknungsverfahren für nukleinsäure-/blockcopolymer-/kationtensid-komplexe
WO2004060363A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-22 Vical Incorporated Method for producing sterile polynucleotide based medicaments
EP1587816B1 (de) 2002-12-23 2010-06-16 Vical Incorporated Impfstoffe gegen infektionen mit dem humanen zytomegalivirus auf grundlage von codonoptimierten polynukleotiden
US7682626B2 (en) * 2003-02-07 2010-03-23 Roche Madison Inc. Polyvinylethers for delivery of polynucleotides to mammalian cells
RU2394041C2 (ru) 2003-04-13 2010-07-10 Энзон Фармасьютикалз, Инк. Полимерные олигонуклеотидные пролекарства
US8080642B2 (en) * 2003-05-16 2011-12-20 Vical Incorporated Severe acute respiratory syndrome DNA compositions and methods of use
WO2004105799A1 (ja) * 2003-05-29 2004-12-09 Toudai Tlo, Ltd. 安定化高分子ミセル
ATE432095T1 (de) * 2003-09-25 2009-06-15 Wageningen Universiteit Agrote Mizellen mit einem komplexkoazervatkern als fäulnishemmende mittel
EP1737899B1 (de) * 2004-04-20 2015-07-08 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Dendritische polymere mit verbesserter amplifikation und innerer funktion
US7985424B2 (en) 2004-04-20 2011-07-26 Dendritic Nanotechnologies Inc. Dendritic polymers with enhanced amplification and interior functionality
US20060024670A1 (en) 2004-05-18 2006-02-02 Luke Catherine J Influenza virus vaccine composition and methods of use
US7422875B2 (en) * 2004-07-20 2008-09-09 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for increasing protein production
AU2005289520A1 (en) * 2004-09-27 2006-04-06 Vical Incorporated Formulations and methods for treatment of inflammatory diseases
WO2006060723A2 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Vical Incorporated Methods for producing block copolymer/amphiphilic particles
WO2006130709A2 (en) * 2005-06-01 2006-12-07 Rhodia Inc. Coacervate systems having soil anti-adhesion and anti-deposition properties on hydrophilic surfaces
US20090209621A1 (en) 2005-06-03 2009-08-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for decreasing microrna expression for the treatment of neoplasia
US9090648B2 (en) * 2005-12-15 2015-07-28 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Cationic oligonucleotides, automated methods for preparing same and their uses
JP2010504318A (ja) * 2006-09-22 2010-02-12 ラボファーム インコーポレイテッド ｐＨ標的化薬剤送達のための組成物及び方法
EP2084234A2 (de) * 2006-11-08 2009-08-05 Massachusetts Institute of Technology Polymere beschichtungen zur deaktivierung von viren und bakterien
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
WO2008141275A1 (en) 2007-05-11 2008-11-20 The Johns Hopkins University Biomarkers for melanoma
WO2009137095A2 (en) 2008-05-08 2009-11-12 The Johns Hopkins University Compositions and methods for modulating an immune response
KR20110095292A (ko) * 2008-11-06 2011-08-24 유니버시티 오브 워싱톤 다중블록 공중합체
CN102781237A (zh) * 2009-11-23 2012-11-14 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的基于环糊精的聚合物
WO2011143651A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolism
EP2569434B1 (de) 2010-05-14 2019-09-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von leukämie und verwandten erkrankungen
US9320814B2 (en) * 2011-11-01 2016-04-26 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Polyplexes of hydrophobically-modified siRNA for delivery of siRNA
CA2856116A1 (en) 2011-11-17 2013-05-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Therapeutic rna switches compositions and methods of use
CA2856117A1 (en) 2011-11-17 2013-05-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Auto-recognizing therapeutic rna/dna chimeric nanoparticles (np)
US9556432B2 (en) 2012-01-10 2017-01-31 The Research Foundation For The State University Of New York Method of treating hyperlipidemia and atherosclerosis with miR-30C
EP3971571A3 (de) 2012-05-25 2022-06-08 The University of Vermont and State Agriculture College Zusammensetzungen und verfahren zum testen der thrombozytenreaktivität und behandlungsauswahl
US20140094432A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
EP3034539A1 (de) * 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Zusammensetzungen zur Einführung von Nukleinsäure in Zellen
WO2017081686A1 (en) 2015-11-10 2017-05-18 B. G. Negev Technologies And Applications Ltd., At Ben-Gurion University Means and methods for reducing tumorigenicity of cancer stem cells
US10596248B2 (en) 2015-12-09 2020-03-24 Jingang Medicine (Australia) Pty Ltd Immunomodulating composition for treatment
EP3386594B1 (de) 2015-12-11 2023-05-03 The General Hospital Corporation Kombination eines hemmer des pdgf-a rezeptors hemmers und eines hemmer der histon-lysin-demethylase zur behandlung arzneimitteltoleranter glioblastom
CA3096274A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
WO2021248052A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating neoplasia

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5944489A (ja) * 1982-09-07 1984-03-12 帝国石油株式会社 原油回収用ミセル溶液組成物
US5041288A (en) * 1986-05-15 1991-08-20 Emory University Method of treating tissue damaged by reperfusion injury
US5017370A (en) * 1986-05-15 1991-05-21 Emory University Improved method of performing angioplasty procedures
US4873083A (en) * 1986-05-15 1989-10-10 Emory University Fibrinolytic composition
US5030448A (en) * 1986-05-15 1991-07-09 Emory University Method of delivering drugs to damaged or diseased tissue
US4801452A (en) * 1986-05-15 1989-01-31 Hunter Robert L Fibrinolytic composition
US5047236A (en) * 1986-05-15 1991-09-10 Emory University Method of treating stroke
US4879109A (en) * 1986-05-15 1989-11-07 Emory University Method for treating burns
EP0262516A2 (de) * 1986-09-29 1988-04-06 Miles Inc. Genetische Transformation von Milchsäurebakterien
AU3129993A (en) * 1991-11-08 1993-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Localized oligonucleotide therapy
DE69431959T2 (de) * 1993-10-15 2003-11-06 Cytrx Corp Therapeutische abgabesysteme und verfahren für ihre verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996015778A1 (en) 1996-05-30
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US5656611A (en) 1997-08-12
EP0789564B1 (de) 2006-03-22

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