DE69531889T2 - Biologisch aktive Fragmente des Glucagon ähnlichen, insulinotropen Peptides - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die medizinische Chemie und liefert neue Peptide und Zusammensetzungen hiervon, die zur Behandlung von Diabetes brauchbar sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Endokrine Sekretionen von Pankreasinselzellen werden durch komplexe Kontrollmechanismen reguliert, die nicht nur durch aus dem Blut stammende Metaboliten gesteuert werden, wie Glucose, Aminosäuren und Catecholmaine, sondern auch durch lokale parakrine Einflüsse. Die hauptsächlichen Pankreasinselzellenhormone, nämlich Glucagon, Insulin und Somatostatin, wechselwirken mit spezifischen Pankreaszelltypen (jeweils A, B und D Zellen), um die Sekretionsreaktion zu modulieren. Obwohl die Insulinsekretion vorwiegend durch die Blutglucosespiegel kontrolliert wird, hemmt Somatostatin die durch Glucose verinittelte Insulinsekretion.
  • Das humane Hormon Glucagon ist ein 29 Aminosäuren langes Hormon, das in Pankreas-A-Zellen gebildet wird. Das Hormon gehört zu einer Multigenfamilie an strukturell verwandten Peptiden, die Sekretin, Enterogastron, vasoaktives-intestinales Peptid und Glicentin umfassen. Diese Peptide regulieren den Kohlenhydratmetabolismus, die gastrointestinale Motilität und die sekretorische Prozessierung auf verschiedene Weise. Jedoch sind die vorwiegend wahrgenommenen Wirkungen des Pankreasglucagons die Förderung der hepatischen Glycogenolyse und Glyconeogenese, was zu einer Erhöhung der Blutzuckerspiegel führt. Diesbezüglich wirken die Aktivitäten von G1ucagon denen von Insulin entgegen und können zur Hyperglykämie beitragen, die Diabetes mellitus begleitet (P. K. Lund et a]., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 345–349(1982)).
  • Wenn Glucagon an den Rezeptor auf Insulin-produzierenden Zellen bindet, steigt die cAMP Bildung an, die wiederum die Insulinexpression stimuliert (L. Y. Korman et al., Diabetes 34: 717–722 (1985)). Darüberhinaus regulieren große Mengen an Insulin die Glucagonsynthese durch einen zurückwirkenden Hemmmechanismus nach unten (W. F. Ganong, Review of Medical Physiology, Lange Publications, Los Altos, California, Seite 273 (1979)). Daher wird die Expression von Glucagon sorgfältig von Insulin und letztlich durch die Serumglucosespiegel reguliert.
  • Präproglucagon, die Zymogenform von Glucagon, wird aus einem 360 Basenpaaren langen Gen translatiert und wird unter Bildung von Proglucagon prozessiert. (Lund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 345–349(1982)). Patzelt et al., (Nature, 282: 260–266(1979)) zeigen, dass Proglucagon weiter zu Glucagon und einem zweiten Peptid prozessiert wird. Spätere Experimente haben gezeigt, dass Proglucagon auf der Carboxylseite von Lys-Arg oder Arg-Arg Resten gespalten wird (P. K. Lund et al., L. C. Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 5485–5489(1983) und G. I. Bell et al., Nature 302: 716–718(1983)). G. I. Bell et al., haben auch festgestellt, dass das Proglucagon 3 diskrete und hoch homologe Peptidregionen enthält, die als Glucagon, Glucagon-ähnliches Peptid 1 (GLP-1) und Glucagon-ähnliches Peptid 2 (GLP-2) bezeichnet werden. Lopez et al. haben gezeigt, dass GLP-1 ein 37 Aminosäuren langes Peptid ist und dass GLP-2 ein 34 Aminosäuren langes Peptid ist. Analoge Untersuchungen bezüglich der Struktur von Rattenpräproglucagon haben ein ähnliches Muster an proteolytischer Spaltung an Lys-Arg oder Arg-Arg Resten gezeigt, was zur Bildung von Glucagon, GLP-1 und GLP-2 führt (G. Heinrich et al. Endocrinol., 115: 2176–2186(1984)). Schließlich wurde festgestellt, dass GLP-1- Sequenzen aus dem Menschen, der Ratte, dein Rind und dem Hamster identisch sind (M. Ghiglione et al., Diabetologia, 27: 599–600(1984)).
  • Die von Lopez et al. gezogene Schlussfolgerung bezüglich der Größe von GLP-1 wird durch die Untersuchung der molekularen Formen von GLP-1 bestätigt, die im humanen Pankreas gefunden werden (L. O. Uttenthal et al., 7. Clin. Endocrinol. Metabol., 61: 472–479(1985)). Ihre Forschung zeigt, dass GLP-1 und GLP-2 im Pankreas als Peptide mit jeweils 37 und 34 Aminosäuren vorkommen.
  • Die Ähnlichkeit zwischen GLP-1 und Glucagon hat die ersten Forscher vermuten lassen, dass GLP-1 eine biologische Aktivität haben könnte. Obwohl einige Forscher festgestellt haben, dass GLP-1 Rattenhirnzellen zur Synthese von cAMP induzieren können (N. M. Hoosein et al., Febs. Lett 178: 83–86(1984)) ist es anderen Forschern nicht gelungen, eine physiologische Rolle für GLP-1 zu finden (L. C. Lopez et al., siehe obige Literaturstelle). Jedoch ist von GLP-1 jetzt bekannt, dass es die Insulinsekretion stimuliert (insulinotrope Wirkung), was eine Glucoseaufnahme durch Zellen verursacht, die die Serumglucosemengen verringert (siehe beispielsweise S. Mojsov, Int. 7. Peptide Protein Research, 40: 333– 343(1992)).
  • Es sind mehrere GLP-1 Analoga in der Technik bekannt, die eine insulinotrope Wirkung zeigen. Diese Varianten und Analoga umfassen beispielsweise GLP-1(7-36), Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), Acetyl-Lys9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1(7-37) und Lys18-GLP-1(7-37). Derivate von GLP-1 umfassen beispielsweise Säureadditionssalze, Carboxylatsalze, Niederalkylester und Amide (siehe beispielsweise WO91/11457 A (1991)). Bedeutender ist, dass mittels GLP-1(8-37)OH gezeigt wurde, dass der Histidinrest an der Position 7 sehr wichtig für die insulinotrope Aktivität von GLP-1 ist (S. Suzuki et al., Diabetes Res., Clinical Practice 5, (Supp. 1): S30 (1988).
  • Endocrinology, Band 125, Nummer 6 von 1989, Suzuki et al., "Comparison of the Effects of Various C-Terminal and N-Terminal Fragment Peptides of Glucagon-like Peptide-1 on Insulin and Glucagon Release from the Isolated Perfused Rat Pankreas", Seiten 3109–3114 beschreibt, dass das verkürzte Glucagon-ähnliche Peptid-1 (GLP-1) eine starke stimulierende Aktivität auf die Insulinbildung besitzt. Es werden die Aktivitäten der N- und C-terminalen Fragmente untersucht.
  • In Anbetracht des oben Erwähnten ist es am überraschendsten, dass festgestellt wurde, dass die Verabreichung der N-terminal deletierten Mutanten von GLP-1 an Versuchstiere eine Steigerung der Serumglucoseaufnahme in Abwesenheit einer insulinotropen Aktivität verursacht. Diese Feststellung legt nahe, dass ein vollkommen neuer Mechanismus zur Verringerung der erhöhten Blutglucosespiegel existieren kann und das hat direkt zur vorliegenden Erfindung geführt.
  • Demnach ist es das primäre Ziel der Erfindung, neue C-terminale GLP-1 Fragmente ohne insulinotrope Wirkung bereitzustellen, die trotzdem zur Behandlung von Diabetes und hyperglykämischen Reaktionen brauchbar sind. Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die biologisch aktive GLP-1 Fragmente enthalten, wie auch Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen zur Behandlung von Diabetes.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein geschütztes, ungeschütztes oder teilweise geschütztes GLP-1 Fragment bereitgestellt, das aus den folgenden Formeln ausgewählt ist:
    Figure 00020001
    Figure 00030001
    worin R1 ausgewählt ist aus NH2, OH, Gly-NH2 und Gly-OH, und
    R2 ausgewählt ist aus OH und NH2.
  • Vorzugsweise ist die Formel des GLP-1 Fragments die folgende
    Figure 00030002
    worin R1 ausgewählt ist aus NH2, OH, Gly-NH2 und Gly-OH.
    Figure 00030003
    worin R1 ausgewählt ist aus NH2, OH, Gly-NH2 und Gly-OH.
    Figure 00030004
    worin R1 ausgewählt ist aus NH2, OH, Gly-NH2 und Gly-OH.
    Figure 00030005
    worin R2 ausgewählt ist aus NH2 und OH.
  • Das GLP-1 Fragment wird vorzugsweise geschützt oder teilweise geschützt. Insbesondere kann die Seitenkette der Aminosäure Lys geschützt werden. Die Seitenkette der Aminosäure Lys kann durch Acetyl oder Cl-Z geschützt werden.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein GLP-1 Fragment der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Diabetes oder Hyperglykämie bei einem Säuger bereitgestellt.
  • Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein GLP-1 Fragment der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthält.
  • Die Zusammensetzung kann zur Behandlung von Diabetes oder Hyperglykämie bei einem Säuger verwendet werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines GLP-1 Fragments gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes bereitgestellt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In einer Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung neue, biologisch aktive, C-terminale Fragmente von GLP-1. Für die Zwecke der Beschreibung bezieht sich der Ausdruck "biologisch wirksam" auf die Fähigkeit einer Substanz, die erhöhten Blutglucosespiegel in einem Säuger ohne der Stimulierung der Insulinsekretion zu verringern.
  • Mit der hierin beschriebenen Sequenzinformation und dem Stand der Technik in der Festphasenproteinsynthese können biologisch aktive GLP-1 Fragmente durch chemische Synthese erhalten werden. Jedoch ist es auch möglich, ein biologisch wirksames GLP-1 Fragment durch die Fragmentierung von Proglucagon mittels beispielsweise proteolytischer Enzyme zu erhalten. Darüberhinaus können rekombinante DNA Techniken zur Expression von biologisch aktiven GLP-1 Fragmenten verwendet werden.
  • Die Prinzipien der chemischen Festphasensynthese von Polypeptiden sind in der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Texten im Fachgebiet gefunden werden, wie H. Dugas und C. Penney, Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York, Seiten 54–92, J. M. Merrifield Chem. Soc., 85: 2149(1962) und Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Seiten 24–66, Freeman (San Francisco, 1969).
  • Beispielsweise kann ein biologisch aktives GLP-1 Fragment durch Festphasenmethodik mittels eines Applied Biosystems 430A Peptidsynthesegeräts (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) und Syntheseryklen, die von Applied Biosystems bereitgestellt werden, synthetisiert werden. BOC-Aminosäuren und andere Reagenzien sind im Handel von Applied Biosystems und anderen chemischen Herstellern erhältlich. Sequentielle BOC-Chemie mittels Doppelkupplungsprotokollen werden au die p-Methylbenzhydrylaminausgangsharze zur Herstellung der C-terminalen Carboxamide angewendet. Zur Herstellung der C-terminalen Säuren wird das entsprechende PAM Harz verwendet. Asp, Gln und Arg werden mittels vorgefertigter Hydroxybenzotriazolester gekuppelt. Die folgenden Seitenkettenschutzgruppen können verwendet werden:
    Arg, Tosyl
    Asp, Cylohexyl
    Glu, Cylohexyl
    Ser, Benzyl
    Thr, Benzyl
    Tyr, 4-Bromcarbobenzoxy
  • Die Abspaltung der BOC-Gruppe kann mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid erreicht werden. Nach der Vervollständigung der Synthese können mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (F), der 10% meta-Cresol enthält, die Schutzgruppen entfernt und die Peptide vom Harz abgespalten werden. Die Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen und des Peptids vom Harz wird bei Null Grad Celsius oder darunter, vorzugsweise bei –20°C für dreißig Minuten gefolgt von dreißig Minuten bei 0°C durchgefülhrt. Nach der Entfernung des HF wird das Peptid/Harz mit Ether gewaschen und das Peptid wird mit Eisessig extrahiert und lyophilisiert.
  • Die Herstellung von geschütztem, ungeschütztem und partiell geschütztem GLP-1 wurde in der Technik beschrieben. Siehe US 5 120 712 A und US 5 118 666 A , die hiermit eingeführt sind, und C. Orskov et al., J. Biol. Chem., 264(22); 12826–12829(1989) und WO 91/11457 A (D. I. Buckley et al. vom B. August 1991).
  • Ähnlich liefert der Stand der Technik in der Molekularbiologie dein Fachmann ein weiteres Mittel, durch das biologisch aktive GLP-1 Fragmente erhalten werden können. Obwohl GLP-1 Fragmente durch Festphasenpeptidsynthese, rekombinante Verfahren oder Fragmentierung von Glucagon lergestellt werden können, können rekombinante Verfahren bevorzugt sein, da höhere Ausbeuten möglich sind. Die grundlegenden Schritte bei der rekombinanten Herstellung eines biologisch aktiven GLP-1 Fragments umfassen:
    • a) Isolierung einer natürlichen DNA Sequenz, die für GLP-1 kodiert, oder Konstruktion einer synthetischen oder semisynthetischen für GLP-1 kodierenden DNA Sequenz,
    • b) Plazieren der kodierenden Sequenz in einen Expressionsvektor in einer Weise, die zur Expression der Proteine entweder alleine oder als Fusionsproteine geeignet ist,
    • c) Transformation einer geeigneten eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszelle mit dem Expressionsvektor,
    • d) Kultivierung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression eines GLP-1 Zwischenprodukts erlauben, und
    • e) Gewinnung und Reinigung des rekombinant hergestellten Proteins.
  • Wie vorher erwähnt können die kodierenden Sequenzen für GLP-1 Fragmente vollkommen synthetisch sein oder das Ergebnis einer Modifizierung der längeren, für natives GLP-1 kodierenden DNA sein. Eine DNA Sequenz, die für Präproglucagon kodiert, ist in Lund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 345–49 (1982) beschrieben und kann als Ausgangsmaterial bei der rekombinanten Herstellung eines biologisch aktiven GLP-1 Fragments durch Veränderung der nativen Sequenz zur Erreichung der gewünschten Ergebnisse verwendet werden.
  • Synthetische Gene, deren in vitro oder in vivo Transkription und Translation zur Bildung eines biologisch aktiven GLP-1 Fragments führen, können durch Techniken konstruiert werden, die in der Technik gut bekannt sind. Aufgrund der natürlichen Degeneriertheit des genetischen Codes erkennt der Fachmann, dass eine beträchtliche aber definierte Anzahl an DNA Sequenzen konstruiert werden kann, die für GLP-1 Zwischenprodukte kodieren.
  • Die Methodik der Konstruktion von synthetischen Genen ist in der Technik gut bekannt. Siehe Brown et al., (1979) Methods in Enzymology, Academic Press, N. Y., Band 68, Seiten 109–151. DNA Sequenzen, die für GLP-1 Zwischenprodukte kodieren, können aufgrund der hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen entworfen werden. Einmal entworfen, kann die Sequenz an sich mittels herkömmlicher DNA Synthesegeräte hergestellt werden, wie den Applied Biosystems Model 380A oder 380B DNA Synthesegeräten (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).
  • Um die Expression eines biologisch aktiven GLP-1 Fragments zu bewirken, inseriert man die Hergestellte synthetische DNA Sequenz in einem von vielen geeigneten rekombinanten DNA Expressionsvektoren durch die Verwendung von geeigneten Restriktionsendonukleasen. Siehe allgemein Maniatis et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., Band 1–3. Es werden Restriktionsschnittstellen an jedes Ende der für das GLP-1 Fragment kodierenden DNA angebracht, um die Isolierung von und die Integration in bekannte Amplifizierungs- und Expressionsvektoren zu erleichtern. Die im einzelnen verwendeten Endonukleasen werden durch das Restriktionsmuster des verwendeten Ausgangsexpressionsvektors vorgegeben. Die Wahl der Restriktionsschnittstellen erfolgt so, dass die kodierende Sequenz mit den Kontrollsequenzen richtig orientiert wird, um eine im Leserahmen korrekte Ablesung und Expression des Proteins von Interesse zu erreichen. Die kodierende Sequenz muss so positioniert werden, dass sie im richtigen Leserahmen mit dein Promotor und der Ribosomenbindungsstelle des Expressionsvektors liegt, die beide in der Wirtszelle funktionsfähig sind, in der das Protein exprimiert werden soll.
  • Um eine effiziente Transkription der kodierenden Region zu erreichen, muss das Gen funktionsfähig mit einer Promotor-Operator Region verbunden sein. Daher wird die Promotor-Operator Region des Gens in derselben sequenziellen Orientierung in Bezug auf das ATG Startcodon der kodierenden Region plaziert.
  • Es ist eine Vielzahl an Expressionsvektoren in der Technik gut bekannt, die zur Transformation von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen brauchbar sind. Siehe The Promega Biological Research Products Catalogue (1992) (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 53711–5399) und The Stratagene Cloning Systems Catalogue (1992) (Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037). Die US-A 4 710 473 beschreibt ebenfalls Plasmidtransformationsvektoren aus zirkulärer DNA, die zur Expression von exogenen Genen in E. coli in hohen Mengen brauchbar sind. Diese Plasmide sind als Transformationsvektoren in rekombinanten DNA Verfahren brauchbar und
    • (a) verleihen dem Plasmid die Fähigkeit zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle,
    • (b) kontrollieren die autonome Plasmidreplikation in Bezug zur Temperatur, bei der die Wirtszellkulturen gehalten werden,
    • (c) stabilisieren den Erhalt des Plasmids in den Wirtszellpopulationen,
    • (d) steuern die Synthese eines Proteinprodukts, das den Plasmiderhalt in einer Wirtszellpopulation anzeigt,
    • (e) liefern eine Reihe von Restriktionsschnittstellen, die in dein Plasmid nur eimnal vorkommen, und
    • (f) beenden die mRNA Transkription.
  • Diese zirkulären DNA Plasmide sind als Vektoren in rekombinanten DNA Verfahren zur Sicherstellung von hohen Expressionsspiegeln von exogenen Genen brauchbar.
  • Nach der Konstruktion eines Expressionsvektors für ein biologisch aktives GLP-1 Fragment ist der nächste Schritt die Plazierung in eine geeignete Zelle und die Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle hierdurch, die zur Expression eines biologisch aktiven GLP-1 Fragments fähig ist. Techniken zur Transformation von Zellen mit rekombinanten DNA Vektoren sind in der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Literaturen, wie Maniatis et al., siehe obige Literaturstelle gefunden werden. Wirtszellen können entweder aus eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen konstruiert werden. Eukaryotische Wirtszellen sind zur Durchführung von posttranslationalen Glykosylierungen an exprimierten Proteinen fähig und einige sind zur Sekretion des gewünschten Proteins in das Kulturmedium fähig.
  • Prokaryotische Wirtszellen bilden im allgemeinen das Protein mit größeren Geschwindigkeiten, sind leichter zu kultivieren aber sind nicht zur Glykosylierung des fertigen Proteins fähig. Proteine, die in hohem Maß in bakteriellen Exressionssystemen exprimiert werden, aggregieren charakteristischerweise in Granula oder Einschlusskörperchen, die hohe Mengen des überexprimierten Proteins enthalten. Solche Proteinaggregate müssen typischerweise mittels in der Technik gut bekannter Verfahren aufgelöst, denaturiert und rückgefaltet werden. Siehe Kreuger et al., (1990) in Protein Folding, Gierasch und King, Herausgeber, Seiten 136–142, American Association for the Advancement of Science Publication Nr. 89–185, Washington, D. C. und US-A 4 923 967.
  • Unabhängig von den zur Herstellung eines biologisch aktiven GLP-1 Fragments verwendeten Verfahren wird im allgemeinen eine Reinigung des Proteins erforderlich sein. Verfahren zur Reinigung von Proteinen sind in der Technik gut bekannt und umfassen herkömmliche Chromatographie, einschließlich Ionen- und Kationenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung und Chromatographie-Immunaffinitätsmedien. Die hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen ermöglichen in Zusammenhang mit den gut bekannten Proteinreinigungsverfahren es dem Fachmann, die hierin beanspruchten biologisch aktiven GLP-1 Fragmente zu reinigen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Salzformen der biologisch aktiven GLP-1 Fragmente. Ein biologisch aktives GLP-1 Fragment der Erfindung kann ausreichend sauer oder ausreichend basisch sein, um mit einer Vielzahl an anorganischen Basen und anorganischen und organischen Säuren unter Bildung eines Salzes zu reagieren. Säuren, die herkömmlich zur Bildung von Säureadditionssalzen verwendet werden, sind anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoff säure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phsphorsäure und dergleichen und organische Säuren, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Essigsäure und dergleichen. Beispiele für solche Salze umfassen Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfat, Bisulfit, Phosphat, Monohzdrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caproat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, γ-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, Mandelat und dergleichen. Bevorzugte Säureadditionssalze sind die, die mit Mineralsäuren gebildet werden, wie Chlorwasserstoffsäure und Bromwasserstoffsäure, und speziell Chlorwasserstoffsäure.
  • Basenadditionssalze umfassen die, welche von anorganischen Basen stammen, wie Ammonium- oder Alkalioder Erdalkalimetallhydroxide, -carbonate, -bicarbonate und dergleichen. Solche zur Herstellung der erfindungsgemäßen Salze brauchbaren Basen sind unter anderem Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumcarbonat und dergleichen. Die Salzformen der GLP-1 Analoga sind besonders bevorzugt. Wenn natürlich die erfindungsgemäßen Verbindungen für therapeutische Zwecke verwendet werden, können diese Verbindungen auch in Form eines Salzes vorliegen, aber das Salz muss pharmazeutisch annehmbar sein.
  • Die Unfähigkeit eines GLP-1 Fragments zur Stimulierung der Insulinsekretion kann durch die Bereitstellung eines GLP-1 Fragments an kultivierte Tierzellen, wie der RIN-38 Ratteninsulinomzelllinie und der Verfolgung der Freisetzung von immunreaktivem Insulin (IRI) in das Medium bestimmt werden. Alternativ dazu kann man ein GLP-1 Fragment in ein Ter injizieren und die Plasmamengen von Immunreaktivem Insulin (IRI) verfolgen.
  • Das Vorkommen von IRI wird durch die Verwendung eines Radioimmuntests detektiert, der speziell Insulin detektieren kann. Jeder Immuntest, der zur Detektion des Vorkommens von IRI fähig ist, kann verwendet werden, wobei ein solcher Test eine Modifikation des von J. D. M. Albino et al., Acta Endocrinol., 70: 487–509(1972) beschriebenen Verfahrens ist. In dieser Modifikation wird ein Phosphat/Albuminpuffer mit einem pH von 7,4 verwendet. Die Inkubation wird mit der anschließenden Zugabe von 500 μl Phosphatpuffer, 50 μl Perfusatprobe oder Ratteninsulinstandard im Perfusat, 100 μl Antiinsulinantiserum (Wellcome Laboratories, 1 : 40 000 Verdünnung) und 100 μl [125I] Insulin ausgeführt, was ein Gesamtvolumen von 750 μl in einem 10 × 75 mm Einwegglasröhrchen ergibt. Nach der Inkubation für 2–3 Tage bei 4°C wird das freie Insulin vom Antikörper-gebundenen Insulin durch Aktivkohleabtrennung getrennt. Die Testempfindlichkeit beträgt 1–2 μE/ml. Um die Freisetzung von IRI an das Zellkultwmedium von Zellen zu messen, die in Gewebekultur angezogen wurden, wird vorzugsweise eine radioaktive Markierung in das Proinsulin eingearbeitet. Obwohl jede radioaktive Markierung verwendet werden kann, die zur Markierung eines Polypeptids fähig ist, ist die Verwendung von 3H Leucin bevorzugt, um markiertes Proinsulin zu erhalten.
  • Ob ein GLP-1 Fragment insulinotrope Eigenschaften aufweist, kann auch durch Pankreasinfusion bestimmt werden. Der in situ isolierte perfundierte Rattenpankreastest ist eine Modifikation des Verfahrens von J. C. Penhos et al., Diabetes, 18: 733–738(1969). Gefastete männliche Albinoratten vom Charles River Stamm, die 350–600 g wiegen, werden mit einer intraperitonealen Injektion mit Amytal-Natrium (Eli Lilly und Co. 160 ng/kg) betäubt. Die Blutgefäße der Niere, der Nebenniere, des Magens und des unteren Colons werden ligiert. Der gesamte Dünndarm wird bis auf wenige cm des Duodenums und des absteigenden Colons und des Rektums entfernt. Daher ist nur ein kleiner Teil des Dünndarms perfundiert, was die mögliche Wechselwirkung durch enterische Substanzen mit Glucagon-ähnlicher Immuweaktivität minimiert. Das Perfusat ist ein modifizierter Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer mit 4% Dextrin T70 und 0,2% Rinderserumalbumin (Fraktion V) und wird mit 95% O2 und 5% CO2 begast. Eine 4-Kanalrollenpumpe mit einem nicht pulsierenden Fluss (Buchler polystatisch, Buchler Instruments Division, Nuclear-Chicago Corp.) wird verwendet und eine Umschaltung von einer Perfusatquelle zur anderen wird durch die Umschaltung eines Dreiwegehahns erreicht. Die Art, au der die Perfusion ausgeführt, verfolgt und analysiert wird, folgt der Methode von C. C. Weir et al., J. Clin. Investigat. 54: 1403–1412(1974), die hiermit eingeführt ist.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein GLP-1 Fragment der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthalten. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen werden au eine in der pharmazeutischen Technik bekannten Weise hergestellt und werden einzeln oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln vorzugsweise über parenterale Wege verabreicht. Speziell bevorzugte Wege umfassen die intramuskuläre und subkutane Verabreichung.
  • Parenterale Tagesdosen, vorzugsweise eine einzelne Tagesdosis, liegen im Bereich von etwa 1 pg/kg bis etwa 1000 μg/kg Körpergewicht, obwohl geringere oder höhere Dosierungen verabreicht werden können. Die erforderliche Dosis hängt von der Schwere des Zustands des Patienten und von Kriterien ab, wie der Größe, dem Gewicht, dem Geschlecht, dem Alter und der Krankengeschichte.
  • Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff, der zumindest ein Protein der vorliegenden Erfindung umfasst, gewöhnlich mit einem Hilfsstoff gemischt oder mit einem Hilfsstoff verdünnt. Wenn ein Hilfsstoff als Verdünnungsmittel verwendet wird, kann dies ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel, Träger oder Medium für den Wirkstoff dient.
  • Bei der Herstellung einer Formulierung kann es notwendig sein, den Wirkstoff zu mahlen, im die geeignete Partikelgröße vor der Kombination mit den anderen Inhaltsstoffen bereitzustellen. Falls der Wirkstoff im wesentlichen unlöslich ist, wird er gewöhnlich au eine Partikelgröße von weniger als etwa 200 Mesh gemahlen. Falls der Wirkstoff im wesentlichen wasserlöslich ist, wird die Partikelgröße normalerweise durch Mahlen eingestellt, um eine im wesentlichen gleichförmige Verteilung in der Formulierung bereitzustellen, beispielsweise etwa 40 Mesh.
  • Einige Beispiele für geeignete Hilfsstoffe sind unter anderem Lactose, Glucose, Saccharose, Trehalose, Sorbit, Mannit, Stärkearten, Akaziengummi, Calciumsilicat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup und Methylcellulose. Die Formulierungen können zusätzlich Gleitmittel, wie Talkum, Magnesiumstearat und Mineralöl, Netzmittel, Emulgier- und Suspendiermittel, Konservierungsmittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate, Süßstoffe und Geschmacksstoffe enthalten. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können so formuliert werden, dass sie eine schnelle, anhaltende oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs nach der Verabreichung an den Patienten durch Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren bereitstellen.
  • Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer Einheitsdosierungsform formiliert, wobei jede Dosierung normalerweise etwa 50 μg bis etwa 100 mg, gewöhnlicher etwa 1 mg bis etwa 10 mg des Wirkstoffs enthält. Der Ausdruck "Einheitsdosierungsform" bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einmalige Dosierungen für den Menschen oder andere Säuger geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff die zur Herstellung des gewünschten therapeutischen Effekts berechnet wurde, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoff enthält.
  • Für die Zwecke der parenteralen Verabreichung werden Zusammensetzungen, die ein Protein der vorliegenden Erfindung enthalten, vorzugsweise mit destilliertem Wasser kombiniert und der pH wird auf etwa 6,0 bis etwa 9,0 eingestellt.
  • Es können zusätzliche pharmazeutische Verfahren verwendet werden, um die Wirkdauer zu kontrollieren. Kontrolliert freisetzende Präparationen können durch die Verwendung von Polymeren erreicht werden, um eine Verbindung der vorliegenden Erfindung zu komplexieren oder zu absorbieren. Die kontrollierte Abgabe kann durch die Auswahl von geeigneten Makromolekülen (beispielsweise Polyestern, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und Protaminsulfat) und die Konzentration von Makromolekülen, wie auch der Verfahren der Einarbeitung, um die Freisetzung zu kontrollieren, erreicht werden.
  • Ein weiteres mögliches Verfahren zur Verlängerung der Wirkdauer durch kontrolliert freisetzende Präparationen ist die Einarbeitung eines Proteins der vorliegenden Erfindung in Partikel aus einem polymeren Material, wie Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Polymilchsäure oder Ethylenvinylacetatcopolymeren.
  • Alternativ dazu ist es anstelle der Einarbeitung einer Verbindung in diese polymeren Partikel möglich eine in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise jeweils Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln oder in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen, beispielsweise Liposomen, Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen einzuschließen. Solche Techniken sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.
  • Ähnlich liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Belandlung von Diabetes oder Hyperglycämie bei einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen der einer solchen Behandlung bedarf, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines GLP-1 Fragments oder einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen solchen Säuger umfasst.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung bereitgestellt, um bei der Beschreibung zu helfen, wie die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung hergestellt und ausgeführt werden. Diese Beispiele sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken.
  • Beispiel 1
  • Synthese von GLP-1(9-36)NH2
  • GLP-1(9-36)NH2 (SEQ ID Nr. 9) wird durch eine Festphasenpeptidchemie auf einem Applied Biosystems (ABI) 460A Peptidsynthesegerät mittels eines MBHA Harzes (Applied Biosystems Inc., Lotnummer A1A023, 0,77 mmol/g) hergestellt. Alle Aminosäuren haben ihre α-Aminogruppen durch die tert-Butyloxycarbonylgruppe (t-Boc) geschützt. Die Aminosäuren mit reaktiven Seitenketten haben diese wie folgt geschützt: Arg(Tos), Lys(C1-Z), Trp(CHO), Glu(CHex), Tyr(Br-Z, Ser(Bzl), Asp(OBzI) und Thr(Bzl).
  • Die geschützten Aminosäuren werden in Dichlormethan (DCM) mit einer Hälfte eines Äquivalents an Dicyclohexylcarbodümid (DCC) pro Äquivalent Aminosäure unter Bildung des symmetrischen Anhydrids der Aminosäure aktiviert. Jedoch werden Arginin-, Glutamin- und Glycinreste durch die Bildung der 1-Hydroxybenzotriazolester (HOBt) dieser Aminosäuren (1 : 1 : 1 Äquivalente an Aminosäure, HOBt und DCC und Dimethylfortnamid (DMF)) aktiviert.
  • Die Reste werden sequenziell vom C-terminalen zum N-terminalen Ende mit einer Reihe an Kupplungs- und Schutzgruppenabspaltungszyklen zusammengefügt. Ein Kupplungszyklus setzt sich aus einer aktivierten Aminosäure zusammen, die einer nukleophilen Substitution durch das freie primäre Amin der vorher gekuppelten Aminosäure unterzogen wird. Eine Schutzgruppenabspaltung ist die Entfernung der N-terminalen Schutzgruppe Boc mit wasserfreier Trifluoressigsäure (TFA). Dies erzeugt eine freie Amingruppe nach der Neutralisation mit Diisopropylethylamin (DIEA).
  • Der Synthesemaßstab beträgt 0,5 mmol. Die Konzentration der funktionellen Stellen am MBHA Harz beträgt 0,77 mmol/g, wobei 640 mg Harz verwendet werden. Es wird ein zweifacher molarer Überschuss des symmetrischen Anhydrids für alle Aminosäuren verwendet. Das C-terminale Arginin wird über Standardprotokolle an das MBHA Harz gekuppelt. Alle Reste werden doppelt gekuppelt. Das heißt, dass jeder Rest zweimal an das Harz gekuppelt wird. Die zweite Kupplung wird ohne einen Boc Schutzgruppenabspaltungsschritt durch die erneute Zugabe der Aminosäure ausgeführt. Dies hilft die freien Aminogruppen am Harz vollkommen umzusetzen. Der Tryptophanrest wird vierfach gekuppelt.
  • Nach dem zweiten Kupplungsschritt jedes Zweifachkupplungszyklus werden die N-terminalen Boc Gruppen mit wasserfreier TFA entfernt und mit DIEA neutralisiert.
  • Die Formylschutzgruppe der Seitenkette am Tryptophan wird mit Piperidin in DMF vor der Abspaltung des Peptids vom Harz entfernt. Nachdem das Peptidylharz in eine 50 ml Glasnutsche überführt wurde, wird es mehrmals mit DCM und DMF gewaschen. Dann werden 3–5 ml einer 50/50 Piperidin/DMF Lösung zum Peptidharz so zugegeben, dass es gerade bedeckt ist. Nach 5 Minuten wird das Piperidin/DMF durch Vakuum entfernt und 3–5 ml Piperidin/DMF werden zugegeben. Nach 10 Minuten wird das Piperidin/DMF erneut durch Vakuumfiltration entfernt und 15–20 ml Piperidin/DMF werden zugegeben. Nach 15 Minuten wird das Piperidin/DMF entfernt und das Peptidylharz wird mehrmals mit DMF, gefolgt von DCM gewaschen. Das Peptidylharz wird dann in einen Vakuumofen gegeben (keine Hitze), um das Lösemittel vollständig zu entfernen.
  • Wenn die Aminosäuren sequenziell gekuppelt und die Formylgruppe entfernt ist, wird das Peptid vom Harz durch Hydrolyse mit flüssiger Fluorwasserstoffsäure (F) bei 0°C für eine Stunde mittels eines Teflonreaktionsgefäßes entfernt. In dem Verfahren der Freisetzung des Peptids wird das C-terminale Hydroxid durch eine Amidgruppe vom MBHA-Harz ersetzt (siehe Matseuda und Stewart, Peptides 2: 45 (1981)). Für jedes Gramm an Peptidylharz wird 1 ml m-Cresolfänger zugegeben und dann werden 10 ml flüssiger HF verwendet. Der Fänger verhindert die Wiederanlagerung der Schutzgruppen der Seitenketten (freigesetzt als Carbokationen) an das Peptid. Nach 1 Stunde wird der HF durch Vakuum entfernt, wobei eine Auschlämmung aus Peptid, Harz und m-Cresol zurückbleibt.
  • Das Peptid wird dann im HF Reaktionsgefäß mit eiskaltem Diethylether gefällt. Der Niederschlag wird in eine 150 ml fassende Glasnutsche zusammen mit mehren Etherwaschschritten überführt. Das physikalische Gemisch aus Peptid/Harz wird mehrmals mit kaltem Ether gewaschen, um restlichen HF und m-Cresol zu entfernen. Der zweite Schritt ist die Extraktion des Peptids vom Harz mittels 10% Essigsäure in Wasser (V/V). Die Vakuumfiltration in einen sauberen Rundbodenkolben ergibt eine rohe Peptidlösung.
  • Beispiel 2
  • Reinigung
  • Die rohe in Beispiel 1 erhaltene Peptidlösung wird auf einer analytischen Umkehrplasen-HPLC bei pH 2,3 gefahren. Das Chromatogramm zeigt einen Hauptpeak, der anzeigt, dass eine beträchtliche Menge des gewünschten Produkts gebildet wurde und dass die präparative Reinigung garantiert wurde.
  • Die gesamte rohe Peptidlösung wird auf einer präparativen Umkehrpasen-HPLC bei pH 2 unter den folgenden Bedingungen gefahren:
    Puffer: A = 0,1% TFA, 10% Acetonitril B = 0,1% TFA, 50% Acetonitril
    Säule: Vydac C18 (2,2 × 25 cm)
    Temperatur: etwa 20°C
    Detektor: 280 nm
    Flussrate: 2,0 ml/min
    Gradient: 25% B bis 100% B über 1000 Minuten
  • Das Titelpeptid eluiert etwa bei 34% Acetonitril, wie dies durch analytische HPLC und Elektrospraymassenspektroskopie identifiziert wird. Die ungefähre Ausbeute beträgt 125 mg mit 60% Reinheit gemäß HPLC bei pH 2,3.
  • Die Ausbeute der etwa zu 60% reinen 125 mg wird darin au einer präparativen Umkehrphasen-HPLC bei pH 7,7 unter den folgenden Bedingungen gefahren:
    Puffer: A = 0,1% (NH4)HC03, 10% Acetonitril
    B = A, 50% Acetonitril
    Säule: Vydac C18 (2,2 × 25 cm)
    Temperatur: etwa 20°C
    Detektor: 280 nm
    Flussrate: 2,0 ml/min
    Gradient: 35% B bis 70% B über 1000 Minuten
  • Das Titelpeptid eluiert zwischen 32% und 37% Acetonitril, wie dies durch analytische HPLC identifiziert wird.
  • Die ungefähre Ausbeute beträgt 11%.
  • Beispiel 3
  • Synthese und Reinigung von GLP-1(9-37)OH
  • GLP-1(9-37)OH (SEQ ID Nr. 10) wird durch Festphasensynthese auf einem Modell 430A Peptidsynthesegerät (Applied Biosystems, Foster City, CA) mittels der Boc Schutzgruppenstrategie hergestellt. Die Schutzgruppen der Seitenketten sind: Asp(Chxl), Glu(OBzl), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Lys(C1-Z), His(BOM), Trp(CHO), Tyr(Br-Z) und Arg (Tos). Alle außer Asp(Chxl)(Peptides International) werden von Applied Biosystems erhalten. Jeder Rest wird unter Verwendung von entweder durch DCC initiiertem symmetrischem Anydrid oder HOBt Aktivierung doppelt gekuppelt.
  • Das Zwischenprodukt mit den 30 Aminosäuren bleibt am Harz. Die Titelverbindung wird im wesentlichen gemäß Beispiel 2 isoliert und eluiert zwischen 33% und 34% Acetonitril, wie dies durch analytische HPLC identifiziert wird. Die ungefähre Ausbeute beträgt 11%.
  • Beispiel 4
  • Synthese und Reinigung von GLP-1(8-37)OH
  • GLP-1(8-37)OH (SEQ ID Nr. 12) wird im wesentlichen gemäß Beispiel 3 synthetisiert und gemäß Beispiel 2 isoliert. Die Titelverbindung eluiert bei etwa 42% Acetonitril, wie dies durch analytische HPLC identifiziert wird. Die ungefähre Ausbeute beträgt 13%.
  • Beispiel 5
  • Synthese und Reinigung von GLP-1(826)(9-36)NH2
  • GLP-1 (R26)(9-36)NH2 (SEQ ID Nr. 13) wird im wesentlichen gemäß Beispiel 1 synthetisiert und gemäß Beispiel 2 isoliert. Die Titelverbindung eluiert bei etwa 34% Actonitril, wie dies durch analytische HPLC identifiziert wird.
  • Die ungefähre Ausbeute beträgt 4,1%.
  • Beispiel 6
  • In vivo hyperglycämischer Klemmentest
  • (Glucoseaufnahmetest)
  • (a) Tiervorbereitung:
  • Männliche Sprague-Dawley Ratten (Charles Rivers), die etwa 350 Gramm wiegen, können sich für eine Woche an ihre Umgebung gewöhnen, wonach sie unter einer Isofluoranbetäubung durch Inhalation mit Kanülen versehen werden. Es werden zwei Katheter in die Jugularvenen für die Infusion von Glucose und dem GLP-1 Fragment implantiert. Ein weiterer Katheter wird in die Arteria carotis zum Entnehmen von Blut implantiert. Die Katheter werden durch die Haut am Scheitel des Kopfes nach außen geführt, mit Glycerin/Heparin Lösung gefüllt (30 ml Glycerin/10 ml Heparin aus einer 1000 E/ml Stammlösung) und mit einem 1 Zentimeter langen Stahlverschluss verschlossen. Die Ratten werden einzeln in Drahtkäfigen gehalten und werden mit freiem Zugang zu einer Rattenstandardnahrung gefüttert. Jedes Tier kann sich zumindest für 1 Woche von der Operation erholen, bevor die GLP-1 Fragmente auf biologische Aktivität getestet werden.
  • (b) Test
  • Die Ratten lässt man über Nacht fasten, wobei am Morgen des Experiments Probenröhchen an die Katleter angeschlossen werden und die Röhrchen in einer Leichtgewichtedelstlhlfeder zum Schutz eingeschlossen werden. Die Ratten werden in ihren Käfigen für 15 Minuten akklimatisiert. Alle Experimente werden in sich frei bewegenden Ratten bei Bewusstsein ausgeführt.
  • Es wird eine Blutprobe des Ausgangszustands zur Messung der Insulin- und Glucosemengen zum Zeitpunkt 0 au der Uhr entnommen. Den Ratten wird ein Bolus aus 20% Glucose verabreicht, um entweder die Plasmaglucose au 150 mg/dl (8,3 mM) oder 200 mg/dl (11,2 mM) zu erhöhen. Die Plasmaglucosespiegel werden au dein gewählten Spiegel durch Messen der Plasmaglucosespiegel etwa alle 5 Minuten und einer Nachstellung der kalibrierten variablen Infusionspumpe gehalten, wie dies erforderlich ist, um die eingestellten Blutglucosespiegel aufrechtzuerhalten. Die Blutproben werden nach 45 Minuten und 60 Minuten für die Messungen der Kontrollperiode entnommen. Nach 60 Minuten an der Infusionsklammer werden 0,3 nmol/kg des experimentellen GLP-1 Fragments über den Jugularvenenkatheter injiziert und mit Kochsalzlösung gespült. Es werden Blutproben nach 62, 64, 66, 68, 70, 75, 80, 90, 100, 110 und 120 Minuten entnommen, um Glucose und Insulin zu messen.
  • Die Blutproben werden in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die Plasmakomponente abzutrennen. Die Plasmaglucose wird au einem Beckman Glucose Analyser II mittels der Glucoseoxidasemethode gemessen. Das Plasmainsulin wird durch einen Standardradioimmuntest nach den Angaben des Herstellers (Diagnostic Products Corp.) bestimmt. Die Aktivität des GLP-1 Fragments wird durch die prozentuale Veränderung der Glucoseinflusionsrate und der Veränderung in der Insulinsekretion bestimmt. Diese zwei Parameter werden verglichen, um Ratten zu kontrollieren, die nur Verdünnungsmittel erhalten haben. Die Testergebnisse sind in den Tabellen 1–6 zusammenfasst.
  • Anmerkung: Dieser Test basiert auf Berichten, dass die insulinotrope Wirkung von GLP-1 von Glucose abhängt. Dieses Testprotokoll eliminiert die Variabilität aufgrund fallender Glucosespiegel in anderen Protokollen mittels des "Bolusverfahrens". Die hyperglycämische Klemme umfasst die Verabreichung von verschiedenen Glucosemengen (20% Dextrose), um die Glucose auf einem konstanten Spiegel von 8,3 oder 11,2 mM in normalen, gefasteten Sprague Dawley Ratten zu halten. Die hyperglycämische Infusionsklemme wird für 1 Stunde aufrechterhalten, wonach das GLP-1 Frag ment als Bolus über die Jugularvene injiziert wird. Die hyperglycämische Infusionsklemme wird für eine weitere Stunde fortgesetzt. Es wird die Glucoseinfusionsrate (GIR) in den letzten 15 Minuten der Kontrollperiode und nach der Injektion des Peptids berechnet. Die Aktivität des Peptids wird durch die Zunahme der Glucoseinfusionsrate und der Veränderung in der Insulinsekretion nach der Injektion des Peptids bestimmt.
  • Tabelle 1 (200 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00140001
  • Tabelle 2 (200 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00150001
  • Tabelle 3 (200 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00150002
  • Tabelle 4 (200 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00160001
  • Tabelle 5 (200 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00170001
  • Tabelle 6 (150 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00180001
  • Tabelle 7 (150 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00190001
  • Tabelle 8 (150 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00200001
  • Tabelle 9 (150 mg/dl Plasmaglucose)
    Figure 00210001
  • Beispiel 7
  • In vitro GLP-1 Agonist cAMP Test
  • a) Membranpräparation des GLP-1 Rezeptors der Ratte
  • Die veröffentlichte DNA Sequenz für den GLP-1 Rattenrezeptor (B. Thorens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8641–8645(1992) und das Dihydrofolatreduktaseresistenzmarkergen werden zusammen mit Polymerasekettenreaktionstechniken (PCR) verwendet, um einen Expressionsvektor zu konstruieren. Die Dihydrofolatreduktase-defiziente mutierte Ovarzelllinie des Chinesischen Hamsters (DXB-11) wird mit dem Vektor Vansformiert, was zu einer rekombinanten Ovarzellinie des Chinesischen Hamsters führt, die den GLP-1 Membranrezeptor der Ratte exprimiert.
  • Die Zellen werden bis zur Konfluenz in 10% dialysiertem fetalem Rinderserum/Hochglucose Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 0,1% Prolin bei 37°C angezogen. Die Zellen werden dann geerntet und die Membranen werden präpariert, indem man zuerst die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und dann zweimal mit kaltem Puffer wäscht (25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 2 mM MgCl2, 1 mM Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA), 20 μg/ml Leupeptin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 2 μg/ml Aprotinin, 50 μg/ml Trypsininhibitor pH 8,0). Die gewaschenen Zellen werden in kaltem Puffer resuspendiert, in einem Glasteflonhomogenisiergerät lysiert und dann bei 35 300 × g für 30 Minuten bei 4°C gewaschen. Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird in kaltem Puffer resuspendiert und homogenisiert. 200 μl Aliquots (3,2 mg/m1) werden bei –80°C gelagert.
  • b) Test au cyclisches AMP(cAMP)
  • Kurz gesagt werden 10 μ Membranpräparation (80 μg/ml) mit 10 μl Testverbindung oder Referenzverbindung in Puffer (25 mM HEPES, 0,2% (G/n Rinderserumalbumin (BSA), pH 7,6) bei 32°C für 10 Minuten vorinkubiert. 5 μl Reaktionspuffer (25 mM HEPES, 0,2% (G/n BSA, 13 mM (CH3COO)2Mg × 4 H2O, 4 mM Adenosin-5'-triphoshat (ATP), 40 nM Guanosin-5'-O-3'-thiotriphosphat (GTP-6-s), 25 mM Creatinphosphat, Creatinkinase 250 E/ml, 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), pH 7,6) werden zugegeben und für weitere 30 Minuten inkubiert. Die Inkubationen werden durch die Zugabe von 25 μl an 10 mM EDTA und dein Fluoreszenzmarker gestoppt (cAMP-β Phycoerythrinkonjugat). Nachdem die Inkubation gestoppt wurde, werden 25 μl Affinitäts-gereinigtes anti-cAMP-Kaninchenantiserum (12,5 ml an 25 mM HEPES, 0,2% (G/n BSA, pH 7,6) zu einem Gläschen an lyophilisiertem Atiserum (Sigma Immuno Chemicals Produktnummer A-0670) gegeben. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 45 Minuten werden 25 μl anti-Kaninchen-IgG beschichtete Testpartikel (0,2% G/n zugegeben und für weitere 15 Minuten inkubiert. Die Platten werden dann entleert und au Fluoreszenz in einem Pandex Screen Gerät gemessen.
  • Dieser Test, ein au Partikelkonzentration basierender Fluoreszenzimmuntest, beruht auf der Kompetition zwischen unmarkiertem cAMP und einer fixierten Menge an Fluoreszenz-markiertem cAMP für eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen au einem CAMP spezifischen Antikörper. Durch Konstanthalten der Menge an fluoreszierendem Liganden und Antikörper, ist die Menge an durch den Antikörper gebundener Fluoreszenzliganden umgekehrt proportional zur Konzentration an umnarkiertem cAMP. Das antikörpergebundene cAMP wird dann durch Testpartikel gefangen, die durch Anti-Kaninchen IgG beschichtet sind. Die Abtrennung der gebundenen Antikörperfuktion wird durch Filtration au Fluoricon®-Ca Testplatten erreicht. Nach dein Messen der Fluoreszenz im Pellet wird die Menge an gebundenem fluoreszierendem cAMP berechnet. Die Geschwindigkeit der cAMP Bildung (pmol/min/mg) wird durch durch Interpolation aus einer Standardkurve berechnet.
  • In diesem Test zeigen Mittel, die in vivo eine insulinotrope Wirkung zeigen, wie GLP-1(7-37)OH eine erhöhte Fluoreszenzaktivität aufgrund der erhöhten cAMP Konzentration. Im Gegensatz dazu können Mittel ohne einer insulinotropen Wirkung in vivo die Bildung von cAMP nicht stimulieren und zeigen daher keine Zunahme in der Fluoreszenzintensität.
  • Tabelle 10
    Figure 00220001
  • Senuenzliste
    Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Figure 00270001

Claims (12)

  1. Geschütztes, ungeschütztes oder partiell geschütztes GLP-1 Fragment, ausgewählt aus den folgenden Formeln
    Figure 00280001
    worin R1 ausgewählt ist aus NH2, OH, Gly-NH2 und Gly-OH, und R2 ausgewählt ist aus OH und NH2.
  2. GLP-1 Fragment nach Anspruch 1, worin die Formel folgende ist
    Figure 00280002
    worin R1 ausgewählt ist aus NH2, OH, Gly-NH2 und Gly-OH.
  3. GLP-1 Fragment nach Anspruch 1, worin die Formel folgende ist
    Figure 00280003
    worin R1 ausgewählt ist aus NH2, OH, Gly-NH2 und Gly-OH.
  4. GLP-1 Fragment nach Anspruch 1, worin die Formel folgende ist
    Figure 00290001
    worin R1 ausgewählt ist aus NH2, OH, Gly-NH2 und Gly-OH.
  5. GLP-1 Fragment nach Anspruch 1, worin die Formel folgende ist
    Figure 00290002
    worin R2 ausgewählt ist aus NH2 und OH.
  6. GLP-1 Fragment nach einem Ansprüche 1 bis 5, worin das GLP-1 Fragment geschützt oder partiell geschützt ist.
  7. GLP-1 Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Seitenkette der Aminosäure Lys geschützt ist.
  8. GLP-1 Fragment nach Anspruch 7, worin die Seitenkette der Aminosäure Lys durch Acetyl oder C1-Z geschützt ist.
  9. GLP-1 Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes oder Hyperglykämie bei einem Säuger.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein GLP-1 Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in Kombination. mit einem pharmazeutischen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthält.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes oder Hyperglykämie bei einem Säuger.
  12. Verwendung eines GLP-1 Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.
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