DE69736634T2

DE69736634T2 - Antagonisten des intestinotrophen glp-2 peptides

Info

Publication number: DE69736634T2
Application number: DE69736634T
Authority: DE
Inventors: J. Daniel Toronto DRUCKER; E. Anna Toronto CRIVICI; Martin Bolton SUMNER-SMITH
Original assignee: 1149336 Ontario Inc; NPS Allelix Corp Canada
Current assignee: 1149336 Ontario Inc; NPS Allelix Corp Canada
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-07-18
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2017-07-19
Also published as: JP4026854B2; US20030109449A1; US6489295B1; CA2260291C; WO1998003547A1; ES2277676T3; US5994500A; AU3615797A; CA2260291A1; AU739263B2; EP0914341B1; JP2000516579A; ATE338771T1; DE69736634D1; EP0914341A1

Description

I. GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung sind das Glucagon betreffende Peptide, bei denen es sich um funktionelle Antagonisten von Glucagon-like Peptide 2 handelt, und auf ihre Anwendung, um einer Hyperplasie therapeutisch entgegenzuwirken oder eine Hypoplasie, insbesondere im Darmgewebe, zu induzieren.
II. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Expression der Glucagon-Gene ergibt eine Gewebe-determinierte Reihe verschiedener Peptidprodukte, die aus dem Proglucagon-Produkt (160 Reste) prozessiert werden. Die Organisation dieser Peptide im Proglucagon-Präkursor wurde durch das molekulare Klonieren von Präproglucagon-cDNAs aus dem Pankreas des Anglerfisches, der Ratte, des Hamsters und des Rindes abgeklärt. Diese Analysen gaben zu erkennen, dass Präproglucagon nicht nur die Sequenz von Glucagon und Glicentin, sondern auch zwei zusätzliche Glucagon-like Peptides (GLP-1 und GLP-2) enthält, die vom Glucagon und voneinander durch zwei Spacer oder intervenierende Peptide (IP-I und IP-II) getrennt sind. Diese Peptide sind von basischen Aminosäuepaaren flankiert, die für die klassischen Prohormon-Spaltungsstellen charakteristisch sind, was darauf hindeutet, dass sie nach der posttranslationalen Prozessierung von Proglucagon gegebenenfalls freigesetzt werden könnten (Drucker, Pankreas, 1990, 5(4): 484). Die Analyse der zum Beispiel aus dem Proglucagon in den Langerhansschen Inseln im Pankreas freigesetzten Peptide deutet darauf hin, dass das freigesetzte primäre Pankreas-Peptid das 29-mer-Glucagon darstellt, wohingegen Glicentin, Oxyntomodulin, IP-II und die Glucagon-like Peptides im Dünn- und Dickdarm prävalenter sind. Dieser Nachweis, dass die Glucagon-like Peptides im Darm gefunden werden, hat den Anstoß zur Erforschung der genauen Struktur und der putativen Funktion(en) dieser neu entdeckten Darmpeptide gegeben. Die meisten Studien haben sich auf GLP-1 konzentriert, weil mehrere Evidenzlinien darauf hingedeutet haben, dass GLP-1 ein wichtiges neues Regulationspeptid darstellen könnte. Es wurde tatsächlich bestimmt, dass es sich bei GLP-1 um den potentesten bekannten peptidergen Stimulus für die Insulinausschüttung handelt, eine Wirkung, die auf eine Glucose-abhängige Weise durch Interaktion mit Rezeptoren auf den β-Zellen des Pankreas vermittelt wird. GLP-1 und seine Derivate befinden sich in der Entwicklung zur Anwendung in der Behandlung von Diabetikern.
Bezüglich der biologischen Rolle von GLP-2 offenbart die gleichzeitig anhängige US-Anmeldung, Aktenzeichen 08/422,540 (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/32414), die hierin vollständig durch Bezugnahme eingeschlossen ist, dass GLP-2 von Säugern als ein trophisches Mittel zur Förderung des Wachstums von Darmgewebe wirkt. Die Wirkung von GLP-2 kommt insbesondere durch das gesteigerte Wachstum des Dünndarmgewebes deutlich zum Ausdruck. Überdies offenbaren die gleichzeitig anhängige US-Anmeldung, Aktenzeichen Nr. 08/631,273 und die PCT-Anmeldung Nr. PCT/CA 97/00252, die beide hierin vollständig unter Bezugnahme eingeschlossen sind, dass Analoge von GLP-2 von Vertebraten eine verstärkte intestinotrophe Aktivität aufweisen können.
III. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nunmehr entdeckt, dass die Veränderung der GLP-2-Peptidstruktur Peptide ergeben kann, die zur Inhibition der intestinotrophen Aktivität von GLP-2 fähig sind. Insbesondere und gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt werden Antagonisten bereitgestellt, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die der von einem ersten Referenz-GLP-2 von einem Säuger entspricht, das dergestalt mutiert wurde, dass von einem bis vier von jedwedem der ersten vier N-terminalen Reste deletiert werden. In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt entsprechen die Antagonisten einem Referenz-GLP-2 von einem Säuger, das dergestalt mutiert wurde, dass mindestens eine Aminosäure, die aus den Aminosäurepositionen ausgewählt ist, die den Aminosäurepositionen des humanen GLP-2 an Asp¹⁵, Thr²⁹ und Thr³² entsprechen, mit einer Aminosäure substituiert wird, die an dieser Position im Referenz-GLP-2 nicht natürlich vorkommt. In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird Position Ala² mit einer Aminosäure substituiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cys, Trp und PO₃-Tyr². In einem noch anderen erfindungsgemäßen Aspekt entspricht der Antagonist einem Polypeptid mit jedweder Kombination der vorstehenden Substitutionen und Deletionen, das relativ zum Referenz-GLP-2 von einem Säuger mutiert ist.
Als ein erfindungsgemäßer Aspekt bereitgestellt sind auch Verfahren zur Herstellung und Identifikation von GLP-2-Antagonisten.
Zur Anwendung in der medizinischen oder veterinärmedizinischen Behandlung wird weiter erfindungsgemäß eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend eine Menge eines GLP-2-Antagonisten, der zum Antagonisieren der GLP-2-Aktivität in vivo wirksam ist, und einen pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch verträglichen Träger.
Die GLP-2-Antagonistenaktivität der vorliegenden GLP-2-Antagonisten manifestiert sich in vivo als eine Reduktion der Masse des Dünndarmgewebes oder als eine Fähigkeit zur Inhibition der intestinotrophen Aktivität von GLP-2 oder intestinotrophen Analogen davon.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verwendung von Peptiden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen wie in den anhängenden Ansprüchen definiert ist.
IV. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind therapeutische und verwandte Anwendungen einer neuen Klasse von GLP-2-Antagonisten, insbesondere zur Abnahme der Wachstumsrate von gastrointestinalem Gewebe, insbesondere des Dünndarms. Die biologische Wirkung der vorliegenden GLP-2-Antagonisten manifestiert sich als eine Abnahme des Dünndarmgewichts relativ zu einer scheinbehandelten Kontrolle oder als eine Fähigkeit zur Inhibition der intestinotrophen Aktivität von GLP-2 oder einem intestinotrophen Analog von GLP-2 relativ zu einem Kontrolltier, dem entweder GLP-2 oder ein intestinotrophes Analog von GLP-2 allein gegeben wird.
Die vorliegenden GLP-2-Antagonisten stellen strukturelle Analoge der intestinotrophen GLP-2-Peptide dar. Die GLP-2-Peptide verweisen kollektiv auf die verschiedenen GLP-2-Formen von Vertebraten und auf modifizierte Formen (gekennzeichnet durch mindestens eine Addition, Deletion, Substitution und/oder Inkorporation eines Aminosäurerestes mit einer Blockierungsgruppe) der GLP-2-Analogen, die noch die intestinotrophe Aktivität beibehalten. Wie jedoch hierin beschrieben ist, können bestimmte stellenspezifische Veränderungen dieser intestinotrophen GLP-2-Peptide Antagonistenaktivität an das stellenspezifisch veränderte Analog verleihen.
Ohne durch die folgende Erklärung beschränkt zu sein, besteht die Annahme, dass die stellenspezifischen Veränderungen eine Antagonisten-Aktivität verleihen, die in eine der funktionellen Aktivitäten des GLP-2-Hormonpeptids, aber nicht in alle funktionellen Aktivitäten eingreift. Zum Beispiel kann es sich bei einer Veränderung, die Antagonisten-Aktivität an ein GLP-2-Analog verleiht, um eine handeln, die die Hormonbindung an seinen kognaten Rezeptor nicht inhibiert, sondern die sich anschließende Signaltransduktion durch den gebundenen Rezeptor verhindert. Die stellenspezifische Veränderung des Hormons kann zum Beispiel die Dimerisierung des Hormonrezeptors, der zur Übertragung eines Signals an das Innere der Zelle notwendig ist, verhindern. Ein derartiger Mechanismus zur antagonistischen Aktivität wurde mit anderen Hormonen, wie zum Beispiel dem humanen Wachstumshormon, beobachtet (siehe Fuh et al., Science, 1992, 256: 1677–1680).
Im Allgemeinen stellen Stellen, die unter den GLP-2 von einem Säuger hoch konserviert sind, Kandidaten zur Modifikation dar, um einen Antagonisten zu erhalten. Unter den Säugern sind mindestens die Reste 1-5, 7, 15 und 22, 29 und 32-33 hoch konserviert. Deshalb kann die Deletion oder Substitution der Reste an diesen Stellen zu einem GLP-2-Antagonisten führen. Außerdem können bestimmte Modifikationen von Stellen in der Nähe dieser konservierten Stellen auch Antagonistenaktivität durch Disruptieren der lokalen tertiären Aminosäurestruktur oder der Platzierung der angrenzenden konservierten Reste verursachen.
Die erfindungsgemäßen GLP-2-Antagonisten schließen Peptid-Derivate mit einer Sequenz ein, die sich von einem GLP-2 von einem Vertebraten herleitet, in dem eine oder mehr von jedweder der ersten vier N-terminalen Aminosäuren (relativ zur Sequenz des humanen GLP-2) deletiert ist/sind. Auf diese Analoge wird hierin als auf die Deletionsklasse von GLP-2-Antagonisten verwiesen. Es wird erkannt werden, dass aus der Deletionsklasse der GLP-2-Antagonisten der GLP-2-Antagonismus aus der Disruption der N-terminalen Struktur von GLP-2 in den ersten vier Aminosäuren resultieren kann. Die Deletionsklasse von GLP-2-Antagonisten umfasst folglich: GLP-2 (2-33), GLP-2 (3-33), GLP-2 (4-33) und GLP-2 (5-33), [desAla²]GLP-2, [desAsp³]GLP-2 und [desGly⁴]GLP-2.
Die erfindungsgemäßen GLP-2-Antagonisten schließen außerdem Substitutionsderivate von GLP-2 von einem Vertebraten ein. Die Substitutionsklasse von GLP-2-Antagonisten schließt die Antagonisten ein, die eine der folgenden Aminosäuren an den folgenden Positionen (relativ zur Sequenz des humanen GLP-2) durch eine andere Aminosäure: Reste 15, 29 und 32, ersetzen Auch eingeschlossen in der Substitutionsklasse sind diejenigen, die bestimmte Ala²-Substitutionen inkorporieren.
Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass die GLP-2-Antagonisten in erfindungsgemäßen Ausführungsformen jedwede Kombination von einer Deletion und einer Substitution inkorporieren können oder zwei oder mehr Substitutionen an den angemerkten Stellen inkorporieren können.
A. GLP-2-ANTAGONISTEN
Die GLP-2-Antagonisten können demgemäß Analoge von humanem GLP-2 sein, das die folgende Sequenz aufweist:
Sofern nicht anderweitig angegeben ist, versteht man unter dem Begriff „GLP-2" die Sequenz von humanem GLP-2.
Die erfindungsgemäßen Antagonisten stellen Polypeptide dar, die Aminosäuresequenzen umfassen, die denen eines ersten Referenz-GLP-2 von einem Säuger entsprechen, das dergestalt mutiert wurde, dass:

(i) von einem bis vier von jedwedem der ersten vier N-terminalen Reste deletiert werden; oder
(ii) mindestens eine Aminosäure, die aus den Aminosäurepositionen ausgewählt ist, die den Aminosäurepositionen von humanem GLP-2 an Asp¹⁵, Thr²⁹ und Thr³² entsprechen, durch eine Aminosäure substituiert ist, die an dieser Position in der Referenz-GLP-2 nicht natürlich vorkommt; oder
(iii) die Position Ala² durch eine Aminosäure substituiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cys, Trp and PO₃-Tyr², oder
(iv) eine Kombination von (i) und (ii) oder (ii) and (iii) mutiert ist.

In erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen können zum Beispiel die erfindungsgemäßen GLP-2-Antagonisten, die an den Restepositionen 1, 2, 3, 4, 22, 29, 32 und/oder 33 verändert sind, Derivate von GLP-2 von der Ratte sein, bei dem es sich um eine Ala¹⁵-Variante vom humanen GLP-2, GLP-2 vom Degu, bovinem GLP-2, porzinem GLP-2, GLP-2 vom Meerschweinchen und GLP-2 vom Hamster handelt, deren Sequenzen von vielen Autoren, einschließlich Buhl et al. in J. Biol. Chem., 1988, 263(18): 8621, berichtet wurden.
An einer spezifischen Position auftretende GLP-2-Reste werden durch Aligning der Sequenzen von GLP-2, die aus verschiedenen Vertebraten-Spezies isoliert werden und die Sequenz mit der vorstehend reproduzierten humanen Sequenz verglichen wird, bestimmt.
Die erfindungsgemäßen GLP-2-Antagonisten, die an den Restepositionen 1, 2, 3, 4, 22, 29, 32 und/oder 33 verändert sind, können weiter Derivate von GLP-2-Agonisten, wie sie zum Beispiel in der gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung, Aktenzeichen 08/632,533 und 08/631,273 und der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 96/32414 und PCT-Anmeldung Nr. PCT/CA 97/00252, beschrieben sind, darstellen.
Aminosäure-Substitutionen, die an diesen Stellen geeignet sind, um einen Antagonisten zu ergeben, können ohne weiteres unter Verwendung des herein beschriebenen murinen Modells des GLP-2-Antagonismus bestimmt werden. Das heißt, eine GLP-2-Verbindung, die eine strukturelle Veränderung inkorporiert, wird erhalten und dann im hierin erläuterten murinen Modell auf GLP-2-Antagonismus-Aktivität gescreent. Die GLP-2-Verbindungen, die eine Abnahme des Darmwachstums auslösen und/oder die intestinotrophe Aktivität von GLP-2 oder einem GLP-2-Agonisten inhibieren, werden bei diesem Screening als GLP-2-Antagonisten identifiziert.
Die erfindungsgemäßen GLP-2-Antagonisten werden als funktionelle Antagonisten von GLP-2 angesehen, wenn bei Beurteilung im hierin erläuterten murinen Modell, der Antagonist: (1) konsistent eine messbare Abnahme des Dünndarmgewichts relativ zu einem Kontrolltier, das nur das Vehikel erhält, vermittelt; und/oder (2) bei Beurteilung durch Coadministration im murinen Modell mit GLP-2 oder einem GLP-2-Agonisten (in einem überschüssigen Molverhältnis von bevorzugt 10:1 und bevorzugter 4:1 im Vergleich zum Agonisten) konsistent in einer messbaren Inhibition der intestinotrophen Wirkung von GLP-2 oder dem GLP-2-Agonisten resultiert, wie durch eine Reduktion der Erhöhung des Dünndarmgewichts, das durch die Verabreichung von GLP-2 allein induziert wird, ersichtlich ist.
Insbesondere geeignet zur therapeutischen Anwendung sind die funktionellen Antagonisten von GLP-2, die eine Abnahme des Darmgewichts von mindestens 10% relativ zu einem Kontrolltier, das nur das Vehikel erhält, vermitteln; zur therapeutischen Anwendung bevorzugt sind die, die eine Abnahme des Dünndarmgewichts von mindestens 15% oder mehr vermitteln.
Die Aktivität der vorliegenden GLP-2-Antagonisten zur Reduktion der Dünndarmmasse wird am signifikantesten in Bezug auf das Jejunum und insbesondere das proximale Jejunum bemerkt und wird auch im distalen Ileum verzeichnet. Außerdem kann die Aktivität von GLP-2-Antagonisten auch als eine Reduktion der Krypten-/Villushöhe des Dünndarms verzeichnet werden.
Als Alternative können die GLP-2-Antagonisten unter Verwendung des vorstehend detaillierten Coadministrationsmodells beurteilt werden. In diesem Fall werden die Antagonisten für nützliche Antagonisten von GLP-2 gehalten, wenn sie bei Coadministration mit GLP-2 oder einem intestinotrophen Analog davon, bei einem Molverhältnis von ca. 10:1 oder bevorzugter bei einem Molverhältnis von ca. 4:1, die Aktivität von GLP-2 oder einem intestinotrophen Analog davon um mindestens 10% vermindern, wie durch eine Reduktion der Erhöhung des Dünndarmgewichts relativ zu einem mit entweder GLP-2 oder dem GLP-2-Agonisten allein behandelten Kontrolltier manifest wird.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein zum Identifizieren von Antagonisten von GLP-2 nützliches Verfahren, wie zum Beispiel die vorstehend beschriebenen, bereitgestellt, umfassend die Schritte von:

1) Erhalt eines GLP-2-Analogs, das eine Veränderung in der Peptidsequenz inkorporiert;
2) Behandlung eines Säugers mit dem Analog unter Verwendung eines Regimes, das zur Auslösung eines messbaren Verlusts der Masse des Darms fähig ist; und
3) Bestimmung der Wirkung des Analogs auf das Dünndarmgewicht relativ zu einem scheinbehandelten Kontrolltier, wodurch ein funktioneller GLP-2-Antagonist als ein Analog von GLP-2 identifiziert wird, das eine Verminderung des Gewichts auslöst.

In einem verwandten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zum Identifizieren eines GLP-2-Antagonisten bereitgestellt, umfassend die Schritte von:

(1) Erhalt eines GLP-2-Analogs, das sich von einem Referenz-GLP-2 von einem Säuger dadurch unterscheidet, dass es eine strukturelle Veränderung aufweist, ausgewählt aus (i) einer Deletion von mindestens einer Aminosäure und (ii) einer Substitution von mindestens einer Aminosäureposition mit einer Aminosäure, die an dieser Stelle nicht natürlich vorkommt und (iii) einer Kombination von (i) und (ii);
(2) Behandlung eines Säugers mit dem Analog, das mit GLP-2 oder einem intestinotrophen Analog von GLP-2 zusammen verabreicht wird, unter Verwendung eines Regimes, das zur Auslösung einer Reduktion der Erhöhung des Dünndarmgewichts fähig ist, die bei Verabreichung von GLP-2 allein gesehen wird; und
(3) Bestimmung der Wirkung des Analogs auf das Dünndarmgewicht relativ zu einem Kontrolltier, das das GLP-2 allein oder ein intestinotrophes GLP-2-Analog allein erhält, wodurch der funktionelle Antagonist als ein Analog identifiziert ist, das eine Reduktion der Erhöhung des Darmgewichts auslöst.

In einer bevorzugten Version der vorstehend beschriebenen Verfahren, die zur Identifikation funktioneller GLP-2-Antagonisten nützlich sind, wird das GLP-2-Analog aus den hierin beschriebenen GLP-2-Antagonisten gewählt.
B. WAHL SUBSTITUIERENDER AMINOSÄUREN
Die substituierenden Aminosäuren können aus einer großen Reihe verschiedener den Peptidchemikern zur Verfügung stehenden Aminosäuren gewählt werden und schließen sowohl die D-Aminosäuren als auch die L-Aminosäuren und ihre zahlreichen Derivate ein. Die gewählten Aminosäuren sind am zweckmäßigsten der Inkorporation durch Festphasen- oder Lösungsphasensynthese oder durch rekombinante DNA-Produktionsmittel zugänglich.
In einem ersten Screening werden Analoge, bei denen es sich um Kandidaten für die antagonistische Aktivität handelt, durch die Alanin-Scanning-Mutagenese oder andere systematische Mutageneseverfahren identifiziert. Diese Alanin-Substitutionen werden unter Verwendung der hierin detailliert beschriebenen Verfahren auf antagonistische Aktivität getestet.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt können dann wirksamere GLP-2-Antagonisten durch drastische Änderung des Charakters des natürlich vorkommenden Aminosäurerests, der zur Bildung struktureller Interaktionen (Wasserstoffbindung, Salzbrückenbildung, hydrophober Interaktionen, Positionierung von Resten) des GLP-2-Hormons mit seinem Target-Molekül (z.B. einem Rezeptor) wichtig ist, hergestellt werden. Mit diesem Ziel vor Augen ist es in der Regel nicht notwendig, jede Stelle mit Ersatz durch alle 18 der anderen natürlich vorkommenden Reste zu screenen. Anstelle dessen werden repräsentative Glieder von Restegruppen ausgewählt. Im Allgemeinen handelt es sich bei diesen Gruppen um die folgenden:

a. Positiv geladene Reste: His, Arg und Lys
b. Negativ geladene Reste: Asp und Glu
c. Amide: Asn und Gln
d. Aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp
e. Hydrophobe Reste: Ala, Pro, Gly, Val, Leu, Ile und Met
f. Nicht geladene hydrophile Reste: Ser und Thr.

Bei der Herstellung dieser Antagonistenkandidaten würde man einen Rest aus einer Gruppe mit Ausnahme des Restetyps, der an dieser Position natürlich vorkommt, wählen. Extreme Substitutionen werden durch Auswahl eines Restes aus einer Gruppe mit entgegengesetzten Kombinationsmerkmalen generiert. Ein negativ geladener Rest kann zum Beispiel durch einen positiv geladenen Rest substituiert werden.
Im Fall der Ala²-Substitutionen werden die substituierenden Aminosäuren sorgfältig ausgewählt, damit sich die Antagonisten der GLP-2-Aktivität ergeben. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass Substitutionen an Position 2 die Wirkung einer Verstärkung der intestinotrophen Aktivität von GLP-2 aufweisen können. Wenn Ala² zum Beispiel durch Gly ersetzt wird, ist das Ergebnis eine dramatisch verstärkte intestinotrophe Aktivität ebenso wie Resistenz gegen die Verdauung des GLP-2-Peptids durch das DPP-IV-Enzym. Die erfindungsgemäßen GLP-2-Antagonisten können überraschend auch durch Substitution von Ala² generiert werden. In erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden substituierende Aminosäuren an Position 2, die zur Generierung von GLP-2-Antagonisten nützlich sind, aus Cys, Trp and PO₃-Tyr ausgewählt. GLP-2-Antagonisten, die diese Substitutionen inkorporieren, weisen den zusätzlichen Vorteil auf, dass sie das Peptid gegen den Verdau durch das DPP-IV-Enzym resistent machen. Bevorzugt stellt die Ala² substituierende Aminosäure Cys dar.
Aminosäuren, die für Asp¹⁵, Thr²⁹ und Thr³² substituieren, werden gegebenenfalls aus denen ausgewählt, die eine kleine hydrophobe Seitenkette, wie zum Beispiel Ala, Gly und Val, inkorporieren.
In erfindungsgemäßen Ausführungsformen schließt die Substitutionsklasse von GLP-2-Antagonisten Folgendes ein: [Gly², Ala¹⁵]GLP-2, [Ala¹⁵]GLP-2, [Ala¹⁵]GLP-2 (2-33), [Ala¹⁵]GLP-2 (3-33), [Ala¹⁵]GLP-2 (4-33), [Ala¹⁵]GLP-2 (5-33), [Gly², Ala²⁹]GLP-2, [Gly², Ala³²)GLP-2, [Trp²]GLP-2, [PO₃-Tyr²]GLP-2, [Cys²]GLP-2, [Ala¹⁵]GLP-2, [Ala²⁹]GLP-2, [Ala³²]GLP-2.
C. ZUSÄTZLICHE MODIFIKATIONEN ZUR VERBESSERUNG DER EIGENSCHAFTEN DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN ANALOGE
Die vorliegenden GLP-2-Antagonisten, obwohl sie eine strukturelle Veränderung des angemerkten Typs inkorporieren, können verschiedene Aminosäuresequenzen aufweisen, die mit den Sequenzen von GLP-2 als solches oder von GLP-2-Agonisten konsistent sind. Die GLP-2-Antagonisten können auch Analoge von GLP-2-Agonisten von Vertebraten aufweisen, bei denen kollaterale Modifikationen zur Verstärkung anderer biochemischer, biologischer oder physiologischer Eigenschaften des Peptids vorgenommen wurden. Solche Modifikationen schließen zum Beispiel (in den Peptiden, für die Antagonismus durch Substitution mit Ausnahme an Position 2 verliehen wird) die Substitution von nativem Ala² durch eine Aminosäure ein, die den GLP-2-Antagonisten gegen die Verdauung durch das Enzym DPP-IV resistent macht. Eine für diesen Zweck geeignete Aminosäure schließt insbesondere Gly ein. Der Met¹⁰-Rest kann auch durch eine oxidativ stabilere Aminosäure, wie zum Beispiel Leu, Nle, Ile oder Ala ersetzt werden. Solche Met¹⁰-substituierten Analoge sind demzufolge während der Synthese, der Aufarbeitung und Lagerung stabiler. Eine andere Modifikation stellt in diesem Kontext der Ersatz der Aminosäure an Position 20 durch eine Aminosäure mit Ausnahme von Arg dar. In bestimmten Applikationen, insbesondere für die synthetische Generierung von pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch verträglichen Peptiden, ist diese Modifikation zur Vermeidung der Retention durch den Arg-Rest von Gegenionen aus den Lösungsmitteln, wie zum Beispiel TFA, wünschenswert.
Im erfindungsgemäßen Rahmen befinden sich auch Moleküle, worin der N- oder C-Terminus zur Inkorporation einer Blockierungsgruppe des Typs, der üblicherweise im Stand der Peptidchemie zum Schutz der Peptidtermini vor einem unerwünschten biochemischen Angriff und Abbau in vivo verwendet wird, modifiziert wurde.
Geeignete N-terminale Schutzgruppen schließen zum Beispiel C_1-5-Alkanoylgruppen, wie zum Beispiel Acetyl ein. Als N-terminale Schutzgruppen sind auch Aminosäure-Analoge geeignet, denen die Aminofunktion mangelt. Geeignete C-terminale Schutzgruppen schließen Gruppen, die Ketone oder Amide am Kohlenstoffatom des C-terminalen Carboxyls bilden, oder Gruppen, die Ester am Sauerstoffatom des Carboxyls bilden, ein. Keton- und Ester-bildende Gruppen schließen Alkylgruppen, insbesondere verzweigte oder unverzweigte C_1-5-Alkylgruppen, z.B. Methyl-, Ethyl- und Propylgruppen ein, während Amid-bildende Gruppen Aminofunktionen, wie zum Beispiel primäre Amin- oder Akylaminofunktionen, z.B. Mono-C_1-5-Alkylamino- und Di-C_1-5-Alkylaminogruppen, wie zum Beispiel Methylamino, Ethylamino, Dimethylamino, Diethylamino, Methylethylamino und dergleichen ein. Aminosäureanaloge sind zum Schutz des C-terminalen Endes der vorliegenden Verbindungen, zum Beispiel decarboxylierten Aminosäure-Analogen, wie zum Beispiel Agmatin, auch geeignet.
Erfindungsgemäße Ausführungsformen schließen spezifisch solche Analoge ein, worin die N-terminale Blockierungsgruppe Acetyl darstellt; und Analoge, worin die C-terminale Blockierungsgruppe ein Amin, wie z.B. -NH₂ darstellt.
D. SYNTHESE DER GLP-2-ANTAGONISTEN
Die vorliegenden GLP-2-Antagonisten können unter Verwendung von Standardverfahren der Peptidchemie synthetisiert und können auf GLP-2-Antagonistenaktivität beurteilt werden, alles gemäß der hierin bereitgestellten Anleitung. Die GLP-2-Antagonisten, die nur L-Aminosäuren inkorporieren, können durch Applikation der rekombinanten DNA-Technologie in gewerblichen Mengen hergestellt werden. Für diesen Zweck wird die DNA-Kodierung für den gewünschten GLP-2-Antagonisten in einen Expressionsvektor inkorporiert und in einen mikrobiellen, z.B. Hefe, oder anderen zellulären Wirt transformiert, der dann unter Bedingungen kultiviert wird, die für die GLP-2-Antagonistenexpression geeignet sind. Eine Reihe vieler verschiedener Genexpressionssysteme wurden für diesen Zweck angepasst, und treiben in der Regel die Expression des gewünschten Gens aus Expressionsregulationselementen, die von dem gewählten Wirt natürlich verwendet werden, an. Da GLP-2 für seine Aktivität keine posttranslationale Glycosylierung erfordert, kann seine Produktion zweckmäßigerweise in Bakterienwirten, wie zum Beispiel E. coli, erreicht werden. Für eine derartige Produktion kann die DNA-Kodierung für den ausgewählten GLP-2-Antagonisten nützlicherweise unter Expressionskontrollen der lac-, trp- oder PL-Gene von E. coli gestellt werden. Als eine Alternative zur Expression der DNA-Kodierung für den GLP-2-Antagonisten als solches kann der Wirt zur Expression des GLP-2-Antagonisten als ein Fusionsprotein angepasst werden, worin der GLP-2-Antagonist freisetzbar mit einem Trägerprotein, das die Isolation und Stabilität des Expressionsprodukts fördert, verknüpft ist.
In einem universell anwendbaren Ansatz zur Herstellung von ausgewählten GLP-2-Antagonisten, und einem, der notwendigerweise zur Herstellung von GLP-2-Antagonistenformen verwendet wird, die nicht genetisch kodierte Aminosäuren und N- und C-terminal derivatisierte Formen inkorporieren, werden die gut etablierten Verfahren der automatisierten Peptidsynthese eingesetzt, von denen allgemeine Beschreibungen zum Beispiel in J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; und in M. Bodanszky und A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York; Applied Biosystems 430A Users Manual, 1987, ABI Inc., Foster City, California, erscheinen. In diesen Verfahren wird der GLP-2-Antagonist aus seinem C-terminalen, Harz-konjugierten Rest durch die sequenzielle Addition von angemessen geschützten Aminosäuren unter Verwendung von entweder den Fmoc- oder tBoc-Protokollen, wie zum Beispiel von Orskov et al., 1989, vorstehend beschrieben wird, gezüchtet.
Zur Inkorporation von N- und/oder C-schützenden Gruppen können auch für die Festphasen-Peptidsyntheseverfahren übliche Protokolle angewendet werden. Für die Inkorporation von C-terminalen Schutzgruppen wird die Synthese des gewünschten Peptids zum Beispiel in der Regel unter Verwendung, als Festphase, eines geträgerten Harzes durchgeführt, das chemisch modifiziert wurde, damit die Spaltung vom Harz in einem Peptid mit der gewünschten C-terminalen Schutzgruppe resultiert. Zur Bereitstellung von Peptiden, worin der C-Terminus eine primäre Aminoschutzgruppe trägt, wird zum Beispiel die Synthese unter Verwendung eines p-Methylbenzhydrylamin-Harzes (MBHA-Harzes) dergestalt durchgeführt, dass – wenn die Peptidsynthese abgeschlossen ist – die Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure das gewünschte C-terminal aminierte Peptid freisetzt. Auf ähnliche Weise wird die Inkorporation einer N-Methylamin-schützenden Gruppe am C-Terminus unter Verwendung von N-Methylaminoethyl-derivatisiertem DVB-Harz erreicht, das nach der HF-Behandlung ein Peptid freisetzt, das einen N-Methyl-amidierten C-Terminus trägt. Schutz des C-Terminus durch Veresterung kann auch unter Verwendung üblicher Verfahren erreicht werden. Dies macht die Verwendung einer Kombination von Harz-/Blockierungsgruppen erforderlich, die die Freisetzung von Seitenketten-geschütztem Peptid aus dem Harz erlaubt, um die sich anschließende Reaktion mit dem gewünschten Alkohol zur Bildung der Esterfunktion zu ermöglichen. Die FMOC-Schutzgruppen, in Kombination mit DVB-Harz, das mit Methoxyalkoxybenzylalkohol oder einem äquivalenten Linker derivatisiert ist, können für diesen Zweck verwendet werden, wobei die Spaltung aus dem Träger durch TFA in Dichlormethan bewirkt wird. Die Veresterung der geeignet aktivierten Carboxylfunktion, z.B. mit DCC, kann dann durch Zufügen des gewünschten Alkohols, gefolgt von Entschützung und Isolation des veresterten Peptidprodukts, ablaufen.
Die Inkorporation von N-terminalen Schutzgruppen kann, während das synthetisierte Peptid noch am Harz angeheftet ist, zum Beispiel durch Behandlung mit einem geeigneten Anhydrid und Nitril, erreicht werden. Zur Inkorporation einer Acetyl-Schutzgruppe am N-Terminus kann zum Beispiel das Harzgekoppelte Peptid mit 20%igem Essigsäureanhydrid in Acetonitril behandelt werden. Das N-geschützte Peptidprodukt kann dann aus dem Harz gespalten, entschützt und anschließend isoliert werden.
Sobald die gewünschte Peptidsequenz synthetisiert, aus dem Harz gespalten und vollständig entschützt wurde, wird das Peptid alsdann zur Gewährleistung der Rückgewinnung eines einzelnen Oligopeptids mit der ausgewählten Aminosäuresequenz gereinigt. Die Reinigung kann unter Verwendung von jedwedem der Standardansätze erreicht werden, welche die Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) auf alkylierten Silikasäulen, z.B. C₄-, C₆- oder C₁₆-Silika, einschließen. Eine derartige Säulenfraktionierung wird im Allgemeinen durch laufende lineare Gradienten, z.B. 10–90%, von prozentual zunehmendem organischem Lösungsmittel, z.B. Acetonitril, in einem wässrigen Puffer, enthaltend gewöhnlich eine kleine Menge (z.B. 0,1%) eines Paarungsmittels, wie zum Beispiel TFA oder TEA, erreicht. Als Alternative kann die Ionenaustausch-HPLC zum Trennen von Peptidspezies auf der Basis ihrer Ladungsmerkmale eingesetzt werden. Die Säulenfraktionen werden gesammelt und die, die Peptid der gewünschten/geforderten Reinheit enthalten, werden optional gepoolt. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Peptid dann auf die etablierte Weise zum Austausch der Spaltungssäure (z.B. TFA) gegen eine pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch verträgliche Säure, wie zum Beispiel Essig-, Salz-, Phosphor-, Malein-, Wein- und Bernsteinsäure und dergleichen, zur Bereitstellung eines wasserlöslichen Salzes des Peptids behandelt.
E. ANWENDUNGEN DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN GLP-2-ANTAGONISTEN
Es wird erfindungsgemäß beabsichtigt, dass der GLP-2-Antagonist zur Behandlung von Patienten, einschließlich Tieren und Menschen, die von einer verminderten gastrointestinalen Gewebewachstumsrate profitieren würden, verabreicht wird. In einem Aspekt handelt es sich bei den Patienten-Kandidaten um die, die von einer verminderten Dünndarmgewebsmasse profitieren würden. Die Wirkungen von GLP-2-Antagonisten auf dieses Gewebe, wie sich anhand der hierin erläuterten Ergebnisse erwiesen hat, ist dramatisch, und es würden eindeutig die Patienten davon profitieren, die an Erkrankungen und Störungen leiden, die durch Hyperplasie in der Schleimhaut des Dünndarms gekennzeichnet sind, die GLP-2-produzierende Tumoren einschließen. Eine andere Patientengruppe, die eindeutig von den Wirkungen der GLP-2-Antagonisten profitieren würde, stellt diejenige dar, bei denen die Induktion einer Hypoplasie des Dünndarmgewebes, wie zum Beispiel bei Patienten, die in der nahen Zukunft eine Strahlen- oder Chemotherapie erhalten, oder bei Patienten, die eine Strahlen- oder Chemotherapie erhalten, nützlich ist. Die Epithelzellen des Dünndarms sind durch schnelle Zellteilung gekennzeichnet und sind folglich besonders suszeptibel für Schädigungen durch eine Strahlen- oder Chemotherapie. Zellschädigungen an den Epithelzellen des Dünndarms stellen bei Krebspatienten, die sich einer Therapie unterziehen, in der Tat die Ursache einer signifikanten Mortalität und Morbidität dar. Folglich wäre es wünschenswert, die Wachstumsrate dieser Zellen sofort vor der Einleitung dieser Therapien und während des Behandlungszyklus zu verlangsamen. Die Fähigkeit zur Abnahme der Wachstumsrate der Dünndarmzellen bei diesen Patienten und folglich des Erreichens einer Darmruhe vor der Behandlung mit Chemo- oder Strahlentherapie würde den zusätzlichen Vorteil mit sich bringen, dass sie höhere Dosen der strahlen- und chemotherapeutischen Mittel zulässt.
Eine andere klinische Situation, worin ein funktioneller Antagonist von GLP-2 klinisch nützlich wäre, stellt die Behandlung eines Patienten, einschließlich eines Tieres oder eines Menschen dar, der mit GLP-2 oder einem GLP-2-Agonisten chronisch oder akut überdosiert wurde. Eine noch andere potenzielle Applikation von funktionellen Antagonisten von GLP-2 besteht in der Blockierung des Transports von Toxinen oder anderen Arzneimitteln über die Schleimhautschicht. Pathogene Wirkungen bei einigen Erkrankungen entstehen aufgrund der Absorption von Toxinen oder Arzneimitteln über das intestinale Epithel. Die Eliminierung der absorptiven Kapazität des Dünndarms durch Reduktion des intestinalen Epithels kann gegebenenfalls vorteilhaft sein. Zum Beispiel verlaufen einige Erkrankungen, wie zum Beispiel Cholera, tödlich, weil das Choleratoxin an die Rezeptoren im intestinalen Epithel selbst bindet, was zu Dehydratation und zum Tod führt. GLP-2-Antagonisten können eine Darmruhe herbeiführen, wobei das Targetgewebe für das Toxin (das intestinale Epithel) und folglich die pathologische Response auf Cholera eliminiert wird.
Eine noch andere Gruppe von Patienten, die von einer Abnahme der Masse des Dünndarms profitieren würden, stellen diejenigen, die an Adipositas leiden, als eine Alternative zur chirurgischen Intervention, wie zum Beispiel einer Resektion des Dünndarms, dar.
Die therapeutische Wirksamkeit der Behandlung mit dem GLP-2-Antagonisten kann durch eine Darmbiopsie zur Untersuchung der Villus-Morphologie oder durch biochemische Beurteilung der Nährstoffabsorption überwacht werden. Die Wirksamkeit kann zusätzlich unter Verwendung eines klinischen Endpunkts, der für die bestimmte behandelte Störung relevant ist, wie zum Bespiel Gewichtsverlust, behandelt werden. Patienten mit Dünndarmkarzinom kann der GLP-2-Antagonist zur Verminderung der Größe des Tumors verabreicht werden. Als Alternative können Patienten mit Darmmotilitätsstörungen, Reizdarm und chronischer Diarrhoe vom GLP-2-Antagonisten zur Steigerung der Motilität und/oder Reduktion der Diarrhoe profitieren.
Gegenstand der Erfindung ist sowohl die Coadministration des GLP-2-Antagonisten mit einem strahlentherapeutischen Mittel oder einem chemotherapeutischen Mittel als auch die alternative Verabreichung des GLP-2-Antagonisten, um auf diese Weise das Wachstum des Dünndarmgewebes vor der Einleitung der Strahlen- oder Chemotherapie zu reduzieren. Geeignete Dosierungsregime für GLP-2-Antagonisten können durch Überwachung der sich anschließenden Reduktion der intestinalen Schädigung und/oder Genesungszeit nach der Strahlen- oder Chemotherapie bestimmt werden.
Eine andere Anwendung für Antagonisten von GLP-2 besteht in einer Therapie zum Korrigieren des Flüssigkeitsungleichgewichts aufgrund eines Malabsorptionsproblems über den Dünndarm hinweg. Die Wirksamkeit der Behandlung mit einem GLP-2-Antagonisten wird durch Beurteilung des Stuhlvolumens, des intra- und extrazellulären Flüssigkeitsvolumens (ICF- und ECF-Volumens), Urinvolumens und der Osmolarität, des Blutdrucks und der Plasmaelektrolyten überwacht.
Wie hierin verwendet, versteht man unter dem Begriff „Patient" einen Menschen oder einen anderen Säuger, einschließlich Nutz- und Haustieren.
F. FORMULIERUNGEN DER GLP-2-ANTAGONISTEN
Zur Verabreichung an Patienten, einschließlich Menschen und Tieren, werden die GLP-2-Antagonisten in einem erfindungsgemäßen Aspekt in pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch verträglicher Form (z.B. als ein Präparat, das zum Beispiel durch ein Filter von 0,22 μm steril filtriert ist) und im Wesentlichen pyrogenfrei bereitgestellt. Der zu formulierende GLP-2-Antagonist wandert gegebenenfalls als ein einzelner oder individualisierter HPLC-Peak, weist eine uniforme und authentische Aminosäurezusammensetzung und Sequenz nach der Analyse davon auf und entspricht anderweitig den von den verschiedenen nationalen Behörden, die die Qualität pharmazeutischer und veterinärmedizinischer Produkte regulieren, festgelegten Standards.
Zur therapeutischen Anwendung wird der gewählte GLP-2-Antagonist mit einem Träger formuliert, der pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch verträglich ist und zur Abgabe des Peptids über die gewählte Verabreichungsroute angemessen ist. Geeignete pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch verträgliche Träger stellen die dar, die üblicherweise mit auf Peptid basierenden Arzneimitteln, wie zum Beispiel Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen und dergleichen, verwendet werden. Es wird auf „Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985, als Leitlinie zu Arzneimittelformulierungen im Allgemeinen verwiesen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Verbindungen zur Verabreichung durch Infusion oder durch Injektion, entweder subkutan oder intravenös, formuliert und werden demgemäß als wässrige Lösungen in steriler und pyrogenfreier Form verwendet und optional auf einen geringgradig sauren oder physiologischen pH gepuffert. Folglich können die Verbindungen in destilliertem Wasser oder wünschenswerter in Kochsalzlösung, gepufferter Kochsalzlösung oder 5% Dextroselösung verabreicht werden. Die Wasserlöslichkeit kann gegebenenfalls durch Inkorporation eines Löslichkeits-Enhancers, wie zum Beispiel Essigsäure, verstärkt werden.
Der wässrige Träger oder das wässrige Vehikel kann zur Anwendung als Injektionsmittel mit einer Gelatinemenge, die als Depot für den GLP-2-Antagonisten an der Injektionsstelle oder in die Umgebung der Injektionsstelle für seine langsame Freisetzung am gewünschten Wirkort supplementiert werden. Von Gelatine-Konzentrationen, die zum Erlangen der Depotwirkung wirksam sind, wird erwartet, dass sie im Bereich von 10–20% liegen. Alternative Gelatinierungsmittel, wie zum Beispiel Hyaluronsäure, können auch als Depot-Mittel nützlich sein.
Die erfindungsgemäßen GLP-2-Antagonisten können auch als eine Implantationsvorrichtung mit langsamer Freisetzung zur verlängerten und hinhaltenden Verabreichung des GLP-2-Antagonisten formuliert werden. Beispiele solcher Formulierungen mit hinhaltender Freisetzung schließen Verbundstoffe von biokompatiblen Polymeren, wie zum Beispiel Poly(milchsäure), Poly(milchsäure-co-glykolsäure), Methylcellulose, Hyaluronsäure, Kollagen und dergleichen ein. Die Struktur, Auswahl und Verwendung von abbaubaren Polymeren in Arzneimittelabgabevehikeln wurden in mehreren Veröffentlichungen, einschließlich A. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3: 279–292 (1992), besprochen. Zusätzliche Leitlinien zur Auswahl und Verwendung von Polymeren in pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Formulierungen können im Text von M. Chasin und R. Langer (Hrsg.), „Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", Vol. 45 in „Drugs and the Pharmaceutical Sciences," M. Dekker, New York, 1990, eingesehen werden. Liposome können auch zur Bereitstellung für die hinhaltende Freisetzung eines GLP-2-Antagonisten bereitgestellt werden. Nähere Angaben hinsichtlich wie die liposomalen Formulierungen von Arzneimitteln von Interesse verwendet und hergestellt werden, sind unter anderen Stellen in US-Pat. Nr. 4,944,948; US-Pat. Nr. 5,008,050; US-Pat. Nr. 4,921,706; US-Pat. Nr. 4,927,637; US-Pat. Nr. 4,452,747; US-Pat. Nr. 4,016,100, US-Pat. Nr. 4,311,712; US-Pat. Nr. 4,370,349; US-Pat. Nr. 4,372,949; US-Pat. Nr. 4,529,561; US-Pat. Nr. 5,009,956; US-Pat. Nr. 4,725,442; US-Pat. Nr. 4,737,323; US-Pat. Nr. 4,920,016, zu finden. Formulierungen mit hinhaltender Freisetzung sind von besonderem Interesse, wenn die Bereitstellung einer hohen lokalen Konzentration eines GLP-2-Antagonisten oder mit verlängert zirkulierenden Konzentrationen wünschenswert ist.
Der GLP-2-Antagonist kann in der Form eines steril gefüllten Durchstichfläschchens oder einer steril gefüllten Ampulle verwendet werden, die eine Menge des Peptids enthält, das zum Antagonisieren der endogenen GLP-2-Aktivität, entweder in Unit-Dosis- oder Multi-Dosis-Mengen, wirksam ist. Das Durchstichfläschchen oder die Ampulle kann den GLP-2-Antagonisten und den gewünschten Träger als eine verabreichungsfertige Formulierung enthalten. Als Alternative kann das Durchstichfläschchen oder die Ampulle das GLP-2-Peptid in einer Form, wie zum Beispiel in einer lyophilisierten Form enthalten, die zur Rekonstitution in einem geeigneten Träger, wie zum Beispiel einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung geeignet ist.
Als eine Alternative zu injizierbaren Formulierungen kann der GLP-2-Antagonist zur Verabreichung über andere Routen formuliert werden. Orale Dosierungsformen, wie zum Beispiel Tabletten, Kapseln und dergleichen, können gemäß der standardmäßigen praktischen pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Ausführung formuliert werden.
Letztendlich kann die anhaltende Abgabe des GLP-2-Antagonisten für Gewichtsverlust oder andere therapeutische Indikationen durch Gentherapieverfahren erreicht werden. Die Zellen können zum Beispiel ex vivo zur Expression hoher Konzentrationen des GLP-2-Antagonisten manipuliert werden, und danach können solche Zellen in den tierischen oder humanen Patienten zur therapeutischen Wirkung implantiert werden.
G. DOSIERUNGEN DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN GLP-2-ANTAGONISTEN
Die therapeutische Dosierung und das therapeutische Regime, die für die Behandlung am angemessensten sind, werden selbstverständlich mit der zu behandelnden Erkrankung oder Störung und gemäß dem Gewicht des Patienten and anderen Parametern variieren. Die hierin nachstehend vorgelegten Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Dosis des GLP-2-Antagonisten äquivalent mit ca. 1 mg/kg bis 100 μg/kg (oder weniger), zweimal täglich über 10 Tage verabreicht, eine sehr signifikante Abnahme der Dünndarmmasse herbeiführen kann. Es ist vorstellbar, dass viel kleinere Dosen, zum Beispiel im Bereich von μg/kg und einer kürzeren oder längeren Behandlungsdauer oder -frequenz auch zu therapeutisch nützlichen Ergebnissen, d. h. einer statistisch signifikanten Abnahme, insbesondere der Dünndarmmasse führen. Die zur humanen Anwendung angemessensten Dosierungsgrößen und das Dosierungsregime werden von den hierin vorgelegten Ergebnissen geleitet und können in ordnungsgemäß angelegten klinischen Prüfungen bestätigt werden.
Ein wirksames Dosierungs- und Behandlngsprotokoll kann anhand üblicher Mittel bestimmt werden, wobei man mit einer niedrigen Dosis bei Labortieren beginnt und dann die Dosierung steigert, während man die Wirkungen überwacht und auch das Dosierungsregime systematisch variiert. Zahlreiche Faktoren können von einem Kliniker bei der Ermittlung einer optimalen Dosierung für einen gegebenen Patienten in Betracht gezogen werden. Primär unter diesen ist die Menge von GLP-2, die in der Regel im Plasma zirkuliert, die in der Größenordnung von 151 pmol/ml im Ruhezustand liegt, die nach Nahrungsaufnahme für gesunde erwachsene Menschen auf 225 pmol/ml ansteigt (Orskov. C. und Holst, J. J., 1987, Scand. J. Clin. Lav. Invest. 47: 165). Zusätzliche Faktoren schließen die Größe des Patienten, das Alter des Patienten, den Allgemeinzustand des Patienten, die entsprechende zu behandelnde Erkrankung, den Schweregrad der Erkrankung, das Vorliegen anderer Arzneimittel im Patienten, die Aktivität des GLP-2-Antagonisten in vivo und dergleichen ein. Die Studiendosierungen würden nach Erwägung der Ergebnisse aus Tierstudien und der klinischen Literatur gewählt. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass Informationen, wie zum Beispiel der sich von kompetitiven GLP-2-Bindungsassays in vitro herleitenden Bindungskonstanten und Ki, auch bei der Berechnung der Dosierungen ebenso wie der berechneten Halbwertzeit des GLP-2-Antagonisten in vivo verwendet werden können.
Eine typische humane Dosis eines GLP-2-Antagonisten würde von ca. 10 μg/kg Körpergewicht/Tag bis ca. 10 mg/kg/Tag, bevorzugt von ca. 50 μg/kg/Tag bis ca. 5 mg/kg/Tag und am bevorzugtesten ca. 100 μg/kg/Tag bis 1 mg/kg/Tag betragen. Genauso wie es vorstellbar ist, dass die erfindungsgemäßen GLP-2-Antagonisten bis zu 10- und sogar 100-mal potenter als GLP-2 sein könnten, könnte eine typische Dosis eines derartigen GLP-2-Antagonisten niedriger, wie zum Beispiel von ca. 100 ng/kg Körpergewicht/Tag bis 1 mg/kg/Tag, bevorzugt 1 μg/kg/Tag bis 500 μg/kg/Tag und noch bevorzugter 1 μg/kg/Tag bis 100 μg/kg/Tag liegen.
Die folgenden Beispiele beschreiben erfindungsgemäße Peptide und andere Peptide für Referenzwecke.
BEISPIEL 1 – SYNTHESE DES GLP-2-ANTAGONISTEN
Die folgenden GLP-2-Antagonisten-Peptide wurden synthetisiert:
[Gly², Ala¹⁵]GLP-2; [Gly², Ala²²]GLP-2; [Gly², Ala²⁹]GLP-2; [Gly², Ala³²]GLP-2 [Gly², Ala³³]GLP-2; Ratten-GLP-2 (2-33), Ratten-GLP-2 (3-33); Ratten-GLP-2 (4-33); Ratten-GLP-2 (5-33); [Leu²]GLP-2; [Glu²]GLP-2; [Arg²]GLP-2; [Trp²]GLP-2; [Cys²]GLP-2; [PO₃-Tyr²]GLP-2 und [Phg²]GLP-2.
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) wurde manuell in einem 300 Milliliter (ml) fassenden Gefäß im 3-Millimol-(mmol)-Maßstab unter Verwendung von 6 Gramm (g) Chlormethyl-(Merrifield)-Harz (für die C-terminale freie Säure der Peptide) mit einer Substitution von 0,5 Milliäquivalenten (mÄq) pro Gramm durchgeführt. Aminosäuren wurden am Amino-Terminus mit der t-Butyloxycarbonyl-Gruppe (tBoc-Gruppe) geschützt. Die Seitenketten von trifunktionellen Aminosäuren wurden mit den Benzyl- (Bz, für Serin und Threonin), Benzyloxymethyl-(BOM, für Histidin), 2-Brombenzyloxycarbonyl-(2-BrZ, für Tyrosin), 2-Chlorbenzyloxycarbonyl-(2-ClZ, für Lysin), Cyclohexyl-(cHex, für Asparagin- und Glutaminsäuren) und Tosyl-Gruppen (Tos, für Arginin) geschützt. Die erste Aminosäure wurde durch Veresterung der geschützten Aminosäure in Anwesenheit von Kaliumfluorid (KF) an das Chlormethyl-Harz gekoppelt. C-terminale Amide von Peptiden wurden auf einem 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz) im 3-mmol-Maßstab unter Verwendung von 6 g Harz mit einer Substitution von 0,5 mÄq/g synthetisiert. Die erste Aminosäure wurde gemäß dem für die Peptidelongation beschriebenen Verfahren an das MBHA-Harz gekoppelt.
Die Entschützung der Aminogruppe wurde unter Verwendung von 50% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (CH₂Cl₂) durchgeführt, gefolgt von der Neutralisierung unter Verwendung von zweimaligem Waschen mit 10% Triethylamin (Et₃N) in CH₂Cl₂. Die Peptidelongation wurde unter Verwendung von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid-/1-Hydroxybenzotriazol-Aktivierung (DCC/HOBt-Aktivierung) in CH₂Cl₂/Dimethylformamid (DMF) durchgeführt. Die wachsende Peptidkette wurde nach jedem Elongationsschritt mit 20% Ac₂O in CH₂Cl₂ gekappt. Das Peptid-Harz wurde nach jedem Elongations-, Kappungs- und Entschützungsschritt mit Isopropanol (iPrOH) und Methanol (MeOH) gewaschen. Das Waschen wurde einmal wiederholt. Die N-terminalen Acetylpeptide wurden, wie beschrieben, durch Acetylierung der terminalen Aminogruppe mit 20% Ac₂O in CH₂Cl₂ nach der Entschützung und Neutralisation hergestellt. Die Harz-gebundenen Produkte wurden mittels eines „Low- High"-Verfahrens unter Verwendung von Fluorwasserstoff (HF), enthaltend Dimethylsulfid (DMS) und p-Kresol als Fänger, routinemäßig gespalten.
Die Rohpeptide wurden mithilfe der präparativen Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Vydac C18, 15–20 μm Porenweite, 2 Inch × 12 Inch, Umkehrphasen-Silikasäule unter Verwendung der Gradientenelution mit 0,1% TPA, in Wasser modifiziert mit Acetonitril gereinigt. Die Elution wurde bei 220 Nanometer (nm) überwacht. Jede gesammelte Fraktion wurde anhand der analytischen HPLC unter Verwendung einer Vydac C18, 5 μm, 4,6 × 254 Millimeter (mm), Umkehrphasen-Silikasäule mittels Gradientenelution unter Verwendung von 0,1% TFA in Wasser, modifiziert mit Acetonitril auf Reinheit analysiert und bei 215 nm überwacht. Fraktionen, die eine größere als 95%ige Reinheit aufwiesen, wurden kombiniert und lyophilisiert. Aus den TFA-Salzen wurden Acetatsalze der Peptide durch Auflösung des lyophilisierten Pulvers in Wasser, mit Zugabe von Acetonitril, um gegebenenfalls die Auflösung zu unterstützen, hergestellt. Die Lösung wurde durch ein protoniertes Kationenaustauscherharz Bio-Rex 70 gegeben. Das Harz wurde mit 5 Bettvolumina Wasser gewaschen und das Harz-gebundene Peptid mit 50% Essigsäure in Wasser eluiert. Der Eluent wurde mit Wasser verdünnt und lyophilisiert.
Das letztlich lyophilisierte Pulver wurde anhand zweier analytischer Umkehrphasen-HPLC-Verfahren unter Verwendung einer Vydac C18, 5 μm, 4,6 × 254 mm Umkehrphasen-Silikasäule auf Reinheit analysiert. Es wurden zwei Lösungsmittelsysteme verwendet: ein Wassergradient, eingestellt auf pH 2,25 mit Triethylaminphosphat, modifiziert mit Acetonitril; und ein Gradient aus 0,1% TFA in Wasser, modifiziert mit Acetonitril. Der Säuleneluent wurde bei 215 nm überwacht. Die Identität von jedem Produkt wurde mittels der Aminosäureanalyse und mittels Elektroskopie-Massenspektrometrie bestätigt.
Die GLP-2-Antagonisten wurden als Nächstes wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben formuliert. Jeder der GLP-2-Antagonisten war, sofern nicht anderweitig angegeben wird, in Wasser bei Raumtemperatur vollständig löslich.
BEISPIEL 2 – FORMULIERUNG DES GLP-2-ANTAGONISTEN
Die GLP-2-Antagonisten wurden für Injektionszwecke entweder in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder als eine Gelatine-enthaltende Depotformulierung formuliert. Für die PBS-formulierten GLP-2-Antagonistenpräparationen wurde zuerst unter Verwendung von 80 g NaCl (BDH ACS 783), 2 g KCl (BDH ACS 645), 11,5 g Na₂HPO₄ (Anachemia AC-8460) und 2 g KH₂PO₄ (Malinckrodt AR7100) eine 10 × PBS-Stammlösung hergestellt, die mit sterilem destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von einem Liter aufgefüllt wurde. Die endgültige Arbeitslösung wurde durch eine Verdünnung der Stammlösung von 10:1 mit sterilem destilliertem Wasser erhalten und gegebenenfalls unter Verwendung ausreichender Volumina von 10 N NaOH auf pH 7,3–7,4 eingestellt. Die Arbeitslösung wurde dann 30 Minuten autoklaviert. In der endgültigen PBS-Arbeitslösung betrugen die Konzentrationen 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄·7H₂O und 1,4 mM KH₂PO₄.
Die GLP-2-Antagonisten, als ein pulverförmiges Peptid, wurden der PBS-Arbeitslösung nach Bedarf zugefügt, um Formulierungen mit den gewünschten Peptidkonzentrationen zu erzeugen. So wurden zum Beispiel zur Erzeugung einer PBS-Lösung aus einem GLP-2-Antagonisten bei 130 mg/l 5,2 mg GLP-2-Antagonist in 40 ml PBS aufgelöst, um eine GLP-2-Antagonisten-Konzentration von 130 μg/ml zu ergeben, und Filter-sterilisiert. 0,5 ml der GLP-2-Antagonistenlösung wurden zweimal täglich injiziert.
Zur Erzeugung von auf Gelatine basierenden GLP-2-Antagonisten-Formulierungen wurde zuerst eine Gelatinelösung durch Auflösen von 12 Gramm Gelatine (Sigma, G-8150 Lot Nr. 54HO7241 Typ A aus Schweinehaut [9000-70-8] ca. 300 Bloom) in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Gelatinelösung wurde dann autoklaviert, bei 37°C erwärmt und der in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung aufgelöste GLP-2-Antagonist wurde, wie vorstehend beschrieben, zugefügt, um spezifische, gewünschte Peptidkonzentrationen zu erlangen. Um zum Beispiel eine auf Gelatine basierende PBS-Lösung des GLP-2-Antagonisten in einer Konzentration von 130 mg/l zu erzeugen, wurden 10 ml einer mit 5,2 mg GLP-2-Antagonist hergestellten PBS-Lösung mit 30 ml der 20%igen Gelatine-Arbeitslösung, wie zuerst vorstehend beschrieben, hergestellt. Die Lösung wurde durch vorsichtiges Pipettieren gemischt, um eine Endlösung von 130 mg/l GLP-2-Antagonist in PBS/15% Gelatine zu ergeben.
BEISPIEL 3 – ASSAY AUF RESISTENZ GEGEN DIPEPTIDYLPEPTIDASE IV
Die folgenden Peptide wurden auf Resistenz gegen Dipeptidylpeptidase IV (DPP-IV) getestet: ein Kontrollpeptid, Ratten-GLP-2; der [D-Ala²]-GLP-2-Agonist der Ratte; und der [Gly²]-GLP-2-Agonist der Ratte. Zusätzlich wurden auch die folgenden Peptide auf DPP-IV-Resistenz getestet: [Gly², Ala¹⁵]GLP-2, [Gly², Ala-²²]GLP-2, [Gly², Ala²⁹]GLP-2, [Gly², Ala³²]GLP-2, [Gly², Ala³³]GLP-2, [Leu²]GLP-2, [Glu²]GLP-2, [Arg²]GLP-2, [Trp²]GLP-2, [PO₃-Tyr²]GLP-2 und [Cys²]GLP-2. Zur Durchführung des Assays wurden 2,5 Mikroliter (μl) einer Lösung von DPP-IV aus der humanen Plazenta (Calbiochem, La Jolla, CA, Kat. Nr. 317624), enthaltend 0,125 Millieinheiten (mU) Enzym in 50% Glycerol, 10 mM Tris, pH 7,8, EDTA und 0,02% NaN₃ 50 μl einer Lösung des in einer Konzentration von 0,2 mg/ml in PBS bei pH 7,4 hergestellten Testpeptids zugefügt. Das Gemisch wurde bei 37°C in einem Umlaufwasserbad 24 Stunden inkubiert. Die Inkubation wurde durch die Zugabe von 50 μl einer Lösung aus Diprotin A, hergestellt in einer Konzentration von 4 mg/ml in PBS, gequencht. Jedes Peptid wurde in Doppelbestimmung getestet.
Jede Probe wurde mittels der Umkehrphasen-(RP)-HPLC wie folgt analysiert: 90 μl des gequenchten Inkubationsgemischs wurden auf eine Rainin Dynamax 300 Å, C18, 5 Mikron, 4,6 × 250 Millimeter Säule injiziert. Die Proben wurden mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, modifiziert mit 0,1% Acetonitril, unter Verwendung eines linearen Gradienten und einer Fließrate von 1 ml pro Minute eluiert. Die Probenkomponenten wurden bei 214 Nanometer (nm) nachgewiesen. Das Ausmaß der Spaltung wurde durch relative Integration des Peaks, der dem Spaltprodukt entspricht, im Vergleich zu dem des zurückbleibenden, nicht verdauten Ausgangspeptids gemessen. Es wurde bestätigt, dass sich das Spaltprodukt des Kontrollpeptids, Ratten-GLP-2(1-33), das Ratten-GLP-2(3-33) sein sollte, aus der Spaltung zwischen den Resten Ala² und Asp², durch Vergleich der Retentionszeit dieser Komponente mit der eines synthetischen Peptid-Standards, Ratten-GLP-2(3-33), und durch Sammlung des Produkts aus der HPLC und Analyse mittels Massenspektrometrie, ergab.
Nach der 24-stündigen Inkubation wurden 22% des Kontrollpeptids, Ratten-GLP-2 durch DPP-IV gespalten. Für die folgenden Peptide wurden nach 24 Stunden keine Spaltprodukte nachgewiesen: [D-Ala²]GLP-2 der Ratte, [Gly²]GLP-2 der Ratte, [Gly², Ala¹⁵]GLP-2, [Gly², Ala²²]GLP-2, [Gly², Ala-²⁹]GLP-2, [Gly², Ala³²]GLP-2, [Gly², Ala³³]GLP-2, [Leu²]GLP-2, [Glu²]GLP-2, [Arg²]GLP-2, [Trp²]GLP-2, [PO₃-Tyr²]GLP-2, und [Cys²]GLP-2.
BEISPIEL 4 – BEURTEILUNG DES GLP-2-ANTAGONISTEN DURCH VERABREICHUNG AN MÄUSE
Empfänger waren CD1-Mäuse, die vom Charles River Laboratory (Ontario, Kanada) erworben wurden. Bei den CD1-Mäusen handelte es sich zum Zeitpunkt der Injektion um altersmäßig abgestimmte Weibchen (n = 3–4 pro Gruppe), 6 Wochen alt, sofern nicht anderweitig spezifiziert wird. Die Tiere durften sich vor Einleitung eines jeden Experiments mindestens 24 Stunden an die Laboreinrichtung akklimatisieren. Die Tiere wurden mithilfe eines gestanzten Ohrlochs identifiziert. Die Ration oder die Aktivität der Mäuse wurde während der Experimente nicht eingeschränkt. Der Licht-Dunkel-Zyklus betrug, zwischen 18:00 Uhr und 6:00 Uhr, 12 Stunden. Bei den Kontrollen handelte es sich um alters- und geschlechtsmäßig abgestimmte (n = 3–4) Tiere. Die Mäuse wurden zweimal täglich (b.i.d.) mit 2,5 μg Peptid in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml PBS subkutan injiziert und wurden in der Laboreinrichtung täglich überwacht. Die Tiere wurden 10 oder 14 Tage nach der Injektion geopfert und wurden vor dem Opfern mindestens 20 Stunden fasten lassen.
Die Mäuse wurden mit CO₂ anästhesiert und mittels Herzpunktion ausgeblutet. Das Blut wurde in 75 μl TED (Trasysol; EDTA (5000 KIU/ml: 1,2 mg/ml; Diprotin-A)) gesammelt und wurde bei 14 k × g 5 Minuten zentrifugiert, und das Plasma wurde vor der Analyse bei –70°C gelagert. Der Dünndarm wurde, vom Pylorus bis zum Cäcum, aus der Bauchhöhle entfernt, gereinigt, gewogen und gemessen. Für Vergleichszwecke wurden von jedem Tier, von der identischen anatomischen Position, Schnitte angefertigt. Für die Histomorphometrie wurden jeweils 1,5–2,0 cm lange Fragmente bei 8 ± 2 cm, 182 cm, 32 ± 2 cm vom Pylorus ausgehend gewonnen, die dem proximalen Jejunum, distalen Jejunum und distalen Ileum entsprachen. Jedes Dünndarmfragment wurde längs verlaufend an seiner dem Mesenterium abgewandten Seite auf einem Gewebsblock geöffnet, dann über Nacht in 10% Formalin (Vol./Vol.) gegeben und danach in 70%igen ETOH überführt.
Die prozentuale Änderung des Dünndarmgewichts wurde wie folgt berechnet: durch Dividieren der mittleren Änderung des Darmgewichts von mit dem Antagonisten behandelten Mäusen relativ zu mit nur dem Vehikel behandelten Mäusen, durch das mittlere Darmgewicht von nur mit dem Vehikel behandelten Mäusen, und Multiplikation dieser Zahl mit 100.
TABELLE 1
Diese Ergebnisse etablieren, dass Antagonisten des humanen GLP-2, die Substitutionen der konservierten Reste an den Positionen 15, 29, 32 oder 33 mit einem Alaninrest enthalten, faktisch zu einer Abnahme des Dünndarmgewichts führen, wenn sie in die Maus injiziert werden. Im Gegensatz dazu erhöhen Analoge des humanen GLP-2, die einen Wildtyprest an diesen Positionen enthalten (die aber die Gly²-Substitution enthalten), das Dünndarmgewicht, wenn sie unter Verwendung eines identischen experimentellen Protokolls in die Mäuse injiziert werden (Daten nicht gezeigt). Deshalb wurde gefolgert, dass die Substitution der Reste an den Positionen 15, 29, 32 oder 33 die funktionelle Aktivität von GLP-2 teilweise disruptiert und zu einem GLP-2-Antagonisten führt.
Zusätzlich zeigen diese Daten auch das extrem überraschende Ergebnis, dass Substitutionen der Ala²-Position durch einen Aminosäurerest, mit Ausnahme von Gly, spezifisch Leu, Glu, Arg, Trp, Cys, PO₃-Tyr und Phg zu einer antagonistischen Aktivität führten.
BEISPIEL 5 – BEURTEILUNG VON GLP-2-ANTAGONISTEN DURCH COADMINISTRATION MIT GLP-2 AN MÄUSE
Der Kandidaten-Peptidantagonist und GLP-2 von der Ratte wurden in PBS aufgelöst, um ein Endverhältnis von 25 μg Antagonist/2,5 μg GLP-2 pro 0,5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (für ein Verhältnis von 10:1) oder 12,5 μg Antagonist/2,5 μg GLP-2 pro 0,5 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (für ein Verhältnis von 4:1), wie angezeigt zu ergeben. Das Antagonisten-/GLP-2-Gemisch wurde an 6–8 Wochen alte weibliche CD1-Mäuse subkutan verabreicht, wobei die injizierte Peptidmenge 25 μg Antagonist/2,5 μG GLP-2 in 0,5 ml zweimal täglich oder 12,5 μg Antagonist/2,5 μg GLP-2 in 0,5 ml zweimal täglich betrug. Nach 10–14 Tagen wurden die mit Peptid-injizierten Mäuse und die Kontrollmäuse (mit Kochsalz injiziert) geopfert und die Dünndarmgewichte bestimmt.
TABELLE 2
Diese Ergebnisse erläutern, dass Deletionen der ersten eins bis vier Reste von GLP-2 zu einem Antagonisten führen, der die intestinotrophe Aktivität der Ratten-GLP-2 antagonisiert, wenn er in experimentelle Mäuse coinjiziert wird. Diese Ergebnisse sind aus mindestens zwei Gründen signifikant. Erstens zeigen diese Daten, dass der extreme Aminoterminus der GLP-2-Peptide an der intestinotrophen Wirkung von GLP-2 beteiligt ist. Deshalb werden andere Veränderungen, welche diesen Terminus disruptieren, zum Beispiel Substitutionen von Aminosäuren mit entgegengesetzten Eigenschaften, anstelle von Deletionen, wahrscheinlich an das sich ergebende Analog auch eine antagonistische Aktivität verleihen. Zweitens dient die Coadministration von Antagonist und GLP-2 der Abnahme oder sogar Elimination der intestinotrophen Wirkung von GLP-2. Antagonisten von GLP-2 können deshalb in Situationen an einen Patienten verabreicht werden, bei dem eine übermäßige Produktion von GLP-2 auftritt, zum Beispiel bei einem Patienten mit einem Tumor, der GLP-2 sezerniert und/oder auf das GLP-2-Peptid trophisch anspricht.

Claims

Polypeptid-Analog eines GLP-2-Peptids von einem Säuger, worin das Analog die intestinotrophe Aktivität des GLP-2-Peptids inhibiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus einem Referenz-GLP-2 von einem Säuger besteht und relativ zum GLP-2-Peptid eine oder mehr strukturelle Mutation(en) inkorporiert, ausgewählt aus: (i) einer Deletion aus von einem bis vier von jedwedem der ersten vier N-terminalen Reste des GLP-2-Peptids, (ii) einer Substitution von mindestens einer Aminosäure, die im GLP-2-Peptid an einer Position auftritt, die aus Asp¹⁵, Thr²⁸ und Thr³² ausgewählt ist, mit einer Aminosäure, die an der Position im Referenz-GLP-2 nicht natürlich vorkommt; und (iii) einer Substitution von Ala² im GLP-2-Peptid mit einer Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cys, Trp und PO₃-Tyr².
Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Referenz-GLP-2 von einem Säuger aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus humanem GLP-2, GLP-2 vom Degu, bovinem GLP-2, porzinem GLP2, GLP-2 vom Meerschweinchen und GLP-2 vom Hamster.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, worin das Referenz-GLP-2 von einem Säuger humanes GLP-2 darstellt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das Peptid eine Substitution an einer Position aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Asp¹⁵, Thr²⁹ und Thr³², mit einer Aminosäure, die an der Position im Referenz-GLP-2 nicht natürlich vorkommt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus [Trp²]GLP-2, [PO₃-Tyr²]GLP-2 und [Cys²]GLP-2.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, das GLP-2 (2-33) ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, das GLP-2 (3-33) ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, das GLP-2 (4-33) ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, das GLP-2 (5-33) ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–4, welches Peptid weiter eine oder mehr Substitution(en) umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, bestehend aus: (i) einer Substitution von Ala² mit Val, Gly oder D-Ala; (ii) einer Substitution von Met¹⁰ mit Leu, Ile, Nle oder Ala; (iii) einer Amino-terminalen Blockierungsgruppe; und (iv) einer Carboxy-terminalen Blockierungsgruppe.
Polypeptid nach Anspruch 10, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: [Gly², Ala¹⁵]GLP-2; [Gly², Ala²²]GLP-2; [Gly², Ala²⁹]GLP-2; [Gly², Ala³²)GLP-2; und [Gly², Ala³³]GLP-2.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–11 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Dünndarmkarzinoms, einer Darmmotilitätsstörung, eines Reizdarm-Syndroms, einer chronischen Diarrhöe oder einer klinischen Adipositas bei einem Patienten.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–11 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Reduktion einer Hyperplasie oder zur Induktion einer Hypoplasie von Dünndarmgewebe bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 14, worin der Patient an Adipositas leidet oder ein Patient, der vor der Behandlung mit Chemotherapie oder Strahlentherapie Darmruhe benötigt.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–11 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Besserung eines pathologischen Effekts oder Symptoms einer gastrointestinalen Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die gastrointestinale Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Dünndarmkarzinom, Cholera, Reizdarm, Darmmotilitätsstörungen und chronischer Diarrhöe.
Verfahren zur Identifikation eines GLP-2-Antagonisten, umfassend die Schritte von: (1) Erhalt eines GLP-2-Analogs, das sich von einem Referenz-GLP-2 von einem Säuger dadurch unterscheidet, dass es eine strukturelle Veränderung aufweist, ausgewählt aus: (i) einer Deletion von mindestens einer Aminosäure und (ii) einer Substitution von mindestens einer Aminosäureposition mit einer Aminosäure, die an dieser Position nicht natürlich vorkommt und (iii) eine Kombination von (i) und (ii); (2) Behandlung eines Säugers mit dem Analog unter Verwendung eines Regimes, das zur Auslösung einer Abnahme des Dünndarmgewichts fähig ist; und (3) Bestimmung der Wirkung des Analogs auf das Dünndarmgewicht relativ zu einem Kontrollsäuger, der nur das Vehikel erhält, wodurch der funktionelle Antagonist von GLP-2 als ein Analog identifiziert ist, das eine Abnahme des Dünndarmgewichts auslöst.
Verfahren zur Identifikation eines GLP-2-Antagonisten, umfassend die Schritte von: (1) Erhalt eines GLP-2-Analogs, das sich von einem Referenz-GLP-2 von einem Säuger dadurch unterscheidet, dass es eine strukturelle Veränderung aufweist, ausgewählt aus: (i) einer Deletion von mindestens einer Aminosäure und (ii) einer Substitution von mindestens einer Aminosäureposition mit einer Aminosäure, die an dieser Position nicht natürlich vorkommt und (iii) einer Kombination von (i) und (ii); (2) Behandlung eines Säugers mit dem Analog, das mit GLP-2 oder einem intestinotrophen Analog von GLP-2 zusammen verabreicht wird, unter Verwendung eines Regimes, das zur Auslösung einer Reduktion der Dünndarmgewichtszunahme fähig ist, die bei Verabreichung von GLP-2 allein gesehen wird; und (3) Bestimmung der Wirkung des Analogs auf das Dünndarmgewicht relativ zu einem Kontrolltier, das das GLP-2 allein oder ein intestinotrophes GLP-2-Analog allein erhält, wodurch der funktionelle Antagonist als ein Analog identifiziert ist, das eine Reduktion der Erhöhung des Darmgewichts auslöst.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, worin die strukturelle Veränderung des GLP-2-Analogs eine Deletion aus von einem bis vier von jedwedem der ersten vier N-terminalen Reste darstellt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, worin die strukturelle Veränderung des GLP-2-Analogs eine Substitution an einer Position darstellt, die aus Asp¹⁵, Phe²², Thr²⁹, Thr³² und Asp³³ ausgewählt ist.
Wirtszelle, die mit einem Polynukleotid-Expressionskonstrukt transformiert ist, das für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–11 kodiert.