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Erfindungsgebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein zusammengesetztes immobilisiertes Enzympräparat und ein Verfahren zum
Herstellen von D-Aminosäuren
unter Verwendung dieses Präparats.
Insbesondere ist das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat der
vorliegenden Erfindung nützlich
zur Herstellung von D-α-Aminosäuren, welche
Zwischenprodukte zur Herstellung von Antibiotika sind, wie beispielsweise
D-(p-Hydroxyphenyl)glycin, das zur Herstellung des Antibiotikums
Amoxycillin und ähnlichem
verwendet werden soll.
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Hintergründe der
Erfindung
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Optisch aktive D-Aminosäuren sind
wichtige Verbindungen als Zwischenverbindungen für Medikamente, und es war bekannt,
dass sie in effizienter Weise durch das Kombinieren einer asymmetrischen
Hydrolysereaktion von 5-substituierten Hydantoinen in die entsprechenden
D-N-Carbamyl-α-aminosäuren mit
Enzymen, Hydantoinasen (nachfolgend manchmal als "Hase" abgekürzt) (GB-A-2
042 531 und JP-B 62-30785) und eine Umwandlungsreaktion der dadurch
erhaltenen D-N-Carbamyl-α-aminosäuren in
die entsprechenden D-α-Aminosäuren mit
Enzymen, den D-N-Carbamyl-α-aminosäureamidohydrolasen
(nachfolgend manchmal als "Decarbamylase" oder "DCase" abgekürzt) (PCT/JP91/0696:
WO 92/10579) hergestellt werden können.
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Außerdem offenbaren EP-A-0261836
(JP-A-63-185382), WO 92/22643 und ähnliche, dass entsprechende
Reaktionen in effizienterer Weise durch Verwenden dieser Enzyme
in Form sogenannter immobilisierter Enzyme durchgeführt werden können, wobei
diese auf Trägern
wie beispielsweise Ionenaustauschharzen und ähnlichen immobilisiert sind.
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Es ist jedoch eine Zweischrittreaktion
zum Durchführen
dieser Reaktionen benutzt worden, da die optimalen und stabilen
pH-Werte beider
Enzyme beträchtlich
voneinander abweichen. Deswegen mussten beide immobilisierten Enzyme
getrennt voneinander hergestellt werden, und komplizierte Reaktionsarbeitsverfahren werden
benötigt.
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WO 93 21 335 A betrifft ein Verfahren
zum Herstellen von D-Aminosäuren aus
einem racematischen Gemisch unter Verwendung von Mikroorganismen,
die enzymatische Hydantoinase- und Carbamylase-Wirkungen enthalten,
die auf einem Träger
immobilisiert sind. Die Einzelenzyme Hydantoinase und Carbamylase wurden
nicht voneinander getrennt. Das bedeutet, dass dem Dokument zufolge
der Mikroorganismus auf dem Träger
immobilisiert ist und nicht das Enzym.
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US-A-4,211,840 und JP-2119796 A beschreiben
ein Verfahren zum Herstellen von D-α-Aminosäuren durch das Kontaktieren
eines 5-substituierten Hydantoins mit einem Enzym, das in der Lage
ist, das 5-substituierte Hydantoin in die D-α-Aminosäure umzuwandeln. Für die Umwandlung
des 5-substituierten Hydantoins in die D-α-Aminosäure wird nur ein notwendiges
Enzym verwendet.
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WO 94 00577 A betrifft die Herstellung
eines Carbamoylaseenzyms durch das Exprimieren rekombinanter DNA,
die ein Carbamoylasegen in einem homologen Wirt codiert. Sie betrifft
auch spezifische rekombinante DNA-Vektoren, die ein Carbamoylaseenzym
und/oder ein Hydantoinaseenzym umfassen, um D-α-Aminosäuren herzustellen. Unter Verwendung
der DNA, die in diesem Dokument beschrieben ist, wird D,L-5-substituiertes
Hydantoin in seine D-α-Aminosäure umgewandelt.
WO 92 00577 A beschreibt jedoch nicht die Immobilisierung beider
Enzyme, die beispielsweise aus einem Mikroorganismus auf einem Träger, der
diese unter Verwendung von DNA-Vektoren beide herstellt, erhalten
werden.
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EP-261 836 betrifft ein immobilisiertes
Enzympräparat.
Das Enzympräparat
umfasst eine immobilisierte Hydantoinase zur Herstellung von D(–)(gegebenenfalls
substituiertem Phenyl)glycin oder ein N-Carbamoylderivat davon durch
die Hydrolyse von 5-(gegebenenfalls substituiertem Phenyl)hydantoin.
Es wurde herausgefunden, dass die Gegenwart eines divalenten Metallions
in einem immobilisierten Enzymsystem dem Präparat Stabilität verleiht.
Das Hydantoinenzym ist aus einem Mikroorganismus gewonnen.
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JP 211 9796 A betrifft ein Verfahren zum Herstellen
von L-Homophenylalanin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der
eine L-spezifische Hydantoinase besitzt, die aus einer Hydantoinhydrolase
und N-Carbamylaminosäurehydrolase
besteht, oder einem Enzym dieser Art wird ermöglicht, auf 5-Benzylmethylhydantoin
einzuwirken, um L-Homophenylalanin herzustellen.
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JP 227 6586 A betrifft ein Verfahren zum Herstellen
von D-Homophenylalanin. D-Homophenylalanin wird mit einem Mikroorganismus
hergestellt, der zu Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Serratia,
Aspergillus und Rhizomocur gehört,
oder mit einem D-Hydantoin-zersetzenden Enzym, das aus einem dieser
Mikroorganismen stammt, dem ermöglicht
wird, auf 5-Benzylmethylhydantoin einzuwirken.
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Ziele der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine effiziente Technik zum Herstellen von D-α-Aminosäuren unter Verwendung eines
immobilisierten Enzymharzes, das durch das gleichzeitige Immobilisieren
von Hydantoinase und Decarbamylase direkt auf einem Immobilisierungsharzträger in einem
Zustand der Koexistenz der Enzyme (nachfolgend als "zusammengesetzte
Enzyme" bezeichnet)
erhalten wird.
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In diesen zwei enzymatischen Umsetzungen
zum Umwandeln von 5-substituierten Hydantoinen in D-α-Aminosäuren ist
der optimale pH-Wert der Hydantoinaseumsetzung pH 8 bis 9 und die
Löslichkeit
des Substrats wird mit einem Anstieg des pH-Werts gesteigert. Zusätzlich wird
die racematische Umsetzung des Hydantoinrings in einem alkalischen
Bereich gefördert.
Deswegen ist es beabsichtigt, die Hydantoinasereaktion in einem
pH-Wert durchzuführen,
der von 7 bis 10 reicht, bevorzugt in einem alkalischen Bereich.
Andererseits ist der optimale pH-Wert der Decarbamylasereaktion
im allgemeinen 6,5 bis 9,0, aber die Hemmung der Reaktion durch
gebildetes Ammonium wird durch Anstieg des pH-Werts bemerkenswert
gesteigert. Deswegen ist es beabsichtigt, die Decarbamylaseumsetzung
bei einem pH-Wert über
dem Neutralwert durchzuführen.
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Wenn eine sogenannte Einschrittreaktion
zum Durchführen
dieser Umsetzungen verwendet werden kann, d. h. dass diese zwei
enzymatischen Reaktionen in einem Reaktionsgefäß gleichzeitig durchgeführt werden,
verglichen mit einer sogenannten Zweischrittreaktion, indem zwei
verschiedene Enzyme mit den Substraten getrennt reagieren, werden
die Reaktionsarbeitsschritte einfach, und die Gesamtreaktionsdauer
kann verkürzt
werden. Indem die Hydantoinaseumsetzung, welche eine Umkehrreaktion
ist, und die Decarbamylasereaktion, welche eine nicht umkehrbare
Reaktion ist, zusätzlich
kombiniert werden, kann die Konversionsausbeute von Hydantoin ebenso
verbessert werden, wie die anschließende Reinigung der D-α-Aminosäuren vereinfacht
werden kann. So ist es zu erwarten, dass die Produktionskosten signifikant
gesenkt werden können.
Wenn jedoch die entsprechenden Enzyme auf verschiedenen Immobilisierungsträgern immobilisiert
sind und sie bei deren Verwendung gemischt werden, werden die Reaktionsfähigkeiten aufgrund
des Unterschieds beim optimalen pH-Wert schlechter, und es gibt
ein Problem hinsichtlich der Stabilität der immobilisierten Enzyme.
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Die vorstelligen Erfinder haben intensiv
geforscht, um ein zusammengesetztes immobilisiertes Enzympräparat herzustellen,
in dem beide Enzyme gleichzeitig direkt auf einem Immobilisierungsträger immobilisiert werden.
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Wenn diese zwei Enzyme gleichzeitig
immobilisiert werden, treten nacheinander in den Mikrozwischenräumen der
Harze zwei enzymatische Reaktionen ein. Deswegen wird eine Bewegung
des Substrats für die
Decarbamylase, eine D-N-Carbamyl-α-aminosäure, von
der immobilisierten Hase zu der immobilisierten DCase mittels Diffusion
nicht benötigt,
und die Variierung des pH-Werts in den Mikrozwischenräumen kann
minimiert werden. Auf diese Weise wird erwartet, dass zusätzlich zum
Anstieg der Reaktivitäten
der entsprechenden Enzyme und der Verhinderung der Hemmung des Produkts
aufgrund von Ammonium, die Stabilität der Enzyme nach wiederholter
Verwendung verbessert wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren zur effizienten Herstellung einer D-Aminosäure des
entsprechenden DL-5-substituierten Hydantoins mit Hilfe einer Einschrittreaktion
zur Verfügung,
welche das Verwenden eines zusammengesetzten immobilisierten Enzyms
bei einem pH-Wert bei ungefähr
neutralem Wert umfasst, wobei das zusammengesetzte immobilisierte
Enzym durch die gleichzeitige Immobilisierung eines Gemisches einer
Hydantoinase, die ihren optimalen pH-Wert innerhalb eines alkalischen
Bereichs hat, und einer D-N-Carbamyl-α-aminosäureamidohydrolase mit einem
optimalen pH-Wert über
dem neutralen Wert in einem Zustand der Koexistenz direkt auf einem
Immobilisierungsträger
eines anionischen Ionenaustauschharzes umfasst (nachfolgend als
zusammengesetztes Enzym bezeichnet).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Hinsichtlich der Hydantoinase, die
in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können Enzyme von Tieren, Pflanzen
und Mikroorganismen verwendet werden. Die Hydantoinasen aus Mikroorganismen
sind für die
industrielle Herstellung geeignet. Als ein solcher Mikroorganismus
kann einer, der in GB-A-2 042 531 (JP-B-62-30759) offenbart ist,
exemplarisch dargestellt werden. Diese Bakterien schließen Achromobacter, Aerobacter,
Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium,
Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella,
Microbacterium, Micrococcus, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas,
Sarcina, Serratia, Xanthomonas und ähnliche ein. Die Actinomyceten
schließen
Actinomyces, Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces, Actinoplanes
und ähnliche
ein. Die filamentösen
Pilze schließen
Aspergillus, Paecilomyces und Penicillium und ähnliche ein. Die Hefen schließen Candida,
Pichia, Rhodotorula, Torulopsis und ähnliche ein.
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Von den oben genannten Mikroorganismen
schließen
Beispiele für
Stämme,
die relativ hohe Hydantoinaseaktivitäten haben und zur praktischen
Verwendung hervorragend geeignet sind, Aerobacter cloacae IAM 1221,
Agrobacterium rhizogenes IFO 13259, Brevibacterium incertum IFO
12145, Corynebacterium sepedonicum IFO 3306, Microbacterium flavum
ATCC 10340, Micrococcus roseus IFO 3764, Pseudomonas striata IFO
12996, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Nocardia corallina IFO
3338, Streptomyces flaveolus IFO 3241, Bacillus sp. KNK108 (FERM
P-6056), Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863) und ähnliche ein.
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Zusätzlich können Enzyme verwendet werden,
die durch künstliche
Mikroorganismen hergestellt werden, in denen die Hydantoinaseproduktionsfähigkeit
durch Genrekombinationstechnologie verliehen wird, z. B. E. coli
HB101pTH104 (FERM BP-4864), oder erhöht ist, oder eine Dihydropyrimidinase
mit ähnlicher
Aktivität wie
in JP-A 53-136583 kann verwendet werden.
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Hinsichtlich der Decarbamylase, die
in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind deren Ursprünge nicht
spezifisch beschränkt,
und solche, die von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen, können verwendet
werden. Für
die industrielle Herstellung sind jedoch Enzyme aus Mikroorganismen
geeignet. Beispiele solcher Mikroorganismen schließen natürlich auftretende
Mikroorganismen ein, wie beispielsweise Agrobacterium, Pseudomonas,
Arthrobacter, Alcaligenes, Achromobacter, Moraxella, Paracoccus,
Aerobacter, Aeromonas, Brevibacterium, Bacillus, Flavobacterium
und Serratia ein, die in JP-B 57-18793, GB-A 2022 591 (JP-B-63-20520)
und GB-A-2042 531 (JP-B-I-48758) offenbart sind, oder die artifiziellen
Mikroorganismen, die in WO 92/10579 beschrieben werden, in denen
die Decarbamylaseproduktionsfähigkeit
durch die Genrekombinationstechnologie verliehen oder gesteigert
wird. Repräsentative
Beispiele solcher Mikroorganismen schließen Agrobacterium sp. KNK712
(FERM BP-1900), Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP-3181), Pseudomonas
sp. KNK505 (FERM BP-3182),
Escherichia coli JM109pAD108 (FERM BP 3184), E. coli JM109pPD304
(FERM BP-3183) und ähnliche
ein.
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Wenn eine stabilisierte Decarbamylase
verwendet wird, in der die Aminosäure, die für eine Hitzeresistenz der Decarbamylase
verantwortlich ist, welche durch eine andere ersetzt ist, können die
folgenden Transformanten, die in WO 94/03613 offenbart sind, verwendet
werden. Die Transformanten schließen beispielsweise E. coli
JM109pAD402 (FERM BP-3912), E. coli JM109pAD404 (FERM BP-3913),
E. coli JM109pAD406 (FERM BP 3914), E. coli JM109pAD416 (FERM BP-3915),
E. coli JM109pAD429 (FERM BP-4035), E. coli JM109pAD421, E. coli JM109pAD422,
E. coli JM109pAD423, E. coli JM109pAD424 (FERM BP-4034), E. coli JM
109pAD426, E. coli JM109pAD427, E. coli JM109pAD451, E. coli JM109pAD455
(FERM BP-4036), E coli HB101pNT4553 (FERM BP-4368) oder ähnliche
ein. Wenn solche stabilisierten Enzyme verwendet werden, können bei
wiederholter Verwendung der zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparate der
vorliegenden Erfindung bessere Ergebnisse erhalten werden.
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Die in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Enzyme können
gleichzeitig unter Verwendung eines Mikroorganismus hergestellt
werden, der in der Lage ist, beide Enzyme herzustellen. Alternativ
dazu können die
Enzyme getrennt voneinander oder simultan unter Verwendung von Mikroorganismen
hergestellt werden, die in der Lage sind, die entsprechenden Enzyme
alleine herzustellen. Als Mikroorganismus, der in der Lage ist,
beide Enzyme herzustellen, kann ein Mikroorganismus, der aus einer
natürlichen
Quelle isoliert wurde, wie beispielsweise ein Agrobacterium, das
in GB-A-202 2591 (JP-8-63-20520) beschrieben ist und ähnliche
verwendet werden. Zusätzlich
kann ein rekombinanter Mikroorganismus, der durch das Isolieren
von Genen beider Enzyme aus Mikroorganismen, die aus einer natürlichen
Quelle isoliert wurden und durch das Einschleusen davon in einen
Wirt hergestellt werden, beispielsweise die Mikroorganismen, die
in WO 94/00577 offenbart sind, verwendet werden. Ein Mikroorganismus,
der beide Enzyme gleichzeitig produziert, ist auch Agrobacterium
spKNK-712 (FERM BP-1900), Rhizobium sp. KNK 1415 (FERM BP-4419) oder Pseudomonas
sp. KNK 003A (FERM BP-3181). Alternativ dazu können beide Enzyme aus gleichen
oder verschiedenen Mikroorganismen isoliert werden und in den gleichen
Sektor in der exprimierbaren Form beider Gene inseriert werden oder
in verschiedene Vektoren inseriert werden, die verschiedene Replikationsmodi
besitzen, z. B. pUC19 und pACYC184. Dann kann ein Empfängerwirt
wie beispielsweise E. coli mit dem obengenannten Vektor oder den Vektoren
transformiert werden, so dass ein einzelner Mikroorganismus beide
Enzyme herstellen kann. In diesen Fällen kann das Verhältnis der
Herstellung jedes Enzyms durch das Auswählen der Promotorarten mit
verschiedenen Fähigkeiten
und von Plasmiden mit verschiedenen Kopienanzahlen entsprechend
des besonderen Zwecks variiert werden. Es wird jedoch bevorzugt,
das Verhältnis
so einzustellen, dass fast gleiche Mengen der Enzymproteine erhalten
werden. Im Fall, dass Mikroorganismen verwendet werden, die die
verschiedenen Enzyme getrennt voneinander herstellen, können auch
Stämme
verwendet werden, die aus ihren natürlichen Quellen isoliert wurden
oder rekombinante Mikroorganismen, die unter Verwendung von rekombinanten
Gentechnologien hergestellt wurden, verwendet werden. In einem solchen
Fall kann die Herstellung der Enzyme durch das getrennte Kultivieren
der Herstellermikroorganismen durchgeführt werden oder durch das Kultivieren
in einer gemischten Kultur in verschiedenen Verhältnissen, bevorzugt in einem
solchen Verhältnis, dass
fast gleiche Mengen der Enzyme hergestellt werden.
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Die Kultivierung kann aerobisch durchgeführt werden,
z. B. durch eine Schüttelkultur
unter Verwendung von Flaschen oder durch eine Spinnerkultur mit
Belüftung.
Als normalerweise verwendetes Kulturmedium, das bei der Kultivierung
normalerweise verwendet wird, kann ein Nährmedium, das allgemein verwendete natürliche Nährstoffe
enthält,
wie beispielsweise Fleischextrakt oder Polypepton und ähnliche,
verwendet werden. Wenn die Hydantoinase getrennt oder gleichzeitig
mit Decarbamylase hergestellt wird, kann ein gutes Ergebnis durch
das Durchführen
der Kultivierung unter der Zugabe von Manganionen in einer Menge
von beispielsweise 1 bis 100 mg/l, bevorzugt ungefähr 20 mg/l
Manganchlorid durchgeführt
werden.
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Und sofern die Enzyme unter den Bedingungen
sind, dass die enzymatischen Wirkungen gezeigt werden können, können die Enzyme
in jeder Form vorliegen und von jeder Substanz begleitet werden.
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Bei der Herstellung oder Verwendung
des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats der vorliegenden Erfindung
können
bessere Ergebnisse durch Zugeben eines Antioxidationsmittels für eine wiederholte
Verwendung erhalten werden. Als ein solches Antioxidationsmittel
kann Dithiothreitol, 2-Mercaptoethanol, L-Cysteinhydrochlorid, Cysteaminhydrochlorid,
Dithioerythritol oder ein Gemisch aus Dithiothreitol und Dithioerythritol,
reduziertem Glutathion und ähnlichem
verwendet werden.
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Der immobilisierte Träger, der
verwendet wird, kann entsprechend den besonderen Verwendungsbedingungen
der immobilisierten Enzyme variiert werden. Wenn eine Rohenzymlösung wie
beispielsweise ein zellfreier Extrakt oder eine teilweise gereinigte
Enzymlösung,
die mit Ammoniumsulfatpräzipitierung
oder ähnlichem
behandelt wurden, einer Immobilisierung unterworfen werden, können Polymerträger mit
Ionenaustauschgruppen oder kovalenten Bindungsgruppen verwendet
werden.
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Als Polymerträger mit einer Ionenaustauschgruppe,
können
z. B. Duolit (registrierte Handelsmarke)-Serien, oder Amberlite
IRA (registrierte Handelsmarke)-Serien verwendet werden, wobei die
Austauschgruppen primäre,
sekundäre,
tertiäre,
und quaterniäre
Amine sind; oder ein Polystyrolharz mit einer funktionalen diethanolartigen
Gruppe, beispielsweise Diaion EX.
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Als Träger mit einer kovalenten Bindungsgruppe
kann ein substituiertes Polymethacrylatpolymer mit einem Aldehyd
als Bindungsgruppe, eine Tonerde mit hoher Dichte, die mit einem
Polyethylenimin/Glutaraldehydkomplex bedeckt ist und ähnliche
verwendet werden.
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Das zusammengesetzte immobilisierte
Enzympräparat
der vorliegenden Erfindung wird wie folgt hergestellt. Eine Lösung der
Roheenzymzusammensetzung, in der die Aktivitäten von Hase und DCase entsprechend
eingestellt sind, wird mit einem Träger in Kontakt gebracht, um
die entsprechenden Enzyme zu absorbieren und dann zur Stabilisierung
mit einem Vernetzungsmittel behandelt. Um eine Lösung der zusammengesetzten
Rohenzyme herzustellen, wird jedes Enzym zuerst durch die Kultivierung
der mikrobiellen Zellen hergestellt. In diesem Fall kann ein zellfreier
Extrakt durch das Einsammeln der Zellen und deren Zerstören beispielsweise
durch Beschallung, mechanisches Aufschließen (z. B. Homogenisator) oder
eine Enzymbehandlung hergestellt werden, wenn ein Mikroorganismus,
der in der Lage ist, die Enzyme gleichzeitig zu produzieren, verwendet
wird. Wenn eine Lösung
der Enzymzusammensetzung unter Verwendung verschiedener Mikroorganismen
hergestellt wird, kann diese durch das getrennte Kultivieren der
Mikroorganismen, das Einsammeln der Zellen, das Herstellen entsprechender
zellfreier Extrakte und dem Mischen davon hergestellt werden. Oder
es kann durch das Kultivieren der entsprechenden Mikroorganismenproduzenten
zusammen hergestellt werden, und durch das Zerstören dieser Zellen zum gleichen
Zeitpunkt, um einen zellfreien Extrakt herzustellen, in dem beide
Enzyme gemischt sind. Sind beide Enzyme von verschiedenen Mikroorganismen hergestellt
werden, können
die Produktionsfähigkeiten
in großem
Ausmaß,
entsprechend den Arten der Mikroorganismen und dem Unterschied der
Kultivierungsverfahren, variieren. Hinsichtlich der Hydantoinase
produziert ein normaler Mikroorganismenproduzent im allgemeinen
jedoch die Hydantoinase zu ungefähr
0,1 bis ungefähr
10 Units/ml (ein Unit des Enzyms, wie es hier verwendet wird, ist
als die Menge definiert, die benötigt wird,
um das Substrat 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin
in D-N-Carbamyl-p-hydroxyphenylglycin bei einem pH-Wert von 8,7,
40°C für eine Minute
umzuwandeln) und ein rekombinanter künstlicher Mikroorganismenproduzent
produziert es zu ungefähr
5 bis ungefähr
150 Units/ml.
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Hinsichtlich der Decarbamylase, produziert
ein normaler Mikroorganismenproduzent die Decarbamylase zu ungefähr 0,01
bis ungefähr
2 Units/ml (ein Unit des Enzyms, wie es hier verwendet wird, ist
als die Menge definiert, die benötigt
wird, um das Substrat D-N-Carbamyl-p-hydroxyphenylglycin in D-p-Hydroxyphenylglycin
bei einem pH-Wert von 7,0, 40°C
für eine
Minute umzuwandeln), und ein rekombinanter künstlicher Mikroorganismenproduzent
produziert es zu ungefähr
0,1 bis ungefähr
20 Units/ml. Die Verhältnisse
der Hase und DCase-Aktivitäten in einer
Lösung
der Rohenzymzusammensetzung werden eingestellt, so dass die Reaktionen,
die die D-α-Aminosäure aus
5-substituiertem Hydantoin hervorbringt, am effizientesten voranschreiten
kann. Wie nachfolgend beschrieben, wird diese Reaktion bei einem
neutralen pH-Wert durchgeführt,
welcher nahezu der optimale pH-Wert für die DCase ist, und deswegen
sind die Bedingungen verschieden von denen, die eine maximale Wirkung
der Hase aufweisen. Ferner ist es gewünscht, dass beide enzymatischen Aktivitäten so eingestellt
werden, dass fast gleiche Aktivitäten bei dem Reaktions-pH-Wert
erreicht werden. Im Fall, dass die Reaktion beispielsweise bei einem
pH-Wert von 7,5 durchgeführt
wird, kann das gewünschte
zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat hergestellt werden, indem
die Immobilisierungsreaktion unter Verwendung einer Enzymlösung durchgeführt wird,
in der fast gleiche Mengen an Proteinen und enzymatische Aktivitäten vorhanden
sind, so dass die Hydantoinase ungefähr fünf Mal mehr ist als die DCase
in Units. Um solche Aktivitäten
nach der Immobilisierung zu bewahren, ist es gewünscht, dass das Verhältnis der
Enzymaktivitäten
(Hase zu DCase) in einer Lösung
der Rohenzymzusammensetzung in einem Verhältnis von 1 bis 10 : 1 sein
sollte. Deswegen werden die Aktivitäten der Rohenzymzusammensetzung
nach dem Zerstören
der mikrobiellen Zellen und vor der Absorbierung auf solche Niveaus
eingestellt.
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Um außerdem geeignete Mengen der
Enzyme auf dem Träger
zu absorbieren, wird bevorzugt die Konzentration der Decarbamylase
in der Lösung
der Rohenzymzusammensetzung auf 10 bis 300 Units/ml einzustellen.
Die absorbierte Aktivität
ist ungefähr
20 bis ungefähr
90% der hinzugegebenen Aktivität,
und zwischen beiden Enzymen können
keine wesentlichen Unterschiede erkannt werden.
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Der Träger wird nach der Aktivierung
seiner Austauschgruppe mit beispielsweise einer wässrigen
Natriumchloridlösung
und durch Equilibrieren, beispielsweise in einer Pufferlösung, verwendet.
Es ist bevorzugt, dass das Verhältnis
der Lösung
der Rohenzymzusammensetzung und des Trägers so eingestellt wird, dass die
Gesamtmenge des Proteins in der Rohenzymlösung fast die gleiche ist wie
die maximale Adsorptionskapazität
des Trägers.
Falls notwendig, kann 1 bis 10 mM eines Antioxidationsmittels und/oder
0,5 bis 20 mM Manganion vorhanden sein. Das Gemisch wird bei 4 bis
30°C, bevorzugt
bei 15°C,
gerührt
und der Träger
wird durch Filtrieren nachdem die Menge des absorbierten Enzyms
die gegebene Menge erreicht, eingesammelt (normalerweise 8 bis 48
Stunden, bevorzugt wird dieses in einer trägen Gasatmosphäre, wie
beispielsweise Stickstoff, durchgeführt). Dann wird der Träger gewaschen
und durch die Behandlung mit einem Vernetzungsmittel zum Stabilisieren
unlöslich
gemacht. Als Vernetzungsmittel kann ein bekanntes Mittel zu weniger
als 1%, bevorzugt 0,1 bis 0,2% Glutaraldehyd verwendet werden. Das
vernetzte immobilisierte Präparat
der Enzymzusammensetzung wird mit destilliertem Wasser und einer
Pufferlösung
(bevorzugt 0,1 bis 20 mM, normalerweise 1 bis 5 mM Antioxidationsmittel
wie oben beschrieben enthalten) gewaschen und in feuchtem Zustand in
einem versiegelten Gefäß bei niedriger
Temperatur (4°C)
gelagert. Im allgemeinen liegen die Aktivitäten des zusammengesetzten immobilisierten
Enzympräparats,
das so erhalten wird, bei 5 bis 80 Units/g Träger hinsichtlich der Decarbamylase.
Bei der Hydantoinase ist ihre Wirkung entsprechend den Adsorptionsbedingungen
1 bis 10 mal weniger als die der Decarbamylaseaktivität.
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Das Verfahren zum Herstellen von
D-α-Aminosäuren aus
5-substituierten Hydantoinen unter Verwendung des zusammengesetzten
immobilisierten Enzympräparats
der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend beschrieben.
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Die Reaktion wird durchgeführt, indem
das Substrat, 5-substitutiertes Hydantoin, mit dem zusammengesetzten
immobilisierten Enzympräparat,
falls notwendig in Gegenwart eines Antioxidationsmittels und/oder Manganionen,
umgesetzt wird. Normalerweise wird es bevorzugt, dass die Reaktion
in Gegenwart von 0,1 bis 20 mM eines Antioxidationsmittels und Manganionen
durchgeführt
wird. Die Reaktion verläuft
gemäß dem folgenden
Reaktionsschema:
wobei R eine Phenylgruppe,
Phenylgruppe, die mit einer Hydroxygruppe, Alkylgruppe, substituierten
Alkylgruppe, Aralkylgruppe oder Thienylgruppe substituiert ist,
darstellt.
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Die Konzentration des Substrats 5-substituiertes
Hydantoin, das verwendet werden soll, beträgt 0,1 bis 30% (W/V), bevorzugt
1 bis 5% (W/V). Es wird bevorzugt, dass die Menge des zusammengesetzten
immobilisierten Enzympräparats,
die verwendet werden soll, ungefähr
10 bis ungefähr
20 Units/g Substrat als Decarbamylaseaktivität ist. Die Reaktionstemperatur
variiert gemäß den besonderen
Enzymen, aber im allgemeinen beträgt sie 30 bis 60°C. Enzyme
mit Wärmeresistenz
können
bei viel höheren
Temperaturen verwendet werden.
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Der pH-Wert der Reaktion wird passend
aus einem Bereich von 6,5 bis 8,0 ausgewählt. Der pH-Wert ist für die DCase
fast optimal. Er ist jedoch beträchtlich
weit vom optimalen pH-Wert
für die
Hase entfernt, und die Hase-Aktivität sinkt mehrere Male unter
die Aktivität
bei optimalem pH-Wert. Dadurch sinkt auch die Racematisierungsrate.
Schließlich
wird die Herstellung von D-α-Aminosäure jedoch
durch das Enzym des letzten Schritts, die DCase bestimmt, so dass
es bevorzugt wird, die Menge des Enzyms und die Reaktionsbedingungen
basierend auf der DCase einzustellen (d. h. die optimalen Bedingungen
für die
DCase), und die Hase-Aktivität im Verhältnis zu
der DCase-Aktivität
zu kombinieren. Im allgemeinen wird das Verhältnis der Enzyme, die auf dem
Träger
absorbiert werden sollen, so eingestellt, so dass fast gleiche Aktivitäten exprimiert
werden können,
obwohl dies von den besonderen Reaktionsbedingungen abhängt. Die "fast gleichen Aktivitäten" bedeutet eine Situation,
wo das Verhältnis
der Hydantoinaseaktivität,
die bei pH-Wert 7,5 gemessen wird, dargestellt in "Units (pH 7,5"), und die Decarbamylaseaktivität wie oben
beschrieben bei ungefähr
0,5 bis 1,5 : 1 liegt. Die Reaktion wird unter Einstellen eines
Reaktions-pH-Werts zum so gewählten
pH-Bereich durchgeführt, normalerweise
auf pH 7,5. Durch diese Arbeitsschritte werden die ungünstigen
Bedingungen für
die Hase überwunden
und das Reaktionsgleichgewicht neigt sich in Richtung der Herstellung
von D-N-Carbamylaminosäure. Auf
diese Weise kann die Reaktion effizienter durchgeführt werden
als erwartet und die Umwandlung des Substrats, einem 5-substituierten
Hydantoin, kann verbessert werden. Wenn die Reaktion bei einem alkalischen pH-Bereich
nahe dem optimalen pH-Wert der Hydantoinase durchgeführt wird,
sinkt die Decarbamylaseaktivität
auf unter die Hälfte
der Aktivität
bei optimalem pH-Wert, obwohl die Herstellung von einer D-N-Carbamylaminosäure erfolgreich
voranschreiten kann. Zusätzlich
ist beobachtet worden, dass die Gesamtausbeute sinkt und dass die
Stabilität
der Decarbamylase selbst gesenkt wird, da die Reaktion stark durch
das Ammonium gehemmt wird, was während
der Reaktion hergestellt wird. Aus diesen Gründen kann die Reaktion unter
Verwendung des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats wirksam
durchgeführt
werden, wenn das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat mit
einem solchen Immobilisierungsverhältnis, dass die Decarbamylasereaktion
unter Bedingungen nahe den optimalen Reaktionsbedingungen und der
Substratkonzentration der Decarbamylase leicht ratenbestimmend ist.
Zusätzlich
ist es vorteilhaft, dass die Gesamtaktivität des zusammengesetzten immobilisierten
Enzympräparats
leicht kontrolliert werden kann, da die Produktivität der Hase
hoch ist und die DCase die irreversible Reaktion katalysiert.
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Die Reaktion wird normalerweise mittels
eines Säulenverfahrens
oder durch das Suspendieren des zusammengesetzten immobilisierten
Enzympräparats
in einem Reaktionsgefäß durchgeführt. Im
letzteren Fall wird für
gewöhnlich
eine Batch-Reaktion durchgeführt
und die Reaktionsdauer beträgt
ungefähr
6 bis ungefähr 48
h je Batch. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen zusammengesetzten immobilisierten
Enzympräparats
kann die entsprechende D-Aminosäure aus
einem 5-substituierten Hydantoin in einer hohen Ausbeute in einer
Einschrittreaktion hergestellt werden. Die folgenden Beispiele stellen
die vorliegende Erfindung weiter detailliert dar, aber sollen nicht
so verstanden werden, dass sie deren Umfang begrenzen.
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Beispiel 1
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Zuerst wurde Bacillus sp. KNK108
(FERM P-6056) zum Herstellen einer Hydantoinaseenzymlösung in
250 ml eines Saatkulturmediums inokuliert (Fleischextrakt 1%, Polypepton
1%, Hefeextrakt 0,5% (pH 7,0)) und bei 33°C für ungefähr 25 h kultiviert. Diese Saatkultur
wurde in 2,5 1 eines Kulturmediums inokuliert (Fleischextrakt 1%,
Polypepton 1%, Hefeextrakt 0,5%, Urazil 0,1%, MnCl2 20
ppm (pH 7,5)) und bei 33°C
für ungefähr 16 h
kultiviert. Die mikrobiellen Zellen wurden durch Zentrifugierung
gesammelt und in 50 ml 20 mM MnSO4 wässriger
Lösung
suspendiert. Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 8,5 wurden die
Zellen durch Beschallung aufgeschlossen und der Rest wurde entfernt,
um eine Rohenzymlösung
der Hydantoinase zu erhalten (107 Units/ml).
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Um zusätzlich eine Enzymlösung der
Decarbamylase herzustellen, wurde E. coli HB101pNT4553 (FERM BP-4368)
in 20 ml 2YT-Medium kultiviert (Bactopepton 1,6%, Bactohefeextrakt
1,0%, NaCl 0,5%), supplementiert mit 50 μg/ml Ampicillin bei 37°C für ungefähr 16 h.
Diese Kultur wurde in 1,4 l 2YT-Medium in einer Menge von 1% inokuliert
und bei 37°C
für ungefähr 28 h
kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren eingesammelt
und in 140 ml 5 mM Dithiothereitollösung suspendiert. Nach dem
Einstellen des pH-Werts auf 7,0 wurden die Zellen durch Beschallung
aufgeschlossen und der Rest wurde entfernt, um den Überstand
als Decarbamylaserohenzymlösung
zu erhalten (36 Units/ml).
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Beispiel 2
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Unter Verwendung der in Beispiel
1 erhaltenen Rohenzymlösungen
wurde eine Immobilisierung der Enzyme durchgeführt. Duolite A-568 (Rohm & Haas) als Immobilisierungsträger wurde
zuerst mit 1 M NaCl und Ionenausgetauschtem Wasser gewaschen und
in das ionenausgetauschte Wasser getan, und der pH-Wert wurde auf
7,5 eingestellt. Zu 8,4 g dieses Harzes wurden 20 ml der Hydantoinaserohenzymlösung hinzugegeben
und 11,5 ml der Decarbamylaserohenzymlösung, wobei der pH-Wert von
beiden auf 7,5 eingestellt worden ist, und das Gemisch wurde bei
15°C für ungefähr 20 h
in einer Stickstoffatmosphäre
gerührt. Nachdem
dieses Harz zweimal mit 0,5 nM MnSO4-Lösung gewaschen
wurde, wurde das Harz in fünfmal
dem Volumen des ionenausgetauschten Wassers suspendiert. Danach
wurde der pH-Wert
auf 7,5 eingestellt, die Suspension wurde für 35 min unter portionsweiser
Zugabe von 544 μl
2,5% Glutaraldehyd gerührt.
Diese Suspension wurde mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT und
1 mM MnSO4 über Nacht behandelt, und dann wurde
das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat durch Filtrieren eingesammelt
(Hydantoinaseaktivität
8,2 Units (pH 7,5) und Decarbamylaseaktivität 9,9 Units je 1 g Harz).
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Dann wurden als Kontrollen Harze,
auf denen die zwei Enzyme getrennt voneinander immobilisiert wurden,
hergestellt.
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Jeweils 20 ml der Hydantoinaserohenzymlösung und
60 ml der Decarbamylaserohenzymlösung
wurden mit jeweils 4,2 g und 22,0 g des oben genannten Immobilisierungsträgers gemischt
und die gleichen Arbeitsschritte wie oben beschrieben wurden durchgeführt, um
jeweils ein immobilisiertes Enzymharz zu erhalten, auf dem jedes
Enzym getrennt voneinander immobilisiert war (immobilisiertes Hydantoinase-Enzym:
24 Units/g Harz, 2,7 Units/g Harz (pH 7,5), und immobilisiertes
Decarbamylase-Enzym: 37 Units/g Harz).
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Beispiel 3
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Unter Verwendung des zusammengesetzten
immobilisierten Enzympräparats
und der immobilisierten Enzyme, die die entsprechenden einzelnen
Enzyme enthalten, die in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden Reaktionen
zum Herstellen der entsprechenden D-α-Aminosäure aus 5-substituiertem Hydantoin
durchgeführt.
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Nach der Zugabe von 1 g 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin
als Substrat zu 100 ml an 0,1 M KPB (pH 7,5), 1 mM MnSO4 und
5 mM DTT wurde ausreichend Stickstoffgas eingeschleust und die Reaktionsbedingungen wurden
auf 40°C
und pH 7,5 eingestellt. Um die gleichen enzymatischen Aktivitäten beider
Enzyme zu erhalten, wurden 0,97 g des zusammengesetzten immobilisierten
Enzympräparats
oder 3,0 g des immobilisierten Hydantoinaseenzyms und 0,26 g des
immobilisierten Decarbamylaseenzyms hinzugegeben. Die Reaktion wurde
unter Einleiten von Stickstoffgas und dem Kontrollieren des Reaktions-pH-Werts
auf 7,5 mit 2 N H2SO4 oder
6 N NaOH durchgeführt.
Die Reaktion wurde für
29 h unter periodischem Probenziehen durchgeführt. Die hergestellte Menge
an p-Hydroxyphenylglycin an jedem Probenentnahmepunkt wurde durch
Hochleistungsflüssigchromatographie
(Nippon Bunko, Finepack SIL C-18 column) bestimmt.
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Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt.
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Wie aus 1 ersichtlich wird, wurde gefunden, dass
die Reaktion effizienter durchgeführt werden kann, wenn zwei
Enzyme gleichzeitig auf dem gleichen Harz immobilisiert sind.
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Beispiel 4
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Die Stabilität der Enzymaktivitäten wurde
durch das wiederholte Durchführen
der Reaktion mit dem zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparat durchgeführt.
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Zwei Gramm 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin
wurden zu 100 ml 1 mM MnSO4 und 5 mM DTT
gegeben, und der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt. Zu dem Gemisch
wurden 8,9 g des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats,
das in Beispiel 2 erhalten wurde, hinzugegeben und die Reaktion
wurde bei 40°C
für 23
h unter Einleiten von Stickstoffgas und dem Kontrollieren des pH-Werts
auf 7,5 durchgeführt.
Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemisches durch Saugen, wurde ein
weiteres Gemisch in der gleichen Weise wie oben beschrieben zu dem
zusammengesetzten immobilisierten Enzym hinzugegeben und die Reaktion
wurde durchgeführt.
Dieser Arbeitsschritt wurde fünfmal
wiederholt und beide Enzymaktivitäten wurden an dem Ende jeder
Reaktion bestimmt.
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Die relativen Aktivitäten bezogen
auf die erste Reaktion werden in 2 gezeigt.
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Die Abnahme der Aktivitäten wurde
in diesen fünf
Reaktionen selten beobachtet.
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Beispiel 5
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Zum Herstellen einer Hydantoinaseenzymlösung wurde
E. coli HB101pTH104 (FERM BP-4864), enthaltend ein Hydantoingen
aus Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863), in 20 ml 2YT-Medium bei
37°C für ungefähr 16 h
kultiviert. Diese Kultur wurde in 1,2 l 2YT-Medium transferiert,
welches mit 50 μg/ml
Ampicillin und 400 ppm an MnCl2·4H2O supplementiert war und für 26 h bei
37°C kultiviert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und in 80 ml wässriger
1 mM MnSO4 Lösung suspendiert. Nach dem
Einstellen des pH-Werts auf 8,5 mit Ammoniumwasser wurden die Zellen
durch Beschallung aufgeschlossen und der Rest wurde durch Zentrifugieren
entfernt. Nach dem Einstellen des pH-Werts des Überstandes auf 8,5 wurde eine Wärmebehandlung
bei 60°C über 20 min
durchgeführt.
Die denaturierten Proteine wurden durch Zentrifugieren entfernt,
um eine Rohenzymlösung
der Hydantoinase zu erhalten (1.100 Units/ml).
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Unter Verwendung dieser Rohenzymlösung und
einer Rohenzymlösung
der Decarbamylase, die auf die gleiche Weise hergestellt wurde,
wie in Beispiel 1 beschrieben (240 Units/ml), wurde das zusammengesetzte
immobilisierte Enzympräparat
auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.
Unter Verwendung von 30 ml der Decarbamylaserohenzymlösung und
13 ml der Hydantoinaserohenzymlösung
wurden die Enzyme auf 29 g nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel
2 beschrieben, auf dem Harz immobilisiert (Decarbamylase: 45 Units
und Hydantoinase: 119 Units, 44 Units (pH 7,5) je 1 g Harz).
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Als Kontrollen wurden Harze, auf
denen zwei Enzyme getrennt immobilisiert waren, verwendet. Das immobilisierte
Decarbamylaseenzym (43 Units/g Harz) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben
hergestellt. Das immobilisierte Hydantoinaseenzym wurde entsprechend
dem Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, durch Mischen
von 21,8 g des Harzes zur Immobilisierung mit 60 ml der Rohenzymlösung hergestellt
(177 Units/g Harz, 51 Units/g (pH 7,5)).
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Beispiel 6
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Unter Verwendung von 5 g des zusammengesetzten
immobilisierten Enzympräparats,
das in Beispiel 5 erhalten wurde und als immobilisierte Enzyme,
die durch das Immobilisieren der entsprechenden Enzyme auf verschiedenen
Harzen hergestellt wurde, wurde ein Gemisch von 5,6 g des immobilisierten
Hydantoinaseenzyms und 5,2 g des immobilisierten Decarbamylaseenzyms,
das in Beispiel 5 erhalten wurde (die Decarbamylaseaktivität (pH 7,5)
war gleich der des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats und
die Hydantoinaseaktivität
(pH 8,7) war zweimal höher
als die des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats),
wurde die Reaktion mit 3% Substrat entsprechend dem Verfahren, das
in Beispiel 3 beschrieben wurde, durchgeführt.
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Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
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Wie in 3 gezeigt
wird, war die Reaktivität
des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats ähnlich der Reaktivität der getrennt
immobilisierten Enzyme, obwohl die Hydantoinaseaktivität der Hälfte des
getrennt immobilisierten Enzyms entsprach. So wurde herausgefunden,
dass die Reaktion mittels des zusammengesetzten immobilisierten
Enzympräparats
effizienter ist und dass die Menge des teuren Harzes zur Immobilisierung
stark reduziert werden kann.
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Beispiel 7
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Indem jeweils 5 g des zusammengesetzten
immobilisierten Enzyms, das in Beispiel 5 erhalten wurde, verwendet
wurden, wurde die Wirkung des pH-Werts der Reaktion untersucht.
Bei drei pH-Niveaus von 7,0, 7,25 und 7,5 wurden die Reaktionen
mit 3% Substrat durchgeführt.
Die Dauern, die benötigt
wurden, um 99% des Substrats umzuwandeln, wurden gemessen. Die Dauern
betrugen 5,5, 5,4 und 6,75 h. So wurde herausgefunden, dass pH 7,0
und 7,25 für
die Reaktion vorteilhaft sind.
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Wie oben beschrieben, ist es entsprechend
der vorliegenden Erfahrung unter Verwendung eines zusammengesetzten
immobilisierten Enzympräparats,
das durch das gleichzeitige Immobilisieren der Hydantoinase und
der Decarbamylase auf dem gleichen Harz bei der Herstellung der
entsprechenden D-α-Aminosäuren aus
5-substituierten Hydantoinen hergestellt werden, eine Einschrittreaktion
mit viel einfacheren Arbeitsschritten durchzuführen, als eine Zweischrittreaktion,
und effizienter als die Reaktion mit einem Gemisch der zwei immobilisierten
Enzyme, die durch das getrennte Immobilisieren dieser Enzyme auf
verschiedenen Harzen erhalten werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Graph, der die zeitlichen Verläufe der Reaktionen zur Herstellung
des entsprechenden D-p-Hydroxyphenylglycins aus 5-(p-Hydroxyphenyl)-hydantoin in Beispiel
3 unter Verwendung des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats der
vorliegenden Erfindung und des Gemisches, das durch das getrennte
Immobilisieren von Hydantoinase und Decarbamylase auf verschiedene
Harze hergestellt wurde, darstellt.
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2 ist
ein Graph, der die Stabilität
der Enzyme in wiederholten Reaktionen unter Verwendung des zusammengesetzten
immobilisierten Enzympräparats
an Beispiel 4 zeigt.
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3 ist
ein Graph, der den Vergleich der Aktivität des zusammengesetzten immobilisierten
Enzympräparats
und der Aktivität
des Gemischs der getrennt hergestellten immobilisierten Enzympräparate darstellt (die
Hydantoinaseaktivität
ist zweimal höher
als das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat) in Beispiel 6.