DE69530380T2

DE69530380T2 - Retropeptide, antikörper dagegen und deren verwendungen in der impfung und in vitro diagnostik

Info

Publication number: DE69530380T2
Application number: DE69530380T
Authority: DE
Inventors: Jean-Paul Briand; Gilles Guichard; Sylviane Muller; Marc Regenmortel
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1995-03-13
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2015-03-14
Also published as: EP0750508B1; US7122193B1; FR2717081B1; WO1995024916A1; FR2717081A1; US6455244B1; EP0750508A1; DE69530380D1; ATE237343T1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Retropeptide sowie gegen diese gerichtete Antikörper und deren Verwendung hauptsächlich auf dem Gebiet der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, vor allem von Vakzinen und für die Invitro-Diagnostik diverser Erkrankungen.
Die Entwicklung von Neuropeptiden, von Peptidhormonen und Antibiotika auf Peptidbasis oder von synthetischen Vakzinen auf Peptidbasis wird durch die hohe Sensibilität der Peptide gegenüber der Proteolyse, welche unter anderem die orale und parenterale Verabreichung einschränkt, stark behindert.
Viele Jahre hat man sich auf die Synthese analoger Peptide konzentriert, um die Peptide zu erforschen, die Peptide oder natürliche Proteine mimikrieren und eine in Bezug auf letztere gestiegene Aktivität und biologische Halbwertszeit aufweisen. Beispielhaft wurden analoge Peptide durch Ersetzen von L-Aminosäuren des natürlichen Peptids durch die entsprechenden D-Aminosäuren oder durch nichtnatürliche Reste (z. B. Sarkosin und b-Alanin) oder durch Modifikation von Peptidverbindungen des natürlichen Peptids (Chorev, M. & Goodman, M. (1993), Acc. Chem. Res. 26, 266-273; Marraud et al., (1993), Biopolymers, 33, 1135-1148) gewonnen.
Diese Modifikationen ergeben Pseudopeptide oder Peptide, die Peptide oder natürliche Proteine (man spricht auch von Peptidmimetika) mit einer metabolischen Stabilität, die höher ist als die der letztgenannten nachahmen, da der Großteil der natürlichen Proteasen die D-Aminosäuren und die Nicht- Peptidbindungen nicht spalten kann.
Das Hauptproblem, das sich bei derartigen Pseudopeptiden ergibt, ist die Konservierung ihrer biologischen Aktivität in Bezug auf jene des natürlichen Peptids oder des natürlichen Proteins, die sie offenbar mimikrieren.
Kürzlich wurde die D-Form der HIV-1 Protease synthetisiert (De L. Milton et al., (1992), Science, 256, 1445-1448). Wie erwartet zeigte das enantiomere Protein eine chirale reziproke Spezifität in der Weise, dass das Enzym nicht in der Lage war, das normale L-Substrat zu spalten, es jedoch sein D- Enantiomer hydrolisierte.
Im Gegensatz dazu haben Wen und Laursen (Wen, D. & Laursen, R. A., (1993), FEBS Lett., 317, 31-34) gezeigt, dass sich die D- und L-Form eines enteisenden α-helikalen Polypeptids gleich gut an das gleiche achirale Eissubstrat binden, wohingegen Wade et al. (Wade et al., (1990), Proc. Natl. Acad. I Sci., USA, 87, 4761-4765) herausgefunden haben, dass die L- und D-Enantiomere mehrerer Kanäle bildender Antibiotika auch beide aktiv waren.
Die modifizierten Peptide könnten sich als potenzielle synthetische Vakzine eignen, wenn sie die Bildung von Antikörpern, die die nichtmodifizierten antigenen Strukturen des entsprechenden Pathogens erkennen und dessen infektiöse Eigenschaft neutralisieren, induzieren könnten.
Auf jeden Fall weiß man wenig über die Immunreaktion gegen analoge Peptide, insbesondere gegen D-Peptide und Peptide, die modifizierte Verbindungen enthalten, wenn man dies mit den beachtlichen Arbeiten vergleicht, die bis zum heutigen Tage auf dem Gebiet der Erzeugung von Antikörpern gegen natürliche Proteine oder gegen synthetische Peptide, die aus letzteren hervorgegangen sind, und der Erforschung der Kreuzreaktionen zwischen derartigen Antikörpern und diesen Proteinen oder natürlichen Peptiden geleistet wurde.
Mehrere Autoren haben behauptet, dass die Pseudopeptide wahrscheinlich eine sehr geringe oder gar keine Antigenität besitzen, da sie nicht transformiert und den Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert werden können, um von den T-Helferzellen oder von den zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt zu werden. So haben Dintzis et al. (8) kürzlich beschrieben, dass das L-Enantiomer des Rubrexodins durch die Bildung von Immunglobulin mit dem Isotyp G (IgG) eine starke Immunreaktion induziert, wohingegen das entsprechende Protein, das aus Aminosäuren ausschließlich der D- Konfiguration, keine Immunreaktion induziert.
Die vorliegende Erfindung verfolgt das Ziel, pharmazeutische Zusammensetzungen und insbesondere Vakzine zu liefern, die analoge Peptide umfassen, welche eine Halbwertszeit aufweisen, die deutlich über derjenigen von natürlichen Proteinen oder jener von Synthesepeptiden, die aus solchen natürlichen Proteinen hervorgegangen sind oder nicht (diese natürlichen Proteine oder Peptide, die teilweise aus letzteren hervorgegangen sind, werden im Folgenden auch als "Proteine oder verwandte Peptide" bezeichnet), deren Analoge sie sind, indem sie eine biologische und insbesondere eine immunologische Aktivität aufweisen, die vergleichbar oder sogar höher ist als jene oben genannter Ausgangsproteine oder -peptide ist, liegt.
Die vorliegende Erfindung verfolgt zudem das Ziel, In-vitro- Diagnostikmethoden für Krankheiten zu liefern, die mit dem Vorhandensein von endogenen oder exogenen Proteinen im Organismus einer Person verbunden sind, wobei diese Methoden mit Hilfe von analogen Peptiden wie oben definiert realisiert werden und den Vorteil aufweisen, dass sie effektiver sind als die derzeitigen Diagnostikmethoden, welche mit Hilfe von Ausgangspeptiden oder -proteinen realisiert werden. Die vorliegende Erfindung verfolgt demzufolge vor allem das Ziel, neue Kits zu liefern, um solche Diagnostikmethoden anzuwenden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht hauptsächlich in der Verwendung von Verbindungen vom Peptidtyp (die auch als analoge Peptide, Pseudopeptide oder Peptidmimetika bezeichnet werden),
von denen wenigstens eine der -CO-NH-Bindungen und vorteilhafterweise alle -CO-NH--Bindungen der Peptidkette des entsprechenden Ausgangspeptids (welches keine -NH- CO-Bindung in seiner Peptidkette enthält)
durch eine (mehrere) -NH-CO-Bindung(en) ersetzt wird (werden), wobei die Chiralität jedes Aminoacylrestes, welcher entweder in eine oder mehrere der vorher erwähnten -NH-CO-Bindungen eingeschlossen ist oder nicht, im Vergleich zu den entsprechenden Aminoacylresten, die das Ausgangspeptid bilden, umgekehrt ist, wobei diese Verbindungen vom Peptidtyp auch als "retro-inverse" Peptide bezeichnet werden; wobei diese retro-inversen Peptide von Ausgangspeptiden abgeleitet werden, welche der folgenden Formel (I) entsprechen:
X-AA1-(AA2----AAn-1)i-AAn-Y (I)
in der:
-AA1 eine Aminoacylgruppe darstellt, welche desaminiert werden kann und deren Aminfunktionalität am α-Atom, falls sie vorhanden ist, durch eine Gruppe X geschützt werden kann, wobei X P-, R- oder RCO- darstellt,
-i = 0 oder 1 ist,
-falls i = 0 ist, n 2 darstellt, und falls i = 1 ist, n eine ganze Zahl zwischen 3 und 1000, bevorzugt zwischen 5 und 100, darstellt, wenn n = 3 ist, entspricht das entsprechende retro-inverse Peptid der Formel AA1-AA2-AA3,
-AAn einen Aminoacylrest darstellt, die decarboxyliert werden kann und deren Säurefunktionalität am α-Atom, falls sie vorhanden ist, eventuell durch eine Gruppierung Y geschützt wird, wobei Y vom Estertyp ist: -OR oder Amid, -NH&sub2; oder -NRR', wobei
die Gruppen R, R' Wasserstoffatome; Alkylradikale mit 1 bis 25 Kohlenstoffatomen, Radikale mit einer Allylgruppe mit 3 bis 25 Kohlenstoffatomen oder Radikale mit einer Arylgruppe mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen sein können, und insbesondere -CH&sub3; (Methyl), -CH&sub2;CH&sub3; (Ethyl), -CH(CH&sub3;)&sub2; (Isopropyl), - C(CH&sub3;)&sub3; (tertiäres Butyl), -Φ (Phenyl), - CH&sub2;Φ (Benzyl), -CH&sub2;-CH&sub2;Φ (2-Phenylethyl), -CH&sub2;CHCH&sub2; (Allyl), Methylfluorenyl, -CH&sub2;CONH&sub2; (Glykolamid), -CH&sub2;ONΦ&sub2; (Benzylhydroglykolamid), wobei diese Liste nicht einschränkend ist, wobei
die Gruppe P vom Urethantyp ist (Boc (tertiäres Butyloxycarbonyl), Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl), Z (Benzyloxycarbonyl), CH&sub2;CHCH&sub2;OCO- (Alloxycarbonyl) oder andere),
und in diesen Ausgangspeptiden der Formel (I) wenigstens eine der Bindungen zwischen zwei Aminoacylresten der Formel (I) eine -NH-CO-Bindung ist, und gegebenenfalls wenigstens einer der Aminoacylreste AA1 bis AAn eine zu dem entsprechenden Aminoacylrest im Ausgangspeptid entgegengesetzte Chiralität hat, und insbesondere die retro-inversen Peptide der folgenden Formel (II) entsprechen:
A-CH (Ri)-NH-[CO-CH(Rk)-NH]j-i-CO-CH(Rj+i)-B (II)
in der:
- Ri, Rk, Rj+1 die Seitenketten der an einer oder mehreren - NH-CO--Bindungen beteiligten Reste darstellen,
-die Gesamtanzahl der Reste der Sequenz auf n festgesetzt ist, wobei n eine ganze Zahl größer als 1 und bevorzugt 3 bis 1000 und bevorzugt 3 bis 100 ist,
- 1 ≤ i, j, k die folgendermaßen definierten Parameter sind:
1 i < j ≤ n,
wobei k = 0 ist, falls i = j ist und k die Werte i+1 bei j annimmt, wobei sie
vier Möglichkeiten der Konfiguration bezüglich der Art der Blöcke A und B aufweisen können:
1/i = 1 und j+1 = n:
A = H-, H&sub2; N-, P-HN-, RR'N-, H&sub2;NC&sub0;-, RR'NCO-, RCO-
B = H-, -COOH, -COOR, -CONH&sub2;, -CONRR', -NHCOR.
2/i = 1 und j+1 + n:
A = H-, H&sub2; N-, P-HN-, RR'N-, H&sub2;NC0-, RR'NCO-, RCO-
B = -CO-NH-CH (Rj+2) -CO-... -NH-CH (Rn) -CO-Y
mit Y = -OH, -OR, -NH&sub2;, -NRR'.
3/i ≠ 1 und j+1 = n:
A = X-HN-CH (R1) -CO-...-NH-CH (Ri-1) CO-NH-
mit X = H-, P-, R-, RCO-
B = H-, -COOH, -COOR, -CONH&sub2;, -CONRR', -NHCOR.
4/i ≠ 1 und j+1 + n:
A = X-HN-CH (R1) -CO-... -NH-CH (Ri-1) CO-NH-
mit X = H-, P-, R-, RCO-
B = -CO-NH-CH (Rj+2) -CO-... -NH-CH (Rn) -CO-Y
mit Y = -OH, -OR, NH&sub2;, -NRR', wobei
die Gruppen R, R' Wasserstoffatome, Alkylradikale mit 1 bis 25 Kohlenstoffatomen, Radikale mit einer Allylgruppe mit 3 bis 25 Kohlenstoffatomen oder Radikale mit einer Arylgruppe mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen sein können, und insbesondere -CH&sub3; (Methyl), -CH&sub2;CH&sub3; (Ethyl), - CH(CH&sub3;)&sub2; (Isopropyl), -C(CH&sub3;)&sub3; (tert. Butyl), Φ (Phenyl), -CH&sub2; (Benzyl), -CH&sub2;-CH&sub2; (2-Phenylethyl), -CH&sub2;CHCH&sub2; (Allyl), Methylfluorenyl, -CH&sub2;CONH&sub2; (Glykolamid), -CH&sub2;CONΦ&sub2; (Benzylhydroglykolamid), wobei diese Liste nicht einschränkend ist, wobei
die Gruppe P vom Urethantyp ist (Boc (tertiäres Butyloxycarbonyl), Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl), Z (Benzyloxycarbonyl), CH&sub2;CHCH&sub2;OCO- (Alloxycarbonyl) oder andere),
wobei die Chiralität jedes Aminoacylrestes, gleichgültig ob er in eine oder mehrere -NH-CO--Bindungen eingeschlossen ist oder nicht, bezüglich der entsprechenden Aminoacylgruppen, die das Ausgangspeptid bildenden, belassen oder umgekehrt ist, oder
* von gegen die oben erwähnten retro-inversen Peptide gerichteten Antikörpern (anti-retro-inverse Antikörper),
wobei die retro-inversen Peptide mit den oben erwähnten anti-retro-inversen Antikörpern sowie mit den gegen die Ausgangspeptide oder -proteine gerichteten Antikörpern (bezeichnet als Anti-Ausgangs-Antikörper) einen Komplex bilden können
für die Herstellung:
- eines Medikaments für die Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen viralen oder bakteriellen Ursprungs oder von Autoimmunkrankheiten oder neurodegenerativen Erkrankungen oder
- eines Medikaments für die Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen mit Beteiligung der Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes und/oder der T-Zell- Rezeptoren,
oder für die in-vitro-Anwendung eines diagnostischen Verfahrens für die vorher erwähnten Krankheiten.
Wie wir vorher bereits gesehen haben, sind unter dem oben erwähnten Begriff "Ausgangspeptid"
- entweder ein Peptid im natürlichen Zustand, vor allem in einem Mikroorganismus oder einem höheren Organismus (vor allem im menschlichen Organismus),
- oder alle durch Peptidsynthese gewonnenen Peptide, die von immunologischem Interesse sind,
- oder ein Peptid, das aus einem in den oben erwähnten Organismen im natürlichen Zustand existierenden Protein vor allem durch Fragmentierung des Proteins (vor allem mit Hilfe der geeigneten Proteasen, anschließendem Reinigen des in Frage stehenden Peptids) oder durch Peptidsynthese (gemäß den klassischerweise in diesem Bereich angewandten Methoden) hervorgegangen ist,
- oder ein Peptid, das aus einem im natürlichen Zustand existierenden Protein hervorgegangen ist, dessen immunologische Aktivität jedoch durch Ersetzen bestimmter Aminosäuren der natürlichen Sequenz modifiziert, konserviert oder optimiert worden ist, beispielsweise als Folge des Siebens einer Bibliothek mit analogen Peptiden, die durch Peptidsynthese gewonnen wurden.
Selbstverständlich müssen die -CO-NH- und -NH-CO- Bindungen im Bereich davor und danach berücksichtigt werden in Richtung der Ausgangspeptidkette, die vom aminoterminalen Ende (N- Terminus) in Richtung des carboxyterminalen Endes (C- Terminus) verläuft.
Die in der Erfindung verwendeten retro-inversen Peptide können linear, zyklisch oder verzweigt sein.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten retro- inversen Peptide sind Verbindungen, die aus einer Peptidkette gebildet werden, in der mindestens einer der Reste, der gegebenenfalls eine Chiralität besitzt, die derjenigen des ihm in der Peptidkette des Ausgangspeptids entsprechenden Aminoacylrestes entgegengesetzt ist mit mindestens einem seiner Nachbarreste durch eine -NH-CO-Bindung verbunden ist, wobei die Peptidkette gegebenenfalls ein oder mehrere Aminoacyl(e) enthält, das/die einer Chiralität besitzt/besitzen, die derjenigen des ihm in der Peptidkette des Ausgangspeptids entsprechenden Aminoacylrests entgegengesetzt ist, wobei die amino- und carboxyterminalen Enden entweder unabhängig voneinander in den N- und C-terminalen Enden des entsprechenden Ausgangspeptids identisch sein oder sich in diesen beiden Enden unterscheiden können.
Unter Rest versteht man eine Gruppe mit der Formel -X-CH(R)-Y-, in der X und Y identisch sind oder sich voneinander unterscheiden und aus -NH- oder CO- ausgewählt werden. Mit Rest bezeichnet man entweder einen Aminoacylrest oder ein Aminoacylderivat, in dem die terminalen Enden nicht diejenigen eines Aminoacylrestes sind.
In den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptiden können sich die NR-CO-Bindungen, die die -CO-NH- Bindungen des entsprechenden Ausgangspeptids ersetzen, an einer beliebigen Stelle des Peptids befinden und entweder eine -CO-NH-Bindung, die an der Schnittstelle Proteasen entspricht, oder eine -CO-NH-Bindung, die einer solchen Schnittstelle nicht entspricht, ersetzen.
Die -NR-CO-Bindungen, die die -CO-NH-Bindungen ersetzen, sind vorteilhafterweise jene, die mit dem Peptidrezeptor (Antikörper, MHC, T-Rezeptor) interagieren.
Falls i = 1 und j+1 = n, sind alle Bindungen -NH-CO-Bindungen.
Falls i = 1 und j+1≠n, sind alle -NH-CO-Bindungen N-terminal.
Falls i≠1 und j+1≠n, sind alle -NH-CO-Bindungen C-terminal
da i ≠1 und j+1 ≠ n, sind alle -NH-CO-Bindungen weder N- terminal noch C-terminal.
Die Anzahl der -NH-CO-Bindungen ist gleich j-i+1.
Vorteilhafterweise ist die Anzahl der -NH-CO-Bindungen mindestens gleich 2.
Unter retro-inversen Peptiden muss man alle Peptide und peptidischen Entsprechungen verstehen, auf die die oben stehender Definition zutreffen und die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei das Peptid speziell aus einer Peptidkette gebildet wird, in der mindestens einer der Reste einerseits mit mindestens einem Nachbarrest durch eine -NH-CO- Bindung verbunden ist und andererseits, wenn es sich um einen Aminoacylrest handelt, dieser eine Chiralität besitzt, die derjenigen desselben Aminoacylrestes in der Peptidkette des Ausgangspeptids entgegengesetzt ist.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten retro- inversen Peptide sind in speziellerer Weise die, welche oben definiert worden sind und die der oben erwähnten Formel (II) entsprechen, in der mindestens einer der Reste mit mindestens einem seiner Nachbarreste durch eine -NH-CO-Bindung verbunden ist und wenn es sich um einen Aminoacylrest handelt, dieser eine Chiralität besitzt, die derjenigen des entsprechenden Aminoacylrests im Ausgangspeptid entgegengesetzt ist.
Diese oben erwähnten retro-inversen Peptide sind:
* entweder teilweise retro-inverse Peptide, d. h.:
a) entweder teilweise retro-, vollständig inverse Peptide, d. h. Peptide, bei denen nur eine oder mehrere, aber nicht alle Bindungen zwischen den Resten (eine) -NH-CO- Bindung(en) ist (sind) und bei denen die Gesamtheit der Aminoacylreste, die mit mindestens einem Nachbarrest durch eine -NH-CO-Bindung verbunden ist, eine Chiralität besitzt, die derjenigen des entsprechenden Aminoacylrestes im Ausgangspeptid entgegengesetzt ist,
b) oder teilweise retro-, teilweise inverse Peptide, d. h. Peptide, in denen nur eine oder mehrere, aber nicht die Gesamtheit der Bindungen zwischen den Resten (eine) -NH-CO- Bindung(en) ist (sind) und von denen mindestens ein, aber nicht alle Aminoacylrest(e) mit mindestens einem Nachbarrest durch eine -NH-CO-Bindung verbunden ist (sind) und der/die eine Chiralität besitzt/besitzen, die derjenigen des entsprechenden Aminoacylrestes im Ausgangspeptid entgegengesetzt ist,
diese beiden teilweise retro-inversen Peptidtypen, die durch die Formel (II) dargestellt werden und in speziellerer Weise durch die sich darauf beziehenden Fig. 2, 3, 4, beschrieben werden,
* entweder vollständig retro-, teilweise inverse Peptide, d. h. Peptide, bei denen die Gesamtheit der Bindungen zwischen den Resten (eine) -NH-CO-Bindung(en) ist (sind) und bei denen mindestens einer, aber nicht die Gesamtheit der Aminoacylreste mit mindestens einem Nachbarrest durch eine -NH-CO- Bindung verbunden ist und die eine Chiralität besitzen, die derjenigen des entsprechenden Aminoacylrestes im Ausgangspeptid entgegengesetzt ist,
* oder vollständig retro-inverse Peptide, d. h. Peptide, bei denen die Gesamtheit der Bindungen zwischen den Resten -NH-CO-Bindungen sind und bei denen die Gesamtheit der Aminoacylreste der Peptidkette dieser retro-inversen Peptide eine Chiralität besitzen, die derjenigen der entsprechenden Aminoacylreste im Ausgangspeptid entgegengesetzt sind.
Diese beiden letzten retro-inversen Peptidtypen werden durch die Formel (II) dargestellt und werden durch die sich darauf beziehende Fig. 1 näher beschrieben.
Vorteilhafterweise sind die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten retro-inversen Peptide vollständig retro- invers.
Eine andere im Rahmen der Erfindung verwendete vorteilhafte Klasse retro-inverser Peptide besitzt mindestens zwei aufeinanderfolgende "retro-inverse" Bindungen.
Die Krankheiten, die man mit Hilfe der pharmazeutischen Zusammensetzungen auf Basis der retro-inversen Peptide im Rahmen der vorliegenden Erfindung diagnostizieren oder behandeln könnte, sind hauptsächlich Erkrankungen mit viralem oder bakteriellem Ursprung oder Autoimmunerkrankungen beziehungsweise neurodegenerative Erkrankungen.
Zu den Erkrankungen mit viralem Ursprung, die man im Rahmen der vorliegenden Erfindung diagnostizieren oder behandeln könnte, gehören:
- AIDS, ausgelöst durch das Virus der humanen Immunschwäche HIV-1 und HIV-2,
- die mit HTVL-1 verbundene Paraplegie oder die adulte T- Zell-Leukämie, ausgelöst durch das Virus der humanen T- Zell-Lymphome (Virus: HTLV),
- die durch das respiratorische Synzytial-Virus ausgelösten Infektionen,
- die durch das Coxsackie-Virus ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die akute lymphozytäre Meningitis,
- die durch das Epstein-Barr-Virus ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die infektiöse Mononukleose,
- die durch das Zytomegalie-Virus ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die Einschlusskörperchen-Krankheit,
- der Herpes, ausgelöst durch das humane Herpes-Virus,
- der Herpes, ausgelöst durch das humane Herpes simplex- Virus 6,
- die durch das humane Parvovirus B19 ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die gastro-enteralen Infektionen,
- die durch das Hepatitis B-Virus ausgelöste Hepatitis B,
- die durch das Hepatitis C-Virus ausgelöste Hepatitis C,
- die durch das Influenza-Virus ausgelöste Grippe,
- die durch das Rötel-Virus ausgelösten Röteln,
- die durch das Dengue-Virus ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die Arbovirosen,
- durch die Rhinoviren ausgelöste Erkältung, Rhinitis und Schnupfen,
- die durch das Maul- und Klauenseuche-Virus ausgelöste Maul- und Klauenseuche.
Zu den Hauptautoimmunerkrankungen, die man im Rahmen der vorliegenden Erfindung behandeln kann, zählen die in der folgenden Tabelle A angegebenen Erkrankungen.

Tabelle A

Die Hauptautoimmunerkrankungen (von oben nach unten, von speziellen Autoimmunerkrankungen der Organe bis hin zu nicht speziellen Autoimmunerkrankungen der Organe).
Erkrankung Target-Autoantigene
Hashimoto-Thyroiditis Thyroglobulin, Mikrosomen
Bäsedow-Krankheit TSH-Rezeptor
Addison-Krankheit Cortex
Hypophyseninsuffizienz Hypophyse
Biermer-Gastritis Abwehrzellen des Magens
bestimmte Sterilitäten Spermium, Ovarium
juveniler Diabetes vom Typ 1 Langerhanssche Inseln, Insulin
Goodpasture-Syndrom glomeruläre Basalmembran
Myasthenie quergestreifter Muskel, Acetylcholin-Rezeptor
akuter Gelenkrheumatismus Herzmuskel (Streptokokken)
Pemphigus epidermale Interzellularbrücken
bullöses Pemphigoid kutane Basalmembran
Dermatitis herpetiformis Gliadine, Retikulin
Vitiligo Melanozyten
Pelade Haarfollikel
Psoriasis Opthalmia sympathica Uvea
Uveitis vordere Augenkammer
Guillain-Barré-Syndrom Multiple Sklerose Myelin
hämolytische Anämie Erythrozyten
idiopathische thrombozytopenische Purpura (Blut-) Plättchen
idiopathische Leukopenie Granulozyten
primäre biliäre Zirrhose Mitochondrien
aktive chronische Hepatitis glatter Muskel, Kerne
hämorrhagische Rektocolitis Crohn-Krankheit Colon (E. coli)
Gougerot-Sjögren-Syndrom Zellkerne: SS-A, SS-B
rheumatoide Polyarthritis IgG, Zellkerne
Dermatomyositis-Polymyositis-Komplex Zellkerne: Jol, Muskeln
Sklerodermie Zellkerne: Scl-70
Sharp-Syndrom Zellkerne: RNP
diskoider Lupus erythematodes Zellkerne:
systemischer Lupus erythematodes Zellkerne: ADN, Antigen Sm Koagulationsfaktoren Cardiolipin, etc. ...
Gegenstand der Erfindung sind ebenso die gegen die retro- inversen Peptide gerichteten Antikörper gemäß der Erfindung, auch als Antikörper-retro-inverse Antipeptide bezeichnet.
Die anti-retro-inversen Antikörper gemäß der Erfindung sind polyklonale oder monoklonale Antikörper.
Die oben erwähnten polyklonalen Antikörper werden durch Immunisierung eines Tieres mit wenigstens einem retro-inversen Peptid gemäß der Erfindung erhalten, gefolgt von der Rückgewinnung von ausgesuchten Antikörpern in gereinigter Form durch Serumentnahme des Tieres und Separierung der Antikörper der anderen Serumbestandteile, vor allem durch Affinitätschromatographie auf einer Säule, auf der ein speziell von den Antikörpern erkanntes Antigen befestigt ist, vor allem ein retro-inverses Peptid gemäß der Erfindung.
Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung können durch die Hybridomtechnik gewonnen werden, deren allgemeines Prinzip nachfolgend erläutert wird:
Zunächst immunisiert man ein Tier, im Allgemeinen eine Maus, (oder Zellkulturen im Rahmen der In-vitro-Immunisierung) mit einem retro-inversen Peptid gemäß der Erfindung, dessen B- Lymphozyten nun in der Lage sind, Antikörper gegen das retro- inverse Peptid zu bilden und/oder gegen dieses Protein und/oder gegen das Ausgangspeptid. Diese Antikörper produzierenden Lymphozyten werden dann mit den "unsterblichen" Myelomzellen (im Beispiel Murine) fusioniert, um Hybridome zu erhalten. Mit dieser so gewonnenen heterogenen Zellmischung führt man sodann eine Selektion von Zellen durch, die in der Lage sind, einen speziellen Antikörper zu produzieren und sich unbegrenzt zu vermehren. Jedes Hybridom vermehrt sich in Form eines Klons, wobei jedes zur Produktion eines monoklonalen Antikörpers führt, dessen Erkennungseigenschaften gegenüber dem retro-inversen Peptid der Erfindung zum Beispiel in ELISA durch Immuntransfer in einer oder zwei Größen, in der Immunfluoreszenz oder mit Hilfe eines Biosensors getestet werden können. Die auf diese Weise ausgewählten monoklonalen Antikörper werden anschließend vor allem gemäß der unten beschriebenen Affinitätschromatographietechnik gereinigt.
Die Antikörper gemäß der Erfindung sind speziell dadurch gekennzeichnet, dass sie mit retro-inversen Peptiden einen Komplex bilden können und/oder mit Peptiden oder Ausgangsproteinen, die letzteren entsprechen.
In dieser Hinsicht zielt die Erfindung in noch speziellerer Weise auf Antikörper ab, die oben definiert wurden und die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie retro-inverse Peptide und/oder die entsprechenden Ausgangspeptide oder -proteine, insbesondere die Ausgangspeptide oder -proteine der L- Konfiguration erkennen.
Die Antikörper gemäß der Erfindung sind in noch speziellerer Weise dadurch gekennzeichnet, dass sie Schutz-Antikörper sind, das heißt Antikörper, die, wenn sie einer Person, die Träger eines endogenen Proteins oder exogenen Pathogens ist, verabreicht werden, oder wenn deren Bildung durch Verabreichung eines retro-inversen Peptids, das gemäß der Erfindung von solchen Antikörpern erkannt werden kann, induziert wird, in der Lage sind, sich mit dem endogenen oder exogenen Protein unter der Bedingung, dass der mit diesem Protein verbundene pathogene Charakter auf diese Weise neutralisiert wird, zu verbinden.
Die retro-inversen Antipeptid-Antikörper der Erfindung erkennen das Ausgangspeptid oder das Ausgangsprotein mit einer Affinität, die mindestens der Affinität der Ausgangs- Antipeptid-Antikörper oder Ausgangs-Antiprotein gegenüber dem Ausgangspeptid oder Ausgangsprotein entspricht.
Die Antipeptid-Antikörper oder Ausgangs-Antiproteine erkennen die im Rahmen der Erfindung verwendeten retro-inversen Peptide mit einer Affinität, die mindestens der Affinität derselben oben erwähnten Antikörper gegenüber den Ausgangspeptiden oder -proteinen, die den oben genannten retro-inversen Peptiden entsprechen, gleicht. Die oben in Frage stehende Affinität kann durch die Affinitäts-Gleichgewichtskonstante Ka der Komplexe, die einen der oben genannten Antikörper mit einem der oben genannten Antigen einschließen, gemessen werden.
Die Erfindung betrifft ebenso die Anti-Idiotypen, die mit den Antikörpern gemäß der Erfindung einen Komplex bilden können, wobei diese Anti-Idiotypen durch Immunisierung eines Tieres mit den Antikörpern wie oben definiert gemäß der Erfindung erhalten werden.
Die Erfindung hat ebenso in noch speziellerer Weise die Antigen-Antikörper-Komplexe zum Gegenstand, die gemäß der Erfindung zwischen den retro-inversen Peptiden oder ihrem Ausgangspeptid oder Ausgangsprotein und den Antikörpern wie oben definiert gebildet werden.
In dieser Hinsicht zielt die Erfindung in speziellerer Weise auf die folgenden Komplexe ab:
- Ausgangsprotein Antikörper, gerichtet gegen ein retro-inverses Peptid, das einem vom Ausgangsprotein abgeleiteten Ausgangspeptid entspricht
- Ausgangspeptid Antikörper, gerichtet gegen ein retro-inverses Peptid, das einem Ausgangspeptid entspricht
- retro-inverses Peptid, das einem Ausgangspeptid entspricht Antikörper, gerichtet gegen das Ausgangspeptid oder das Ausgangsprotein
- retro-inverses Peptid, das einem Ausgangspeptid entspricht Antikörper, gerichtet gegen ein retro-inverses Peptid, das einem Ausgangspeptid entspricht
Mit Ausgangspeptid, das aus dem Ausgangsprotein hervorgegangen ist, bezeichnet man eine Sequenz des Ausgangsproteins.
Es muss darauf hingewiesen werden, dass die Gesamtheit der oben definierten Komplexe eine Stabilität aufweist, die mindestens jener Stabilität dieser Komplexe entspricht, in denen es bei Eintreffen eines retro-inversen Peptids durch ein Ausgangspeptid oder Ausgangsprotein ersetzt wird und es bei Eintreffen eines retro-inversen Antipeptid-Antikörpers durch einen Ausgangs-Antipeptid-Antikörper oder Ausgangs-Antiprotein ersetzt wird.
Spezieller gesagt sind die Ausgangspeptid/anti-retro-inverse Peptid Ausgangsprotein-Antikörper mindestens genauso stabil wie die Ausgangspeptid/-protein-Antikörper, die gegen das Peptid oder Ausgangsprotein gerichtet sind.
Es muss ebenfalls angemerkt werden, dass die retro-inversen- Antikörper-Peptidkomplexe, die gegen das Ausgangspeptid oder Ausgangsprotein gerichtet sind, mindestens genauso stabil sind wie entsprechenden Komplexe, in denen die retro-inversen Peptide durch das Ausgangspeptid oder Ausgangsprotein ersetzt wurden.
Vorteilhafterweise sind Antigen-Antikörperkomplexe, in denen das Antigen ein retro-inverses Peptid ist und/oder der Antikörper gegen ein retro-inverses Peptid gerichtet ist, das eine konstante höhere Affinität besitzt als der Ausgangs- Antigen-Komplex (das heißt Ausgangspeptid oder Ausgangsprotein)-Antikörper gegenüber den Ausgangsantigenen (das heißt Antikörper gerichtet gegen das Ausgangspeptid oder Ausgangsprotein gerichtet) Gegenstand der Erfindung.
Gemäß einem vorteilhaften Realisationsmodus betrifft die Erfindung die Antigen-Antikörper-Komplexe, in denen das Antigen ein retro-inverses und der Antikörper gegen das Ausgangspeptid oder Ausgangsprotein gerichtet ist (entsprechend dem oben genannten Retro-Invers), das eine höhere konstante Affinität besitzt als der Antigen-Antikörper-Komplex, in dem das Antigen das Ausgangspeptid oder das Ausgangsprotein ist und der Antikörper gegen das Ausgangspeptid oder das Ausgangsprotein gerichtet ist.
Um die Gedanken festzuhalten, kann die Größenordnung, nach der die "Affinitätskonstante höher ist", von ungefähr 5 bis ungefähr 1000 variieren, insbesondere ungefähr 7 bis ungefähr 1000, vorteilhafterweise ungefähr 10 bis 1000 und insbesondere ungefähr 10 bis ungefähr 100.
Die Erfindung betrifft auch Komplexe zwischen einem Retro- Invers wie oben definiert und einem Molekül des Haupthistokompatibilitätskomplexes (auch als MHC-retro-invers-Komplex bezeichnet).
Tatsächlich setzt die Immunreaktion das Erkennen eines endogenen oder exogenen Antigens durch spezialisierte Zellen ein. Um erkannt zu werden, muss das Antigen durch die Antigenpräsentierenden Zellen (APC) anfangs in adäquater Weise dargestellt werden. Während die B-Lymphozyten die von den nichtmodifizierten intakten Antigenen transportierten Epitope erkennen, wird das Antigen den T-Lymphozyten in viel komplexerer Weise präsentiert, in dem Maße, in dem das Antigen zunächst durch die präsentierende Zelle internalisiert, proteolysiert und unter Umständen an seiner Oberfläche in Form von Peptidfragmenten in Verbindung mit den Proteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) reexprimiert wird. Der T-Lymphozyt, der das native Antigen nicht erkennt, erkennt ein Peptidfragment, das mit einem MHC-Molekül verbunden ist.
Diese MHC-Moleküle gehören zwei Klassen an: I und II.
Die Moleküle der Klasse I sind Transmembran-Glykoproteine, die aus einer schweren polymorphen α-Kette bestehen, welche in nichtkovalenter Weise mit einer leichten, nichtglykolisierten β2 m-Kette verbunden ist. Ihre kristallographische Struktur ist aufgelöst worden (Bjorkman et al. (1987), Nature, 329: 506-512) und zeigt das Vorhandensein einer Spur, die den Präsentationsort des Peptids darstellt, dessen Basis aus acht β-Faltblättern und dessen Ränder aus zwei α-Helixen bestehen. Diese Moleküle werden an der Oberfläche der Quasi- Totalität der Zellen präsentiert.
Die Moleküle der Klasse II sind ebenfalls Membran- Glykoproteine, die aus zwei polymorphen Ketten α und β bestehen, die in nichtkovalenter Weise miteinander verbunden sind, um, wie die kürzlich geklärte kristallographische Struktur dies zeigt (Brown et al. (1993), Nature, 364: 33-39), ein β- Faltblatt, das zwei α-Helixe trägt, zu bilden. Die gebildete Spur stellt den Präsentationsort des Peptids dar. Diese Moleküle werden nur an der Oberfläche bestimmter Zellen präsentiert, zu denen die Makrophagen und B-Zellen gehören.
Die zytotoxischen T-Lymphozyten (Zellen, die CD-8-Marker besitzen) erkennen die proteolytischen Fragmente viraler Proteine, die mit den MHC-Molekülen der Klasse I verbunden sind und bewirken die Lyse der Zellen, dis das Antigen präsentieren.
Die Helfer-T-Lymphozyten (Zellen, die CD-4-Marker tragen) erkennen die Fragmente der durch die Endozytose eingefangenen exogenen Proteine, die in Verbindung mit den MHC-Molekülen der Klasse II präsentiert werden und induzieren die Zellstimulation der Immunantwort.
Die Erfindung hat ebenfalls die Komplexe zwischen einem retro-inversen Peptid gemäß der Erfindung und einem T- Zellrezeptor zum Gegenstand.
Die Erfindung zielt auch auf Komplexe zwischen einem Molekül des Haupthistokompatibilitätskomplexes, einem retro-inversen Peptid wie oben definiert und einem T-Zellrezeptor (auch als MHC-retro-inverser Peptid-T-Rezeptor-Komplex bezeichnet) ab.
Die Erfindung hat ebenso die Verwendung von retro-inversen Peptiden wie oben definiert für die Umsetzung von in-vitro- Diagnostikmethoden für Krankheiten wie oben erwähnt, die mit der Anwesenheit eines oder mehrerer exogenen (exogener) oder endogenen (endogener) Proteins (Proteine), die (das) einerseits direkt oder indirekt am Prozess des Auftretens und/oder der Entwicklung dieser Krankheiten beteiligt sein kann (können) und andererseits sowohl durch die retro-inversen anti- Peptid-Antikörper gemäß der Erfindung als auch durch die retro-inversen Peptide gemäß der Erfindung, zum Beispiel im Falle der Detektion von Antikörpern beim Patienten, erkannt werden können, zum Gegenstand.
In dieser Hinsicht hat die Erfindung jede in-vitro- Diagnostikmethode zum Gegenstand, die oben definiert wurde und Folgendes umfasst:
- das In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe eines Patienten, welcher Träger von gegen die endogenen oder exogenen Proteine gerichteten Antikörpern sein kann, mit einem retro-inversen Peptid gemäß der Erfindung unter Bedingungen, welche die Reaktion zwischen den gegen die Proteine gerichteten Antikörpern, welche in der biologischen Probe enthalten sein können, und dem oben erwähnten retro-inversen Peptid ermöglichen;
- den in-vitro-Nachweis des Antigen-Antikörper-Komplexes wie oben definiert gemäß der Erfindung, welcher im vorhergehenden Schritt gebildet werden kann, oder
- den in-vitro-Nachweis von im Patienten zirkulierenden Antikörpern durch einen Kompetitionstest unter Verwendung eines anti-retro-inversen Antikörpers.
Vorteilhafterweise ist das bei dem oben erwähnten in-vitro- Diagnostikverfahren verwendete Peptid ein retro-inverses Peptid, das den endogenen oder exogenen Proteinen vollständig oder teilweise entspricht oder einem Peptid entspricht, das durch Antikörper erkannt werden kann, die ihrerseits exogene oder endogene Proteine erkennen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf jedes in-vitro- Diagnostikverfahren, wie es oben definiert wurde und Folgendes umfasst:
- das In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe eines Patienten, der Träger der genannten endogenen oder exogenen Proteine sein kann, mit wenigstens einem der oben definierten Antikörper, die gegen ein retro-inverses Peptid gerichtet sind, gemäß der Erfindung unter Bedingungen, welche die Reaktion zwischen den Proteinen, die in der biologischen Probe enthalten sein können, und den vorher erwähnten gegen das oben erwähnten retro-inverse Peptid gerichteten Antikörpern erlauben;
- den in-vitro-Nachweis des Antigen-Antikörper-Komplexes wie oben definiert, welcher im vorhergehenden Schritt gebildet werden kann oder
- den Nachweis von im Patienten zirkulierenden Antigenen in Kompetitionstests unter Verwendung eines der oben erwähnten retro-inversen Peptide.
Vorteilhafterweise sind die gegen das retro-inverse Peptid gerichteten und in dem oben erwähnten in-vitro- Diagnostikverfahren verwendeten Antikörper jene oben erwähnte, gemäß der Erfindung gegen ein retro-inverses Peptid, das vollständig oder teilweise den endogenen oder exogenen Proteinen entspricht, gerichtete Antikörper.
Gemäß einem anderen Durchführungsmodus des oben erwähnten invitro-Diagnostikverfahrens handelt es sich bei den gegen das retro-inverse Peptid gerichteten Antikörpern um die oben definierten und gemäß der Erfindung gegen ein Retropeptid, das den endogenen oder exogenen Proteinen vollständig oder teilweise entspricht, gerichteten Antikörper.
Die oben erwähnten Diagnostikverfahren der Erfindung werden vorteilhafterweise wie folgt durchgeführt:
- Inkubation der biologischen Probe, die Antigene (Protein oder exogenes oder endogenes Peptid) oder gegen diese Antigene gerichtete Antikörper enthalten kann, wobei diese Antigene oder Antikörper mit einer Krankheit oder einer Familie vorbestimmter Krankheiten verbunden sind, vor allem mit den oben beschriebenen Krankheiten mit jeweils anti-retro-inversen Antikörpern gemäß der Erfindung, die die Antigene erkennen oder mit retro-inversen Peptiden gemäß der Erfindung, die durch die gegen diese Antigene gerichteten Antikörper erkannt werden können, wobei die Antigene oder gegen letztere gerichteten Antikörper auf einem soliden Träger fixiert sind, insbesondere im Inneren der Vertiefungen in der Mikrotiterplatte des Typs, der gewöhnlicherweise für die Umsetzung von Nachweis- oder Dosierungstechniken verwendet wird, sehr bekannt unter dem Namen ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay),
- Spülen des soliden Trägers,
- Inkubation der auf dem soliden Träger verbliebenen, fixierten Elemente nach dem vorhergehenden Reinigungsschritt:
- entweder mit einem Antikörper enthaltenden Milieu, insbesondere anti-retro-inverse Antikörper gemäß der Erfindung, die (hauptsächlich radioaktiv, enzymatisch oder fluoreszent) markiert sind oder ihrerseits von einem markierten Reagenz erkannt werden können, wobei die markierten Antikörper die in der biologischen Probe enthaltenen Antigene erkennen können, die nach dem vorhergehenden Reinigungsschritt mit den anti-retro-inversen Antikörpern, die gemäß der Erfindung zu Beginn auf dem soliden Träger fixiert wurden, verbunden geblieben sind,
- oder mit einem Milieu, das Antigene enthält, insbesondere retro-inverse Peptide gemäß der Erfindung, die (vor allem radioaktiv, enzymatisch oder fluoreszent) markiert sind oder ihrerseits durch ein markiertes Reagenz erkannt werden können, wobei die markierten Antigene die in der biologischen Probe enthaltenen Antikörper erkennen können, die nach dem vorhergehenden Reinigungsschritt mit den retro-inversen Peptiden, die gemäß der Erfindung zu Beginn auf dem soliden Träger fixiert wurden, verbunden bleiben,
- Spülen des soliden Trägers,
- Nachweis von markierten Antigenen oder Antikörpern, die jeweils mit den Antikörpern oder Antigenen der biologischen Probe bei dem vorhergehenden Inkubationsschritt verbunden geblieben sind.
Vorteilhafterweise werden die in-vitro-Diagnostikverfahren der Erfindung mit Hilfe von vollständig retro-inversen Peptiden oder auch mit gegen diese vollständig retro-inversen Peptiden gerichteten Antikörpern durchgeführt.
Die Erfindung hat auch die erforderlichen Vorrichtungen oder Bausätze für die Umsetzung der oben beschriebenen in-vitro- Diagnostikverfahren, die Folgendes umfassen, zum Gegenstand:
- ein retro-inverses Peptid gemäß der Erfindung, ausgewählt zwischen einem retro-inversen Peptid, das den endogenen oder exogenen Proteinen vollständig oder teilweise entspricht, oder einem Peptid, das von Antikörpern erkannt werden kann, die ihrerseits die exogenen oder endogenen Proteine erkennen oder
- anti-retro-inverse Antikörper gemäß der Erfindung, die gegen dieses retro-inverse Peptid gerichtet sind;
- Reagenzien, um ein geeignetes Milieu für die Bildung einer Immunreaktion zu schaffen;
- Reagenzien, die es erlauben, den Antigen-Antikörper- Komplex nachzuweisen, der zur Liste der oben definierten Verbindungen gehört und bei der Immunreaktion gebildet worden ist, wobei die Reagenzien eventuell einen Marker enthalten oder ihrerseits von einem markierten Reagenz erkannt werden können, insbesondere in dem Fall, in dem das retro-inverse Peptid oder die oben erwähnten antiretro-inversen Antikörper nicht markiert sind.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung mindestens eines retro-inversen Peptids wie oben definiert für die Herstellung eines Medikaments, das zur Vorbeugung oder zur Behandlung von Krankheiten, die mit der Anwesenheit eines oder mehrerer exogener oder endogener Proteine im Organismus einer Person zusammenhängen, das (die) direkt oder indirekt am Prozess des Auftretens und/oder der Entwicklung dieser Krankheiten beteiligt sein kann (können).
Die oben erwähnten Krankheiten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind in erster Linie entweder Erkrankungen mit viralem, bakteriellem oder parasitärem Ursprung, wenn sie mit dem Mikroorganismus selbst, einem von einem viralen, bakteriellen oder parasitären Partikel stammenden Protein oder exogenen Peptid verbunden sind, oder Autoimmunerkrankungen, wenn sie mit der Anwesenheit von Proteinen oder endogenen Peptiden, die die normale physiologische Funktionsweise eines Organismus stören, wenn diese letzteren eine direkte Rolle von Antikörpern spielen oder die Bildung von Antikörpern induzieren, die die speziellen Orte des Organismus erkennen und verändern (zum Beispiel, indem sie Antikörper-Antigen-Komplex-Depots bilden, Entzündungszustände hervorrufen, usw.) zusammenhängen.
Bei den oben erwähnten Erkrankungen kann es sich auch um neurodegenerative Erkrankungen handeln, wenn sie mit der Anwesenheit von exogenen Proteinen in einem Organismus verbunden sind, was zu neurologischen Läsionen führt.
Die retro-inversen Peptide, die für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen oder bei den bereits behandelten und im Folgenden nochmals betrachteten Vakzinen verwendet werden, sind vorteilhafterweise vollständig retro-inverse Peptide.
Die Erfindung zielt in speziellerer Weise auf die Verwendung mindestens eines retro-inversen Peptids wie oben definiert für die Herstellung eines Vakzins im Rahmen der Vorbeugung von Krankheiten ab, die mit der Anwesenheit eines oder mehrerer exogener oder endogener Proteine im Organismus einer Person, die von den gegen die retro-inversen Peptiden oder gegen die Anti-Idiotypen gemäß der Erfindung gerichteten Antikörpern erkannt werden können, zusammenhängen.
Die Erfindung betrifft auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere die Vakzine, die mindestens einen Anti- Idiotypen wie oben definiert in Verbindung mit einem physiologisch akzeptablen Träger umfassen.
Vorteilhafterweise werden die in den oben erwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendeten Anti-Idiotypen mit Hilfe von vollständig retro-inversen Peptiden erhalten.
Die Erfindung zielt auch auf jede pharmazeutische Zusammensetzung ab, die mindestens ein retro-inverses Peptid wie oben definiert oder mindestens einen oben erwähnten Anti-Idiotypen umfasst, verbunden oder nicht verbunden mit einem proteinartigen Trägermolekül, das die in-vivo-Produktion von Antikörpern induzieren kann, in dem es die für die Krankheit verantwortlichen exogenen oder endogenen Proteine neutralisiert oder eine zelluläre zytotoxische Immunantwort wie oben beschrieben in vivo induzieren kann.
Zur Veranschaulichung im Bereich der Impfung hat die Erfindung in speziellerer Weise die beiden vollständig retro- teilweise inversen Peptide der folgenden Formel zum Gegenstand:
HO-m(R,S)Leu-DGln-DArg-DAla-DVal-DArg-DX1-DAla-DLeu-DSer-Gly- DX2-DAsp-Gly-DArg-DVal-Gly-DSer-Gly-[Cys-NH&sub2;]
X1 = Ser oder Phe
X2 = Leu oder Pro
entsprechen den Peptiden [A] und [USA], die aus dem Hauptantigen-Determinans, der sich auf dem Protein VP1 des Virus der Maul- und Klauenseuche befindet, hervorgegangen sind und den folgenden Formeln entsprechen:
[A] [H-Cys]-Gly-Ser-Gly-Val-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Ser-Als- Leu-Arg-Val-Ala-Arg-Gln-Leu-OH
[USA] [H-Cys]-Gly-Ser-Gly-Val-Arg-Gly-Asp-Phe-Gly-Ser-Ala- Pro-Arg-Val-Ala-Arg-Gln-Leu-OH
Die Erfindung hat in speziellerer Weise das zyklische vollständig retro-teilweise inverse Peptid mit der folgenden Formel zum Gegenstand:
X = α,β-Diamino-propionat-D-Säure
entsprechend den Resten 139-147 des Ortes A des Hämaglutinins des Grippevirus (Influenza vom Stamm X31) und der folgenden Formel entsprechend:
Die Erfindung hat auch jede pharmazeutische Zusammensetzung zum Gegenstand, die anti-retro-inverse Antikörper gemäß der Erfindung in Verbindung oder nicht in Verbindung mit einem physiologisch akzeptablen Träger umfasst.
Diese letzte Kategorie von pharmazeutischen Zusammensetzungen ist insbesondere für die Behandlung von Krankheiten in Verbindung mit der Anwesenheit von exogenen oder endogenen Proteinen im menschlichen Organismus gedacht, wobei die genannten Proteinen durch die anti-retro-inversen Antikörper gemäß der Erfindung erkannt werden können, wobei letztere als Schutzantikörper wirken, die die exogenen oder endogenen Proteine neutralisieren.
Die Erfindung hat ebenso die retro-inversen Peptide, die oben definiert wurden und die zytotoxischen oder T-Helfer-Epitopen oder auch von den MHC-Molekülen des Typs I oder II erkannten Peptiden entsprechen, die entweder in der Herstellung von synthetischen Vakzinen oder in der Vorbeugung oder Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet werden können, zum Gegenstand.
Da es sich um ihre Verwendung in der Eigenschaft als Vakzine handelt, hat die Erfindung in noch speziellerer Weise die retro-inversen bzw. teilweise retro-inversen Peptide eines zytotoxischen T-Epitops (Minimalepitop 56-68: M56-68) der Matrize des Grippevirus und eines T-Helfer-Epitops (Ausgangssequenz 830-844: TT830-844) des Tetanus-Toxins, dessen Sequenzen nachstehend dargestellt sind, zum Gegenstand:
1/ Sequenz des M56-68:
H-Gly-Ile-Leu-Gly-Phe-Val-Phe-Thr-Leu-OH
Sequenz des Retro-Analogs:
HO-m(R,S)Leu(Δ)-The(Δ)Phe-(Δ)Val-(Δ)Phe-(Δ)Phe-Gly-(Δ)Leuglle-Gly-H
2/ Sequenz des TT830-844:
H-Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu- Leu-OH
Sequenz des Retro-Analogs:
HO-m(R,S)Leu-(Δ)Thr-Gly-(Δ)Ile-(Δ)-Phe(Δ)Lys-(Δ)Ser-(Δ)Asn- (Δ)Ala-(Δ)Lys-(Δ)Ile-gTyr-Gln-H
Das retro-inverse Analog des M56-68 interagiert mit den MHC I Molekülen und wird den zytotoxischen T-Lymphozyten präsentiert, um eine zytotoxische Antwort zu induzieren. Das retro- inverse Analog des TT830-844 interagiert mit den MHC II- Molekülen und wird den T-Helfer-Lymphozyten präsentiert, um die Ausbreitung von T-Zellen anzuregen.
Da es sich um die Verwendung von retro-inversen Peptiden im Rahmen der Herstellung von für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen vorgesehenen Medikamenten handelt, sollte man daran erinnern, dass die Pathogenese zahlreicher Autoimmunerkrankungen die Präsentation von Autoantigenen (die mit MHC- Molekülen verbunden sind) gegenüber dem Rezeptor für die autoreaktiven T-Zellen, die aus dem Toleranzprozess an sich in der einen oder anderen Weise herausgefallen sind, mit sich bringt. Zudem könnte die Entwicklung neuer Strategien für die Modulation der Antwort der autoreaktiven T-Zellen zu therapeutischen Ansätzen führen, die bestimmte Autoimmunerkrankungen zu behandeln vermögen.
Bestimmte Autoimmunerkrankungen sind mit speziellen MHC I oder II Allelen verbunden. So ist die Verwendung von Blockerpeptiden, die in der Lage sind, mit einem gegebenen MHC- Molekül zu interagieren (zum Beispiel ein MHC-Molekül der Klasse II verbunden mit einer bestimmten Autoimmunerkrankung), die jedoch nicht die pathogene T-Zellantwort aktivieren können, vielversprechend. Indes macht der schnelle Abbau der untersuchten Peptide in den biologischen Milieus deren Verwendung schwierig. In diesem Fall wären die retro-inversen Peptide auf Grund ihrer Stabilität sehr vorteilhaft.
Das Phänomen des TCR-Antagonismus durch analoge Peptide bei T-Epitopen wurde kürzlich gezeigt und die Verwendung von speziellen TCR-Antagonisten wurde beschrieben (De Magistris, M. T., Alexander, J., Coggeshall, M., Altmon, A., Gaeta F. C. A., Grey, H. M. and Sette, A. (1992), Cell 68: 625). Diese Peptide sind in der Lage, die von einem Antigen induzierte Verbreitung von T-Zellen zu unterbinden. Solche antagonistischen Peptide werden durch Substitution einer Aminosäure unter den Resten des in Kontakt mit der T-Zelle stehenden Antigen-Peptids oder auch durch den Einbau der in Kontakt mit dem TCR in einer Polyalaninsequenz stehenden Reste erhalten. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist exakt die Verwendung retro-inverser Peptide, die antagonistischen TCR-Peptiden entsprechen, für die Gewinnung von Medikamenten für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, so wie es oben beschrieben wurde.
Die retro-inversen Peptide können wie nachfolgend beschrieben hergestellt werden:
Zur Veranschaulichung sind die allgemeinen Syntheseverfahren für vollständig oder teilweise retro-inverse Peptide mit oder ohne Modifikation der N- und C-terminalen Enden in Bezug auf die Enden der Ausgangspeptide nachfolgend angegeben:
Das Peptidsyntheseverfahren für Peptide, deren Gesamtheit der -CO-NH-Bindungen durch -NH-CO-Bindungen ersetzt wird, wird anders als bei den Ausgangspeptiden ohne Modifikation der Enden durchgeführt, indem man zwischen ihnen die verschiedenen Aminoacylreste, die das Ausgangspeptid bilden, in umgekehrten Sinne des für das Ausgangspeptid angegebenen Sinnes miteinander verbindet. Wenn das Ausgangspeptid durch eine Sequenz vom TYP
H-AA1-AA2-...-AAn-1AAn-OH dargestellt wird,
hat das entsprechende Retro-Analog, das nach den klassischen Peptidsyntheseverfahren an flüssiger oder fester Phase synthetisiert wird, die folgende Formel:
H-AAn-AAn-1......-AA2-AA1-OH
Zur Veranschaulichung besteht das Syntheseverfahren in der flüssigen Phase darin, die Aminosäuren sukzessive jeweils paarweise in der erforderlichen Reihenfolge zu kondensieren oder die Aminosäuren und die vorher gebildeten und bereits mehrere Aminoacyle in der geeigneten Reihenfolge enthaltenden Fragmente oder auch mehrere Fragmente zu kondensieren, die vorher so hergestellt wurden, vorausgesetzt, man bemüht sich von vornherein, alle reaktiven Funktionen zu schützen, die von diesen Aminoacylen oder Fragmenten getragen werden, mit Ausnahme der Aminfunktionen des einen und Carboxylfunktionen des anderen oder umgekehrt, die normalerweise in die Bildung der Peptidbindungen eingreifen müssen, insbesondere nach Aktivierung der Carboxylfunktion gemäß den allseits bekannten Methoden in der Peptidsynthese.
Man kann beispielsweise Schutzgruppen vom Urethan-Typ verwenden (Boc, Fmoc Benzyloxycarbonyl oder Allyloxycarbonyl), um die N-terminalen Enden der Aminsäuren zu schützen und die Gruppen vom Ester-Typ (Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, Tertio- Butyl-, Allyl- oder auch Benzhydrilglykolamidid-), um die Cteminalen Enden der Aminsäuren zu schützen.
Eine solche Synthese kann durchgeführt werden, indem man zunächst den Aminoacylrest AA1 kondensiert, dessen COOH&supmin; Funktion mit dem Aminoacylrest AA2 geschützt ist, dessen NH&sub2;- Funktion geschützt ist. Der Schutz der Aminfunktion des AA2- Restes im so erhaltenen AA1-AA2 Fragment ist somit aufgehoben, um in der Folge das Fragment mit dem Aminoacylrest AA3, dessen Aminfunktion geschützt ist, zu kondensieren. Die vorhergehenden Schritte werden so lange wiederholt, bis alle Aminoacylreste, die in die Kette der zu synthetisierenden Retro-Analoge einzuführen sind, eingeführt wurden.
Gemäß einer anderen von der Erfindung bevorzugten Technik greift man auf jene durch R. D. Merrifield in dem mit "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149- 2154) betitelten Artikel beschriebene Technik zurück.
Um eine Peptidkette nach dem Merrifield-Verfahren zu erzeugen, greift man auf ein sehr poröses Polymerharz zurück, auf dem man die erste C-terminale Aminosäure der Kette (in der Form AA1-OH) fixiert. Diese Aminosäure wird mittels ihre Carboxylgruppe auf dem Harz fixiert, und ihre Aminfunktion ist geschützt, zum Beispiel durch die T-Butyloxycarbonyl-Gruppe.
Wenn die erste C-terminale Aminsäure auf diese Weise auf dem Harz fixiert worden ist, entfernt man die Schutzgruppe der Aminfunktion, indem man das Harz mit einer Säure wäscht.
Man fixiert auf diese Weise nacheinander die Aminosäuren, die die Peptidketten bilden werden, auf der Amingruppe, die zunächst jedes Mal ungeschützt ist von dem Teil der bereits gebildeten Peptidkette und die mit dem Harz verbunden ist.
Wenn die Gesamtheit der gewünschten Peptidkette gebildet worden ist, beseitigt man die Schutzgruppen der verschiedenen die Peptidkette bildenden Aminosäuren, und man trennt das Peptid vom Harz ab, zum Beispiel mit Hilfe von Fluorwasserstoffsäure.
Der Erhalt von zyklischen Retropeptiden wird vorteilhafterweise gemäß A. Kates et al., Tetrabedron Lett., 34, 4709, (1993) durchgeführt.
Wenn die Gesamtheit der AA1 bis AAn Reste eine entgegengesetzte Chiralität besitzt wie dieselben Reste im Ausgangspeptid, so gilt umgekehrt, dass das erhaltene Retro-Analog ein retro-inverses Peptid sein wird.
Wenn ein oder mehrere, jedoch nicht die Gesamtheit dieser Reste, eine entgegengesetzte Chiralität aufweist wie dieselben Reste im Ausgangspeptid, so wird das erhaltene Retro- Analog ein vollständig retro-teilweise inverses Peptid sein.
Der Erhalt von teilweise retro-inversen Peptiden, aber auch von vollständig retro-inversen Peptiden mit Modifikation der Enden wird vorteilhafterweise mit Hilfe der klassischen Technik durchgeführt, bei der die gem-diaminoalkyl-Reste und die C-2-Derivate, die durch Malonsäure ersetzt wurden, verwendet werden, was vor allem im Artikel von Pallai und Goodman (Pallai, P. V., und Goodman, M., (1982), J. Chem. Soc. Chem. Commun., 280-281) beziehungsweise im Kapitel von Cope et al. ((1957), Org. React., 9, 107) beschrieben wird.
In dieser letzten Referenz wird die Herstellung von C-2- Derivaten, die durch Malonsäure ersetzt wurden, durch Alkylierung eines Diesters der Malonsäure durchgeführt.
Das C-2-Monoester, das durch die Malonsäure ersetzt wurde, kann auch durch Alkoholyse der Meldrumsäurederivate erhalten werden (Junek et al., (1976), Synthesis, 333-334; Chorev et al., (1983); J. Med. Chem. 26, 129-135), wobei diese Derivate ihrerseits durch reduktive Alkylierung der Meldrumsäure gemäß dem von Hrubowchak, D. M., und Smith, F. X. (1983), Tetrahedron Lett., (24), 4951-4954) beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Bei der von Pallai und Goodman beschriebenen Synthese der gem-Diaminoalkyl-Derivate werden die optisch reinen gem- Diaminoalkylmono-N-Säure-Reste beginnend mit den N- geschützten Amidpeptiden oder Carbonsäureamid- Aminoacylderivaten durch eine Hoffmann-Neuanordnung erhalten, indem man ein mittleres Oxydationsmittel als Reagenz verwendet: Idobenzen Bis(Trifluoracetat), genannt IBTFA oder TIB. Im Übrigen ist diese Methode in der festen Phase gemäß der von Pessi et al. (1983), J. Chem. Commun., 195-197 beschriebenen Technik zu verwenden.
Zur Veranschaulichung: der Erhalt eines Retropeptids mit der Formel:
...-NH-CH(R1)-CO-NH-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-NH-CO-CH(R4)-CO-NH- CH(R5)-CO-NH-CH(R6)-CO-...
kann durch Kondensation des Aminsäurederivates P-HN-CH(R2)- COOH, wobei P eine Schutzgruppe des Urethantyps darstellt, mit dem Carbonsäureamidderivat H&sub2; N-CH(R3)-CO-NH&sub2; durchgeführt werden, gefolgt von einer Behandlung des durch IBTFA erhaltenen Dipeptid-Amids, was zum Erhalt einer gem-Diaminoalkylmono-N-Säure der Formel P-HN-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-NH&sub2;führt, sowie anschließender Kondensation dieses Derivats mit einem durch Malonsäure substituierten C&sub2;-Monoester der Formel HOOC- CH(R4)-COOR, wobei -R eine Schutzgruppe wie -CH&sub3;, -CH&sub2;CH&sub3;, - C(CH&sub3;)&sub3; oder -benzyl darstellt, was zum Erhalt eines Fragments mit der Formel:
P-HN-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-NH-CO-CH(R4)-COOR
führt, gefolgt von der selektiven Aufhebung des Schutzes der R-Gruppe und Kondensation des Fragments, dessen C-terminale Säurefunktion auf diese Weise mit einem Fragment der Formel H&sub2; N-CH(R5)-CO-NH-CH(R6)-CO..., schutzlos wird, das durch Kondensation eines Aminsäurederivats P'-NH-CH(R5)-COOH erhalten wird, wobei P' einen Schutz vom Urethantyp und ein Fragment der Formel H&sub2; N-CH(R6)-CO..., dessen C-Terminus geschützt ist und ein selektives Aufheben des Schutzes von P' darstellt, was zur Gewinnung eines Fragments mit der Formel:
P-HN-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-NH-CO-CH(R4)-CO-NH-CH(R5)-CO-NH- CH(R6)-CO-...
führt, gefolgt von einem selektiven Aufheben des Schutzes der P-Schutzgruppe und der Kondensation des Fragments, dessen N- terminale Aminfunktion auf diese Weise schutzlos wird, mit einem Fragment oder einem Aminsäurederivat der Formel...-NH- CH(R1)-COOH, dessen N-Terminus geschützt ist, was zum Erhalt des gewünschten Derivats der Formel:
...-NH-CH(R1)-CO-NH-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-NH-CO-CH(R4)-CO-NH- CH(R5)-CO-NH-CH(R6)-CO-...
führt, welches einen gem-Diaminoalkylrest enthält, der R3 trägt, sowie ein Derivat der Malonsäure, das R4 trägt.
Wenn man mehrere aufeinanderfolgende -NH-CO-Bindungen innerhalb eines teilweise retro-inversen Peptids erhalten möchte, so genügt es, gemäß den klassischen Techniken in der Peptidsynthese einen oder mehrere Aminoacylreste, die die gleiche oder entgegengesetzte Chiralität besitzen wie dieser Aminosäurerest im Ausgangspeptid, zwischen einem gem-Diaminoalkyl und einem Derivat der Malonsäure wie unten beschrieben einzubauen.
Als Beispiel dient das Fragment mit der Formel:
P-HN-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-NH&sub2;, dessen Erhalt durch Behandlung des Dipeptidamids mit IBTFA kürzlich beschrieben wurde und das mit einem Aminosäurederivat der Formel P'-HN-CH(R4)-COOH kondensiert werden kann, was zum Erhalt eines Fragments mit der Formel P-HN-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-NH-CO-CH(R4)-NH-P' führt, das nach selektivem Aufheben des Schutzes der P'-Schutzgruppe mit einem C&sub2;-Monoester, das durch Malonsäure der Formel HOOC- CH(R5)-COOR substituiert wurde, kondensiert werden kann, wobei -R eine Schutzgruppe wie -CH&sub3;, -CH&sub2;CH&sub3;, -C (CH&sub3;)&sub3;, -CH&sub2;- CH=CH&sub2; oder -benzyl darstellt, was zu einem Fragment mit der Formel
P-HN-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)-NH-CO-CH(R4)-NH-CO-CH(R5)-COOR
führt, das nach selektivem Aufheben des Schutzes der R- Schutzgruppe und Kondensation des Fragments, dessen Cterminale Säurefunktion somit mit einem Fragment der Formel
H&sub2;N-CH(R6)-CO-... geschützt ist, führt,
was wiederum zu einem Fragment mit der Formel: P-HN-CH(R2)- CO-NH-CH(R3)-NH-CO-CH(R4)-NH-CO-CH(R5)-CO-NH-CH(R6)-CO-..., führt, das nach selektivem Aufheben des Schutzes der P- Schutzgruppe mit dem Fragment ...-NH-CH(R1)-COOH, dessen N- Terminus geschützt ist, kondensiert werden kann, was zum Derivat mit der Formel ...-NH-CH(R1)-CO-HN-CH(R2)-CO-NH-CH(R3)- NH-CO-CH(R4)-NH-CO-CH(R5)-CO-NH-CH(R6)-CO-... führt.
Wie vorher wird der Erhalt von teilweise retro-inversen Peptiden durch das oben beschriebene Verfahren durch die Wahl der Chiralität der Aminoacylreste konditioniert, die durch eine Bindung vom Typ -NH-CO- mit mindestens einem ihrer Nachbarn im gewonnen Analog verbunden sein werden.
Aufgabe der Erfindung sind zudem Verfahren zum Erhalt von retro-inversen, vollständig retro-inversen oder vollständig retro-teilweise inversen Peptiden wie oben beschrieben, deren N- und C-terminale Enden modifiziert sind, um zudem die Enden des Ausgangspeptids zu mimikrieren.
Wie wir in den vorhergehenden Synthesebeispielen gesehen haben, wird in der Tat ausgehend vom durch die Formel:
H&sub2; N-CH(R1)CO-NH-CH(R2)-CO...NH-CH(Rn-1)-CO-NH-CH(Rn)-COOH,
dargestellten Ausgangspeptid das nach Inversion der Gesamtheit der -CO-NH-Bindungen erhaltene Retropeptid durch die Formel
A-CH(R1)NH-CO-CH(R2)-NH...-CO-CH(Rn-1)-NH-CO-CH(Rn)-B dargestellt, in der A und B jeweils HOOC- und -NH&sub2; oder jede andere ursprünglich in N- oder C- terminaler Position des Ausgangspeptids befindliche Gruppe darstellen, wenn das Analog ohne Modifikation seiner Enden aufgebaut wird.
Es ist hingegen möglich, die N- und C-terminalen Gruppen des Retro-Analogs in der Weise zu modifizieren, dass man die N- und C-terminalen Enden des Ausgangspeptids mimikriert.
Es ist insbesondere möglich, Retro-Analoge mit der unten angegebenen Formel zu erhalten, in der A H-, H&sub2; N-, P-HN-, RR'N- , H&sub2;NCO-, RR'NCO-, RCO- und B -H, -COOH, COOR, -CONH&sub2;, - CONRR', -NHCOR, R, R' und P darstellen, die wie in Bezug auf Formel (II) unten angegeben definiert sind.
Zur Veranschaulichung kann der Erhalt von Retro-Analogen, in denen A H&sub2; N- und B -COOH darstellt, durchgeführt werden, indem man ein gem-Diaminoalkyl (H&sub2; N-CH(R1)-NH-) einbaut, um das N-terminale Ende des Ausgangspeptids zu mimikrieren und indem man ein C&sub2;-Derivat, das durch Malonsäure substituiert worden ist (-CO-CH(Rn)-COOH), einbaut, um das C-terminale Ende des Ausgangspeptids gemäß den unten angegebenen Methoden zu mimikrieren.
Der Erhalt von Retro-Analogen, in denen A H&sub2;NCO- und B -NHCOR darstellt, wobei R der unten angegebenen Definition entspricht, kann durch Amidbildung des COOH der Ngeschützten Aminosäure HOOC-CH(R1)-NH-P und durch Acetylierung des N- terminalen Endes durchgeführt werden; (als Beispiel wird eine Acetylierung mit Acetanhydrid in Anwesenheit von DIEA [DIEA = Diisopropylethylamin], was für B: -NHCOCH&sub3; ergibt] durchgeführt).
Indem man die verschiedenen oben beschriebenen Techniken der Einführung der Gruppen A und B miteinander kombiniert, ist es möglich, alle möglichen Kombinationen der Gruppen A und B an den Enden der Analoge der Erfindung zu erhalten.
In dieser Hinsicht werden Retro-Analoge, welche im Rahmen der Erfindung besonders werden, für die A H&sub2;NCO- und B COOH darstellt, erhalten, indem man ein Carbonsäure-Ende in Cterminaler Position des Retro-Analogs einführt und indem man am N-terminalen Ende des Retro-Analogs ein C&sub2;-Derivat einführt, das durch Malonsäure gemäß den oben beschriebenen Techniken substituiert worden ist.
Es muss präzisiert werden, dass Malonsäurederivate in razemischer Form (dargestellt -m(R,S)AAi-) eingeführt werden und dass, wenn man ein chirales Zentrum auf dem Niveau dieses Malons im Peptid erhalten möchte, es notwendig ist, das Gemisch der beiden so erhaltenen Diastereoisomere am Ende der Synthese zu reinigen, insbesondere durch Chromatographie in der flüssigen Phase.
Die Erfindung wird weitergehend mit Hilfe von Beispielen veranschaulicht, die dem Erhalt von retro-inversen Peptiden wie oben beschrieben folgen, sowie mit Hilfe der Demonstration ihrer antigenen und immunogenen Eigenschaften.
Verzeichnis der Figuren:
Fig. 1: Sie betrifft die schematische Darstellung des natürlichen L-IRGERA Peptids sowie analoger Peptide
Fig. 2: Sie betrifft den ELISA-Test der Immunantwort gegen die vier analogen Peptide, die als an die SUV von BALB/c- Mäusen angehängte Peptide injiziert werden. Die Antiseren werden im Verhältnis 1 : 500 verdünnt und mit homologen Peptiden (A und B) oder mit H3 (Ausgangsprotein) (C, D) getestet. Das Anti-Maus-Konjugat IgG (H + L), das die Mäuseantikörper mit den Isotopen IgG1, IgG2a und IgG2b (offene Symbole) entwickelt und das Anti-Maus-Konjugat IgG3 (geschlossene Symbole) werden im Verhältnis 1 : 5000 verdünnt. Die Ergebnisse stellen die Absobierungs-Mittelwerte dar, die in jeder Gruppe der beiden mit dem IRGERA L (Δ, Δ) dem retro-inversen Peptid (O, ) dem D-Peptid ( , ) und dem Retro-Peptid ( , ) immunisierten Mäuse erhalten werden. Die Pfeile zeigen das Schema der Immunisierung der Mäuse an.
Fig. 3: Sie bezieht sich auf die Resistenz der vier analogen Peptide gegenüber dem Trypsin. Das Trypsin wird in kovalenter Weise auf Nylonkugeln immobilisiert. Das Aufschlussgemisch, das zu unterschiedlichen Zeiten bei 25ºC inkubiert wird, wird zunächst mit dem Antikörper Mab 11 · 2 (4 ug/ml) inkubiert und danach mit dem auf der aktivierten Matrize des Biacore- Dextrans immobilisierten L-Peptid injiziert. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Inhibition der Mab 11 · 2-Bindung an das durch die kompetitiven, dem Trypsin untergeordneten Peptide immobilisierte L-Peptid ausgedrückt. Die Mab 11 · 2- Bindung an das L-Peptid in Abwesenheit des Inhibitor-Peptids entspricht 800 RU. In Anwesenheit eines aufgeschlossenen Peptids ist die Mab 11 · 2-Bindung an das L-Peptid 220 RU, 240 RU, 260 RU und 250 RU jeweils für das L-Peptid, das retro-inverse Peptid, das D-Peptid und das Retro-Peptid.
Fig. 4: Sie betrifft die Synthese des retro-inversen Analogs des C-terminalen Epitops des H3-Proteins: IRGERA.
Sequenz das Ausgangspeptids:
[H-Cys-Gly-Gly]-Ile-Arg-Gly-Glu-Arg-Ala-OH
Sequenz des retro-Analogs:
HO-m(R,S)Ala-DArg-DGlu-Gly-DArg-DIle-[Gly-Gly-Cys-NH&sub2;]
In dieser Figur ist:
a = MBHA Harz; b = BOP, HOBT, DIEA/DMF; c = TFA; d = HF
Abkürzungen: MBHA = 4-Methylbenzylhydrylamin, HOBT = Hydroxybenzotriazol, TFA = Trifluoressigsäure, HF = Fluorwasserstoffsäure, BOP = Benzotriazolyl-oxytri(dimethylaxnino)phosphon-Hexafluorphosphat,
DMF = Dimethylformamid, DIEA = Diisopropylethylamin.
Fig. 5: Sie betrifft die Synthese in der Lösung eines retro- inversen Analogs des T-Epitops (56-68) der Grippe-Matrize.
Sequenz des Ausgangspeptids:
H-Gly-Ile-Leu-Gly-Phe-VaI-Phe-Thr-Leu-OH
Sequenz des retro-inversen Analogs:
HO-m(R,S)Leu-(Δ)Thr-(Δ)Phe-(Δ)Val-(Δ)Phe-Gly-(Δ)Leu-gIle-Gly- H
In dieser Figur ist:
a = BOP, HOBT, DIEA/DMF, b = IBTFA, CH&sub3;CN/H&sub2;O (1 : 1), C = TFA, d = NaOH (1 N)/MeOH, g = gem-Diaminoalkyl.
Fig. 6: Reaktivität der von an LED und SS leidenden Patienten Serumproben in ELISA mit dem Ausgangspeptid und Analog RIb 277-291 von Ro52. Die Seren der Patienten werden im Verhältnis 1 : 1000 verdünnt. Lediglich die Aktivität der Antikörper der Subklasse IgG wird gemessen. Die Mittelwerte der optischen Dichte werden angezeigt. Die gepunktete Linie stellt die Obergrenze der Normalbevölkerung dar und entspricht dem Mittelwert der optischen Dichte von 20 normalen menschlichen Seren + 2 DS (Standardabweichung) (0,30 DO-Einheiten).
Fig. 7: Reaktivität der beiden Seren von an LED erkrankten Patienten (A, B) in ELISA mit dem Ausgangspeptid L 277-291 von Ro52 ( - ) und den beiden Diastereoisomeren RIa ( - ) und RIb (o-o). Die Seren der Patienten werden im Verhältnis 1 : 1000 verdünnt und mit variierenden Konzentrationsmengen des Peptids in Reaktion gebracht.
Fig. 8: schematische Struktur des Peptids L 304-324 von Ro60. Reaktion von Seren von 20 an LED und SS erkrankter Patienten in ELISA mit Analogen des Peptids 304-324 von Ro60. Die Seren der Patienten werden im Verhältnis 1 : 1000 verdünnt. Lediglich die Aktivität des IgG wird gemessen. Die Mittelwerte der optischen Dichte werden angezeigt. Die gepunkteten Linien stellen die Obergrenze der Normalbevölkerung dar und entsprechen dem Mittelwert der optischen Dichte von 20 normalen menschlichen Seren + 2 DS (Standardabweichung) (0,30 DO- Einheiten).
Fig. 9: Immunoenzymatischer Test auf der Membran ("Dot- Test") des Peptids L 304-324 von Ro60 und der mit &sup6;&sup5;Zn inkubierten analogen Peptide. Ein Nachweispeptid, das die bindende Struktureinheit des Zinks nicht enthält (Peptid 56-77 von U1-RNP Polypeptid A, Barakat et al., Clin. Exp. Immunol., 86: S. 71-78, 1991) wird als Nachweis verwendet (Bande 1). Steigende Mengen der 5 analogen Peptide und des Nachweispeptids werden auf Nitrocelluloseblättern (0,22 um) abgelagert; die Peptide werden mit &sup6;&sup5;Zn wie vorher beschrieben inkubiert (Mazen, A., Menissier-de Murcia, J., Molmete, M., Simonin, F., Gradwohl, G., Poirier, G., und de Murcia, G. (1989), Poly(ADP-ribose)polymerase: A novel finger protein. Nucl. Acids. Res., 17: 4689-4698; Muller S., Briand, J. P., Barakat, S., Lagueux, J., Poirier, G. G., De Murcia, G., und Isenberg, D. A. (1994) Autoantibodies reacting with poly(ADP-ribose) and with a zinc-finger functional domain of poly(ADP-ribose) polymerase involved in the recognition of damaged DNA. Clin. Immunol. Immunopathol., 73: 187-196). Die Nitrocelluloseblätter werden 5 Stunden lang (A) und 14 Stunden lang (B) bei -70ºC autoradiographiert. Banden 2,2': L-Peptid: Banden 3,3': RI-Peptid; Banden 4,4': D-Allo-Ile R1-Peptid; Band 5: blockiertes L-Peptid; Banden 6,6': blockiertes R1-Peptid. Die Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Versuchen (A und B).
Fig. 10 stellt die Liste der für die therapeutischen Immunmodulationstests synthetisierten Peptide dar.
Fig. 11 stellt in schematischer Weise das Nachweisprinzip der HLA-Peptid-Verbindung dar.
Fig. 12 zeigt alle Fixierungsresultate auf dem HLA-A2- Molekül. Die Peptide werden in Abszissen dargestellt und die Fluoreszenzeinheiten in Ordinaten. Die ausgefüllten Balken entsprechen den Peptidkonzentrationen in 10 ug/ml und die schraffierten Balken entsprechen den Peptidkonzentrationen in 1 ug/ml.
Fig. 13 entspricht der Zytolysemessung (in %- ausgedrückt) (in Ordinaten) in Abhängigkeit der Anzahl der Effektor- /Target-Zellen (in Abszissen), im Rahmen des bei Martinon et al., Eur. J. Immunol. 1990, 20, 2071-2176 beschriebenen Tests. Die Kurve mit den Dreiecken entspricht dem GG7-Peptid, die mit den Quadraten dem GG10-Peptid, die mit den vollen Kreisen dem M58-66-Peptid und die mit den leeren Kreisen dem GG0a-Peptid.

Beispiel 1

Materialien und Methoden

H3-Histon und Peptide

Das H3-Histon von Hühnererythrozyten wird isoliert und wie vorher beschrieben gereinigt (Van der Westhuyzen, D. R., & Von Holt, C. (1971), FEBS Lett., 14, 333-337).
Drei Modell-Peptid-Analoge der IRGERA-Sequenz, die den COOH- Terminalresten 130 bis 135 des H3-Histons entsprechen, werden hergestellt. Herstellung und Reinigung der L-und D-IRGERA- Peptide wurden vorher beschrieben (Benkirane et al., (1993), J. Biol. Chem., 268, 26279-26285). Die beiden neuen Analoge, die retro-inversen Peptide und die Retropegtide, werden in derselben Weise wie die L- und D-Peptide durch das Verfahren in der festen Phase auf einem Multikanal-Peptidsynthesizer synthetisiert (Neimark, J. & Briand, J. P., (1993), Peptide Res., 6, 219-228). Die retro-inversen Isomere und Retro- Isomere, die an den terminalen Enden modifiziert sind, werden verbunden, indem man die Boc-Schutzgruppe auf einem p-Methyl- Benzylhydrylamin-Harz verwendet (Applied Biosystem, Roissy, France). Die Verbindung der geschützten Peptidkette wird in der Größenordnung von 200 umol durchgeführt, indem man das Neutralisationsprotokoll in situ verwendet, kürzlich beschrieben (Neimark, J. & Briand, J. P., (1993), Peptide Res., 6, 219-229). Das durch Alkoholyse von 2,2,5-Trimethyl-1,3- Dioxan-4,6-Dion (Chorev et al., (1983), J. Med. Chem., 26, 129-135) erhaltene Monobenzyl-Ester der (R-S)-2-Methyl- Malonsäure wird in razemischer Form in die Peptidkette eingebracht. Die Kopplung wird durch den Ninhydrin-Test überprüft. Nach dieser letzten Kopplung wird das Peptid-Harz zweimal mit Ether gewaschen und im Vakuumtrockner getrocknet. Die Peptide werden vom Harz durch Behandlung mit wasserfreier HF, die 10% (v/v) Anisol und 1% (v/v) 1,2 Ethaneditiol enthält, abgespalten. Nach der Beseitigung von HF im Vakuum werden die Peptide vom Harz extrahiert und lyophilisiert. Die Rohpeptide werden dann auf einer C18-Säule unter Verwendung eines Mitteldruckapparates (Kronwald Separation Technology, Sinsheim, FRG) durch Elution mit einem linearen Gradienten von 5 bis 50% (v/v) Acetonitril, in 0,06% wässriger Trifluorwasserstoffsäure gereinigt. Die Reinheit einer jeden Fraktion wird durch analytische Passagen auf einer Säule von Novapak C18 von 5 um (3,9 · 150 mm) bestimmt, indem man einen linearen Gradienten zwischen 7 und 32% (v/v) von Acetonnitril in einem wässrigen Triethylammonium-Phosphat-0,1 M-Puffer verwendet. Die Passagen werden mit einem Gerät von Waters (Waters Corporation, Milford, MA) durchgeführt. Die Fraktionen, die das reine Diastereoisomer-Gemisch enthalten, werden aufgefangen und lyophilisiert. Die Massenspektren werden auf einem Instrument mit doppelter analytischer VG ZAB-2SE erhalten und in ein VG 11-250 Datensystem (VG Analytical, Manchester, UK) aufgenommen, wie beschrieben (Briand et al., (1989), Peptide Res., 2, 381-388). Die Maßnahmen des zirkulären Dichroismus werden wie in (Benkirane et al., (1993), J. Biol. Chem., 268, 26279- 26285) beschrieben durchgeführt.

Konjugation Peptid-Träger

Um die Peptide auf eine Folie zu legen, so dass man einen ELISA-Test direkt in der festen Phase durchführen kann, werden die IRGERA-Analoge zunächst in der BSA konjugiert, indem man N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) wie vorher beschrieben (14) verwendet. Für die Immunisierung von Mäusen werden die Peptide in kovalenter Weise an vorher gebildete sehr kleine einlamellige Liposomen (SUV) gekoppelt, die 4-(p-Maleimidophenyl) Butyrylphosphatidyl-Ethanolamin (MBP-PE) enthalten. Das Monophosphoryl Lipid A (MPLA) ist als Additiv in die SUV eingebracht (Benkirane et al., (1993), J. Biol. Chem., 268, 26279-26285; Friede et al., (19,93), Molec. Immunol., 30, 539-547).

Antiseren und monoklonale Antikörper

Die Antiseren werden gewonnen, indem man BALB/c-Mäuse mit Peptiden, die mit Liposomen verbunden sind, wie in (Benkirane et al., (1993), J. Biol. Chem., 268, 26279-26285) beschrieben, immunisiert. Man injiziert den Mäusen die verschiedenen SUV-Zubereitungen, die 1 umol Lipid, 2 ug MPLA und 60 ug Peptid pro Injektion je Tier enthalten, in intraperitonealer Weise.
Die Mäuse erhalten drei Injektionen im Abstand von drei Wochen, und ihnen wird fünf Tage nach jeder Injektion Blut abgenommen, danach regelmäßig jeweils 6 Monate nach der letzten Injektion. Das Nachweisserum wird jeder der Mäuse vor der ersten Injektion entfernt. Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern (Mab) injiziert man den BALB/c-Mäusen dreimal im Abstand von jeweils 3 Wochen die Peptide L und D (100 ug), die in kovalenter Weise mit den SUV, die MPLA enthalten, verbunden sind. Die Wiederholungsinjektionen werden an den Tagen 105, 106, 107 und 108 durchgeführt, das heißt, -4, -3, -2 und -1 vor der Fusion. Die monoklonalen Antikörper der Peptide L und D werden durch Standardfusionsprotokolle (16) hergestellt. Die ausführlichen Beschreibungen der Erzeugung und der Charakterisierung der monoklonalen Antikörper werden anderweitig gegeben (N. Benkirane, G. Sommermeyer and 5. Muller, Molecular Immunology, Vol. 24, No. 7, pp. 779-789, 1987).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Herstellung dieser drei monoklonalen Antikörper in folgender Weise durchgeführt wurde:
- Immunisierung von BALB/c-Mäusen: siehe oben,
- Die eigentliche Fusion:
-- L-Peptid: 2 · 10&sup7; Lymphozyten der immunisierten Maus + 2 · 10&sup7; Myelomzellen [PAI, Ref. in Muller et al., 1987]
-- D-Peptid: 3,2 · 10&sup7; Lymphozyten + 3,5 · 10&sup7; PAI
2 unter sukzessivem Klonen für die beiden Fusionen. -- Zusammenfassung der Fusion:
6 Klone wurden in großem Maßstab gezüchtet, um einige Dutzend mg von Ac zu erhalten. 41,6 mg von Ac 11x2, 80 mg von Ac 11x7 und 62 mg von 4x11 Ac wurden auf diese Weise hergestellt und gereinigt.
Die Reaktivität der drei monoklonalen Antikörper 4x11 (Derivat einer gegen das L-Peptid immunisierten Maus), 11x2 und 11x7 (Derivat einer gegen das D-Peptid immunisierten Maus) ist untenstehend beschrieben.
Außerdem wurden ebenso zwei andere monoklonale Antikörper, 4x8 und 4x10, erhalten, und man hat die Affinitätskonstante dieser Antikörper gegenüber dem L-IRGERA-Peptid und retro- inversen IRGERA-Peptid gemessen. Die Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle dargestellt (Tabelle 2).

ELISA

Das ELISA-Verfahren (direkter Verbindungs- und Kompetitionstest) wird wie in Benkirane et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 26279-26285 beschrieben, durchgeführt.

Kinetische Analyse der Bindung monoklonaler Antikörper

Für Bindungs-Experimente in Echtzeit wird ein BIAcore (Pharmacia Biosensor, AB, Uppsala, Sweden) Biosensorsystem verwendet. Die Reagenzien, einschließlich der Reaktionsoberflächen (Dextran) CMS, des Tensioaktivs P20 und des Kopplungskits, das N-Hydroxysuccinimid (NHS), N-Ethyl-N'-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC), 2-(2- Pyridinyldithio)-ethylamin (PDEA) und Ethanolamin-HCL enthält, werden mit dem Pharmacia Biosensor AB gewonnen.
Um die Peptide auf der Reaktionsoberfläche (Dextran) zu immobilisieren, wird das vorher beschriebene (17, 18) Standardprotokoll verwendet mit der Ausnahme, dass die Oberfläche des Dextrans zunächst durch das NHS-EDC-Gemisch aktiviert wird und anschließend durch Injektion des Kopplungsagenten PDEA Thiol (15 ul von 80 mM von PDEA in einem 0,1 M, pH 8,5 Borat- Puffer) modifiziert wird, indem man die reaktive Thiolgruppe analoger Peptide mit der durch eine Thio-Disulfid- Austauschreaktion aktivierten Matrize kuppelt. Nach der Passage der Immobilisierung des Peptids werden die an der Reaktionsoberfläche übriggebliebenen reaktiven Gruppen durch einen 4 minütigen Strom von 50 mM Zystein in NaCL, 1 M, pH 4,3 deaktiviert.
Die drei monoklonalen Antikörper 4x 11, 11x2 und 11x7 werden anschließend zur Interaktion mit den Reaktionsoberflächen gebracht, auf denen die vier verschiedenen analogen Peptide immobilisiert wurden. Sechs bis zehn Konzentrationen jedes monoklonalen Antikörpers von 50 bis 800 nM in HBS pH 7,4 (10 mM HEPES, 150 mM NACl, 3, 4 mM EDTA, 0,05% Tensioaktiv P20) werden in jedem Test verwendet. Die Antikörper-Zusammensetzung wird bei einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 3 ul pro min 7 Minuten lang bei 25ºC injiziert und im Abstand von 10 Sekunden werden 5 Minuten lang Messwerte aufgezeichnet, beginnend 1,30 Minuten nach Beendigung der Injektion der monoklonalen Antikörper (Zeder et al., (1993), Molec. Recogn., 6, 71-79).
Die Kompetitionstests werden wie vorher beschrieben durchgeführt (Zeder et al., (1993), Molec. Recogn., 6, 71-79). Die monoklonalen Antikörper 4x11, 11x2 und 11x7 (200 nM) werden mit den kompetitiven Peptiden inkubiert, die im molaren Überschuss von 1,75 bis 800 in Bezug auf die Antikörper verwendet werden.
Die kinetischen Konstanten der Antikörper werden wie beschrieben (Zeder et al., (1993), Molec. Recogn., 6, 71-79) gemessen. Die Theorie der kinetischen Messungen unter Verwendung des BIAcore-Biosensor-Systems wurde bereits vorher beschrieben (Zeder et al., (1993), Molec. Recogn., 6, 71-79; Altschuh et al., (1992), Biochemistry, 31, 6298-6304).

Trypsinresistenz

Die Resistenz der vier analogen Peptide gegenüber dem Trypsin wird getestet, indem man das proteolytische Enzym, das in kovalenter Weise auf Nylonkugeln von 3,2 mm Durchmesser (Michalon et al., (1993), Eur. J. Biochem., 216, 387-394) immobilisiert wurde, verwendet. Die spezifische Aktivität der Enzym- Kugeln entspricht 18 nmol des pro Minute pro Nylonkugel hydrolysierten p-Toluensulfonyl-L-(Arginin)-Methylesters. Der Aufschluss durch die Protease wird durch Eintauchen von 15 Enzym-Kugeln in 1 ml einer Peptidlösung von 150 ug/ml, die unter konstantem Rühren auf einer Temperatur von 25ºC gehalten wird, ausgelöst. Der Aufschluss wird in HBS pH 7,4 zwischen 5 und 240 Minuten durchgeführt. Die Reaktion wird beendet, indem man die Enzym-Rugeln herausnimmt. Die Abspaltung von Peptiden wird auf immunochemischem Wege bewertet. Man lässt zunächst die Aufschlusszusammensetzungen bei 25ºC mit dem Mab 11x2 (200nM) 30 Minuten lang inkubieren, dann setzt man sie dem auf der wie vorher beschrieben aktivierten Reaktionsoberfläche immobilisierten L-Peptid aus. In diesem Versuch tritt das Peptid, wenn es gegenüber dem Trypsin resistent ist, in Kompetition zu der Mab 11x2-Bindung an das auf der Dextranoberfläche immobilisierte L-Peptid, das wie oben beschrieben aktiviert wird, und das Signal, das in Resonanzeinheiten (RU) ausgedrückt wird, ist schwach. Im umgekehrten Fall tritt keine Kompetition auf, wenn das Peptid vom Trypsin abgebaut wird, und das Signal entspricht der Referenzlösung ohne kompetitives Peptid.

Ergebnisse

Synthetische Peptide

Vier Peptide werden in dieser Studie verwendet (Abb. 1). Das Ausgangspeptid IRGERA entspricht dem COOH-terminalen Ende des Histons H3, das vorher untersucht worden ist (Friede et al., (1993) Molec. Immunol., 30, 539-547; Muller et al., (1982), EMBO J., 1, 421-425; Briand et al., (1992), J. Immunol. Meth., 156, 255-265). Ein Zystein und zwei zusätzliche Glyzinreste werden am NH2-terminalen Ende hinzugefügt, um die selektive Konjugation von Peptiden bei Liposomen oder bei der BSA zu ermöglichen und um die Zugänglichkeit der mit dem Träger verbundenen Peptide zu erhöhen.
Die Fig. 1 stellt die Struktur des L-Peptids und der drei strukturell angeschlossenen Analoge, die in dieser Studie verwendet werden, dar, das heißt, das D-Enantiomer (Benkirane et al., (1993), J. Biol. Chem. 268, 26279-26285), die retro- inversen Analoge und die an den Enden modifizierten Retros. Das Retro-Analog wird erhalten, indem man die normalen Reste der aminierten L-Säuren durch entsprechende D- Reste ersetzt und indem man die Richtung der Peptidkette umdreht. Dadurch wird die Topochemie der Seitenketten erhalten, was bedeutet, dass die ursprüngliche Raumausrichtung aller Seitenketten erhalten bleibt (Goodman, M. und Chorev, M. (1979), Acc. Chem. Res., 12, 1-7). Im Falle des Retro-Analogs wird die Peptidkette umgedreht, aber die Chiralität der Aminosäuren in der Sequenz wird beibehalten, was zu einer Nicht-Komplementarität der Chemie der Seitenketten zwischen diesem Analog und dem Ausgangspeptid führt. Dieses Retro-Analog wird auf diese Weise topochemisch mit dem D-Enantiomer verbunden. Dagegen besitzen in derartigen linearen Peptiden die beiden topochemisch verbundenen Peptidpaare an den Enden nicht dieselben Gruppen und ihre Ladungen sind nicht komplementär. Um dieses Problem zu lösen, kann ein gem-Diaminoalkyl-Rest von der aminoterminalen Seite eingeführt werden und eine 2-Malonsäure, die am carboxyterminalen Ende substituiert ist (Goodman, M. und Chorev, M. (1979), Acc. Chem. Res., 12, 1-7). Dagegen werden die monoacetylierten gem-Diaminoalkyle hydrolysiert, und man muss damit rechnen, dass die Halbwertszeit der Peptide, die solche Reste einbauen, bei 25ºC zwischen 10 und 50 Stunden liegt (Loudon et al. (1981), J. Am. Chem. Soc., 103, 4508-4515). Infolgedessen und weil das NH2-terminale Zystein nicht Teil des Epitops ist, hat man sich entschlossen, ein Carboxamid-Ende zu verwenden. Die (R, S)-2-Methylmalonsäure ist in den Peptiden in razemischer Form eingebaut, wodurch ein Paar von Diastereoisomeren erzeugt wird. Die beiden Diastereoisomere der beiden Retro- und retro-inversen Analoge werden durch analytische HPLC identifiziert - 6,35 und 6,64 Minuten für das retro-inverse und 6,50 und 6,78 Minuten für das Retro, aber die Separierung ist nicht ausreichend, um eine Reinigung der Diastereoisomere zu ermöglichen. Die Diastereoisomer-Gemische werden als rein betrachtet auf der Basis der HPLC-Analyse 87% für das Retro-inverse und 86% für das retro und der Massenspektroskopie (M + 1)&spplus;. 946,4.
Die negative Ellipsität, die bei 198 nm im CD-Spektrum des L- Peptids und der Retropeptide gefunden wurde, deutet auf eine nichtgeordnete Form hin. Wie schon vorher für das L- Ausgangspeptid und dessen D-Enantiomer erwähnt (Benkirane et al., (1993), J. Biol. Chem., 268, 26279-26285), sind die CD- Spektren der retro- und retro-inversen Analoge Spiegelbilder.

Polyklonale Antikörper gegenüber IRGERA-Analogen

Zwei BALB/c-Mäusegruppen werden die vier an den Liposomen konjugierten IRGERA-Analoge injiziert. Die Reaktion der Antikörper gegenüber den vier Peptiden mit analogen Peptiden und mit H3 wird in einem ELISA-Direkttest gemessen. In diesem Test werden H3 und die vier analogen Peptide, die am BSA in der Mitte des SPDP konjugiert sind, verwendet, um die Platten zu bedecken. Wie in den Fig. 2A und 2B dargestellt, wird bei den immunisierten Mäusen eine starke Antikörperantwort gegenüber den vier Peptiden erreicht. Im Falle des L-Peptids gehören die Antikörper den Subklassen IgGl, 2a und 2b an. Die IgG3 Antikörperantwort tritt etwas später auf (Blutabnahme 4) als die IgG1, 2a und 2b (Blutabnahme 2) Antikörperantwort. Im Fall der retro-inversen, D- und Retro-Peptide ist die IgG3 Antikörperantwort vorherrschend. Der Großteil der Antikörper- Subklassen reagiert in Kreuzreaktion mit dem H3 Ausgangshiston (Fig. 2C und 2D) mit Ausnahme der Antikörper IgG1, 2a und 2b, die gegen das D-Peptid und das Retropeptid (Fig. 2D) gerichtet sind, die eine sehr geringe Reaktion mit dem H3 aufweisen. Es muss beachtet werden, dass, obwohl die IgG3 Antikörper-Antwort gegenüber dem retro-inversen und Retropeptid besonders stark ist, die Dauer der Antikörperantwort jener ähnelt, die gegen die L- und D-Peptide induziert wird.
Die gewonnenen Antikörper mit den Isotypen IgG1, 2a und 2b, die gegen das L- und retro-inverse Peptid gerichtet sind, erkennen das L-Peptid und das retro-inverse Peptid sowie das Histon H3 gleichermaßen, nicht jedoch das D-Peptid und das Retropeptid. Umgekehrt erkennen die gewonnenen Antikörper mit den IgG1, 2a und 2b Isotypen gegen das D- und Retropeptid das D- und Retropeptid gleichermaßen, aber weder das L-Peptid noch das retro-inverse Peptid. Die Antikörper mit dem IgG3 Isotyp, die gegen die vier Peptide induziert werden, reagieren in Kreuzreaktion mit den vier analogen Peptiden und H3 gleichgut. Die Immunreaktivität der Peptidkonjugate wird in einem Bindungstest durch Kompetition mit den freien Peptiden in der Lösung bestätigt (Tabelle 1).
Generell zeigen die mit den beiden Testtypen (BSA-Konjugateadsorbierte oder freie Peptide) gewonnenen Resultate, dass:
1) die Antikörper vom IgG Isotyp gegen das Retropeptid oder das retro-inverse Peptid leicht gewonnen werden können;
2) im Falle der Immunretroiden und des D-Peptids eine starke IgG3-Antwort produziert wird;
3) das retro-inverse Peptid IRGERA das natürliche L- Peptid gut mimikriert, aber weder das D-Peptid noch das Retropeptid, obwohl das Retropeptid das D- Peptid gut mimikriert, nicht jedoch das L-Peptid und das retro-inverse Peptid.

Monoklonale Antikörper gegenüber L- und IRGERA-Analogen

Mehrere Fusionsexperimente werden mit Milzzellen von immunisierten BALB/c-Mäusen mit verschiedenen IRGERA-Analogen, die vorher beschrieben wurden (9), durchgeführt. Von allen gewonnenen monoklonalen Antikörpern wurden drei Antikörper auf der Grundlage ihrer Reaktivität mit den vier analogen Peptiden in ELISA ausgewählt. Das Mab 4x 11 (IgG1) wird aus den Splenozyten einer mit dem L-Peptid immunisierten Maus erzeugt; es reagiert in ELISA mit dem L-Peptid und dem retro-inversen Peptid, nicht jedoch mit dem D-Peptid und nur schwach mit dem Retropeptid. Die monoklonalen Antikörper 11x2 und 11x7 (beide mit IgG3) werden aus den Splenozyten einer mit dem D-Peptid immunisierten Maus erzeugt; sie reagieren in ELISA mit den vier IRGERA-Analogen sowie mit dem Ausgangshiston H3.
Die Bindung dieser Antikbrper an die vier analogen Peptide wird in einem BIAcore gemessen, indem man Peptide verwendet, die in kovalenter Weise mit der Dextranmatrize über ihre freie SH-Gruppe verbunden sind. Die kinetischen Konstanten und die Affinitäts-Gleichgewichtskonstanten der drei monoklonalen Antikörper für die vier analogen Peptide werden in Tabelle 2 zusammengetragen. Die Affinitäts- Gleichgewichtskonstanten (Ka) von Mabs 4xll, 11x2 und 11x7 gegenüber den homologen Peptiden sind 3 · 10&sup6; PC, 1,3 · 10¹&sup0; PC beziehungsweise 1,2 · 10&sup7; M&supmin;¹ (Tabelle 2). Es muss beachtet werden, dass die beiden monoklonalen Antikörper 4x11 und 11x7 einen Ka-Wert aufweisen, der für das homologe Peptid mindestens 50 mal schwächer ist als für ein heterologes Peptid, nämlich das retro-inverse Peptid im Falle des monoklonalen Antikörpers 4x11 und das Retropeptid im Falle des monoklonalen Antikörpers 11x7 (Tabelle 2). Der monoklonale Antikörper 11x2 reagiert mit den vier Peptiden. Dagegen sind die Ka- Werte im Vergleich mit der Affinität des Antikörpers gegenüber dem homologen Peptid 30 mal schwächer als für das retro- heterologe Peptid und 10³-10&sup4; schwächer für das L-Peptid und das retro-inverse Peptid (Tabelle 2).
Um die Differenz in der Immunreaktivität der verschiedenen analogen Peptide zu bestätigen, werden Inhibitionsversuche mit den drei monoklonalen Antikörpern im BlAcore-System durchgeführt. Man lässt die drei monoklonalen präinkubierten Antikörper mit den variierten Konzentrationen der vier analogen Peptide mit den auf der Oberfläche des SENSOR immobilisierten homologen Peptiden reagieren. Wie in Tabelle 3 angegeben, wird die Bindung des monoklonalen Antikörpers 11x2 an die L- und D-Peptide von den vier analogen Peptiden inhibiert (50% der Inhibition der Bindung des Antikörpers, beobachtet mit 0,5 bis 25 Molarüberschuss verschiedener Peptide gegenüber den Antikörpern). Die Bindung des monoklonalen Antikörpers 4x11 an das L-Peptid wird lediglich durch die freien L- Peptide und retro-inversen Peptide inhibiert, wohingegen die Bindung des Antikörpers 11x7 an das D-Peptid nur durch das D- Peptid und die freien Retropetide inhibiert wird. Diese Ergebnisse stimmen somit gänzlich mit jenen oben beschriebenen in den ELISA-Tests und dem Direkttest in BIAcore gewonnenen Ergebnissen überein. In Bezug auf die Quantität hingegen findet man, wenn man die Antikörperreaktivität mit den vier analogen Peptide in ELISA und im BlAcore-System vergleicht, in einigen Fällen eine schwache Korrelation (Tabelle 4). Zum Beispiel werden ähnliche Werte der optischen Dichte (OD) in ELISA erzielt, wenn der monoklonale Antikörper 11x mit den L- und D-Peptiden zur Reaktion gebracht wird, wohingegen die im Biosensor-System gemessenen Ka-Werte eine Differenz von 4 log aufweisen.

Polyklonale Antikörper H3 des Kaninchens gegenüber D-, RI IRGERA-Analogen und dem Ausgangspeptid.

Tabelle 5 zeigt, dass die Ausgangs-Antiprotein-Antikörper (Histon H3) in der Lage sind, in ELISA in identischer Weise das Ausgangs IRGERA-Peptid und sein Analog, das Peptid RI zu erkennen. Dieses Ergebnis eröffnet alle Verwendungsmöglichkeiten von Immunretroiden in der Diagnostik in all jenen Fällen, in denen man Antikörper gegen ein exogenes (zum Beispiel in der Virologie, Mikrobiologie) oder endogenes Protein (zum Beispiel Autoimmunität, neurodegenerative Krankheiten) nachweisen möchte.
Wir haben vorher schon gesehen, dass monoklonale Antipeptid- Ausgangs-Antikörper das Peptid RI erkennen können, das eine Affinität besitzt, die sehr viel größer ist als jene, die im Rahmen der Erkennung des Ausgangspeptids durch die monoklonalen Antikörper gemessen wurde (siehe Tabelle 2, monoklonale Antikörper Mab 4x11), was es erlauben kann, in speziellen Fällen den Diagnostiktest zu verbessern, zum Beispiel durch Verwendung von Antikörpern, insbesondere monoklonaler, Anti- R1, um das gesuchte Protein in einer biologischen Mischung "herauszupicken".

Resistenz von analogen Peptiden gegenüber Trypsin

Einer der potenziellen Vorteile der Verwendung von analogen Peptiden, die D-Aminosäurereste oder inverse Peptidbindungen besitzen, ist deren höhere Resistenz gegenüber der Protease, was ihre Immunogenizität im Vergleich zu natürlichen Peptiden erhöhen könnte. Unter Verwendung des radioaktiven Rubredoxins haben Dintzis et al. (Dintzis et al., (1993), Proteins, 16, 306-308) zum Beispiel gezeigt, dass die D-Form des Proteins mindestens 4-mal solange im Organismus gespeichert wird wie die L-Form. Wade et al. (Wade et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 4761-4765) haben gezeigt, dass die D- Enantiomere verschiedener Peptidantibiotika gegenüber dem enzymatischen Abbau resistent sind. Man hat hier die Resistenz von analogen Peptiden gegenüber dem Trypsin getestet, dessen Spezifität auf lateralen positiv geladenen Arginin- und Lysinketten beruht. Man hat das in kovalenter Weise auf Nylonkugeln immobilisierte Enzym verwendet und die Restkapazität der proteolysierten Peptide, die mit dem L-Peptid um die Bindung des monoklonalen Antikörpers 11x2 im BlAcore in Kompetition treten, gemessen. Der monoklonale Antikörper 11x2 wird in diesem Versuch verwendet, weil er die vier Analoge in der Lösung erkennt (Tabelle 3). Der Vorteil der Verwendung des auf Nylonkugeln immobilisierten Enzyms liegt in seiner größeren Stabilität, der Abwesenheit von der Ergänzung eines Agenten, der die Proteaseaktion blockiert, um die Reaktion und eine experimentelle Kontrolle des Experiments zu beenden (Michalon et al., (1993), Eur. J. Biochem., 216, 387-394). Wie in Fig. 3 gezeigt, wird das L-Peptid unter diesen Bedingungen schnell aufgeschlossen. Die Hälfte seiner antigenen Aktivität ist nach 7 Minuten verloren, und nach 10 Minuten ist jegliche Aktivität verschwunden. Das Retropeptid ist etwas weniger sensibel (Halbwertszeit: 9 Minuten, kompletter Verlust der immunologischen Aktivität nach 40 Minuten), während das D-Peptid und das retro-inverse Peptid dem Trypsin gegenüber sehr viel resistenter sind (Halbwertszeit: 73 beziehungsweise 67 Minuten, kompletter Verlust der Aktivität nach 240 Minuten noch nicht festgestellt). TABELLE 1 Erkennung des IRGERA-Peptids und IRGERA-Analoge durch Mäuseantikbrper, die gegen homologe und analoge Peptide induziert wurden, im ELISA Kompetitionstest
Mikrotiterplatten werden mit Hilfe von SPDP (Molares Verhältnis des Peptids zum Träger 1 : 10) mit 2 uM von mit BSA konjugiertem Peptid bedeckt und mit Mäuseantiseren, die gegen das homologe Peptid gerichtet sind (Verdünnung des Serums 1 : 500) inkubiert und mit den verschiedenen Peptiden und mit H3, das als Inhibitor verwendet wird, präinkubiert. Eine Referenzpeptidlösung, die der Sequenz 149-158 des Proteins des Virus der Mosaikstruktur des Tabaks entspricht, wird als interne Referenz verwendet und hat keinerlei Wirkung auf die Bindung mit den Antikörpern.
Die Anti-IgG-Konjugate der Mäuse, die mit der Peroxydase gekoppelt sind, werden beide im Verhältnis 1 : 5000 verdünnt.
Die molaren Überschüsse des Inhibitorpeptids werden in Abhängigkeit des in den Vertiefungen in der Mikrotiterplatte abgelagerten Peptids ausgedrückt und werden wie beschrieben berechnet (Benkirane et al., (1993), J. Biol. Chem., 268, 26279-26285).
*-, Kreuzreaktivität nicht nachweisbar (bis 125 ug/ml des kompetitiven Peptids)
L = Ausgangs-L-Peptid, RI = retro-inverses Peptid, D = D- Peptid, R = Retropeptid. Tabelle 2 Kinetische Konstanten und Affinitäts-Gleichgewichtskonstanten von Mab 4x11, 11x2 und 11x7 für die vier IRGERA-Analoge und 4x8 und 4x10 für L-IRGERA und RI-IRGERA.
* nb, reine Bindung
Die Konstanten der Assoziierungs- (ka) und Dissoziierungsraten (kd) sind die in zwei aus vier unabhängigen Versuchen erhaltenen Mittelwerte.
L = Ausgangs-L-Peptid; RI = retro-inverses Peptid; D = D- Peptid; R = Retropeptid. TABELLE 3 Erkennung des IRGERA-Peptids und der IRGERA-Analoge durch die Antikörper Mab 4x11, 11x2 und 11x7 in Kompetitionstests im BIAcore-System
L = L-Ausgangspeptid, RI = retro-inverses Peptid, D = D- Peptid, R = Retropeptid.
Die molaren Überschüsse des Inhibitors werden im Verhältnis zum Antikörper ausgedrückt (200 nM Mab).
*-, Kreuzreaktivität nicht nachweisbar (bis 250 ug/ml des kompetitiven Peptids). TABELLE 4 Reaktivität der Mab 4x11, 11x2 und 11x7 mit den vier IRGERA- Analogen in ELISA. Affinitäts-Gleichgewichtskonstanten der drei Mab für die vier Analoge.
*nb, keine Bindung.
Für ELISA werden die Mikrotiterplatten mit Hilfe von SPDP mit 2 uM des mit BSA konjugierten Peptids bedeckt und mit den Mabs (4 ug/ml) inkubiert.
Die anti-Maus IgG-Konjugate der Peroxydase werden im Verhältnis 1 : 5000 verdünnt.
L = L-Ausgangspeptid, RI = retro-inverses Peptid, D = D- Peptid, R = Retropeptid. TABELLE 5 Reaktivität der Anti-Histon H3 Antikörper (Ausgangsprotein) bei Kaninchen mit IRGERA L, D und RI-Peptiden induziert.
(1) Werte der optischen Dichte bei 450 nm.

Beispiel 2

Retro-inverse Peptide und Diagnostik.

In den letzten zehn Jahren sind die Immunversuche in der festen Phase wie der ELISA-Test und die radioimmunologischen Tests in der festen Phase immer gebräuchlicher geworden, und diese Tests werden vielfach verwendet, um die antigenische Aktivität von synthetischen Peptiden zu diagnostischen und gleichzeitig experimentellen Zwecken zu bestimmen. Insbesondere wurde eine gewisse Anzahl von Immunversuchen, die auf der Verwendung von synthetischen Peptiden für die Erkennung und die Quantifizierung von Autoantikörpern, die sich in den Seren der von Autoimmunkrankheiten betroffenen Patienten befinden, entwickelt (Elkon, K. B., (1992) Use of synthetic peptides for the detection and quantification of antibodies. Molec. Biol. Rep., 16: 207-212; Muller, S. (1994), Use of synthetic peptides for the analysis of B-cell epitopes in autoantigens, In: M. Zouali (Ed.) Autoimmunity: Experimental Aspects. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p. 76-90). Es ist wichtig zu unterstreichen, dass die verwendeten Peptide - entweder frei in der Lösung oder direkt auf den Mikrotiterplatten adsorbiert durch die Proteasen, die in den Patientenseren enthalten sind während der Tests verändert werden können. Eine der Charakteristiken der akut entzündlichen Reaktion ist tatsächlich die Freisetzung der variierten proteolytischen Enzyme, die zu einer Läsion des Gewebes und zur endgültigen Freisetzung anderer Proteasen führt (Kaplan, A. P. und Silverberg, M. (1988) Mediators of inflammation: an overview. Meth. Enzymol., 163: 3-23). Bei Autoimmerkrankungen wie der rheumatoiden Polyarthritis oder Lupus erythematosus disseminatus (LED), kann der Abbau des entzündlichen Gewebes auch durch zirkulierende Immunkomplexe verursacht werden (Levinson, S. S. (1994), Humoral mechanisms in autoimmune disease. J. Clin. Immunoassay, 17: 72-84). Der proteolytische Abbau von Peptiden kann durch deren Konjugation an einem Trägerprotein umgangen werden. Dagegen kann diese Etappe für verschiedene Labore eine unbequeme Technik darstellen oder gemäß der in Frage stehenden Peptidsequenz kann eine Kopplungsstrategie schwer zu akzeptieren sein, wenn die Reste, die nicht Teil des Epitops sind, nicht verfügbar sind. Als Alternative zielt die Erfindung gemäß einer ihrer Aspekte darauf ab, antigenische Peptide in Peptidanloge umzuwandeln, die die Ausgangspeptide ("Peptidmimetika") mimikrieren, welche dem proteolytischen Abbau gegenüber resistent sind und trotzdem eine hohe antigene Aktivität bewahren.

Materialien und Methoden.

2.1 Peptide.

Alle analogen Peptide werden durch die Methode in der festen Phase auf einem Multipeptidsynthesizer synthetisiert (Neimark, J. und Briand, J. P. (1993) Development of a fully automated multichannel peptide synthesizer with integrated TFA cleavable capability. Peptide Res. 6: 219-228), indem für die L-Peptide ein vollautomatischer und für die retro-inversen Peptide ein halbautomatischer Modus verwendet wird. Die Derivate der geschützten L- und D- Aminosäuren stammen von Neosystem (Straßburg). Die schematische Darstellung der in diesem Beispiel verwendeten analogen Peptide ist in Tabelle 6 zu f finden.

2.1.1 Peptid 130-135 des Histons H3.

Die Synthese der L- und retro-inversen Peptide wurde vorher beschrieben (Guichard, G., Benkirane, N., Zeder-Lutz, G., von Regenmortel, M. H. V., Briand, J. P. und Muller, S. (1994) Antigenic mimicry of natural L-peptides with retro-inversopeptidomimetics. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 9765-9769).

2.1.2 Peptid 277-291 des Proteins 52 kD des SSA/Ro (Ro52).

Die L- und retro-inversen Peptide werden durch Boc-Chemie auf einem Boc-Leu-Pam-Harz (Phenylacetamidmethyl) beziehungsweise einem p-Methylbenzhydrylamin aufgebracht. Die Verbindung der geschützten Peptidkette wird in einem Maßstab von 100 umol unter Verwendung der in-situ-Neutralisation, die vorher beschrieben wurde, durchgeführt (Neimark, J. und Briand, J. P. (1993) Development of a fully automated multichannel peptide synthesizer with integrated TFA cleavable capability. Peptide Res. 6: 219-228). Für die retro-inversen Peptide mimikriert man das C-terminale Ende des Ausgangspeptid, indem man ein Malonatderivat verwendet. Das Monobenzyl-Ester der (R,S)-2- Isobutyl-Malonsäure, das durch Alkoholyse von 2,2-Dimethyl- 5,-Isobutyl-1,3-Dioxan-4-6 Dion erhalten wird (Chorev, M., Rubini, E., Gilon, C., Wormser, U. und Selinger, Z. (1983) Synthesis of partially modified retro-inverso substance P analogues and their biological activity. J. Med. Chem., 26: 129-135), ist in der Peptidkette in razematischer Form eingebracht und erzeugt so ein Paar von Diastereoisomeren. Die Peptide werden durch die Behandlung mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure (HF), die 10% (v/v) Anisol und 1% (v/Vv) von 1,2 Ethanedithiol enthält, vom Harz abgespalten.
Nach Eliminierung der HF im Vakuum werden die Peptide aus dem Harz extrahiert und lyophilisiert. Die Rohpeptide werden anschließend auf einer Aquapore C18 ODS (100 · 10 mm) Säule gereinigt, indem man einen präparativen HPLC-Apparat verwendet (Perkin Eimer, Saint Quentin en Yvelines, Frankreich). In Bezug auf das retro-inverse Analog konnten die beiden Diastereoisomere separiert und durch HPLC gereinigt werden. Sie werden anhand ihrer Retentionszeit identifiziert. Das am schnellsten eluierte retro-inverse Isomer wird mit "RIa Peptid" und das am langsamsten eluierte Peptid wird mit "RIb Peptid" bezeichnet (Tabelle 6). Die Isomerisationsrate der separierten Diastereoisomere wurde bei 4ºC und bei 37ºC verfolgt. Beide isomerisieren, wenn sie 12 Stunden lang bei 37ºC inkubiert werden (Bedingungen, die normalerweise geschaffen werden, um die ELISA-Platten zu sensibilisieren), die RIa- und RIb-Bestandteile führen zu einer Mischung mit einem Diastereoismergleichgewicht von ungefähr 50 : 50 (RIa/RIb) beziehungsweise 70 : 30 (RIb/RIa). Im Gegensatz dazu erscheinen die beiden Isomere bei 4ºC sehr stabil, vorausgesetzt, dass jede Veränderung in den entsprechenden HPLC- Profilen beobachtet wird. Die Bedeckung der Platten mit den analogen Peptiden Ro52 277-291 wurde somit bei 4ºC über die Dauer der gesamten Studie durchgeführt.

2.1.3 Peptid 304-324 des Proteins 60kD von SSA/Ro.

Zwei Peptidserien sind synthetisiert worden. In der ersten Serie sind die N- und C-terminalen Enden des Ausgangspeptids und die umgekehrten Enden des retro-inversen Peptids ungeschützt. Sie werden in der Fmoc-Chemie auf einem Harz des p- Alkoxybenzy-Alkohols verbunden. Im retro-inversen Analog D- allo-Ile wird das D-allo-Ile anstelle des D-Ile eingeführt. In der zweiten Analogserie werden die N- und C-terminalen Enden des Ausgangspeptids und der retro-inversen Peptide acetyliert beziehungsweise amidiert. Diese blockierten Peptide werden in der Fmoc-Chemie auf einem Fmoc -2,4-Dimethoxy-4'- (carboxymethyloxy)-Benzhydrylamin verbunden.
Die Verbindung der geschützten Peptidketten wird in einem Maßstab von 25 umol gemäß einer klassischen Fmoc-Methode durchgeführt. Die Peptide des Harzes werden mit dem Reagenz K (King, D., Fields, C. und Fields, G. (1990) A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid-phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res., 36r 255-266) innerhalb von zwei Stunden gespalten, und jedes Peptid wird in einer mit tert.-Butyl-methyl-ether-Röhre bei 4ºC zurückgewonnen. Nach der Zentrifugation werden die Reste zweimal mit kaltem Ether gewaschen. Nach der letzten Zentrifugation wird jedes Peptid in einer wässrigen Lösung aufgelöst, um dann lyophilisiert werden zu können. Die Rohpeptide werden zum Schluss wie oben beschrieben gereinigt.

2.1.4 Peptid 28-45 des Histons H3.

Vier analoge Peptide wurden synthetisiert, das heißt, das L- Ausgangspeptid, das L-Peptid, in dem die freie terminale COOH-Gruppe durch eine -CONH&sub2; Carboxamidgruppe ersetzt worden ist und das L-Peptid und das retro-inverse Peptid mit den N- und C-terminal blockierten Enden (Tabelle 6). Die vier Peptide werden in der Fmoc-Chemie wie oben beschrieben hergestellt.
Alle in dieser Studie verwendeten Peptide wurden durch HPLC gesteuert und durch (FAB)-Massenspektroskopie analysiert.

2.2 Bindung des Zinks an peptidartige Analoge des Peptids 304-324 von Ro60.

Die Bindungskapazität des Ausgangspeptids Ro60 304-324 und der retro-inversen Analoge im Falle von Zinkionen wurde unter Verwendung von &sup6;&sup5;Zn getestet. Die Peptide wurden auf Nitrocellulose wie vorher beschrieben immobilisiert (Mazen, A., Menissier-de Murcia, J., Molmete, M., Simonin, F., Gradwohl, G., Poirier, G., und de Murcia, G. (1989), Poly(ADP- ribose)polymerase: a novel finger protein. Nucl. Acids. Res., 17: 4689-4698; Muller, S., Briand, J. P., Barakat, S., Lagueux, J., Poirier, G., de Murcia, G., und Isenberg, D. A. (1994) Autoantibodies reacting with poly(ADP-ribose) and with a zincfinger functional domain of poly(ADP-ribose)polyTnerase involved in the recognition of damaged DNA. Clin. Immunol. Immunopathol., 73: 187-196).

2.3 Kopplung des Peptids 130-135 von H3.

Das Peptid 130-135 von H3 und sein retro-inverses Analog wurden mit dem Albumin-Bovin-Serum (BSA) mit Hilfe des N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionats (SPDP) konjugiert. Der Bildungsgrad der Kopplung wurde durch Spektrophotometrie gemessen, indem man das Aussalzen des 2-Thiopyridons ab der durch SPDP modifizierten BSA anlässlich der Interaktion mit den Zystein enthaltenden Peptiden untersucht (Muller, S. (1988), Peptide-carrier conjugation. In: R. H. Burdon und P. H. von Kippenberg (Eds.), Synthetic Polypetides as Antigens. Elsevier, Amsterdam, S. 95-130).

2.4 Humane Autoimmunseren und Mausseren.

Weibliche F1 Seren von an Lupus leidenden Mäusen (NZB/W) wurden von S. Batsford (Freiburg) gewonnen. Die humanen Seren stammen von Patienten, die an Lupus erythematosus disseminatus (LED) und am Sjörgen-Syndrom (SS) leiden. Sie wurden von D. A. Isenberg (London), O. Meyer (Paris) und G. Fournie (Toulouse) gewonnen. Die Seren gesunder Freiwilliger wurden durch J. L. Pasquali (Straßburg) gewonnen. Der Großteil dieser Seren wurde in vorhergehenden Studien verwendet (Ricchiuti, V., Briand, J. P., Meyer, O., Isenberg, D. A., Pruijn, G. und Muller, 5. (1994) Epitope mapping with synthetic peptides of 52kD SSA/Ro protein reveals heterogeneous antibody profiles in humane autoimmune sera. Clin. Exp. Immunol., 95: 397-407; Ricchiuti, V. und Muller, S. (1994) Use of peptides for the mapping of B-cell epitopes recognized by anti-Ro (SS-A) antibodies. In: D. A. Isenberg und A. C. Horsfall (Eds.), Autoimmune Diseases: focus on Sjögren's syndrome. Bios Scientific Publishers, Oxford, S. 101-106).

2.5 ELISA-Test

Die Seren von an Lupus leidenden Mäusen wurden durch ELISA getestet wie vorher beschrieben (Benkirane, N., Friede, M., Guichard, G., Briand, J. P., Van Regenmortel, M. H. V. und Muller, 5. (1993) Antigenicity and immunogenecity of modified synthetic peptides containing D-amino acid residues. J. Biol. Chem., 268: 26279-26285). Lediglich die Antikörper mit dem Isotyp IgG wurden getestet. Der Test mit Antikörpern mit dem Isotyp IgG, die mit den Peptiden von Ro52 und Ro60 reagieren, wurde wie von Barakat et al. (Barakat, S., Meyer, O., Torterotot, F., Youinou, P., Briand, J. P., Kahn, M. F. und Muller, S. (1992) IgG antibodies from patients with primary Sjögren's syndrome and systemic lupus erythematosus recognize different epitopes in 60-ku SSA/Ro protein. Clin. Exp. Immunol., 89: 38-45) und Ricchiuti et al. (Ricchiuti, V., Briand, J. P., Meyer, O., Isenberg, D. A., Pruijn, G. und Muller, S. (1994) Epitope mapping with synthetic peptides of 52kD SSA/Ro protein reveals heterogeneous antibody profiles in human autoimmune sera. Clin. Exp. Immunol., 95: 397-407) beschrieben durchgeführt mit Ausnahme des Peptids Ro52 277-291, bei dem die Sensibilisierung der ELISA-Platten bei 4ºC anstatt bei 37ºC (Begründung siehe oben) durchgeführt wurde. Der Schwellenwert der Positivität jedes Tests inklusive jenes Werts von Tests, die auf der Verwendung von retro-inversen analogen Peptiden basieren, wurde festgelegt, indem man 20 Seren gesunder Personen verwendete. Die antigenische Aktivität der Peptide wird auch durch ELISA gemessen, indem man einen Inhibitionstest in der flüssigen Phase verwendet. Das Verfahren ist genauso wie vorher beschrieben (Ricchiuti, V., Briand, J. P., Meyer, O., Isenberg, D. A., Pruijn, G. und Muller, S. (1994) Epitope mapping with synthetic peptides of 52kD SSA/Ro protein reveals heterogeneous antibody profiles in human autoimmune sera. Clin. Exp. Immunol., 95: 397-407).

3. Ergebnisse.

3.1. Synthetische Peptide und retro-inverse Analoge.

Bei der nativen Peptidsequenz impliziert die retro-inverse Modifikation von linearen Polypeptiden die synthetische Verbindung von Aminosäuren mit der Stereochemie des Carbons, die in a derjenigen von entsprechenden aminierten L-Säuren entgegengesetzt ist, in inverser Reihenfolge. Das Ergebnis besteht darin, dass die Positionen der Amino- und Carboxylgruppen in jeder der Peptidbindungen getauscht werden, während die Topologie der Seitenketten jener des natürlichen Peptids ähnelt oder mit ihr identisch ist. Die Inversion der terminalen Gruppen wirft ein großes Problem in Bezug auf die Komplementarität der Struktur und der Ladung auf. Es wurden jedoch einige Ansätze in Betracht gezogen, um dieses Problem zu behandeln (Goodman, M. und Chorev, M. (1979) On the concept of linear modified retro-peptide structures. Acc. Chem. Res., 12: 1-7). Beispielsweise wurden retro-inverse Analoge des Peptids 130-135 von H3 und 277-291 von Ro52 wie retro-inverse Isomere, die an ihren terminalen Enden modifiziert sind, synthetisiert. Man hat einen durch C-2 ersetzten Malonsäurerest eingeführt, um möglichst genau das C-terminale Carbon der Ausgangspeptide und der Carboxamidgruppe (-NH&sub2;-CO-) anstelle der freien terminalen Aminogruppe mimikrieren zu können. Die beiden Diastereoisomere des retro-inversen Peptids 277-291 von Ro52 (Analoge RIa und RIb, Tabelle 6) konnten durch HPLC separiert werden.
Eine Alternative zur Eingrenzung des Problems des terminalen Endes besteht in der Herstellung von blockierten Peptiden und blockierten retro-inversen Analogen. Diese Lösung wurde für die Peptide 304-324 von Ro60 und 28-45 von H3 angenommen. Die Verwendung dieser Strategie impliziert offenbar als Vorbedingung, dass die Peptide, deren terminalen Enden blockiert sind, noch von Antikörpern erkannt werden.
Ein anderes Problem bei der Annäherung an retro-inverse Peptide besteht darin, dass die sekundären asymmetrischen Zentren der Seitenketten von Threonin und Isoleucin ihre korrekte Chiralität beibehalten müssen. Dies wurde mit dem Peptid 304- 324 von Ro60, das in seiner retro-inversen Form entweder mit D-Ile- oder mit D-allo-Tle-Resten synthetisiert wurde, (Tabelle 6) untersucht.
Die Reinheit der in dieser Studie verwendeten 13 analogen Peptide liegt über 80%, wie in der analytischen HPLC gezeigt. Die MS-FAB-Analyse erbringt für alle Verbindungen die erwarteten Ergebnisse.

3.2 Erkennung des retro-inversen Analogs von C-terminalem Hexapeptid von H3 durch Seren von durch Lupus betroffenen Mäusen

Das C-terminale Hexapeptid des Histons H3 entspricht einem Hauptepitop des Proteins (Muller, S., Himmelspach, K. und Van Regenmortel, M. H. V. (1982) Immunochemical localization of the C-terminal hexapeptide of histone H3 at the surface of chromatin subunits. EMBO J., 1: 421-425). Dieses Segment wurde in früheren Studien der modifizierten Peptide als Modellpeptid verwendet, insbesondere, um zu zeigen, dass die retroinversen Analoge gegenüber proteolytischen Enzymen sehr viel resistenter sein können als die L-Peptide (Guichard, G., Benkirane, N., Zeder-Lutz, G., von Regenmortel, M. H. V., Briand, J. P. und Muller, S. (1994) Antigenic mimicry of natural L-peptides with retro-inverso peptidomimetics. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 9765-9769). Zunächst hat man eine Serie von Seren weiblicher Mäuse F1 (NZB/W) mit dem Ausgangspeptid 130-135 von H3 abgesiebt und eine gewisse Anzahl positiver Seren gewählt. Diese Seren wurden anschließend in ELISA auf ihre Reaktionskapazität mit dem retro-inversen Peptid 130-135 getestet. Wie in Tabelle 7 gezeigt, reagieren die Seren von an Lupus erkrankten Mäusen mit dem retro-inversen Peptid 130- 135 genauso gut wie mit dem Ausgangspeptid 130-135.

3.3 Erkennung des retro-inversen Analogs von Ro52 277-191 durch Seren autoimmuner Patienten

Dreißig Seren von an LED und SS erkrankten Patienten wurden zunächst auf ihre Reaktionskapazität mit dem Ausgangspeptid 277-291 von Ro52, das vorher als ein Epitop enthaltend identifiziert wurde, das von den Antikörpern der IgG Subklasse autoimmuner Patienten erkannt wird, getestet (Ricchiuti, V., Briand, J. P., Meyer, O., Isenberg, D. A., Pruijn, G. und Muller, S. (1994) Epitope mapping with synthetic peptides of 52kD SSA/R0 protein reveals heterogeneous antibody profiles in human autoimmune sera. Clin. Exp. Immunol., 95: 397-407). Indem ein Schwellenwert für die Positivität verwendet wird, der 0,30 Einheiten DO entspricht (Ricchiuti, V., Briand, J. P., Meyer, O., Isenberg, D. A., Pruijn, G. und Muller, S. (1994) Epitope mapping with synthetic peptides of 52kD SSA/R0 protein reveals heterogeneous antibody profiles in human autoimmune sera. Clin. Exp. Immunol., 95: 397-407), hat man herausgefunden, dass von diesen 30 Seren 5 Antikörper der IgG- Subklasse, die mit dem L-Peptid reagieren, enthalten (Fig. 6; mit den Peptiden bei 4ºC anstatt 37ºC sensibilisierte Mikrotiterplatten). Die 30 Seren (positiv oder negativ gegenüber dem L-Peptid) wurden parallel zu den Analogen RIa und RIb getestet. Man hat gezeigt, dass alle bei dem L-Peptid positiven Seren auch bei retro-inversen Peptiden positiv waren. Die Werte der optischen Dichte waren bei dem Analog RIb ( Fig. 7) signifikant höher. Interessanterweise haben von den 25 negativen Seren bei dem L-Peptid 10 mit dem RTb-Peptid reagiert (Fig. 6). Die durchschnittliche optische Dichte entspricht dem arithmetischen Mittel aller Werte für die optische Dichte, einschließlich der Werte unter dem Schwellenwert für die Positivität von 0,21 (Standardabweichung 0,25) und 0,51 (Standardabweichung 0,62) bei den Peptiden L beziehungsweise RIb.
Kompetitionstests wurden mit Seren von 11 Patienten durchgeführt, die im ELISA-Test direkt Werte für die optische Dichte angezeigt haben, die über oder gleich 0,40 bei dem Peptid RIb 277-291 waren. Wenn das Peptid L 277-291 als Inhibitor und das Peptid RIb als Antigen verwendet werden, um die Mikrotiterplatten zu sensibilisieren, hat man herausgefunden, dass das L-Peptid in alle Fällen eine inhibitorische Aktivität besaß. Gemäß den getesteten Seren hat man eine Inhibition von bis zu 75,8% festgestellt. Das homologe Peptid, das parallel unter den gleichen Bedingungen getestet wurde, hat die Bindung der Antikörper an das RIb-Peptid um bis zu 79,2% inhibiert.
Man hat auf diese Weise gezeigt, dass nicht nur das Peptid 277-291 RIb das L-Peptid mimikrierte, sondern auch, dass es von den Antikörpern der Patienten generell besser erkannt wird als das Ausgangspeptid. Diese Tatsache hat es erlaubt, die Anwesenheit von Antikörpern gegen das Antipeptid 277-291 in 50% der Seren der getesteten Patienten nachzuweisen, wohingegen nur 17% der Seren mit dem L-Peptid reagiert haben (Fig. 6).

3.4 Erkennung des retro-inversen Peptidanalogs des Peptids Ro60 304-324 durch die Seren autoimmuner Patienten.

Die Region 304-324 von Ro60 wurde vorher erkannt als eine Region, die ein Hauptepitop des Proteins enthält (Ricchiuti, V. und Muller, S. (1994) Use of peptides for the mapping of Bcell epitopes recognized by anti-Ro (SS-A) antibodies. In: D. A. Isenberg und A. C. Horsfall (Eds.), Autoimmune Diseases: focus on Sjögren's syndrome. Bios Scientific Publishers, Oxford, p. 101-106). Zwanzig Seren von Patienten, die an LED oder SS leiden, wurden zunächst mit den L-Analogen und retroinversen Analogen getestet. Sechs Seren (30%) haben mit dem L-Peptid reagiert (mittlere optische Dichte 0,21, Standardabweichung 0,26), wohingegen 15 Seren (75%) mit dem retroinversen Peptid reagieren (mittlere optische Dichte 0,81, Standardabweichung 0,54). Die Patientenseren haben geringfügig besser mit dem D-allo-Ile retro-inversen Analog reagiert, wie in Fig. 8 dargestellt: 16 Seren (80%) haben mit diesem letzten Analog (mittlere optische Dichte 0,81 m, Standardabweichung 0,50) reagiert.
Anschließend hat man getestet, ob die analogen Peptide Ro60 304-324, die ein N-terminales acetyliertes und ein Cterminales Carboxamid-Ende besitzen, von den Auto-Antikörpern erkannt werden. Wenn man dies mit der mit dem natürlichen L- Peptid gewonnenen Reaktivität vergleicht, so stellt sich heraus, dass das blockierte L-Peptid sehr viel besser von den Antikörpern der Auto-Immunpatienten erkannt wird (Fig. 8). Vierzehn Seren (70%) haben mit dem blockierten L-Peptid (mittlere optische Dichte 0,86, Standardabweichung 0,87) reagiert. Die mittlere optische Dichte und die Anzahl der positiven Seren werden noch erhöht, indem man das retro-inverse Analog, dessen terminale Enden blockiert sind (15/20 positive Seren, d. h. 75%; mittlere optische Dichte 1,15, Standardabweichung 0,97) verwendet. Gemäß den Seren ist die positive Reaktion mit dem retro-inversen blockierten Analog auch noch bei einer Verdünnung des Serums von 1 : 4000 nachweisbar. Die Bindung der Antikörper an das blockierte retro-inverse Analog kann gleichzeitig durch das homologe blockierte retro-inverse Analog sowie durch das heterologe blockierte L-Peptid inhibiert werden.
Es wurde erst kürzlich gezeigt, dass das Peptid 304-324 des Proteins Ro60, das eine kleine Struktureinheit in Fingerform des Zinks enthält, das radioaktive Zink in effizienter Weise bindet (Muller, S., Briand, J. P., Barakat, S., Lagueux, J., Poirier, G., De Murcia, G., und Isenberg, D. A. (1994) Autoantibodies reacting with poly(ADP-ribose) and with a zincfinger functional domain of poly(ADP-ribose) polymerase involved in the recognition of damaged DNA. Clin. Immunol. Immunopathol., 73: 187-196). Man hat damit verifiziert, dass die analogen Peptide und spezieller gesagt die retro-inversen Peptide in der Lage sind, das &sup6;&sup5;Zn zu binden. Wie in Fig. 9 dargestellt, bindet das blockierte L-Peptid ebenso wie die drei retro-inversen Analoge das &sup6;&sup5;Zn in effektiver Weise. Dieses Ergebnis impliziert, dass retro-inverse Analoge wie das natürliche L-Peptid leicht eine Fingerstruktur, die durch ein zentrales Zinkatom stabilisiert wird, das wiederum in tetrahedrischer Weise koordinativ abgelagert ist, bilden können, indem sie die beiden Zysteinreste und die beiden Histidinreste der Sequenz als Liganden verwenden (Reste 305, 309, 320 und 323; Fig. 8).

3.5 Erkennung des retro-inversen Analogs des Peptids 28-45 von H3.

Das Peptid 28-45 von H3 und sein retro-inverses Analog wurden mit autoimmunen Seren getestet. Aus vorhergehenden Studien ging nicht hervor, dass das Peptid 30-45 von H3 eine signifikante antigenische Aktivität besitzt (Muller, S., und Van Regenmortel, M. H. V. (1993), Histones. In: M. H. V. Van Regenmortel (Ed.), Structure of Antigens. CRC Press, Boca Raton, S. 149-178). Man hat in ELISA 69 Seren von Patienten, die an verschiedenen systemischen rheumatoiden Krankheiten leiden, einschließlich 22 Seren von an Lupus leidenden Patienten getestet. Von den 69 Seren sind 12 Seren (17,4%) positiv bei dem natürlichen L-Peptid 28-45 (8 von 22 LED-Seren), 20 Seren (29%) sind positiv bei dem blockierten L-Peptid 28-45 (12 von 22 LED-Seren) und 21 Seren (30,4%) reagieren mit dem blockierten retro-inversen Analog (12 Seren von 22 LED-Seren).

4. Diskussion.

Im Rahmen dieser Erfindung wird gezeigt, dass man retroinverse Peptide anstelle von natürlichen linearen L-Peptiden verwenden kann, um die Antikörper im Serum autoimmuner Patienten nachzuweisen. In allen in dieser Arbeit untersuchten Fällen (Antigen-Domänen 28-45 und 130-135 von H3, 277-291 von Ro52 und 304-324 von Ro60) hat man herausgefunden, dass die retro-inversen Peptide eine antigenische Aktivität besitzen, die mindestens gleich groß oder größer ist als die des natürlichen L-Peptid-Enantiomers. Diese Tatsache hat es erlaubt, überdies positive Seren nachzuweisen, die mit jedem Peptid reagieren und generell die Werte der optischen Dichte der individuellen Seren gegenüber von Peptidsonden in signifikanter Weise zu erhöhen, ohne den für normale Seren bestimmten Schwellenwert der Positivität zu ändern. Man muss festhalten, dass die Antikörper, die mit den retro-inversen Peptiden reagieren, nicht eine Untereinheit bestimmter in den Patientenseren enthaltener Antikörper darstellen, vorausgesetzt, dass die Bindung der Antikörper der Patienten an das retro-inverse Analog genauso gut durch die L-Peptide wie durch die retroinversen Peptide inhibiert wird. Diese neue Entwicklung der retro-inversen Peptide in der Diagnostik ist demzufolge sehr vielversprechend.
Wie bereits ausführlich oben dargelegt, beruht der Erfolg dieses Ansatzes auf einer totalen Kontrolle der Peptidsonden. So ist es angebracht, spezielles Augenmerk auf die Umkehrung der Ladungen der Enden, die die antigenische Reaktivität retro-inverser Peptide verändern kann, zu richten. Zum Beispiel sind viele biologisch aktive Peptid-Enantiomere, die in der Literatur wegen ihrer Verwendung in der Pharmakologie beschrieben werden, überhaupt nicht aktiv. Eine gewisse Anzahl von Ansätzen wurde ins Auge gefasst, um dieses Problem zu umgehen (Goodman, M., und Chorev, M. (1979) On the concept of linear modified retro-peptide structures. Acc. Chem. Res. 12: 1-7); (Chorev, M., und Goodman, M. (1993) A dozen years of retro-inverso peptidomimetics. Acc. Chem. Res., 26: 266-273). Zum Beispiel kann ein gem-Diaminoalkyl-Rest am N-terminalen Ende des retro-inversen Peptides eingeführt werden und die an 2 substituierte Malonsäure kann am carboxyterminalen Ende eingeführt werden. Dagegen sind die Monoacyl-gem- Diaminoalkyle hydrolisierbar, und man muss damit rechnen, dass die Halbwertszeit von Peptiden einschließlich solcher Reste zwischen 10 und 50 Stunden bei 25ºC beträgt (Loudon, G. M., Merrick, R. A. und Jacob, J. N. (1981) Mechanism of hydrolysis of N-(1-aminoalkyl)amides. J. Am. Chem. Soc., 103: 4508-4515). Folglich hat man im Falle der retro-inversen Peptide 130-135 von H3 und 277-291 von Ro52 ein Carboxamid-Ende anstelle einer freien Aminogruppe der Ausgangspeptide gewählt. Die an C-2 substituierte Malonsäure ist in diesen Peptiden in razematischer Form eingebaut, um das C-terminale Ende von L-Peptiden zu mimikrieren. Man muss zeigen, dass man im Falle des retro-inversen Analogs von Ro60 304-324 herausgefunden hat, dass das retro-inverse Analog mit den nichtbloekierten inversen terminalen Enden besser erkannt wurde als das L-Peptid (Fig. 8), was zu der Annahme führt, dass für dieses spezielle Peptid gilt, dass sich die Inversion der terminalen Gruppen nicht auf seine Antigenizität auswirkt.
Im Vergleich zu den Ausgangspeptiden, die freie N- und Cterminale Enden besitzen, hat man herausgefunden, dass die blockierten Peptide 304-324 von Ro60 und 28-45 von H3 besser von den Antikörpern der Autoimmunseren erkannt werden. Dies könnte mit der Tatsache zusammenhängen, dass die Antikörper wahrscheinlich gegen die mit anderen Proteinen oder Nukleinsäuren (ADN oder ARN) komplexierten Proteine induziert wurden. Wenn die internen Sequenzen in der Primärstruktur des Proteins speziell von den Auto-Antikörpern erkannt werden, ist es möglich, dass die Peptide, die blockierte Amino- und Carboxylgruppen enthalten, die interne Region des Proteins besser mimikrieren (Gras-Masse, H. S., Jolivet, M. E., Audibert, F. M., Beachey, E. H., Chedid, L. A. und Tartar, A. L. (1986) Influence of COHN&sub2; or COOH as C-terminus groups on the antigenic characters of immunogenic peptides. Molec. Immunol., 23: 1391-1395). Im Zusammenhang mit dem weiter oben Gesagten und in Bezug auf das Vorhandensein von inversen terminalen Enden in den blockierten retro-inversen Analogen hat man erneut herausgefunden, dass sich die Inversion der terminalen Enden nicht auf die Antigenizität auswirkt. Es wird hingegen angeraten, dieses Ergebnis bei jedem neu getesteten Peptid zu überprüfen.
Die Anwesenheit von Threonin- und Isoleucinresten, die zwei chirale Zentren besitzen, kann auch ein Problem darstellen, wenn es darum geht, die korrekte Chiralität der retroinversen Verbindung zu respektieren. Da das Peptid Ro60 304- 324, das zwei Isoleukinreste in Position 319 und 324 enthält, wurden zwei retro-inverse Analoge entweder mit D-Ile oder mit D-allo-Ile synthetisiert, und man hat herausgefunden, dass das retro-inverse Analog D-allo-Ile etwas besser von Antikörpern der Patienten erkannt wurde als das retro-inverse Analog, das die D-Ile-Reste enthält. Man muss hingegen beachten, dass die beiden Peptide 277-291 von Ro52 und 28-45 von H3 2 Threoninreste enthalten und dass sich diese Tatsache offensichtlich nicht auf ihre antigenische Aktivität auswirkt.
Letztendlich kann das retro-inverse Analog bei Peptiden, die Prolinreste enthalten, in diesem Stadium lokale konformationsbedingte Zwänge darstellen (Goodman, M., und Chorev, M, (1979) On the concept of linear modified retropeptide structures. Acc. Chem. Res. 12: 1-7); (Chorev, M., und Goodman, M. (1993) A dozen years of retro-inverso peptidomimetics. Acc. Chem. Res., 26: 266-273), die die Bindung des retro-inversen Peptids an den Antikörper beeinflussen können. Geht man davon aus, dass das retro-inverse Peptid von Ro60 304-324, das einen Prolinrest in Position 321 enthält, sehr gut von den Autoantikörpern erkannt wird und effektiv Zink binden kann, so führt dies zu der Annahme, dass dieser Prolinrest 321, der in der Fingerstruktur von Zink anwesend ist (Fig. 8) nur dazu dient, die beiden Histidinreste in einer angemessen Distanz zu halten und dass es weder die Bindung der metallischen Ionen noch die Interaktion mit den Antikörpern gefährdet. Tabelle 6 Tabelle 7 Reaktivität in $LISA von Seren an Lupus erkrankter Mäuse mit dem natürlichen C-terminalen Peptid 130- 35 des Histons H3 und mit dem retro-inversen Peptid.
Mikrotiterplatten werden direkt mit Peptid-BSA Konjugaten (2 uM im Peptid ausgedrückt) bedeckt. Die Mäuseseren werden im Verhältnis 1:500 verdünnt, und man inkubiert sie in den Vertiefungen eine Stunde lang wie in Benkirane, N., Friede, M., Guichard, G., Briand, J. P., Van Regenmortel, M. H. V. und Muller, S. (1993) Antigenicity and immunogenecity of modified synthetic peptides containing D-amino acid residues. J. Biol. Chem., 268: 26279-26285) beschrieben. Das Ziege-anti-Maus IgG, das an die Raifort-Peroxydase konjugiert ist und zur Sichtbarmachung der Reaktion dient, wird im Verhältnis 1 : 5000 verdünnt. Die Ergebnisse werden in Werten der optischen Dichte ausgedrückt und die Messungen ergeben 450 nm.

Beispiel 3

Retro-inverse Peptide und Vakzin.

Zur Veranschaulichung auf dem Gebiet der Impfung hat die Erfindung spezieller vollständig retro, teilweise inverse Peptide zum Gegenstand, die dem Hauptantigendeterminanten, die sich auf dem Protein VP1 des Virus der Maul- und Klauenseuche (foot-and-mouth disease virus, FMDV, in Englisch) befindet, entsprechen.
Die Maul- und Klauenseuche bleibt eine der Haupttierkrankheiten, von der Rinder, Schafe und Ziegen betroffen sind, und sie kann zu beträchtlichen wirtschaftlichen Verlusten führen. Obwohl diese Krankheit selten zum Tod des Tiers führt, bleiben die Produktionsausfälle sehr hoch, und die zahlreichen Nachwirkungen erfordern die Schlachtung der Tiere.
Das FMDV gehört zur Familie der Picornaviren, das die einfachsten Viren vereint, die man kennt. Nur ein chemischer Ansatz hat es erlaubt, die exakte Struktur des FMDV zu verstehen: die Hülle setzt sich zusammen aus einer Verbindung von 60 Kopien eines jeden der 4 Proteine, die VP1, VP2, VP3, und VP&sub4; genannt werden. Man weiß heute, dass das Protein VP1 die Synthese der neutralisierenden Antikörper (Ac) auslöst.
Die Vakzine bestehen klassischerweise in zwei Formen, abgeschwächt oder deaktiviert, aber ihre Herstellung und ihre Manipulation stellen zahlreiche Probleme dar. Seit einiger Zeit steht eine neue Generation von Vakzinen, die - verglichen mit traditionellen Produkten - sicherer und stabiler sind, unmittelbar vor dem Durchbruch. So haben im Falle des FMDV mehrere Forschergruppen die Möglichkeit untersucht, dank der Gentechnologie große Mengen des VP1 Proteins produzieren zu lassen.
Dagegen sind die für die Einleitung eines Tierschutzes benötigten Dosen, wie für das natürliche Protein VP1, das isoliert ist von den viralen Partikeln, noch immer zu hoch.
Parallel wurde ein anderer Ansatz verfolgt, der darin bestand, durch chemische Synthese das Fragment 141-160 des Proteins VP1 zu imitieren. Dieses Fragment entspricht tatsächlich einer bestimmten Region des Proteins VP1, auf der sich der oder die neutralisierenden Antikörper speziell ablagern. Auf der anderen Seite induziert dieses Peptid, das an ein Trägerprotein gekoppelt ist, bei den Versuchstieren eine Immunantwort in der Weise, dass das immunisierte Tier gegen die Maul- und Klauenseuche geschützt ist (diese Tiere stellen ein sehr gutes biologisches Modell für die Untersuchung der Krankheit dar). Es wurde festgestellt, dass eine einzige Injektion von konjugiertem Peptid ausreichend war, um die infizierten Tiere zu schützen.
Grundlegende Untersuchungen werden hingegen noch notwendig sein, um diesen Synthesepeptiden ihre gesamte Wirksamkeit als Vakzine zu geben. Es stellt sich tatsächlich oftmals als schwer oder sogar unmöglich heraus, ausreichende Ac-Titer von Anti-Peptiden zu gewinnen. Dies könnte mit Stabilisationsproblemen eines "optimalen" Aufbaus einer linearen Sequenz sowie einem schnellen Abbau der injizierten Peptide beim Tier zusammenhängen. Im Rahmen der Erfindung wurde demnach die Untersuchung der antigenischen und immunogenischen Eigenschaften retro-inverser Analoge (RI), die aus der immundominanten Schleife der drei Varianten des Sereotyps A12 des FMDV stammen, durchgeführt. Die Sequenzen dieser Peptide und entsprechenden RI-Analoge sind in Tabelle 8 dargestellt (Anmerkung: die Ausgangssequenz des untersuchten Peptids deckt die Region 141-159 ab; ein Zysteinrest wird in N-terminaler Position an die Kopplungsenden angefügt) TABELLE 8 Sequenzen synthetischer Peptide (Region 141-159), die aus der immundominanten Schleife der drei Varianten des Sereotyps A12 des Maul- und Klauenseuchevirus (FDV) stammen.
Sequenzen der entsprechenden retro-inversen Analoge
HO-m(R oder S)Leu-q-r-a-v-r(*)-a-1-s-G-(**)-d-G-r-v-G-s-G-c-NH&sub2;
(**): f f s
(*): p l l
Die Untersuchung besteht aus drei Teilen:

1) Untersuchung der antigenischen Eigenschaften der Analoge.

Man verfügt über Seren von Versuchstieren, die gegen das Virus ("Anti-virion") immunisiert sind, das Protein VP1 ("Anti- Protein VP1"), gegen das Peptid 141-159 (Variante USA; FP- Anti-Peptid") sowie über das Serum von Versuchstieren, die mit dem Virus infiziert sind ("konvaleszent"). Normales Serum (Negativcharge) von Versuchstieren dient als Referenzlösung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Die beiden Diastereomere RIa und RIb wurden separiert, durch HPLC gereinigt und separat in ELISA getestet. Das Isomer R1, das am schnellsten in HPLC eluiert wird, wird RIa genannt, das zweite eluierte Pik (das am wenigsten schnell eluierte Isomer) schließt das RIb genannte Isomer ein. Es werden lediglich die Ergebnisse im FP-System gezeigt.
Es ist festzustellen, dass die R1-Analoge genauso gut und oft auch besser erkannt werden als das Ausgangs-FP-L-Peptid. Die Ergebnisse sind analog im Falle der Peptide FL und SL.
Die Inhibitionsuntersuchungen wurden in BlAcore durchgeführt. In Tabelle 10 sind die Analogmengen gezeigt, die benötigt werden, um 50% der Bindung diverser Antikörper an das Ausgangspeptid FP-L auf der Dextranmatrize (durch Zystein) zu inhibieren. In dieser Experimentreihe hat man den Effekt der Position in N-t oder C-t des Zysteins untersucht sowie den Effekt des Blockierens der C-t oder der beiden N- und C-t- Enden.
Man muss feststellen, dass die blockierten oder nichtblockierten R1-Analoge genauso kompetitiv sind wie das FP-L- Ausgangspeptid. TABELLE 9 Reaktivität in ELISA mit dem Ausgangspeptid und den retro-inversen Analogen der Antiseren der Versuchstiere Anti-Peptid 141-159 (FMDV, Serotyp A12, Variante USA), Anti-Protein VP1 und Antivirion und von Seren konvaleszenter Versuchstiere. TABELLE 10 Erkennung des FP-Peptids und der Analoge durch die polyklonalen Antikörper im BIAcore-Kompetitionstest

2) Untersuchung der immunogenischen Eigenschaften der Analoge.

Man hat das Ausgangspeptid (-L) und die Analoge RIa und RIb Kaninchen gespritzt und die Antwort bezüglich der homologen Peptide in ELISA gemessen.
Die Ergebnisse werden anhand des Peptids FL in Tabelle 11 gezeigt. Man muss feststellen, dass das Peptid FL-RIb beim Kaninchen "Cannes" um das 8-Fache erhöhte Antikörpertiter induziert hat. Des Weiteren fällt der Titer beim Kaninchen "Cannes" langsam ab, obwohl das Tier nicht mehr reimmunisiert wurde, während er sehr schnell beim Anti-Peptid FL-L ("Antibes") abfällt und am Tag 143 Null erreicht (in demselben Augenblick beträgt der Antikörpertiter beim Kaninchen "Cannes" noch 6000). TABELLE 11 Test in ELISA der Seren gegen das Ausgangspeptid FL und die Analoge R1 des Peptids FL immunisierter Kaninchen.
(1) die Kaninchen wurden an den Tagen 0, 14, 30, 43 und 58 mit den analogen Peptiden (60 ug/Injektion), die mit sehr kleinen unilamellaren Liposomen kovalent gekoppelt sind und Monophosphoryl Lipid A als Adjuvans enthalten (sub-kutane Injektionen), immunisiert.
(2) Tage nach der ersten Injektion.
(3) Die Werte sind als Titer (größte Verdünnung des Serums, bei welcher der Absorbierungswert in ELISA 1,0 beträgt) ausgedrückt. Die Blutabnahmen werden in ELISA unter Verwendung von 2 uM der Peptid-BSA-Konjugate getestet, um die Platten zu sensibilisieren. Testprinzip:
SPDP = N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
Man hat nach demselben Prinzip, das in Tabelle 10 dargestellt ist, die Erkennung der verschiedenen Analoge durch die Antipeptid-Antikörper des Kaninchens getestet, indem man die Analoge in Lösung im BIAcore verwendet hat (Tabelle 12, Kompetitionstest). TABELLE 12 Erkennung des Peptids FL und der Analoge durch polyklonale Antikörper im BIAcore Kompetitionstest.
Die Antiseren der Kaninchen wurden um Verhältnis 1 : 2 Verdünnt.
Es sei angemerkt, dass die Ac Anti-FL die Peptide der Serie FL und der Serie FP gleichermaßen gut erkennen und dass eine Kreuzreaktion zwischen den Peptiden L, RIa und RIb der beiden Serien FL und FP stattfindet.

3) Untersuchung der immunogenischen Eigenschaften der Analoge: neutralisierende Antwort

Die Peptide FP-L und RIb wurden Versuchstieren injiziert, und man hat die neutralisierende Antwort auf den Virus in vitro gemessen. Die verwendeten Zubereitungen entsprechen den analogen Peptiden, die den Liposomen des Typs 'kleine unilamellare Liposomen' entsprechen, und sind gemäß dem von Benkirane et al. beschriebenen Verfahren (J. Biol. Chem., 268: 26279- 26285, 1993) hergestellt. Der Neutralisationstest wurde gemäß Francis und Black (1983) J. Hyg. Camb., 91: 329-334 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt. TABELLE 13 Ergebnisse der in-vitro-Neutralisation der 1. und 2. Blutabnabme (3 Tiere pro Peptid)
Injektion: Tag 0
1. Blutabnahme: Tag 20
2. Injektion: Tag 43
2. Blutabnahme: Tag 74
Die Ergebnisse sind in log&sub1;&sub0; ausgedrückt und entsprechen der Differenz zwischen dem Titer des mit dem normalen Serum inkubierten Virus und jenem des mit dem Serum des immunisierten Versuchstiers inkubierten Virus (Verdünnung der Seren 1/20).
Die Tests wurden im Labor von Professor F. Brown (Amerikanische Landwirtschaftsabteilung, Zentrum für Tierkrankheiten von Plum Island, Greenport, NY 11944, USA) durchgeführt.
Man stellt fest, dass die Wirksamkeit des Peptids FP-L jener desselben vorhergehend beschriebenen Peptids ähnelt (Rowlands et al., Nature, 306: 694-697, 1983) und dass diese Ergebnisse mit dem Peptid FP-R1 exakt wiederholt werden.

Beispiel 4

Therapeutische Immunmodulation.

Kürzlich wurde das Phänomen des TCR-Antagonismus (T- Zellrezeptor) durch analoge Peptide des T-Epitops gezeigt, und die Verwendung spezieller TCR-Antagonisten wurde beschrieben (De Magistris, M. T., Alexander, J., Coggeshall, M., Altmon, A., Gaeta, F. C. A., Grey, H. M. und Sette, A. (1992) Cell 68: 625). Diese Peptide sind in der Lage, die Verbreitung der T-Zellen, die durch ein Antigen induziert wurde, zu inhibieren. Solche Peptidantagonisten werden durch Substitution einer Aminosäure von Resten des Peptidantigens in Kontakt mit der T-Zelle gewonnen oder besser durch Einbauen der Reste, die Kontakt mit TCR haben, in eine Polyalaninsequenz.
Die vorliegende Erfindung ist in der Weise neuartig, dass sie exakt die Verwendung von Immunretroiden, die Peptidantagonisten oder TCR-Antagonisten entsprechen, für die Gewinnung von "Medikamenten" für die virale Behandlung (antagonistischer Effekt auf die T-Helferzellen) oder für die Behandlung autoimmuner Krankheiten (antagonistischer Effekt auf die T- Helferzellen oder englisch "Helper" zum Beispiel) zum Gegenstand hat.
Man hat teilweise retro-inverse Immunoretroide eines zytotoxischen T-Epitops (Epitop 56-68) der Matrize des Grippevirus, das durch das Molekül HLA-A2 (Molekül der Klasse I) erkannt wird, als Beispiel genommen. In dieser Arbeit hat man systematisch eine Amidbindung des Ausgangspeptids eins zu eins durch retro-inverse Bindungen ersetzt. Die Pseudopeptide, die dieser Untersuchung gedient haben, wurden durch die Methode in Lösung wie oben beschrieben synthetisiert. Die Liste dieser Peptide ist in Fig. 10 dargestellt. Die Terminologie a, b wurde verwendet, wenn die beiden optischen Isomere durch HPLC separiert werden konnten. In Fig. 10 zeigt der Inhalt der vorhergehenden Klammer M58-66 die Position der retroinversen Bindung an. Als Beispiel für das Peptid GG5, [gLeu&sup6;&sup0;-mGly&sup6;¹] bedeutet M58-66, dass die retro-inverse Bindung zwischen der Aminosäure 60 und der Aminosäure 61 besteht. Man muss anmerken, dass falls in Syntheseeinrichtungen die retro-inverse Bindung Gly-Ile betrifft, Ile durch Leu ersetzt worden ist (siehe Peptide GG0a und GGOb), und wenn die retro-inverse Bindung aPhe-Thr betrifft, Thr durch Ala ersetzt worden ist (siehe Peptid GG11) diese Mutation die Bindung an das HLA-Molekül nicht beeinflusst.
Man hat zu Beginn die Interaktion eines jeden Immunretroiden mit dem Präsentationsmolekül des Peptids HLA-A2 untersucht, anschließend wurde jedes Peptid, das in der Lage war, sich zu binden, auf Inhibitionskapazitäten oder Aktivierung der zytotoxischen T-Antwort getestet.
Der erste Test (Bindungstest der Peptide an das Molekül HLA- A2) wird wie folgt durchgeführt:

1. Quelle des HLL-A2

1.1 Ab der Zelllinie T2.

T2 ist eine Variante der Linie T1, die durch die Fusion einer Zelle eines T-Lymphoms (CEM) und einer lymphoblastoiden Zelllinie von B-Lymphoblastoiden (721,174) entsteht. Durch Immunofluoreszenz entdeckt man praktisch keine HLA-Moleküle der Klasse I an der Oberfläche der T2. Dies beruht auf einer Mutation, die die Abwesenheit der Peptidträger im endoplasmatischen Retikulum bewirkt. Da keine Peptide zur Stabilisierung der Bindung der schweren Kette und β2Mikroglobulin (β2 m) - außer vielleicht einiger endogener Signalpeptide - vorhanden sind, betrachtet man diese Zellen als eine exzellente Quelle der "leeren" HLA-Moleküle der Klasse I, die bereit sind, exogene Peptide auf ihrer Akzeptorseite aufzunehmen.
Die HLA-Moleküle werden stabilisiert, indem man exogenes Peptid hinzufügt.

1.2 Ab den gereinigten HLA-Molekülen.

1.2.1 Reinigung der HLA-Moleküle der Klasse I.

Die HLA-Moleküle wurden auf einer Affinitätssäule ab den durch das Epstein-Barr-Virus (EBV) immortalisierten lymphoblastoiden B-Zellen gereinigt. Zu diesem Zweck wurden die Zellen in einem Tris-HCl 50mM, NaCl 150 mM, EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 5 nM, Nonidet P40 (NP40) 0,5%- Puffer, der Proteaseinhibitoren enthält, lysiert. Die Lysaten wurden anschließend durch eine Säulenreihe geleitet, auf denen Anti-HLA Antikörper fixiert waren. Man hat durch Elution in basischem pH die MHC-Moleküle, die an diesen Affinitätsreihen fixiert waren, wiedergewonnen.

1. 2.2 Denaturierung der HLA-Moleküle der Klasse I.

Die gereinigten HLA-Moleküle der Klasse I müssen ihrer endogenen Peptide "entleert" worden sein, bevor sie auf ihre Bindung mit exogenen Peptiden getestet werden können. Zu diesem Zweck führt man eine Denaturierung mit NAOH 12,5 mM, Harnstoff 1,5 mM, Bovinserumalbumin (BSA) sehr rein (Sigma) 1% 1 Stunde bei 4ºC durch. Die schweren Ketten werden nachdem sie die denaturierten HLA-Moleküle auf der Säule G25/PD10 Sephadex (Pharmacia) passiert haben, wiedergewonnen. Die Peptide, die einen neuen Tri-Komplex mit der schweren Kette und der β2 m bilden könnten, werden durch Retention in der Säule eliminiert. Die leichten Ketten (32 m (12 kd) müssten mit den schweren Ketten aus der Säule fallen (Ausnahme < 10 kd), aber da einige potenziell zurückgehalten werden, fügt man in einem zweiten Schritt exogenes β2 m (2 ug/ml, SIGMA) hinzu.

2. Antikörper.

Die folgenden monoklonalen Antikörper wurden eingesetzt, um die schweren Ketten der HLA-Moleküle im Laufe der Etappen der Affinitätschromatographie und anlässlich des Punktes 3 unten, abzufangen:
- W6/32 und 89.12.1, die gegen alle HLA-Typen gerichtet sind, aber die bestimmte Epitope erkennen,
- B1.23.2 für die HLA-B,
- BB7,2, spezifisch von HLA-A2,
- A11.1, spezifisch von HLA-A3, All und A24,
- M28, das das β2 m erkennt.

3. Nachweis der 8LA-Peptidbindung.

- Mit den defizienten Zellen in Peptidträgern: 800 000 Zellen wurden 1 Stunde bei 37ºC in einem Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Nonidet P40 0,5%-Puffer mit Proteaseinhibitoren in Anwesenheit oder Abwesenheit von exogenen Peptiden in der gewünschten Konzentration lysiert. Nach der Zentrifugation wurden die auf der Oberfläche schwimmenden wiedergewonnen und auf 200 ul aufgefüllt mit einem Phosphat-Salin-Puffer (PBS) Tween 0,05%, BSA 1%, PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) 1 mM, Trypsininhibitor (T1) 10 mg/ml.
- Mit gereinigtem und denaturiertem HLA: aliquote Fraktionen von 1 ug von HLA wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit eines exogenen Peptids in der gewünschten Konzentration 24 Stunden oder 48 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die Renaturierungsprodukte wurden auf ein Volumen von 200 ul mit PBS Tween 0,05%, BSA 1%, PMSF 1 mm, TI 10 mg/ml gebracht.
In allen Fällen wurden die Proben eine Nacht lang bei 4ºC in doppelter Ausführung von 100 ul in den Vertiefungen der mit den spezifischen monoklonalen Antikörper der schweren Ketten der untersuchten HLA sensibilisierten Mikroplatten gelagert. Diese Antikbrper wurden vorher bei 10 ug/ml in PBS 2 Stunden lang bei 37ºC oder über Nacht bei 4ºC immobilisiert, anschließend wurde eine Saturierung mit PBS, das 1% BSA enthält, 1 Stunde lang bei 22ºC durchgeführt.
Da die Fixierung von 2 m an die schwere Kette eines HLA nur dann durchführbar ist, wenn ein Peptid vorhanden ist, um den Komplex zu stabilisieren, entwickelt man ausschließlich die HLA, die dank des Antikörpers M28 ein Peptid gebunden haben. Dieser Anti-β2 m-Antikörper ist an die alkaline Phosphatase gekoppelt. Die Anwesenheit des Enzyms und somit des Antikörpers wurde durch dessen Aktion auf dem p-4-Methyl- Umbelliferyl (MuP, Sigma), das in Methyl-Umbelliferon umgewandelt wird, offenbart. Letzteres sendet bei einer Stimulation von 405/492 nm ein fluoreszierendes Signal aus. Die Ablesung wurde mit einem Fluoscan (Millipore) Gerät durchgeführt.
Fig. 11 fasst das Nachweisprinzip zusammen.
Die Ergebnisse werden in Fig. 12 gezeigt: Man sieht, dass das retro-inverse Peptid GGOa mindestens genauso aktiv ist wie das Ausgangspeptid M58-66 (die Peptide Leu 59 und Ala 65, die die Wechsel Ile→Leu in Position 59 und Thre→Ala in Position 65 umfassen, sind ebenfalls sehr aktiv). Die Analoge R1 GG0b, GG7, GG10 und GG11 sind etwas weniger aktiv, aber verbinden sich in auffallender Weise mit dem HLA-A2-Molekül. Die anderen Analoge R1 (GG1, GG5, GG8 und GG12) verbinden sich nicht mit dem HLA-A2-Molekül.
Um in der Immunmodulation effizient zu sein, ist es nicht ausreichend, dass sich ein Peptid an das HLA-Molekül bindet, es muss auch vom TCR erkannt worden sein. Der zweite Test ist demnach ein biologischer Test mit dem folgenden Prinzip:
Die Ergebnisse werden in Fig. 13 gezeigt: Das Peptid GG0a ist in Bezug auf die Inhibition der Zytolyse mindestens genauso effizient (wenn nicht sogar effizienter) wie das Peptid M58-66. Das Peptid GG10 ist weniger effizient. Das Peptid GG7 induziert keine Zytolyse. Dieses letzte Peptid ist demnach genauso interessant wie das GG0a. Man hat daraus geschlossen, dass das GG0a ein sehr guter Zytolyseagonist zu sein scheint und dass das GG7 ein Zytolyseantagonist sein könnte.

Claims

1. Verwendung

* von Verbindungen vom Peptidtyp,

von denen wenigstens eine der -CO-NH-Bindungen, und vorteilhafterweise alle -CO-NH-Bindungen, der Peptidkette des entsprechenden Ausgangspeptids, (welches keine -NH-CO-Bindung in seiner Peptidkette enthält), durch eine (mehrere) -NH-CO- Bindung(en) ersetzt wird (werden), wobei die Chiralität jedes Aminoacylrestes, welcher entweder in eine oder mehrere der vorher erwähnten - NH-CO-Bindungen eingeschlossen ist oder nicht, im Vergleich zu den entsprechenden Aminoacylgruppen, die das Ausgangspeptid bilden, umgekehrt ist, wobei diese Verbindungen vom Peptidtyp auch als "retroinverse" Peptide bezeichnet werden, wobei diese retro-inversen Peptide von Ausgangspeptiden abgeleitet werden, welche der folgenden Formel (I) entsprechen:

X-AA1-(AA2----AAn-1)i-AAn-Y (I)

in der:

- AA1 eine Aminoacylgruppe darstellt, welche desaminiert werden kann und deren Aminfunktionalität am α-Atom, falls sie vorhanden ist, durch eine Gruppe X geschützt werden kann, wobei X P-, R- oder RCO- darstellt,

- i = 0 oder 1 ist,

- falls i = 0 ist, n 2 darstellt, und falls i = 1 ist, n eine ganze Zahl zwischen 3 und 1000, bevorzugt zwischen 5 und 100, darstellt, wenn n = 3 ist, entspricht das entsprechende retro-inverse Peptid der Formel AA1-AA2-AA3,

- AAn eine Aminoacylgruppe darstellt, die decarboxyliert werden kann und deren Säurefunktionalität am α-Atom, falls sie vorhanden ist, eventuell durch eine Gruppierung Y geschützt wird, wobei Y vom Estertyp ist: -OR oder Amid, -NH&sub2; oder NRR', wobei

die Gruppen R, R' Wasserstoffatome, Alkylradikale mit 1 bis 25 Kohlenstoffatomen, Radikale mit einer Allylgruppe mit 3 bis 25 Kohlenstoffatomen oder Radikale mit einer Arylgruppe mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen sein können, und insbesondere -CH&sub3; (Methyl), -CH&sub2;CH&sub3; (Ethyl), -CH(CH&sub3;)&sub2; (Isopropyl), - C(CH&sub3;)&sub3; (tertiäres Butyl), -Q (Phenyl), -CH&sub2; (Benzyl), -CH&sub2;-CH&sub2; (2-Phenylethyl), -CH&sub2;CHCH&sub2; (Allyl), Methylfluorenyl, -CH&sub2;CONH&sub2; (Glykolamid), CH&sub2;CONΦ&sub2; (Benzylhydroglykolamid), wobei diese Liste nicht begrenzend ist, wobei

die Gruppe P vom Urethantyp ist (Boc (tertiäres Butyloxycarbonyl), Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl), Z (Benzyloxycarbonyl), CH&sub2;CHCH&sub2;OCO- (Alloxycarbonyl) oder andere), und in diesen Ausgangspeptiden der Formel (I) wenigstens eine der Bindungen zwischen zwei Aminoacylresten der Formel (I) eine -NH-CO-Bindung ist, und gegebenenfalls wenigstens einer der Aminoacylreste AA1 bis AAn eine zu dem entsprechenden Aminoacylrest im Ausgangspeptid entgegengesetzte Chiralität hat, und insbesondere die retro-inversen Peptide der folgenden Formel (II) entsprechen:

A-CH(Ri)-NH-[CO-CH(Rk)-NH]j-i-CO-CH(Rj+1) -B (II)

in der:

- Ri, Rk, Rj+1 die Seitenketten der an einer oder mehreren -NH-CO--Bindungen beteiligten Reste darstellen,

- die Gesamtanzahl der Reste der Sequenz auf n festgesetzt ist, wobei n eine ganze Zahl größer als 1 und bevorzugt 3 bis 1000 und bevorzugt 3 bis 100 ist,

- i, j, k die folgendermaßen definierten Parameter sind:

1 ≤ i ≤ j ≤ n,

wobei k = 0 ist, falls i = j ist und k die Werte i+1 bei j annimmt, wobei sie vier Möglichkeiten der Konfiguration bezüglich der Art der Blöcke A und B aufweisen können:

1/ i = 1 und j+1 = n:

A = H-, H&sub2; N-, P-HN-, RR'N-, H&sub2;NCO-, RR'NCO-, RCO-

B = H-, -COOH, -COOR, -CONH&sub2;, -CONRR', -NHCOR,

2/ i = 1 und j+1 ≠ n:

A = H-, H&sub2;N-, P-HN-, RR'N-, H&sub2;NCO-, RR' NCO-, RCO-

B = -CO-NH-CH(Rj+2)-CO-...-NH-CH(Rn) -CO-Y

mit Y = -OH, -OR, NH&sub2;, -NRR',

3/ i ≠ 1 und j+1 = n:

A = X-HN-CH(R&sub1;)-CO-...-NH-CH(Ri-1)CO-NH-

mit X = H-, P-, R-, RCO-

B = H-, -COOH, -COOR, -CONH&sub2;, -CONRR', -NHCOR,

4/ i ≠ 1 und j+1 ≠ n:

A = X-HN-CH(R&sub1;)-CO-...-NH-CH(Ri-1)CO-NH-

mit X = H-, P-, R-, RCO-

B = -CO-NH-CH(Rj+2)-CO-...-NH-CH(Rn)-CO-Y

mit Y = -OH, -OR, NH&sub2;, -NRR', wobei

die Gruppen R, R' Wasserstoffatome, Alkylradikale mit 1 bis 25 Kohlenstoffatomen, Radikale mit einer Allylgruppe mit 3 bis 25 Kohlenstoffatomen oder Radikale mit einer Arylgruppe mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen sein können, und insbesondere -CH&sub3; (Methyl), -CH&sub2;CH&sub3; (Ethyl), -CH(CH&sub3;)&sub2; (Isopropyl), - C(CH&sub3;)&sub3; (tertiäres Butyl), -Φ (Phenyl), -CH&sub2;Φ (Benzyl), -CH&sub2;-CH&sub2;Φ (2-Phenylethyl), -CH&sub2;CHCH&sub2; (Allyl), Methylfluorenyl, -CH&sub2;CONH&sub2; (Glykolamid), CH&sub2;CONΦ&sub2; (Benzylhydroglykolamid), wobei diese Liste nicht begrenzend ist, wobei

die Gruppe P vom Urethantyp ist (Boc (tertiäres Butyloxycarbonyl), Fmoc

(Fluorenylmethyloxycarbonyl), Z (Benzyloxycarbonyl), CH&sub2;CHCH&sub2;OCO- (Alloxycarbonyl) oder andere), wobei die Chiralität jedes Aminoacylrestes, welcher entweder in eine oder mehrere -NH-CO-Bindungen eingeschlossen ist oder nicht, im Vergleich zu den entsprechenden Aminoacylgruppen, die das Ausgangspeptid bildenden, umgekehrt ist, oder

* von gegen die oben erwähnten retro-inversen Peptide gerichteten Antikörpern (anti-retro-inverse Antikörper),

wobei die retro-inversen Peptide mit den oben erwähnten anti-retro-inversen Antikörpern sowie mit den gegen die Ausgangspeptide oder -proteine gerichteten Antikörpern (bezeichnet als anti-Ausgangs-Antikörper) einen Komplex bilden können für die Herstellung:

-- eines Medikaments, für die Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen viralen oder bakteriellen Ursprungs oder von Autoimmunkrankheiten oder neurodegenerativen Erkrankungen,

-- eines Medikaments, für die Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen mit Beteiligung der Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes und/oder der T- Zell-Rezeptoren,

oder für die in vitro-Anwendung eines diagnostischen Verfahrens für die vorher erwähnten Krankheiten.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Krankheiten ausgewählt sind aus:

-- den Krankheiten mit Beteiligung von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes und/oder der T-Zell- Rezeptoren,

-- den Autoimmunerkrankungen, insbesondere die Hashimoto-Thyroiditis, die Basedow-Krankheit, die Addison-Krankheit, die Hypophyseninsuffizienz, die Biermer-Gastritis, bestimmte Sterilitäten, juveniler Diabetes vom Typ 1, das Goodpasture-Syndrom, die Myasthenie, der akute Gelenkrheumatismus, der Pemphigus, das bullöse Pemphigoid, die Dermatitis herpetiformis, die Vitiligo, die Pelade, die Psoriasis, die Ophthalmia sympathica, die Uveitis, das Guillain-Barre-Syndrom, Multiple Sklerose, die hämolytische Anämie, die idiopathische thrombozytopenische Purpura, die idiopathische Leukopenie, die primäre biliäre Zirrhose, die aktive chronische Hepatitis, die hämorrhagische Rektocolitis, die Crohn-Krankheit, das Gougerot-Sjögren- Syndrom, die rheumatoide Polyarthritis, der Dermatomyositis-Polymyositis-Komplex, die Sklerodermie, das Sharp-Syndrom (connectivite mixte), der diskoide Lupus erythematodes, der systemische Lupus erythematodes,

-- den neurodegenerativen Erkrankungen

-- den Erkrankungen mit viralem Ursprung, insbesondere:

- AIDS, ausgelöst durch das Virus der humanen Immunschwäche HIV-1 und HIV-2,

- die mit HTVL-1 verbundene Paraplegie, oder die adulte T-Zell-Leukämie, ausgelöst durch das Virus der humanen T- Zell-Lymphome (Virus: HTLV),

- die durch das respiratorische Synzytial-Virus ausgelösten Infektionen,

- die durch das Coxsackie-Virus ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die akute lymphozytäre Meningitis,

- die durch das Epstein-Barr-Virus ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die infektiöse Mononukleose,

- die durch das Zytomegalie-Virus ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die Einschlusskörperchen- Krankheit,

- der Herpes, ausgelöst durch das humane Herpes-Virus,

- der Herpes, ausgelöst durch das humane Herpes simplex- Virus 6,

- die durch das humane Parvovirus B19 ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die gastro-enteralen Infektionen,

- die durch das Hepatitis B-Virus ausgelöste Hepatitis B,

- die durch das Hepatitis C-Virus ausgelöste Hepatitis C,

- die durch das Influenza-Virus ausgelöste Grippe,

- die durch das Rötelvirus ausgelösten Röteln,

- die durch das Dengue-Virus ausgelösten Infektionen, zum Beispiel die Arbovirosen,

- durch die Rhinoviren ausgelöste Erkältung, Rhinitis und Schnupfen,

- die durch das Maul- und Klauenseuche-Virus ausgelöste Maul- und Klauenseuche.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die retro-inversen Peptide vollständig retro-inverse Peptide oder teilweise retro-invers mit wenigsten zwei aufeinanderfolgenden "retro-inversen" Bindungen sind, und insbesondere zwei aufeinanderfolgende "retro-inverse" Bindungen haben.

4. Polyklonale oder monoklonale anti-retro-inverse Antikörper, wie sie durch die Immunisierung eines Tieres mit wenigstens einem retro-inversen Peptid nach Anspruch 1 erhalten werden, wobei die Antikörper einen Komplex mit wenigstens einem der oben genannten retro-inversen Peptide und mit den Ausgangspeptiden oder -proteinen, die dem letzteren entsprechen, bilden können und dadurch gekennzeichnet sind, dass sie das Ausgangspeptid oder das Ausgangsprotein mit einer Affinität erkennen, welche wenigstens gleich jener ist, welche im Vergleich die Antikörper gegen das Ausgangspeptid oder das Ausgangsprotein zu dem Ausgangspeptid oder dem Ausgangsprotein aufweisen.

5. Antigen-Antikörper-Komplex, dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem der folgenden Komplexe besteht:

- Ausgangsprotein Antikörper, gerichtet gegen ein retro-inverses Peptid, das einem vom Ausgangsprotein abgeleiteten Ausgangspeptid entspricht

- Ausgangspeptid Antikörper, gerichtet gegen ein retro-inverses Peptid, das einem Ausgangspeptid entspricht

- retro-inverses Peptid, das einem Ausgangspeptid entspricht Antikörper, gerichtet gegen das Ausgangspeptid oder das Ausgangsprotein

- retro-inverses Peptid, das einem Ausgangspeptid entspricht Antikörper, gerichtet gegen ein retro-inverses Peptid, das einem Ausgangspeptid entspricht

wobei das retro-inverse Peptid wie im Anspruch 1 definiert ist und der gegen das retro-inverse Peptid gerichtete Antikörper wie im Anspruch 4 definiert ist,

die Komplexe eine Stabilität aufweisen, die wenigstens gleich jener der Komplexe ist an denen, wenn ein retro-inverses Peptid beteiligt ist, es durch ein Ausgangspeptid oder ein Ausgangsprotein ersetzt wird, und wenn ein gegen ein retro-inverses Peptid gerichteter Antikörper beteiligt ist, er durch einen Antikörper gegen das Ausgangspeptid oder gegen das Ausgangsprotein ersetzt wird.

6. Komplex zwischen einem retro-inversen Peptid, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 3 definiert, und einem Bestandteil des Haupthistokompatibilitätskomplexes (auch als MHC-retro-inverses Peptid-Komplex bezeichnet) und eventuell einem T-Zell-Rezeptor (auch als MHC-retroinverses Peptid-T-Rezeptor-Komplex bezeichnet).

7. Komplex zwischen einem retro-inversen Peptid, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 3 definiert, und einem T-Zell- Rezeptor.

8. In vitro-Diagnostikverfahren, wie in Anspruch 1 definiert, für Krankheiten, die mit der Anwesenheit eines exogenen oder endogenen Proteins im Organismus eines Patienten zusammenhängen, welches direkt oder indirekt am Prozess des Auftretens und/oder der Entwicklung der Krankheiten beteiligt sein kann, dadurch gekennzeichnet, das es umfasst:

- das in Kontakt bringen einer biologischen Probe eines Patienten, welcher Träger von gegen das Protein gerichteter Antikörper sein kann, mit einem retroinversen Peptid nach Anspruch 1, wobei das retro-inverse Peptid dem endogenen oder exogenen Protein vollständig oder teilweise entspricht, oder einem Peptid entspricht, welches durch Antikörper erkannt werden kann, die selbst das exogene oder endogene Protein erkennen, oder

unter Bedingungen, welche die Reaktion zwischen den gegen das Protein gerichteten Antikörpern, welche in der biologischen Proben enthalten sein können, und dem oben erwähnten retro-inversen Peptid ermöglichen;

- den in vitro-Nachweis des Antigen-Antikörper-Komplexes nach Anspruch 5, welcher im vorhergehenden Schritt gebildet werden kann, oder

- den in vitro-Nachweis von im Patienten zirkulierenden Antikörper durch Kompetitionstests unter Verwendung eines anti-retro-inversen Antikörpers.

9. In vitro-Diagnostikverfahren, wie in Anspruch 1 definiert, für Krankheiten, die mit der Anwesenheit eines exogenen oder endogenen Proteins im Organismus eines Patienten zusammenhängen, welches direkt oder indirekt am Prozess des Auftretens und/oder der Entwicklung dieser Krankheiten beteiligt sein kann, dadurch gekennzeichnet, das es umfasst:

- das in Kontakt bringen einer biologischen Probe eines Patienten, welcher Träger des Proteins sein kann, mit wenigstens einem der Antikörper nach Anspruch 4, wobei der Antikörper vorteilhafterweise gegen ein retroinverses Peptid gerichtet sind, welches aus einem retroinversen Peptid besteht, das dem endogenen oder exogenen Protein vollständig oder teilweise entspricht, oder unter Bedingungen, welche die Reaktion zwischen dem Protein, welches in der biologischen Probe enthalten sein kann, und den vorher erwähnten, gegen das retro-inverse Peptid gerichteten Antikörpern ermöglichen;

- den Nachweis von im Patienten zirkulierenden Antigenen durch Kompetitionstests unter Verwendung eines retroinversen Peptids nach Anspruch 1.

10. In vitro-Diagnostikverfahren dach Anspruch 8, wobei die Krankheiten nach Anspruch 2 ausgewählt sind.

11. In vitro-Diagnostikverfahren nach Anspruch 9, wobei die Krankheiten nach Anspruch 2 ausgewählt sind.

12. Bausatz oder Satz zur Durchführung der diagnostischen in vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11 mit:

- einem retro-inversen Peptid nach Anspruch 1, welches vollständig oder teilweise dem endogenen oder exogenen Protein entspricht, oder einem Peptid entspricht, welches durch Antikörper erkannt werden kann, die wiederum das exogene oder endogene Protein erkennen, oder auch gegen das retro-inverse Peptid gerichtete Antikörper nach Anspruch 4;

- Mittel zum Anpassen einer Umgebung für die Durchführung einer immunologischen Reaktion;

- Mittel für den Nachweis des Antigen-Antikörper- Komplexes nach Anspruch 5, welcher aufgrund der immunologischen Reaktion gebildet wurde, wobei diese Mittel eventuell eine Markierung enthalten oder nacheinander durch ein markiertes Mittel erkannt werden können, insbesondere in dem Fall, dass das retro-inverse Peptid oder die oben erwähnten anti-retro-inversen Antikörper nicht markiert sind.

13. Verwendung wenigstens eines retro-inversen Peptids nach Anspruch 1, für die Herstellung eines Medikaments, welches für die Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten, die mit der Anwesenheit eines exogenen oder endogenen Protein im Organismus einer Person zusammenhängen, welches direkt oder indirekt am Prozess des Auftretens und/oder der Entwicklung dieser Krankheit beteiligt sein kann.

14. Verwendung wenigstens eines retro-inversen Peptids nach Anspruch 1, für die Herstellung einer Vakzine im Rahmen der Vorbeugung von Krankheiten, die mit der Anwesenheit eines exogenen oder endogenen Proteins im Organismus einer Person zusammenhängen, welches durch die gegen die retro-inversen Peptide gerichteten Antikörper erkannt werden kann.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass ein retro-inverses Peptid nach Anspruch 1 mit einem Protein-tragendem Molekül zusammenhängt oder nicht, wobei es in vivo die Produktion von Antikörpern induzieren kann, welche das für die Krankheit verantwortliche exogene oder endogene Protein neutralisieren, oder in vivo eine zelluläre zytotoxische Immunantwort induzieren kann.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie Antikörper nach Anspruch 4 in Verbindung mit einem physiologisch akzeptablen Träger umfasst.