DE69114339T2

DE69114339T2 - Verfahren zur Identifizierung oder Bestimmung von Proteinen und Verwendungen dazu.

Info

Publication number: DE69114339T2
Application number: DE69114339T
Authority: DE
Inventors: Jacques Barbet; Michel Delaage; Frederic Jean
Original assignee: Immunotech SAS
Current assignee: Immunotech SAS
Priority date: 1990-04-06
Filing date: 1991-04-04
Publication date: 1996-05-30
Anticipated expiration: 2011-04-05
Also published as: JPH05240855A; JP3070773B2; ES2079621T3; ATE130102T1; FR2660757A1; GR3018371T3; FR2660757B1; DE69114339D1; US5449601A; EP0451070A1; EP0451070B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung oder Quantifizierung von Proteinen und seine Anwendungen.
Die genaue immunologische Quantifizierung eines Proteins erfordert den Einsatz von Antikörpern, deren Affinität die Detektion von im allgemeinen geringen Mengen eines Antigens zuläßt und deren Spezifität Interferenzen mit den anderen Bestandteilen des Mediums, in welchen man diese Bestimmung durchführt, vermeidet. Bei der Gewinnung dieser Antikörper stößt man häufig auf die Schwierigkeit, eine Quelle in ausreichendem Überschuß und von einer für das untersuchte Antigen geeigneten Reinheit zur Verfügung zu haben.
Der Einsatz von Synthesepeptiden, wie Immunogenen, gestattete die Gewinnung von Antikörpern, die gegen seltene Antigene oder solche, von denen man nur die Aminosäuresequenz kennt, oder gegen spezielle, in einem Protein schwach immunologische Epitope gerichtet sind. In den meisten Fällen erkennen jedoch die gegen ein synthetischen Peptid erzeugten Antikörper nicht das vollständige Protein mit einer ausreichenden Affinität, um eine immunologische Quantifizierung mit entsprechender Empfindlichkeit zu erstellen.
Ziel zahlreicher Behandlungen war die Ausschaltung von Interferenzen aufgrund von anderen Bestandteilen des Mediums, in dem eine immunologische Quantifizierung eines Proteins durchgeführt wird. Eine dieser Methoden besteht darin, die Quantifizierung nach einer proteolytischen Behandlung der Probe auszuführen. Diese Methode gestattet, so wie sie beschrieben ist, entweder die selektive Zerstörung der an den kontaminierenden Proteinen vorhandenen Epitope, wobei jene, die von dem zu quantifizierenden Protein getragen sind, konserviert werden, oder die Quantifizierung der proteolytischen Fragmente des Proteins, die spezielle Epitope tragen, u.zw. mit Hilfe von Antikörpern, die durch Immunisierung mit gereinigten Fragmenten des gespaltenen Proteins erhalten werden (Europäische Patentanmeldung Nr. 0.051.985). Es hat jedoch jeder der beiden Aspekte dieser Methodik Nachteile. Die selektive Zerstörung der von den interferierenden Proteinen getragenen Epitope kann nur dann bewerkstelligt werden, wenn man die Örtlichkeit der von den Quantifizierungsantikörpern erkannten Epitope und die Beschaffenheit der kontaminierenden Proteine genau kennt, oder durch eine umfassende Studie der verschiedenen Techniken der proteolytischen Fragmentierung. Außerdem erfordert die Quantifizierung von proteolytischen Fragmenten mit Hilfe von durch Immunisierung mit den gereinigten Fragmenten erhaltenen Antikörpern eine beträchtliche Menge an nativem Protein in hochreiner Form. Weiters impliziert die Suche nach spezifischen Antikörpern die Charakterisierung der gereinigten proteolytischen Fragmente vor ihrer Verwendung als Immunogene oder die intensive Studie der Spezifität der nach einer Immunisierung mit den verschiedenen Peptiden erhaltenen Antikörper.
Cupo A., Rougon-Rapuzzi G. und Delaage M. (1981) beschrieben in Immunochemical Detection of Vasopressin Precursors: Artificial Processing and Quantification along the Hypothalamo-Hypophisial Axis, Eur. J. Biochem., 115, 169-174 ein Verfahren zur Quantifizierung des Vorläufers von Vasopressin mit Hilfe von Antikörpern, die gegen Vasopressin selbst gerichtet sind, wobei die Antigen-Deterrninante vor der Quantifizierung durch enzymatische oder chemische Behandlung rekonstituiert wird.
Ein ähnlicher Weg wurde auch erfolgreich zur Quantifizierung von Met-Enkephalin eingeschlagen, wobei gegen ein natürliches Fragment des Vorläufers erzeugte Antikörper verwendet wurden. Diese Quantifizierung erfolgt nach einer Behandlung der Probe mit Trichloressigsäure zur Entfernung des natürlichen Fragments, gefolgt von einer Behandlung mit Trypsin (Cupo A., Pontarotti P.A., Jarry T. et Delaage M.A. (1984) in "A New Immunological Approach to the Detection and the Quantitation of the Met-Enkaphalin Precursors in Rat Brain", Neuropeptides, 4: 375-387).
Die WO-A-87 07957 beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung eines Proteins durch Kompetition mit Hilfe eines gegen dieses Protein gerichteten Antikörpers und eines als Tracer verwendeten Syntheseproteins, welches ebenfalls von diesem Antikörper erkannt wird. Dieses Verfahren zeigt aber nicht auf, daß das Syntheseprotein zur Erzeugung der Antikörper verwendet werden kann, und außerdem bedingt die Realisierung dieses Verfahrens die Synthese eines Proteins, dessen Struktur sehr nahe an das natürliche Protein, gegen welches der Antikörper gerichtet ist, herankommt, damit die Reaktionsfähigkeit dieses Antikörpers für das Syntheseprotein und für das natürliche Protein gleich ist. Diese Verfahren läßt keine Wahl des Syntheseproteins in Abhängigkeit von einer enzymatischen Behandlung der Probe zu, durch welche ein Peptid mit einer zum Syntheseprotein identischen Struktur erzeugt werden kann.
Die EP-A-0 175 360 beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung eines Proteins mit Hilfe eines Anitkörpers, der gegen ein Synthesepeptid erzeugt wird, dessen entsprechendes Epitop am natürlichen Protein während der Quantifizierung durch den Einsatz eines für das Protein schwach denaturierenden Mittels exponiert wird, welches nichtsdestotrotz die Bindungsfahigkeit des Antikörpers bewahrt.
Dieses Verfahren zeigt nicht, daß die Behandlung der Probe eine enzymatische Proteolyse sein könnte, die nicht als teilweise Denaturierung des Proteins betrachtet werden kann. Es ist nicht möglich, im Vorhinein eine Aminosäuresequenz auszuwählen, die einem Epitop entspricht, welches durch diese Behandlung exponiert werden könnte.
Einfacher gesagt, gestattet die Untersuchung der Primärstruktur des zu quantifizierenden Proteins bei der vorliegenden Erfindung die direkte Quantifizierung von spezifischen proteolytischen Fragmenten ohne nachträgliche Modifikation oder vorherige Behandlung. Sie unterscheidet sich von den genannten Arbeiten durch drei wesentliche Unterschiede: das immunisierende Peptid ist ein künstliches Fragment, es muß keine Extraktion zur Entfernung eines natürlichen Fragments durchgeführt werden und es muß keine chemische Veränderung an den Proben vorgenommen werden.
Daher betrifft die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zur Identifizierung oder Quantifizierung von Proteinen, bei dem man Antikörper mit Hilfe eines nötigenfalls immunogen gemachten Peptids herstellt, dann die so erhaltenen Antikörper zur Quantifizierung der gewünschten Proteine aus einer diese enthaltenden Probe verwendet, welche derart behandelt wird, daß dieses Peptid freigesetzt wird, und welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Peptid aus einer bekannten Sequenz des Proteins als durch enzymatische Behandlung freisetzbares Proteinfragment oder freisetzbarer Proteinfragmentteil ausgewählt wird und dann durch Synthese hergestellt wird.
Ein derartiges Verfahren besitzt die mit der Verwendung von Synthesepeptid-Immunogenen verbundenen Vorteile, nämlich eine einfache Herstellung und die Wahl des Epitops von Interesse, und gestattet außerdem die Vermeidung von Problemen des Affinitätsverlustes, auf die man im Fall einer immunologischen Quantifizierung eines nativen Proteins stößt, denn in diesem Fall entspricht das Immunogen vollkommen dem zu quantifizierenden Antigen, weil es beispielsweise streng identisch mit dem zu quantifizierenden Antigen sein kann. Es gibt übrigens ein breites Angebot an Techniken zur enzymatischen proteolytischen Spaltung, bei denen die Schnittstellen spezifisch und an der Primärstruktur des Proteins leicht zu identifizieren sind, wodurch eine große Auswahl bei der Selektion eines Peptidfragments gegeben ist.
Die Herstellung von Antikörpern mit Hilfe von Peptiden ist an sich gut bekannt; für den Fall, daß diese Peptide nicht oder nicht ausreichend immunogen sind, ist es möglich, ihnen diese Eigenschaften zu verleihen, z.B. indem diese Peptide auf einem, insbesondere von einem Protein stammenden, Makromolekül fixiert werden.
Die Auswahl dieser Peptide kann ausgehend von einer Sequenz, die hinsichtlich der Aminosäuren bekannt oder von der Nucleinsäuresequenz eines entsprechenden Gens abgeleitet ist, erfolgen.
Diese Peptide entsprechen einem Fragment eines Proteins, wie einem Hormon oder einem Virusprotein.
Die Peptide werden selektioniert, weil sie proteolytischen Fragmenten entsprechen, die durch enzymatische Behandlung erhalten werden können, wie Trypsinftagmenten, die nach einer Behandlung des Proteins mit Trypsin erhalten werden.
Unter "Fragmentteil" wird ein C-terminaler, N-terminaler oder mittlerer Teil des Proteinfragments verstanden.
Im folgenden wird unter "Fragment" das Fragment oder der Fragmentteil verstanden.
Es ist selbstverständlich auch möglich, andere einfache enzymatische Behandlungen oder solche, bei denen mehrere Enzyme, wie beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Prolin- Endopeptidase kombiniert werden, anzuwenden.
Diese Peptide werden auch in Abhängigkeit von ihrer Größe und ihrer Repräsentanz in bezug auf ein Einzelprotein oder in bezug auf eine Gruppe von Proteinen selektioniert.
Zur Durchführung des ertindungsgemäßen Verfahrens kann man ein oder mehrere, beispielsweise 2, 3 oder 4 Peptide verwenden
Unter bevorzugten Bedingungen zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens umfaßt das aus einer bekannten Proteinsequenz als durch geeignete Behandlung freisetzbares Proteinfragment selektionierte Peptid 6 bis 30 Aminosäuren, vorzugsweise 6 bis 20 Aminosäuren.
Wenn die ausgewänlten Peptide angesichts der oben dargelegten Kriterien auch als solche verwendet werden können, so kann es doch von Vorteil sein, diese Peptide zu modifizieren,
Eine solche Modifikation kann durch Substitution erfolgen. So werden, da die Anzahl an Aminosäuren beibehalten wird, eine oder mehrere Aminosäuren des ausgewählten Peptids, vorzugsweise weniger als ein Viertel der Aminosäuren, insbesondere 1, 2 oder 3 Aminosäure(n) durch eine oder mehrere unterschiedliche Aminosäure(n) ersetzt. Die Substitutions- Aminosäure(n) umfassen vorzugsweise eine freie Funktion, wie beispielsweise NH&sub2;, COOH, SH.
Als Aminosäuren, die eine oder mehrere Aminosäure(n) des selektionierten Peptids substituieren können, kann man insbesondere Tyrosin oder die Aminosäuren nennen, die eine auf ein Trägerprotein, ein Enzym oder jedes andere interessante Molekül gerichtete Kopplung gestatten.
Es ist auch interessant, dem selektionierten Peptid eine odere mehrere Aminosäure(n) hinzuzufügen. Die hinzugefügte(n) Aminosäure(n) werden vorteilhafterweise aus jenen ausgewählt, die für die Substitutionen verwendet werden können.
Es kann auch von Interesse sein, das Fragment durch Deletion einer oder mehrerer Aminosäure(n), vorzugsweise weniger als der Hälfte der Aminosäuren, zu modifizieren.
Um Interferenzen bei der erfindungsgemäßen Identifizierung oder Quantifizierung der Proteine zu vermeiden, kann das selektionierte Peptid in der Sequenz eines Proteins wiedergefünden werden, konimt aber im Zustand eines Peptidfragments nicht natürlich vor.
Wie bereits ausgeführt, kann das Peptid wegen seiner Spezifität für ein einzelnes Protein ausgewählt werden. Andererseits kann das Peptid wegen seiner Spezifität für eine Proteinfamilie ausgewählt werden.
Zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens kann das selektionierte Peptid in polymerer Form vorliegen. Diese polymere Form kann beispielsweise zwei durch eine geeignete Behandlung freisetzbaren Proteinfragmenten entsprechen, die durch eine oder mehrere Disulfidbrücken unter Zwischenschaltung von natürlichen Cysteinen miteinander verbunden sind.
Die Polymerisation kann auch mit dem Ziel angewendet werden, die immunogenen Eigenschaften eines oder mehrere Peptide zu modifizieren. Das Polymer kann aus gegebenenfalls identischen Monomeren bestehen. Die Fixierung der Monomere kann beispielsweise mit Hilfe der Amin-, Carboxylat- oder Sulfhydrylfünktionen und insbesondere unter Zwischenschaltung eines oder mehrerer an diese Monomere gekoppelten Moleküle erfolgen.
Es gibt zahlreiche Vorteile des oben beschriebenen Verfahrens.
Es besteht keinerlei Notwendigkeit, das Protein physisch zu halten. Eine bibliografische Kenntnis der Sequenz oder eines Teils der Sequenz des bzw. der zu quantifizierenden Protein(e) genügt. Der Fachmann kann in Kenntnis der enzymatischen Trennmethoden mittels eines oder mehrerer Enzyme feststellen, welche Peptide einem durch eine geeignete Behandlung freisetzbaren Fragment entsprechen können.
Die Auswahl des Peptids kann entweder deswegen erfolgen, weil das betreffende Protein das einzige ist, das diese Sequenz besitzt, oder andererseits, weil die Sequenz einer ganzen Proteinfamilie gemeinsam ist und man die gesamte Proteinfamilie quantifizieren will.
Es ist auch möglich, eine Sequenz angesichts spezieller Kriterien, wie des Kriteriums der Größe des Peptids, a priori auszuwählen.
Es ist möglich, das ausgewählte Peptidfragment zu modifizieren, was beispielsweise die Durchführung einer Kopplung an ein Trägerprotein ermöglicht, so daß die Antigen-Antikörper-Antwort ausgerichtet werden kann oder vorteilhatterweise ein interessantes Molekül, wie ein Enzym, gekoppelt werden kann oder aber eine Aminosäure, wie Tyrosin, eingeführt werden kann, um eine Markierung mit Iod 125 vorzunehmen.
Durch die Methode der vorliegenden Erfindung fällt auch eine Anzahl von Nachteilen der Methoden des Standes der Technik, wie die Entfernung störender Proteine, weg. Bei den Methoden des Standes der Technik ist es nämlich schwierig, eine effizziente Vorgangsweise zu finden, und es sind langwierige Bemühungen erforderlich, um die enzymatische und/oder chemische Trennmethode zu ermitteh, mit welcher die Eliminierung der parasitären Proteine möglich ist.
Die Synthese des ausgewählten Peptids fällt unter die Kompetenz des Fachmanns und kann gemäß wohlbekannter Techniken bewerkstelligt werden, von denen insbesondere die Peptidsynthese in fester Phase nach Merrifield zu nennen ist.
Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Durchführung von immunologischen Quantifizierungen zahlreicher Proteinhormone, die schwierig zu reinigen sind und häufig Strukturhomologien aulweisen. Ein anderer interessanter Fall ist jener der immunologischen Quantifizierung eines Virusproteins, bei dem drei größere Schwierigkeiten auftreten können: erstens die Gewinnung des Antigens in einer Menge und Reinheit, die zur Immunisierung von Tieren ausreichend ist, zweitens die große Antigenstreuung, die man bei den verschiedenen Stämmen ein- und desselben Virus antreffen kann, und drittens die Interferenz, die durch die in den Seren infizierter Personen vorhandenen viralen Anti-Protein-Antikörper hervorgerufen wird, die von den Quantifizierungs-Antikörpem erkannte Epitope zur Gänze oder zum Teil maskieren können. Auch in diesem Fall ermöglicht die Quantifizierung eines proteolytischen Fragments die Lösung dieser verschiedenen Probleme. Durch den Einsatz eines einem proteolytischen Fragment entsprechenden Synthese-Peptids ist es nämlich möglich, ein sehr reines Immunogen in einer bedeutenden Menge zur Verfügung zu haben; eine kluge Wahl der Sequenz gestattet die Selektionierung von Fragmenten, die in den verschiedenen Stämmen ein- und desselben oder andererseits eines für einen Stamm spezifischen Virus konserviert sind, und die Epitope der Quantifizierungs-Antikörper können, da sie nicht im natürlichen Zustand vorkommen, nicht durch Serum-Antikörper maskiert werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.

Beispiel 1: Quantifizierung des Proteins P25 des HIV-Virus

1. Selektion der Pepüdfragmente

Die Wahl der Fragmentierungstechnik mittels Trypsin wurde wegen der Wirksamkeit, der niedrigen Kosten, der Einfachheit und der Spezifität (Trennung nach den Aminosäuren Arginin und Lysin) derselben getroffen. Die Karte der Trypsin-Digerierung des Proteins P25 vom Referenzstarnm HIV-1 BRU wurde ausgehend von der Aminosäure-Sequenz, welche von der Datenbank GENPRO mit Hilfe der Software BISANCE (CITI 2) extrahiert worden war, erstellt. Es wurden nur die Trypsinfragmente mit einer Größe von sechs Aminosäuren oder mehr selektioniert. Die herangezogenen Fragmente wurden danach mit den Aminosäure-Sequenzen der Proteine P25 der anderen Stämme des HIV-1- und HIV-2-Virus, welche in den Datenbanken NBRF und GENPRO enthalten sind, verglichen. Es wurden nur die Trypsin- Fragmente bzw. Peptide mit mehr als sechs Aminosäuren entsprechend einem COOH- oder NH&sub2;-Ende eines Trypsin-Fragments, welche mehr als 80 % Sequenz-Homologie gegenüber den verschiedenen Stämmen des HIV-1- und HIV-2-Virus aufiviesen, konserviert. Diese Peptide wurden danach mit sämtlichen in den Datenbanken NBRF und GENPRO enthaltenen Protein-Sequenzen verglichen, und es wurde keine signifikante Homologie mit anderen Sequenzen als jenen der Proteine P25 der HIV-Viren und der SIV-Viren entdeckt.
Es wurden vier Peptide nach den vorhergehenden Kriterien ausgewählt und synthetitisert:

Das Peptid T7K

Thr-Leu-Asn-Ala-Trp-Val-Lys

Dieses Peptid ist ein vollständiges Trypsinfragment entsprechend den Aminosäuren 19 bis 25 des Proteins P25 vom Referenzstannn HIV-l BRU. Es wurde gegenüber den verschiedenen Stämmen des HIV-Virus, deren Sequenzen untersucht wurden, strikt konserviert.

Das Peptid G11C

Gly-Ser-Asp-Ile-Ala-Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-Cys

Dieses Peptid entspricht den Aminosäuren 101 bis 110 des NH&sub2;-Endes des Trypsinfragments, welches die Aminosäuren 101 bis 131 beim Referenzstamm HIV- 1 BRU umfaßt, an welche in COOH ein zusätzliches Cystein angefügt wurde, welches auf die Gruppe SH gerichtete chemische Kopplungen zuläßt. Dieses Peptid wurde auch gegenüber den verschiedenen Stämmen des HIV-Virus, deren Sequenzen untersucht wurden, strikt konserviert.

Das Peptid N 17K

Asn-Trp-Met-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys Dieses Peptid ist ein vollständiges Trypsinfragment entsprechend des Aminosäuren 183 bis 99 des Proteins P25 vom Referenzstamm HIV-1 BRU. Es besitzt eine Substitution der Glutaminsäure in der Position 187 durch ein Glutamin beim Virus HIV-2 ROD; eine Substitution der Glutaminsäure in der Position 187 durch ein Glutamin, eine Substitution des Asparagins in der Position 193 durch ein Serin und eine Deletion des Alanins in der Position 194 durch ein Glutamin beim Virus HIV-2 SBLISY; eine Substitution der Glutaminsäure in der Position 187 durch ein Glutamin und eine Substitution des Valins in der Position 191 durch ein Isoleucin beim Virus HIV-2 FG; und eine Substitution des Asparagins in der Position 183 durch Glycin beim Virus HIV-1 Z2.

Das Peptid T18K

Thr-Leu-Glu-Glu-Met-Met-Thr-Ala-Cys-Gln-Gly-Val-Gly-Gly-Pro-Gly-His-Lys

Dieses Peptid entspricht den Aminosäuren 210 bis 227 des COOH-Endes des aus den Aminosäuren 204 bis 227 bestehenden Trypsinfragments beim Referenzstamm HIV-1 BRU. Es besitzt eine Substitution des Methionins in der Position 215 durch ein Leucin und eine Substitution des Histidins in der Position 226 durch ein Glutamin beim Virus HIV-2 ROD; eine Substitution des Methionins in der Position 215 durch ein Leucin und eine Substitution des Glycins in der Position 220 durch ein Isoleucin beim Virus HIV-2 SBLISY; eine Substitution des Methionins in der Position 215 durch ein Leucin; eine Substitution des Alanins in der Position 217 durch ein Threonin und eine Substitution des Histidins in der Position 226 durch ein Glutamin beim Virus HIV-2 FG; und eine Substitution des Glycins in der Position 225 durch ein Serin bei den Viren HIV-1 ELI, HIV-1 MAL und HIV-1 Z2.

2. Herstellung von Antikörpern

Diese vier Peptide wurden mit verschiedenen Trägerproteinen gekoppelt, um als Immunogene verwendet zu werden.
Insbesondere wurde das Peptid N17K an Rinder-Serumalbumin unter Zwischenschaltung von 4-Succinimidyl-(N-maleimidomethyl)-1-cyclohexancarboxylat (SMCC) gekoppelt, welches einerseits mit der SH-Gruppe des natürlichen Cysteins des Peptids und andererseits mit den Epsllon-NH&sub2;-Gruppen der Lysine des Trägerproteins reagiert. Zu Rinder-Serumalbumin (Serva), gelöst zu 5 mg/ml in 0,1M Phosphatpuffer, pH 7, gibt man SMCC (Pierce), gelöst zu 25 mg/ml in DMF, in einem Molverhältnis von 1/50. Nach einer einstündigen Inkubation bei Umgebungstemperatur werden die verschiedenen Reagenzien durch Molekularsiebung auf einer mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6, equilibrierten Biogel P2-Säule (Bio-Rad ) getrennt. Das Peptid wird danach zur BSA-SMCC-Lösung in einem Molverhältnis von 30/1 gegeben, und die Reaktionsmischung wird 12 Stunden bei 4º inkubiert. Die Reinigung des Immunogens erfolgt durch Molekolarsiebung auf einer mit PBS-Puffer, pH 7,2, equilibrierten Biogel P4-Säule (Bio-Rad ). Vier BALB/c-Mäuse wurden im monatlichen Intervall mit 50 ug dieses Immunogens, injiziert in komplettem Freund Adjuvans zur Hälfte auf subkutanem Weg und zur Hälfte auf intraperitonealem Weg, immunisiert.

3. Charakterisierung der Antikörper

Die so erhaltenen Antikörper werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit charakterisiert, einen radioaktiven Tracer zu binden, welcher aus dem Peptid N17K, gekoppelt an mit bd 125 markiertes Glycyl-L-Tyrosin, besteht. Zu einem ersten Zeitpunkt gibt man zu einer Lösung von 20 mM Glycyl-L-Tyrosin (Sigma) in 0, iM Phosphatpuffer mit pH 7,0 SMCC (Pierce), gelöst zu 25 mg/ml in DMF, in einem Molverhältnis von 1/1 und inkubiert die Reaktionsmischung 2 Stunden bei 20º. Das Konjugat Glycyl-L-Tyrosin-SMCC (GT-SMCC) wird dann mittels HPLC-Chromatografie in Umkehrphase gereinigt und an das Peptid N17K, gelöst zu 0,5 mM in 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 6,0, in einem Molverhältnis von 1/1 gekoppelt. Nach 12 Stunden Inkubation bei 4º wird der Tracer N17K-SMCC-GT mittels HPLC-Chromatografie in Umkehrphase gereinigt. Der Tracer N17K-SMCC-GT wird mittels des Chloramin T-Verfahrens mit Iod 125 markiert und mittels HPLC-Chromatografie neuerlich gereinigt.
Ein Beispiel für ein Resultat, welches mit dem Antiserum einer mit dem Konjugat N17K-SMCC-BSA immunisierten Maus erhalten wurde, ist in Fig. 1 dargestellt: zu 100 ul Mäuse-Antiserum, verdünnt auf 1/1000 in 0,1 % PBS-BSA-Puffer, pH 7,2> gibt man 50 ul radiomarkierten Tracer N17K-SMCC-GT im gleichen Puffer und 50 ul Peptid N17K bzw. P25 HIV- 1 BRU (Transgène) bzw. P25 nach einer Behandlung mit Trypsin in unterschiedlichen Konzentrationen in normalem Humanplasma. Die Antigen-Antikörper-Komplexe werden nach einer 12-stündigen Inkubation bei 4º durch Zugabe von 200 ul PEG 6000 zu 20 % in Wasser und Zentrifügation ausgefällt. Danach wird die Radioaktivität des Bodensatzes gemessen. Wie in Fig. 1 gezeigt, erkennen die Antikörper das Peptid N17K ebenso gut wie das mit Trypsin behandelte Protein P25, aber nicht das native Protein P25.
Die quantitative Bestimmung des Peptids N17K gestattet also die Durchführung einer Quantifizierung des Proteins P25 des Virus HIV-1 BRU, sollte aber auch jene der Proteine P25 sämtlicher Stämme des HIV-Virus zulassen, die eine Strukturhomologie mit diesem Fragment aulweisen, ermöglichen.

Beispiel 2: 0uantifizierung von LPH (menschlichem Lipotropin)

Es wurde eine immunologische Quantifizierung von LPH unter Verwendung von gegen NH&sub2;-terminales Hexapeptid (E6R), Glu-Leu-Thr-Gly-Gln-Arg, er zeugten Antikörpern entwikkelt.
Dieses Peptid, welches einem Trypsinfragment entspricht, weist keine signifikante Homologie mit der Gruppe der in den Datenbanken NBRF und GENPRO enthaltenen Proteinsequenzen auf
Mit dem Ziel, gegen die COOH- und NH&sub2;-Enden dieses Fragments gerichtete Antikörper zu erhalten, wurden die Immunisierungen mit einem Peptid durchgeführt, dessen Sequenz wie folgt lautet: Glu-Leu-Thr-Cys-Gln-Arg, worin ein Cystein das im ursprunglichen Fragment enthaltene Cystein ersetzt, um dieses Peptid unter Zwischenschaltung der -SH-Gruppe dieses Cysteins an ein Trägerprotein koppeln zu können.
Diese Kopplung wird mit Hilfe von 4-Succinimidyl-(N-maleimidomethyl)-1-cyclohexancarboxylat (SMCC) durchgeführt, das einerseits mit einer SH-Gruppe eines natürlichen oder überzähligen Cysteins des Peptids und andererseits mit den Epsilon-NH&sub2;-Gruppen der Lysine des Trägerproteins reagiert:
Zu Rinder-Serumalbumin (Serva) (im folgenden BSA), gelöst zu 5 mg/ml in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, gibt man SMCC (Pierce), gelöst zu 25 mg/ml in DMF, in einemmolverhältnis von 1/50. Nach einer einstündigen Ihkubation bei Umgebungstemperatur werden die verschiedenen Reagenzien durch Molekularsiebung auf einer mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6, equilibrierten Biogel P2-Säule (13i0-Rad ) getrennt. Das Peptid wird danach zur BSA- SMCC-Lösung in einem Molverhältnis von 30/1 gegeben, und die Reaktionsmischung wird 12 Stunden bei 4º ihkubiert. Die Reinigung des Immungens erfolgt durch Molekularsiebung auf einer mit Phosphatpuffer (PBS), pH = 7,2, equilibrierten Biogel P4-Säuie (Bio-Rad ).
Acht BALBIC-Mäuse und zwei Kaninchen wurden im Monatsintervall mit 50 bzw. 250 ug dieses Immunogens, injiziert auf subkutanem Weg in komplettem Freund Adjuvans, immunisiert.
Zwei dieser Tiere produzierten Antikörper, die die spezifische Quantifizierung von LPH ermöglichten. Nach der Behandlung der Serumprobe mit Trypsin, welches die Freisetzung des NH&sub2;-terminalen Peptids bewirkt, wird die Quantifizierung durch Kompetition mit einem identischen Peptid ausgeführt, welches unter Zwischenschaltung von SMCC an mit bd 125 radiomarkiertem Glycyl-L-Tyrosin gekoppelt wurde (Fig. 2).
Man hat also bei dieser Anwendung der vorliegenden Erfindung ein immunologisches Quantifizierungsverfahren von LPH zur Verfügung, für das es besonders schwierig ist, eine ausreichende Menge Protein einer für die Durchführung von Immunisationen geeigneten Reinheit zu erhalten.

Claims

1 Verfahren zur Identifizierung oder Quantifizierung eines Proteins, bei dem

- man in dem Protein nach Untersuchung seiner Sequenz ein durch eine enzymatische proteolytische Behandlung freisetzbares Peptid auswählt,

- man durch Synthese ein synthetisches Peptid herstellt, das die Sequenz des obigen Peptids aufweist,

- man Antikörper gegen dieses synthetische Peptid herstellt,

- man eine Probe, die gegebenenfalls das genannte Protein enthält, der enzymatischen Behandlung unterzieht, um das Protein zu spalten,

- man in der Probe eine immunologische Bestimmung der Anwesenheit des freisetzbaren Peptids vornimmt, indem man die Antikörper mit der Probe in Kontakt bringt,

- man, falls gewünscht, hieraus die Menge des in der Probe vorhandenen Proteins ableitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid 6 bis 30 Aminosäuren aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid 6 bis 20 Aminosäuren aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid einem Teil eines C-terminalen, N-terminalen oder mittleren Fragments entspricht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das ausgewählte Peptid modifiziert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid durch Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid durch Hinzufügung einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid durch Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das ausgewählte Peptid in der Sequenz eines Proteins wiedergeflinden werden kann, jedoch nicht natürlich im Zustand eines Fragments existiert.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid nach seiner Spezifität für ein einzelnes Protein ausgewählt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid nach seiner Spezifität für eine Proteinfamilie ausgewählt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid in polymerer Form vorliegt.

13 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, verwendet für die Identifizierung eines Proteins.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, verwendet für die Quantifizierung eines Proteins.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein das P25-Protein eines HIV-Virus ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein das humane Lipotropin (LPH) ist.