DE69526728T3

DE69526728T3 - Verwendung von IL-12 und IL-12 Antagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels für Behandlung von Autoimmunkrankheiten

Info

Publication number: DE69526728T3
Application number: DE69526728T
Authority: DE
Inventors: John P. Leonard; Samuel Goldman; Jr. Richard O'hara
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1994-03-14
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2015-03-08
Also published as: DK0750509T3; PT750509E; EP0750509B1; ES2173953T5; WO1995024918A1; ATE217533T1; EP2311484A1; DE69526728T2; EP1179348A2; EP1179348A3; TW400233B; ES2173953T3; ZA95960B; EP2201959A3; JPH09510444A; DE69526728D1; EP2201959A2; EP0750509B2; US6338848B1; IL112677A0

Description

Hintergrund der Erfindung
Gamma-Interferon (IFN-γ) und Alpha-Tumornekrosefaktor (TNF-α) sind mit der Entwicklung, Verschlimmerung und bzw. oder Wiederkehr von zahlreichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht worden. So sind z.B. sowohl IFN-γ als auch TNF-α mit dem Verlauf von multipler Sklerose [Chloflon et al., Eur. Cytokine Netw. 3(6), 1992, Seiten 523-531; Steinman Scientific American, September 1993, Seiten 107–114, Hofman et al., J. Exp. Med. 170, 1989, Seiten 607–612; Panitch et al., Neurology, 37, 1987, Seiten 1097–1102] und Diabetes vom Typ I (Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, IDDM) [Castano et al., Annu. Rev. Immunol. 8, 1990, Seiten 647–679; Campbell et al., J. Clin. Invest. 87, 1991, Seiten 739–742] in Verbindung gebracht worden. Während gefunden worden ist, dass TNF-α die Entwicklung von rheumatoider Arthritis fördert [Feldmann et al., Progress in Growth Factor Research, 4, 1992, Seiten 247–255], ist die Verabreichung von IFN-γ mit Verbesserungen bei an Arthritis leidenden Patienten in Verbindung gebracht worden [Veys et al., J. Rheumatology, 15(4), 1988, Seiten 570–574]. Weiterhin haben Studien gezeigt, daß IFN-γ in die Autoimmunerkrankungen involviert ist, die mit systemischem Lupus erythematosus (SLE) [Funauchi et al., Tohoku J. Exp. Med. 164, 1991, Seiten 259-267; Bankhurst, J. Rheumatology, 14 (supp. 13), 1987, Seiten 63–67] autoimmuner Thyroiditis [Tang et al., Eur. J. Immunol. 23, 1993, Seiten 275–278] und autoimmunen entzündlichen Augenerkrankungen (z.B. autoimmune Uveoretinitis)[Charteris et al., Immunology 75, 1992, Seiten 463–467] assoziiert sind. Die Entwicklung von autoimmuner Lungenentzündung [Deguchi et al., Clin. Exp. Immunol. 85, 1991, Seiten 392–395] und des Guillain-Barre Syndroms [Baron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, Seiten 4414–4418] sind ebenfalls mit TNF-α-Aktivität in Verbindung gebracht worden.
Interleukin-12 (IL-12) ist ein heterodimeres Cytokin, das ursprünglich als ein Faktor identifiziert wurde, der IFN-γ von T-Zellen und natürlichen Killerzellen induziert, wie beschrieben in PCT/US91/06332, veröffentlicht am 02. April 1992. PCT/US91/06332 erwähnt IL-12 als einen natürliche Killerzellen stimulierenden Faktor oder NKSF. EP 433827 , veröffentlicht am 26. Juni 1991, offenbart IL-12 als einen die Reife von cytotoxischen Lymphozyten fördernden Faktor (CLMF). IL-12 stimuliert auch natürliche Killerzellen an vitro durch Steigerung ihrer Fähigkeit Target-Zellen zu lysieren, in einem Ausmaß vergleichbar dem mit IFN-α und IL-2 erreichten, gut bekannten Aktivatoren der cytotoxischen Aktivität von natürlichen Killerzellen. Zu den weiteren identifizierten in vitro Aktivitäten von IL-12 zählen die Induzierung von TNF-α; die Induzierung der Proliferation von T-Zellen als Co-Stimulanz; die Suppression der durch IL-2 induzierten Proliferation von natürlichen Killerblasten; die Suppression der durch IL-2 induzierten Proliferation von T-Zellrezeptor-γδ-positiven Zellen; die Promotion der Differenzierung von Th1 T-Zellen aus Vorläufern; die Steigerung der Proliferation nur von Th1, aber nicht von Th2; die Steigerung der cytolytischen Aktivität von T-Zellen; die Steigerung der Erzeugung von cytotoxischen Lymphozyten; die Steigerung der cytolytischen Aktivität von natürlichen Killerzellen und natürlichen Killerblasten; die ex vivo Steigerung der natürlichen Killeraktivität in peripheren mononuklearen Zellen im Blut von mit IL-2 behandelten Patienten; die Induzierung von Adhäsionsmolekülen auf natürlichen Killerzellen; die Induzierung von Perforin- und Granzym B-mRNAs in natürlichen Killerblasten; die Induzierung von IL-2 Rezeptoruntereinheiten (p55, p75) auf natürlichen Killerzellen; die Suppression der Synthese von IgE durch von IFN-γ abhängige und unabhängige Mechanismen; die Modulation der Entwicklung von T-Zellen im fetalen Thymusorgankulturen; und die Synergie mit einem Kit-Liganden zur Förderung des Wachstums von Myeloid- und B-Zellen-Vorläufern. Zu den bekannten in vivo Aktivitäten von IL-12 zählen die Induzierung von IFN-γ; die Steigerung der Aktivität von natürlichen Killerzellen in Milz, Leber, Lungen und Bauchhöhle; die Steigerung der Erzeugung von Allo-spezifischen cytotoxischen Lymphozyten; die Induzierung von extramedullarer Hematopoese in der Milz der Maus; die reversible Suppression der Hematopoese im Knochenmark; die reversible Induzierung von Anämie, Lymphopenie und Neutropenie in der Maus; die Suppresion der durch Anti-IgD induzierten Expression von IgE, IgG1 und IL-4; die gesteigerte Überlebensrate von SCID-Mäusen, die mit Toxoplasma gondii behandelt wurden; die Heilung von Leishmaniasis in dafür empfänglichen Mäusestämmen; die herabgesetzte Biobelastung im Cryptococcose-Modell; die Suppression von Tumorwachstum; und die Steigerung der Immunität gegenüber Tumorzellen. IL-12 wird weiterhin in vivo induziert in dem Reaktionsmodell des septischen Schocks nach Shwartzman.
Darüber hinaus offenbart EP 0 638 644 , publiziert am 15. Februar 1995, die Verwendung von IL-12 Rezeptoren mit niedriger Affinität und Immunglobuline, die fähig sind, selektiv an den IL-12 Rezeptor zu binden, zur Behandlung autoimmuner Funktionsstörungen. Die Verwendung einer p40 Untereinheit von IL-12 zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen ist in EP 0 625 354 , publiziert am 23. November 1994, offenbart. Die Verwendung eines IL-12 p40 Homodimers zur Behandlung von autoimmunen Störungen wird in EP 0 640 689 , publiziert am 1. März 1995 beschrieben. Der Disclaimer in Anspruch 1 wurde eingefügt, um den obengenannten Gegenstand von EP 0 638 644 , EP 0 625 354 und EP 0 640 689 auszuschliessen.
Auch wenn IL-12 die Erzeugung von IFN-γ und TNF-α in vivo induzieren kann, so ist doch der Zusammenhang zwischen den in vivo Konzentrationen von IL-12 und solchen Autoimmunerkrankungen, die durch die Konzentrationen an IFN-γ und TNF-α beeinflußt werden, noch nicht festgestellt. Weiterhin sind die Wirkungen der Verabreichung von Antagonisten von endogenem IL-12 (wie z.B. Anti-IL,-12 Antikörper) auf Autoimmunerkrankungen, die mit der Induzierung von IFN-γ oder TNF-α verbunden sind, noch nicht untersucht worden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines IL-12 Antagonisten für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung (z.B. die Heilung, Linderung, Verzögerung oder Verhinderung des Ausbruchs, Verhinderung einer Wiedererkrankung oder eines Rückfalls) von autoimmunen Zuständen oder Erkrankungen zur Verfügung, mit der Maßgabe, dass dieser Antagonist keiner der folgenden ist: ein IL-12 Rezeptor, welcher spezifisch und in sättigbarer Weise IL-12 bindet, mit einer apparenten Affinität von 5 oder 10 nM; ein Immunglobulin, welches in der Lage ist, selektiv an den IL-12 Rezeptor zu binden; ein IL-12 p40 Homodimer; oder eine IL-12 p40 Untereinheit. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Zustand ein solcher, der durch einen Anstieg der Konzentrationen eines Cytokins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNF-α oder IFN-γ, gefördert wird. Zu solchen Zuständen zählen, ohne Beschränkung hierauf, diejenigen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus multipler Sklerose, systemischem Lupus erythematosus, rheumatoider Arthritis, autoimmuner Lungenentzündung, Guillain-Barré Syndrom, autoimmuner Thyroiditis und autoimmuner entzündlicher Augenkrankheit. Multiple Sklerose ist ein besonders bevorzugter Zustand zur Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie hierin beschrieben.
In bestimmten Ausführungsformen schließt die Verwendung zur Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines IL-12 Antagonisten an ein Säugetier ein, vorteilhaft die Verabreichung eines Antikörpers oder eines anderen Stoffes, der mit IL-12 immunoreaktiv ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird der IL-12 Antagonist in einer Dosis von etwa 0,05 bis etwa 25 mg/kg, vorzugsweise von etwa 0,2 bis etwa 2 mg/kg verabreicht. Der Antagonist kann auch in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff verabreicht werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt graphische Darstellungen von Daten dar, die sich auf den adoptiven Transfer von experimentell erzeugter allergischer Enzephalomyelitis (EAE) unter Verwendung von Lymphknoten- und Milzzellen beziehen, die in vitro mit PLP und rmIL-12 stimuliert wurden. Milz und Lymphknoten wurden Mäusen 10 Tage nach Immunisierung mit PLP entnommen und an vitro mit dem Antigen allein (offene Symbole) oder dem Antigen und 20 ng/ml rmIL-12 (geschlossene Symbole) stimuliert, wie unter Materialien und Methoden beschrieben. Die Krankheit wurde unter Verwendung von 30 × 10⁶ Zellen übertragen. Die Ergebnisse sind angegeben als durchschnittliche Bewertung für (a) Lymphknoten- (n=7) und (b) Milzzellen (n=5). Die Daten sind repräsentativ für mindestens zwei getrennte Experimente. Siehe Beispiel 1.
2 stellt graphische Darstellungen von Daten dar, die sich auf die Produktion von IFN-γ und TNF-α durch LNC beziehen, die in vitro mit PLP und IL-12 stimuliert wurden. LNC (2,5 × 10⁶/ml) von mit PLP immunisierten Mäusen wurden mit PLP allein, mit PLP und rmIL-12 (20 ng/ml) oder mit PLP, rmIL-12 und Anti-IFN-γ (5 μg/ml) 96 Stunden lang vor dem Zelltransfer von 30 × 10⁶ Zellen kultiviert. 2(a) gibt die Konzentrationen an IFN-γ und TNF-α wieder, die mittels ELISA in den Überständen von gepoolten Kulturen gemessen wurden. 2(b) zeigt die durchschnittliche (oder gemittelte) Bewertung der Schwere der Krankheit nach dem Transfer von stimulierten Lymphknotenzellen. n=3 für PLP allein und PLP + IL12 und n=4 für PLP + IL12 + Anti-IFN-γ. Siehe Beispiel 1.
3 zeigt graphische Darstellungen von Daten, die sich auf die Wirkungen der Verabreichung von IL-12 in vivo auf den adoptiven Transfer von EAE unter Verwendung von mit PLP stimulierten LNC beziehen. LNC von mit PLP immunisierten Mäusen wurden in vitro mit Antigen kultiviert, wie unter Materialien und Methoden beschrieben, und in naive Mäuse transferiert. rmIL-12 (0,3 μg/Maus) wurde an den Tagen 0, 1 und 2 nach dem Zelltransfer (geschlossene Kreise) verabreicht, und die Mäuse wurden auf Anzeichen für Erkrankung beobachtet. Mäuse einer Kontrollgruppe erhielten ein gleiches Volumen an Kochsalzlösung (offene Kreise). 3(a) zeigt den mittleren klinischen Score nach Transfer von 30 × 10⁶ LNC-Zellen (n=5). 3(b) zeigt die durchschnittliche klinische Bewertung nach dem Transfer von 10 × 10⁶ LNC (n=4). 3(a) ist das repräsentative Ergebnis von drei getrennten Experimenten. Siehe Beispiel 1.
4 zeigt graphische Darstellungen von Daten, die sich auf die Wirkungen der Verabreichung in vivo von Anti-IL-12 Antikörper auf den adoptiven Transfer von EAE unter Verwendung von mit PLP stimulierten LNC beziehen. LNC von mit PLP immunisierten Mäusen wurden mit Antigen in vitro kultiviert, wie unter Materialien und Methoden beschrieben, und 30 × 10⁶ Zellen wurden in naive Mäuse transferiert. Anti-IL-12 Antikörper (Schaf anti-Maus polyklonaler Antikörper, 200 μg/Maus) wurde durch intraperitoneale Injektion verabreicht, beginnend mit dem Tag des Zelltransfers (geschlossene Kreise). Mäuse der Kontrollgruppe erhielten eine äquivalente Menge von Schaf-IgG (offene Kreise). 4(a) zeigt die durchschnittliche klinische Bewertung nach Verabreichung von αIL-12 Antikörper an jedem zweiten Tag vom Tag 0 bis zum Tag 6. 4(b) zeigt die durchschnittliche klinische Bewertung nach Verabreichung von αIL-12 Antikörper an jedem zweiten Tag von Tag 0 bis zum Tag 12. (n=5–7). Siehe Beispiel 1.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von IL-12 Antagonist für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von autoimmunen Zuständen zur Verfügung, mit der Maßgabe, dass dieser Antagonist keiner der folgenden ist: ein IL-12 Rezeptor, welcher spezifisch und in sättigbarer Weise IL-12 bindet, mit einer apparenten Affinität von 5 oder 10 nM; ein Immunglobulin, welches in der Lage ist, selektiv an den IL-12 Rezeptor zu binden; ein IL-12 p40 Homodimer; oder eine IL-12 p40 Untereinheit. "Autoimmune Zustände" sind diejenigen, in denen das eigene Immunsystem eines Subjekts gegen die Zellen oder Gewebe des Subjekts reagiert, was zu einer Schädigung dieser Zellen oder Gewebe führt. Ein besonderer autoimmuner Zustand wird "gefördert durch einen Anstieg der Konzentrationen eines Cytokins", wenn ein Anstieg der Konzentrationen eines solchen Cytokins im Serum oder im Gewebe die Entwicklung oder das Wiederauftreten oder die Beschleunigung des Eintretens eines solchen autoimmunen Zustands verursachen oder dazu beitragen kann. Zu den autoimmunen Zuständen, die durch einen Anstieg der Konzentrationen von IFN-γ und bzw. oder TNF-α befördert werden, zählen, ohne Beschränkung hierauf, Multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematosus, rheumatoide Arthritis, autoimmune Lungenentzündung, Guillain-Barré Syndrom, autoimmune Thyroiditis und autoimmune entzündliche Augenkrankheit.
"IL-12 Antagonisten" schließen ein (1) Stoffe, welche IL-12 oder biologisch aktive Fragmente davon binden, und (2) Stoffe, die die Bindung von IL-12 an Rezeptoren oder andere bindende Proteine stören. Zu den Antagonisten, die IL-12 binden, zählen, ohne Beschränkung hierauf, Antikörper (mono- oder polyclonale) und Fragmente davon (einschließlich F_ab-Fragmente), chimäre Antikörper und Fragmente davon, Lectine, IL-12 Rezeptoren oder Fragmente davon, reaktive Peptide oder Fragmente davon und organische kleine Moleküle, die so angelegt sind, dass sie die Bioaktivität von IL-12 Rezeptoren vortäuschen. Zu den Antagonisten, die die Bindung von IL-12 stören, zählen, ohne Beschränkung hierauf, chemisch oder genetisch modifizierte Peptide von IL-12, Untereinheiten von IL-12 und Fragmente davon, Homopolymere von IL-12 Unterheiten und Fragmente davon sowie organische kleine Moleküle, die so angelegt sind, dass sie die Bioaktivität von IL-12 vortäuschen. Vorteilhaft stören Antagonisten, die die Bindung von IL-12 stören, dessen Bindung an Rezeptoren, die IFN-γ oder TNF-α induzieren, ohne dieselbe Konzentration an solchen Faktoren zu induzieren, wie sie durch die Bindung von IL-12 an den Rezeptor induziert werden würden.
IL-12 Antagonisten können nach Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Beispielsweise können monoklonale IL-12 Antikörper hergestellt werden, indem man Antikörper erzeugende Hybridomas nach bekannten Verfahren erzeugt (siehe z.B. Godin, 1983, Monoclonal antibodies: principles and paractice. Academic Press Inc., New York; Yokoyama, 1992, "Production of Monoclonal Antibodies" in Current Protocols in Immunology, Unit 2,5, Greene Publishing Assoc. and John Wiley & Sons). Polyklonale Seren und Antikörper gegen IL-12 können durch Impfung eines Säugetiers mit IL-12 oder Fragmenten davon nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Chizzonite et al., J. Immunol. 148, 1992, Seite 3117, beschreiben die Identifizierung und Isolierung eines IL-12 Rezeptors. Fragmente von Antikörpern, Rezeptoren oder anderen reaktiven Peptiden können aus den entsprechenden Antikörpern durch Spaltung und Abtrennung der gewünschten Fragmente nach bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. Goding, supra; Andrew et al., 1992, "Fragmentation of Immunoglobulins" in Current Protocols in Immunology, Unit 2.8, Greene Publishing Assoc, and John Wiley & Sons). Chimäre Antikörper können ebenfalls nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen IL-12 Antagonisten enthalten und für die Verwendung nach der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können auch pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren und bzw. oder Materialien enthalten, die in der Technik gut bekannt sind. Die Bezeichnung „pharmazeutisch akzeptabel" bezeichnet ein Material, das nicht die Wirksamkeit oder die biologische Aktivität des oder der aktiven Bestandteile stört und das nicht für den Empfänger toxisch ist, dem es verabreicht wird. Die Charakteristika des Trägers oder der anderen Materialien hängen von der Art der Verabreichung ab.
Es ist derzeit vorgesehen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen etwa 0,1 Mikrogramm bis etwa 1 Milligramm IL-12 Antagonist pro Milliliter enthalten.
Die Verabreichung kann auf eine Mehrzahl von üblichen Methoden erfolgen. Die bevorzugte Methode der Verabreichung des IL-12 Antagonisten ist die intraperitoneale Injektion. Intravenöse, kutane oder subkutane Injektion können ebenfalls angewandt werden. Zur Injektion wird der IL-12 Antagonist vorteilhaft in der Form von Pyrogen-freien parenteral akzeptablen wäßrigen Lösungen verwendet. Die Herstellung solcher parenteral akzeptablen Proteinlösungen unter Berücksichtigung von pH, Isotonizität, Stabilität usw., ist dem Fachmann geläufig.
Die Menge an IL-12 Antagonist, die für die Behandlung verwendet wird, hängt von der Schwere des Zustandes, dem Weg der Zuführung, der Reaktivität des IL-12 Antagonisten mit IL-12 ab und wird letztlich von dem Behandler bestimmt. Bei der Durchführung des Verfahrens nach dieser Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Dosis eines IL-12 Antagonisten verabreicht. Die Bezeichnung "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet die gesamte Menge jeder aktiven Komponente des Verfahrens oder der Zusammensetzung, die ausreicht, um einem Patienten einen signifikanten Nutzen zu bringen (d.h. zu heilen, erleichtern, das Einsetzen der Krankheit zu verzögern oder zu verhindern, oder das Wiederauftreten der Krankheit oder einen Rückfall zu verhindern). Ein übliches Verfahren zur Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge für einen bestimmten Patienten besteht darin, steigende Dosen periodisch zu verabfolgen, bis ein signifikanter Nutzen für den Patienten durch den Behandler beobachtet wird. Wenn dieses Verfahren mit einem individuellen Wirkstoff angewandt wird, der allein zugeführt wird, bezieht sich die Bezeichnung auf diesen Wirkstoff allein. Wenn sie für eine Kombination angewandt wird, bezieht sich die Bezeichnung auf die kombinierten Mengen der Wirkstoffe, die zu dem therapeutischen Effekt führen, unabhängig davon, ob sie in Kombination hintereinander oder gleichzeitig verabreicht werden. Es ist vorgesehen, dass eine therapeutisch wirksame Dosis eines IL-12 Antagonisten in dieser Erfindung im Bereich von etwa 0,05 mg/kg bis etwa 25 mg/kg liegt. Die Anzahl der Verabreichungen kann variieren, in Abhängigkeit von dem individuellen Patienten und der Schwere des autoimmunen Zustandes.
Der IL-12 Antagonist, der bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung angewandt wird, kann allein oder in Kombination mit anderen Therapien für autoimmune Zustände angewandt werden, wie z.B. steroiden oder anderen anti-entzündlichen Therapien und die Verabreichung von anderen Cytokinen.
Die Verwendungen nach der vorliegenden Erfindung sind weiterhin im folgenden Beispiel beschrieben, das die Erfindung illustrieren soll.
Beispiel 1
Experimentell erzeugte allergische Encephalomyelitis (EAE) ist eine durch T-Zellen vermittelte Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (CNS). Die Erkrankung kann in dafür empfänglichen Mäusestämmen durch Immunisierung mit CNS Myelin Antigenen induziert werden, oder alternativ kann die Erkrankung passiv auf dafür empfängliche Mäuse übertragen werden durch Verwendung von Antigen-stimulierten CD4⁺ T-Zellen [Pettinelli, J. Immunol. 127, 1981, Seite 1420]. EAE ist weithin als ein akzeptables Tiermodell für Multiple Sklerose in Primaten anerkannt [Alvord et al. (eds.) 1984, Experimental allergic encephalomyelitis – A useful model for multiple sclerosis. Alan R. Liss, New York). Die Wirkungen der Verabreichung eines IL-12 Antagonisten auf die Induzierung von EAE nach adoptivem Transfer von Lymphozyten von immunisierten Mäusen, die in vitro mit einem synthetischen Peptid von Myelinproteolipidprotein (PLP) restimuliert waren, wurden analysiert.
Adoptiver Transfer von mit PLP sensibilisierten LNC
Weibliche SJL/J-Mäuse (7 bis 10 Wochen alt) wurden von The Jackson Laboratory gekauft, zu fünft in einem Käfig gehalten und mit einem üblichen Nagetierfutter und beliebigen Mengen Wasser gefüttert. Die Mäuse wurden an zwei Stellen in der Flanke mit 150 μg PLP Peptid der Maus immunisiert, das die Bausteine 139 bis 151 enthielt (zur Verfügung gestellt von G. Brown, Genetics Institute). Das PLP wurde in 200 μl Complete Freunds Adjuvants, das 2 mg/ml Mycobacteria Tuberculosis H37RA (Difco) enthielt, zugeführt. An dem Tag der Immunisierung wurden den Mäusen intravenös 0,75 × 10¹⁰ Bordatella pertussis Bazillen (Massachusetts Public Health Laboratories, Boston, MA) injiziert. Zehn Tage nach der Immunisierung wurden die Milzen und die Lymphknoten (popliteal, axillar und brachial) entnommen, und die Zellen wurden in RPMI-1640 resuspendiert, das 10 % FBS (Hyclone), 5 × 10⁵ M2-Mercaptoethanol, 100 μg/ml Streptomycin und 100 Einheiten/ml Penicillin enthielt. PLP wurde den Kulturen in einer Menge von 2 μg/ml zugesetzt. Nach 96 Stunden wurden die Zellen geerntet, zweimal gewaschen, und 30 × 10⁶ Zellen (entweder LNC oder Milz) wurden i.p. in naive SJL/J-Mäuse injiziert.
Klinische Bewertung der Erkrankung

Die Mäuse wurden auf klinische Anzeichen von EAE hin beobachtet und die Anzeichen bewertet nach einer Skala von 0 bis 3 wie folgt:

0,5	Distal schlaffer Schwanz (distal limp tail)
1,0	Vollständig schlaffer Schwanz
1,5	Schlaffer Schwanz und Schwäche der hinteren Gliedmaßen (unsicherer Gang)
2,0	Teilweise Paralyse der hinteren Gliedmaßen
3,0	Vollständige bilaterale Paralyse der hinteren Gliedmaßen

In Vitro Verabreichung von IL-12 vor dem Zelltransfer
Rekombinantes murines IL-12 (20 ng/ml, rmIL-12, Genetics Institute) wurde den in vitro Kulturen von Lymphknoten- oder Milzzellen mit Antigen vor dem Zelltransfer zugesetzt. Nach 96 Stunden wurden die Zellen zweimal gewaschen, und 30 × 10⁶ Zellen wurden in naive SJL/J-Mäuse transferiert, um die Wirkungen des IL-12 auf den nachfolgenden Krankheitsverlauf zu bestimmen.
In getrennten Experimenten wurden LNC entweder mit Antigen allein, mit Antigen plus IL-12 (20 ng/ml) oder mit Antigen plus IL-12 plus einem neutralisierenden Antikörper gegen IFN-γ (5 μg/ml, von Endogen) kultiviert. Am Ende der Kultivierungsperiode wurden die Überstände gesammelt (von drei Flaschen gepoolt), und IFN-γ und TNF-α wurden durch ELISA (von Genzyme) bestimmt. 30 × 10⁶ Zellen aus jeder Gruppe wurden in naive Mäuse transferiert, die auf Zeichen von Krankheit hin beobachtet wurden.
In vivo Verabreichung von IL-12 und Anti-IL-12 Antikörper nach Transfer von mit PLP stimulierten LNC
rmIL-12 (0,3 μg/Maus, 200 μl i.p.) wurde Mäusen verabreicht, nachdem entweder 30 × 10⁶ oder 10 × 10⁶ durch PLP stimulierte LNC transferiert worden waren. IL-12 wurde an den Tagen 0, 1 und 2 nach dem Zelltransfer verabreicht. Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten ein gleiches Volumen des Vehikels allein. Um zu bestimmen, ob IL-12 bei der Induzierung der Erkrankung nach dem Transfer der durch PLP stimulierten LNC involviert war, wurden die Mäuse mit 200 μg eines von Schafen stammenden polyklonalen Antikörpers gegen murines IL-12 (200 μl i.p.) an alternierenden Tagen für insgesamt entweder 6 oder 12 Tage nach dem Zelltransfer behandelt, und die Mäuse wurden auf Anzeichen für Erkrankung hin beobachtet. Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten eine gleiche Menge IgG von Schafen. Die Mäuse wurden beobachtet.
Wirkung von rmIL-12 auf die Restimulation von mit PLP vorbehandelten T-Zellen in vitro
LNC von Mäusen, die mit PLP, wie in Methoden beschrieben, immunisiert worden waren, wurden in vitro 96 Stunden lang mit Antigen stimuliert, in Abwesenheit oder Anwesenheit von rmIL-12 (20 ng/ml), wonach sie hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet wurden, die Krankheit auf naive SIL/J-Mäuse zu übertragen. Mäuse, welche allein mit PLP an vitro stimulierte LNC erhalten hatten, entwickelten klinische Anzeichen einer Erkrankung zwischen den Tagen 6 und 8. Alle Mäuse der Kontrollgruppe erreichten Bewertungen von 2 oder höher (7/7), wobei 4 von 7 Mäusen eine vollständige Paralyse der hinteren Gliedmaßen entwickelten, die zwischen 1 und 4 Tagen andauerte (1a). Alle Mäuse der Kontrollgruppe hatten sich bis zum Tag 19 erholt. Im Gegensatz dazu entwickelten Mäuse, welche an vitro mit PLP und IL-12 kultivierte Zellen erhalten hatten, schwere EAE mit rapidem Auftreten von klinischen Anzeichen (1a). Bis zum Tage 6 hatten 4 von 7 Mäusen klinische Bewertungen von 2 oder höher, und alle Mäuse entwickelten vollständige Paralyse der hinteren Gliedmaßen bis zum Tag 8. In diesem besonderen Experiment haben sich 5 von 7 Mäusen nicht von der Paralyse erholt.
Milzzellen von mit PLP immunisierten Mäusen, die in vitro 96 Stunden lang mit Antigen in Abwesenheit oder Anwesenheit von rmIL-12 (20 ng/ml) stimuliert worden waren, wurden ebenfalls untersucht, um zu bestimmen, ob sie die Krankheit auf naive SJL/J-Mäuse übertragen konnten. Die Schwere der Erkrankung nach dem adoptiven Transfer von 30 × 10⁶ mit PLP stimulierten Milzzellen war mild im Vergleich zu der Krankheit, die durch eine äquivalente Zahl von mit PLP stimulierten LNC induziert worden war, wobei nur 2 von 5 Mäusen eine vollständige Paralyse der hinteren Gliedmaßen entwickelten und die verbleibenden 3 Mäuse nur schwache Anzeichen einer Erkrankung zeigten (1b). Ähnlich den mit LNC beobachteten Resultaten verschlimmerte der Zusatz von rmIL-12 (20 ng/ml) zu der in vitro Kultur der Milzzellen vor dem Transfer die nachfolgende Krankheit (1b). Mäuse, welche mit PLP und rmIL-12 stimulierte Milzzellen erhalten hatten, entwickelten klinische Zeichen der Erkrankung bis zum Tag 6, und alle entwickelten bis zum Tag 12 eine vollständige Paralyse der hinteren Gliedmaßen. Die mittlere Dauer der Paralyse betrug bei diesen Mäusen 5,4 Tage (Bereich 2 bis 8 Tage).
Produktion von Cytokin nach in vitro Stimulation von LNC mit PLP und IL-12
Um die Wirkungen von IL-12 auf die Produktion von Cytokin während der in vitro Stimulation mit Antigen zu bestimmen, wurden LNC von mit PLP vorbehandelten Mäusen entweder mit PLP allein, mit PLP und IL-12 (20 ng/ml) oder mit PLP, IL-12 und einem neutralisierenden Anti-IFN-γ Antikörper kultiviert. Am Ende der an vitro Kultur wurden IFN-γ und TNF-α, in dem Überstand mittels ELISA gemessen, und die Zellen wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Krankheit in naive Mäuse zu übertragen. Der Zusatz von IL-12 während der in vitro Stimulation von LNC mit PLP führte zu einem mehr als zehnfachen Anstieg des IFN-γ (5,2 ng/ml im Vergleich gegenüber 64 ng/mg IL-12) und zu einem zweifachen Anstieg des TNF-α in dem Überstand der Zellkultur (2a). Der Zusatz eines neutralisierenden Antikörpers gegen IFN-γ während der Kultivierung der LNC mit Antigen und IL-12 blockierte den Nachweis von IFN-γ vollständig, aber hatte keine Wirkung auf den Anstieg von TNF-α in den Überständen, der etwa zweifach höher im Vergleich zur Kontrolle war (100 pg/ml in der Kontrolle verglichen mit 180 pg/ml mit αIFN-γ Antikörper). Weiterhin waren transferierte Zellen, die in vitro mit PLP und IL-12 in Gegenwart eines neutralisierenden Antikörpers gegen IFN-γ stimuliert worden waren, noch in der Lage, eine schwere Erkrankung mit der gleichen Kinetik und Dauer zu induzieren wie nach dem Transfer von Zellen beobachtet wurde, die mit PLP und IL-12 allein stimuliert worden waren (2b).
Die Wirkung einer in vivo Verabreichung von IL-12 auf den Verlauf der Krankheit
Nach dem Transfer von 30 × 10⁶ mit PLP stimulierten LNC wurde den Mäusen 3 Tage lang rmIL-12 (0,3 μg/Maus) oder Kochsalzlösung verabreicht und die Wirkungen auf den folgenden Verlauf der Krankheit beobachtet. Das Einsetzen und der Fortschritt der Krankheit in der Kontrollgruppe war ähnlich wie zuvor beschrieben, wobei die klinischen Anzeichen zwischen den Tagen 6 und 8 nach dem Transfer der LNC evident waren und 80 % der Mäuse eine vollständige Paralyse der bilateralen hinteren Gliedmaßen entwickelten. In den Mäusen der Kontrollgruppe hatte die Krankheit etwa 3 Tage lang ihren Höhepunkt, wonach die Mäuse sich spontan erholten (3a). Die Verabreichung von rmIL-12 (0,3 μg/Maus) 3 Tage lang nach dem Transfer einer äquivalenten Anzahl von vorbehandelten LNC von denselben in vitro Kulturen änderte den Verlauf der Krankheit dramatisch. Obwohl die Symptome bei den mit IL-12 behandelten Mäusen nur wenig früher einsetzten (Tag 5), war der nachfolgende Verlauf bis zum Höhepunkt der Krankheit beschleunigt, wobei alle Mäuse bis zum Tag 8 eine vollständige Paralyse der hinteren Gliedmaßen zeigten. Die Dauer der Paralyse war ebenfalls erheblich verlängert und betrug bis zu 14 Tage (Bereich 11 bis 14). Mehrere mit rmIL-12 behandelte Mäuse, die eine verlängerte Paralyse entwickelten, welche noch anhielt, nachdem die Mäuse der Kontrollgruppe sich vollständig erholt hatten, wurden geopfert.
In einem gesonderten Experiment wurden die Wirkungen einer in vivo Verabreichung von rmIL-12 auf die Schwere der Erkrankung nach dem Transfer einer suboptimalen Anzahl von LNC (10 × 10⁶Zellen) untersucht. Die Mäuse der Kontrollgruppe, die diese niedrigere Anzahl von LNC erhielten, entwickelten eine milde Erkrankung (3b), wobei eines von vier Tieren eine vollständige Paralyse der hinteren Gliedmaßen entwickelte, während die übrigen drei Mäuse nur minimal erkrankten. Im Gegensatz dazu entwickelten Mäuse, die mit rmIL-12 in vivo nach dem Transfer von 10 × 10⁶ LNC Zellen behandelt worden waren, vollständige klinische Symptome einer Erkrankung, wobei alle Mäuse mit 2 oder höher bewertet wurden und 3 von 4 Mäusen eine vollständige Paralye der hinteren Gliedmaßen zeigten. Die Wirkungen von rmIL-12 waren auch nach dem Transfer von so wenig wie 5 × 10⁶ LNC Zellen offensichtlich, wobei 3 von 5 Mäusen eine Bewertung von 1 erreichten. Bei dieser Zellzahl zeigten Mäuse der Kontrollgruppe keine Zeichen von Erkrankung (Daten nicht dargestellt).
Die Wirkungen der Verabreichung von Anti-IL-12 Antikörper auf den Verlauf der Erkrankung
Um zu bestimmen, ob endogenes IL-12 eine wesentliche Rolle bei dem Transfer der Krankheit spielt, wurden Mäuse mit 200 μg eines von Schafen stammenden polyklonalen Antikörpers gegen murines IL-12 jeden zweiten Tag 6 oder 12 Tage lang nach dem Transfer von 30 × 10⁶ mit PLP stimulierte LNC Zellen behandelt. Mäuse der Kontrollgruppe erhielten eine gleiche Menge von Schaf IgG. Das Einsetzen der klinischen Symptomen in der mit Schaf IgG behandelten Kontrollgruppe war ähnlich wie bei den unbehandelten Mäusen, die mit PLP stimulierte LNC erhielten (Tag 6 bis 7, 4a). Alle Mäuse der Kontrollgruppe entwickelten Anzeichen von Krankheit, die mit 2 oder höher bewertet wurden (70 % entwickelten volle Paralyse). Die Zuführung von Anti-IL-12 Antikörper während der ersten 6 Tage nach dem Transfer verminderten nicht die Schwere der Krankheit, das Einsetzen der klinischen Anzeichen war jedoch um etwa 7 Tage verzögert. Diese Mäuse entwickelten danach die Krankheit, wobei alle Mäuse eine Bewertung von 2 oder höher erreichten (80 % entwickelten volle Paralyse) mit einem zeitlichen Verlauf der Erholung ähnlich dem der Tiere in der Kontrollgruppe. Um zu bestimmen, ob diese Verzögerung des Transfers der Krankheit durch eine längere Verabreichung von Anti-IL-12 Antikörper unterstützt werden könnte, behandelten wir Mäuse 12 Tage lang nach dem adoptiven Transfer von mit PLP geprimten LNC. Mäuse, welche nach dem Transfer von mit PLP stimulierten LNC 12 Tage lang jeden zweiten Tag mit Anti-IL-12 Antikörper behandelt worden waren, zeigten nicht nur eine ausgeprägtere Verzögerung in der Kinetik des Einsetzens der Krankheit, sondern erfuhren auch eine dramatisch verminderte klinische Erkrankung, wobei nur 2 von 5 Mäusen milde Anzeichen der Krankheit entwickelten (4b).

Claims

Verwendung eines IL-2 Antagonisten zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung eines Säugetier-Subjektes, mit der Maßgabe, dass dieser Antagonist keiner der folgenden ist: a) ein IL-12 Rezeptor, welcher IL-12 spezifisch und in sättigbarer Weise bindet mit einer apparenten Affinität von 5-10 nM; b) ein Immunglobulin, welches in der Lage ist, selektiv an einen IL-12 Rezeptor zu binden; c) ein IL-12 p40 Homodimer; oder d) eine IL-12 p40 Untereinheit.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei dieser IL-12 Antagonist ein mit IL-12 immunreaktiver Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei dieser Antikörper ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei dieser Antagonist in einer Dosis von 0,05 bis 25 mg/kg zu verabreichen ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei dieser Antagonist in einer Dosis von 0,2 bis 2 mg/kg zu verabreichen ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei diese Autoimmunerkrankung durch einen Anstieg eines Zytokins, ausgewählt aus TNF-α oder INF-γ, gefördert wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei diese Autoimmunerkrankung aus multipler Sklerose, systemischem Lupus Erythematodes, rheumatoider Arthritis, autoimmuner Lungenentzündung, Guillain-Barré Syndrom, autoimmuner Thyroiditis, und autoimmuner entzündlicher Augenerkrankung ausgewählt ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei diese Autoimmunerkrankung multiple Sklerose ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei diese Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei diese pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff enthält.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei diese pharmazeutische Zusammensetzung 0,1 Mikrogramm bis 1 Milligramm pro Milliliter des IL-12 Antagonisten enthält.