DE69525176T2 - Filtrationsverfahren zur entfehrnung von viren aus virus-kontaminierten wasserigen lösungen - Google Patents

Filtrationsverfahren zur entfehrnung von viren aus virus-kontaminierten wasserigen lösungen

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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Virusfiltration einer Lösung, die mindetens ein Makromolekül enthält, vermittels eines Gesamtsalzgehaltes der Lösung im Bereich von etwa 0,2 M bis zur Sättigung der Lösung bezüglich des betreffenden Salzes. Das erfindungsgemäße Verfahren reduziert die Verweilzeit und das Ausmaß, bis zu dem die Lösung verdünnt werden muß, und sie optimiert die Ausbeute bei der Virusfiltration von vornehmlich Proteinen, Polysacchariden und Polypeptiden. Die Verringerung des Virusgehaltes ist mindestens genauso gut wie bei herkömmlichen Techniken, bei denen der Gesamtsalzgehalt niedrig ist. Die vorliegende Erfindung erleichtert die Virusfiltration mit Hilfe der sogenannten "Dead - End" - Technik, welche zu mehreren Verfahrensvorteilen und wirtschaftlichen Vorteilen im Vergleich zu der normalerweise angewandten tangentialen Virusfiltrationstechnik führt. Wenn der Plasmaproteinfaktor IX virusfiltriert wird, wird die bei der Virusfiltrationsstufe erreichte Ausbeute von etwa 70% auf über 95% erhöht, indem der Salzgehalt der Lösung entsprechend der vorliegenden Erfindung erhöht wird.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Dem Problem der Viruskontamination von verschiedenen Proteinpräparationen, die für eine Medikation am Menschen vorgesehen sind, wurde in den letzten Jahren größere Beachtung geschenkt. Z. B. wurden gelegentlich Berichte vorgelegt, die z. B. Blutproteine betrafen, welche mit Hepatitis-A-Virus, Hepatiti-B-Virus, Hepatitis-C-Virus und/oder dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) kontaminiert waren. Unter Beachtung dieser Berichte haben die Regulatorien bzw. Behörden mehrerer Länder ihre Anforderungen bezüglich der Reinigung von Proteinpräparationen im Hinblick auf mögliche Viruskontaminationen verschärft.
  • Heutzutage werden bei herkömmlichen Techniken Viren mit der Hilfe von chemischen Zusatzstoffen, vornehmlich Lösungsmitteln und Detergentien, und/ oder durch Exposition der Viren erhöhten Temperaturen inaktiviert. Das erstere Verfahren hat den Nachteil, daß es allein bei Viren mit Lipidhüllen funktioniert, z. B. beim Hepatitis Virus B und HIV. Die oben erwähnte letztere Technik hat den Nachteil, daß viele Proteine bei jenen Temperaturen, die zur wirksamen Verringerung des kontaminierenden Virus erforderlich sind, thermisch instabil sind.
  • Die US - A - 4 473 494 (dem U.S. - Militärminister (Secretary of the Army) zugewiesen) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von stromafreiem, Nicht - Häm - Protein - freiem Hämoglobin durch die Verwendung von Zinkionen, um die Präzipitation eines an Zinkionen gebundenen unlöslichen Hämoglobinkomplexes zu fördern, gefolgt von einer Membranultrafiltration des Zink-Hämoglobin-Komplexes von dem flüssigen Filtratmedium. Bei dem einzigen Schritt, wo Viren vom Hämoglobin entfernt würden, liegt der Gesamtsalzgehalt unter 0,05 M, d. h. der Gesamtgehalt an Salz ist herkömmlich.
  • Die EP-A-0307373 (der Ares-Serono zugewiesen) betrifft die Entfernung von Viren und/oder anderen Kontaminanten von biologischen Materialien in flüssiger Form unter Verwendung von Ultrafiltrationsmembranen mit einem Cut - off bzw. einer Ausschlußgrenze von 100 000 Da. Ein bevorzugtes biologisches Material ist menschliches Wachstumshormon. Bei den Beispielen der EP-A-0307373 liegt der Gesamtgehalt an Salz bei dem Virusfiltrationsschritt im Bereich von 0,01 bis hin zu 0,10 M (NH&sub4;CO&sub3;), d. h. der Gesamtgehalt an Salz ist herkömmlich.
  • Es besteht somit ein Bedarf nach einem wirksamen Virusverringerungsverfahren, welches auf unterschiedliche Typen von Makromolekülen, vornehmlich Proteinen, und bei unterschiedlichen Virustypen angewendet werden kann.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Verweilzeit beträchtlich zu verringern, wenn Lösungen, die Makromoleküle enthalten, virusfiltriert werden.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, die flüssigen Volumina beträchtlich zu verringern, wenn Lösungen, die Makromoleküle enthalten, virusfiltriert werden.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, die Filterfläche zu verringern, welche erforderlich ist, wenn man Lösungen, die Makromoleküle enthalten, virusfiltriert.
  • Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, zu erreichen, daß die Makromolekülausbeute über etwa 90% bei dem Virusfiltrationsschritt liegt.
  • Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Polymerisation zu verringern, die auf der Virusfilteroberfläche geschieht, um es zu ermöglichen, daß die Flußrate erhöht wird und die Prozeßzeit vermindert wird.
  • Diese und andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erfüllt, welche ein Verfahren der Virusfiltration einer Lösung betrifft, die mindestens ein Makromolekül enthält, wobei der Gesamtsalzgehalt der Lösung innerhalb des Bereiches von etwa 0,2 M bis hin zur Sättigung der Lösung durch das betreffende Salz liegt.
  • Die Erfinder dieser Erfindung haben somit herausgefunden, daß die Virusfiltration sehr viel effektiver als bisher bekannt ausgeführt werden kann, indem der Salzgehalt der Lösung erhöht wird. Diese Erkenntnis ist überraschend, da man bisher bei der Virusfiltration von Proteinen angenommen hat, daß allein die Proteinkonzentration, die Flußrate und der pH-Wert einen Einfluß auf den Vorgang hat.
  • Man nimmt an, daß der bei höheren Salzkonzentrationen erreichte erhöhte Filtrationseffekt darauf zurückzuführen ist, daß das Protein sich zusammenzieht und dadurch leichter durch die Filterporen dringen kann. Es ist ebenfalls denkbar, daß die Wechselwirkung zwischen den Makromolekülen selbst verringert wird und/oder zwischen den Makromolekülen und dem Material der Filtermembran. Es ist ebenfalls denkbar, daß Proteine mit einer größeren Anzahl von hydrophoben Gruppen stärker durch eine erhöhte Salzkonzentration beeinflußt werden.
  • Je näher das Molekulargewicht oder die relative Molekülmasse des Makromoleküls bei der Porengröße der Filtermembran liegt, desto wirksamer ist die vorliegende Erfindung. Die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls verstärkt, wenn der Unterschied in der Größe und/ oder im Molekulargewicht der Kontaminanten und des Produktes zunimmt, d. h. mit zunehmender Konzentration an hochmolekularen Kontaminanten im Produkt.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, daß spezifische Fraktionen von einem gewünschten Produkt abgetrennt werden, ermöglicht es z. B., daß unerwünschte Proteine von dem Protein abgetrennt werden, das das Produkt ausmacht.
  • Die Anwendung eines hohen Salzgehaltes gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht ebenfalls die Verwendung der sogenannten "Dead-End"-Filtertechnik. Diese bevorzugte Ausführungsform hat mehrere Vorteile gegenüber tangentialen Filtrationsverfahren, die normalerweise angewendet werden, insbesondere mit einer Porengröße von 5-30 nm. z. B. sind die erforderliche Gerätschaft und die erforderlichen Arbeitsschritte viel einfacher und somit weniger teuer. Die Verwendung der "Dead-End"-Filtration verringert ebenfalls den Verlust des Makromoleküls, vermindert die Prozeßzeit, erhöht die Permeabilität des Makromoleküls durch den Filter und ermöglicht eine allgemeine konstante Konzentrierung des Makromoleküls, die über den Filter zu erreichen ist, sowie einen konstanten Membrandruck. Ein weiterer Vorteil bei der Dead-End-Filtrationstechnik ist die Tatsache, daß das Scaling-up von Virusfiltrationsverfahren vom Labormaßstab zum Industriemaßstab beträchtlich vereinfacht wird.
  • Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung liegt der Gesamtsalzgehalt der Lösung geeigneterweise im Bereich von 0,3 bis 3,0 M, vorzugsweise im Bereich von 0,4 bis 2,5 M, und er liegt stärker bevorzugt im Bereich von 0,6 bis 2,0 M. Es ist besonders bevorzugt, daß der Gesamtsalzgehalt der Lösung im Bereich von 0,8 bis 1,5 M beträgt.
  • Sofern erforderlich, kann der Gesamtsalzgehalt der Lösung eingestellt werden, indem jedwedes annehmbare Salz hinzugegeben wird. Z. B. ist es möglich, lösliche anorganische Salze, lösliche organische Salze oder Kombinationen solcher Salze zu verwenden. Es wird angenommen, daß wichtige Verfahrensvorteile erreicht werden, wenn Salze verwendet werden, die einen hohen Aussalzeffekt entsprechend der sogenannten Hofmeistersche Reihen zeigen. Hier wird Bezug genommen auf S. Glasstone, Textbook of Physical Chemistry, von Nostrand Co., Toronto, 2. Ausgabe, April 1946, Seiten 1254-1259. Die wichtigsten Beispiele für Anionen, welche einen solchen hohen Aussalzeffekt aufweisen, sind Citrat, Tartrat, Sulfat, Acetat und Phosphat. Kationen, welche vorteilhaft bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommen können, sind monovalente Kationen, wie Natrium, Kalium und Ammonium, sowie zweiwertige Kationen, wie Calcium. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumacetat und Natriumcitrat oder Kombinationen davon sind besonders bevorzugte Salze gemäß der Erfindung im Hinblick auf die Vorteile, die durch pharmazeutisch annehmbare Additive geboten werden. Es ist ebenfalls denkbar, ein oder mehrere Salze der Reihe nach hinzuzusetzen, wenn der Filtrationsprozeß in zwei oder mehreren Schritten durchgeführt wird.
  • Eine Proteinkonzentration innerhalb eines Bereiches von etwa 5 bis etwa 10 mg/ml Lösung wird häufig für eine Virusfiltration empfohlen. Wenn die vorliegende Erfindung angewendet wird, wurde überraschenderweise herausgefunden, daß Lösungen mit einer höheren Proteinkonzentration, von etwa 10 bis etwa 20 mg/ml durch den Virusfilter vorteilhaft verarbeitet werden konnten.
  • Die Lösung sollte eine Temperatur in einem Bereich von 0ºC bis zu der Temperatur aufweisen, bei der das betreffende Protein denaturiert wird. Die Temperatur der Lösung liegt geeigneterweise in einem Bereich von 10ºC bis 50ºC, vorzugsweise von 20ºC bis 35ºC.
  • Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung sollte die Lösung einen pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis etwa 9, geeigneterweise von 4 bis 8, aufweisen. Der pH - Wert der Proteinlösung sollte nicht zu nahe am isoelektrischen Punkt des betreffenden Proteins liegen. Z. B. wird im Fall von Gammaglobulin ein besseres Ergebnis mit einem pH von 5,5 als mit einem pH von 6,8 erhalten.
  • Bei der vorliegenden Erfindung bezieht sich Lösung auf eine Lösung, welche mindestens 50 Gew.-% Wasser enthält, gegebenenfalls ein oder mehrere Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton oder Acetonitril, einschließend.
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um die Prozeßarbeitsschritte zu optimieren, wenn Lösungen virusfiltriert werden, die eine große Anzahl von unterschiedlichen Typen an Makromolekülen enthalten. Beispiele solcher Moleküle sind Proteine, Polysaccharide und Polypeptide oder Kombinationen davon. Der Ursprung der Makromoleküle ist für den Einsatz der vorliegenden Erfindung irrelevant. Die Makromoleküle können somit aus dem Pflanzenreich oder dem Tierreich stammen, oder sie können ursprünglich mittels industrieller Verfahren hergestellt werden. Gleichwohl sind die Makromoleküle geeigneterweise menschlichen oder tierischen Ursprungs oder gentechnisch erzeugt (Rekombinanten).
  • Besonders geeignete Proteine bezüglich der vorliegenden Erfindung sind Faktor VIII, Faktor IX, Antithrombin III, Gammaglobulin, Albumin, Streptokinase, Apolipoproteine und Wachstumshormone.
  • Ein besonders bevorzugtes Faktor IX-Produkt ist Nanotiv®, welches von der Pharmacia AB, Stockholm, Schweden vertrieben wird. Der Vorteil mit diesem Produkt ist der, daß seine spezifische Aktivität vor der Filtration ausreichend hoch ist, um die Verwendung eines Filters sehr feiner Struktur zu ermöglichen. Dies ermöglicht es, daß die Viruskonzentration auf einen extrem niedrigen Gehalt abgesenkt werden kann, wobei gleichzeitig der Filtrationsvorgang selbst sehr schnell ist und zu einer hohen Ausbeute führt.
  • Bevorzugte Typen an Faktor VIII sind Deletionsabkömmlinge von durch Rekombinanten erzeugten Faktor VIII-Produkten. Ein besonders bevorzugtes Faktor VIII-Produkt ist r-VIII SQ, welches von der Pharmacia AB, Stockholm, Schweden vertrieben wird. Ein Vorteil dieses Produktes ist der, daß das Rekombinanten - erzeugte Produktmolekül nicht den inaktiven Zwischenteil des natürlichen Faktor VIII - Moleküls aufweist. Dies führt beim Molekül zu einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 170 000. Ein Molekül dieser Größe ist besonders für die Filtration mit solchen Filtern geeignet, welche eine beträchtliche Virusverminderung möglich machen.
  • Bevorzugte Apolipoproteine schließen Apolipoprotein AI (Apo AI), Apolipoprotein AII (Apo AII), Apolipoprotein AIV (Apo AIV), Apolipoprotein E (Apo E) und Varianten oder Mischungen davon ein. Varianten schließen Preformen, Fragmente und gestutzte, gestreckte oder mutierte Formen von Apo AI, Apo II, Apo IV und Apo E ein. Mutierte Formen, bei denen mindestens eine Arginingruppe durch eine Cysteingruppe ersetzt worden ist, sind besonders bevorzugt. Eine solche mutierte Form ist Apo A-IMilano (Apo A-IM), welches ebenfalls durch die Technik mittels rekombinanter DNA von der Pharmacia AB, Stockholm, Schweden, hergestellt wurde.
  • Polysaccharide, welche gemäß der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt sind, sind Glycosaminoglycane und Bakterienpolysaccharide. Beispiele für Glycosaminoglycane sind Heparine, Heparinfragmente, Heparinderivate, Heparansulfat und Hyaluronsäure. Eine besonders bevorzugte Gruppe für Glycosaminglycanebesteht aus niedermolekulargewichtigen Heparinen mit einem mittleren Molekulargewicht von bis zu etwa 10 000, vorzugsweise 2 000 bis 8 000.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignete Polypeptide bioaktive Polypeptide, wie rekombinante menschliche Wachstumshormone, welche in Säugerzellen gebildet werden.
  • Die vorliegende Erfindung kann somit verwendet werden, um den Vorgang der Virusfiltrierung von Lösungen zu optimieren, welche z. B. Proteine, Polysaccharide und Polypeptide enthalten. Gleichwohl wird die Erfindung im nachfolgenden mit Bezug auf Lösungen beschrieben, welche Proteine, insbesondere Proteine, welche natürlich im Menschen auftreten, enthalten.
  • Die Viren, welche in Proteinlösungen auftreten können, sind normalerweise viel größer als die Proteine selbst. Es wird somit angenommen, daß die Viren von Proteinen entsprechend der Größe z. B. mittels Filtration entfernt werden können.
  • Viren, die effizient mittels der vorliegenden Erfindung entfernt werden können, können eine Größe von unter etwa 350 nm aufweisen. Die Größe der Viren, welche entfernt werden können, beträgt geeigneterweise weniger als 200 nm, vorzugsweise weniger als 150 nm. Normalerweise sind die Viren, welche entfernt werden können, größer als etwa 20 nm, d. h. die ungefähre Größe des Parvovirus.
  • Die vorliegende Erfindung ist vornehmlich zur Entfernung von Viren von Makromolekülen gedacht, wobei die Makromoleküle das Produkt von Interesse sind. Es liegt gleichwohl innerhalb des Umfangs der Erfindung das vorliegende Verfahren zur Abtrennung von Viren von Makromolekülen anzuwenden, wobei die Viren das Produkt von Interesse sind. Ein Beispiel ist die Reinigung vom Parvovirus zur Verwendung als ein Testagens und von Poliovirus zur Verwendung als ein Impfstoff, wobei z. B. Proteine und Polysaccharide durch das vorliegende Verfahren entfernt werden können.
  • Die Virusfiltration wird normalerweise in einem tangentialen Filtrationsverfahren oder in einem sogenannten "Dead-End"-Filtrationsverfahren durchgeführt. Bei der tangentialen Virusfiltration wird die Proteinlösung mit einer konstanten Fließrate auf der Retentionsseite entlang gepumpt, wohingegen eine andere Pumpe die Proteinlösung durch den Filter durch Ansaugen abzieht. Wenn ein bestimmtes Volumen auf der Retentionsseite erhalten worden ist, wird ein Puffer auf der Retentionsseite hinzugesetzt. Dieser Vorgang wird sofern erforderlich viele Male wiederholt, wobei der Hauptteil des verbliebenen Proteins den Filter passiert, wobei der Virus auf der Retentionsseite zurückgehalten wird. Ein solches Verfahren wird als Diafiltration bezeichnet. Der Filter wird normalerweise nach jedem Lauf weggeworfen, um eine Übertragung des Virus zu vermeiden.
  • Bei der sogenannten "Dead-End"-Virusfiltration kann der gleiche Virusfilter, wie der bei der tangentialen Virusfiltration, verwendet werden, obgleich die periphere Gerätschaft und die Arbeitsschritte viel einfacher und weniger teuer sind als im Fall der tangentialen Virusfiltration. Somit involviert im Prinzip die "Dead-End"-Filtration das Einbringen der die Makromoleküle enthaltenden Lösung in ein Druckgefäß vor der Filtration und Pressen der Lösung durch den Virusfilter mit Hilfe einer Druckquelle, geeigneterweise Stickstoff(gas).
  • Der Grad der Feinheit von Filtern wird allgemein normalerweise als Porengröße oder ungefähres Molekulargewicht (relative Molekülmasse) angegeben, bei der die Moleküle durch den Filter gestoppt werden, der sogenannte Cut - off. Bei der vorliegenden Erfindung können die Virusfilter einen Cut - off - Wert von etwa 1 000 000, geeigneterweise 500 000, aufweisen. Um kleine Viren zu entfernen, sollten die Virusfilter einen Cut-off-Wert von 200 000, vorzugsweise 100 000, besitzen. Um eine maximale Virusverminderung zu erreichen, sollte der Virusfilter einen Cut - off - Wert aufweisen, der etwas höher als das Makromolekül ist, welches virusfiltriert wird.
  • Virusfilter sind im Fachbereich bekannt und werden unter anderen von Millipore aus Massachusetts, USA, und Asahi Chemical Industry Co., Ltd aus Japan vertrieben. Millipore vertreibt Filter mit zwei Typen an Membranen, in Abhängigkeit von der Größe des betreffenden Proteins. Z. B. verreibt Millipore unter anderen ViresolveTM/70 für Proteine mit einem Molekulargewicht oder einer relativen Molekülmasse von bis zu etwa 70 000, und ViresolveTM/180 für Proteine mit einem Molekulargewicht bis zu etwa 180 000. Dieser zuletzt genannte Filter kann z. B. für monoklonale Antikörper verwendet werden. Asahi Chemical Industry vertreibt unter anderen Dingen PlanovaTM35- und PlanovaTM15-Filter, wobei dieser letztgenannte Filter verwendet wird um kleinere Viren, wie den Poliovirus, zu entfernen.
  • Wie vorstehend erwähnt, hängt die Wahl des Filters unter anderen Dingen von der Größe des betreffenden Proteins ab. Faktor IX, Antithrombin III, menschliches Serumalbumin (HSA) und Apo A-IM (das Dimer) haben alle ein Molekulargewicht von rund 60 000-70 000, wobei ViresolveTM/70 z. B. eine geeignete Alternative ist. Gammaglobulin hat ein Molekulargewicht von etwa 180 000, wobei ViresolveTM/180 z. B. eine geeignete Alternative ist. Der letztgenannte Filter ist ebenfalls für die Verwendung mit dem durch Rekombinanten erzeugten Faktor VIII-Produkt r-VIII SQ geeignet, welches ein Molekulargewicht von etwa 170 000 aufweist, wie oben erwähnt.
  • Die Möglichkeit der Wahl eines Filters mit feiner Struktur gibt es außerdem nur dann, wenn die Proteinlösung einen hohen Reinheitsgrad vor der Filtration aufweist. Infolge ist die Verwendung eines Filters mit feiner Struktur eine Voraussetzung für die Möglichkeit, Proteinlösungen zu erzeugen, welche einen sehr niedrigen Virusgehalt im Endprodukt aufweisen. Um so in der Lage zu sein, die Viruskonzentration auf ein sehr niedrigen Gehalt zu reduzieren, ist ein Filter mit sehr feiner Struktur erforderlich, z. B. ViresolveTM/70. Die Viruskonzentration kann nicht auf einen solche niedrigen Wert gesenkt werden, wenn ViresolveTM/180 zur Anwendung kommt.
  • Die Wirksamkeit oder Effizienz des Filtrationsschrittes wird durch die Reinheit der durch den Filter geschickten Proteinlösung beeinflußt. Diesbezüglich führt eine hohe spezifische Aktivität vor der Filtration zu einer höheren Ausbeute im Filtrationsschritt. Z. B. wurde im Fall von bevorzugten Ausführungsformen, die zur Anwendung kamen, wenn Faktor IX enthaltende Filtrationslösungen filtriert wurden, herausgefunden, daß die Proteinausbeute in dem Filtrationsschritt von etwa 70% auf über 95% gesteigert werden kann. Jedoch ist es bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung möglich, Proteinausbeuten von über 90% zu erreichen, selbst wenn man mit Lösungen niedriger spezifischer Aktivität arbeitet.
  • Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, den Gehalt sehr kleiner, nicht - komplexer Viren bzw. Viren ohne komplexe Hülle, wie den Parvovirus, um mindestens 3 Log, geeigneterweise mindestens 4 Log, und vorzugsweise um mindestens 5 Log zu verringern. Die Verringerung ist sehr gut mit der Tangentialtechnik, jedoch noch besser mit der "Dead- End"-Technik, wenn sie gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt.
  • Gemäß der Erfindung - wird die Virusfiltration am Ende einer Proteinherstellungssequenz durchgeführt, da eine hohe spezifische Aktivität vor der Filtration zu einer höheren Proteinausbeute im Filterschritt führt. Die vorliegende Erfindung wird bevorzugterweise als letzter Reinigungsschritt durchgeführt, wahlweise gefolgt von einem Schritt zur Einstellung z. B. der Proteinkonzentration, des Salzgehaltes oder des pH-Wertes des Endproduktes. Eine nachfolgende Diafiltrationsstufe unter Verwendung einer UF-Membran kann ebenfalls zur Anwendung kommen, um Salze zu entfernen, welche, obgleich sie von einem Verfahrensaspekt betrachtet während der Virusfiltration vorteilhaft sind, nicht in dem Endprodukt vorkommen sollten. Proteinlösungen, welche für die Verabreichung fertig sind, werden normalerweise eine physiologische Lösung enthalten, z. B. 0,15 M Natriumchlorid bei einem pH-Wert von 7, in Kombination mit einem oder mehreren Stabilisatoren, wie Saccharose oder Aminosäuren. Das Virusfiltrationsverfahren kann auch in zwei oder mehreren Schritten, mit oder ohne Zwischenverfahrensschritte, durchgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung senkt wirksam den Gehalt von Viren mit Lipidhüllen und Viren ohne Lipidhüllen. Beispiele für Viren ohne eine Lipidhülle sind der Hepatitisvirus A, Poliovirus und Parvovirus, welche relativ kleine Viren sind. Beispiele für Viren mit einer Lipidhülle sind der Hepatitis - B - Virus, der Hepatitis - C - Virus und der Human Immunodeficiency Virus (HIV).
  • Die Erfindung wird nun genauer mit Hilfe von veranschaulichenden, nicht beschränkenden Beispielen erläutert.
    • Experimenteller Abschnitt
  • Experimente wurden durchgeführt, bei denen der Siebkoeffizient von Proteinen oder der Proteinpermeabilitätsfaktor zuerst bei unterschiedlichen Filtratfließraten bestimmt wurde. Der Siebkoeffizient oder der Proteinpermeabilitätsfaktor wird als P/R angegeben, wobei P die Proteinkonzentration auf der Permeatseite (der Filtratseite), gemessen mittels Absorption bei 280 nm (A&sub2;&sub8;&sub0;), und R die Proteinkonzentration auf der Retentionsseite (R), gemessen mittels Absorption bei 280 nm (A&sub2;&sub8;&sub0;), ist. Die Filtratfließrate, welche den höchsten Siebkoeffizienten in Abwesenheit einer Polymerisation auf dem Filter ergab, wurde dann gewählt. Eine Ausbeuteoptimierung wurde ebenfalls mit einigen Makromolekülen durchgeführt.
    • Beispiel 1 (zum Vergleich)
  • Experimente wurden mit dem Faktor IX als Makromolekül durchgeführt, um den Effekt von zwei Salzgehalten auf die Proteinsiebcharakteristik, das Diafiltrationsvolumen und die Ausbeute zu veranschaulichen. Eine kommerzielle Lösung, die Faktor IX, Nanotiv ®, enthielt, wurde von der Pharmacia AB, Stockholm, Schweden, erhalten. Die den Faktor IX enthaltende Lösung wurde aus menschlichem Blutplasma erhalten, und sie wurde vor der Filtration in einer Sequenz von Arbeitsschritten behandelt, die den Anionenaustausch, eine chemische Virusinaktivierung, Affinitätschromatographie und Kationenaustausch involvierte. Die Lösung wurde zwischen jedem Schritt ultrafiltriert, jedoch nicht zwischen dem Schritt der chemischen Inaktivierung und dem Schritt der Affinitätschromatographie.
    • Versuchsbedingungen:
  • Reinheitsgrad der eintretenden Proteinlösung: hoch
  • Puffer: 0,144 M NaCl + 0,0055 M Natriumcitrat
  • Gesamtsalzgehalt: etwa 0,15 M
  • Proteinkonzentration; 0,5-1,0 A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten
  • pH-Wert der Proteinlösung: 7
  • Versuchstemperatur: Raumtemperatur (etwa 23ºC)
  • Filter zur Virusabtrennung: ViresolveTM/70
  • Filtertechnik: tangential
  • Filterfläche: 1/3 ft²
  • Retentionsflußrate: 41 1/h
  • Pumpe: Watson-Marlow 504
  • Transmembrandruck: 0,2-0,3 bar
  • Tabelle 1
  • Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten
  • Es wurde eine optimale Flußrate von 20,8 ml/min durch die Bestimmung des Proteinsiebkoefiizienten erhalten. Tabelle 2 Ausbeutenoptimierung: Filtrationsflußrate: 20,8 ml/min, hoher Reinheitsgrad der Proteinlösung; Puffer: 0,144 M NaCl + 0,0055 M Natriumcitrat; Gesamtsalzgehalt; etwa 0,15 M
  • Die Diaflitration mit einer Verdünnung von etwa 1 Volumeneinheit pro Volumeneinheit der eintretenden Proteinlösung (1 + 1) führte zu einer Ausbeute von etwa 90%.
    • Beispiel 2
  • Es wurden die gleichen Bedingungen wie jene beim Beispiel 1 angewandt, mit der Ausnahme, daß in diesem Fall der Puffer 1,0 M NaCl + 0,01 M Natriumcitrat enthielt, was zu einem Gesamtsalzgehalt von etwa 1,0 M führte. Tabelle 3 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten
  • Diese Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten ergab eine optimale Filtratflußrate von 24,3 ml/min. Tabelle 4 Ausbeuteoptimierung: Filtratflußrate: 24,3 ml/min.
  • Diafiltration mit einer Verdünnung von etwa 0,3 Volumeneinheiten pro Volumeneinheit der eintretenden Lösung (1 + 0,3) führte zu einer Ausbeute von > 95%.
    • Beispiel 3
  • Der Virusentfernungseffekt, der durch die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Experimente erreicht wurde, wurde mittels einer Virusuntersuchung bestimmt. Die Untersuchung wurde beim Parvovirus durchgeführt, welche Viren ohne Lipidhülle sind und eine Größe von 20-25 nm aufweisen. Im Prinzip fallen Versuche mit solchen Viren in die Kategorie des "schlimmsten Falles", da sie zu den kleinsten bekannten Viren gehören.
  • Der Parvovirus wurden den den Faktor IX enthaltenden Lösungen mit einem Salzgehalt von 0,144 M NaCl + 0,0055 M Natriumcitrat (Experiment 1, zum Vergleich) bzw. 1,0 M NaCl + 0,01 M Natriumcitrat (Experiment 2) hinzugesetzt. Die Lösungen wurden dann gemäß den Beispielen 1 und 2 virusfiltriert. Die Lösungen wurden bezüglich des Parvovirus sowohl vor und nach der Virusfiltration analysiert.
    • Experiment Virusverminderung
  • 1 (zum Vergleich) 1 · 103,7
  • 2 1 · 104,0
  • Die Ergebnisse zeigen, daß die Virusfiltration gemäß den Beispielen 1 und 2 den von den Regulatorien vorgeschriebenen bezüglich der Virusreduktion in einem Prozeßsschritt vorgegebenen Anforderungen genügen. Ferner ist die Anwendung eines hohen Salzgehaltes gemäß der Erfindung zumindest genauso wirksam bezüglich der Entfernung von Viren wie bisher bekannte Techniken.
    • Beispiel 4
  • Die gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 wurden angewandt, mit der Ausnahme, daß die eintretende Proteinlösung nicht so rein war.
  • Die Diaflitration mit einer Verdünnung von etwa 3 Volumeneinheiten pro Volumeneinheit der eintretenden Proteinlösung (1 + 3) führte zu einer Ausbeute von etwa 65%.
    • Beispiel 5
  • Es kamen die gleichen Bedingungen zur Anwendung, wie sie in Beispiel 2 angewendet wurden, mit der Ausnahme, daß die eintretende Proteinlösung nicht so rein war.
  • Die Diafiltration mit einer Verdünnung von etwa 3 Volumeneinheiten pro Volumeneinheit der eintretenden Proteinlösung (1 + 3) führte zu einer Ausbeute von 89%. Der Ausbeutefaktor IX : C betrug 87%.
    • Beispiel 6
  • Die Experimente wurden mit Faktor 1X als Makromolekül durchgeführt, um den Effekt von vier Salzgehalten auf den Proteinsiebkoeffizienten, das Diafiltrationsvolumen und die Ausbeute zu zeigen, wobei die anderen Versuchsbedingungen konstant waren. Die verwendete Nanotiv®-Lösung entsprach der in Beispiel 1 verwendeten. Die angewandten Versuchsbedingungen waren die gleichen wie von Beispiel 1. Tabelle 5 (zum Vergleich) Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten. Der Puffer beinhaltete 0,144 M NaCl + 0,0055 M Natriumcitrat. Gesamtsalzgehalt: etwa 0,15 M. Tabelle 6 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten. Der Puffer beinhaltete 0,5 M NaCl + 0,01 M Natriumcitrat. Gesamtsalzgehalt: etwa 0,5 M. Tabelle 7 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten. Der Puffer beinhaltete 1,0 M NaCl + 0,01 M Natriumcitrat. Gesamtsalzgehalt: etwa 1,0 M. Tabelle 8 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten. Der Puffer beinhaltete 1,5 M NaCl + 0,01 M Natriumcitrat. Gesamtsalzgehalt: etwa 1,5 M.
  • Es ist aus den Tabellen 5 bis 8 ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung zu einer deutlichen Verbesserung bei den Verfahrensbedingungen führt, wenn Faktor IX-Lösungen virusfiltriert werden, im Vergleich zu bisher bekannten Techniken, wo niedrige Salzgehalte zur Anwendung kamen.
    • Beispiel 7
  • Die Experimente wurden mit Faktor IX als Makromolekül durchgeführt, um den Effekt von drei unterschiedlichen Salze auf den Proteinsiebkoeffizienten, das Diafiltrationsvolumen und die Ausbeute zu zeigen, wobei die anderen Versuchsbedingungen konstant waren. Die verwendete Nanotiv®-Lösung entsprach der in Beispiel 1 verwendeten. Die angewandten Versuchsbedingungen waren die gleichen wie von Beispiel 1. Tabelle 9 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten. Der Puffer beinhaltete 0,5 M Kaliumdihydrogenphosphat. Gesamtsalzgehalt: 0,5 M. Tabelle 10 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten. Der Puffer beinhaltete 0,5 M NaCl. Gesamtsalzgehalt: 0,5 M. Tabelle 11 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten. Der Puffer beinhaltete 0,5 M Bariumchlorid. Gesamtsalzgehalt: 0,5 M.
  • Es ist aus den Tabellen 9 bis 11 ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise mit einer Anzahl unterschiedlicher Salze durchgeführt werden kann. Es ist auch ersichtlich, daß die Proteinsiebkoeffizienten ansteigen, wenn Salze verwendet werden, die einen hohen Aussalzeffekt gemäß den Hofmeistersche Reihen haben (Kaliumdihydrogenphosphat) im Vergleich zu einem Salz, welches einen niedrigen Aussalzeffekt besitzt (Bariumchlorid).
    • Beispiel 8
  • Versuche wurden mit Gammaglobulin als Makromolekül durchgeführt, um den Effekt des Salzgehaltes auf den Proteinsiebkoeffizienten, das Diafiltrationsvolumen und die Ausbeute zu zeigen. Die Gammaglobulin enthaltende Lösung- war ein kommerzielles Produkt, das von Blutplasma erhalten wurde, Gammonativ®, vertrieben von der Pharmacia AB, Stockholm, Schweden. Vor der Filtration wurde die Gammaglobulinlösung durch eine anfängliche Cohn- Fraktionierung gefolgt von einen Chromatographieschritt gereinigt.
  • Die angewandten Versuchsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß der Virusentfernungsfilter ein ViresolveTM/180-Filter war, der pH-Wert der Lösung sich auf 6,8 belief und die Proteinkonzentration 2,5-5,0 A&sub2;&sub8;&sub0; - Einheiten betrug. Der Puffer beinhaltete 2,2% Albumin + 0,15 M NaCl + 0,02 M NaAc + 0,075 M Glycin. Gesamtsalzgehalt: 0,17 M. Tabelle 12 (zum Vergleich) Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten.
  • Die Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten ergab eine optimale Filtratflußrate von 20,8 ml/min.
    • Beispiel 9
  • Die gleichen Bedingungen wurden angewandt, wie jene in Beispiel 8, mit der Ausnahme, daß in diesem Fall der Puffer 2,2% Albumin + 1,0 M NaCl + 0,02 M NaAc + 0,075 M Glycin beinhaltete. Gesamtsalzgehalt: etwa 1,0 M. Tabelle 13 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten.
  • Die Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten ergab eine optimale Filtratflußrate von 20,8 ml/min.
  • Die Optimierung der Ausbeute bei einer Filtratflußrate von 20,8 ml/min und einer Verweilzeit von bis zu 10 Minuten ergab einen P/R-Quotienten zwischen 60% und 68%.
  • Die Diafiltration mit einem Verdünnungsgrad von etwa 1 Volumeneinheit pro Volumeneinheit der eintretenden Proteinlösung (1 + 1) führte zu einer Ausbeute von 90%.
    • Beispiel 10
  • Es wurden die gleichen Bedingungen wie in Beispiel 8 angewandt, mit der Ausnahme, daß in diesem Fall der pH-Wert der Lösung 5,5 war. Tabelle 14 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten.
    • Beispiel 11
  • Es wurden die gleichen Bedingungen wie in Beispiel 10 angewandt, mit der Ausnahme, daß in diesem Fall der Puffer 2,2% Albumin + 1,0 M NaCl + 0,02 M NaAc + 0,075 M Glycin beinhaltete. Gesamtsalzgehalt: etwa 1,0 M. Tabelle 15 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten.
    • Beispiel 12
  • Experimente wurden mit Albumin als Makromolekül durchgeführt, um den Effekt des Salzgehaltes auf den Proteinsiebkoeffizienten, das Diafiltrationsvolumen und die Ausbeute zu zeigen. Die 4%ige Lösung, welche menschliches Serumalbumin (HSA), das aus Blutplasma erhalten wurde, enthielt, wurde von der Pharmacia AB, Stockholm, Schweden, erhalten. Vor der Filtration ist die Albumin enthaltende Lösung durch eine kombinierte Cohn - Fraktionierung und einem chromatographischen Schritt gereinigt worden.
  • Die angewandten Versuchsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß die Proteinkonzentration etwa 10 A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten betrug. Der Puffer beinhaltete 0,15 M NaCl + 0,02 M NaAc, was zu einem Gesamtsalzgehalt von 0,17 M führte. Tabelle 16 (zum Vergleich) Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten.
  • Die Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten führte zu einer optimalen Filtratflußrate von 20,8 ml/min.
    • Beispiel 13
  • Es wurden die gleichen Bedingungen wie in Beispiel 12 angewandt, mit der Ausnahme, daß in diesem Fall der Puffer 1,0 M NaCl + 0,02 M NaAc beinhaltete, was zu einem Gesamtsalzgehalt von etwa 1,0 M führte. Tabelle 17 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten.
  • Die Diafiltration mit einem Verdünnungsgrad von etwa 1 Volumeneinheit pro Volumeneinheit der eintretenden Proteinlösung (1 + 1) führte zu einer Ausbeute von 85%.
    • Beispiel 14
  • Experimente wurden mit Faktor IX als Makromolekül durchgeführt, um den Effekt der Retentionsflußrate auf den Proteinsiebkoeffizienten bei gleichzeitigem Konstanthalten der anderen Bedingungen zu zeigen. Die verwendete kommerzielle Nanotiv®-Lösung entsprach der in Beispiel 1 verwendeten Lösung. Die angewandten Bedingungen waren die gleichen wie die in Beispiel 1 angewandten, mit der Ausnahme, daß in diesem Fall der Puffer 1 M NaCl + 6,4 mM Natriumcitrat beinhaltete und einen pH-Wert von 7,0 aufwies. Tabelle 18 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten bei unterschiedlichen Retentionsflußraten.
  • Niedrigere Retentionsflußraten führen zu einer höheren Proteinpermeabilität durch den Filter.
    • Beispiel 15
  • Experimente wurden mit Faktor IX als Makromolekül in einer Lösung durchgeführt, die einen hohen Salzgehalt aufwies, um den Effekt des Typs der Virusfiltrationstechnik auf die Verdünnung, Ausbeute, den Proteinsiebkoeffizienten und die Prozeßzeit zu zeigen, wobei die anderen experimentellen Bedingungen im wesentlichen konstant waren. Die angewandten Versuchsbedingungen, einschließlich der Nanotiv®-Lösung, waren die gleichen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme der folgenden Unterschiede: Tabelle 19 Bestimmung der Verdünnung, Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit unter Verwendung unterschiedlicher Virusfiltrationstechniken. Tabelle 19 (Fortsetzung) Bestimmung der Verdünnung, Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit unter Verwendung unterschiedlicher Virusfiltrationstechniken.
  • Die Virusfiltration vom Faktor IX unter Verwendung der "Dead-End"-Technik bedeutet eine geringere Verdünnung, kürzere Prozeßzeiten und führt zu einer höheren Ausbeute und Proteinpermeabilität.
    • Beispiel 16
  • Experimente wurden mit Faktor IX als Makromolekül durchgeführt, um den Effekt des Salzgehaltes auf die Ausbeute und den Proteinsiebkoeffizienten zu zeigen, wenn mittels der "Dead-End"-Technik virusfiltriert wurde, wobei die restlichen experimentellen Bedingungen konstant waren. Zusätzlich zu NaCl enthält der Puffer ebenfalls 6,4 mM Natriumcitrat (pH 7,0) in beiden Fällen. Die angewandten Bedingungen, einschließlich der Nanotiv®-Lösung, waren die gleichen wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der folgenden Unterschiede: Tabelle 20 Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute und des Proteinsiebkoeffizienten bei Verwendung eines Puffers, welcher 1,0 M NaCl + 6,4 mM Natriumcitrat (pH 7,0) enthielt. Proteinkonzentration
  • Es wurde eine Gesamtausbeute von 83% über dem Virusfilter erhalten, und zwar mit einem Verdünnungsgrad von 1+0,07. Prozeßzeit: 264 kIU Faktor IX/h. Tabelle 21 (zum Vergleich) Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute und des Proteinsiebkoeffizienten bei Verwendung eines Puffers, welcher 0,15 M NaCl + 6,4 mM Natriumcitrat (pH 7,0) enthielt. Proteinkonzentration
  • Es wurde eine Gesamtausbeute von 63% mit dem Virusfilter erhalten, und zwar bei einem Verdünnungsgrad von 1 + 0,07. Prozeßzeit: 194 kIU Faktor IX/h.
    • Beispiel 17
  • Experimente wurden mit Antithrombin (AT III) als Makromolekül in einer Lösung mit niedrigem Salzgehalt durchgeführt, um den Effekt dieses Typs der Virusfiltrationstechnik auf die Verdünnung, die Ausbeute, den Proteinsiebkoeffizienten und die Prozeßzeit zu zeigen, wobei die anderen Bedingungen im wesentlichen konstant waren. Die kommerzielle ATenativ®-Lösung wurde von der Pharmacia AB, Stockholm, Schweden, geliefert. Der Puffer enthielt in beiden Fällen 0,12 M NaCl + 1 mM Natriumphosphat (pH 7,4), wodurch das Verfahren als solches außerhalb des Bereichs der Erfindung liegt. Die angewandten Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der folgenden Unterschiede: Tabelle 22 Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit mit Hilfe verschiedener Virusfiltrationstechniken.
  • Die Virusfiltration von AT III führte bei Anwendung der "Dead - End" - Technik zu einer geringeren Verdünnung, bot eine höhere Proteinpermeabilität und kürzere Prozeßzeiten.
    • Beispiel 18
  • Experimente wurden mit Antithrombin (AT III) als Makromolekül durchgeführt, um den Effekt des Salzgehalts auf die Ausbeute und die Proteinpermeabilität (Siebkoeffizient) zu zeigen, wenn gemäß der Tangentialtechnik virusfiltriert wurde, wobei die anderen experimentellen Bedingungen konstant blieben. Zusätzlich zu NaCl enthielt der Puffer 1 mM Natriumphosphat (pH 7,4) bei allen Experimenten. Die angewandten Bedingungen, einschließlich der ATenativ®-Lösung, waren die gleichen wie in Beispiel 17, mit der Ausnahme, daß die Retentionsflußrate bei allen Experimenten 20 1/h betrug. Tabelle 23 Bestimmung des Proteinsiebkoeffizienten bei unterschiedlichen Salzgehalten und unterschiedlichen Filtratflußraten.
  • Ein höherer Salzgehalt führte zu einer verbesserten Proteinpermeabilität in bezug auf AT III.
    • Beispiel 19
  • Experimente wurden mit menschlichem Serumalbumin (HSA) als Makromolekül in einer Lösung mit einem hohen Salzgehalt durchgeführt, um den Effekt des Typs der Virusfiltrationstechnik auf die Verdünnung, die Ausbeute, die Proteinpermeabilität und die Prozeßzeit zu zeigen, wobei die anderen Versuchsbedingungen im wesentlichen konstant blieben. Die verwendete HSA-Lösung entsprach der in Beispiel 12 verwendeten Lösung. Der Puffer enthielt 1,0 M NaCl + 20 mM Natriumacetat (pH = 7,4) bei allen Experimente. Die angewandten Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der folgenden Unterschiede: Tabelle 24 Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit unter Anwendung der tangentialen Virusfiltration. Proteinkonzentration
  • Es wurde eine Gesamtausbeute von 85% mit dem Virusfilter erhalten, bei einer Verdünnung von 1 + 0,72. Prozeßzeit: 4615 mg HSA/h.
    • Tabelle 25 Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit, bei Virusfiltration mittels der "Dead-End"-Technik.
  • Menge der Proteinlösung nach der Virusfiltration (g): 6380
  • Verdünnung: 1 + 0,0
  • Ausbeute (%): 98
  • Proteinsiebkoeffizient (P/R in %): 97-100
    • Tabelle 25 (Fortsetzung) Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit, bei Virusfiltration mittels der "Dead-End"-Technik.
  • tatsächliche Filtratflußrate (ml/min): 24-34
  • Prozeßzeit (mg HSA/h): 14895
  • Proteinbeladung (A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten/ft²): 124807
  • Filtrationseffizienz (l/m² Filter*h): 34
  • Bei Anwendung der "Dead-End"-Technik führte die Virusfiltration von HSA zu einer geringeren Verdünnung und führte zu einer höheren Ausbeute und einer höheren Proteinpermeabilität und kürzeren Prozeßzeiten.
    • Beispiel 20
  • Experimente wurden mit Gammaglobulin als Makromolekül in einer Lösung mit höherem Salzgehalt durchgeführt, um den Effekt dieses Typs der Virusfiltrationstechnik auf die Verdünnung, die Ausbeute, den Proteinsiebkoeffizienten und die Prozeßzeit zu zeigen, wobei die anderen Versuchsbedingungen im wesentlichen konstant blieben. Die verwendete Gammaglobulinlösung entsprach der in Beispiel 8 verwendeten Lösung. Der Puffer enthielt 1,0 M NaCl + 20 mM Natriumacetat + 0,075 M Glycin (pH = 5,5) bei allen Experimenten. Die angewandten Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der folgenden Unterschiede: Tabelle 26 Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit unter Anwendung der "Dead-End"-Filtration: Proteinkonzentration
  • Es wurde eine Gesamtausbeute von 94% mit dem Virusfilter erhalten, bei einem Verdünnungsgrad von 1 + 0.12. Prozeßzeit: 2790 mg Gammaglobulin/h.
    • Tabelle 27 Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit unter Anwendung der tangentialen Virusfiltration.
  • Menge der Proteinlösung nach der Virusfiltration (g): 643
  • Verdünnung: 1 + 1,16
  • Ausbeute (%): 92
    • Tabelle 27 (Fortsetzung) Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit unter Anwendung der tangentialen Virusfiltration.
  • Proteinsiebkoeffizient (P/R in %) 43-67
  • tatsächliche Filtratflußrate (ml/min): 16-20
  • Prozeßzeit (mg Gammaglobulin/h): 1873
  • Proteinbeladung (A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten/ft²): 3192
  • Filtrationseffizienz (l/m² Filter*h): 23
  • Die Virusfiltration von Gammaglobulin mit der "Dead - End"-Technik involvierte eine geringere Verdünnung und führte zu einer höheren Ausbeute und Proteinpermeabilität und kürzeren Prozeßzeiten.
    • Beispiel 21
  • Experimente wurden mit Antithrombin als Makromolekül durchgeführt, um darzulegen, daß die vorliegende Erfindung im industriellen Maßstab unter Anwendung einer beträchtlich größeren Filterfläche (10 ft²) als bei den vorhergehenden Beispielen (1/3 ft²) anwendbar ist. Eine Antithrombin (AT III) enthaltende kommerzielle Lösung, ATenativ®, wurde von Pharmacia AB, Stockholm, Schweden erhalten.
    • Versuchsbedingungen:
  • Puffer: 1 M NaCl + 1mM Natriumphosphat
  • Gesamtsalzgehalt: etwa 1,0 M
  • Proteinkonzentration: 9,2 A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten
  • pH-Wert der Proteinlösung: 7,4
  • Menge der Proteinlösung vor der Virusfiltration: 20,8 kg
  • Filter zur Virusabtrennung: ViresolveTM/70
  • Filtertechnik: Dead-End
  • Filterfläche: 10 ft²
  • Retentionsflußrate: 0 l/h
  • Filtratpufferflußrate: 20 l/h
  • Transmembrandruck: 0,3 bar
    • Tabelle 28 Bestimmung der Verdünnung, der Ausbeute, des Proteinsiebkoeffizienten und der Prozeßzeit unter Verwendung einer Filterfläche von 10 ft² und der Dead-End-Filtertechnik gemäß der Erfindung.
  • Menge der Proteinlösung nach der Virusfiltration (kg): 24,1
  • Verdünnung: 1 + 0,16
  • Ausbeute (%): 96
  • Proteinsiebkoeffizient (P/R in %) 94-97
  • tatsächliche Filtratflußrate (ml/min): 7-12
  • Prozeßzeit (kIU AT III/h): 735
  • Proteinbeladung (A&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten/ft²): 19.136
  • Filtrationseffizienz (l/m² Filter*h): 8,8
  • Es ist aus diesem Beispiel ersichtlich, daß die Virusfiltration von Antithrombin gemäß der Erfindung im industriellen Maßstab mit ausgezeichneten Ergebnissen angewendet werden kann.
    • Beispiel 22
  • Der mit den in Beispiel 15 dargelegten Versuchen erreichte Virusentfernungseffekt wurde mittels einer Virusuntersuchung bestimmt, jedoch bei einem höheren Salzgehalt. Die Virusfiltrationstechnik war die "Dead-End"-Technik. Die Untersuchung wurde beim Parvovirus wie im Beispiel 3 durchgeführt. Der Parvovirus wurden den Lösungen hinzugesetzt, die Faktor IX, 1,0 M NaCl + 0,01 M Natriumcitrat enthielten (Experiment 1). Die Lösungen wurden bezüglich des Parvovirus sowohl vor als auch nach der Virusfiltration analysiert.
    • Experiment Virusverminderung
  • 1 1 · 105,5
  • Die Ergebnisse zeigen, daß die Virusfiltration gemäß Beispiel 15 unter Anwendung der "Dead-End"-Technik die von den Regulatorien vorgeschriebenen Anforderung bezüglich der Virusverringerung bei einem Verfahrensschritt erfüllen. Ferner ist die Verwendung eines hohen Salzgehaltes gemäß der Erfindung mindestens genauso effektiv bei der Virusentfernung wie bei den bisher bekannten Techniken.

Claims (11)

1. Verfahren zur Filtration zur Virusentfernung aus einer wässrigen Lösung, die mindestens ein Makromolekül umfasst, wobei das genannte Verfahren das Virusfiltrieren der genannten wässrigen Lösung umfasst, wobei der Gesamtsalzgehalt der wässrigen Lösung innerhalb des Bereiches von 0,2 M bis zur Sättigung liegt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Gesamtsalzgehalt der Lösung innerhalb des Bereiches von 0,4 M bis 2,5 M liegt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem der Gesamtsalzgehalt der Lösung innerhalb des Bereiches von 0,6 M bis 2,0 M liegt.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Salz aus der Gruppe bestehend aus Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumacetat und Natriumcitrat und Kombinationen davon ausgewählt wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Makromolekül aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Polysacchariden und Polypeptiden und Kombinationen davon ausgewählt wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5. bei dem das Makromolekül Faktor IX ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5., bei dem das Makromolekül γ-Globulin ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem das Makromolekül Albumin ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem das Makromolekül Antithrombin III ist.
10. Verfahren nach Anspruch 5. bei dem das Makromolekül ein Deletionsderivat von rekombinantem Faktor VIII ist.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das Virusfiltrierverfahren nach der "Dead-End"-Filtrationstechnik durchgeführt wird.
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