CN100398642C - 病毒生产的改进 - Google Patents

Abstract

从病毒感染的鸡胚的尿囊液中回收病毒的一种改进方法。在尿囊液内与粒状和纤维状碎片结合在一起的病毒可从碎片上解离下来并被回收，从而提高病毒产率。通过将病毒一碎片复合物置于高盐浓度的条件下，例如0.5M或更大，来实现解离。

Description

病毒生产的改进

本申请要求2003年6月20日申请的美国临时申请序列号60/429,723、2004年1月30日申请的美国临时申请序列号60/540,782和2004年5月20日申请的美国临时申请序列号60/572,718的优先权，所有这些在此通过参考将其整体合并到本发明中。

发明领域

本发明涉及从病毒感染的鸡胚的尿囊液中回收包膜病毒。提高的回收率有助于生产病毒疫苗，特别是流感疫苗，并且也能提供高产量的病毒蛋白质，其中包括由病毒载体表达的异种蛋白质。

发明背景

一旦被病原体感染，宿主的免疫***就能识别出在病原体上或病原体内的抗原，并介导免疫应答对抗含抗原的病原体。在这一应答过程中，对病原体的抗原特异的免疫细胞数量增加，并且这些细胞中的一些在感染平息之后仍然存在。当宿主在以后受到该病原体侵袭时这些存在的细胞阻止病原体建立感染。这称为保护性免疫。

在没有引起疾病的情况下，疫苗通过将病原体的抗原呈现给免疫***提供对抗病原体的保护性免疫。已开发了一些方法，在病原体没有引起疾病感染的情况下允许抗原存在。这些方法包括使用活的减毒病原体、灭活病原体或病原体的片段(亚单位)。

由于对许多病毒感染的治疗仍难以捉摸，因此优选通过疫苗接种来预防或缓解感染，而不是在感染出现之后治疗感染。特别棘手的传染性病毒的实例是那些正粘病毒科(orthomyxoviridae)，特别是流感病毒、副粘液病毒科、黄病毒科、批盖病毒科、弹状病毒科和冠状病毒科。每年有数百万人预防接种以对抗这些病毒家族中的一种或多种。

尽管有些病毒在细胞培养物中繁殖得很好，但另一些病毒需要在含胚的鸡蛋中繁殖并从尿囊液中回收病毒。多年来，流感疫苗作为从含胚的鸡蛋的尿囊液中回收的多菌株的联合产品提供给大众。每年从大批菌株样本中选择三种菌株进行培养，纯化，并收集以产生指定的疫苗。每一种被选择的流感菌株的生长可显著地变化，从而常常导致难以有效地满足每年对这样一种三价疫苗的市场需求。

已提出了各种方法以改进和/或简化从原料中回收病毒或病毒产物。US 3,627,873公开了使用***和乙酸甲酯从浓缩的尿囊液原料中提取病毒的方法。根据US 4,000,257报道使用乙酸丁酯和乙酸乙酯进行多次提取已获得更进一步提高的产率。

US 3,316,153公开了一种多步提取方法，该方法旨在从细胞碎片中分离病毒颗粒，且宣称可将该方法用于从病毒感染的小鸡尿囊液或细胞或组织培养液获得的原料。在该方法中，被吸附到磷酸钙沉淀上的病毒在pH7.8-8.3下分散在EDTA内，引起解离并且EDTA螯合可溶钙，从而释放病毒以供回收。所得到的含病毒的溶液用水或优选甘氨酸-氯化钠水溶液透析以降低EDTA和磷酸根含量。

美国专利No.4,724,210公开了使用离子交换色谱纯化流感病毒的方法。将含流感病毒的溶液例如尿囊液通过硫酸纤维素柱，在该柱中病毒被吸附到柱的填充物上。随后洗涤该柱子，并用含1.0M-1.5M的氯化钠溶液洗脱病毒。接着用4.99M的氯化钠洗涤。

在WO 02/067983中，公开了裂解流感病毒疫苗的制备方法，其中包括中速离心净化尿囊液，使净化的液体吸附到CaHPO₄凝胶上，接着用EDTA-Na₂溶液再溶解。同样参见公开了相同方法的WO 02/08749。

在US 4,327,182中，生长流感病毒的尿囊液原料经历多步提取工艺，该提取工艺旨在回收流感病毒亚单位，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。该技术取决于浓缩步骤，在该步骤中将病毒原料与去污剂和盐溶液混合在一起，接着通过连续过滤以除去非病毒颗粒。

美国专利No.3,962,421公开了裂解流感病毒的方法。将尿囊液进行高速离心。所得到的沉淀再悬浮在生理盐水中并球磨12-15小时以获得病毒悬液。然后用磷酸酯处理该病毒悬液，将病毒颗粒裂解成携带完整病毒表面抗原的不含脂质体的颗粒(亚单位)。

在US 3,874,999中，低速离心含流感病毒的尿囊液以除去粗颗粒。然后通过高速离心从上清液中分离出病毒并将该病毒重新悬浮在磷酸盐缓冲液中。在碱性pH条件下，在4℃下，用0.1-0.4M的硫酸镁处理悬液16-18小时以除去非病毒蛋白质和脂质体。低速离心净化所得悬液，并从所得上清液中纯化病毒。

对本发明背景技术中特别感兴趣的是病毒的回收处理和各种盐浓度对被纯化的病毒的影响的研究，其中包括使非尿囊液病毒源与具有升高浓度的一种或多种盐的溶液接触。

一些方法宣称当将被感染的细胞与含高盐浓度的溶液接触或培育随后从该溶液中纯化病毒时，可提供高产量的病毒或高纯度的病毒。

在WO 99/07834中，将被疱疹病毒感染的Vero细胞培养物在高渗的盐水溶液(例如0.8-0.9M NaCl)中培养数小时。然后除去溶液并从收集溶液中的疱疹病毒。该方法被宣称优于将细胞进行超声裂解的方法。

其它方法涉及了使被病毒感染的培养细胞与高浓度盐接触。

US 5,506,129报道了将被感染的BS-C-1细胞培养在含～0.3M NaCl的培养介质中之后，肝炎A病毒的产率提高。

Karakuyumchan等(Acta virol.155-158，1981)报道了在含0.3M NaCl的缓冲溶液中振荡被感染的脑组织之后所得到的狂犬病毒缺少由残留的脑组织引起的神经过敏活性。

Pauli和Ludwig(Virus Research，2：29-33，1985)报道了将感染了病毒的细胞系培养在含～0.3M NaCl的介质中得到了高产量的博尔纳病病毒(Borna disease virus)。

不同的研究组研究了被纯化的病毒与升高的盐浓度接触对病毒特性的影响。

在Breschkin等(Virology，80：441-444，1977)中，在等渗盐水中缺少红血球凝集活性的特定突变的麻疹病毒在0.8M(NH₄)₂SO₄中具有野生型水平的红血球凝集活性，而高变对野生型的病毒的红血球凝集活性没有影响。

Wallis和Melnick(Virology，16：504-506，1962)报道到：尽管高盐(1M MgCl₂，1M CaCl₂，或2M NaCl)可防止脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和ECHO病毒的热失活，但1M MgCl₂能增强腺病毒、乳多空(papova)病毒、疱疹病毒、粘液病毒、arbor病毒和痘病毒的失活。

在Willkommen等(Acta virol.27：407-411，1983)中，将纯化的冻干流感病毒在含有升高浓度的NaCl(最多到1.15M)的缓冲盐水中复原。随后，用去污剂裂解该被复原的病毒并进行单向辐射状免疫扩散(SRD)试验。在采用一些流感病毒的菌株的情况下，在复原的缓冲液内增加盐浓度表明对血凝素(HA)的SRD试验结果没有影响。然而，当其它菌株在含1.15M NaCl的缓冲盐水中被复原时，它们在SRD试验中给出的HA浓度是相同菌株在含0.15M NaCl的缓冲盐水中被复原时HA浓度的2倍。作者确认病毒聚集将尽可能阻滞去污剂的渗透并减弱了SRD应答。

Molodkina等(Colloids and Surfaces A：Physicochemical and EngineeringAspects，98：1-9，1995)报道了将盐浓度增加到0.3M NaCl会使纯化的流感病毒聚集体分散。

Sudnik等(Vyestsi Akademii Navuk BSSR Syeryya Biyalahichnykh Navuk，6：71-77，1985)报道了在pH2.2下，高电离度能部分抵消对流感病毒包膜的破坏。

本发明背景技术中感兴趣的还有Makhov等(Voprosy Virusologii，34(2)：274-279)关于尿囊液中丝状流感病毒体比例的研究结果。在病毒回收中分离出来的菌肉中，Makhov等报道了尿囊液中丝状流感病毒体的存在是菌株特异的且与离子强度相关。应用电子显微镜检测尿囊液以测定丝状病毒体的存在。对于一种特定的流感病毒菌株来说，在尿囊液中丝状病毒体的出现率为7.1％。当NaCl浓度升高到0.25M或1.0M时，出现率分别降低到0.37％和0.16％。

因此，本领域仍需要改进从病毒感染的鸡胚的尿囊液中获得病毒的纯度与产率。

发明概述

本发明提供了从病毒感染的鸡胚的尿囊液中回收病毒的改进方法。正如在此所公开的，现已发现在尿囊液内有相当部分的病毒是与粒状或纤维状碎片结合在一起的，因此当净化尿囊液除去碎片时，它们随之被损失掉。在最终的分离处理之前通过将病毒从碎片中分离出来提高病毒的产率。

从尿囊液中回收病毒的工艺方法常常包括将尿囊液进行净化的步骤，例如通过离心或过滤以形成净化的液体组分和含碎片的组分。当通过离心净化尿囊液时，含碎片的组分典型地为沉淀(pellet)形式；当通过过滤净化尿囊液时，含碎片的组分典型地为截留物(retentate)形式。通过包括将病毒从该含碎片的组分中提取出来的这个步骤，本发明提供了改进已知的从感染的鸡胚的尿囊液中回收病毒的方法。

从含碎片的尿囊液组分中提取病毒的优选方法是将病毒解离到悬液中，该悬液具有一种或多种盐的非等渗浓度。特别地，采用含一种或多种盐的溶液，所述该盐溶液中总的盐浓度约为0.5M或更大或相当量摩尔比的盐/ml尿囊液，病毒可容易地从碎片上解离下来。特别有用的溶液是pH范围从3到10且包括从约1.0M到约3.5M的总盐浓度(例如总NaCl浓度)的磷酸盐缓冲溶液。被解离的病毒从该悬液中回收。回收包括第二次净化形成第二种净化液体和第二种含碎片的组分。回收病毒的优选方法还包括在蔗糖密度梯度上定位病毒。

在一些方面中，本发明通过将一种或多种盐加入到尿囊液中，使溶液中的总盐浓度约为0.5M或更大，随后从所得液体中回收病毒提供了从病毒感染的鸡胚的尿囊液中回收病毒的方法。盐可以是以水溶液的形式加入，如浓磷酸盐缓冲液(PBS)。在一个实施方案中，在将尿囊液从鸡蛋中分离出来之前将盐加入到尿囊液中。在添加一种或多种盐之后，病毒的回收包括一个净化步骤以形成含碎片的组分。提取存留在含碎片的组分内的任何病毒，以病毒的产率最优化。或者，在除去或没有除去水以降低被分级的液体体积的情况下，将盐处理过的尿囊液用例如蔗糖密度梯度分级直接进行加工处理。

在一个特别优选的实施方案中，将含一种或多种盐的溶液加入到尿囊液中以使溶液内总体积浓度约为1.5M或更大。也可调节或维持尿囊液的pH。pH的优选范围包括pH3.0-pH6.8或pH6.8-pH9.8。在将盐加入到尿囊液中之后，通过离心或过滤使之净化。然后将净化的尿囊液进行蔗糖密度梯度分离以定位病毒。随后，从该梯度中将定位的病毒分离出来。

使用本发明的方法能基本上回收在病毒感染的鸡胚内进行复制且在尿囊液内存在的任何病毒。特别优选的病毒是包膜RNA病毒，其中包括正粘病毒科、副粘病毒科、黄病毒科、批盖病毒科、弹状病毒科和冠状病毒科家族的成员。正如实施例中所证实的，本发明的方法显著提高了流感病毒A和流感病毒B二者的回收率。

本发明的其它特征和优点从下面详细的描述中可显而易见。然而，应当理解，该详细的描述和具体的实施例尽管表示本发明的优选实施方案，但仅仅通过说明的方式给出，因为根据该详细的描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和改性对熟练本领域的技术人员来说都是显而易见的。

附图说明

图1：用含1.6M NaCl的溶液处理从净化的尿囊液中下来的沉淀提高了产率并在蔗糖梯度内提供了更好的定位。

优选实施方案的描述

在一方面中，本发明提供了从病毒感染的鸡胚的尿囊液中回收病毒的改进方法。该方法显著提高了从尿囊液中回收病毒的产率，并且提供了可用于制备疫苗的高度纯化的病毒组合物，或衍生的病毒亚单位制品。

正如此处和在权利要求中所使用的，“病毒”是指包膜的病毒颗粒，优选完整和具有传染性的，而不是病毒片段、组分和/或单独的病毒抗原，例如通过公知的裂解技术获得的。根据本发明回收病毒之后，病毒颗粒的断裂或裂解非常容易。

本发明的方法可用于天然存在的病毒和基因修饰的病毒，例如在WO 99/66045和它的对应公报US 2003/0087417中所描述的那些。

在一个优选的实施方案中，根据目前建立的用于疫苗生产的指南制备病毒感染的鸡胚尿囊液。一般地，该方法需使用9-12日龄的含胚鸡蛋，这些鸡蛋预先被光照过(precandled)以剔除腐坏或未受精(unfertilized)的鸡蛋。然后将希望获得疫苗的特定的活病毒菌株接种在其余鸡蛋的羊膜和/或尿囊腔中。一般在32-37℃下将鸡蛋孵育2或3天，之后照蛋(post-candled)以剔除腐坏的鸡蛋，接着在约4-6℃的温度下将这些鸡蛋冷藏约24小时而后在无菌状态下收获鸡蛋液体。如此收获的尿囊液含有高浓度的活病毒。该方法尤其可用于生产各种类型的流感病毒，其中包括流感病毒A和流感病毒B的绝大多数或所有菌株。

正如下面实施例1中所证实的，尽管病毒感染的尿囊液含有高浓度的活病毒，但许多病毒是与纤维状或粒状碎片结合(聚集)在一起的，并且当通过净化使碎片基本上从尿囊液中分离出来时，这些病毒随之被损失掉。通过使用升高的盐浓度使病毒从碎片中解离下来并回收被解离的病毒，本发明的方法提高了从尿囊液中回收病毒的产率。在任何净化之前，在尿囊液内(或者在感染的鸡蛋内或将尿囊液从鸡蛋中分离出来之后)能将病毒从碎片上解离下来。实际上，在一些实例中，在例如蔗糖密度梯度分离之前，可免去净化作为初步的回收步骤。或者，可将尿囊液净化形成含碎片的组分，随后从该含碎片的组分中将病毒从碎片上解离出来。在病毒从碎片上解离下来之后，使用如下所述的常规的病毒纯化技术回收病毒。

从聚集的碎片中将病毒解离下来的优选方法是将与碎片结合的病毒置于在具有非等渗盐浓度的环境中。据报道当它显著不同于尿囊液的盐浓度时，环境具有“非等渗”盐浓度，所述尿囊液的总盐浓度为约150mM。非等渗盐浓度的实例包括，但不限于，10mM或更少，20mM或更少，30mM或更少，40mM或更少，50mM或更少，60mM或更少，70mM或更少，80mM或更少，90mM或更少，100mM或更少，110mM或更少，120mM或更少，130mM或更少，140mM或更少，这些浓度可通过用水稀释尿囊液得到。用等渗盐溶液如磷酸盐缓冲液稀释不会使尿囊液成为非等渗，但如下列所述，就从碎片中解离病毒来说可具有有益的效果。

非等渗盐浓度包括高渗盐浓度，例如160mM或更大，170mM或更大，180mM或更大，190mM或更大，0.2M或更大，0.3M或更大，0.4M或更大，0.5M或更大，0.6M或更大，0.7M或更大，0.8M或更大，0.9M或更大，1.0M或更大，1.1M或更大，1.2M或更大，1.3M或更大，1.4M或更大，1.5M或更大，1.6M或更大，1.7M或更大，1.8M或更大，1.9M或更大，2.0M或更大，2.5M或更大，3.0M或更大，和3.5M或更大，以及可通过直接加入游离盐或优选通过加入浓盐溶液来获得。

在所有的实施方案中，将一种或多种盐加入到尿囊液中实现了将病毒从聚集的碎片中解离下来。一旦发生病毒解离，则在回收病毒之前，可再次稀释含病毒的溶液，例如使得该溶液变得较等渗(即高渗程度降低)。或者，在添加盐之前或同时，稀释尿囊液，之后可将稀释的溶液浓缩以提高盐浓度，从而在回收病毒之前，将病毒从聚集的碎片中解离出来。在这些实施方案中，得到了盐与尿囊液的初始体积的优选摩尔比。

例如，在下面的示例10中，通过添加50ml的1×PBS来稀释100ml等分的尿囊液，使样品体积成为150ml。随后将等体积(150ml)的20×PBS加入到该样品内，得到300ml的最终体积。尿囊液和1×PBS具有约0.15M(150mM)的NaCl浓度。因此，在初始的尿囊液内有0.015mol NaCl(0.1L×150mM NaCl)。然后用1×PBS稀释，添加0.0075molNaCl(0.05L×150mMNaCl)。所添加的20×PBS增加0.45mol NaCl(0.15L×3.0M NaCl)。300ml的最终体积含有0.4725mol的NaCl(0.015+0.0075+0.45)。因此，盐与尿囊液的摩尔比是0.4725mol/100ml尿囊液或4.725mmol/ml尿囊液原料。若将尿囊液调节成0.5MNaCl，则摩尔比是1.5mmol NaCl/ml尿囊液原料，而与被调节的(总)体积无关。

优选的盐是那些通常在人用药物中使用的被视为安全(GRAS)的盐。优选的盐是氯化钠。该盐也可由其单价、二价或多价阳离子混合物制备而成，和可包括或具体地排除硫酸铵。因此，KCl、LiCl、CaCl₂、MgCl₂和其它盐被视为组合盐。其它的变包括各种无机盐和有机盐(例如，乙酸钠、乙酸钾等)。在使用高盐浓度将病毒从聚集的碎片中解离出来的实施方案中，在本发明方法中所选用的盐应当是那些在满足所需环境要求的高浓度下保持可溶的盐。任何能够显著提高溶液的电离度(渗透度)同时又保持溶解度的盐都是适用的。这种盐包括氯化钠和氯化钾以及类似物。

在一个优选的实施方案中，将以公知方式制备的病毒感染的尿囊液与含有高浓度盐的水溶液混合，以便所得混合物含有的盐的摩尔浓度至少0.5M和最多饱和，更理想的摩尔浓度在1.0M-3.5M范围内。通常这可以实现，例如通过混合等体积的尿囊液和盐溶液，或使用能提供所需盐浓度的任何其它混和方法。在一些实施方案中，在添加盐溶液之前，将尿囊液从鸡蛋中分离出来。在其它实施方案中，将盐溶液加入到鸡蛋内的尿囊液中，或在收集了大多数尿囊液之后，使用盐溶液清洗尿囊腔。

优选地，尿囊液与盐的混合物还可被缓冲，例如按一般的方法使用磷酸盐缓冲体系(例如20-250mM)以得到所需的pH。优选的pH范围是从3.0到10.0。基于逐个病毒，可以调节pH使回收率最大。通过将浓盐/原料混合物的pH微调到对于给定的病毒类型或亚型优选的范围内能进一步提高产率。优选的pH范围是从3.0到10.0。例如，当非等渗环境具有6.8-7.1范围内相对中性/略微酸性pH时，流感病毒A的Moscow菌株的产率较高。然而，在相同盐的条件下，当非等渗环境具有较高的pH水平时，约8.4，流感病毒B的一些Yamanashi菌株的产率较大。

将病毒从碎片上解离下来的环境可进一步包括二价阳离子螯合剂，如EDTA。螯合剂起到螯合二价阳离子的目的的作用，其中二价阳离子影响病毒颗粒的沉淀或聚集，从而使滴度测定测不到它们，或者使它们不能接触到在疫苗生产阶段的工艺中所使用的灭活条件。合适的螯合剂的浓度是能促使聚集的病毒颗粒分离的那些浓度。在使用EDTA的情况下，浓度适合在1.0mM-1.0M范围内，这取决于起始的二价阳离子的浓度。其它添加剂，可单独或结合，包括还原剂，如DTT，和润湿剂，如非离子去污剂Triton X-100和Pluronic F68。

如上所述，在一些实施方案中，将一种或多种盐加入到病毒感染的鸡胚的尿囊液中以提高其内的盐浓度。在一些实施方案中，需要尿囊液和浓盐溶液的混合物，其中为了方便起见，在室温下(18-25℃)，所述混合物pH可被任选地调节和含有任选的螯合剂。该混合物可被搅拌。然后在盐没有沉淀的情况下将该混合物冷却以保持病毒的传染性，该含病毒的悬液是在无搅拌的剩余期间，或者理想地通过离心或过滤形成的。

然后视需要加工处理该含病毒的上清液或滤液以进一步富集病毒。典型地，按处理粗尿囊液公知的方式，接着对上清液进行蔗糖梯度离心处理，该处理将病毒定位在该梯度上或梯度内。从该梯度中回收被定位的病毒，得到含病毒的组分。在基于蔗糖的分离过程之后获得了一种或多种合并的含病毒的组分，形成富含病毒的提取物。该富含病毒的提取物也可进行高变处理，从而防止或除去通常由梯度纯化造成的病毒聚集体。

应当理解，本发明的方法不限于任何特定的分级或分离方法，相反可采用任何其它的对从尿囊液中获得纯化病毒有用的分级或分离方法，其中包括使用尺寸排阻色谱、离心、过滤、溶剂萃取、离子交换色谱的那些方法和类似方法。此外，可使任何一个或多个所得组分为非等渗，以改进病毒的回收工艺，因为病毒基本上单分散在溶液内。

在一些实施方案中，回收的病毒被灭活。灭活的方法可以是在疫苗生产中已经公知的那些中的任何一种方法，其中包括***固定、辐射、去污剂或溶剂裂解以及类似方法。

本发明可用于回收和纯化宽范围的病毒。在优选的实施方案中，该方法用于回收含RNA基因的包膜病毒。这类病毒包括正粘病毒科(例如流感病毒)、副粘病毒科(例如腮腺炎病毒、仙台病毒和新城疫病毒)、黄病毒科(例如日本脑炎病毒和黄热病毒)、批盖病毒科(例如风疹)、弹状病毒科(例如水泡性口炎病毒和狂犬病病毒)和冠状病毒科(例如禽类感染支气管炎病毒)家族中的那些。在特定的实施方案中，该方法用于回收流感病毒，其中包括流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C、禽类流感病毒、马类流感病毒和猪类流感病毒的菌株。

如上所述，在本发明的一些实践中，在回收病毒之前，稀释尿囊液。在其它方面中，将最初净化得到的含碎片的组分再悬浮，用高盐处理以使病毒从碎片中释放出来，再净化，并将所得到的该净化的溶液回加到起始净化的溶液中。因此，在加工过程中含病毒的溶液的体积会增加。

处理大体积的含病毒的溶液可能是繁琐的，尤其当从蔗糖密度梯度中回收病毒时。在没有显著损失病毒的情况下，降低含病毒的溶液的体积的方法在本领域内是已知的。例如，可将含病毒的溶液进行切流过滤(TFF)或透析过滤(diafiltration)。在TFF中，将溶液内的病毒流过中空纤维过滤管或穿过过滤材料板。与原料流向和压力处于相同方向的正常的流动过滤相反，TFF依赖于与原料流动方向垂直的压力。因此，在TFF中，滤液流经过滤管的含膜壁，同时截留物沿过滤管的路径向下流动。在该工艺过程中，可按需要降低溶液体积。

在一些实施方案中，希望将含病毒的溶液进行透析过滤。在透析过滤过程中，自由透过过滤膜的表面活性剂、蛋白质或其它溶质从溶液中除去。一般来说，有两种常用的透析过滤模式：间歇和恒定体积。在间歇透析过滤过程中，添加大体积的缓冲液或溶液，然后浓缩截留物。在恒定体积的透析过滤过程中，以与滤液流出相同的速度添加缓冲液或溶液。

在对含病毒的溶液进行TFF或透析过滤中使用的膜可商购(例如MILLIPORE，Billerica，MA)。在优选的实施方案中，膜的截留范围是100kD-0.05微米。

在一些实施方案中，本发明用于纯化由病毒编码的一种或多种蛋白质，和在一些情况下，由感染的胚细胞分泌到尿囊液内的蛋白质。蛋白质可以是病毒蛋白质或由包含在重组病毒载体内的外来基因编码的蛋白质。在优选的实施方案中，将一种或多种盐加入到含该蛋白质的尿囊液内以使蛋白质从碎片中解离下来。或者，将与纤维碎片结合的蛋白质例如通过离心或过滤从尿囊液中分离出来，然后将含碎片的组分置于非等渗盐浓度中使蛋白质从碎片中解离出来。随后使用标准技术纯化被解离下来的蛋白质。

当将本发明应用到从鸡尿囊液中回收流感病毒时，对于一个指定的流感疫苗生产周期来说本发明所要求的鸡蛋数量显著下降。这又降低了在每年流感季节开始时疫苗短缺的可能性。其它的优点还包括总工作量减少和废物的易于管理问题。所有这些优点显著降低了生产流感疫苗的成本。

在用于从尿囊液中提取流感病毒的本发明的具体实施方案中，可以以下述特定方式应用本发明的方法。

在标准的工业程序下收获含高滴度流感病毒疫苗菌株的被感染的尿囊液，并立即进行处理或者在进一步处理之前，在冻干状态下(例如在-70℃下)储存。

当加工时，用等体积的磷酸盐缓冲的16-20％(w/v)的NaCl处理液态尿囊液，pH通常在6.5-8.5的范围内，这取决于待纯化的流感病毒菌株，并且可含有或不含有螯合剂如EDTA或其它添加剂。经过适当培育之后，约5分钟或更长，当在尿囊液内病毒已从碎片中解离下来，通过蔗糖密度离心将病毒从溶液中纯化出来。或者，可使用一步或多步净化步骤。在一些实施方案中，通过在最多14000×g，例如2000-5000×g的离心下净化病毒制品。与没有受到高盐处理的上清液相比，该上清液显著富含活病毒。沉淀的碎片可任选地用含高浓度盐的溶液处理，以提取可能还没有从污染的碎片中释放下来的任何病毒。

或者，可净化尿囊液，形成净化的液体组分和含碎片的组分。优选的净化方法包括离心和过滤。在高盐浓度溶液中悬浮或洗涤所得到的沉淀或过滤后截留物以释放病毒，将所述病毒任选地合并到经过或没有经过离心或其它方式净化的原尿囊液中。

使被处理过的上清液澄清一般可促进通过蔗糖密度离心的进一步纯化。典型地使用级增或连续的30-50％(w/v)的蔗糖梯度。流感病毒疫苗的生产商们典型地使用连续流动离心策略。

最后，从蔗糖梯度中回收的活流感病毒通常有很大比例的病毒呈聚集状态。用磷酸盐缓冲的高盐溶液或其它高离子强度的溶液在通常6.5-8.5范围内的pH下进一步处理被分离的梯度组分或组分合并物(pool)，使聚集的活流感病毒释放并使病毒产率最大化，这些可通过HA滴度、感染性分析、免疫分析和电子显微镜来监控。

病毒制品的后纯化处理得到了解聚的或理想地单分散的病毒颗粒的溶液，进一步处理这种病毒颗粒，其损失少于通常遇到的病毒损失。例如，由于存在病毒聚集体，梯度纯化的病毒的***灭活常常不是完全有效的，并导致显著的产品损失和必须进行后***处理。在流感疫苗的情况下，在***处理之后存在活病毒要求采用醚萃取或其它操作方法。在高盐处理之后，病毒制品的***处理很少失败，并且大大地降低了因聚集导致的产品损失。

本发明方法的进一步的优点是病毒在尿囊液内从碎片中解离下来导致回收的病毒原料的纯度提高，即由鸡蛋组分导致的污染显著减少。由于鸡蛋组分，如卵白蛋白，在一些个体中能引起过敏反应，因此本发明的方法被认为能提供具有较高纯度的疫苗，所以在接受疫苗的个体中引起过敏反应的可能性下降。例如，通过高浓度的盐处理从尿囊液碎片上解离下来的流感病毒的一种或多种蔗糖梯度组分一般足以提供检测不出卵白蛋白的产品。

参考下述实施例描述本发明的实施方案，这些实施例仅仅用于说明的目的并且不能用于限制本发明的范围。

实施例

实施例1-在被流感病毒感染的尿囊液内，大多数病毒以高度不溶的病毒/碎片聚集体的形式存在

在经过或没有经过离心(Eppendorf微量离心机，5000RPM，5分钟)净化的情况下，用HA(终点测定)分析粗的尿囊收集物。

表1表明，尽管记录到非常高的增量(流感病毒A/德克萨斯)，但是离心净化典型地使HA滴度降低4倍。总的来说，该数据表明尿囊收集物中存在的大多数流感病毒是以低溶解度形式存在，容易通过物理方法被除掉。

实施例2-尿囊液的处理提高了可溶流感病毒的滴度

将80微升等分的粗流感病毒A/莫斯科(InfluenzaA/Moscow)感染的尿囊液与80微升3M NaCl溶液混合。将盐处理过的病毒样品和对照品在冰上培育15分钟，并偶尔搅拌，然后通过离心(Eppendorf微量离心机，全速，30秒)净化。

HA分析：通过将50微升样品转移到含50微升磷酸盐缓冲液(PBS)的孔内，将100微升的每一上清液样品(2倍)序列连续稀释。添加等体积(50微升)0.5％(v/v)的小鸡RBC悬液，混合，并在室温下静置(1-2小时)。在稀释序列中以观察到血细胞完全凝集的孔作为最终孔测定每一测试样品的终点HA滴度。

典型地，如表2所示，与对照品相比，盐处理过的流感病毒A/莫斯科感染的尿囊液样品中HA滴度可见增加了4倍。

实施例3-尿囊液碎片的处理释放出可溶的流感病毒

将1.5M NaCl应用于Flu A和B的收集物。用0.15M NaCl处理对照样品，并且将每一制品离心不同次数，以测定相对于沉淀在上清液中的病毒分配量。

将每一病毒样品(2×300微升)进行等分并与1体积3M的NaCl或0.15M NaCl(对照品)混合。将样品混合并等分成6×100微升。在30分钟培养之后，在10000RPM下，将样品离心0、2、4或6分钟(Eppendorf微量离心机)，并收集100微升上清液并转移到HA分析板上。将沉淀重新悬浮在100微升1.6M NaCl中，离心2分钟，并将沉淀的洗液转移到HA测定板上。

将结果总结在表3和4中。数值是以HA单位/ml表示的HA终点。

表3

流感病毒B/山梨县(Yamanashi)

表4

流感病毒A/莫斯科(Moscow)

实施例4-处理极大地提高了经蔗糖梯度纯化的流感病毒A的病毒产率

用于高盐处理的尿囊液样品通过离心被净化，并用10％体积的1.6M盐洗涤(过夜，然后1小时)洗涤2次将病毒从碎片沉淀中回收。再净化洗液，然后与尿囊上清液合并。

使用粗玻璃纤维“深度”过滤器净化对照样品，以模拟疫苗生产中使用的典型方法。在过滤之后，对照样品呈略微混浊。没有使用1微米或0.45微米的过滤器进行二次过滤，因此提供了对于以技术为基础的产率收益来说最糟糕的方案。

在6ml蔗糖阶梯梯度上分离(fractionated)每一尿囊制品，得到17∶1的承载率(loadingrate)。将尿囊样品上样到含几个阶梯级的梯度上，以得到总的承载率。

表5

流感病毒A/新加勒多尼亚梯度加样

实验	盐处理过的HAU	对照HAU	回收比
				1	5232640	86816	60∶1
2	4149120	95488	44∶1

表6

流感病毒A/莫斯科梯度加样

实验	盐处理过的HAU	对照HAU	回收比
				1	368320	8944	40∶1
2	591200	9956	60∶1
				3	223232	7476	30∶1
4	289984	6516	44∶1

在所有情况下，当使用高盐处理的原料时，病毒峰非常尖锐，而在不进行该处理时明显的是较小和非常宽的峰。图1给出了进行处理和不进行处理的情况下，典型的蔗糖梯度曲线的示例。

实施例5-高盐处理极大地提高了经蔗糖梯度纯化的流感B病毒的病毒产率

将流感B病毒尿囊液样品进行处理，其处理方式与前一实施例对流感A病毒处理方式一样。使用粗玻璃纤维过滤器再次净化对照样品。在6ml蔗糖阶梯梯度上分离每一尿囊制品，以得到17∶1的承载率。

表7

流感病毒B/香港梯度加样

实验	盐处理过的HAU	对照HAU	回收比
				1	333312	123328	3∶1
2	780544	211968	4∶1
				3	727298	108032	7∶1

实施例6-高盐处理没有降低病毒感染的滴度

用TCID₅₀测定经过/没有经过高盐处理的梯度纯化的流感制品，以评价该处理对病毒感染性的影响。将病毒制品等分，并将一等份的每一制品与3M NaCl溶液以1∶1混合。将样品在冰上培养1小时，然后在6000RPM下离心5分钟(Eppendorf微量离心机)净化这些样品。在感染介质中连续稀释上清液并将其加到96孔测定板内的MDCK细胞上。每一孔的CPE和/或HA状态用于评价感染的存在。使用Reed and Muench的方法(Amer.Jour.Hygiene，27：493-497，1938)计算感染滴度。

表8

表8表明高盐处理没有负面影响活病毒菌株的滴度。因此，将高盐处理用于尿囊或其它病毒原料不会破坏病毒颗粒。

实施例7-从HA分析、感染滴度和免疫分析获得的流感回收数据全部相关

将在蔗糖梯度纯化之后回收并通过HA分析测定了滴度的流感A/B收集物的组分进行光学免疫分析(OIA，Thermo BioStar)。

表9

组分数	HA终点
		9	32768
10	131072
		11	524288
12	1048576

用PBS以1∶10、1∶100和1∶400稀释每一梯度组分的样品，然后将100微升的等分试样加到含裂解剂的BioStar样品管中。根据Biostar的试剂盒说明进行测定，对照试剂盒内提供的标度，判定颜色强度级别(1-7)。

表10

红血球凝集分析是病毒/菌株敏感的，但全部与病毒颗粒对红血细胞之比相关。正因为如此，HA反映了制品内病毒颗粒的数量。Thermo BioStar的Flu OIA试验是一种能报告流感核蛋白的存在的快速免疫分析，因此能推断出病毒颗粒的存在。OIA颜色强度结果与所测定的HA滴度相关。

还对在蔗糖梯度纯化之后回收并通过HA分析测定了滴度的流感A/B收集物的组分进行TCID₅₀分析。

表11

在选择的梯度组分内HA滴度和感染滴度的比较

组分	HA滴度	HA比	TCID滴度	TCID比
					5	256	1	1.94×10<sup>5</sup>	1
14	524288	2048	3.73×10<sup>7</sup>	192
					17	16384	64	1.50×10<sup>7</sup>	77

在这些分析之间存在相关性，因为最高的HA滴度对应于最高的感染滴度，和最低的HA滴度同样地具有最低的感染滴度。为了有助于比较，相对于被测量的最低值，计算了HA滴度比和TCID₅₀滴度比。

实施例8-被处理的流感病毒保持完整性

进行了初步的透射电子显微(TEM)研究，比较了盐处理过的流感病毒制品与对照的流感病毒制品的峰值梯度组分。将Formvar-涂布的铜TEM样品格栅漂浮在流感病毒A/新加勒多尼亚(New Caledonia)梯度组分的液滴(50微升)上，并在室温下吸附样品15分钟。用PBS洗涤格栅2次，用含0.1％戊二醛的PBS固定(5分钟)，然后使用0.2微米过滤的WFI水洗涤2次并用2％磷钨酸负染色1分钟。将样品在空气中干燥，然后在Hitachi H-7000透射电子显微镜上，使用75kV的加速电压检测。使用Hamamatsu ORCAHR CCD照相机(AMT XR-60图像体系)，以12-bit灰度的压缩TIF格式电子捕获图像。

在梯度分离之前，在已用高盐处理过的制品中观察到，并且病毒颗粒看起来形态完整，并与未处理的对照品一样。病毒体具有负染色不能透过的完整包膜和突出的表面刺突。在处理过的和对照制品二者中都观察到球形和多形性病毒体形状。

在对照制品内的病毒体常常与碎片结合在一起和/或附着在网状纤维污染物上，这种网状纤维污染物经阴性染色似乎围绕病毒体进行浓缩或将病毒体包封起来。相反，盐处理过的制品内的病毒体主要是单分散的。此外，在盐处理过的制品中，污染的纤维基体的性质看起来已经发生变化并且纤维基体与病毒体之间没有明显的结合。

实施例9-由折射仪进行的梯度峰值分析表明病毒密度没有因处理而被改变

由HA分析确定的梯度组分同时由光学折射仪进行分析以测定对应于HA峰值活性的密度。使用Misco PalmAbbe型号PA200测量每一梯度组分的折射指数，使用蔗糖溶液的标准查阅表，将折射指数再转化成密度值。

表12：与流感病毒A/德克萨斯尿囊收集物的蔗糖梯度组分峰值HA活性对应的折射率

表13：与流感病毒B/香港尿囊收集物的蔗糖梯度组分的峰值HA活性对应的折射率

表12和13中总结了流感病毒A/德克萨斯和流感病毒B/香港的蔗糖梯度的折射指数。对于每一次实验周期和对于两种试验病毒来说，盐处理的尿囊样品与对照的尿囊样品的HA峰值组分密度存在紧密的相关性。

实施例10-在处理之前稀释含病毒的尿囊液提高病毒产率

每一尿囊病毒制品(流感病毒B/山犁县和流感病毒A/莫斯科)包括4个试样(每个100ml)用于梯度纯化。对照品未过滤(序列A)或通过玻璃纤维深度类型过滤器的净化(序列B)。通过添加0.5体积的PBS，预先稀释被处理的样品，使样品体积为150ml，然后添加等体积(150ml)的20×PBS，并在4℃下培养1小时至过夜。使用500kda截留值的中空纤维过滤器，将这些被处理的样品再浓缩到100ml，和或者未经净化(序列C)或者经低速离心净化(序列D)。所有样品进行蔗糖梯度纯化、分离和用HA分析进行测定。

结果总结在表14和15中。

表14

流感病毒B/山犁县

组分号	梯度[A]：过滤的对照尿囊液	梯度[B]：对照尿囊液	梯度[C]：盐处理过的尿囊液	梯度[D]：盐处理且经过滤的尿囊液
					1	5120	327680	20480	81920
2	10240	163840	163840	81920
					3	163840	163840	335544320	81920
4	655360	655360	5242880	2621440
					5	655360	327680	335544320	10485760
6	655360	163840	41943040	2621440
					7	655360	81920	327680	163840
8	327680	81920	40960	40960
					9	81920	40960	40960	20480
10	81920	20480	20480	20480
					11	40960	10240	10240	10240
12	40960	5120	10240	10240
					总的HA	3374080	2042880	718909440	16240640

表15

流感病毒A/莫斯科

组分号	梯度[A]：经过滤的对照尿囊液	梯度[B]：对照尿囊液	梯度[C]：盐处理过的尿囊液	梯度[D]：经盐处理且过滤的尿囊液
					1	320	320	10240	10240
2	640	640	10240	20480
					3	1280	1280	20480	40960
4	2560	2560	81920	81920
					5	1280	2560	327680	81920
6	1280	1280	1310720	81920
					7	320	320	5242880	20480
8	20	160	2621440	5120
					9	80	160	40960	5120
10	40	160	20480	2560
					11	20	80	10240	2560
12	20	40	5120	2560
					总的HA	7860	9560	9702400	355840

无论对照样品是否经过过滤净化，它们得到了与每一试验病毒基本相同的HA单位的量。在梯度分离之前没有经过过滤的对照品具有大的沉淀。

相反，经稀释然后经盐处理的制品比未处理的对照品得到高得多的HA滴度。净化不是将病毒分带(banding)所必须的但净化可得到最高的产率。经盐处理后通过净化除去的病毒没有被最佳地回收，因此相对于未净化的样品，产率较低。然而，通过预先稀释和盐处理仍然实现了相对于对照品产率的显著改进，而与梯度分离之前的净化无关。表14表明，对于流感病毒B/山犁县来说，相对于过滤的对照品(序列A)，在没有净化的试样中(序列C)，产率增加213倍，和在净化的试样中(序列D)，产率增加5倍。表15表明，对于流感病毒A/莫斯科来说，相对于过滤的对照品，在没有净化的试样中，产率增加1234倍，和在净化的试样中，产率增加45倍。

根据本发明实践的前述示例显而易见的是，通过调节体积/盐含量，以使盐浓度没有高到使尿囊液蛋白质沉淀(和与之相连的病毒)，也没有低到不能最佳地起到从尿囊液碎片中解离病毒的作用，可通过使用高浓度盐处理，容易使从尿囊液中回收的病毒最大优化。通过初步分析将要进行盐处理的被收集的尿囊液，并基于这些起始试验调节被收集的液体的体积，可容易地进行这种优化工序。按照这一方式，可以解释批料与批料间和可能甚至菌株与菌株间尿囊液中蛋白质的变化。

根据本发明公开的内容，在没有过多试验的情况下，此处所公开和要求保护的所有组合物和/或方法都可以被制备和实施。尽管以优选实施方案的方式描述了本发明的组合物与方法，但对于熟练本领域的技术人员来说，显而易见的是，在没有脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对该组合物和/或方法以及在此处所描述的方法中的步骤或步骤的顺序上进行各种变化。更具体地说，显而易见的是，化学和生理两方面都相关的一些试剂可替代此处所描述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对熟练本领域的技术人员显而易见的所有这种类似的替代和改性被认为在由所附的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念内。同样，尽管上述例举的实施例全部涉及流感病毒A和B的各种菌株在尿囊液中生长并从尿囊液中回收的产率的改进，但本发明的方法容易用于在病毒感染的鸡胚的尿囊液内典型地生长的其它包膜病毒。实际上，与本发明实践相关的提高的回收率可能使得使用以鸡蛋为基础的病毒生长成为目前在哺乳动物细胞培养物内生长的病毒的选择方法，条件是对病毒进行标准改编以适应这种生长。

此处引用的参考文献全部在此通过参考具体地引入，其程度是它们提供的例举的程序或其它细节对此处列举的那些进行补充。

Claims (38)

1.一种从病毒感染的鸡胚的尿囊液中回收病毒的方法，所述尿囊液中含有碎片，该方法包括下述步骤：

(a)将一种或多种盐加入到尿囊液中使其内生成的总盐浓度大于0.5M；和

(b)回收从碎片中解离下来并溶解在尿囊液中的病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在将尿囊液从鸡蛋中分离出来之前，将盐加入到尿囊液中。

3.根据权利要求1所述的方法，其中回收步骤(b)包括通过离心净化步骤(a)的尿囊液以形成含碎片的沉淀和含病毒的上清液。

4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括通过将所述沉淀悬浮在总盐浓度为0.5M或更大的溶液内使病毒从沉淀中解离下来，和从所得到的悬液中回收病毒。

5.根据权利要求1所述的方法，其中回收步骤(b)包括通过过滤净化步骤(a)的尿囊液以形成含病毒的滤液和含碎片的过滤截留物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括将步骤a)的尿囊液进行蔗糖密度离心以在密度梯度内定位病毒。

7.根据权利要求1所述的方法，其中病毒是包膜病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其中包膜病毒包括RNA基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中包膜病毒是选自正粘病毒科、副粘病毒科、黄病毒科、批盖病毒科、弹状病毒科和冠状病毒科中的一种。

10.根据权利要求9所述的方法，其中病毒是流感病毒。

11.根据权利要求10所述的方法，其中病毒是流感A病毒。

12.根据权利要求10所述的方法，其中病毒是流感B病毒。

13.根据权利要求1所述的方法，包括在加入所述的一种或多种盐之前稀释尿囊液。

14.根据权利要求11所述的方法，其中病毒是流感A的莫斯科菌株。

15.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中生成的总盐浓度为1.0M-3.5M。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的一种或多种盐包括氯化钠。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述的一种或多种盐包含在磷酸盐缓冲的溶液内。

18.根据权利要求1的所述方法，其中将尿囊液的pH调节到或维持在pH3-10的范围内。

19.从病毒感染的鸡胚的尿囊液中回收病毒的方法，所述尿囊液中含有碎片，其中将尿囊液进行净化，形成净化的液体组分和含碎片的组分，其特征在于，包括从净化的液体组分和含碎片的组分中提取病毒，所述的从碎片中提取病毒的步骤包括：

(a)用总盐浓度为0.5M或更大的一种或多种盐的溶液将与含碎片的组分结合在一起的病毒解离到悬液中；和

(b)从该悬液中回收被解离的病毒。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述净化包括离心并且所述含碎片的组分包括离心沉淀。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述净化包括过滤并且所述含碎片的组分包括过滤截留物。

22.根据权利要求19所述的方法，进一步包括通过净化悬液形成第二个被净化的液体和第二个含碎片的组分，从而从悬液中回收病毒的步骤。

23.根据权利要求22所述的方法，进一步包括通过在蔗糖密度梯度上定位，从第二个净化的液体中回收病毒的步骤。

24.根据权利要求19所述的方法，其中病毒是包膜病毒。

25.根据权利要求24所述的方法，其中包膜病毒包括RNA基因。

26.根据权利要求25所述的方法，其中包膜病毒是选自正粘病毒科、副粘病毒科、黄病毒科、批盖病毒科、弹状病毒科和冠状病毒科中的一种。

27.根据权利要求26所述的方法，其中病毒是流感病毒。

28.根据权利要求27所述的方法，其中病毒是流感A病毒。

29.根据权利要求27所述的方法，其中病毒是流感B病毒。

30.根据权利要求19所述的方法，包括在添加所述的一种或多种盐之前稀释尿囊液。

31.根据权利要求28所述的方法，其中病毒是流感A的莫斯科菌株。

32.根据权利要求19所述的方法，其中在所述悬液内，所述的总盐浓度为1.0M-3.5M。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述的一种或多种盐包括氯化钠。

34.根据权利要求19所述的方法，其中尿囊液的pH被调节到或维持在pH3-10的范围内。

35.从病毒感染的鸡胚的尿囊液中回收病毒的方法，其中所述的病毒是流感病毒，该方法包括下述步骤：

a)将一种或多种盐添加到尿囊液中，在其内生成1.0 M或更大的总盐浓度使与含碎片的组分结合在一起的病毒解离到尿囊液中；

b)通过离心或过滤净化尿囊液，产生沉淀或截留物；

c)使净化的尿囊液进行蔗糖密度梯度分离，在密度梯度内定位病毒；和

d)从梯度内分离被定位的病毒。

36.根据权利要求35所述的方法，其中步骤a)的尿囊液的pH被调节到或维持在pH3.0-pH6.8范围内。

37.根据权利要求35所述的方法，其中步骤a)的尿囊液的pH被调节到或维持在pH6.8-pH9.8范围内。

38.根据权利要求35所述的方法，进一步包括在提供1.0M或更大的总盐浓度的盐溶液内悬浮步骤b中离心得到的沉淀或者过滤得到的截留物，并将病毒从悬液中分离出来。

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