DE69524103T2

DE69524103T2 - Fluorinierte 2-nitroimidazole analoge zur detektion von hypoxischen tumorzellen

Info

Publication number: DE69524103T2
Application number: DE69524103T
Authority: DE
Inventors: O. Aboagye; B. Kelson; D. Lewis; Michael Tracy; Paul Workman
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd; University of Glasgow; SRI International Inc; Stanford Research Institute
Current assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd; SRI International Inc
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 2002-07-18
Anticipated expiration: 2015-08-01
Also published as: DK0775117T3; WO1996004249A1; ES2165430T3; CA2196900C; EP0775117A1; PT775117E; JPH10506104A; CA2196900A1; EP0775117B1; DE69524103D1; JP3872511B2; US5721265A; ATE209187T1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verbindungen, die zur Feststellung hypoxischer Tumorzellen geeignet sind und spezieller bestimmte neue tumorvermittelnde Verbindungen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Ermittlung hypoxischer Tumorzellen.

Hintergrund

Sauerstoff liefert die Hauptquelle zellulärer Energie durch oxidative Phosphorylierung. Gewebehypoxie hört auf, wenn Sauerstoffzufuhr zu den Zellen gehemmt wird, und kann bei Gefäßerkrankungen, während eines Schlaganfalles oder bei Tumoren auftreten. Hypoxische Tumorzellen sind daher jene, die bei einem mittleren Sauerstoffdruck zwischen gut mit Sauerstoff versorgten Zellen (oxischer Population) und jenen mit ungenügendem Sauerstoff, um die Lebensfähigkeit zu unterstützen (anoxischer Population) existieren. Zellen, die bei einem Sauerstoffpartialdruck (pO&sub2;) von 0,1% oder weniger existieren, werden als radiobiologisch hypoxische Zellen bezeichnet. Strukturelle und funktionelle Abnormalitäten der Turmorgefäßbildung und - mikrozirkulation können Ursache hypoxischer Zellen sein. Vaupel et al. (1989), Cancer Res. 49, Seiten 6449 bis 6465.
Hypoxie bei Tumoren kann in irreversibler, diffusionsbegrenzter ("chronischer") Form oder in reversibler perfusionsbegrenzter ("akuter") Form vorliegen. Brown (1979) Br. J. Radiol. 52, Seiten 650 bis 656, Minchinton et al. (1993) in 8. Internationale Konferenz für chemische Modifiziermittel oder Krebsbehandlung, Kyoto, Japan, Seiten 192 und 193, Thomlinson et al. (1955), Br. J. Cancer 9, Seiten 539 bis 549. Chronische Hypoxie, das'klassische Modell von Turmorhypoxie, hört auf, wenn kompakte Tumore aus ihren Stützgefäßen herauswachsen. Der Diffusionsabstand von molekularem Sauerstoff ist durch Stoffwechselverbrauch auf 150 bis 200 um von der nächsten Kapillarität begrenzt. Über den Diffusionsabstand hinaus sind Zellen nekrotisch. Unmittelbar proximal zu der nekrotischen Zone ist eine Schicht von Zellen, die an Sauerstoff verarmt, aber dennoch lebensfähig sind. Diese Zellen sind das Ergebnis einer Diffusionsbeschränkung von Sauerstoff und bleiben hypoxisch, bis sie entweder erneut mit Sauerstoff versorgt werden oder absterben, und deshalb werden sie als chronisch hypoxische Zellen bezeichnet. Es ist aber wahrscheinlich, daß sie geringe Glucosegehalte und ATP-Gehalte, hohe Gehalte an Cataboliten, wie Lactat, besitzen. Vaupel (1992) NMR Biomed. 5, Seiten 220 bis 225.
Wenn der Blutstrom durch ein Gefäß vorübergehend unterbrochen wird, werden alle normalerweise aeroben Zellen abstromwärts von dem Verschluß plötzlich hypoxisch gemacht. Diese Zellen werden als akut hypoxisch angesehen, da sie nur so lange hypoxisch bleiben, wie der Verschluß andauert, und wieder mit Sauerstoff versorgt werden, wenn der Blutfluß wiederaufgenommen wird. Derzeit verfügbare Informationen über die Parameter, welche das Stoffwechselmikromilieu in menschlichen Tumoren definieren, zeigen, daß bei diesen relevanten Faktoren wahrscheinlich signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Stellen in einem Tumor und zwischen Tumoren der gleichen Eingruppierung und klinischen Einstufung vorliegen. Vaupel (1992), a.a.O.
Historisch hat das Vorliegen hypoxischer Zellen eine wichtige Bedeutung für die Behandlung von Krebs, d. h. in bezug auf Radioresistenz, Chemoresistenz, Genverstärkung und Induktion sowie Überexpression bestimmter zellulärer oder Belastungsproteine. Hypoxische Zellen sind bekanntermaßen zwei- bis dreimal resistenter gegenüber Zellabtötung durch Bestrahlung als oxische Zellen. Coleman (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80, Seiten 310 bis 317, Hall (1988) in Hall (Herausgeber), Radiobiologie für Radiologen, Lippencott Co., Philadelphia, Seiten 137 bis 160. Dies erfolgt, da in Zellen bei normalem Sauerstoffdruck molekularer Sauerstoff in der Lage ist, mit durch Bestrahlung erzeugten Radikalen in DNA in Wechselwirkung zu treten, was zu einer irreversiblen Fixierung der Störung führt. Hall (1988), a.a.O. Gemäß dem radiochemischen Konkurrenzmodell konkurriert molekularer Sauerstoff mit reduzierenden Verbindungen, z. B. Thiolen, wie Glutathion, die in der Lage sind, das Zielmolekül in der ursprünglich unbeschädigten Form wiederherzustellen. Hall (1988), a.a.O. Da hypoxische Zellen keinen ausreichenden Gehalt an molekularem Sauerstoff besitzen, um wirksam mit reduzierenden Verbindungen zu konkurrieren, wird viel von der durch Bestrahlung induzierten Zerstörung in diesen Zellen repariert.
Hypoxische Zellen sind auch resistent gegen einen Bereich chemotherapeutischer Arzneimittel einschließlich Bleomycin und gegen einige Alkylierungsmittel. Workman (1983), Cancer Topics, 4, Seiten 54 und 55. Dies kann durch verschlechterte Arzneimittelabgabe, die Einleitung eines nichtzyklischen zellkinetischen Status oder die Einbeziehung von molekularem Sauerstoff in dem Wirkungsmechanismus des Arzneimittels geschehen. Setzt man Zellen Hypoxie aus, so kann dies auch zur Expression neuer Proteine führen. Diese schließen vaskulären Endothelwachstumsfaktor, Erythropoietin, sauerstoff- und glucoseregierte Proteine und Beanspruchungsproteine, wie Hitzeschocktranskriptionsfaktor ein. Giaccia et al. (1992), Int. J. Radiotion Oncol. Biol. Phys. 23, Seiten 891 bis 897, Semenza et al. (1992), Mol. Cell. Biol. 12, Seiten 5447 bis 5454, Shweiki et al. (1992), Nature 359, Seiten 843 bis 845, Heacock et al. (1986), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12, Seiten 1287 bis 1290. Relativ vorübergehende Hypoxie kann zu einer erhöhten Frequenz von Dihydrofoliatreduktasegenverstärkung und somit zu Methotrexatresistenz führen. Rice et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, Seiten 5978 bis 5982. Durch Hypoxie induzierte Arzneimittelresistenz ist jedoch verschieden von P-Glycoprotein, das mit Resistenz gegenüber vielen Arzneimitteln verbunden ist. Sakata et al. (1991) Br. J. Cancer 64, Seiten 809 bis 814. Die negativen Wirkungen, die hypoxische Zellen auf klinische Antitumortherapie haben, führten zu intensiver Forschung, um diese Zellen in Tumoren zu identifizieren.
Das pO&sub2; von Venenblut ist etwa 5% und ergibt somit nahezu vollständige Abschirmung bei Strahlung. Die Sauerstoffspannung, bei welcher Zellen Empfindlichkeit zwischen jenen in Stickstoff und jenen in Luft haben, sowie jenen in Luft oder reinem Sauerstoff, ist etwa 0,5% (Km-Wert). Dies bewirkt, daß spezielle Sauerstoffgehalte weit unter jenen, die bei normalen Geweben auftreten, genau zu messen sind. Derzeitige Technologie führt jedoch oftmals zu einem Mittelwert für große Anzahlen benachbarter Zellen und befriedigt diesen Bedarf nicht. Dies ist ein ernsthafter Nachteil für die Feststellung und Diagnose, da histologische Bewertung solcher Tumore vorschlägt, daß wesentliche Veränderungen beim zellulären Sauerstoff über Abmessungen von selbst einigen Zelldurchmessern auftreten können. Urtasun et al. (1986), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12, Seiten 1263 bis 1267.
2-Nitroimidazole wurden als Sonden für Tumorhypoxie untersucht, teilweise wegen ihrer Fähigkeit, hypoxische Zellen spezifisch zu markieren, wobei man eine zelluläre Auflösung bekommt, und teilweise wegen ihrer Empfindlichkeit, die obenerwähnten niedrigen pO&sub2;-Werte genau zu überwachen. Die Verbindungen unterliegen bekanntermaßen einer Nitroreduktion unter Bildung reaktiver Zwischenprodukte, wie von Hydroxylaminen, die irreversibel Makromoleküle in hypoxischen Geweben binden. Chapman et al. (1983), Cancer rEs. 43, Seiten 1523 bis 1528, Koch et al. (1984), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 10, Seiten 1327 bis 1332, Miller et al. (1982), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 8, Seiten 741 bis 744, Taylor et al. (1978), Cancer Res. 38, Seiten 2745 bis 2752; Varghese et al. (1980), Cancer Res. 40, Seiten 2165 bis 2169. Die Bioreduktionsgeschwindigkeit nimmt mit abnehmendem pO&sub2; zu, was die Markierung hypoxischer Zellen bevorzugt gegenüber normalen sauerstoffreichen Zellen einschließlich jener des benachbarten Stromagewebes erlaubt. Urtasun et al. (1986), a.a.O. Dieses Phänomen wurde daher in der Entwicklung von Markern für angreifende (durch Biopsie) und nichtangreifende Bewertung von Tumorhypoxie ausgenutzt. Angreifende Verfahren beruhen auf Biopsieproben, die nicht repräsentativ für den gesamten Tumor sein müssen oder eine detaillierte Kenntnis der histologischen Struktur und des Gefäßbildes des interessierenden Tumors erfordern. Nichtangreifende Techniken jedoch haben die Möglichkeit, die Messung des oxidierenden Status des Tumors als Ganzes zu gestatten.
2-Nitroimidazole tragende verschiedene Radiomarkierungen, wie ³H, ¹&sup4;C, ¹&sup8;F, &sup8;²Br und ¹²&sup5;I wurden durch Autoradiographie, Flüssigkeitsszintillation und gamma-Szintillation festgestellt. Chapman (1984), Cancer 54, Seiten 2441 bis 2449, Koh et al (1991), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 22, Seiten 199 bis 212, Mannan et al. (1992) Radiation Res. 132, Seiten 368 bis 372, Rasey et al (1982) Radiation Res. 91, Seiten 542 bis 554, Rasey et al. (1985), Radiation Res. 102, Seiten 76 bis 85, Urtasun et al (1986), a.a.O. Beispielsweise wurden Melanome, Carcinome mit schuppigen Zellen und kleinzelliger Lungekrebs beim Menschen aufgrund ihres Oxidationsstatus von Chapman und Mitarbeitern unter Verwendung von Flüssigszintillation und Autoradiographie histologischer Schnitte ausgesondert. Chapman (1991), Radiother. Oncol. 20 (Supp.) Seiten 13 bis 19. Obwohl diese Verfahren jedoch die Möglichkeit von 2-Nitroimidazolen zeigen, als spezifische Marker für hypoxische Zellen zu wirken, sind sie nicht geeignet für Routineverwendung wegen der erforderlichen großen Dosierungen von markiertem Marker und wegen der mit ihnen verbundenen Strahlungsdosis oder Kontaminierung. Außerdem beschränkt die Instabilität von Markierungen und die Ansammlung von Marker in bestimmten anderen Geweben ihre Verwendung. Chapman (1991), a.a.O., Rasey et al. (1982), a.a.O.
Mehrere Untersuchungen des Oxidierungsstatus von Tumoren wurden unter Verwendung immunohistochemischer Methoden durchgeführt, insbesondere unter Verwendung der Eigenfluoreszenz von Nitroimidazoladdukten oder mit Hilfe von fluoreszierenden polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die gegen die Addukte gerichtet sind. 2-Nitroimidazole, die fluoreszierende Seitenketten enthalten, wie Theophyllin, sowie andere fluoreszierende Nitroheterozyklen, wie trans-5-Amino-3-[(5-nitro-2-furyl)-vinyl-1,2,4-oxadiazol, wurden in histologischen Schnitten unter Verwendung von Strömungszytometrie quantifiziert. Hodgkiss et al. (1991), Br. J. Cancer 63, Seiten 119 bis 125, Olive et al. (1983) Cancer Res. 43, Seiten 3276 bis 3280. Außerdem ergibt das Aussondern von fluoreszierenden Zellen ein Mittel zum Herausfinden des Oxidationsstatus auf der Basis von Zelle zu Zelle. Polyklonale Antikörper an dem hexafluorierten 2-Nitroimidazol CCI-103F und monoklonale Antikörper an dem pentafluorierten 2- Nitroimidazol EF5 wurden jüngst verwendet, um den Oxidationsstatus von Spheroiden und experimentellen Tiertumoren zu untersuchen. Lord et al. (1993), Cancer Res. 53, Seiten 5721 bis 5726, Raleigh et al. (1994), Br. J. Cancer 69, Seiten 66 bis 71, Raleigh et al. (1987), Br. J. Cancer 56, Seiten 395 und 396. Außer Daten für den Oxidationsstatus einzelner Zellen können diese Antikörpertechniken zusätzliche Daten an Bindungsstellen und selbst an individuellen makromolekularen Addukten liefern. Wie mit anderen angreifenden Techniken sind sie jedoch durch die Biopsiegröße begrenzt und würden daher wiederum nicht vollständig der Heterogenität des Tumors als Ganzem Rechnung tragen.
Mit einem Positronemitter, wie ¹&sup8;F, markierte 2-Nitroimidazole können nichtangreifend durch Positronemissionstomographie (PET) festgestellt werden. Beispielsweise demonstrierten Koh et al. (1991), a.a.O. das Vorhandensein hypoxischer Bereiche in Tumoren von Patienten vor der Radiotherapie unter Verwendung von PET-Abbildung. In der Untersuchung wurden hypoxische Elemente in einem Tumorvolumen als Regionen mit einem regionalen Tumor : Plasma-18F-Misonidazol-Schwellenverhältnis ≥ 1,4 durch zwei oder mehr Stunden nach Injektion definiert. PET ist eine hochempfindliche Technik, leidet aber unter größeren Nachteilen, wie kurzer Halbwertszeit des ¹&sup8;F-Markers (t1/2 109,7 min), was zu einer beachtlichen Investition an technischen Anlagen führt, wie zu einem Zyklotron an der Stelle, welches benötigt wird, um die markierten Verbindungen unmittelbar vor der Verwendung in der Behandlungsanlage zu erzeugen. Untersuchungen können auch durch Strahlung und das Fehlen geeigneter chemischer Information gekennzeichnet werden.
Untersuchungen schreiten voran, γ-markierte 2-Nitroimidazole als nichtangreifende Sonden für Tumorhypoxie durch herkömmliche Nuklearmedizin und Emissionstomographie mit Einzelphoton zu entwickeln. Beispielsweise untersuchten Rasey und Mitarbeiter die radiobiologischen und pharmakologischen Eigenschaften von 4-Bromisonidazol als Marker für Tumorhypoxie. Rasey et al. (1982), a.a.O. Auch Parliament und Mitarbeiter verwendeten 1231- Jodazomycinarabinosid als eine Sonde für Tumorhypoxie durch Emissionstomographie mit Einzelphoton (SPECT). Parliament et al. (1992), Br. J. Cancer 65, Seiten 90 bis 95. Unterwegs sind noch Studien, um die Möglichkeit dieser Technik für klinische Verwendung vollständig zu bewerten.
Es wurde nun umfangreich gezeigt, daß 2-Nitroimidazole, die 2H- und 19F- Markierung(en) nichtangreifend in Tumoren durch magnetische Resonanzspektroskopie (MRS) und Abbildung (MRI) festgestellt werden können. Evelhoch et al (1989), Magn. Reson. Med. 9, Seiten 402 bis 410, Jin et al. (1990), Int. J. Radiation Biol. 58, Seiten 1025 bis 1034, Kwock et al. (1992), Radiation Res. 129, Seiten 71 bis 78, Maxwell et al. (1989), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 16, Seiten 925 bis 929, Raleigh et al (1991), Magn. Reson. Med. 22, Seiten 451 bis 466, Raleigh et al. (1986), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12, Seiten 1243 bis 1245. Magnetische Resonanzspektroskopie ist eine Technik, welche ähnlich der kernmagnetischen Resonanz das Signal zeigt, welches von dem interessierenden Kern als ein Intensitätspeak erhalten wird. Dies steht im Gegensatz zur magnetischen Resonanzabbildung, welche die Daten als ein Bild oder eine Karte der Intensitätswerte wiedergibt. Diese Techniken werden zunehmend populär wegen der weitverbreiteten Verfügbarkeit von MR-Geräten in den meisten Krankenhäusern und da sie nichtradioaktive Sonden verwenden.
Der ¹&sup9;F-Kern ist ideal geeignet für MRS-Studien, da er einen Spin von 1/2, eine hohe natürliche Häufigkeit (100%), eine relativ hohe Empfindlichkeit für die Ermittlung (0,83 bezüglich Protonen) und niedrigen Hintergrund hat. Im allgemeinen wird die Verwendung von ¹&sup9;F- MRS von folgendem abhängen
a) Der Verfügbarkeit eines fluorierten Arzneimittels. 2-Nitroimidazole mit einer hohen Zahl von magnetisch äquivalenten Fluoratomen wird allgemein eine höhere Empfindlichkeit ergeben. Die Verbindung sollte ideal eine relativ niedrige Lipophilizität haben und relativ beständig gegen einen Verlust der Markierung durch Stoffwechselverfahren oder Nichtstoffwechselverfahren haben.
b) Die Toxizität des Mittels. Allgemein können derzeit nur Arzneimittel festgestellt werden, die in relativ hohen Dosierungen verabreicht werden können (in der Größenordnung von 0,1 mmol/kg/magnetisch äquivalentes Fluoratom). Workman et al. (1992), NMR Biomed. 5, Seiten 270 bis 272. Dies wird durch die Toxizität der Verbindungen beeinflußt, welche ihrerseits in Beziehung zu ihren Lipophilizitäten steht.
c) Die pharmakokinetischen Eigenschaften der Verbindung und insbesondere das Verhältnis von Tumorgewebe zu normalem Gewebe. Abgesehen von der Beeinflussung der Toxizität der Verbindungen zeigen diese Eigenschaften auch die Spezifizität der Sonden für das interessierende Phänomen.
Bei Verwendung von ¹&sup9;F-MRS haben zwei fluorierte Misonidazolanaloge, Ro07-0741 und CCI-103F, gezeigt, daß sie selektiv in Mäusetumoren zurückgehalten werden. Maxwell et al. (1989), a.a.O., Workman et al. (1992), a.a.O. Es wurde beobachtet, daß die Signalintensitäten in EMT-6 und KHT höher als bei RIF-1-Tumoren sind, und dies stand in Übereinstimmung mit den bekannten hypoxischen Anteilen und war vergleichbar in vivo mit Nitroreduktaseaktivität. Moulder et al (1984), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 10, Seiten 695 bis 712, Walton et al. (1987) Biochem. Pharmacol. 36, Seiten 887 bis 896. Bei einer anderen Studie blieb das ¹&sup9;F- Signal, das man bei Tumoren nach intraperitonealer Injektion von tumortragenden Ratten mit CCI-103F erhielt, bei vier von zehn Ratten nach 24 h feststellbar, was eine nitroreduktive Bioaktivierung durch hypoxische Zellen als möglich zeigt. Kwock et al. (1992), a.a.O. Immunohistochemische Bewertung dieser Tumore ergab etwas Anfärbung für gebundenes Arzneimittel an der Peripherie nekrotischer Zonen. Kwock et al. (1992), a.a.O.
Die Brauchbarkeit des MRI/MRS-Weges zur Feststellung von Tumoren in vivo wurde von Maxwell et al. (1989), a.a.O. unter Verwendung von mit ¹&sup9;Fmarkierten Analogen von Misonidazol, CCI-103Fund Ro 07-0741, und von Prior et al. (1990) Biochem. Pharmacol. 39, Seiten 857 bis 863 mit 5-Fluorouracil (5-FU) demonstriert. Jüngste Arbeiten von Glaholm et al. (1990); Br. J. Radiol. 63, Seiten 547 bis 553 mit Patienten, die 5-FU-Behandlung bei wiederkehrenden gastrointestinalen Adenocarcinomen erhielten, ergaben auch, daß MRI/MRS-Techniken bei der Überwachung der Pharmakokinetik geeignet markierter Verbindungen in vivo brauchbar sein können. Solche Methoden haben die Möglichkeit, eine Ausführung mit präziserer Behandlung für individuelle Patienten möglich zu machen.
Obwohl CCI-103F besser als Ro 07-0741 bezüglich der magnetischen Resonanzempfindlichkeit ist, kann seine klinische Brauchbarkeit durch seine Lipophilizität (Octanol/Wasser- Aufteilungskoeffizient von CCI-103F = 20, jener von Ro 07-0741 = 0,41) und daher seine Toxizität begrenzt sein. Wie Misonidazol ist auch CCI-103F empfänglich für Stoffwechseldealkylierung unter Verlust der ¹&sup9;F-Markierung. Dies kann auf nichtsauerstoffabhängige Veränderungen bei der kovalenten Adduktbildung sowie die Schwierigkeit bei der Interpretation der Aufrechterhaltungsdaten zurückzuführen sein.
Die Hauptprobleme mit den bislang für MRI- und MRS-Techniken benutzten ¹&sup9;F- markierten Verbindungen sind ihre neurotoxischen Nebenwirkungen infolge ihrer relativ hohen Lipophilizitäten (CCI-103F und Ro 07-0741) sowie ein relativ schwaches Signal infolge der Anzahl von Fluoratomen je Molekül (z. B. mit 5-FU gefunden).
Obwohl diese Verbindungen signifikantes Potential zeigen, gibt es daher einen entscheidenden Bedarf an Technik für stärker ortsspezifischen und weniger toxischen ¹&sup9;F- Tumorfeststellungsmitteln mit hoher Signalstärke.

Überblick von verwandter Technik

Zusätzlich zu den im vorausgehenden Abschnitt zitierten Veröffentlichungen sind die folgenden Literaturstellen von Interesse, da sie Nsubstituierte 2-Nitroimidazolderivate betreffen:
Die US-Patentschrift Nr. 3 679 698 von Beaman et al. beschreibt N- Alkansäureamidderivate von 2-Nitroimidazolderivaten.
Die US-Patentschrift Nr. 4 977 273 von Kagiya et al. beschreibt 2-Nitroimidazolderivate, die fluorsubstituierte Methylengruppen enthalten.
Shibamoto et al (1992), Int. J. Radiation Biol. 61, Seiten 473 bis 478, Sasai et al. (1991), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 20, Setien 1249 bis 1254 und Sasai et al. (1991), Inte. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 21, Seiten 1231 bis 1234 beschreiben Ku-2285, ein 2-Nitroimidazol mit einem N¹-Substituenten von CH&sub2;CF&sub2;C(O)NHCH&sub2;CH&sub2;OH.
Mashiba et al. (1991), Life Sciences 49, Seiten 1419 bis 1425 und Shibamoto et al. (1991), Int. J. Radiation Biol. 59, Seiten 105 bis 115 beschreiben 1-(4'-Hydroxy-2'-butenoxy)- methyl-2-nitroimidazol (RK-28).
Shibamoto et al (1989), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 16, Seiten 1045 bis 1048 beschreiben 2-Nitroimidazole und 3-Nitro-1,2,4-triazole, die ein oder zwei Fluoratom(e) an ihren Seitenketten tragen.
Murayama et al. (1989), Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 17, Seiten 575 bis 581 beschreiben 1-[2-Hydroxy-1-(hydroxymethyl)-ethoxy]-methyl-2-nitroimidazol (RP-170).
Li et al. (1991), Cancer Comm. 3, Seiten 133 bis 139 beschreiben Hexafluormisonidazol (CCI-103F) als eine Markierung für hypoxische Zellen, die durch [¹H]/[¹&sup9;F]-magnetische Resonanzspektroskopie in vivo gemessen werden kann.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 94/11 348 von Koch et al. beschreibt N- substituierte 2-Nitroimidazolderivate, die in vivo durch kernmagnetische Resonanz für die Ermittlung von Gewebehypoxie gemessen werden können, wobei der N-Substituent -R¹-C(O)- NH-R² ist, worin R¹ CH&sub2;, CHX oder CX&sub2; ist, worin X Halogen bedeutet, und R² eine C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylgruppe ist, die vorzugsweise bis zu 6 Halogenatome hat.
Die europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 294 847 A von Kagiya et al. beschreibt N- substituierte 2-Nitroimidazolderivate für die Verwendung als Radiosensibilisatoren.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist demnach ein Hauptziel der Erfindung, den obenerwähnten Bedarf in der Technik zu berücksichtigen, indem man neue Verbindungen liefert, die zur Feststellung von Tumoren und Überwachung von Antitumortherapie unter Verwendung magnetischer Resonanzabbildung und/oder magnetischer Resonanzspektroskopie brauchbar sind.
Es ist ein anderes Ziel der Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen für die Abbildung hypoxischer Tumorzellen und zur Überwachung des Voranschreitens von Antitumortherapie bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur nichtangreifenden Abbildung hypoxischer Tumorzellen und zur Überwachung des Voranschreitens von Antitumortherapie zu bekommen, bei dem man dem zu behandelnden Patienten eine wirksame Menge einer Verbindung nach der Erfindung verabreicht.
Weitere Ziele, Vorteile und neue Merkmale der Erfindung ergeben sich teilweise aus der folgenden Beschreibung und werden dem Fachmann bei der Prüfung der folgenden Ausführungen teilweise offenbar oder können durch die Praxis der Erfindung gelernt werden.
Bei einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung bestimmte neue Verbindungen, die als Tumorfeststellungsmittel unter Verwendung magnetischer Resonanzabbildung und magnetischer Resonanzspektroskopie brauchbar sind. Die neuen Verbindungen, die hier beschrieben und beansprucht sind, besitzen relativ geringe neurotoxische Aktivität, d. h. sie sammeln sich nicht in merklichem Umfang im Gehirn an, konzentrieren sich in Tumorzellen in einer ausreichend hohen Konzentration, um ein ¹&sup9;F-Signal ausreichender Intensität für die Ermittlung unter Verwendung von MRI/MRS-Techniken zu ergeben, und können leicht synthetisiert werden. Die neuen Verbindungen haben die Strukturformel (I)
worin
a) wenigstens eine der Gruppen R¹ und R² C&sub1;&submin;&sub6; ist, welches mit einer CF&sub3;-Gruppe und weiterhin mit ein oder zwei OH-Gruppen substituiert ist, und, wenn eines von R¹ oder R² vier oder mehr Kohlenstoffatome enthält, es mit mehr als einer OH-Gruppe substituiert ist, und jede der restlichen Gruppen R¹ oder R² unter
(i) Wasserstoff,
(ii) einem unsubstituierten Monosaccharid,
(iii) einem Monosaccharid, das mit einer C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxygruppe, einer Acylgruppe, worin die über die Carbonylbindung gebundene Alkylgruppe C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ist, einem Amin-, Halogen- oder Carbonsäurerest substituiert ist,
(iv) C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl; das mit einer-CF&sub3;-Gruppe substituiert ist und weiterhin mit einer oder zwei OH-Gruppen substituiert ist, und
(v) fünf- und sechsgliedrigen heterozyklischen Ringen, die ein unter N, O und S ausgewähltes Heteroatom enthalten, ausgewählt ist, oder
b) R¹ und R² unter Bildung eines fünf- oder sechsgliedrigen heterozyklischen Ringes verbunden sind, welcher wenigstens ein unter N und O ausgewähltes Heteroatom hat, und worin weiterhin der heterozyklische Ring entweder
(i) mit einem CF&sub3;-Rest substituiert ist oder
(ii) mit einem CF&sub3;-Rest und einem weiteren Substituenten substituiert ist, welcher unter -OH, -CH&sub2;OH und -NH&sub2; ausgewählt ist, worin sich der zusätzliche Substituent an demselben Kohlenstoffatom wie das CF3 befindet.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere der obigen Verbindungen in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Diese Zusammensetzungen werden allgemein, obwohl nicht notwendigerweise, oral verabreicht.
Die Erfindung enthält weiterhin Verfahren zur Feststellung hypoxischer Tumorzellen durch Verabreichung einer wirksamen tumorermittelnden Menge einer Verbindung der Erfindung an einen Patienten, der einer MRI- oder MRS-Bewertung unterzogen wird. MRI und/oder MRS werden dann verwendet, um Verbindung zu ermitteln, welche mit Tumorzellen in dem Patienten verbunden und von diesen Zellen zurückgehalten wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 erläutert in graphischer Form den Stoffwechsel von SR 4554 durch Mäuselebermikrosomen, wie im Beispiel 4 erklärt ist.
Fig. 2 bedeutet in graphischer Form eine Bewertung von Fluorabbildungen äußerer und innerer Zellen von A2780-Spheroiden vor und nach Rinnenkultur, erhalten unter Verwendung von Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS), wie in Beispiel 5 beschrieben.
Fig. 3 zeigt in graphischer Form die Pharmakokinetik von SR 4554 in EMT-6- tumoraufweisenden Balb/c-Mäusen, wie in Beispiel 6 bewertet.
Fig. 4 zeigt in graphischer Form die Gewebe-zu-Plasma-Verhältnisse von SR 4554 als eine Funktion der Zeit nach intraperitonealer Injektion, wie in Beispiel 6 beschrieben.
Fig. 5A erläutert in graphischer Form das Körpergewicht von Balb/c-Mäusen nach intravenöser Injektion mit SR 4554 oder Kochsalzlösung.
Fig. 5B zeigt in graphischer Form das Körpergewicht von Balb/c-Mäusen nach intraperitonealer Injektion mit SR4554 oder Kochsalzlösung.
Fig. 6A ist ein magnetisches Resonanzspektrum von SR 4554 und 5-Fluortryptophan, während
Fig. 6B ein magnetisches Resonanzspektrum von HOD (natürlich reichlich vorkommend deuterisiertes Wasser) und Essigsäure-d ist.
Fig. 7 zeigt in graphischer Form die Zurückhaltung von Arzneimittel, das von RIF-1- Tumoren zurückgehalten wird, als eine Funktion des Tumorgewichtes, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Fig. 8 zeigt die Rückhaltung von SR 4554 in Mäuse- und Menschentumorxenograften.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Definitionen und Nomenklatur:

Bevor die vorliegenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Methoden offenbart und beschrieben werden, ist zu verstehen, daß diese Erfindung nicht auf spezielle Reagenzien oder Reaktionsbedingungen, spezielle pharmazeutische Träger oder spezielle Verabreichungsmethoden beschränkt ist, da diese variiert werden können. Es ist auch zu verstehen, daß die hier verwendete Terminologie nur zum Zwecke einer Beschreibung spezieller Ausführungsformen verwendet wird und nicht beschränkend, sein soll.
Es muß bemerkt werden, daß bei Verwendung in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen die Einzahlformen "ein", "eine" und "der, die, das" auch die Mehrzahl einschließen, wenn nicht der Kontext klar etwas anderes bestimmt. So schließt beispielsweise ein Bezug auf "ein 2-Nitroimidazolanaloges" Gemische von 2-Nitroimidazolanalogen ein, die Bezugnahme auf "einen pharmazeutischen Träger" schließt Gemische zweier oder mehrerer solcher Träger ein und so weiter.
In dieser Beschreibung und den Ansprüchen, die folgen, wird auf eine Anzahl von Begriffen, die so definiert sein sollen, daß sie die folgenden Bedeutungen haben, Bezug genommen:
Der Begriff "Alkyl", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine verzweigte oder unverzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, Octyl, Decyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Eicosyl, Tetracosyl und dergleichen. Bevorzugte Alkylgruppen enthalten hier 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Der Begriff "niedermolekulares Alkyl" meine eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "Alkenyl", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen und mit wenigstens einer Doppelbindung, wie Ethenyl, n-Propenyl, Isopropenyl, n-Butenyl, Isobutenyl, tert-Butenyl, Octenyl, Decenyl, Tetradecenyl, Hexadecenyl, Eicosenyl, Tetracosenyl und dergleichen. Bevorzugte Alkenylgruppen enthalten hier 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Der Begriff "niedermolekulares Alkenyl" soll eine Alkenylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten. Der Begriff "Cycloalkenyl" bedeutet eine zyklische Alkenylgruppe mit 3 bis 8, vorzugsweise 5 oder 6 Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "Alkoxy", wie er hier verwendet wird, meint eine Alkylgruppenbindung über eine einzelne, endständige Etherbindung, d. h. eine "Alkoxy"-Gruppe kann als -OR definiert werden, worin R Alkyl ist, wie oben definiert. Eine "niedermolekulare Alkoxy"-Gruppe bedeutet eine Alkoxygruppe, die 1 bis 6, stärker bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält.
Der Begriff "Acyl", wie er hier verwendet wird, wird in seinem herkömmlichen Sinn benutzt, um sich auf eine Alkylgruppe zu beziehen, die über eine -(CO)-Bindung gebunden ist. Der Begriff "niedermolekulares Acyl" bedeutet eine Acylgruppe, in welcher die Alkylgruppe, welche über eine Carbonylgruppe gebunden ist, eine niedermolekulare Alkylgruppe ist.
"Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Jod und betrifft gewöhnlich Halogensubstitution für ein Wasserstoffatom in einer organischen Verbindung. Von den Halogenen sind Chlor und Fluor allgemein bevorzugt.
Der Begriff "Zuckerrest" soll Monosaccharide einschließen. Der Zuckerrest sollte so ausgewählt sein, daß er die Löslichkeit in Wasser erhöht und/oder die Lipophilizität der tumorfeststellenden Verbindung senkt. Der Begriff "Zucker" schließt jene Reste ein, welche modifiziert wurden, z. B. solche, worin eine oder mehrere der Hydroxylgruppen durch Halogen, Alkoxyreste, aliphatische Gruppen ersetzt sind oder als Ether, Amine oder dergleichen funktionalisiert sind. Beispiele modifizierter Zucker sind etwa jene, welche eine niedermolekulare Alkoxygruppe anstelle des Hydroxylrestes enthalten, d. h. α- oder β-Glycoside, wie Methyl-α-D- glucopyranosid, Methyl-β-D-glucopyranosid und dergleichen. Jene, die mit Aminen umgesetzt wurden, d. h. mit N-Glycosylaminen oder N-Glycosiden, wie N-(α-D-Glucopyranosyl)- methylamin, jene, die acylierte Hydroxylgruppen, typischerweise 1 bis 5 niedermolekulare Acylgruppen enthalten, jene, die eine oder mehrere Carbonylsäuregruppen enthalten, z. B. D- Gluconsäure oder dergleichen, sowie jene, die Carbonsäuregruppen enthalten, z. B. D- Gluconsäure oder dergleichen, und jene, die freie Aminogruppen enthalten, wie D-Glucosamin, D-Galactosamin, N-Acetyl-D-glucosamin und dergleichen. Beispiele bevorzugter Saccharide sind Glucose, Galactose, Fruktose, Ribose, Mannose, Arabinose, Xylose, wobei D-Glucose besonders bevorzugt ist.
Unter dem Begriff "wirksame Menge" eines Mittels, wie es hier zur Verfügung gestellt wird, meint man eine nichttoxische, aber ausreichende Menge des Mittels, um die erwünschte Signalintensität zu bekommen, so daß MRI und MRS durchgeführt werden können. Wie nachfolgend ausgeführt werden wird, wird die erforderliche genaue Menge von Patient zu Patient variieren, je nach der Art, dem Alter und dem allgemeinen Zustand des Patienten, der Schwere der Erkrankung in Verbindung mit dem Tumor, dem speziellen fluorierten 2- Nitroimidazolanalogen und seiner Verabreichungsweise usw. Somit ist es nicht möglich, eine genaue "wirksame Menge" zu spezifizieren. Eine geeignete wirksame Menge kann jedoch von einem Fachmann auf diesem Gebiet unter Verwendung lediglich von Routineexperimenten bestimmt werden.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbar" zur Beschreibung pharmazeutischer Träger und dergleichen meine Materialien, die nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht sind, d. h. das Material kann an einen Patienten zusammen mit dem ausgewählten fluorierten 2- Nitroimidazolanalogen verabreicht werden, ohne irgendwelche unerwünschten biologischen Wirkungen oder eine Wechselwirkung in schädlicher Weise mit irgendeiner der anderen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, worin es enthalten ist, zu verursachen.
Die Erfindung befaßt sich mit neuen fluorierten 2-Nitroimidazolderivaten, die für die nichtangreifende Ermittlung von Tumorhypoxie durch magnetische Resonanzabbildung und/oder magnetische Resonanzspektroskopie brauchbar sind. Die Verbindungsklasse der 2- Nitroimidazole unterliegt einer Nitroreduktion zu reaktiven Zwischenprodukten, welche kovalente Addukte mit Makromolekülen bilden. Die Bindung dieser Verbindungen an Gewebe nimmt mit abnehmender Sauerstoffkonzentration (oder zunehmender Hypoxie) zu und ermöglicht es somit, daß die Verbindungen als Marker für Tumorhypoxie wirken. Die Einführung einer ¹&sup9;F- Markierung gestattet eine Ermittlung der zurückgehaltenen Verbindungen unter Verwendung nichtangreifender Techniken, wie von Magnetresonanzabbildung und Magnetresonanzspektroskopie. Da kompakte Tumore allgemein Bereiche hypoxischer Zellen haben, die es ihnen ermöglichen, ungeachtet intensiver Behandlungen lebensfähig zu bleiben, würde die Feststellung und Quantifizierung von Hypoxiebereichen in Tumoren eine rationale Auswahl von Patienten es am wahrscheinlichsten ermöglichen, Nutzen aus Hypoxiezieltherapien, wie Radiosensibilisatoren, Chemosensibilisatoren und anderen bioreduktiv aktivierten Arzneimitteln zu ziehen. Außerdem wird eine Beobachtung der Reaktionen dieser Zellen zu verbesserten Behandlungsverfahren führen.

Die neuen Verbindungen

Die neuen Verbindungen, die hier bereitgestellt werden, sind jene, die durch die Strukturformel (I) definiert sind, worin
R¹ und R² unabhängig voneinander unter Wasserstoff, einem Monosaccharid, welches gegebenenfalls funktionalisiert ist, um eine niedermolekulare Alkoxygruppe, niedermolekulare Acylgruppe, Aminogruppe, einen Halogenrest oder Carbonsäurerest zu enthalten, worin die Bindung an ein Kohlenstoffatom des Monosaccharids vorliegt, niedermolekularem Alkyl, welches mit einer CF&sub3;-Gruppe und außerdem mit wenigstens einer OH-Gruppe substituiert ist,
und 5- und 6gliedrigen carbozyklischen Ringen, die ein unter N, O und S ausgewähltes Heteroatom enthalten, oder worin R¹ und R² unter Bildung eines 5- oder 6gliedrigen Alkylringes, welcher mit einem CF&sub3;-Rest substituiert ist, mit den folgenden Voraussetzungen ausgewählt sind,
daß wenigstens eine der Gruppen R¹ und R² ein niedermolekularer Alkylsubstituent ist, der mit einer CF&sub3;-Gruppe und weiterhin mit wenigstens einer OH-Gruppe substituiert ist, und daß, wenn eine der Gruppen R¹ und R² 4 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, sie mit mehr als einer OH-Gruppe substituiert ist.
Beispiele bevorzugter Verbindungen in dieser Gruppe sind folgende:
- jene, worin R¹ Wasserstoff ist und R² niedermolekulares Akyl ist, welches mit einer CF&sub3;- Gruppe und wenigstens einer OH-Gruppe, vorzugsweise zwei OH-Gruppen substituiert ist,
- jene, worin R¹ und R² unabhängig voneinander niedermolekulare Alkylgruppen sind, die mit einer CF&sub3;-Gruppe und wenigstens einer OH-Gruppe substituiert sind, vorzugsweise solche Verbindungen, worin R¹ und R² nicht identisch sind und
- jene, worin R¹ ein Monosaccharid und R² eine niedermolekulare Alkylgruppe sind, welche letztere mit einer -CF&sub3;-Gruppe und wenigstens einer -OH-Gruppe substituiert ist, und vorzugsweise solche Verbindungen, worin R¹ D-Glucose ist.
Beispiele besonders bevorzugter Verbindungen sind solche, worin R¹ 2-Hydroxy-3,3,3- trifluorpropyl und R² Wasserstoff, Hydroxyethyl oder D-Glucose sind.
Spezielle Beispiele innerhalb der Gruppe sind folgende:

Brauchbarkeit und Verabreichung

Die Verbindungen nach der Erfindung, die durch die Strukturformel (I) definiert sind und die pharmakologisch annehmbaren Salze derselben einschließen, sind als Tumorfeststellungsmittel brauchbar, besonders als für hypoxische Zellen spezifische Sonden, und können bequemerweise zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die aus einer oder mehreren der Verbindungen in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger bestehen. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, E. W. Martin (Mack Publ. Co:, Easton PA 1990) beschreibt typische Träger und herkömmliche Methoden zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die benutzt werden können, um Formulierungen unter Verwendung der Tumorfeststellungsmittel nach der Erfindung zu bereiten. Das Verfahren der Erfindung schließt eine Verabreichung einer wirksamen tumorfeststellenden Menge der ausgewählten Verbindung an den Patienten, der einer Bewertung unterzogen wird, d. h. einem Säugetierpatienten, und anschließende Ermittlung der Verbindung, die mit den Tumorzellen verbunden sind und von ihnen zurückgehalten werden, hinsichtlich ihrer Anwesenheit ein. Eine solche Ermittlung, wie oben angegeben, wird unter Verwendung nichtangreifender Techniken, wie magnetischer Resonanzabbildung oder magnetischer Resonanzspektroskopie, durchgeführt.
Die Verbindungen können oral, parenteral (z. B. intravenös), durch intramuskuläre oder inträperitoneale Injektion oder dergleichen verabreicht werden. Intravenöse Verabreichung einer Lösung wird klinisch bevorzugt, da eine Kontrolle über die genaue verabreichte Dosis leichter erfolgen kann. Die Menge an verabreichter aktiver Verbindung wird natürlich von dem der Bewertung unterzogenen Patienten, dem Gewicht desselben, der Verabreichungsweise und der Beurteilung des vorschreibenden Arztes abhängen.
Je nach der beabsichtigten Verabreichungsweise können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in festen, halbfesten oder flüssigen Dosierungsformen, wie beispielsweise als Tabletten, Suppositorien, Pillen, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten, Suspensionen oder dergleichen vorliegen, vorzugsweise in einer Dosierungseinheitsform, die für eine einzelne Verabreichung einer genauen Dosierung geeignet ist. Die Zusammensetzungen werden, wie oben festgestellt, eine wirksame Menge des ausgewählten Arzneimittels in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen und können außerdem andere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel usw. enthalten.
Für feste Zusammensetzungen enthalten herkömmliche nichttoxische feste Träger beispielsweise Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Cellulose, Glucose, Rohrzucker, Magnesiumcarbonat und dergleichen, alles in pharmazeutischer Qualität. Flüssige pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen können beispielsweise durch Auflösen, Dispergieren usw. einer aktiven Verbindung, wie hier beschrieben, und gegebenenfalls pharmazeutische Hilfsstoffe in einem Träger, wie beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, wäßriger Dextrose, Glycerin, Ethanol usw. hergestellt werden, um dabei eine Lösung oder Suspension zu bilden. Wenn erwünscht, kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch kleinere Mengen nichtgiftiger Hilfssubstanzen, wie Netzmittel oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel und dergleichen enthalten, wie beispielsweise Natriumacetat, Sorbitmonolaurat, Triethanolamin, Natriumacetat, Triethanolaminoleat usw. Tatsächliche Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder werden dem Fachmann offenbar, siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, a.a.O.
Für orale Verabreichung können feine Pulver oder Granalien Verdünnungs-, Dispergier- und/oder oberflächenaktive Mittel enthalten und in Wasser oder einem Sirup, Kapseln oder Dragees in trockenem Zustand oder einer nichtwäßrigen Lösung oder Suspension, worin Suspendiermittel eingeschlossen sein können, in Tabletten, worin Bindemittel und Schmiermittel enthalten sein können, oder in einer Suspension in Wasser oder einem Sirup dargereicht werden. Wenn erwünscht oder erforderlich, können Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel oder Emulgiermittel eingeschlossen werden. Tabletten und Granalien sind bevorzugte orale Verabreichungsformen, und diese können überzogen sein.
Parenterale Verabreichung ist, wenn angewendet, allgemein durch Injektion gekennzeichnet. Injizierbare Zusammensetzungen können in herkömmlichen Formen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, in fester Form, die für Auflösung oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet ist, oder als Emulsionen hergestellt werden. Ein in jüngerer Zeit verarbeiteter Weg für parenterale Verabreichung schließt eine Verwendung eines langsam abgebenden oder wirkungsrückhaltenden Systems ein, so daß ein konstanter Dosierungsspiegel aufrechterhalten wird. Siehe z. B. die US-Patentschrift Nr. 3 710 795, auf die hier Bezug genommen wird.
Für Verabreichung über die Lunge ist es bevorzugt, daß das zu verabreichende Arzneimittel in Pulverform überführt, mit einem herkömmlichen Treibmittel, wie einem Halogenkohlenwasserstoff, wie Tetrafluorethan, Trichlorfluormethan, Dichlorfluormethan oder dergleichen, vereinigt und als ein Aerosol verabreicht wird. Die Formulierung enthält vorzugsweise auch oberflächenaktive Mittel, um die Suspension oder Dispersion von Arzneimittelpulver in dem Treibmittel zu erleichtern und zu stabilisieren. Das Arzneimittelpulver wird normalerweise aus etwa 0,1 bis 10 Gew.-% der Formulierung bestehen. Die Aerosolformulierung mit festen Teilchen wird typischerweise in einer oder mehreren Einheitsdosierungen mit Dosierungen, wie oben angegeben, verabreicht, um therapeutische Arzneimittelgehalte zu bekommen.

Herstellungsverfahren

Das Ziel der Erfindung ist es, fluorhaltige 2-Nitroimidazole mit den erwünschten physikochemischen Eigenschaften zu erzeugen, die sowohl die üblicherweise bei Nitroheterozyklen gefundenen neurotoxischen Nebenwirkungen vermindern als auch die Ansammlung dieser Arzneimittel in hypoxischen Tumorzellen steigern. Die Hauptprobleme mit den bislang benutzten Verbindungen sind ihre relativ schwachen Signals infolge der Anzahl von Fluoratomen je Molekül (wie mit 5-Fluoruracil) oder ihre neurotoxischen Nebenwirkungen (CCI-103F und Ro 07- 0741), welche wahrscheinlich ihre hohen Lipophilizitäten betreffen. Brown et al. (1980), Radiation Res. 82, Seiten 171 bis 190. Die Erfinder haben hier Verbindungen synthetisiert, die die Trifluormethylgruppe enthalten, da man fand, daß die Anzahl der Fluoratome je Molekül des Arzneimittels für die hohe Signalstärke und die Empfindlichkeit mit MRI/MRS-Bewertung wichtig ist. Die 2-Nitroimidazolfunktionalität wird als erforderlich angesehen, da irreversible kovalente Bindung des markierten Arzneimittels an Makromoleküle in hypoxischen Zellen zu erhöhter Konzentration von Fluormarkierungen in diesen Zellen führt, was seinerseits an einer verbesserten Ermittlung der kompakten Tumore führt.
Der Syntheseweg, der nachfolgend beispielhalber angegeben ist, beruht auf der Synthese von fluorierten Analogen der bioreduktiv aktivierten Nitroheterozylusverbindung Etanidazol (SR 2508), die bereits bei SRI von W. W. Lee und J. M. Brown (Stanford University) (Brown et al. [1981], Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 7, Seiten 695 bis 703) entwickelt wurde. Dieser zeigte, daß Etanidazol weniger neurotoxisch als Misonidazol ist, was in Wechselwirkung mit niedrigerer Lipophilizität steht (Misonidazo: log P = -0,32, Etanidazol: log P = -1,28).
Die in dieser Reihe synthetisierte Anfangsverbindung, N-(2-Hydroxy-3,3,3-trifluorpropyl)- 2-(2-nitro-1 H-imidazol-1-yl)-acetamid (SR 4554), enthält alle erwünschten Komponenten für ein geeignetes Sondenmolekül, erwies sich aber als ziemlich unlöslich in 0,9% Kochsalzösung (Etanidazol = 551 mmol ml&supmin;¹ gegenüber SR 4554 = 23 mmol mal ml&supmin;¹) und hatte ein viel positiveres log P als vorausgesagt (Etanidazol = -1,28 gegenüber SR4554 = -0,20). Obwohl nicht der Wunsch besteht, sich durch eine bestimmte Theorie zu binden, ist es die ungewöhnliche elektronische Natur der Trifluormethylgruppe, welche als verantwortlich für diese Phänomene angenommen wurde. Der Umfang dieser Klasse von fluorierten 2- Nitroimidazolen wurde daher ausgedehnt, um besser in Wasser lösliche und hydrophile Derivate einzuschließen.
Von der Anfügung der hydrophilen Hydroxyethylseitenkette, um das tertiäre Amidoanaloge SR 4557 zu ergeben, wurde erwartet, daß dies die Wirkung der Trifluormethylgruppe aufhebt und eine Verbindung mit geeigneten physikochemischen Eigenschaften ergibt. Überraschend zeigte SR 4557 sehr geringe Veränderung des Wertes von log P (SR 4557 = -0,36 gegenüber SR4554 = -0,20), obwohl die Löslichkeit in 0,9%iger Kochsalzlösung stark erhöht wurde (SR 4557 = 628 mmol mal ml&supmin;¹ gegenüber SR 4554 = 23 mmol mal ml&supmin;¹). Die lipophilen Eigenschaften von SR 4554 und SR 4557 wurden ursprünglich angesehen, als machten sie diese Verbindungen ungeeignet für die Verwendung in vivo. Die hier beschriebene Arbeit mit SR 4554 jedoch zeigte, daß diese Annahme für diese Typen von fluorierten Derivaten ungültig sein kann, da pharmakokinetische Studien zeigen, daß SR 4554 sich zwar in hypoxischen Tumorzellen in genügend hoher Konzentration ansammelt, um ein ¹&sup9;F-Signal ausreichender Intensität für MRI/MRS-Techniken zu ergeben, doch sammelt es sich nicht in merklichem Umfang im Gehirn an.
Die Verbindungen der Erfindung können in hoher Ausbeute unter Verwendung relativ einfacher geradliniger Methoden hergestellt werden, wie in dem experimentellen Abschnitt hier beispielhalber gezeigt ist.
Es ist zu verstehen, daß die Erfindung zwar in Verbindung mit den bevorzugten speziellen Ausführungsformen derselben beschrieben wurde, daß aber die vorausgehende Beschreibung sowie die Beispiele, die folgen, dazu dienen, den Erfindungsgedanken zu erläutern und nicht zu beschränken. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen innerhalb des Erfindungsgedankens werden dem Fachmann, der sich mit der Erfindung befaßt, offenbar.

Experimentelles

Extraktion von Gewebeproben und Standards

Silbernitratlösung (25 uIm 30%ig Gew./Vol.) wurde zu 250 ul Gewebeproben und Standards und zu 20 ul innerer Standardlösung (12,5 ug/ml in 0,1 M Tris-Puffer, pH 7,4) zugesetzt. Proben wurden dann 5 min durchgewirbelt und zentrifugiert (200 · g). Die extrahierten Proben (50 ul) wurden dann in das HPLC injiziert.

HPCL-Methodologie

Das chromatographische System bestand aus einem WISP-Modell 712 Selbstprobennehmer (Waters Chromatography Ltd.), der Gefällekontrolleinrichtung Modell660 mit einer quaternären HPLC-Pumpe, einem Photodiodenanordnungsdetektor Modell 991 und einem NEC Powermate XS/16-Personal Computer, der mit Photodiodenanordnungssoftware von Waters 991 lief. Eine chromatographische Trennung mit umgekehrter Phase wurde auf einer analytischen Säule (Millipore) Bondapak C18 (3,9 · 300 mm) von 10 um bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Ein Pellicular ODS (Whatman) gepackt in einer rostfreien Stahlkolonne von 2 · 6,5 mm (Upchurch Scientific, Inc.) wurde als Vorkolonne verwendet. Die mobile Phase war Methanol/H&sub2;O (15 : 85). Alle Lösungsmittel wurden durch eine Teflon- PTEE/Polypropylenfiltermembran von 0,45 um filtriert, mit Helium entgast und isokratisch bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min abgegeben. Der Säulenauslauf wurde durch UV- Photodiodenanordnungsermittlung bei 324 nm (UV-Bereich = 200 bis 500 nm) überwacht. Das Spitzenbereichsverhältnis von Analyt zu innerem Standard wurde für eine Umwandlung der Detektorreaktion auf Konzentrationsschätzungen über die Konstruktion einer Kalibrierkurve verwendet.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, jene Fachleute mit einer vollständigen Offenbarung und Beschreibung auszustatten, wie die Verbindungen der Erfindung herzustellen und zu verwenden sind, und sie sollen nicht den Gedanken der Erfinder in bezug auf ihre Erfindung einschränken. Bemühungen wurden gemacht, eine Genauigkeit in bezug auf die Zahlen, z. B. Mengen, Temperatur usw.) zu gewährleisten, doch sollten einige Irrtümer und Abweichungen in Rechnung gestellt werden. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Teile Gewichtsteile, ist eine Temperatur in Grad Celsius angegeben und der Druck bei oder nahe Atmosphärendruck.
Alle Ausgangsmaterialien und Reagenzien sind im Handel erhältlich.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-(2-Hydroxy-3,3,3-trifluorpropyl)-2-(2- nitro-1H-imidazol-1-yl)-acetamid (SR 4554).
Die Synthese von SR 4554 ist in Schema 1 gezeigt. Eine Umwandlung von 2- Nitroimidazol (4) in sein Natriumsalz erfolgte durch Behandlung mit Natriummethoxid in Methanol-DMF bei 150ºC während 10 min. Anschließende Reaktion mit Methylbromacetat in DMF bei 85ºC während 20 min ergab den Methylester (5). Diese Verbindung wurde dann in die Carbonsärue (6) durch Behandlung von 5 mit 0,1 N NaOH bei 100ºC während 15 min und anschließendes Ansäuern mit 1 M HCl umgewandelt. Die durch Fluor markierte Seitenkette wurde durch Umsetzung von Trifluoracetaldehyd-Halbacetat (7) und Nitromethan in Gegenwart von Kaliumcarbonat bei 60ºC während 3 h hergestellt. Eine Nitroverbindung (8) wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Destillation bei 115ºC bei 60 mm Hg erhalten. Reduktion der Nitrogruppe von 8 erfolgte durch Hydrierung bei 40 psi mit Raney-Nickel-Katalysator, Behandlung des filtrierten Reaktionsgemisches mit HCl in Ether bei -20ºC und ergab die Aminoverbindung (9) als ihr HCl-Salz. Kopplung der Carbonsäure (6) mit dieser Aminoverbindung erfolgte, indem zunächst die Säuregruppe von 6 unter Verwendung von Isobutylchlorformiat und N- Methylmorpholin in Tetrahydrofuran (THF) bei 0ºC umgewandelt wurde. Zugabe des Amins (9) und eines weiteren Äquivalentes von N-Methylmorpholin führte zur Bildung von SR 4554, welches durch Säulenchromatographie und Umkristallisation aus Ethylacetathexanen gereinigt wurde. Schema 1

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-(2-Hydroxyethyl)-N-(2-hydroxy-3,3,3- trifluorpropyl)-2-(2-nitro-1 H-imidazol-1-yl)-acetamid (SR 4557).
Die Synthese von SR 4557 ist in Schema 2 gezeigt. Reduktion von 1-Brom-3,3,3- trifluoraceton (10) mit Lithiumaluminiumhydrid in unter Rückfluß siedendem Ether ergab den Bromalkohol (11), welcher durch Destillation bei 120 bis 122ºC gereinigt wurde. Diese Verbindung wurde unter Verwendung von NaOH bei 100ºC zu dem Epoxid (12) zurückgeführt, welches direkt aus dem Reaktionsgemisch destillierte. Reaktion des Epoxids (12) mit Ethanolammin in H&sub2;O ergab das Diol (13), welches durch Destillation bei 105 bis 115ºC und bei 0,05 mm Hg gereinigt wurde. Kupplung dieses Zwischenproduktes mit der Carbonsäure (6) wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens für SR 4554 durchgeführt. Reinigung durch Säulenchromatographie ergab SR 4557 als eine amorphen Feststoff. Schema 2

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Methyl-2-deoxy-2-[N-2-hydroxy-3,3,3- trifluorpropyl-2-(2-nitro-1 H-imidazol-1-yl)-acetamido-β-D-glucopyranosid].
Der für das D-Glucosederivat (1) verwendete Syntheseweg ist in Schema 3 gezeigt. Behandlung von D-Glucosaminhydrochlorid (14) mit Benzyloxychlorformiat in wäßrigem Natriumbicarbonat ergab (15), welches in das Methylglycosid (16) durch Rücklfußkochen in Methanol mit einem Gehalt an Salzsäure umgewandelt wurde. Die Verbindung (6) wurde dann in das Triacetoxyderivat (17) durch Behandlung mit Essigsäureanhydrid in Pyridin umgewandelt. Entfernng der Benzyloxycarbamatgruppe erfolgte unter Verwendung von H&sub2; und 10%igem Palladium-auf-Kohle in Ethanol und ergab die Aminoverbindung (18). Behandlung von (18) mit dem Trifluormethylepoxid (12) in Acetonitril bei einer Temperatur von 85ºC in einem abgedichteten Rohr führte zur Alkylierung seiner primären Aminogruppe und ergab (19). Kopplung der Aminoverbindung (19) mit 2-(2'-Nitroimidazol)-Essigsäure (6) unter Verwendung von Isobutylchlorformiat und N-Methylmorpholin in THF, wie oben beschrieben, sowie Entfernung der Acetoxy- Schutzgruppen mit katalytischem Natriummethoxid in Methanol ergab das Produkt (1) als einen kristallinen Feststoff, welcher ein Gemisch von Diastereoisomeren war, Schema 3

Beispiel 4

Stoffwechsel von SR 4554 in vitro

SR 4554 wurde durch Mauselebermikrosomen sowie gereinigte Ratten- und Menschen- Cytochrom-P450-Reduktase unter Hypoxie (100% Stickstoff) reduziert. Die Reduktion wurde durch Luft und auch in Gegenwart eines Inhibitors von Cytochrom-P450-Reduktase (TICl&sub3;·4H&sub2;O bei 0,2 mg/ml) vollständig gehemmt. Im Gegensatz dazu verursachte Kohlenmonoxid nur eine 15%ige Hemmung des Stoffwechsels in Mikrosomen. Die Kinetik des Mikrosomen- Stoffwechsels des Arzneimittels wurde durch Km und Vmax bei 650 um und 16,84 nmol min&supmin;¹ mg&supmin;¹ gekennzeichnet. Dies schließt die Einbeziehung von Cytochrom-P450-Reduktase in der Anfangsstufe der Bioaktivierung ein.
Die Eigenschaften von reduktivem Stoffwechsel von SR 4554 durch Mauselebermikrosomen (0,5 mg/ml Protein) sind in Fig. 1 dargestellt. Proben wurden zu veschiedenen Zeitpunkten entfernt, mit Silbernitrat extrahiert und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), wie oben beschrieben, analysiert. SR 4554 wurde unter epoxischen Bedingungen dem Stoffwechsel unterzogen, wie durch den ursprünglichen Arzneimittelverfust gezeigt wird. Die Reaktion wurde vollständig in Abwesenheit von Cofaktor (NADPH) und gegebenenfalls in Luft. Der Cytochrom-P450-Inhibitor - Kohlenmonoxid - hemmte den hypoxischen Stoffwechsel von SR4554 um 15%. Die Zugabe des Cytochroms P450 -Reduktaseinhibitor RICl&sub3;·4H&sub2;O (0,2 mg/ml) hemmte das reduktive Verfahren vollständig. Es wurden keine weiteren nitrohaltigen Verbindungen bezüglich des Stoffwechsels beobachtet.

Beispiel 5

Rückhaltung von SR 4554 in menschlichen Eierstock-A2780-Spheroiden unter Verwendung von Energieverlust-Elektronenspektroskopie

Etwa 100 Spheroide (0,5 bis 1 mm Durchmesser) wurden in einem Kulturmedium, das 1 mmol SR 4554 enthielt, 3 h inkubiert. Die Spheroide wurden dann mit Medium, das keine Arzneimittel enthielt, gewaschen, um ungebundenes Arzneimittel und "Herumirrendes" während weiterer 22 h bei 37ºC zu entfernen. Proben wurden in flüssigem Propanhsopentan bei -185ºC zum Schneiden bei tiefer Temperatur gefroren. Abschnitte wurden durch Energieverlust- Elektronenspektroskopie (EELS) analysiert. Bei SR 4554 wurde gefunden, daß es im Inneren mehr hypoxische Zellen nahe dem Zentrum der Spheroide in Bevorzugung der Außenzellen, d. h. an der Peripherie, ansammelte.
Fluorbilder von SR 4554 wurden unter Verwendung von EELS erhalten und als Fluor/Stickstoff (F/N)-Verhältnis, wie in Fig. 2 gezeigt, quantifiziert. Zellen nahe der Mitte des Spheroide enthalten, wie gefunden wurde, einen signifikanten siebenmal höheren Gehalt an Fluor im Vergleich mit Zellen an der Peripherie des Spheroids (p < 0,05.) enthalten. Diese Experimente wurden in Luft durchgeführt.

Beispiel 6

Pharmakokinetik von SR 4554

EMT-6-Tumor aufweisende Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Mäuse erhielten eine einzelne intraperitoneale oder intravenöse Injektion (180 mg/kg Körpergewicht) oder eine einzelne orale Dosis (p.o. 90 mg/kg) durch Lavage von SR 4554. Drei Mäuse wurden je Zeitpunkt geopfert, und Blut wurde durch Herzpunktur erhalten. Das erhaltene Blut wurde zentrifugiert, um Plasma zu ergeben. Tumore, Leber und Hirn wurden auch zu verschiedenen Zeitpunkten erhalten. Proben wurden mit Silbernitrat extrahiert und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren analysiert.
Die Absorption und der Verbrauch von SR 4554 in Mäusen erwies sich als ähnlich jenen von niedriger Misönidazol-Dosis, wobei das Arzneimittel sehr hohe orale (p. o.), i.v. und i.p. biologische Verfügbarkeit zeigt (Verhältnisse in bezug auf i.v. sind: i.v. 100%, i.p. 100,4%, p. o. 95,5%). Dies offenbart, daß das Arzneimittel wirksam auf einem dieser Wege verabreicht werden könnte. Brown et al. (1980), siehe oben; Workman et al. (1981), Cancer Chemother, Pharmacöl. 6, Sewiten 39 bis 49. Wichtigerweise waren die Gehirnkonzentrationen von SR 4554 sowie das Verhältnis von Gehirn/Plasma allgemein niedrig. In der Tat waren diese überraschenderweise niedriger als vorher bestimmt für die meisten lipophilen 2-Nitroimidazole schließlich Misonidazol und lassen sich eher mit jenem hydrophilerer Nitroimidazole, wie Etanidazol, vergleichen. Brown et al. (1980), a.a.O., Workman et al. (1981), oben. Es wurde beobachtet, daß Gehirnkonzentrationen von Nitroimidazolen durch Lipophilizität geregelt werden und die Toxizität der Verbindungen betreffen. Brown et al. (1980), a.a.O., Workman et al. (1981, oben. Diese Beobachtung legt nahe, daß Lipophilizität nicht das einzige Kriterium ist, das die Penetration solcher Verbindungen in das Gehirn lenkt und SR 4554 potentiell weniger toxisch sein wird, als dies aufgrund seiner Lipophilizität vorausgesagt werden kann.
Wie in Fig. 3 dargestellt, konnte SR 4554 in Plasma (Feststellungsgrenze = 25 ng/ml) bei dieser Dosis wenigstens bis zu 6 h nach der Injektion festgestellt werden. Gewebe- Arzneimittelgehalte waren jedoch unter der Feststellungsgrenze (100 ng/g Gewebe) nach 6 h. Die Spitzenkonzentration von SR 4554 (Cmax) erwies sich als 145 ug/ml) und trat bei (tmax) 30 min auf. Tumorarzneimittelgehalte folgten jenen von Plasma mit einem Cmax von 52 ug/g und einem tmax von 45 min. Sowohl Plasma- als auch Tumor-Pharmakokinetik paßten zu einem monoexponentiellen offenen Modell mit Bestandteilen (trapezoid)-AUC-Werten von 13,9 ug·ml&supmin;¹ min bzw. 6,3 ug·ml&supmin;¹ min. Das entsprechende Modell, das von AUC-Werten abhängt, war 15,1 und 7,7 ug·ml&supmin;¹ min. Die Eliminierungsgeschwindigkeitskonstanten a waren, wie gefunden wurde, 0,136 und 0,135 min&supmin;¹ (Halbwertszeit, t1/2 = 50,8 ± 1,6 min und 51,5 ± 4,4 min) bei Plasma bzw. Tumor.
Tabelle 1 zeigt die Urinausscheidung von SR 4554 bei nichttumorbesitzenden weiblichen Balb/c-Mäusen. Interessanterweise wurde gefunden, daß bis zu 66% der SR 4554 als unveränderte Ursprungsverbindung festgestellt wurde. Dieses Merkmal ist in der Tat repräsentativer für hydrophile als für lipophile Verbindungen. Tabelle 1 Urinausscheidung von SR 4554 bei nichtturmortragenden Balb/c-Mäusen
Diese Verhältnisse von Gewebe zu Plasma bei SR 4554 als eine Funktion der Zeit nach intraperitonealer Verabreichung sind in Fig. 4 erläutert. Das Verhältnis Leber/Plasma nahm sehr schnell ab, während die Verhältnisse Hirn/Plasma allgemein über die gesamte Beobachtungsperiode niedrig blieben. Bei 240 min waren die Verhältnisse Leber/Plasma und Hirn/Plasma etwa die gleichen. Das Tumor/Plasma-Verhältnis stieg schnell mit einer Spitze bei etwa 90 min an und nahm dann mit der Zeit langsam ab. Nach der Absorption blieb das Tumor/Plasma- Verhältnis etwa 6 bis 7 mal größer als die Leber/Plasma- und Hirn/Plasma-Verhältnisse.

Beispiel 7

Toxizität von SR 4554

Toxizitätsstudien mit SR 4554 wurden mit weiblichen Balb/c-Mäusen durchgeführt. Den Mäusen wurde SR 4554 intravenös in einer Dosis von 191 mg/kg (0,05 ml/kg) Körpergewicht oder i.p. von 383 mg/kg (0,05 ml/kg) Körpergewicht injiziert. Kontrollmäusen wurde ein äquivalentes Volumen von Lösungsmittel (Kochsalzlösung) injiziert.
Das mittlere Körpergewicht der Mäuse (als ein Prozentsatz ihres Gewichts) vom Tag 1 ist in Fig. 5A für die i.v.-injizierte Maus und in Fig. 5B für die i.p.-injizierte Maus aufgezeichnet. Es wurden keine Unterschiede in Körpergewichtsveränderungen zwischen behandelten und Kontrollmäusen beobachtet. Außerdem wurden keine Verhaltensveränderungen oder Todesfälle bei den behandelten oder den Kontrollmäusen beobachtet.

Beispiel 8

Magnetische Resonanzspektroskopie

SR 4554 wurde als eine einzelne intraperitoneale Injektion von 180 mg/kg weiblichen EMT-6-Tumor aufweisenden Balb/c-Mäusen verabreicht. In einigen Experimenten wurde Hydralazin (5 mg/ml i.v.) 1 h vor der Verabreichung von SR 4554 verabreicht. Magnetische Resonanzspektroskopie (MRS) wurde auf einem kernmagnetischen Resonanz (NMR)-Spektrometer 4,7 Tesla (SISCO) unter Verwendung einer doppelt abgestimmten (¹&sup9;F/²H)-Schaltung 45 min und 6 h nach Injektion von SR 4554 durchgeführt. Die Arzneimittelkonzentrationen wurden unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Thulborn et al. (1983), J. Magn. Reson. 55, Seiten 357 bis 371 erhalten. Speziell wurde die ¹&sup9;F-Signalintensität in Relation zu dem 2H- Signal natürlicher Häufigkeit von Gewebewasser gesetzt. Kalibrierungen schlossen die Verwendung einer Bezugsküvette ein, die 5-Fluortryptophan (5-TFP) und Essigsäure-d-(AcOH-d) enthielt. Tumore wurden unmittelbar nach MRS-Prüfung ausgeschnitten, und ursprüngliche Arzneimittelgehalte wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt, wie in Beispiel 6 beschrieben ist.
Typische Fluor- und Deuteriumspektren, die von einem RIF-1-Tumor unter Verwendung von MRS erhalten wurden, sind in Fig. 6 gezeigt. Der SR 4554 -Peak ist von jenem von 5-FTP durch 45 ppm getrennt, während der HOD-Peak von jenem von AcOH-d durch 6 ppm getrennt ist. Der SR 4554-Peak umfaßt sowohl das ursprüngliche Arzneimittel als auch verwandte nitroreduzierte Stoffwechselprodukte.
Tabelle 2 zeigt ¹&sup9;F-Signalstärken entsprechend dem ursprünglichen Arzneimittel und den dem Arzneimittel verwandten Stoffwechselprodukten (MRS) und ursprünglichen Arzneimittelgehalten (HPLC) in RIF-1-Tumoren. In Tabelle 2 ist auch MRS des Gehirninhaltes gezeigt. Es wird angenommen, daß die Rückhaltung hoher Konzentrationen von ¹&sup9;F- nach 6 h trotz der viel geringeren (20fachen) Konzentration an ursprünglichem Arzneimittel, die durch HPLC bei 7 h festgestellt wird, ein oder mehrere nitroreduzierte Stoffwechselprodukte präsentiert.
Diese Ergebnisse zeigen, daß SR 4554 schnell aus dem Gehirn entfernt wird, aber selektiv in Tumoren gehalten wird. Tabelle 2 Rückhaltung von RS 4554 in Mausegeweben
ND = nicht bestimmt
Die Beibehaltung von Arzneimittelsignal in RIF-1-Tumoren ist als eine Funktion des Tumorgewichtes in Fig. 7 aufgezeichnet. Tumor ¹&sup9;F-Signalstärken bei 6 h und 45min wurden in umol/g Tumor berechnet. Die Rückhaltung von ¹&sup9;F- bei 6 h in bezug auf 45min in den gleichen Tumoren wurde mit den entsprechenden Tumorgewichten in Gramm verglichen. In diesem Tumormodell (einem Tumor mit niedrigem hypotoxischem Anteil) stand die relative Beibehaltung (6 h/45 min) in Wechselbeziehung zu dem Tumorgewicht (Relationskoeffizient = 0,83).
Tabelle 3 gibt die Ergebnisse eines Vergleichs zweier Tumormodelle wieder. RIF-1- und EMT-6-Tumore haben einen geringen und einen hohen radiobiologischen hypoxischen Anteil. Moulder et al. (1984), siehe oben. Wie erwartet, war die Rückhaltung von SR 4554 in EMT-6- Tumoren größer als in RIF-1-Tumoren. Außerdem zeigen diese Daten auch, daß eine Vorbehandlung von Mäusen mit Hydralazin eine zweifache Steigerung der Retention ergab. Tabelle 3 Rückhaltung von SR 4554 in Mäusetumoren
¹ Daten bedeuten eine mittlere Retention von SR 4554 ± Abweichung. Die Anzahl der verwendeten Mäuse in jeder Studie ist in Klammern angegeben. Tumorgewicht: 0,5 bis 2,7 g.
Zusätzlich zu dem obigen Experiment wurden intensive in vivo-Experimente durchgeführt. Um den Oxidationsstatus verschiedener Mäuse- und Menschentumorxenografte zu prüfen, wurde die Beibehaltung von ¹&sup9;F-Signal, gemessen durch MRS, nach Verabreichung von SR 4554 bewertet. Die in Fig. 8 gezeigten Daten repräsentieren das mittlere +/--SD der Verhältnisse von ¹&sup9;F-Rückhaltung (umol/g) bei 6 h in bezug auf 45 min. RIF-1 (Fibrosarkom), EMT-6 (schuppiges Zellenkarzinom) und KHT (Adenokarzinom) sind Mäusetumore, während HT29 (Dickdarmkarzinom), BB (Dickdarmkarzinom), WIL (Lungenkarzinom ohne kleine Zellen) und HN5 (Schuppenzellenkarzinom an Kopf und Nacken) menschliche Tumorxenografte sind. Wichtigerweise erläutern die Daten den variierenden Rückhaltegrad von SR 4554 durch die verschiedenen Tumore. Außerdem WIL-Tumor war die Rückhaltung des Arzneimittels in menschlichen Tumorxenograften geringer als bei den Mäusetumoren. Allgemein gab es einen Trend, daß Tumore, die bekanntermaßen einen größeren hypoxischen Anteil haben, SR 4554 stärker zurückhielten.
Tabelle 4 zeigt den Einfluß hoher Sauerstoffgehalte (Carbogenbeatmung) auf die Rückhaltung von SR 4554 in dem C3H-Mäusebrusttumor. Tabelle 4 Wirkung von Carbogenbeatmung auf die Rückhaltung von SR 4554
Es gab eine signifikante (P < 0,01) Verminderung der Rückhaltung von SR 4554 zwischen C3H-Tumoren bei Mäusebeatmung mit Luft und Beatmung mit Carbogen. Dies ist in Übereinstimmung mit verbesserten Sauerstoffgehalten in C3H-Tumoren und bei Mäusen als Reaktion auf Carbogenbeatmung.
Tumoroxygenierungsmessungen wurden 3 h nach Verabreichung von SR 4554 unter Verwendung einer polarographischen Nadelsauerstoffelektrode durchgeführt. Tabelle 5 Sauerstoffelektrodenmessung der Rückhaltung von SR 4554 in C3H- und SCVVII-Tumoren
* Die Daten repräsentieren die mittlere Rückhaltung von SR 4554 ± Abweichung
Die Daten in Tabelle 5 legen es nahe, daß es keine signifikanten Unterschiede der Rückhaltung von SR 4554 oder der Mittelgehalte pO&sub2; zwischen diesen beiden Tumoren gibt, obwohl die Schlußfolgerung auf die relativ wenigen versuchten Mäuse beschränkt ist. Wenn die Rückhaltung von SR 4554 größer als 0,5 war, war dann das mittlere pO&sub2; geringer als 2 mm Hg, und 60% der pO&sub2;-Werte waren weniger als 5 mm Hg, was zu der Schlußfolgerung führte, daß anschließende Rückhaltung von SR 4554 mit hohen Werten von Tumorhypoxie verbunden war.
Frühere Untersuchungen mit C3H-Brusttumoren, die in den Fuß implantiert waren, legten nahe, daß der Prozentsatz der pO&sub2;-Werte geringer als 5 mm Hg größer als etwa 60% war.
Dies war gleich einem hypoxischen Anteil von 10%, gemessen durch einen klonogenen Versuch.
Die obigen Werte zeigen, daß SR 4554 als eine MRS/MRI-Sonde verwendet werden kann, um Unterschiede in der menschlichen und Mäusetumorhypoxie festzustellen.

Claims

1. Verbindung mit der Strukturformel (I)

worin

a) wenigstens eine der Gruppen R¹ und R² C16 ist, welches mit einer CF&sub3;-Gruppe und weiterhin mit ein oder zwei OH-Gruppen substituiert ist, und, wenn eines von R¹ oder R² vier oder mehr Kohlenstoffatome enthält, es mit mehr als einer OH- Gruppe substituiert ist,

und jede der restlichen Gruppen R¹ oder R² unter

(i) Wasserstoff,

(ii) einem unsubstituierten Monosaccharid,

(iii) einem Monosaccharid, das mit einer C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxygruppe, einer Acylgruppe, worin die über die Carbonylbindung gebundene Alkylgruppe C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist, einem Amin-, Halogen- oder Carbonsäurerest substituiert ist,

(iv) C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, das mit einer-CF&sub3;-Gruppe substituiert ist und weiterhin mit einer oder zwei OH-Gruppen substituiert ist, und

(v) fünf- und sechsgliedrigen heterozyklischen Ringen, die ein unter N, O und S ausgewähltes Heteroatom enthalten, ausgewählt ist, oder

b) R¹ und R² unter Bildung eines fünf- oder sechsgliedrigen heterozyklischen Ringes verbunden sind, welcher wenigstens ein unter N und O ausgewähltes Heteroatom hat, und worin weiterhin der heterozyklische Ring entweder

(i) mit einem CF&sub3;-Rest substituiert ist oder

(ii) mit einem CF&sub3;-Rest und einem weiteren Substituenten substituiert ist, welcher unter -OH, -CH&sub2;OH und -NH&sub2; ausgewählt ist, worin sich der zusätzliche Substituent an demselben Kohlenstoffatom wie das CF&sub3; befindet und, wenn eine der Gruppen R¹ und R² ein stickstoffhaltiger heterozyklischer Ring ist oder R¹ und R² zusammen einen stickstoffhaltigen heterozyklischen Ring bilden, das Stickstoffatom oder die Stickstoffatome in dem heterozyklischen Ring entweder unsubstituiert oder mit einer C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylgruppe substituiert sind.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ unter Methyl-α-D-glycopyranosid, Methyl-β- glycopyranosid, N-Glycosylaminen, N-Glycosiden, D-Gluconsäure, D-Glucosamin, D- Galactosamin und N-Acetyl-D-glucosamin ausgewählt ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ unter Glucose, Galactose, Fructose, Ribose, Mannose, Arabinose und Xylose ausgewählt ist.

4. Verbindung nach Anspruch 3, worin R¹ D-Glucose ist.

5. Verbindung mit der Sturkturformel (I)

worin

R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander unter

a) Wasserstoff und

b) C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, welches mit einer CF&sub3;-Gruppe substituiert ist und weiterhin mit einer oder zwei OH-Gruppen substituiert ist, ausgewählt sind, unter der Voraussetzung

(i) daß wenigstens eine der Gruppen R¹ und R² C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ist, welches mit einer CF&sub3;-Gruppe substituiert ist und weiterhin mit einer oder zwei OH- Gruppen substituiert ist, und

(ii) daß, wenn R¹ oder R² vier oder mehr Kohlenstoffatome enthält, es mit zwei OH-Gruppen substituiert ist.

6. Verbindung nach Anspruch 5, worin R¹ Wasserstoff und R² C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, welches mit einer CF&sub3;-Gruppe und einer oder zwei OH-Gruppen substituiert ist, ist.

7. Verbindung nach Anspruch 6, worin R² mit einer R³-Gruppe substituiert ist.

8. Verbindung nach Anspruch 6, worin R² mit zwei R³-Gruppen substituiert ist.

9. Verbindung nach Anspruch 5, worin R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander C&sub1;&submin;&sub6;- Alkyl sind, welches mit einer CF&sub3;-Gruppe und einer oder zwei OH-Gruppen substituiert ist.

10. Verbindung nach Anspruch 9, worin R¹ und R² gleich sind.

11. Verbindung nach Anspruch 9, worin R¹ und R² verschieden sind.

12. Verbindung nach Anspruch 9, worin R¹ mit einer OH-Gruppe substituiert ist.

13. Verbindung nach Anspruch 9, worin R¹ mit zwei OH-Gruppen substituiert ist.

14. Verbindung nach Anspruch 12, worin R² mit einer OH-Gruppe substituiert ist.

15. Verbindung nach Anspruch 12, worin R² mit zwei OH-Gruppen substituiert ist.

16. Verbindung nach Anspruch 13, worin R² mit einer OH-Gruppe substituiert ist.

17. Verbindung nach Anspruch 13, worin R² mit zwei OH-Gruppen substituiert ist.

18. Verbindung nach Anspruch 10, worin R¹ und R² jeweils mit einer OH-Gruppe substituiert sind.

19. Verbindung nach Anspruch 10, worin R¹ und R² jeweils mit zwei OH-Gruppen substituiert sind.

20. Verbindung nach der Strukturformel (II)

21. Verbindung mit der Strukturformel (III)

22. Verbindung mit der Strukturformel (IV)

23. Verbindung mit der Strukturformel (V)

24, Verbindung mit der Strukturformel (VI)

25. Verbindung mit der Strukturformel (VII)

26. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Ermittlung hypoxischer Tumorzellen mit einer wirksamen tumorfeststellenden Menge der Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 5, 20, 21, 22, 23, 24 und 25 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial.

27. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 5, 20, 21, 22, 23, 24 und 25 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Ermittlung hypoxischer Tumorzellen in einem Säugetier.

28. Verwendung nach Anspruch 27, bei der die Ermittlung durch magnetische Resonanzabbildung durchgeführt wird.

29. Verwendung nach Anspruch 27, bei der die Ermittlung unter Verwendung von magnetischer Resonanzspektroskopie durchgeführt wird.