DE69434839T2 - Transferrin-rezeptor-gene von haemophilus - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, welche eine konservierte Aminosäuresequenz aus einem Transferrin-Rezeptorprotein enthalten, und immunogene Zusammensetzungen und Antiseren oder Antikörper, die davon abgeleitet sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Eingekapselte Haemophilus influenzae Typ b-Stämme sind die Hauptursache für bakterielle Meningitis und andere invasive Krankheiten bei jungen Kindern. Allerdings sind die nicht-eingekapselten oder nicht-typisierbaren H. influenzae (NTHi) verantwortlich für eine weite Auswahl von Krankheiten beim Menschen, einschließlich Otitis media bzw. Mittelohrentzündung, Epiglottitis, Lungenentzündung und Tracheobronchitis. Impfstoffe, welche auf dem kapsulären Polysaccharid von H. influenzae Typ b, konjugiert an Diphtherie-Toxoid (Berkowitz et al., 1987. Überall in dieser Anmeldung wird auf verschiedene Bezugsteilen in Klammern Bezug genommen, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, welcher diese Erfindung angehört. Die volle bibliographische Information für jedes Zitat findet sich am Ende der Beschreibung, unmittelbar vorausgehend zu den Ansprüchen), Tetanus-Toxoid (Classon et al., 1989, und U.S.-Patent 4 496 538) oder äußeres Membranprotein von Neisseria meningitidis (Black et al., 1991) basieren, sind wirksam zur Verringerung von durch H. influenzae Typ b-induzierter Meningitis, aber nicht von NTHi-induzierter Krankheit, gewesen (Bluestone, 1992).
  • Otitis media ist die häufigste Erkrankung in der frühen Kindheit, wobei ungefähr 60-70% aller Kinder im Alter unter 2 Jahren zwischen einer und drei Ohrinfektionen erleiden. Chronische Otitis media ist für Beeinträchtigung des Hörens, Sprechens und der Wahrnehmung bei Kindern verantwotlich. Infektionen mit H. influenzae sind für ungefähr 30% der Fälle von akuter Otitis media und etwa 60% der chronischen Otitis media verantwotlich. Allein in den Vereinigten Staaten kostet die Behandlung von Otitis media zwischen 1 und 2 Milliarden Dollar pro Jahr für Antibiotika und chirurgische Eingriffe, wie Tonsillektomien, Adenoidektomien und Insertion von Tympanostomie-Schläuchen. Weiterhin werden viele der auslösenden Organismen von Otitis media resistent gegen eine Antibiotikabehandlung. Ein effektiver prophylaktischer Impfstoff gegen Otitis media ist deshalb wünschenswert. Nicht-typisierbare Stämme von H. influenzae sind ebenfalls wichtige Pathogene, welche für Lungenentzündung bei älteren Personen und anderen Individuen, welche besonders anfällig für Atemwegsinfektionen sind, verantwortlich sind. Es besteht daher ein Bedarf nach Antigenen aus H. influenzae, welche nützlich als Komponenten in immunogenen Präparationen sind, die Schutz gegen die vielen Serotypen von H. influenzae bereitstellen.
  • Eisen ist ein essenzieller Nährstoff für das Wachstum vieler Bakterien. Mehrere Humanpathogene, wie H. influenzae, Branhamella catarrhalis, N. meningitidis, N. gonorrhoeae und nicht-pathogene kommensalistische Neisseria-Stämme, können humanes Transferrin als eine Eisenquelle nutzen (Schryvers, 1988; Schryvers und Lee, 1989; Mickelsen und Sparling, 1981). Der bakterielle Transferrin-Rezeptor (TfR) ist aus zwei Ketten, Tbp1 und Tbp2, aufgebaut. In Stämmen von H. influenzae beläuft sich das Molekulargewicht von Tbp1 auf ungefähr 100 000, wohingegen das Molekulargewicht von Tbp2 im Bereich von 60 000 bis 90 000, abhängig vom Stamm, variabel ist (Schryvers und Gray-Owen, 1992; Holland et al. 1992). Es wird angenommen, dass die Expression von H. influenzae-Transferrin-Rezeptor Eisen- und/oder Heminreguliert ist (Morton et al., 1993), und eine vermeintliche fur-Bindungsstelle (Braun und Hantke, 1991) ist stromaufwärts von tbp2 identifiziert worden. Diese Sequenz wird in der Promotorregion von Genen gefunden, welche von Eisen negativ reguliert werden, einschließlich N. meningitidis-TfR (Legrain et al., 1993). Dem Promotor folgen die Gene tbp2 und tbp1, eine Anordnung, welche in anderen bakteriellen TfR-Operons gefunden wird (Legrain et al., 1993; Wilton et al., 1993). Antikörper, welche den Zugang des Transferrin-Rezeptors zu seiner Eisenquelle blockieren, können bakterielles Wachstum verhindern. Darüber hinaus können Antikörper gegen TfR, welche opsonisierend oder bakterizid sind, ebenfalls Schutz durch alternative Mechanismen bereitstellen. Somit sind der Transferrin-Rezeptor, Fragmente davon, seine Bestandteilketten oder daraus abgeleitete Peptide Impfstoffkandidaten, um gegen H. influenzae-Erkrankung zu schützen. Mit N. meningitidis-TfR-Proteinen in Freund'schem Adjuvans immunisierte Mäuse wurden vor einer homologen Herausforderung geschützt, und die Anti-TfR-Antiseren waren bakterizid und schutzgebend in einem passiven Transfer-Assay (Danve et al., 1993). Schweine, welche mit rekombinantem A. pleuropneumoniae-Tbp2 immunisiert wurden, wurden gegen homologe Herausforderung, aber nicht heterologe Herausforderung geschützt (Rossi-Campos et al., 1992). Diese Daten zeigen die Wirksamkeit von TfR-basierenden Impfstoffen beim Schutz vor Krankheit. Es wäre wünschenswert, die Sequenz des DNA-Moleküls, welches den Transferrin-Rezeptor codiert, und Peptide, entsprechend Bereichen des Transferrin-Rezeptors, sowie Vektoren, enthaltend derartige Sequenzen, zur Diagnose, Immunisierung und zur Erzeugung von diagnostischen und immunologischen Reagenzien bereitzustellen.
  • Poliovirus ist ein Enterovirus, eine Gattung der Familie Picornaviridae. Es gibt drei unterschiedliche Serotypen des Virus, und mehrere Stämme innerhalb jedes Serotyps. Virulente Stämme sind auslösende Agenzien von paralytischer Poliomyelitis. Attenuierte Stämme, welche ein verringertes Potenzial zur Verursachung von paralytischer Erkrankung aufweisen, und inaktivierte virulente Stämme werden als Impfstoffe verwendet. Eine Infektion mit dem Virus induziert eine langanhaltende, schutzgebende mucosale Immunität. Eine Inokulation mit inaktivierten Polyvirus-Impfstoffen kann ebenfalls eine mucosale Immunantwort induzieren.
  • Die Struktur von Poliovirus ist bekannt und ist unter Stämmen und Serotypen stark konserviert. Die Strukturen von mehreren anderen Picornaviren (Viren, welche Gattungen der Familie Picornaviridae angehören), sind ebenfalls ermittelt worden, und von ihnen wurde gezeigt, mit der Struktur von Poliovirus nah verwandt zu sein. Es ist möglich, Fremdepitope auf dem Capsid oder Polioviren zu exprimieren (Murdin et al., 1992), und diese Arbeit ist auf andere Picornaviren ausgedehnt worden. Epitope, welche exprimiert worden sind, sind üblicherweise kurze, gut definierte, fortlaufende Epitope, und die meisten sind innerhalb der Poliovirus-"Neutralisations-Antigenischen"-Stelle I (NAgI) oder der äquivalenten Stelle auf anderen Picornaviren exprimiert worden. Diese Stelle schließt die Schleife ein, welche die beta-Stränge B und C (die BC-Schleife) von Poliovirus-Capsid-Protein VP1 verknüpft. Die BC-Schleife von VP1 ist eine an der Oberfläche exponierte Schleife von neun Aminosäuren, welche ersetzt und mit mindestens fünfundzwanzig heterologen Aminosäuren erweitert werden kann (Murdin et al., 1991). Hybride oder chimäre Polioviren, welche Transferrin-Rezeptor-Epitope exprimieren, welche zu einem hohen Titer wachsen und immunogen sind, wären nützlich als Impfstoffe und als Werkstoffe für die Erzeugung von immunologischen Reagenzien.
  • Gray-Owen, S. D., et al. (1993), Microbial Pathogenesis, Band 14, Seiten 389-398, offenbart monoklonale Antikörper, welche für humanes Transferrin spezifisch sind.
  • Stevenson, P., et al. (1992) Infection & Immunity, Band 60, Nr. 6, Seiten 2391-2396, offenbart ein Antiserum gegen TBP-2, gereinigt aus einem Stamm von N. meningitidis, welcher mit allen untersuchten meningococcalen Isolaten und mit TBP-2 aus mehreren Stämmen von H. influenzae, Typ b, kreuzreagiert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung sieht Peptide mit nicht weniger als sieben Aminosäuren und nicht mehr als 150 Aminosäuren und enthaltend eine Aminosäuresequenz, welche unter Bakterien, welche ein Transferrin-Rezeptorprotein, umfassend TBP-2, produzieren, konserviert ist, vor, wobei die konservierte TBP-2-Sequenz folgende ist:
    LEGGFYG (SEQ. ID. Nr. 85),
    und enthaltend eine Aminosäuresequenz, welche wie folgt ist:
    LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr. 74).
  • Das Peptid kann eine Aminosäuresequenz einschließen, die aus der SEQ. ID. Nr. 95 und der SEQ. ID. Nr. 74 gewählt ist.
  • Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung wird eine immunogene Zusammensetzung vorgesehen, welche ein solches Peptid als eine aktive Komponente umfasst. Die Zusammensetzung kann mindestens ein synthetisches Peptid, wie hierin bereitgestellt, umfassen, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür. Die mindestens eine aktive Komponente erzeugt eine Immunantwort bei Verabreichen an einen Wirt.
  • Die hierin vorgesehenen immunogenen Zusammensetzungen können als ein Impfstoff zur in vivo-Verabreichung zum Schutz gegen Krankheiten formuliert werden, welche von bakteriellen Pathogenen verursacht werden, die Transferrin-Rezeptoren erzeugen. Für einen solchen Zweck können die Zusammensetzungen als eine Mikroteilchen-, Kapsel- oder Liposomen-Präparation formuliert werden. Alternativ dazu können die Zusammensetzungen in Kombination mit einem Targeting- bzw. Zielrichtungs-Molekül zur Zuführung an spezifische Zellen des Immunsystems oder zu Schleimhautoberflächen bereitgestellt werden. Die immunogene Zusammensetzung kann eine Vielzahl von aktiven Komponenten umfassen, um Schutz gegen eine Krankheit bereitzustellen, welche durch eine Vielzahl von Spezies von Transferrinrezeptor-herstellenden Bakterien verursacht wird. Die immunogenen Zusammensetzungen können ferner ein Adjuvans umfassen.
  • Die Zusammensetzungen können in einem Verfahren zum Induzieren von Schutz gegen Infektion oder Krankheit, welche durch Haemophilus oder andere Bakterien verursacht wird, die Transferrinrezeptor-Protein herstellen, verwendet werden, umfassend den Schritt des Verabreichens einer wirksamen Menge der immunogenen Zusammensetzung, wie oben angegeben, an einen empfindlichen Wirt, wie einen Menschen.
  • Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung wird ein Antiserum oder Antikörper, spezifisch für mindestens eine der Aminosäuresequenzen SEQ. ID. Nr. 85, SEQ. ID. Nr. 74 oder SEQ. ID. Nr. 50, bereitgestellt.
  • Es kann ein lebender Vektor zum Zuführen von Transferrin-Rezeptor an einen Wirt vorgesehen werden, umfassend einen Vektor, der das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, enthält. Der Vektor kann ausgewählt werden unter Salmonella, BCG, Adenovirus, Pockenvirus, Vaccinia und Poliovirus. Der Vektor kann spezifisch Poliovirus sein, und das Nukleinsäuremolekül kann ein Fragment des Transferrin-Rezeptors codieren, welches eine Aminosäuresequenz von LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr. 74) oder LEGGFYG (SEQ. ID. Nr. 85) aufweist. Wir beschreiben hierin die Vektoren pT7TBP2A, pT7TBP2B, pT7TBP2C und PT7TBP2D (ATCC-Bezeichnungen Nr. 75931, 75932, 75933, 75934).
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die vorliegende Erfindung wird ferner aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen verstanden werden, worin:
  • Die 1A die Restriktionskarte von zwei Plasmidklonen (pBHT1 und pBHT2) des Transferrin-Rezeptor-Operons von Haemophilus influenzae-Typ b-Stamm DL63 zeigt.
  • Die 1B zeigt die Restriktionskarte der Klone S-4368-3-3 und JP-901-5-3, welche TfR-Gene aus dem H. influenzae-Typ b-Stamm Eagan enthalten.
  • Die 1C zeigt die Restriktionskarte der Klone DS-712-1-3, enthaltend das Transferrin-Rezeptor-Gen aus H. influenzae-Typ b-Stamm MinnA.
  • Die 1D zeigt die Restriktionskarte des Klons JB-1042-7-6, welcher das Transferrin-Rezeptor-Gen aus dem nicht-typisierbaren H. influenzae-Stamm PAK 12085 enthält.
  • Die 2 veranschaulicht die Organisation und Restriktionskarten der klonierten Tbp1- und Tbp2-Gene von identifizierten Stämmen sowie die genetische Organisation des TfR-Operons mit zwei Genen (tbp1 und tbp2) in Tandemanordnung, welche ein Operon unter der transkriptionellen Regulation eines einzelnen Promotors bilden, und zeigt ebenfalls das 3,0 kb große DNA-Fragment von pBHIT2, welches verwendet wurde, um Bibliotheken hinsichtlich TfR-Genen aus den Haemophilus-Stämmen zu sondieren.
  • 3 zeigt die Nukleotidsequenzen der Transferrin-Rezeptor-Gene (SEQ. ID. Nr.: 1) und ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. Nr.: 5 - Tbp1 und SEQ. ID. Nr.: 6 - Tbp2) aus H. influenzae Typ b, Stamm DL63. Die unterstrichenen Aminosäuresequenzen entsprechen Peptiden von Tbp1, welche durch Aminosäuresequenzierung identifiziert wurden. Die vermeintlichen Signalsequenzen sind durch Doppelüberstreichung angegeben und entsprechen den Resten 1 bis 17 für Tbp1 und 1 bis 25 für Tbp2.
  • Die 4 zeigt die Nukleotidsequenzen der Transferrin-Rezeptor-Gene (SEQ. ID. Nr.: 2) und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. Nr.: 7 - Tbp1, und SEQ. ID. Nr.: 8 - Tbp2) aus dem H. influenzae Typ b-Stamm Eagan. Vermutete Sequenzen für die -35, -10 und Ribosomenbindungs-Stelle sind überstrichen.
  • Die 5 zeigt die Nukleotidsequenzen der Transferrin-Rezeptor-Gene (SEQ. ID. Nr.: 3) und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. Nr.: 9 - Tbp1, und SEQ. ID. Nr.: 10 - Tbp2) aus dem H. influenzae-Typ b-Stamm MinnA. Vermutete Sequenzen für die -35, -10 und Ribosomenbindungs-Stelle sind überstrichen.
  • Die 6 zeigt die Nukleotidsequenzen der Transferrin-Rezeptor-Gene (SEQ. ID. Nr.: 4) und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. Nr.: 11 - Tbp1, und SEQ. ID. Nr.: 12 - Tbp2) aus dem nicht-typisierbaren H. influenzae-Stamm PAK 12085. Die vermuteten -35-, -10- und Ribosomenbindungs-Stellen-Sequenzen sind überstrichen.
  • Die 7 zeigt die Nukleotidsequenzen der Transferrin-Rezeptor-Gene (SEQ. ID. Nr.: 105) und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. Nr.: 106 - Tbp1, und SEQ. ID. Nr.: 107 - Tbp2) aus dem nicht-typisierbaren H. influenzae-Stamm SB33.
  • Die 8 zeigt die Nukleotidsequenz des Tbp2-Gens (SEQ. ID. Nr.: 108) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. ID. Nr.: 109 - Tbp2) aus dem nicht-typisierbaren Stamm H. influenzae-Stamm SB12.
  • Die 9 zeigt die Nukleotidsequenz des Tbp2-Gens (SEQ. ID. Nr.: 110) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. ID. Nr.: 111 - Tbp2) aus dem nicht-typisierbaren Stamm H. influenzae-Stamm SB29.
  • Die 10 zeigt die Nukleotidsequenz des Tbp2-Gens (SEQ. ID. Nr.: 112) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. ID. Nr.: 113 - Tbp2) aus dem nicht-typisierbaren Stamm H. influenzae-Stamm SB30.
  • Die 11 zeigt die Nukleotidsequenz des Tbp2-Gens (SEQ. ID. Nr.: 114) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. ID. Nr.: 115 - Tbp2) aus nicht-typisierbaren Stamm H. influenzae-Stamm SB32.
  • Die 12A zeigt die Nukleotidsequenzen der Promotorregionen und des 5'-Endes der tbp2-Gene aus den H. influenzae-Stämmen Eagan (SEQ. ID. Nr.: 116), MinnA (SEQ. ID. Nr.: 117), PAK 12085 (SEQ. ID. Nr.: 118) und SB33 (SEQ. ID. Nr.: 119). Der Codier-Strang-Primer, der zum Amplifizieren von tbp2-Genen mittels PCR verwendet wurde, ist unterstrichen (SEQ. ID. Nr.: 120).
  • Die 12B zeigt die Nukleotidsequenz der intergenischen Region und des 5'-Endes der tbp1-Gene aus den H. influenzae-Stämmen Eagan (SEQ. ID. Nr.: 121), MinnA (SEQ. ID. Nr.: 122), DL63 (SEQ. ID. Nr.: 123), PAK 12085 (SEQ. ID. Nr.: 124), SB12 (SEQ. ID. Nr.: 125), SB29 (SEQ. ID. Nr.: 126), SB30 (SEQ. ID. Nr.: 127) und SB32 (SEQ. ID. Nr.: 128). Der Nicht-Codier-Strang-Primer, der zum Amplifizieren der tbp2-Gene mittels PCR verwendet wurde, ist unterstrichen (SEQ. ID. Nr.: 129).
  • Die 13 zeigt die Agarosegel-Analyse von PCR-amplifizierten tbp2-Genen aus den nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämmen SB12, SB29, SB30, SB32 und SB33. Spur 1 ist SB33, Spur 2 ist SB12, Spur 3 ist SB29, Spur 4 ist SB30, Spur 5 ist SB32.
  • Die 14 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von Tbp1 aus den H. influenzae-Stämmen Eagan, DL63, PAK 12085 und SB33 (SEQ. ID. Nr.: 7, 5, 11 und 106), den N. meningitidis-Stämmen B16B6 und M982 (SEQ. ID. Nr.: 94 und 95) und dem N. gonorrhoeae-Stamm FA19 (SEQ. ID. Nr.: 96).
  • Die 15 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz von Tbp2 aus den H. influenzae-Stämmen Eagan, DL63, PAK 12085, SB12, SB29, SB30 und SB32 (SEQ. ID. Nr.: 8, 6, 12, 109, 110, 112, 114), den N. meningitidis-Stämmen B16B6 und M982 ((SEQ. ID. Nr.: 97 und 98), dem N. gonorrhoeae-Stamm FA19 und den Actinobacillus pleuropneumoniae-Stämmen AP205 und AP37 (SEQ. ID. Nr.: 99 und 100).
  • Die 16A zeigt die vorhergesagte Sekundärstruktur von H. influenzae-Tbp1-Protein, und die 16B zeigt die vorhergesagte Sekundärstruktur von H. influenzae-Tbp2-Protein.
  • Die 17 zeigt das Konstruktionsschema des Plasmids JB-1468-29, welches H. influenzae-Typ b-Eagan-Tbp1 aus E. coli exprimiert.
  • Die 18 zeigt das Konstruktionsschema des Plasmids JB-1424-2-8, welches H. influenzae-Typ b-Eagan-Tbp2 aus E. coli exprimiert.
  • 19 zeigt die Oligonukleotidpaare (SEQ. ID. Nr.: 130, 131), die zum Konstruieren des Plasmids JB-1424-2-8 verwendet wurden.
  • 20 zeigt die Sequenz der Oligonukleotidpaare A (SEQ. ID. Nr.: 86, 87), B (SEQ. ID. Nr.: 88, 89), C (SEQ. ID. Nr.: 90, 91) und D (SEQ. ID. Nr.: 92, 93) zum Konstruieren von Tbp1- und Tbp2-Expressionsplasmiden.
  • Die 21 zeigt das Konstruktionsschema von Plasmid JB-1600-1, welches H. influenzae-Stamm SB12-Tbp2 aus E. coli eprimiert.
  • Die 22 zeigt SDS-PAGE-Gele von Produkten aus der Expression von Haemophilus-Typ b-Eagan-Tbp1-Protein, Eagan-Tbp2-Protein und nicht-typisierbarem H. influenzae SB12-Tbp2-Protein aus E. coli. Spur 1, JB-1476-2-1 (T7/Eagan Tbp1) bei t0; Spur 2, JB-1476-2-1 bei t = 4 h Induktion; Spur 3, Molekulargewichtsmarker von 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa und 31 kDa; Spur 4, JB-1437-4-1 (T7/Eagan Tbp2) bei t0; Spur 5, JB-1437-4-1 bei t = 4 h Induktion; Spur 6 JB-1607-1-1 (T7/SB12 Tbp2) bei t0; Spur 7, JB-1607-1-1 bei t = 4 h Induktion.
  • Die 23 zeigt ein Reinigungsschema für rekombinantes Tbp1 und Tbp2, welche von E. coli exprimiert werden.
  • Die 24 zeigt eine Analyse der Reinheit von rekombinantem Tbp1 und Tbp2, die durch das Schema von 23 gereinigt werden. Spur 1 enthält Molekulargewichts-Größenmarker (106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 und 18,5 kDa). Spur 2 ist E. coli-Ganzzelllysat. Spur 3 beinhaltet solubilisierte Einschlusskörper. Spur 4 ist gereinigtes Tbp1 oder Tbp2.
  • Die 25 zeigt die Immunogenität von rTbp1 (obere Tafel) und rTbp2 (untere Tafel) in Mäusen.
  • Die 26 zeigt die Reaktivität von Anti-Eagan-rTbp1-Antiseren mit verschiedenen H. influenzae-Stämmen auf einem Western-Blot. Spur 1, BL31/DE3; Spur 2, SB12 - EDDA; Spur 3, SB12 + EDDA; Spur 4, SB29 - EDDA; Spur 5, SB29 + EDDA; Spur 6, SB33 - EDDA; Spur 7, SB33 + EDDA; Spur 8, Eagan - EDDA; Spur 9, Eagan + EDDA; Spur 10, B. catarrhalis 4223 - EDDA; Spur 11, B. catarrhalis 4223 + EDDA; Spur 12, N. meningitidis 608 - EDDA; Spur 13, N. meningitidis 608 + EDDA; Spur 14, induziertes JB-1476-2-1, welches rekombinantes Eagan-Tbp1 exprimiert; Spur 15, Molekulargewichtsmarker. Spezifische ~95 kDa große Banden reagierten mit den Anti-Tbp1-Antiseren in den Spuren 3, 4, 5, 7, 8 und 9, entsprechend den H. influenzae-Stämmen SB12, SB29, SB33 und Eagan; ~110 kDa große Banden in den Spuren 10 und 11, entsprechend dem B. catarrhalis-Stamm 4223; und ~80 kDa große Banden in den Spuren 12 und 13, entsprechend N. meningitidis 608.
  • Die 27 zeigt die Reaktivität von Anti-Eagan-rTbp2-Antiseren mit verschiedenen H. influenzae-Stämmen auf einem Western-Blot. Spur 1, Molekulargewichtsmarker; Spur 2, induziertes JB-1437-4-1, welches rekombinantes Eagan-Tbp2 exprimiert, Spur 3, SB12 - EDDA; Spur 4, SB12 + EDDA; Spur 5, SB29 - EDDA; Spur 6, SB29 + EDDA; Spur 7, SB30 - EDDA; Spur 8, SB30 + EDDA; Spur 9, SB32 - EDDA; Spur 10, SB33 - EDDA; Spur 11, SB33 + EDDA; Spur 12, PAK - EDDA; Spur 13, PAK + EDDA; Spur 14, Eagan - EDDA; Spur 15, Eagan + EDDA. Spezifische Banden von 60-70 kDa waren reaktiv mit den Anti-Tbp2-Antiseren in den Spuren 3, 6, 7, 8, 13, 14 und 15, d. h. den Stämmen SB12, SB29, SB30, PAK und Eagan.
  • Die 28 zeigt die Konstruktion der Plasmide pUHIT1KFH und pUHIT1KFP, welche verwendet wurden, um Stämme von H. influenzae zu erzeugen, welche nicht Transferrin-Rezeptor herstellen.
  • Die 29 zeigt die Konstruktion von Plasmiden, welche chimäre Polioviren codieren, die ein Epitop exprimieren, abgeleitet aus Transferrin-Rezeptor-Protein, welches unter Bakterien, die Transferrin-Rezeptor-Protein herstellen, konserviert ist.
  • Die 30 ist ein Western-Blot, welcher die Reaktivität von Antiseren zeigt, hergestellt durch Immunisieren von Kaninchen mit Poliovirus-Chimären, welche ein Epitop exprimieren, abgeleitet aus Transferrin-Rezeptor-Protein, welches unter Bakterien, die Transferrin-Rezeptor-Protein herstellen, konserviert ist. Tafel A zeigt ein mit Coomassie-Brilliant Blue gefärbtes Gel, welches gereinigtes rekombinantes Tbp2 aus dem H. influenzae-Stamm SB12, exprimiert in E. coli (Spur 1), gereinigtes Tbp2 aus Branhamella catarrhalis-Stamm 4223 (Spur 2), ein Ganzzelllysat von eisenlimitiertem B. catarrhalis-Stamm 4223 (Spur 3), ein Ganzzelllysat von E. coli JM109, gezüchtet unter nicht-eisenlimitierten Bedingungen (Spur 5), zeigt. Die Tafel B zeigt Ergebnisse eines Western-Blots eines Wiederholungsansatz-Gels unter Verwendung eines Pools der Seren, welche am Tag 27 aus Kaninchen abgesammelt wurden, die mit PV1TBP2A immunisiert worden waren (Kaninchen 40, 41 und 42). Tafel C zeigt die Ergebnisse für einen Pool von Vorab-Blutproben-Seren aus denselben, welcher eine minimale spezifische Reaktivität aufzeigte.
  • In einigen der obenstehenden Figuren sind die folgenden Abkürzungen verwendet worden, um jeweilige stellenspezifische Restriktionsendonukleasen zu bezeichnen: R, EcoRI; Ps, PstI; H, HindIII; Bg, BglII; Nde, NdeI; Ear, EarI; und Sau, Sau3AI.
  • In der 28 sind die folgenden Abkürzungen verwendet worden, um jeweilige stellenspezifische Restriktionsendonukleasen zu bezeichnen: A, AccI; B BamHI; E, EcoRI; O, XhoI; H, HindIII; Ps, PstI; V, EcoRV; X, XbaI; G, BglII; S, SalI; K, KpnI; und S*, SacI.
  • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Jedweder Haemophilus-Stamm kann in zweckdienlicher Weise verwendet werden, um die gereinigte und isolierte Nukleinsäure bereitzustellen, welche in der Form von DNA-Molekülen vorliegen kann, umfassend mindestens einen Bereich der Nukleinsäure, welche für einen Transferrin-Rezeptor codiert, wie durch Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beispielhaft angegeben. Solche Stämme sind im Allgemeinen aus klinischen Quellen und aus Bakterienkultursammlungen, wie der American Type Culture Collection, erhältlich.
  • Gemäß eines Aspekts der Erfindung kann das Transferrin-Rezeptor-Protein aus Haemophilus-Stämmen durch die Verfahren isoliert werden, welche von Schryvers (1989), Ogunnaviwo und Schryvers (1992) und dem U.S.-Patent 5 141 743 beschrieben werden. Obwohl die Einzelheiten eines passenden Verfahrens im Patent U.S. 5 141 743 angegeben werden, ist eine kurze Zusammenfassung des Verfahrens wie folgend. Die Isolierung von Transferrin-Rezeptor wird durch Isolieren einer Membranfraktion aus einem Bakterienstamm, der Transferrin-Bindungsaktivität exprimiert, und Reinigen des Transferrin-Rezeptors durch ein Affinitätsverfahren unter Beteiligung der aufeinanderfolgenden Schritte des Vor-Bindens von Transferrin an den Transferrin-Rezeptor in der Membranfraktion, Solubilisierens der Membran, Immobilisierens des Transfer rins und Trennens des Transferrin-Rezeptors von dem immobilisierten Transferrin erzielt. Alternativ dazu können die Rezeptor-Proteine durch eine Modifikation des oben genannten Verfahrens isoliert werden, in welcher der Vor-Bindungsschritt vermieden wird und eine hohe Konzentration an Salz in den Solubilisierungspuffer eingeschlossen wird, um eine direkte Isolierung mit immobilisierten Transferrin zu gestatten, wie beschrieben in Ogunnariwo und Schryvers (1992).
  • In dieser Anmeldung wird der Begriff "Transferrin-Rezeptor" verwendet, um eine Familie von Tbp1- und/oder Tbp2-Proteinen zu definieren, welche diejenigen einschließt, welche Variationen in ihren Aminosäuresequenzen aufweisen, einschließlich denjenigen, die natürlich in verschiedenen Stämmen von zum Beispiel Haemophilus vorkommen. Andere bakterielle Quellen für Transferrin-Rezeptor schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Spezies von Neisseria, Branhamella, Pasteurella und Actinobacillus ein. Manche, wenn nicht alle, dieser Bakterien enthalten sowohl Tbp1 als auch Tbp2. Die gereinigten und isolierten DNA-Moleküle, umfassend wenigstens einen Abschnitt, codierend für Transferrin-Rezeptor der vorliegenden Erfindung, schließen ebenfalls diejenigen ein, welche funktionelle Analoge von Transferrin-Rezeptor codieren. In dieser Anmeldung ist ein erstes Protein oder Peptid ein "funktionelles Analog" eines zweiten Proteins, wenn das erste Protein immunologisch verwandt ist zu und/oder dieselbe Funktion aufweist wie das zweite Protein oder Peptid. Das funktionelle Analog kann beispielsweise ein Fragment des Proteins oder eine Substitutions-, Additions- oder Deletions-Mutante davon sein.
  • In einer besonderen Ausführungsform wurde der Transferrin-Rezeptor aus H. influenzae-Typ b-Stamm DL63 isoliert und durch Affinitätschromatographie-Verfahren gereinigt, wie beschrieben von Schryvers (1989), Ogunnariwo und Schryvers (1992) und im U.S.-Patent 5 141 743. Der isolierte und gereinigte Transferrin-Rezeptor wurde verwendet, um Anti-TfR-Antiseren in Kaninchen zu erzeugen. Chromosomale DNA aus H. influenzae-Typ b-Stamm DL63 wurde mechanisch geschert, EcoRI-Linker wurden angefügt, und eine λZAP-Expressionsbibliothek wurde konstruiert. Die Bibliothek wurde mit den Anti-TfR-Kaninchen-Antiseren gescreent, und zwei positive Klone (pBHIT1 und pBHIT2) wurden erhalten, welche überlappende Restriktionskarten aufwiesen (1A und 2). Die Klone wurden sequenziert, und zwei große offene Leserahmen wurden identifiziert (2). Die Nukleotidsequenzen der Transferrin-Rezeptor-Gene Tbp1 und Tbp2 (SEQ. ID. Nr.: 1) aus H. influenzae DL63 und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. Nr.: 5 - Tbp1, und SEQ. ID. Nr.: 6 - Tbp2) sind in der 3 gezeigt. Die Sequenzanalyse zeigte, dass das TfR-Operon aus zwei Genen (Tbp1 und Tbp2) besteht, welche tandemartig angeordnet sind und von einem einzelnen Promotor transkribiert werden (wie insbesondere gezeigt in 2 und 3). Das Tbp2-Protein neigt hinsichtlich des Molekulargewichts dazu, abhängig von der Spezies zu schwanken, wohingegen das Tbp1-Protein dazu neigt, ein konsistenteres Molekulargewicht mit einer gewissen Variabilität über die verschiedenen, TfR-Gene aufweisenden Bakterien hinweg zu besitzen. Das Molekulargewicht von Tbp1 liegt üblicherweise im Bereich von 94- bis 106 000, wohingegen das Molekulargewicht von Tbp2 beträchtlich von 58- bis 98 000 variiert.
  • Die Aminosäuresequenzierung der N-Termini und Cyanogenbromid-Fragmente von Transferrin-Rezeptor aus H. influenzae DL63 wurden ausgeführt. Der N-Terminus von Tbp2 war blockiert, aber Aminosäuresequenzen wurden durch Sequenzierung von Tbp1 identifiziert und sind durch Unterstreichung innerhalb der Proteinsequenz von 3 angegeben. Diese Peptidsequenzen sind Glu Thr Gln Ser Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Ile Ser Ser Glu Val Asp Thr (wie gezeigt in 3, SEQ. ID. Nr.: 101) und Leu Gln Leu Asn Leu Glu Lys Lys Ile Gln Gln Asn Trp Leu Thr His Gln Ile Ala Phe (wie gezeigt in 3; SEQ. ID. Nr.: 102). Die Signalsequenz von Tbp1 und die vermutete Signalsequenz von Tbp2 sind durch Doppel-Überstreichung in 3 angegeben. Die vermutete Signalsequenz für Tbp1 ist Met Thr Lys Lys Pro Tyr Phe Arg Leu Ser Ile Ile Ser Cys Leu Leu Ile Ser Cys Tyr Val Lys Ala (SEQ. ID. Nr.: 103). Die vermutete Signalsequenz für Tbp2 ist Met Lys Ser Val Pro Leu Ile Ser Gly Gly Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ala (SEQ. ID. Nr.: 104). Die abgeleitete Aminosäuresequenz der N-terminalen Region von Tbp2 weist darauf hin, dass es sich um ein Lipoprotein handelt.
  • Chromosomale DNA aus dem H. influenzae-Typ b-Stamm Eagan wurde hergestellt, und Bibliotheken wurden erzeugt. Die erste Bibliothek wurde aus DNA konstruiert, welche mit Sau3AI partiell verdaut, hinsichtlich ~ 5-10 kb großen Fragmenten größenfraktioniert und in ein pUC-basierendes Plasmid kloniert war. Die zweite Bibliothek wurde aus mit EcoRI restriktionsverdauten chromosomalen DNA-Fragmenten konstruiert, welche in λZAP kloniert wurden. Beide Bibliotheken wurden mit einem 5'-Fragment des pBHIT-Klons sondiert, wie gezeigt in 2, und partielle Klone der TfR-Gene von H. influenzae-Eagan, welche als S-4368-3-3 und JB-901-5-3 bezeichnet wurden, wurden erhalten. Unter Bezugnahme auf die 1B und 2 werden somit, gemäß weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung, die Plasmidklone S-4368-3-3 und JB-901-5-3 veranschaulicht, welche Tbp1 und Tbp2 aus dem H. influenzae-Typ b-Stamm Eagan codieren. Die DNA-Sequenzen der Tbp1- und Tbp2-Gene (SEQ. ID. Nr.: 2) aus dem H. influenzae-Typb-Stamm Eagan und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. Nr.: 7 und 8) werden in der 4 gezeigt, wobei die Tbp2-Sequenz das erste Gen in dem Operon ist. In 4 sind die vermeintlichen -35-, -10- und Ribosomenbindungsstellen-Sequenzen überstrichen.
  • Chromosomale DNA aus dem H. influenzae-Typ b-Stamm MinnA wurde hergestellt, und die DNA wurde mit Sau3AI partiell verdaut, hinsichtlich 10-20 kb großen Fragmenten größenfraktioniert und in die BamHI-Stelle von EMBL3 kloniert. Die Bibliothek wurde mit dem 5'-Fragment des pBHIT-Klons (2) sondiert, und ein Volllängenklon, welcher TfR (DS-712-1-3) codiert, wurde erhalten. Unter Bezugnahme auf die 1C und 2 wird, gemäß weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung, der Plasmidklon DS 712-1-3 veranschaulicht, welcher Tbp1 und Tbp2 aus dem H. influenzae-Typ b-Stamm MinnA codiert. Die DNA-Sequenzen von Tbp1 und Tbp2 (SEQ. ID. Nr.: 3), und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. Nr.: 9 - Tbp1, und SEQ. ID. Nr.: 10 - Tbp2), aus dem H. influenzae-Typ b-Stamm MinnA werden in 5 gezeigt, wobei die Tbp2-Sequenz die erste in dem Operon ist. In 5 sind vermutete -35-, -10- und Ribosomenbindungsstellen-Sequenzen überstrichen.
  • Chromosomale DNA aus dem nicht-typisierbaren H. influenzae-Stamm PAK 12085 wurde hergestellt. Die DNA wurde partiell mit Sau3AI verdaut, hinsichtlich 10-20 kb großen Fragmenten größenfraktioniert und in die BamHI-Stelle von EMBL3 kloniert. Die Bibliothek wurde mit den Fragmenten des pBHIT-Klons (2) sondiert, und ein Volllängenklon, welcher TfR (JB-1042-7-6) codiert, wurde erhalten. Die Restriktionskarte von Klon JB-1042-7-6 wird in den 1D und 2 gezeigt, und die Nukleotidsequenzen der Tbp1- und Tbp2-Gene (SEQ. ID. Nr.: 4) aus H. influenzae-PAK 12085 und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden in 6 gezeigt (SEQ. ID. Nr.: 11, 12), und zwar zuerst mit der Tbp2-Sequenz. In 6 sind vermutete -35-, -10- und Ribosomenbindungsstellen-Sequenzen überstrichen.
  • Chromosomale DNA aus dem von Otitis media abgeleiteten nicht-typisierbaren H. influenzae-Stamm SB33 wurde hergestellt. Die DNA wurde mit Sau3AI partiell verdaut, hinsichtlich 10-20 kb großen Fragmenten größenfraktioniert und in die BamHI-Stelle von EMBL3 kloniert. Die Bibliothek wurde mit den Fragmenten des pBHIT-Klons (2) sondiert, und ein Volllängenklon, welcher TfR codiert (JB-1031-2-9), wurde erhalten. Die Restriktionskarte des Klons JB-1031-2-9 ist in der 2 gezeigt, und die Nukleotidsequenzen der Tbp1- und Tbp2-Gene (SEQ. ID. Nr.: 4) aus H. influenzae SB33 und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in der 7 gezeigt (SEQ. ID. Nr.: 11, 12), und zwar zuerst mit der Tbp2-Sequenz. Bei dem SB33-tbp2-Gen wurde festgestellt, dass es eine Einzelbasendeletion aufweist, welche zu einer Rasterverschiebung am Rest 126 und einer verfrühten Trunkierung bzw. Verkürzung des resultierenden Proteins an Rest 168 führte.
  • Eine PCR-Amplifizierung der tbp2-Gene aus von Otitis medis abgeleiteten NTHi-Stämmen SB12, SB29, SB30 und SB32 wurde durchgeführt, und die Gene wurden sequenziert.
  • Die Nukleotidsequenz der tbp2-Gene aus den nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämmen SB12 (SEQ. ID. Nr.: 105), SB29 (SEQ. ID. Nr.: 108), SB30 (SEQ. ID. Nr.: 110) und SB32 (SEQ. ID. Nr.: 112) sind in den 8, 9, 10 bzw. 11 gezeigt.
  • Es wurde festgestellt, dass alle der amplifizierten tbp2-Gene Volllängen-Tbp2-Proteine codieren, was darauf hinweist, dass das defekte tbp2-Gen des Stammes SB33 atypisch war.
  • Die drei H. influenzae b-Stämme besaßen alle identische kurze intergenische Sequenzen von lediglich 13 bp zwischen tbp2 und tbp1, aber die NTHi-Stämme PAK 12085 und SB33 wiesen längere intergenische Sequenzen von 27 bp auf (12).
  • Der Stamm SB12 wies eine 13 bp große intergenische Sequenz auf, identisch zu derjenigen, welche in den H. influenzae b-Stämmen gefunden wird, wohingegen die Stämme SB29, SB30 und SB32 längere intergenische Sequenzen (27-30 bp) enthielten, wie gefunden in den anderen NTHi-Stämmen PAK 12085 und SB33 (2B). Alle neun Stämme besaßen eine gemeinsame konservierte 13 bp große Kernsequenz zwischen ihren tbp2- und tbp1-Genen.
  • Eine Pentapeptidsequenz nahe dem Aminoterminus von H. influenzae-Tbp1 wurde identifiziert (12), welche ähnlich zu der TonB-Box ist. Das tonB-Gen von H. influenzae ist kürzlich kloniert und sequenziert worden (Jarosik et al., 1994).
  • Die Aminosäuresequenzen von Tbp1 aus den H. influenzae-Stämmen Eagan/MinnA, DL63, PAK 12085 und SB33-Stämmen werden in der 14 verglichen. Die Tbp1-Proteine von Eagan und MinnA sind identisch und 912 Aminosäuren lang, dasjenige von DL63 besitzt 914 Reste, jenes von PAK 12085 besitzt 914 Reste und jenes von SB33 besitzt 911 Reste. Die H. influenzae-Tbp1-Proteine sind hoch konserviert, bei einer Sequenzidentität von 95-100%. Die Aminosäuresequenzen von Tbp2 aus den H. influenzae-Stämmen Eagan/MinnA, DL63, PAK 12085, SB12, SB29, SB30 und SB32 werden in der 15 verglichen. Die Tbp2-Proteine von Eagan und MinnA sind identisch und enthalten 660 Aminosäuren, jenes von DL63 besitzt 644 Reste, und jenes von PAK 12085 besitzt 654 Reste. Es gibt eine Einzelbasendeletion im SB33-tbp2-Gen, welche zu einer Rasterverschiebung am Rest 126 und einer vorreifen bzw. verfrühten Trunkierung des resultierenden Proteins am Rest 168 führt. Die fehlende Base wurde durch direkte Sequenzierung von PCR-amplifizierter chromosomaler DNA bestätigt. Mit der Ausnahme von Eagan und MinnA, welche identisch sind, sind die Tbp2-Proteinsequenzen mit lediglich 66-70% Identität weniger konserviert, aber es gibt mehrere kurze Segmente von konservierter Sequenz, welche in 15 identifiziert werden können. Die PCR-amplifizierten tbp2-Gene aus den Stämmen SB12, SB29, SB30 und SB32 codieren festgestelltermaßen sämtlich Volllängen-Tbp2-Proteine. Es gab eine Sequenz- und Größen-Heterogenität unter den abgeleiteten Tbp2-Proteinen, wobei SB12 648 Aminosäuren aufwies, SB29 631 Reste aufwies, SB30 630 Reste aufwies und SB32 631 Reste aufwies.
  • Die vermuteten Sekundärstrukturen von Eagan-Tbp1 und -Tbp2 wurden bestimmt (16A und 16B). Beide Proteine besitzen mehrere Transmembrandomänen, wobei Tbp1 die Membran 20-mal durchquert und Tbp2 selbige 12-mal durchquert. Drei exponierte konservierte Epitope wurden in der aminoterminalen Region von Tbp1 identifiziert (DNEVTGLGK - SEQ. ID. Nr.: 43, EQVLN/DIRDLTRYD - SEQ. ID. Nr.: 139 und 140, und GAINEIEYENVKAVEISK - SEQ. ID. Nr.: 141), und eines in der C-terminalen Region (GI/VYNLF/LNYRYVTWE - SEQ. ID. Nr.: 142 und 143). Nur drei kleine konservierte Regionen können innerhalb der Tbp2-Proteine der Humanpathogene identifiziert werden: CS/LGGG(G)SFD - SEQ. ID. Nr.: 75, 144 und 145, am N-Terminus, LE/SGGFY/FGP - SEQ. ID. Nr.: 74 und 146, welche intern liegen, und VVFGAR/K - SEQ. ID. Nr.: 83 und 84, am C-Terminus.
  • Die Feststellung, dass die Tbp2-Aminosäuresequenz zwischen Stämmen von Haemophilus variiert, gestattet die Gruppierung von Haemophilus in Untergruppen, welche durch die gleiche Tbp2-Aminosäuresequenz definiert sind. Diese Feststellung gestattet die rationelle Auswahl einer Minimalanzahl von Tbp1- und/oder Tbp2-Sequenzen oder synthetischen Peptiden, welche Epitope repräsentieren, die derartigen Untertypen innerhalb von Stämmen von Haemophilus gemeinsam sind, welche in immunogenen Zusammensetzungen verwendet werden sollen, beispielsweise zur Immunisierung gegen die Krankheiten, welche von Haemophilus und anderen Bakterien, die Transferrin-Rezeptor mit Sequenzähnlichkeiten zu Tbp1 und Tbp2 aus Haemophilus-Spezies produzieren, verursacht werden. Somit kann eine minimale Zahl an Transferrin-Rezeptor, Analogen, Fragmenten und/oder Peptiden verwendet werden, um gegen viele oder alle Stämme von Haemophilus und anderen bakteriellen Pathogenen, welche Transferrin-Rezeptor produzieren, zu immunisieren.
  • Darüber hinaus wurden die Aminosäuresequenzen des Transferrin-Rezeptors aus einem Bereich von bakteriellen Pathogenen (H. influenzae-Typ b, nicht-typisierbares H. influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae und Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae) verglichen, wie gezeigt in den 14 und 15. Diese Analyse enthüllte Regionen von Tbp1 und Tbp2, welche zwischen allen diesen Bakterien konserviert sind. Einige von derartigen konservierten Sequenzen sind in Peptiden in den Tabellen 2 und 3 enthalten. Insbesondere sind die Sequenzen DNEVTGLGK (SEQ ID: 43), EQVLNIRDLTRYDPGI (SEQ. ID. Nr.: 44), EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGMD (SEQ. ID. Nr.: 45), GAINEIEYENVKAVEISKG (SEQ. ID. Nr.: 46) und GALAGSV (SEQ. ID. Nr.: 47) in Tbp1 konserviert (Tabelle 1 und 14). Besondere konservierte Sequenzen in Tbp2 schließen LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr.: 74), CSGGGSFD (SEQ. ID. Nr.: 75), YVYSGL (SEQ. ID. Nr.: 76), CCSNLSYVKFG (SEQ. ID. Nr.: 77), FLLGHRT (SEQ. ID. Nr.: 78), EFNVOF (SEQ. ID. Nr.: 79), NAFTGTA (SEQ. ID. Nr.: 80), VNGAFYG (SEQ. ID. Nr.: 81), ELGGYF (SEQ. ID. Nr.: 82), VVFGAR (SEQ. ID. Nr.: 83) und VVFGAK (SEQ. ID. Nr.: 84) ein (Tabelle 2 und 15).
  • Die Ermittlung von konservierten Sequenzen innerhalb des Transferrin-Rezeptors bei einem Bereich von bakteriellen Pathogenen gestattet die Auswahl einer minimalen Anzahl von Anti-Genen mit jeweiligen Aminosäuresequenzen (einschließlich in der Form von synthetischen Peptiden), um gegen die Krankheit zu immunisieren, welche von Pathogenen verursacht wird, die Transferrin-Rezeptoren aufweisen. Solche Bakterien schließen, zusätzlich zu denjenigen, welche oben zitiert wurden, andere Spezies von Neisseria, wie Neisseria gonorrhoeae, und Branhamella einschließlich Branhamella catarrhalis, ein. Derartige konservierte Aminosäuresequenzen unter vielen bakteriellen Pathogenen gestatten die Erzeugung von TfR-spezifischen Antikörpern, einschließlich monoklonalen Antikörpern, welche die meisten, wenn nicht alle, Transferrin-Rezeptoren erkennen. Antiserum wurde gegen Peptide herangezogen, welche konservierten Bereichen des Transferrin-Rezeptors entsprachen. Dieses Antiserum erkannte den Transferrin- Rezeptor in Branhamella catarrhalis. Derartige Antiseren sind nützlich für die Detektion und Neutralisierung der meisten, wenn nicht aller, Bakterien, welche TfR-Protein produzieren, und sind des Weiteren nützlich für eine passive Immunisierung gegen die Krankheiten, welche von derartigen Pathogenen verursacht werden. Diagnostische Assays und Kits unter Verwendung solcher konservierten Aminosäuresequenzen sind nützlich, um viele, wenn nicht alle, Bakterien zu detektieren, welche Transferrin-Rezeptor produzieren.
  • Epitope, welche die zuvor erwähnten Aminosäuresequenzen enthalten, können an Zellen des Immunsystems durch die Verwendung von synthetischen Peptiden, welche solche Sequenzen enthalten, oder durch die Verwendung von lebenden Vektoren, welche solche Sequenzen exprimieren, oder durch die direkte Verabreichung von Nukleinsäuremolekülen, welche die Aminosäuresequenz codieren, zugeführt werden.
  • Einige Peptide, welche konservierte Aminosäuresequenzen innerhalb der Tbp1-Proteine von H. influenzae-Typ b-Stämmen Eagan, MinnA, DL63 und dem nicht-typisierbaren Stamm PAK 12085 enthalten, sind in der Tabelle 2 gezeigt. Antikörper gegen manche dieser Peptide wurden in Meerschweinchen herangezogen (Tabelle 4). Peptide, welche konservierte Aminosäuresequenzen innerhalb der Tbp2-Proteine von H. influenzae-Typ b-Stämmen Eagan, MinnA, DL63 und dem nicht-typisierbaren Stamm PAK 12085 enthalten, sind in der Tabelle 3 gezeigt. Antikörper gegen manche dieser Peptide wurden in Meerschweinchen herangezogen (Tabelle 4).
  • Die codierenden Sequenzen der Tbp1- und Tbp2-Gene können in geeignete Expressionsvektoren kloniert werden, um rekombinante Proteine zu produzieren. Rekombinantes Tbp1 und Tbp2 wurden von E. coli unter Verwendung des T7-Expressionssystems exprimiert. Das tbp1-Gen, codierend das reife Eagan-Tbp1-Protein, wurde im Leseraster hinter den T7-Promotor kloniert, wodurch das Plasmid JB-1468-29 erzeugt wurde, wie gezeigt in 17. Bei Einführung in BL21/DE3-Zellen und Induzieren mit IPTG oder Lactose wurde das Eagan-Tbp1-Protein exprimiert, wie gezeigt in 22.
  • Das tbp2-Gen, codierend das reife Tbp2-Protein, wurde im Leseraster hinter den T7-Promotor kloniert, wodurch das Plasmid JB-1424-2-8 erzeugt wurde, wie gezeigt in 18. Bei Einbringung in E. coli-Zellen und Induzieren wie oben, wurde Tbp2-Protein exprimiert, wie gezeigt in 22.
  • Das tbp2-Gen aus dem Stamm NTHi SB12 wurde mittels PCR amplifiziert. Die resultierende amplifizierte DNA enthält die authentische H. influenzae-Tbp2-Signalsequenz vor dem reifen Protein. Das SB12-tbp2-Gen, codierend die Signalsequenz und das reife Protein, wurde in das pT7-7-Expressionssystem kloniert, wie gezeigt in 21. Als das resultierende Plasmid (JB-1600-1) in E. coli-BL21/DE3-Zellen eingeführt und induziert wurde, wurde SB12-Tbp2 exprimiert, wie gezeigt in 22.
  • Rekombinante Proteine Tbp1 und Tbp2, produziert in E. coli als Einschlusskörper, wurden durch das in 23 gezeigte Schema gereinigt. Die gereinigten Proteine waren zu mindestens etwa 70% rein, wie gezeigt in 24. Immunogenitätsuntersuchungen wurden in Mäusen mit den gereinigten rekombinanten Tbp1- und Tbp2-Proteinen durchgeführt. Beide Proteine riefen eine gute Immunantwort in Mäusen bei Dosen von 3-10 μg hervor (25).
  • Antiseren, welche gegen rekombinantes Tbp1 oder Tbp2, das aus einem H. influenzae-Stamm abgeleitet war, herangezogen wurden, sind kreuzreaktiv mit anderen Stämmen, was diese zu potenziell nützlichen diagnostischen Reagenzien macht (26 und 27).
  • Die Plasmide pUHIT1KFH und pUHITKFP, welche in 28 gezeigt sind, enthalten einen selektierbaren Antibiotikum-Resistenzmarker, der innerhalb des Transferrin-Rezeptor-Operons kloniert ist, und wurden konstruiert, um das Transferrin-Rezeptor-Operon insertional zu inaktivieren. Diese Plasmide wurden verwendet, um Haemophilus zu transformieren, um Stämme zu erzeugen, welche den Transferrin-Rezeptor Tbp1 und/oder Tbp2 nicht produzieren, wie beschrieben in Beispiel 19. Solche Stämme sind nützlich als Negativkontrollen (da sie TfR nicht produzieren) in in vitro- und in vivo-Detektions- und Diagnose-Ausführungsformen. Von solchen Stämmen wird erwartet, hinsichtlich des in vivo-Wachstums attenuiert zu sein, und sie sind nützlich als Lebend-Impfstoffe zur Bereitstellung von Schutz gegen durch Haemophilus verursachte Krankheiten.
  • Wie obenstehend erörtert, können Epitope von Transferrin-Rezeptor-Proteinen an Zellen des Immunsystems zugeführt werden durch die Verwendung von Lebend-Vektoren, die derartige Aminosäuresequenzen exprimieren, und bei dem Lebend-Vektor kann es sich um Poliovirus handeln. Unter Bezugnahme auf die 29 wird die Konstruktion von Hybrid-Polioviren veranschaulicht, welche ein Epitop von Transferrin-Rezeptor-Protein exprimieren, einschließlich des konservierten Epitops aus Tbp2, LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr.: 74). Solche Viren wurden von Antikörpern erkannt, die gegen ein Peptid herangezogen worden waren, das die Aminosäuresequenz LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr.: 74) beinhaltet (Tabelle 5), was anzeigt, dass die Viren diese Sequenz in einer antigenisch erkennbaren Form exprimierten. PV1TBP2A und PV1TBP2B wurden auch durch Kaninchen-Antiseren neutralisiert, welche gegen H. influenzae-Stamm DL63 tbp2 herangezogen worden waren, was zeigt, dass zumindest diese zwei Viren die Sequenz in einer Form exprimierten, welche für Antikörper erkennbar war, die gegen das Protein herangezogen worden waren. Alle Viren waren durch Anti-PV1-Seren neutralisierbar, was anzeigt, dass die Änderungen in der Polio-Neutralisations-Antigenischen-Stelle I andere antigenische Stellen auf den Viren nicht signifikant beeinflusst hatten. Darüber hinaus erkannte Kaninchen-Antiserum, welches durch Immunisierung mit der Poliovirus-Chimäre PV1TBP2A oder PV1TBP2B hergestellt worden war, ein Peptid, das die Aminosäuresequenz LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr.: 74) beinhaltet. Dies weist darauf hin, dass die Sequenzen, welche von PV1TB2A und PV1TBP2B exprimiert wurden, immunogen sind und Antikörper hervorrufen, die zum Erkennen derselben Sequenz im Kontext eines synthetischen Peptids in der Lage sind.
  • Unter Bezugnahme auf die 30, zeigt die Tafel A ein SDS-PAGE-Gel, welches gereinigtes rekombinantes tbp2 aus dem H. influenzae-Stamm SB12, exprimiert in E. coli (Spur 1), tbp2 aus Branhamella catarrhalis-Stamm 4223 (Spur 2), ein Ganzzelllysat von eisenlimitiertem B. catarrhalis-Stamm 4223 (Spur 3), ein Ganzzelllysat von eisenlimitiertem E. coli JM109 (Spur 4) und ein Ganzzelllysat von unter nicht-eisenlimitierten Bedingungen herangezogenem E. coli JM109 (Spur 5) zeigt. Die Tafel B zeigt Ergebnisse eines Western-Blots eines Wiederholungsansatz-Gels unter Verwendung eines Pools von Seren aus Kaninchen, die mit PV1TBP2A immunisiert worden waren. Es gab eine starke Reaktion mit den gereinigten Transferrin-Bindungsproteinen in den Spuren 1 und 2, und mit einer ähnlich großen Bande in Spur 3. Es gab keine signifikante Reaktion mit jedweden E. coli-Proteinen (Spuren 4 und 5). Die Tafel C zeigt die Ergebnisse für einen Pool von Vorab-Blutproben-Seren aus den gleichen Kaninchen, welche eine minimale spezifische Reaktivität zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, dass PV1TBP2A in der Lage ist, Antiseren zu induzieren, welche spezifisch für Transferrin-bindende Proteine aus H. influenzae und B. catarrhalis sind, und dass die Antiseren B. catarrhalis von E. coli unterscheiden können, welcher nicht ein äquivalentes Protein exprimiert.
  • Die gereinigten und isolierten DNA-Moleküle, welche wenigstens einen Bereich umfassen, der für einen Transferrin-Rezeptor einer Spezies von Haemophilus codiert, exemplifiziert durch die hierin beschriebenen Ausführungsformen, sind vorteilhaft als:
    • – Nukleinsäuresonden für die spezifische Identifikation von Haemophilus-Stämmen in vitro oder in vivo.
    • – Die von den DNA-Molekülen codierten Produkte sind nützlich als diagnostische Reagenzien, Antigene für die Produktion von Haemophilus-spezifischen Antiseren, zur Impfung gegen die Krankheiten, verursacht durch Spezies von Haemophilus, und (zum Beispiel) zum Detektieren einer Infektion durch Haemophilus.
    • – Peptide, welche Bereichen des Transferrin-Rezeptors entsprechen, wie exemplifiziert durch die hierin beschriebenen Ausführungsformen, sind vorteilhaft als diagnostische Reagenzien, Antigene für die Herstellung von Haemophilus-spezifischen Antiseren, zur Impfung gegen die Krankheiten, welche durch Spezies von Haemophilus verursacht werden, und (zum Beispiel) zum Detektieren einer Infektion durch Haemophilus.
  • Der von den Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung codierte Transferrin-Rezeptor, Fragmente und Analoge davon, und Peptide, welche Sequenzen enthalten, entsprechend Abschnitten des Transferrin-Rezeptors, welche zwischen verschiedenen Isolaten von Haemophilus und anderen Bakterien, welche Transferrin-Rezeptor herstellen, konserviert sind, sind nützlich in der Diagnose von und der Immunisierung gegen Krankheiten, die von jedwedem Bakterienstamm verursacht werden, der Transferrin-Rezeptor produziert. Insbesondere sind Peptide, ent haltend die Sequenzen LEGGFYGP, in den Transferrin-Rezeptor-Proteinen vieler bakterieller Pathogene konserviert, welche Transferrin-Rezeptor produzieren, und sind geeignet für die Diagnose von und Impfung gegen Krankheiten, welche durch Bakterien verursacht werden, die Transferrin-Rezeptor produzieren. Solche Bakterien schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Spezies von Haemophilus, Neisseria (einschließlich N. meningitidis und N. gonorrhoeae) und Branhamella (einschließlich B. catarrhalis) ein.
  • Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet klar ersichtlich, dass die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung viele Anwendungen in den Bereichen der Impfung, Diagnose und Behandlung von zum Beispiel Haemophilus-Infektionen und Infektionen durch andere bakterielle Pathogene, welche Transferrin-Rezeptor produzieren, und der Erzeugung von immunologischen Reagenzien aufweisen. Eine weitere, nicht einschränkende, Erörterung solcher Anwendungen wird nachstehend weiter dargelegt.
  • 1. Impfstoffherstellung und Verwendung
  • Immunogene Zusammensetzungen, die zur Verwendung als Impfstoffe geeignet sind, können aus immunogenem Transferrin-Rezeptor, Analoga und Fragmenten davon und/oder Peptiden, wie hierin beschrieben, hergestellt werden. Der Impfstoff ruft eine Immunantwort hervor, welche Antikörper, einschließlich Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörpern und Antikörpern, welche opsonisierend oder bakterizid sind, erzeugt. Sollte das geimpfte Subjekt durch Haemophilus oder anderen Bakterien, die Transferrin-Rezeptor herstellen, herausgefordert werden, binden die Antikörper an dem Transferrin-Rezeptor und verhindern dadurch den Zugang der Bakterien zu einer Eisenquelle, welche für die Lebensfähigkeit benötigt wird. Opsonisierende oder bakterizide Anti-TfR-Antikörper können darüber hinaus auch Schutz durch alternative Mechanismen bereitstellen.
  • Impfstoffe, welche Peptide enthalten, sind allgemein im Fachbereich gut bekannt, wie durch die U.S.-Patente 4 601 903; 4 599 231; 4 599 230 und 4 596 792 beispielhaft angeführt. Immunogene Zusammensetzungen, einschließlich Impfstoffen, können als Injektionen, als flüssige Lösungen oder Emulsionen hergestellt werden. Der Transferrin-Rezeptor, Analoga und Fragmente davon und/oder Peptide können mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipientien, welche mit dem Transferrin-Rezeptor, Fragmenten, Analogen oder Peptiden kompatibel sind, gemischt werden. Solche Exzipientien können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon einschließen. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können ferner Hilfssubstanzen, wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel oder Adjuvantien enthalten, um die Wirksamkeit der Impfstoffe zu erhöhen. Immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe können parenteral durch Injektion subkutan oder intramuskulär verabreicht werden. Alternativ dazu können die immunogenen Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurden, in einer Weise formuliert und zugeführt werden, dass eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorgerufen wird. Somit kann die immunogene Zu sammensetzung an Schleimhautoberflächen beispielsweise auf den nasalen oder oralen (intragastrischen) Wegen verabreicht werden. Die immunogene Zusammensetzung kann in Kombination mit einem Targeting-Molekül für die Zuführung an spezifische Zellen des Immunsystems oder an Schleimhautoberflächen eingesetzt werden. Einige solche Targeting-Moleküle schließen Stamm B12- und Fragmente von bakteriellen Toxinen, wie beschrieben in der WO 92/17167 (Biotech Australia Pty. Ltd.), und monoklonale Antikörper, wie beschrieben im U.S.-Patent Nr. 5 194 254 (Barber et al.), ein. Alternativ können andere Modi der Verabreichung, einschließlich Zäpfchen und orale Formulierungen, wünschenswert sein. Für Zäpfchen können Bindemittel und Träger zum Beispiel Polyalkalenglykole oder Triglyzeride einschließen. Orale Formulierungen können normalerweise verwendete Inzipienten, wie zum Beispiel Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat einschließen. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern ein und enthalten 10-95% des Transferrin-Rezeptors, Fragmente, Analoga und/oder Peptide.
  • Die Impfstoffe werden in einer Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist, und in einer Menge, welche therapeutisch wirksam, schützend und immunogen ist. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt, einschließlich zum Beispiel der Kapazität des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren und, nach Bedarf, eine Zell-vermittelte Immun-Antwort hervorzurufen, ab. Genaue Mengen an aktivem Bestandteil, die zur Verabreichung erforderlich sind, hängen von der Beurteilung der praktizierenden Person ab. Gleichwohl sind geeignete Dosierungsbereiche leicht durch einen Fachmann bestimmbar und können in der Größenordnung von Mikrogramm an Transferrin-Rezeptor, Analogen und Fragmenten davon und/oder Peptiden liegen. Geeignete Schemen für die anfängliche Verabreichung und Auffrischungsdosen sind ebenfalls variabel, können jedoch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von anschließenden Verabreichungen, einschließen. Die Dosierung des Impfstoffes kann ebenfalls von der Route der Verabreichung abhängen und variiert entsprechend der Größe des Wirtes.
  • Die Nukleinsäuremoleküle, die für den Transferrin-Rezeptor der vorliegenden Erfindung codieren, können ebenfalls direkt zur Immunisierung durch direkte Verabreichung der DNA, zum Beispiel durch Injektion für eine genetische Immunisierung oder durch Konstruieren eines lebenden Vektors, wie Salmonella, BCG, Adenovirus, Pockenvirus, Vaccinia oder Poliovirus verwendet werden. Eine Diskussion von einigen Lebend-Vektoren, welche verwendet worden sind, um dem Immunsystem heterologe Antigene zuzuführen, wird zum Beispiel in O'Hagan (1992) erörtert. Verfahren zur direkten Injektion von DNA in Testsubjekte für eine genetische Immunisierung sind zum Beispiel in Ulmer et al., 1993, beschrieben.
  • Die Verwendung von Peptiden in vivo kann zuerst ihre chemische Modifizierung erfordern, da die Peptide selbst eine ausreichend lange Serum- und/oder Gewebe-Halbwertszeit und/oder aus reichende Immunogenität nicht besitzen können. Solche chemisch modifizierten Peptide werden hierin als "Peptidanaloga" bezeichnet. Der Ausdruck "Peptidanalog" erstreckt sich auf jedwedes funktionelle chemische Äquivalent eines Peptids, das durch seine erhöhte Stabilität und/oder Effektivität und Immunogenität in vivo oder in vitro in bezug auf die Ausführung der Erfindung gekennzeichnet ist. Der Ausdruck "Peptidanalog" wird ebenfalls hierin verwendet, um sich auf jedwedes Aminosäurederivat der Peptide, wie sie hierin beschrieben sind, zu erstrecken. Peptidanaloga, die hierin in Betracht gezogen werden, werden durch Prozeduren hergestellt, welche Modifikationen an Seitenketten, den Einbau von nicht natürlichen Aminosäuren und/oder ihren Derivaten während der Peptidsynthese und die Verwendung von Vernetzungsmitteln und andere Verfahren, welche den Peptiden oder ihren Analoga eine konformative Beschränkung auferlegen, einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind.
  • Beispiele für Seitenkettenmodifikationen, die durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden, schließen die Modifikation von Aminogruppen, wie durch reduktive Alkylierung durch die Reaktion mit einem Aldehyd, gefolgt von einer Reduktion mit NaBH4; die Amidierung mit Methylacetimidat; die Acetylierung mit Essigsäureanhydrid; die Carbamylierung von Aminogruppen mit Cyanat; die Trinitrobenzylierung von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS); die Alkylierung von Aminogruppen mit Bernsteinsäureanhydrid und Tetrahydrophthalsäureanhydrid; und die Pyridoxylierung von Lysin mit Pyridoxal-5'-phosphat, gefolgt von einer Reduktion mit NaBH4, ein.
  • Die Guanidinogruppe von Argininresten kann durch die Bildung von heterocyclischen Kondensationsprodukten mit Reagenzien wie 2,3-Butandion, Phenylglyoxal und Glyoxal modifiziert werden.
  • Die Carboxylgruppe kann modifiziert werden durch Carbodiimidaktivierung über eine O-Acylisoharnstoffbildung, gefolgt von einer anschließenden Derivatisierung, zum Beispiel zu einem entsprechenden Amid.
  • Sulfhydrylgruppen können mittels Verfahren, wie der Carboxymethylierung mit Iodessigsäure oder Iodacetamid; der Perameisensäureoxidation zu Cysteinsäure; der Bildung von gemischten Disulphiden mit anderen Thiolverbindungen; der Reaktion mit Maleimid; Maleinsäureanhydrid oder sonstigem substituierten Maleimid; der Bildung von Quecksilberderivaten unter Verwendung von 4-Chlorquecksilberbenzoat, 4-Chlorquecksilberphenylsulfonsäure, Phenylquecksilberchlorid, 2-Chlorquecksilber-4-nitrophenol und anderen Quecksilberverbindungen; der Carbamylierung mit Cyanat bei alkalischem pH-Wert, modifiziert werden.
  • Tryptophanreste können modifiziert werden zum Beispiel durch die Oxidation mit N-Bromsuccinimid oder die Alkylierung des Indolringes mit 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder Sulphonylhalogeniden. Tyrosinreste können durch Nitrierung mit Tetranitromethan zur Bildung eines 3-Nitrotyrosin-Derivats verändert werden.
  • Die Modifizierung des Imidazolringes eines Histidinrestes kann bewerkstelligt werden durch die Alkylierung mit Iodessigsäurederivaten oder die N-Carbethoxylierung mit Diethylpyrocarbonat.
  • Beispiele für die Einbringung von unnatürlichen Aminosäuren und Derivaten während der Peptidsynthese schließen die Verwendung von Norleucin, 4-Aminobuttersäure, 4-Amino-3-hydroxy-5-phenylpentansäure, 6-Aminohexansäure, t-Butylglycin, Norvalin, Phenylglycin, Ornithin, Sarkosin, 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure, 2-Thienylalanin und/oder D-Isomeren von Aminosäuren ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die Immunogenität kann signifikant verbessert werden, wenn die Antigene mit Adjuvantien co-verabreicht werden, üblicherweise verwendet als eine etwa 0,05- bis 1,0-prozentige Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Adjuvantien verstärken die Immunogenität eines Antigens, sind aber nicht notwendigerweise selbst immunogen. Adjuvantien können durch örtliches Zurückhalten des Antigens nahe der Verabreichungsstelle zur Hervorrufung eines Depoteffektes wirken, welcher eine langsame, andauernde Abgabe von Antigen an Zellen des Immunsystems erleichtert. Adjuvantien können auch Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot anlocken und solche Zellen zur Hervorbringung von Immunantworten stimulieren.
  • Immunstimulatorische Mittel oder Adjuvantien sind viele Jahre lang verwendet worden, um die Wirts-Immunantworten beispielsweise gegen Impfstoffe zu verbessern. Intrinsische Adjuvantien, wie Lipopolysaccharide, sind normalerweise die Komponenten der als Impfstoffe verwendeten abgetöteten oder attenuierten Bakterien. Extrinsische Adjuvantien sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht-kovalent an Antigene gebunden sind und formuliert sind, um die Wirtsimmunantworten zu verstärken. Somit sind Adjuvantien identifiziert worden, welche die Immunantwort gegen parenteral zugeführte Antigene verstärken. Einige dieser Adjuvantien sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebeneffekte verursachen, was sie ungeeignet zur Verwendung in Menschen und bei vielen Tieren macht. Tatsächlich werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (gemeinsam üblicherweise als Alum bezeichnet) routinemäßig als Adjuvantien in Menschen- und Tiermedizin-Impfstoffen verwendet. Die Effektivität von Alum bei der Erhöhung von Antikörperantworten gegen Diptherie- und Tetanus-Toxoide ist gut etabliert, und noch kürzlicher ist ein HBsAg-Impfstoff mit Alum als Adjuvans versetzt worden. Wenngleich die Nützlichkeit von Alum für manche Anwendungen gut etabliert ist, besitzt sie Einschränkungen. Zum Beispiel ist Alum für Influenza-Impfung unwirksam und ruft eine Zellvermittelte Immunantwort in inkonsistenter Weise hervor. Die durch mit Alum-Adjuvans versetzte Antigene hervorgerufenen Antikörper sind in der Maus hauptsächlich vom IgG1-Isotyp, der zum Schutz durch einige Impfungsmittel nicht optimal sein kann.
  • Ein breiter Bereich von extrinsischen Adjuvantien kann wirkungsvolle Immunantworten gegen Antigene hervorrufen. Diese schließen Saponine, komplexiert an Membranproteinantigene (immunstimulierende Komplexe), Pluronic-Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mycobakterien und Mineralöl, Freundsches vollständiges Adjuvans, bakterielle Produkte, wie Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS), sowie Lipid A, und Liposomen ein.
  • Um humorale Immunantworten (HIR) und Zell-vermittelte Immunität (CMI) effizient zu induzieren, werden Immunogene in Adjuvantien emulgiert. Viele Adjuvantien sind toxisch, wobei sie Granulome, akute und chronische Entzündungen (Freundsches komplettes Adjuvans, FCA), Cytolyse (Saponine und Pluronic-Polymere) und Pyrogenität, Arthritis und anteriore Uveitis (LPS und MDP) herbeiführen. Obwohl FCA ein hervorragendes Adjuvans ist und in der Forschung in weitem Umfang eingesetzt wird, ist es zur Verwendung bei Impfstoffen für den Menschen oder die Tiermedizin aufgrund seiner Toxizität nicht zugelassen.
  • Wünschenswerte Merkmale von idealen Adjuvantien schließen ein:
    • (1) Fehlen von Toxizität;
    • (2) Fähigkeit zur Stimulierung einer lang andauernden Immunantwort;
    • (3) Einfachheit der Herstellung und Stabilität bei der Langzeitaufbewahrung;
    • (4) Fähigkeit zur Hervorrufung von sowohl CMI als auch HIR gegen auf verschiedenen Wegen verabreichte Antigene, falls erforderlich;
    • (5) Synergie mit anderen Adjuvantien;
    • (6) Fähigkeit zur selektiven Wechselwirkung mit Populationen von Antigen-präsentierenden Zellen (APC);
    • (7) Fähigkeit zur spezifischen Hervorrufung von angemessenen TH1- oder TN2-Zell-spezifischen Immunantworten; und
    • (8) Fähigkeit zur selektiven Erhöhung von passenden Antikörper-Isotypspiegeln (zum Beispiel IgA) gegen Antigene.
  • Das an Lockhoff et al. am B. August 1989 erteilte U.S.-Patent Nr. 4 855 283 lehrt Glykolipid-Analoge, einschließlich N-Glykosylamiden, N-Glykosylharnstoffen und N-Glykosylcarbamaten, von denen jedes am Zuckerrest mit einer Aminosäure substituiert ist, als Immunmodulatoren oder Adjuvantien. So berichteten Lockhoff et al., 1991, dass N-Glykolipid-Analoge, welche strukturelle Ähnlichkeiten zu den natürlich vorkommenden Glykolipiden, wie Glykosphingolipiden und Glykoglyzerolipiden, aufzeigten, zur Hervorrufung starker Immunantworten sowohl bei Herpes-Simplex-Virus-Impfstoff als auch Pseudorabies-Virus-Impfstoff in der Lage sind. Einige Glykolipide sind aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren, welche direkt mit den Zuckern über das anomere Kohlenstoffatom verknüpft sind, synthetisiert worden, um die Funktionen der natürlich vorkommenden Lipidreste nachzuahmen.
  • Das an Molony erteilte U.S.-Patent Nr. 4 258 029, übertragen an den Patentinhaber hiervon, lehrt, dass Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH) als ein Adjuvans fungiert, wenn es mit Tetanus-Toxoid und Formalin-inaktiviertem Typ I-, II- und III-Poliomyelitis-Virus-Impfstoff komplexiert wird. Auch Nixon-George et al., 1990, berichteten, dass Octadecylester von aromatischen Aminosäuren, komplexiert mit einem rekombinanten Hepatitis-B-Oberflächenantigen, die Wirtsimmunantworten gegen Hepatitis-B-Virus verstärkten.
  • Die Lipidierung von synthetischen Peptiden ist ebenfalls verwendet worden, um deren Immunogenität zu erhöhen. So beschreibt Wiesmuller, 1989, ein Peptid mit einer Sequenz, welche homolog zu einem Protein des Maul-und-Klauen-Seuchen-Virus ist, gekoppelt an ein Adjuvans Tripalmityl-s-Glyceryl-Cysteinylserylserin, welches ein synthetisches Analog des N-terminalen Teils des Lipoproteins aus gramnegativen Bakterien ist. Darüber hinaus berichteten Deres et al., 1989, über das in vivo-Priming von virusspezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten mit synthetischem Lipopeptidimpfstoff, welcher aus modifizierten synthetischen Peptiden bestand, die aus Influenzavirus-Nukleoprotein durch Verknüpfung an ein Lipopeptid, N-Palmityl-s-[2,3-bis(palmitylxy)-(2RS)-propyl-[R]-cystein (TPC), abgeleitet worden waren.
  • 2. Immunoassays
  • Der Transferrinrezeptor, Analoge und Fragmente davon und/oder Peptide der vorliegenden Erfindung sind als Immunogene, als Antigene in Immunoassays, einschließlich "Enzyme-linked Immunosorbent-Assays" (ELISA), RIAs und anderen nicht-Enzym-verknüpften Antikörperbindungs-Assays oder -Verfahrensweisen, welche im Fachgebiet bekannt sind, für den Nachweis von antibakteriellen, Haemophilus-, TfR- und/oder Peptid-Antikörpern nützlich. In ELISA-Assays wird der Transferrinrezeptor, Analoge, Fragmente und/oder Peptide, welche Bereichen des TfR-Proteins entsprechen, auf eine ausgewählte Oberfläche immobilisiert, beispielsweise eine zur Bindung von Proteinen oder Peptiden fähige Oberfläche, wie die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach Waschen zur Entfernung von unvollständig adsorbiertem Transferrinrezeptor, Analogen, Fragmenten und/oder Peptiden, kann ein nicht-spezifisches Protein, wie eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) oder Casein, das bekanntermaßen hinsichtlich der Testprobe antigenisch neutral ist, an die gewählte Oberfläche gebunden werden. Dies ermöglicht die Blockierung von nicht-spezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und verringert somit den durch nicht-spezifische Bindungen von Antiseren auf die Oberfläche erzeugten Hintergrund. Vorzugsweise stammen die gewählten Peptide aus den konservierten Regionen von Tabelle 2 oder Tabelle 3, um die Spezies-übergreifende Detektion zu verbessern, es sei denn, eine besondere Bakterienspezies soll detektiert werden. In diesem Fall wird ein Polypeptid gewählt, welches einzigartig für den TfR dieser besonderen Spezies ist. Normalerweise liegen die Peptide im Bereich von 12 Resten und darüber und vorzugsweise 14 bis 30 Resten. Es versteht sich jedoch, dass eine Mischung von Peptiden entweder als ein Immunogen in einem Impfstoff oder als ein diagnostisches Mittel verwendet werden kann. Es können Umstände herrschen, bei welchen eine Mischung von Peptiden aus den konservierten Regionen und/oder aus den nicht-konservierten Regionen verwendet werden soll, um Speziesübergreifenden Schutz und/oder Diagnose bereitzustellen. In diesem Fall wird die Mischung von Peptidimmunogenen üblicherweise als eine "Cocktail"-Präparation zur Verwendung als Impfstoff oder diagnostisches Agens bezeichnet.
  • Die immobilisierende Oberfläche wird dann mit einer Probe kontaktiert, wie klinischen oder biologischen Materialien, die auf eine Weise zu testen ist, welche der Immunkomplex-Bildung (Antigen/Antikörper) förderlich ist. Dies kann das Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln, wie BSA, Rinder-Gamma-Globulin (BGG) und/oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung(PBS)/Tween einschließen. Man lässt die Probe dann 2 bis 4 Stunden lang bei Temperaturen, wie in der Größenordnung von 25° bis 37°C, inkubieren. Im Anschluß an die Inkubation wird die mit der Probe kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nicht-immunkomplexiertes Material zu entfernen. Das Waschverfahren kann Waschen mit einer Lösung, wie PBS/Tween oder einem Borat-Puffer einschließen.
  • Im Anschluß an die Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und dem gebundenen Transferrinrezeptor, Analogen, Fragmenten und/oder Peptiden, und dem anschließenden Waschen, können das Vorliegen und sogar die Menge der Immunkomplex-Bildung bestimmt werden, indem man den Immunkomplex einem zweiten Antikörper aussetzt, der Spezifität für den ersten Antikörper aufweist. Wenn die Testprobe von menschlichem Ursprung ist, handelt es sich bei dem zweiten Antikörper um einen Antikörper mit Spezifität für humane Immunglobuline und im allgemeinen IgG. Um Detektionsmittel bereitzustellen, kann der zweite Antikörper eine assoziierte Aktivität, wie eine enzymatische Aktivität, aufweisen, welche zum Beispiel eine Farberzeugung nach Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat erzeugen wird. Eine Quantifizierung kann dann durch Messen des Ausmaßes der Farberzeugung beispielsweise unter Verwendung eines Spektophotometers für sichtbare Spektren erreicht werden.
  • 3. Verwendung von Sequenzen als Hybridisierungssonden
  • Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung, welche die Sequenz des Transferrin-Rezeptor-Gens umfassen, gestatten nun die Identifizierung und Klonierung der Transferrin-Rezeptor-Gene aus jedweder Spezies von Haemophilus und anderen Bakterien, welche Transferrin-Rezeptor-Gene aufweisen.
  • Die Nukleotidsequenzen, welche die Sequenz der Transferrin-Rezeptor-Gene der vorliegenden Erfindung umfassen, sind brauchbar bezüglich ihres Vermögens, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten von anderen TfR-Genen zu bilden. In Abhängigkeit von der Anwendung kann eine Vielzahl von Hybridisierungsbedingungen angewandt werden, um verschiedene Grade der Selektivität der Sonde in Bezug auf andere TfR-Gene zu erreichen. Für einen hohen Selektivitätsgrad werden stringente Bedingungen angewandt, um die Duplexe zu bilden, wie Bedingungen mit niedrigem Salzgehalt und/oder hoher Temperatur, wie sie durch 0,02 M bis 0,15 M NaCl bei Temperaturen zwischen etwa 50°C bis 70°C vorgesehen werden. Für einige Anwendungen sind weniger stringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich, wie 0,15 M bis 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von etwa 20°C bis 55°C. Hybridisierungsbedingungen können ebenfalls stringenter gemacht werden durch die Zugabe von steigenden Mengen an Formamid, um den Hybridduplex zu destabilisieren. Somit können besondere Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden und werden im allgemeinen ein Verfahren der Wahl in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen sein. Im Allgemeinen sind zweckdienliche Hybridisierungstemperaturen in Gegenwart von 50% Formamid: 42°C für eine Sonde, welche 95 bis 100% homolog zu dem Zielfragment ist, 37°C für 90 bis 95% Homologie und 32°C für 85 bis 90% Homologie.
  • In einer klinischen diagnostischen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzen der TfR-Gene der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie einer Markierung, zur Bestimmung der Hybridisierung verwendet werden. Eine große Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind im Fachbereich bekannt, einschließlich radioaktiven, enzymatischen oder anderen Liganden, wie Avidin/Biotin, welche zur Bereitstellung eines nachweisbaren Signals in der Lage sind. In einigen diagnostischen Ausführungsformen kann ein(e) Enzym-"Tag" bzw. -Nachweismarkierung, wie Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, anstelle einer radioaktiven Nachweismarkierung verwendet werden. In dem Fall von Enzym-Nachweismarkierungen, sind colorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, welche angewandt werden können, um Mittel bereitzustellen, die für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar sind, um eine spezifische Hybridisierung mit Proben, die TfR-Gensequenzen enthalten, zu identifizieren.
  • Die Nukleinsäuresequenzen von TfR-Genen der vorliegenden Erfindung sind brauchbar als Hybridisierungssonden bei Lösungshybridisierungen und in Ausführungsformen, welche Festphasenprozeduren anwenden. In Ausführungsformen, welche Festphasenprozeduren involvieren, wird Test-DNA (oder -RNA) aus Proben, wie klinischen Proben, einschließlich Exudaten, Körperflüssigkeiten (z.B. Serum, amniotische Flüssigkeit, Mittelohrausfluss, Sputum, bronchoalveolare Waschungsflüssigkeit) oder selbst Geweben, an die gewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder in anderer Weise fixiert. Die fixierte einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden, umfassend die Nukleinsäuresequenzen der TfR-Gene oder von Fragmenten davon der vorliegenden Erfindung, unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die gewählten Bedingungen hängen von den besonderen Umständen ab, basierend auf den besonderen Kriterien, die in Abhängigkeit von zum Beispiel dem G+C-Gehalt, dem Typ der Ziel-Nukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde etc. erforderlich sind. Im Anschluß an das Waschen der Hybridisierungsoberfläche, um so nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird eine spezifische Hybridisierung mit Hilfe der Markierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert. Wie bei der Wahl der Peptide, wird es bevorzugt, Nukleinsäuresequenz-Bereiche zu wählen, die unter Spezies von Haemophilus konserviert sind, wie Nukleinsäuresequenzen, welche die konservierte Peptidsequenz der 8, 9, 13 und 14 codieren, und insbesondere in den Tabellen 2 und 3 aufgelistet sind. Die gewählte Sonde sollte mindestens 18 bp lang sein und kann eine Länge im Bereich von 30 bp bis 90 bp aufweisen.
  • 4. Expression der Transferrinrezeptor-Gene
  • Plasmidvektoren, die Replicon- und Kontrollsequenzen enthalten, welche von Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, können für die Expression der Transferrinrezeptor-Gene in Expressionssystemen verwendet werden. Der Vektor trägt normalerweise eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, welche in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitzustellen. Zum Beispiel kann E. coli unter Verwendung von pBR322 transformiert werden, welches Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält und somit ein einfaches Mittel zur Identifizierung von transformierten Zellen bereitstellt. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder Phage müssen ebenfalls Promotoren, welche von der Wirtszelle zur Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können, enthalten oder so modifiziert werden, dass sie diese enthalten.
  • Darüber hinaus können Phagenvektoren, welche Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die mit dem Wirtsmikroorganismus kompatibel sind, als ein transformierender Vektor in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Zum Beispiel kann der Phage in lambda GEMTM-11 bei der Herstellung von rekombinanten Phagenvektoren genutzt werden, welche verwendet werden können, um Wirtszellen, wie E. coli LE392, zu transformieren.
  • Promotoren, die gängigerweise in einer rekombinanten DNA-Konstruktion zur Anwendung kommen, schließen die β-Lactamase(Penicillinase)- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979; Goeddel et al., 1980) und andere mikrobielle Promotoren, wie das T7-Promotorsystem (U.S.-Patent 4 952 496), ein. Details hinsichtlich der Nukleotidsequenzen von Promotoren sind bekannt, was einen Fachmann in die Lage versetzt, diese funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren. Der besondere verwendete Promotor ist im allgemeinen eine wahlfreie Entscheidung in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen. Wirte, welche für die Expression der Transferrin-Rezeptor-Gene, Fragmentanaloge oder Varianten davon geeignet sind, schließen E. coli, Bacillus-Spezies, Haemophilus, Pilze, Hefe ein, oder das Baculovirus-Expressionssystem kann verwendet werden.
  • Gemäß dieser Erfindung wird es bevorzugt, das Protein durch rekombinante Verfahren herzustellen, insbesondere wenn das natürlich auftretende TfR-Protein, wie es aus einer Kultur einer Spezies von Haemophilus gereinigt wird, Spurenmengen an toxischen Materialien oder anderen Kontaminanten einschließen kann. Dieses Problem kann vermieden werden durch die Verwendung von rekombinant hergestelltem TfR-Protein in heterologen Systemen, welches aus dem Wirt in einer Weise isoliert werden kann, um Kontaminanten in dem gereinigten Material zu minimieren. Besonders wünschenswerte Wirte für die Expression in dieser Hinsicht schließen grampositive Bakterien ein, welche kein LPS aufweisen und deshalb Endotoxin-frei sind. Solche Wirte schließen Spezies von Bacillus ein und können für die Herstellung von nicht-pyrogenem Transferrin-Rezeptor, Fragmenten oder Analogen davon besonders brauchbar sein. Darüber hinaus gestatten rekombinante Herstellungsverfahren die Herstellung von Tbp1 oder Tbp2 oder Fragmenten daraus getrennt voneinander, was unterschiedlich zu den normalerweise kombinierten Proteinen ist, welche in Haemophilus vorkommen.
  • BIOLOGISCHE HINTERLEGUNGEN
  • Bestimmte Plasmide, welche mindestens einen Abschnitt enthalten, der für einen Transferrin-Rezeptor von Stämmen von Haemophilus influenzae codiert, welche hierin beschrieben sind und auf die hierin Bezug genommen wird, sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), mit Sitz in Rockville, Maryland, USA, unter den Richtlinien des Budapester Vertrags und vor der Einreichung dieser Anmeldung hinterlegt worden. Proben der hinterlegten Plasmide stehen der Allgemeinheit nach der Erteilung eines Patentes basierend auf dieser U.S.-Patentanmeldung, zur Verfügung. Die Erfindung, welche hierin beschrieben und beansprucht wird, ist nicht im Umfang durch hinterlegte Plasmide beschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform nur als eine Veranschaulichung der Erfindung beabsichtigt ist. HINTERLEGUNGSZUSAMMENFASSUNG
    Figure 00270001
  • Stämme von Haemophilus
  • Der HIB-Stamm Eagan ist von Connaught Laboratories Limited, 1755 Steeles Ave. W., Willowdale, Ontario, Canada M2R 3T4, erhältlich.
  • Der HIB-Stamm MinnA wurde aus der Sammlung von Dr. Robert Munson, Department of Microbiology and Immunology, Washington University School of Medicine, Children's Hospital, St. Louis, Missouri 63110, erhalten.
  • Der HIB-Stamm DL63 wurde aus der Sammlung von Dr. Eric Hansen, Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, Texas 75235-9048, erhalten.
  • PAK 12085 wurde aus der Sammlung von Dr. Robert Munson (siehe oben) erhalten.
  • SB12, 29, 30, 32 und 33 wurden aus der Sammlung von Dr. Stephen Barenkamp, Department of Pediatrics, School of Medicine, Saint Louis University Medical Centre, St. Louis, Missouri 63104, erhalten.
  • BEISPIELE
  • Die obenstehende Offenbarung beschreibt im Allgemeinen die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele sind lediglich zur Zwecken der Veranschaulichung beschrieben, und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu begrenzen. Änderungen in der Form und Substitution von Äquivalenten werden berücksichtigt, wie es die Umstände nahe legen oder als zweckdienlich erscheinen lassen können. Obwohl hierin spezifische Begriffe verwendet worden sind, sind derartige Begriffe in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken von Einschränkungen beabsichtigt.
  • Verfahren der Molekulargenetik, Proteinbiochemie, Immunologie und Fermentationstechnik, die zur Anwendung kommen, aber in dieser Beschreibung und diesen Beispielen nicht explizit erläutert werden, sind ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur dargestellt und liegen durchaus innerhalb der Fertigkeiten des Fachmanns auf dem Gebiet.
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von chromosomaler DNA aus den H. influenzae-Stämmen DL63, Eagan, MinnA und PAK 12085 sowie SB33.
  • Die H. influenzae-Stämme wurden auf Mueller-Hinton-Agar oder in Herz-Gehirn-Infusions-Nährmedium wachsen gelassen, wie beschrieben von Harkness et al., 1992.
  • A. Chromosomale DNA-Extraktion aus Haemophilus influenzae-Typ b DL63
  • Chromosomale DNA wurde wie folgend hergestellt. Zweihundertundfünfzig ml Kultur wurden durch Zentrifugation bei 8000 U/min in einem Beckman-J14-Rotor während 15 Minuten pelletiert. Das Pellet wurde mit 200 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, gewaschen, wie zuvor zentrifugiert, in 12,5 ml 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0, resuspendiert und bei -20°C eingefroren. Dann wurden 1,25 ml einer 10 mg/ml-Lysozymlösung in 0,25 M Tris-HCl, pH 8,0, zu dem gefrorenen Zellpellet zugesetzt. Das Pellet wurde aufgetaut und 45 Minuten lang auf Eis inkubiert. Als Nächstes wurden 2,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml Proteinase K in 0,5% SDS, 0,4 M EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zugesetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang mit gelegentlichem Mischen bei 50°C inkubiert. Das Lysat wurde einmal mit 15 ml Tris-gepuffertem Phenol extrahiert, dann wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat und 30 ml Ethanol zugegeben, um die DNA zu fällen. Die DNA wurde auf einem Glasstab aufgewickelt, dann in 12,5 ml 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5, enthaltend 0,2 mg/ml RNAse A, durch Schwenken über Nacht gelöst. Die Probe wurde einmal mit einem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert, präzipitiert und wie oben aufgewickelt. Die DNA wurde in 2 ml 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5, gelöst und bei 4°C aufbewahrt.
  • B. Extraktion von chromosomaler DNA aus Haemophilus influenzae-Typ b Eagan
  • Fünfzig ml Kultur wurden durch Zentrifugation pelletiert, das Pellet wurde in 25 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert, und 2 × 5-ml-Aliquots wurden für die Herstellung chromosomaler DNA verwendet. Zu jedem Aligot wurden 0,6 ml 10% Sarkosyl und 0,15 ml an 20 mg/ml Proteinase K zugesetzt, und die Proben wurden 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Das Lysat wurde einmal mit Tris-gesättigtigem Phenol und dreimal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die wässrigen Phasen wurden für ein Endvolumen von 7 ml vereinigt. Dann wurden 0,7 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 4,3 ml Isopropanol zugegeben, um die DNA zu fällen, welche aufgewickelt, mit 70% Ethanol gespült, getrocknet und in 1 ml Wasser resuspendiert wurde.
  • C. Extraktion von chromosomaler DNA aus Haemophilus influenzae Eagan, MinnA, Pak 12085 und SB33
  • Zellen wurden aus 50 ml Kultur durch Zentrifugation bei 5000 U/min während 15-20 Minuten bei 4°C pellettiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert, und Pronase und SDS wurden zu Endkonzentrationen von 500 μg/ml bzw. 1% zugegeben. Die Probe wurde bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert, bis ein klares Lysat erhalten wurde. Das Lysat wurde einmal mit Tris-gesättigtem Phenol, einmal mit Tris-gesättigtem Phenol/Chloroform (1:1) und einmal mit Chloroform extrahiert. Die letztliche wässrige Phase wurde 24 Stunden lang gegen 2 × 500 ml 1 mM NaCl bei 4°C, wobei der Puffer einmal gewechselt wurde, und 24 Stunden lang gegen 2 × 500 ml TE bei 4°C, wobei der Puffer einmal gewechselt wurde, dialysiert. Das letztendliche Dialysat wurde zur Verwendung aliquottiert.
  • Beispiel 2
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von chromosomalen Bibliotheken.
  • A. H. influenzae DL63-λZAP-Bibliothek
  • 100 μg chromosomale H. influenzae DL63-DNA in TE wurden mechanisch in einer 1 ml großen Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel geschert. Die gescherte DNA wurde durch Zugeben von Wasser zu einem Endvolumen von 405 μl, 45 μl 10 × S1-Nuklease-Puffer (2 M NaCl, 500 mM NaOAc, pH 4,5, 10 mM ZnSO4, 5% Glycerol) und 1,7 μl S1-Nuklease bei 100 U/μl und Inkubieren bei 37°C während 15 Minuten glattendig gemacht. Die Probe wurde einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert, und 1 ml Ethanol wurden zugegeben, um die DNA zu fällen. Die Probe wurde 10 Minuten lang auf Eis oder bei -20°C über Nacht inkubiert, und die DNA wurde durch Zentrifugation in einer Mikrofuge während 30 Minuten geerntet. Die DNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet. Die EcoRI-Stellen in der DNA-Sequenz wurden unter Anwendung von Standardvorgehensweisen methyliert. Zu dieser methylierten DNA wurden 5 μl 100 mM MgCl2, 8 μl dNTP-Mix (2,5 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und 4 μl von 5 U/μl Klenow zugegeben. Die Mischung wurde bei 12°C während 30 Minuten inkubiert. 450 μl STE (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) wurden zugegeben, und die Mischung wurde einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert, bevor 1 ml Ethanol zugegeben wurde, um die DNA zu fällen. Die Probe wurde auf Eis 10 Minuten lang oder bei -20°C über Nacht inkubiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation in einer Mikrofuge während 30 Minuten geerntet, mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet.
  • Die DNA wurde in 7 μl TE resuspendiert, und zu der Lösung wurden 14 μl phosphorylierte EcoRI-Linker (200 ng/μl), 3 μl 10 × Ligationspuffer, 3 μl 10 mM ATP und 3 μl T4-DNA-Ligase (4 U/μl) zugesetzt. Die Probe wurde bei 4°C über Nacht inkubiert, dann bei 68°C 10 Minuten lang inkubiert, um die Ligase zu inaktivieren. Zu der Mischung wurden 218 μl H2O, 45 μl 10 × Universal-Puffer und 7 μl EcoRI bei 30 U/μl zugesetzt. Nach Inkubation bei 37°C während 1,5 Stunden, wurde 1,5 μl 0,5 M EDTA zugegeben, und die Mischung wurde auf Eis gestellt.
  • Die DNA wurde hinsichtlich der Größe auf einem Saccharosegradienten fraktioniert, wobei Fraktionen vereinigt wurden, welche DNA von 6-10 kb enthielten. Die vereinigte DNA wurde mit Ethanol gefällt und in 5 μl TE-Puffer resuspendiert. 200 ng Insert-DNA wurden 2-3 Tage lang bei 4°C mit 1 μg ZAP II-Vektor in einem Endvolumen von 5 μl ligiert. Die Ligationsmischung wurde unter Verwendung von Gigapack II Gold (Stratagene) verpackt und auf E. coli SURE-Zellen auf NZY-Platten ausplattiert. Die Bibliothek wurde titriert, amplifiziert und bei 4°C unter 0,3% Chloroform aufbewahrt.
  • B. H. influenzae Eagan-pUC-Bibliothek
  • Chromosomale DNA, welche aus H. influenzae Eagan durch das Verfahren in Beispiel 1C hergestellt worden war, wurde mit Sau3AI während 2, 5 und 10 Minuten verdaut, und Proben wurden auf einem präparativen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Gelscheibchen, welche DNA-Fragmente mit einer Länge zwischen 3-10 kb einschlossen, wurden ausgeschnitten, und die DNA wurde durch das standardmäßige Einfrier-Auftau-Vorgehen extrahiert. Plasmid-DNA aus pUC 8:2 (pUC 8 mit zusätzlichen BglII- und XbaI-Restriktionsenzymstellen in der Mehrfachklonierungsstelle) wurde mit BamHI und BglII verdaut und mit Kälber-Alkalische-Phosphatase (CAP) dephosphoryliert. Die Fragmente von H. influenzae Eagan-DNA wurden in pUC ligiert, und die Mischung wurde verwendet, um E. coli JM109-Zellen zu transformieren.
  • C. H. influenzae Eagan-λZAP-Bibliothek
  • Chromosomale DNA aus H. influenzae Eagan, die wie in Beispiel 1B hergestellt worden war, wurde mit EcoRI verdaut und hinsichtlich der Größe auf einem präparativen Agarosgel fraktioniert. Gelscheibchen, welche DNA-Fragmenten von 7-23 kb entsprachen, wurden herausgeschnitten, und DNA wurde über Nacht in Dialyseschlauch, enthaltend 3 ml TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) bei 14 V elektroeluiert. Die DNA wurde zweimal präzipitiert und in Wasser resuspendiert, bevor sie über Nacht mit EcoRI-verdauter λZAP II-DNA ligiert wurde. Die Ligationsmischung wurde unter Verwendung des Gigapack II-Verpackungs-Kits (Stratagene) verpackt und auf E. coli XL1-Blue-Zellen ausplattiert. Die Bibliothek wurde titriert, amplifiziert und bei 4°C unter 0,3% Chloroform aufbewahrt.
  • D. EMBL3-Bibliotheken
  • Chromosomale H. influenzae MinnA-DNA (10 μg) wurde hergestellt, wie in Beispiel 1C, und mit Sau3AI (40 Units) während 2, 4 und 6 Minuten verdaut und danach hinsichtlich der Größe auf einem 10-30% Saccharosegradienten in TNE-Puffer (20 mM Tris-HCl, 5 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8) fraktioniert. Fraktionen, welche DNA-Fragmente enthielten, die größer als 5 kb waren, wurden vereinigt und präzipitiert. In einem zweiten Experiment wurde chromosomale DNA (2,6 μg) mit Sau3AI (4 Units) während 1, 2 und 3 Minuten verdaut und nach der Größe durch präparative Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. Gelscheibchen, enthaltend DNA-Fragmente von 10-20 kb, wurden herausgeschnitten, und DNA wurde durch standardmäßige Einfrier-/Auftau-Technik extrahiert. Die größenfraktionierte DNA aus den zwei Experimenten wurde zur Ligation mit BamHI-Armen von EMBL3 (Promega) vereinigt. Die Ligationsmischung wurde unter Verwendung des Gigapack II-Verpackungskits verpackt und auf E. coli LE392-Zellen ausplattiert. Die Bibliothek wurde titriert, dann amplifiziert und bei 4°C unter 0,3% Chloroform aufbewahrt.
  • Chromosomale DNA aus H. influenzae PAK 12085 oder SB33, hergestellt wie in Beispiel 1C, wurde mit Sau3AI (0,5 Units/10 μg DNA) bei 37°C während 15 Minuten verdaut und durch Agarose-Gelelektrophorese größenfraktioniert. Gelscheibchen, entsprechend DNA-Fragmenten von 15-23 kb, wurden herausgeschnitten, und DNA wurde über Nacht in Dialyseschlauch, welcher 3 ml TAE enthielt, bei 14 V elektroeluiert. Die DNA wurde zweimal präzipitiert und in Wasser resuspendiert, vor der Übernacht-Ligation mit EMBL3-BamHI-Armen (Promega). Die Ligationsmischung wurde unter Verwendung des Lambda-in vitro-Verpackungs-Kit (Amersham) gemäß den Anweisungen des Herstellers verpackt und auf E. coli-NM539-Zellen ausplattiert. Die Bibliothek wurde titriert, dann amplifiziert und bei 4°C in Gegenwart von 0,3% Chloroform aufbewahrt.
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel veranschaulicht das Screening der Bibliotheken.
  • A. H. influenzae-DL63-λZAP-Expressionsbibliothek
  • Tbp1- und Tbp2-Proteine wurden auf Festphasen-Human-Transferrin (hTf) affinitätsgereinigt. Kurz gesagt, wurde eine 20 ml große hTf-Sepharose-Säule gemäß dem Protokoll des Herstellers zum Koppeln von Proteinliganden an CNBr-aktivierte Sepharose (Sigma) hergestellt. Die resultierende Matrix wurde mit 3 Säulenvolumina 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 6 M Guanidin-HCl, pH 8,0, gewaschen, um nicht-kovalent gebundenes hTf zu entfernen. Die Säule wurde dann mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, äquilibriert, und gebundenes hTf wurde unter Verwendung von 1 ml an 10 mg/ml FeCl3 in Puffer, enthaltend 100 mM jeweils von Natriumcitrat und Natriumbicarbonat, pH 8,6, eisenbeladen, gefolgt von 2 Säulenvolumina 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 8,0. Gesamt-Bakterienmembranen (300 mg Gesamtprotein) wurden aus H. influenzae-Stamm DL63 hergestellt, welcher auf eisenfreien Medien herangezogen worden war, wie früher beschrieben (Schryvers et al., 1989). Membranen wurden zu 2 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 8,0, verdünnt und durch die Zugabe von EDTA zu 15 mM und Sarkosyl NL97 zu 1,5% solubilisiert. Nach Zentrifugation bei 40000 × g während 1 Stunde wurde der Überstand auf die hTf-Säule aufgetragen, und die Säule mit 10 Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl, pH 8,0, gewaschen. Die Rezeptorproteine wurden unter Verwendung von 2 M GnHCl im gleichen Puffer eluiert, und die eluierten Fraktionen wurden gründlich gegen 25 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer (5 Pufferwechsel) dialysiert, lyophilisiert und bei -20°C aufbewahrt. Isolierte Proteine wurden verwendet, um Transferrin-Rezeptor-spezifische Antiseren in "New Zealand White"-Kaninchen unter Anwendung von Standardtechniken zu erzeugen. Kurz gesagt, wurden Kaninchen dreimal subkutan immunisiert, bei Intervallen von zwei Wochen, unter Verwendung von vollständigem Freund'schen Adjuvans für die erste Injektion und von unvollständigen Freund'schen Adjuvans für nachfolgende Injektionen.
  • Die DL63-λZAP-Bibliothek wurde auf E. coli-SURE-Zellen ausplattiert, und Plaques wurden auf Nitrozellulosemembranen überführt, welche in 10 mM IPTG im Voraus eingeweicht worden waren, um die Expression von dem pBluescript-lacZ-Promotor aus zu induzieren. Filter wurden unter Verwendung von 0,5% Magermilch in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, geblockt, bevor sie mit den polyklonalen Anti-TfR-Antiseren und Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG sondiert wurden. Plaques wurden durch 3 Runden Screening gereinigt, und rekombinante pBluescript-Plasmide (pBHIT1 und pBHIT2; 1A und 2) wurden mittels des in vivo-Excisions-Vorgehens (Short et al., 1988) zurückgewonnen.
  • B. Eagan-, MinnA- und PAK 12085-Nicht-Expressions-Bibliotheken
  • (i) Screening einer H. influenzae Eagan-pUC-Bibliothek
  • Kolonie-Abdrücke auf Nitrozellulose wurden unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt, und die Filter wurden mit der 5'pBHIT2-Sonde des Transferrin-Rezeptor-Gens, veranschaulicht in 2, sondiert. Die Sonde wurde mit Digoxigenin (dig, Boehringer Mannheim) unter Befolgung der Angaben des Herstellers markiert. Mehrere vermeintliche Klone wurden auf Nitrozellulose punktförmig aufgetragen bzw. dot-geblottet und einer zweiten Runden des Screenings unter Verwendung der selben 5'pBHIT2-Sonde unterzogen. Vermeintliche [Klone] der zweiten Runde wurden durch Restriktionsenzym-Kartierung analysiert, und der Klon S-4368-3-3 (1B, 2) wurde zur Sequenzanalyse ausgewählt.
  • (ii) Screening von H. influenzae Eagan-λZAP-Bibliothek
  • Die Phagenbibliothek wurde unter Anwendung von Standardtechniken auf XLI-Blue-Zellen (Stratagene) unter Verwendung von LB-Platten und einer Überlagerungs-Schicht von 0,7% Agarose ausplattiert. Plaques wurden auf Nitrozellulose unter Anwendung von Standardprotokollen abgestempelt, und die Filter wurden bei 80°C während 2 Stunden unter Vakuum gebacken, um die DNA zu fixieren. Die 5'-pBHIT2-Sonde des Transferrin-Rezeptor-Gens (2) wurde mit Digoxigenin markiert, und die Filter wurden 4 Stunden lang bei 42°C vorhybridisiert, und dann über Nacht mit der markierten Sonde bei 42°C hybridisiert. Die Filter wurden bei 68°C gewaschen, und nach der Autoradiographie wurden mehrere Plaques für eine zweite Runde des Screenings ausgewählt. Die in vivo-Exzision von Phagmid-DNA aus vermeintlichen [Plaques] der zweiten Runde wurde gemäß Protokollen durchgeführt, welche mit dem λZAP-System (Promega) bereitgestellt wurden. Vier Klone mit identischen ~2,5 kb großen EcoRI-Inserts wurden erhalten, für welche JB-901-5-3 in Figur B, 2, ein Beispiel ist. Vermeintliche Plaques wurden ebenfalls amplifiziert und die Phagen-DNA wurde aus 500 ml Kultur gereinigt. Insert-DNA wurde durch Verdau mit XbaI herausgeschnitten und wurde in pUC 8:2 (pUC 8, enthaltend zusätzliche BglII- und XbaI-Stellen in seiner Mehrfachklonierungsstelle), welcher mit XbaI verdaut und dephosphoryliert worden war, kloniert. Der Klon JB-911-3-2 (17) enthält die 3'-Hälfte des H. influenzae Eagan-TfR-Operons.
  • (iii) Screening von EMBL3-Bibliotheken
  • Die H. influenzae MinnA-Bibliothek wurde auf LE392-Zellen auf NZCYM-Platten unter Verwendung von 0,7% Top-Agarose in NZCYM als Überlagerungsschicht ausplattiert. Eine Plaque-Abhebung bzw. Abstempelung auf Nitrozellulosefilter wurden unter Befolgung von Stan dardverfahren durchgeführt, und die Filter wurden verarbeitet und mit der 5'pBHIT2-Sonde (2), welche mit Digoxigenin markiert war, sondiert. Vermeintliche Plaques wurden plattiert und zweiten und dritten Runden des Screenings unter Anwendung derselben Vorgehensweisen ausgesetzt. Phagen-DNA wurde aus 500 ml Kultur unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt, die Insert-DNA durch SalI-Verdau herausgeschnitten und in pUC kloniert, um den Klon DS-712-1-3 (1C und 2) zu erzeugen.
  • Die H. influenzae PAK 12085-Bibliothek wurde auf LE392-Zellen auf NZCYM-Platten unter Verwendung von 0,7% Agarose in NZCYM als Überlagerungsschicht plattiert. Plaques wurden auf Nitrozellulose abgehoben, und die Filter wurden verarbeitet und mit der Digoxigeninmarkierten 5'pBHIT2-Sonde (2) sondiert. Vermeintliche Plaques wurden plattiert und einer zweiten Runde des Screenings unter Anwendung derselben Vorgehensweisen unterzogen. Phagen-DNA wurde aus 500 ml-Kulturen durch Standardtechniken hergestellt, das DNA-Insert durch Verdau mit SalI herausgeschnitten und in pUC kloniert, um den Klon JB-1042-7-6 (1D und 2) zu erzeugen.
  • Die H. influenzae SB33-Bibliothek wurde auf LE392-Zellen auf NZCYM-Platten unter Verwendung von 0,7% Agarose in NZCYM als Überlagerungsschicht plattiert. Plaques wurden auf Nitrozellulose abgehoben, und Filter wurden verarbeitet und mit der Digoxigenin-markierten 5'pBHIT2-Sonde (2) sondiert. Vermeintliche Plaques wurden plattiert und einer zweiten Runde des Screenings unter Anwendung derselben Vorgehensweisen unterzogen. Phagen-DNA wurde aus 500 ml-Kulturen durch Standardtechniken hergestellt, das DNA-Insert wurde durch Verdau mit SalI herausgeschnitten und in pUC kloniert, um den Klon JB-1031-2-9 (2) zu erzeugen.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Sequenzierung der Tbp1- und Tbp2-Gene des TfR-Operons.
  • Plasmid-DNA aus den Klonen pBHIT1, pBHIT2, S-4368-3-3, JB-901-5-3, DS-712-1-3, JB-1042-7-6 und JB-1031-2-9 wurden unter Anwendung von Standardtechniken hergestellt. Oligonukleotid-Sequenzierungsprimer von 17-25 Basen Länge wurden auf dem ABI-Modell 380B-DNA-Synthesizer synthetisiert und durch Chromatographie unter Verwendung von OPC-Kartuschen, welche von Applied Biosystems Inc. erhalten und gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wurden, gereinigt. Proben wurden unter Verwendung des ABI-Modell 370A-DNA-Sequenzierers und von Farbstoff-Terminator-Chemie gemäß den Protokollen des Herstellers sequenziert. Die Sequenz des TfR-Operons aus dem Stamm DL63 wird in der 3, jene von Stamm Eagan in 4, jene von Stamm MinnA in 5, jene von PAK 12085 in 6, und jene von SB33 in 7 veranschaulicht.
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die PCR-Amplifikation der tbp2-Gene aus nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämmen SB12, SB29, SB30 und SB32.
  • Chromosomale DNA aus den nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämmen SB12, SB29, SB30 und SB32, wurde wie oben beschrieben hergestellt. Die TfR-Gene sind als ein Operon angeordnet, wobei sich an tbp2 tbp1 anschließt (siehe 12A und 12B). Oligonukleotide wurden gegen das 5'-Ende der tbp2- und das reverse Komplement des 5'-Endes der tbp1-codierenden Sequenzen synthetisiert. Die Primer waren: GGATCCATATGAAATCTGTACCTCTTATCTCTGGT (SEQ. ID. Nr.: 120), entsprechend zu MKSVPLISGS (SEQ. ID. Nr.: 147) aus der Leader-Sequenz von tbp2, und TCTAGAAGCTTTTTTAGTCATTTTTAGTATTCCAT (SEQ. ID. Nr.: 137), welches das reverse Komplement der Leader-Sequenz MTKK (SEQ. ID. Nr.: 138) von Tbp1 und eines Teils der intergenischen Sequenz ist (12A und 12B). Die PCR-Amplifizierung wurde in Puffer ausgeführt, enthaltend 10 mM Tris/HCl, pH 8,3, 50 mM Kaliumchlorid und 1,5 mM Magnesiumchlorid. Jede 100 μl-Reaktionsmischung enthielt 5 ng chromosomale DNA, 1 μg jedes Primers, 5 Units Amplitaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus) und 0,4 mM dNTPs (Perkin Elmer Cetus). Die Zyklierungs-Bedingungen bestanden in 25 Zyklen bei 94°C während 1,0 Minuten, 45°C während 2,0 Minuten und 72°C während 1,5 Minuten. Spezifische 2 kb große Fragmente wurden für jede Probe amplifiziert (13). SB33-DNA wurde als eine Positiv-Kontrolle verwendet (Spur 1). Bei chromosomaler DNA, welche für die Amplifikation des Tbp2-Gens verwendet wurde, handelte es sich um, Spur 1, SB33; Spur 2, SB12; Spur 3, SB29; Spur 4, SB30; und Spur 5, SB32: Die Fragmente wurden in den TA-Klonierungsvektor (Invitrogen) kloniert, und ihre Nukleotidsequenzen wurden bestimmt. Die Nukleinsäuresequenzen von Tbp2 aus den Stämmen SB12 (SEQ. ID. Nr.: 108), SB29 (SEQ. ID. Nr.: 110), SB30 (SEQ. ID. Nr.: 112) bzw. SB32 (SEQ. ID. Nr.: 114), sind in den 8, 9, 10 bzw. 11 gezeigt.
  • Beispiel 6
  • Dieses Beispiel veranschaulicht den Vergleich der Aminosäuresequenzen von Transferrin sowie die Identifizierung von potenziell exponierten Epitopen von Transferrin-Rezeptorproteinen durch Sekundärstrukturanalyse.
  • Unter Bezugnahme auf die 14 wird ein Vergleich der Aminosäuresequenz von Tbp1 aus H. influenzae Typ b Eagan, DL63, nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämmen PAK 12085 und SB33, N. meningitidis-Stämmen B16B6 und M982 (Legrain et al., 1993) und N. gonorrhoeae FA19 (Cornelissen et al., 1992) gezeigt. Diese Analyse enthüllte Regionen von Tbp1, welche unter allen diesen Bakterien konserviert sind.
  • Unter Bezugnahme auf die 15 wird ein Vergleich der Aminosäuresequenz von Tbp2 aus H. influenzae-Typ b-Stämmen Eagan, DL63, nicht-typisierbaren H. influenzae-Stämmen PAK 12085, S812, SB29, SB30 und SB32, N. meningitidis-Stämmen B16B6 und M982, N. gonorrhoeae FA19 und Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae (Gerlach et al., 1992) 205 und 37 gezeigt. Diese Analyse enthüllte Regionen von Tbp2, welche unter allen diesen Bakterien konserviert sind.
  • Protein-Sekundärstruktur-Analysen wurden unter Anwendung der Chou-und-Fasman-Algorithmen (1978) durchgeführt, und Hydrophilizitäts/Hydrophobizitäts-Auftragungen wurden unter Anwendung des Hopp-Algorithmus (1986) durchgeführt. Die Werte wurden aus den Mittelwerten von Heptapeptid-Fenstern abgeleitet und sind an dem Mittenpunkt jedes Fragments aufgetragen. Die 16A veranschaulicht die vorhergesagte Sekundärstruktur von Tbp1 aus H. influenzae-Typ b-Eagan, und 16B veranschaulicht die vorhergesagte Sekundärstruktur von Tbp2 aus H. influenzae-Typ b Eagan. Zu den vorhergesagten Sekundärstrukturen, welche in den 16A und 16B abgebildet sind, gelangte man durch Anwenden der obenstehend beschriebenen Vorgehensweisen. Allerdings waren die Anmelder der Erfindung noch nicht in der Lage, zu bestätigen, dass die Sekundärstruktur von diesen Figuren exakt wiedergegeben wird.
  • Konservierte Epitope von Tbp1- und Tbp2-Proteinen aus mehreren unterschiedlichen Bakterien wurden durch Sequenz-Alignierung, wie gezeigt in den 14 bzw. 15, identifiziert. Einige derartige konservierte Epitope schließen folgende ein:
    Figure 00360001
  • Darüber hinaus wurden, in Kombination mit den vorhergesagten Sekundärstrukturen, vier konservierte exponierte Epitope auf Tbp1 identifiziert, und zwei wurden auf Tbp2 identifiziert. Bei diesen handelt es sich um:
    Figure 00370001
  • Proteine, Polypeptide oder Peptide, welche die zuvor erwähnten konservierten Aminosäuresequenzen enthalten, sind besonders nützlich als Nachweismittel in diagnostischen Ausführungsformen und als Immunogene zum Detektieren von oder Schützen vor Krankheiten, die durch Bakterien, welche Transferrin-Rezeptor-Protein herstellen, verursacht werden. Für die Immunisierung können die jeweilig angegebenen Aminosäuresequenzen dem Immunsystem als Proteine oder Peptide präsentiert werden, oder ein lebendes Zuführvehikel, wie Salmonella, BCG, Adenovirus, Pockenvirus, Vaccinia oder Poliovirus, kann verwendet werden.
  • Beispiel 7
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids JB-1468-29, welches Eagan-Tbp1 aus E. coli exprimiert.
  • Die Plasmide S-4368-3-3 (1B und 2) und JB-911-3-2 (17) enthalten die 5'- bzw. 3'-Teile des Eagan-tbp1-Gens. Die 17 veranschaulicht das Konstruktionsschema für das Plasmid JB-1468-29. Die Oligonukleotid-Sequenzen, welche in der Konstruktion von JB-1468-29 verwendet wurden, sind in der 20 gezeigt (SEQ. ID. Nr.: 86 und 87). Das Plasmid JB-1468-29 wurde in den E. coli-Stamm BL21/DE3 durch Elektroporation eingeführt, um den Stamm JB-1476-2-1 zu erzeugen.
  • JB-1476-2-1 wurde in YT-Medium herangezogen und mit IPTG unter Befolgung von Standardprotokollen induziert. Für die Herstellung von Tbp1 für Immunogenitäts- und andere Untersuchungen, wurde der Stamm JB-1476-2-1 über Nacht in NZCYM-Medien, enthaltend 3% Glucose, herangezogen. Ein 1:40-Inoculum wurde frischen NZCYM-Medien ohne Glucose zugesetzt, und die Kultur wurde bis zu A578 = 0,3 wachsen gelassen. Lactose wurde zu 1% zugegeben, und die Kultur wurde 4 Stunden lang induziert. Eine SDS-PAGE-Analyse von Ganzzelllysaten von JB-1476-2-1 wird in der 22 gezeigt. Spur 1, JB-1476-2-1 (T7/Eagan Tbp1) bei t0; Spur 2, JB-1476-2-1 bei t = 4 h Induktion; Spur 3, Molekulargewichtsmarker von 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa und 31 kDa; Spur 4, JB-1437-4-1 (T7/Eagan Tbp2) bei t0; Spur 5, JB-1437-4-1 bei t = 4 h Induktion; Spur 6, JB-1607-1-1 (T7/SB12 Tbp2) bei t0; Spur 7, JB-1607-1-1 bei t = 4 h Induktion.
  • Beispiel 8
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids JB-1424-2-8, welches Eagan-Tbp2 aus E. coli exprimiert.
  • Unter Bezugnahme auf die 18 wird das Plasmid S-4368-3-3 gezeigt, welches das gesamte tbp2-Gen aus H. influenzae-Typ b Eagan enthält. 18 veranschaulicht das Plasmid JB-1424-2-8, und die 19 zeigt die verwendeten Oligonukleotide. Das Plasmid JB-1424-2-8 wurde in den E. coli-Stamm BL21/DE3 durch Elektroporation eingeführt, um den E. coli-Stamm JB-1437-4-1 zu erzeugen. Nach Induktion mit IPTG oder Lactose wurde Tbp2 von E. coli JB-1437-4-1 exprimiert, wie gezeigt in der 22. Spur 1, JB-1476-2-1 (T7/Eagan Tbp1) bei t0; Spur 2, JB-1476-2-1 bei t = 4 h Induktion; Spur 3, Molekulargewichtsmarker von 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa und 31 kDa; Spur 4, JB-1437-4-1 (T7/Eagan Tbp2) bei t0; Spur 5, JB-1437-4-1 bei t = 4 h Induktion; Spur 6, JB-1607-1-1 (T7/SB12 Tbp2) bei t0; Spur 7, JB-1607-1-1 bei t = 4 h Induktion.
  • Beispiel 9
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion von Plasmiden, welche eine Lipoprotein-Leadersequenz vor der Tbp2-Sequenz codieren.
  • Oligonukleotide, welche verwendet wurden für die Konstruktion von Plasmiden mit Lipoprotein-Leadersequenzen, abgeleitet aus E. coli lpp (SEQ. ID. Nr.: 88 und 89), rlpB (SEQ. ID. Nr.: 90 und 91) und pal (SEQ. ID. Nr.: 92 und 93), welche dem Tbp2 vorangehen, sind in der 20 gezeigt. Die konstruierten Plasmide und entsprechenden erzeugten Stämme sind in der untenstehenden Tabelle 1 veranschaulicht.
  • Beispiel 10
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion des Plasmides JB-1600-1, welches SB12-Tbps2 aus E. coli exprimiert.
  • Das Plasmid DS-1047-1-2 (21) enthält das PCR-amplifizierte SB12-tbp2-Gen. Das tbp2-Gen wurde als ein NdeI- bis EcoRI-Restriktionsfragment herausgeschnitten und in den pT7-7-Expressionsvektor inseriert, wodurch das Plasmid JB-1600-1 erzeugt wurde. Die Elektroporation in BL21/DE3-Zellen ergab den E. coli-Stamm JB-1607-1-1, welcher SB12-Tbp2 exprimiert. Nach Induktion mit IPTG oder Lactose wurde SB12-Tbp2 exprimiert, wie gezeigt in der 22. Spur 1, JB-1476-2-1 (T7/Eagan Tbp1) bei t0; Spur 2, JB-1476-2-1 bei t = 4 h Induktion; Spur 3, Molekulargewichtsmarker von 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa und 31 kDa; Spur 4, JB-1437-4-1 (T7/Eagan Tbp2) bei t0; Spur 5, JB-1437-4-1 bei t = 4 h Induktion; Spur 6, JB-1607-1-1 (T7/SB12 Tbp2) bei t0; Spur 7, JB-1607-1-1 bei t = 4 h Induktion.
  • Beispiel 11
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Extraktion und Reinigung von Tbp1 und Tbp2.
  • Das Reinigungsschema für Tbp1 und Tbp2 wird in der 23 gezeigt. Beide rekombinanten Proteine werden als Einschlusskörper in E. coli exprimiert, und die Aufreinigungsschemen sind identisch. Zellen aus einer 500 ml-Kultur, hergestellt wie beschrieben in 7, für Tbp1, und in Beispiel 8, für Tbp2, wurden in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 resuspendiert und durch Schallbehandlung (3 × 10 min., 70%-Leistungsstufen-Zyklus) aufgebrochen. Der Extrakt wurde bei 20000 × g während 30 Minuten zentrifugiert und der resultierende Überstand, welcher >95% der löslichen E. coli-Proteine enthielt, wurde verworfen.
  • Das verbleibende Pellet (23, PPT1) wurde ferner in 50 ml 50 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA, extrahiert. Nach Zentrifugation bei 20000 × g während 30 Minuten wurde der Überstand, welcher restliche lösliche Proteine und den Großteil der Membranproteine enthielt, verworfen. Das resultierende Pellet (23, PPT2), welches nach der obenstehenden Extraktion erhalten wurde, enthielt die Einschlusskörperchen. Die Tbp1- und Tbp2-Proteine wurden in 50 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 0,1% SDS und 5 mM DTT, solubilisiert. Nach der Zentrifugation wurde der resultierende Überstand weiter auf einer Superdex 200-Gelfiltrationssäule gereinigt, welche in 50 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 0,1% SDS und 5 mM DTT, äquilibriert worden war. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert, und jene, welche gereinigtes Tbp1 oder Tbp2 enthielten, wurden über Nacht bei 4°C gegen 50 mM Tris, pH 8,0, dialysiert und dann 30 Minuten lang bei 20000 × g zentrifugiert. Das Protein blieb unter diesen Bedingungen löslich, und das gereinigte Tbp1 und Tbp2 wurden bei -20°C aufbewahrt.
  • Die SDS-PAGE-Analyse des Reinigungsverfahrens wird in der 24 gezeigt. Spuren 1, vorgefärbte Molekulargewichts-Proteinmarker (106, 80, 49,5, 32,5, 27,5, 18,5 kDa); Spuren 2, E. coli, Gesamtzelllysate; Spuren 3, solubilisierte Einschlusskörper, Spuren 4, gereinigtes Tbp1 oder Tbp2.
  • Beispiel 12
  • Dieses Beispiel veranschaulicht Immunogenitätsstudien von rekombinantem Tbp1 und Tbp2 in Mäusen.
  • Gruppen von fünf Balb/c-Mäusen erhielten subkutane (s. c.) Injektionen an den Tagen 1, 29 und 43 mit gereinigtem rTbp1 oder rTbp2 (1 μg bis 10 μg), hergestellt wie beschrieben in Beispiel 11, in Gegenwart von AlPO4 (1,5 mg pro Dosis). Blutproben wurden an den Tagen 14, 28, 42 und 56 für die Analyse der Anti-rTbp1- und Anti-rTbp2-Antikörperfiter mittels EIA entnommen. Die Ergebnisse der Immunogenitäts-Untersuchungen sind in der 25 veranschaulicht.
  • Beispiel 13
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Entwicklung von EIAs zur Bestimmung von Anti-rTbp1- und Anti-rTbp2-Antikörpern in Maus-Seren.
  • Anti-rTbp1- und Anti-rTbp2-Antikörperfiter wurden ermittelt, im Wesentlichen wie beschrieben von Panezutti et al. (1993). Mikrotiter-Vertiefungen wurden mit 0,5 μg rTbp1 oder rTbp2, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 11, 16 Stunden lang bei Raumtemperatur beschichtet, und dann mit 0,1% (w/v) BSA in PBS blockiert. Die Seren wurde seriell verdünnt, zu den Vertiefungen gegeben und dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Affinitätsgereinigte F(ab')2-Fragmente von Ziege-Anti-Maus-IgG (Fc-spezifischen) Antikörper, konjugiert an Meerettichperoxidase, wurden als sekundärer Antikörper verwendet. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von Tetramethylbenzidin (TMB/H2O2) entwickelt, und die Extinktion bzw. Absorption wurde bei 450 nm (unter Verwendung von 540 nm als einer Referenzwellenlänge) in einer Flow-Multiskan-MCC-Mikroplatten-Lesevorrichtung gemessen. Der reaktive Titer eines Antiserums wurde als der Kehrwert der Verdünnung definiert, welche konsistent eine zweifache Erhöhung der Extinktion gegenüber derjenigen zeigte, welche mit der Prä-Immun-Serumprobe erhalten wurde.
  • Beispiel 14
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Kreuzreaktivität von Anti-Tbp1-Antiseren, welche durch Immunisierung mit rekombinantem Eagan-Tbp1 hergestellt wurden, mit verschiedenen Stämmen von H. influenzae.
  • Ganzzelllysate von H. influeanzae-Stämmen, herangezogen in BHI-Medien, welche mit NAD und Häm (Harkness et al, 1992) ± EDDA ergänzt worden waren, wurden durch SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembran überführt und mit Meerschweinchen-Anti-Tbp1-Antiseren sondiert, welche gegen gereinigtes rekombinantes Eagan Tbp1 herangezogen worden waren (26). Spur 1 BL21/DE3; Spur 2, SB12 - EDDA; Spur 3, SB12 + EDDA; Spur 4, SB29 - EDDA; Spur 5, SB29 + EDDA; Spur 6, SB33 - EDDA; Spur 7, SB33 + EDDA; Spur 8, Eagan - EDDA; Spur 9, Eagan + EDDA; Spur 10, B. catarrhalis 4223 - EDDA; Spur 11, B. catarrhalis 4223 + EDDA; Spur 12, N. meningitidis 608 - EDDA; Spur 13, N. meningitidis 608 + EDDA, Spur 14, induzierter JB-1476-2-1, welcher rekombinantes Eagan-Tbp1 exprimiert; Spur 5 Molekulargewichtsmarker. Spezifische ~95 kDa große Banden reagierten mit den Anti-Tbp1-Antiseren in den Spuren 3, 4, 5, 7, 8 und 9, entsprechend den H. influenzae-Stämmen SB12, SB29, SB33 und Eagan; ~110 kDa große Banden in den Spuren 10 und 11, entsprechend dem B. catarrhalis-Stamm 4223; und ~80 kDa große Banden in den Spuren 12 und 13, entsprechend N. meningitidis 608.
  • Beispiel 15
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Kreuzreaktivität von Anti-Tbp2-Antiseren, die durch Immunisierung mit rekombinantem Eagan-Tbp2 hergestellt worden waren, mit verschiedenen Stämmen von H. influenzae.
  • Ganzzelllysate von H. influeanzae-Stämmen, welche in BHI-Medien herangezogen worden waren, die ergänzt waren mit NAD und Häm (Harkness et al, 1992) ± EDDA, wurden auf einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembran überführt und mit Meerschweinchen-Anti-Tbp2-Antiseren sondiert, die gegen gereinigtes rekombinantes Eagan-Tbp2 herangezogen worden waren (27). Spur 1, Molekulargewichtsmarker; Spur 2, induzierter JB-1437-4-1, welcher rekombinantes Eagan-Tbp2 exprimiert; Spur 3, SB12 - EDDA; Spur 4, SB12 + EDDA; Spur 5, SB29 - EDDA; Spur 6, SB29 + EDDA; Spur 7, SB30 - EDDA; Spur 8, SB30 + EDDA; Spur 9, SB32 - EDDA; Spur 10, SB33 + EDDA; Spur 11, SB33 + EDDA; Spur 12, PAK - EDDA; Spur 13, PAK + EDDA, Spur 14, Eagan - EDDA; Spur 15 Eagan + EDDA. Spezifische Banden von etwa 60-70 kDa waren mit den Anti-Tbp2-Antiseren in den Spuren 3, 6, 7, 8, 13, 14 und 15 reaktiv, entsprechend den Haemophilus-Stämmen SB12, SB29, SB30, PAK und Eagan.
  • Beispiel 16
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von synthetischen Peptiden, welche konservierten Regionen in Tbp2 und Tbp1 entsprechen.
  • Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Tbp1 und Tbp2 wurden verglichen, wie gezeigt in den 14 bzw. 15. Dieser Vergleich identifizierte Regionen der Aminosäuresequenz-Konservierung innerhalb des oben beschriebenen Transferrin-Rezeptors, und, wie gezeigt in den Tabellen 2 und 3, wurden Peptide synthetisiert, welche einen Abschnitt des Transferrin-Rezeptors enthielten. Eine solche Synthese kann durch Expression von rekombinanten Vektoren, enthaltend Nukleinsäure, welche die Peptide codiert, in einem geeigneten Wirt oder durch standardmäßige Peptidsynthese bewirkt werden.
  • Kurz gesagt, wurden Peptide unter Verwendung eines ABI 430A-Peptid-Synthesizers und optimierter t-Boc-Chemie unter Anwendung der vom Hersteller empfohlenen Bedingungen synthetisiert, und Peptide wurden von dem Harz unter Verwendung von Fluorwasserstoffsäure (HF) abgespalten. Die Peptide wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) auf einer halb-präparativen Vydac C4-Säule (1 × 30 cm) unter Verwendung eines 15 bis 55%-Acetonitril-Gradienten in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), welcher über 40 Minuten hinweg bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute entwickelt wurde, gereinigt. Alle synthetischen Peptide, die in biochemischen und immunologischen Untersuchungen verwendet wurden, waren >95% rein, wie beurteilt durch analytische HPLC. Aminosäure-Zusammensetzungsanalysen wurden auf einem Waters Pico-Tag-System durchgeführt und standen in guter Übereinstimmung mit den theoretischen Zusammensetzungen.
  • Beispiel 17
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von synthetischen Peptiden in Testtieren.
  • Meerschweinchen wurden mit 100 μg Peptid, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 16, emulgiert in Freund'schem vollständigem Adjuvans, am Tag 0 intramuskulär immunisiert, gefolgt von Auffrischungs- bzw. Booster-Dosen am Tag +14 und +28 unter Verwendung derselben Menge an Peptid, welches in Freund'schem unvollständigem Adjuvans emulgiert war. Serumproben wurden am Tag 42+ erhalten, und Antikörpertiter wurden durch Enzyme-Linked Immunosorbent-Assay (ELISA) bestimmt. Kurz gesagt, wurden Mikrotitervertiefungen (Nunc-Immunoplate, Nunc, Dänemark) mit 500 ng von irgendeinem jeweiligen Peptid in 50 μl Beschichtungspuffer (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,6) 16 Stunden lang bei Raumtemperatur beschichtet. Die Platten wurden dann mit 0,1% (w/v) BSA in Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung (PBS) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur geblockt. Die Antiseren wurden seriell verdünnt, zu den Vertiefungen zugegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernung der Antiseren wurden die Platten fünfmal mit PBS, enthaltend 0,1% (w/v) Tween-20 und 0,1% (w/v) BSA, gewaschen. F(ab')2 von Ziege-Anti-Meerschweinchen-IgG-Antikörpern, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA) wurden mit Waschpuffer (1/8000) verdünnt und auf die Mikrotiterplatten gegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten fünfmal mit dem Waschpuffer gewaschen. Die Platten wurden unter Verwendung des Substrats Tetramethylbenzidin (TMB) in H2O2 (ADI, Toronto) entwickelt, die Reaktion wurde mit 1 N H2SO4 gestoppt, und die optische Dichte wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Titretek Multiskan II (Flow Labs., Virginia) gemessen. Zwei irrelevante Peptide von 32 Aminosäureresten wurden als Negativkontrollen in diesen ELISAs eingeschlossen. Die Assays wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, und der reaktive Titer von jedem Antiserum wurde als die Verdünnung definiert, welche konsistent eine zweifache Erhöhung hinsichtlich des Extinktionswertes gegenüber demjenigen zeigte, der aus den Negativkontrollen erhalten wurde. Die in Meerschweinchen herangezogenen Antiseren waren monospezifisch für das zur Immunisierung verwendete Peptid. Die Titer der Seren, erhalten im Anschluss an die Immunisierung, sind in der Tabelle 4 gezeigt.
  • Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen Einzelkopien von jedweden von denjenigen, welche in den Tabellen 2 und 3 gezeigt sind, oder Peptide, welche Mehrfachkopien von Analogen davon enthalten. Ein Peptid kann ferner Mehrfache von unterschiedlichen Peptiden umfassen, ausgewählt aus denjenigen, welche in den Tabellen 2 und 3 gezeigt sind, oder Analoge davon, und geeignete Trägermoleküle einschließen. Es wird bevorzugt, dass die Peptide aus konservierten Regionen verwendet werden, um Antikörper zu entwickeln, weil ein Bindungsassay vom Immun-Typ oder einem anderen Typ dann verwendet werden kann, um mehrere Spezies von Haemophilus zu detektieren. Die Tabellen 2 und 3 stellen daher mehrere andere konservierte Regionen von Transferrin-Rezeptor dar, um andere Peptide zu identifizieren, welche in Diagnose, Immunisierung und medizinischer Behandlung nützlich sind.
  • Beispiel 18
  • Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit von Antiserum, welches herangezogen wurde gegen Peptide, die konservierten Bereichen von Transferrin-Rezeptor entsprechen, zur Erkennung des Transferrin-Rezeptors von Branhamella catarrhalis.
  • Meerschweinchen wurden mit Peptid, welches konservierten Bereichen von Transferrin-Rezeptor entsprach, immunisiert, und erhaltene Antiseren sind im Beispiel 17 beschrieben. Ein Ganzzellextrakt von Branhamella catarrhalis wurde mit dem peptidspezifischen Antiserum, welches spezifisch den Transferrin-Rezeptor aus diesem Bakterium erkannte, immungeblottet. Anti-Peptid-Antiserum aus einem Meerschweinchen, welches mit dem Tbp2-N-Terminus-Peptid und dem Peptid TBP2-25 immunisiert worden war, erkannte spezifisch Tbp2-Protein aus Branhamella catarrhalis und rekombinantes Tbp2, welches von dem Plasmidklon pBHIT2 in E. coli exprimiert worden war. Der Klon pBHIT2 exprimiert eine trunkierte Version von Tbp2, welche an Aminosäure 80 beginnt (d. h. NKKFYSG, SEQ. ID. Nr.: 105). Deshalb kann das Tbp2-Protein aus pBHIT2 nur von Antikörpern erkannt werden, welche gegen das zweite Epitop LEGGFYGP (TBP2-25) herangezogen worden waren. Diese Analyse zeigt, dass Peptide, entsprechend konservierten Sequenzen zwischen Transferrin-Rezeptor, beim Detektieren der meisten, wenn nicht aller, Bakterien, die Transferrin-Rezeptor herstellen, sowie als Komponenten in immunogenen Zusammensetzungen nützlich sind, einschließlich Impfstoffen, um eine Immunantwort gegen Transferrin-Rezeptor hervorzurufen und gegen Krankheiten zu schützen, welche von solchen Bakterien verursacht werden.
  • Die Seren aus diesen Kaninchen wurden durch ELISA gegen ein Peptid, welches die Sequenz LEGGFYGP beinhaltete (SEQ. ID. Nr.: 74), oder gegen H. influenzae-Stamm DL63, Tbp2, getestet. ELISA-Platten wurden mit dem Peptid oder dem Protein beschichtet, und dann mit 5% Magermilch geblockt. Serielle Zweifach-Verdünnungen von Seren in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 0,05% Tween-20 und 1% Trockenmilch wurden auf den Platten zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert, wonach die Platten fünfmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen wurden. Die gewaschenen Platten wurden mit einem Meerrettichperoxidase(HRPO)-konjugiertem Esel-Anti-Kaninchen-IgG 30 Minuten lang bei Raumtemperatur sondiert, und dann fünfmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween-20 gewa schen. HRPO-Substrat wurde zu allen Vertiefungen während 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunklen zugesetzt, und dann wurde die Farbentwicklung durch die Zugabe von 50 μl 1 M Schwefelsäure angehalten. Die Farbe wurde durch Bestimmen der Extinktion bei 450 nm gemessen.
  • Beispiel 19
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Erzeugung von H. influenzae-Stämmen, welche Transferrin-Rezeptor nicht herstellen.
  • Ein 2,55 EcoRI-Fragment des Inserts aus pBHIT1 wurde in die EcoRI-Stelle von pUC4K subkloniert, was zur Entfernung der Tn903-Kanamycinresistenz (kan)-Kassette aus diesem Vektor führte (pUHIT1; 28). Dieser Subklonierungsschritt erleichterte die anschließende Insertion entweder eines HincII- oder PstI-pUC4K-Fragmentes, enthaltend die kan-Kassette, in die HindIII- oder PstI-Stellen von pUHIT1, da Beide einzigartige Stellen in dieser Konstruktion sind, um pUHIT1KFH und pUHIT1KFP herzustellen, 28. Im Anschluss an einen Verdau mit EcoRI zur Entfernung der unterbrochenen Gensequenzen, wurden die Konstrukte in das H. influenzae-Wildtyp-Genom durch Transformation unter Verwendung von M-IV-Medien, wie früher beschrieben (Barcak et al., 1991), eingeführt, und Transformanten wurden auf BHINH-Agar, welcher 20 μg/ml Kanamycin enthielt, selektiert.
  • Beispiel 20
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion von Polioviren, welche ein Epitop eines Transferrin-Rezeptors exprimieren.
  • Ein cDNA-Klon der Basen 1175 bis 2956 des Genoms von Poliovirus-Typ 1, Mahoney-Stamm, (PV1-M) wurde mit den Restriktionsenzymen SauI und HindIII geschnitten. Diese Enzyme schneiden ein Fragment heraus, welches die Basen 2754 bis 2786 enthält, welches die PV1-M-Aminosäuren 1094 bis 1102 codiert, wie gezeigt in der 29. In dieser Patentanmeldung verwenden wir den Vier-Ziffern-Code für Poliovirus-Aminosäuren; zum Beispiel ist 1095 die Aminosäure 95 des Capsid-Proteins VP1. Neue Hybrid-cDNA-Klone, welche sowohl Poliovirusals auch Transferrin-Rezeptor-Aminosäuresequenzen codieren, wurden konstruiert durch Ersetzen des herausgeschnittenen Fragments mit synthetischen Oligonukleotiden, welche Aminosäuren aus H. influenzae Tbp2 codieren. Die neuen Hybrid-cDNA-Klone wurden mit den Restriktionsenzymen NheI und SnaBI geschnitten, welche ein Hybridfragment, einschließlich der Transferrin-Rezeptor-DNA-Sequenzen, von Poliovirus-Base 2471 bis 2956 herausschneiden. Ein cDNA-Klon, zum Beispiel pT7XLD oder pT7CMCB, von dem gesamten Genom von PV1-M wurde mit NheI und SnaBI geschnitten, um ein Fragment von Poliovirus-Base 2471 bis 2956 herauszuschneiden. Dieses wurde dann mit einem Hybridfragment ersetzt, einschließlich der Transferrin-Rezeptor-DNA-Sequenzen, wodurch ein Hybrid-cDNA-Klon des Genoms von PV1-M hergestellt wurde, bei welchem die Basen 2754 bis 2786 ersetzt waren durch Basen, welche eine Hybrid-BC-Schleife codieren, einschließlich der Transferrin-Rezeptor-Aminosäuren, wie gezeigt in 29.
  • Das Plasmid pT7XLD und aus pT7XLD abgeleitete Klone, wie pT7CMCB, enthalten eine Promotor-Sequenz für das Enzym T7-RNA-Polymerase am 5'-Ende der PV1-M-cDNA. RNA-Transkripte der PV1-M-cDNA, einschließlich jeglicher Basen, welche Transferrin-Rezeptor-Aminosäuren codieren, wurden unter Anwendung von T7-RNA-Polymerase hergestellt, wie beschrieben durch van der Werf et al. Eine Transfektion von Vero-Zellen mit diesen RNA-Transkripten produzierte vier lebensfähige Hybridviren, welche als PV1TBP2A, PV1TBP2B, PV1TBP2C und PV1TBP2D bezeichnet wurden. Eine Transfektion mit Transkripten von pT7CMCB ergab einen Transfektions-abgeleiteten Wildtyp-Poliovirus, welcher als PV1XLD bezeichnet wurde (29).
  • Die antigenischen Merkmale von PV1TBP2A, PV1TBP2B, PV1TBP2C und PV1TBP2D sind in der Tabelle 5 gezeigt. Alle wurden durch Meerschweinchen-Antiseren neutralisiert, welche herangezogen worden waren gegen ein Peptid, dass die Sequenz LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr.: 74) beinhaltete, was zeigt, dass die Viren diese Sequenz in einer antigenisch erkennbaren Form exprimierten. Um die Antiseren herzustellen, wurden weibliche Meerschweinchen intramuskulär bzw. IM mit einem 500-μl-Volumen, welches 200 μg Peptid enthielt, formuliert in Aluminiumphosphat (3 mg/ml), immunisiert. Die Tiere wurden an den Tagen 1, 14, 28 und 42 immunisiert und Blutproben wurden an den Tagen 0, 28, 42 und 56 entnommen. Seren stammten aus der Blutprobe vom Tag 56. PV1TBP2A und PV1TBP2B wurden ebenfalls durch Kaninchen-Antiseren neutralisiert, welche herangezogen worden waren gegen H. influenzae-Stamm DL63-Tbp2, was anzeigt, dass mindestens diese zwei Viren die Sequenz in einer Form exprimierten, welche für Antikörper erkennbar war, die gegen das Protein herangezogen worden waren. Alle Viren waren durch Anti-PV1-Seren neutralisierbar, was anzeigt, dass die Änderungen in der Neutralisations-Antigenischen-Stelle I von Polio andere antigenische Stellen auf den Viren nicht signifikant beeinflusst hatten.
  • Beispiel 21
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von Poliovirus-Hybriden zum Induzieren von Hochtiter-Antiseren gegen Tbp2.
  • Kaninchen wurden mit CsCl-gereinigtem PV1TBP2A inokuliert (Kaninchen #40, 41, 42). Es ist anzumerken, dass, obwohl die verwendeten Viren lebendig waren, Poliovirus sich nicht in Kaninchen repliziert, und dass jedwede beobachtete Antwort effektiv die Antwort auf ein inaktiviertes Antigen ist. An Tag 1 wurden Kaninchen mit 1 μg Virus in Freund'schem vollständigen Adjuvans subkutan am Rücken inokuliert, und am Tag 14 erhielten die Kaninchen eine Auffrischungsdosis mit 1 μg Virus in Freund'schem unvollständigen Adjuvans, welches subkutan auf dem Rücken inokuliert wurde. Von den Kaninchen wurden am Tag 0 (Vorab-Blutprobe) und am Tag 27 Blutproben entnommen. Die Dosis an Virus je Inokulation belief sich auf 2,5 × 108 pfu, wobei von ihr aus A260-Werten bestimmt wurde, ungefähr 3,0 × 1011 Virionen zu betragen. Dies ist gleichwertig zu 0,5 pmol Virus oder 30 pmol des Epitops LEGGFYG (SEQ. ID. Nr.: 74), da jedes Virion 60 Kopien des Epitops exprimiert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER BESCHREIBUNG
  • In der Zusammenfassung dieser Beschreibung stellt die vorliegende Erfindung gereinigte und isolierte DNA-Moleküle, welche Transferrin-Rezeptor-Gene enthalten, die Sequenzen dieser Transferrin-Rezeptor-Gene und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen davon bereit. Die Erfindung sieht des Weiteren Peptide vor, welche Bereichen des Transferrin-Rezeptors entsprechen. Die Gene, DNA-Sequenzen, rekombinanten Proteine und Peptide sind nützlich zur Diagnose, Immunisierung und zur Erzeugung von diagnostischen und immunologischen Reagenzien. Impfstoffe, welche auf exprimiertem rekombinanten Tbp1 und/oder Tbp2, Bereichen davon oder aus den bereitgestellten Sequenzen abgeleiteten Peptiden basieren, können zur Prävention von Krankheiten hergestellt werden, welche von bakteriellen Pathogenen verursacht werden, die Transferrin-Rezeptor herstellen. TABELLE 1
    Figure 00460001
    TABELLE 2 VORHERGESAGTE ANTIGENISCHE Tbp1-PEPTIDE
    Figure 00470001
    TABELLE 2 (Fortsetzung)
    Figure 00480001
    • 1. Rest-Nummer aus der Sequenz von Tbp1 von H. influenzae-Typ b-Stamm Eagan (wie gezeigt in 8).
    • 2. Cystein wurde zugefügt, um die Kopplung an ein Trägerprotein, zum Beispiel KLH, zu erleichtern.
    TABELLE 3 VORHERGESAGTE KONSERVIERTE ANTIGENISCHE Tbp2-PEPTIDE
    Figure 00490001
    TABELLE 3 (Fortsetzung)
    Figure 00500001
    • 1. Rest-Nummer aus der Sequenz von Tbp2 von Stamm H. influenzae-Typ B-Eagan (wie gezeigt in 9).
    TABELLE 4 Meerschweinchen-Antikörperantworten auf Tbp1- und Tbp2-Peptide
    Figure 00500002
    Figure 00510001
    TABELLE 6 Peptid-spezifische IgG-Titer von Kaninchen, immunisiert mit PV1TBP2A oder PV1TBP2B
    Figure 00520001
    • a Titer sind der Kehrwert der größten Verdünnung von Seren, welche eine A450 von mindestens dem Zweifachen des Hintergrundwerts ergibt. Der Hintergrundwert war die mittlere A450 von Vertiefungen, die in Abwesenheit von Kaninchenseren geassayt wurden.
    • b Die Titer für Kaninchen 10 und 11 betreffen Seren, die am Tag 42 nach drei Immunisierungen mit PV1 Mahoney abgenommen wurden. Die Kaninchen 10 und 11 wurden wie die Kaninchen 40 bis 45 immunisiert, mit der Ausnahme, dass eine zusätzliche Auffrischungsdosis am Tag 28 verabreicht wurde.
  • Liste der Bezugsstellen
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    • WO 92/17167

Claims (9)

  1. Peptid mit nicht weniger als sieben Aminosäuren und nicht mehr als 150 Aminosäuren und enthaltend eine Aminosäuresequenz, welche unter Bakterien, welche ein Transferrin-Rezeptorprotein, umfassend TBP-2, produzieren, konserviert ist, wobei die konservierte TBP-2-Sequenz folgende ist: LEGGFYG (SEQ. ID. Nr. 85).
  2. Peptid, wie in Anspruch 1 beansprucht und enthaltend eine Aminosäuresequenz, welche wie folgt ist: LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr. 74).
  3. Peptid, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Peptid wie folgt ist: LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr. 74) oder LEGGFYG (SEQ. ID. Nr. 85).
  4. Peptid, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Peptid wie folgt ist: LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK (SEQ. ID. Nr. 50).
  5. Immunogene Zusammensetzung, umfassend als eine aktive Komponente ein Peptid, wie in mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht.
  6. Immunogene Zusammensetzung, wie in Anspruch 5 beansprucht, formuliert als ein Impfstoff für die in vivo-Verabreichung, um gegen Krankheiten zu schützen, die durch bakterielle Pathogene, welche Transferrin-Rezeptorproteine produzieren, verursacht werden.
  7. Immunogene Zusammensetzung, wie in Anspruch 6 beansprucht, formuliert als Mikroteilchen, Kapsel oder Liposomenzusammensetzung.
  8. Immunogene Zusammensetzung, wie in mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7 beansprucht, umfassend eine Vielzahl der aktiven Komponenten, um einen Schutz gegen eine Krankheit bereitzustellen, die durch eine Vielzahl von Spezien von Transferrin-Rezeptorprotein produzierenden Bakterien verursacht wird.
  9. Antiserum oder Antikörper, spezifisch für eine Aminosäuresequenz LEGGFYG (SEQ. ID. Nr. 85), LEGGFYGP (SEQ. ID. Nr. 74) oder LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK (SEQ. ID. Nr. 50).
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