DE60037413T2

DE60037413T2 - Rekombinante adhesin-proteine aus haemophilus influenzae

Info

Publication number: DE60037413T2
Application number: DE60037413T
Authority: DE
Inventors: Sheena M. Aurora LOOSMORE; Yan-Ping Willowdale YANG; Michel H. Willowdale Klein
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2020-03-17
Also published as: JP2004529601A; EP1180119B1; EP1180119A2; DE60037413D1; EP2133359A2; US6335182B1; EP1903055A2; WO2000055191A3; WO2000055191A2; EP1903055A3; AU772007B2; MXPA01009335A; JP2011103893A; AU3268000A; ATE380823T1; JP2008188018A; NZ514606A; NZ530979A; EP2133359A3; CA2364667A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekulargenetik und insbesondere trunkierte Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Proteine.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Haemophilus influenzae ist die Ursache von mehreren ernsten Erkrankungen des Menschen wie z. B. Meningitis, Epiglottitis, Septikämie und Otitis media. Es gibt sechs Serotypen von H. influenzae, die mit a bis f bezeichnet werden, welche durch ihr Kapselpolysaccharid identifiziert werden. H. influenzae Typ b (Hib) war bis zu der Einführung von mehreren Hib-Konjugatimpfstoffen in den 1980ern eine Hauptursache von bakterieller Meningitis (Ref. 1. In der gesamten Anmeldung werden verschiedene Referenzen in Klammern angegeben, um den Stand der Technik, zu welchem diese Erfindung gehört, vollständiger zu beschreiben. Die volle bibliographische Information für jedes Zitat findet man am Ende der Beschreibung, unmittelbar vor den Ansprüchen.)
WO 96/30519 bezieht sich auf Haemophilus Adhäsionsproteine, Nukleinsäuren und abgeleitete Impfstoffe.
Impfstoffe, die auf H. influenzae Typ b-Kapselpolysaccharid, konjugiert mit Diphtherietoxoid (Ref. 2), Tetanustoxoid (Ref. 3 und US-Patent 4,496,538 ) oder Neisseria meningitidis Außenmembranprotein (Ref. 4) basieren, waren bei der Linderung einer von H. influenzae Typ b hervorgerufenen Meningitis wirksam. Die anderen Serotypen von H. influenzae sind mit niedrigen Häufigkeiten mit einer invasiven Erkrankung verbunden, auch wenn es eine Zunahme bei dem Auftreten der Erkrankung, die durch diese Stämme verursacht wird, zu geben scheint, wenn das Auftreten der Hib-Erkrankung abnimmt (Ref. 5; Ref. 6). Nicht eingekapselte oder nicht typisierbare H. influenzae (NTHi) sind ebenfalls für einen weiten Bereich menschlicher Erkrankun gen einschließlich Otitis media, Epiglottitis, Pneumonie und Tracheobronchitis verantwortlich. Das Auftreten der NTHi-induzierten Erkrankung ist durch die Einführung der Hib-Impfstoffe nicht beeinflusst worden (Ref. 7).
Otitis media ist die häufigste Krankheit der frühen Kindheit, wobei 60 bis 70% aller Kinder mit einem Alter von weniger als 2 Jahren zwischen einer und drei Ohreninfektionen erleiden (Ref. 8). Chronische Otitis media ist bei Kindern für Hör-, Sprach- und kognitive Schwächen verantwortlich. H. influenzae-Infektionen machen ca. 30% der Fälle von akuter Otitis media und ca. 60% von chronischer Otitis media aus. Allein in den Vereinigten Staaten kostet die Behandlung von Otitis media zwischen 1 und 2 Milliarden Dollar pro Jahr für Antibiotika und operative Verfahren wie z. B. Tonsillektomien, Adenoidektomien und die Einführung von Tympanostomie-Röhrchen. Es wird geschätzt, dass zusätzliche 30 Milliarden $ pro Jahr für begleitende Therapien wie z. B. Sprachtherapie und spezielle Schulungsklassen ausgegeben werden. Weiterhin werden viele der Erregerorganismen von Otitis media gegen eine Antibiotikabehandlung resistent. Ein wirksamer prophylaktischer Impfstoff gegen Otitis media ist somit wünschenswert.
Während der natürlichen Infektion durch NTHi sind an der Oberfläche exponierte äußere Membranproteine, welche eine Antikörperantwort stimulieren, potentiell wichtige Targets für bakterizide und/oder schützende Antikörper und daher mögliche Impfstoffkandidaten. Eine Familie von Proteinen mit hohem Molekulargewicht (HMW1 und HMW2), die bei der Anhaftung von NTHi an Epithelzellen wichtig sind, ist bei ca. 70 bis 75% der NTHi-Stämme identifiziert worden (Ref. 9; Ref. 10). Von diesen Adhäsinen mit hohem Molekulargewicht ist gezeigt worden, dass sie in dem Chinchillamodell von Otitis media einen gewissen Schutz liefern (Ref. 11). Eine zweite Familie von Adhäsionsproteinen mit hohem Molekulargewicht ist in ca. 25% der NTHi und in eingekapselten H. influenzae-Stämmen identifiziert worden (Ref. 12; Ref. 13, Ref. 14). Das NTHi-Mitglied dieser zweiten Familie wird Haemophilus influenzae Adhäsin oder Hia genannt, und das homologe Protein, das in eingekapselten Stämmen gefunden wird, wird Haemophilus influenzae Oberflächenfibrillenprotein oder Hsf genannt. Das hia-Gen wurde ursprünglich aus einer Expressionsbibliothek kloniert, indem Rekonvaleszentenserum aus einem Otitis media-Patienten verwendet wurde, was anzeigt, dass es ein wichtiges Immunogen während der Erkrankung ist.
Die Prototyp Hia- und Hsf-Proteine zeigen ca. 82% Sequenzähnlichkeit, auch wenn das Hsf-Protein beträchtlich größer ist. Die Proteine umfassen konservierte Amino- und Carboxytermini und mehrere Wiederholungsmotive, wobei Hsf mehr Wiederholungssequenzen als Hia enthält. Ein Protein mit hohem Molekulargewicht (200 kDa) wurde ebenfalls aus Moraxella catarrhalis identifiziert, welches eine gewisse Sequenzhomologie mit den Hsf- und Hia-Proteinen aufweist ( U.S.-Patent Nr. 5,808,024 ).
Da Hia oder Hsf bei eingekapselten Stämmen von Haemophilus influenzae und ca. 20 bis 25% der nicht eingekapselten Stämme konserviert ist und gezeigt wurde, dass dieses ein Adhäsin ist, weist das Protein einen Nutzen bei der Diagnose von und einer Impfung gegen eine Erkrankung, die von H. influenzae oder anderen bakteriellen Pathogenen, die Hia oder ein Protein erzeugen, das in der Lage ist, Antikörper hervorzurufen, die spezifisch mit Hia reaktiv sind, verursacht wird, auf.
Ein Nachteil von Hia zur Verwendung als ein Antigen in der Diagnose, zur Erzeugung von anti-Hia-Antikörpern, die in der Diagnose nützlich sind, und als ein Immunogen bei der Impfung ist die geringe Ausbeute des nativen Proteins aus Haemophilus influenzae-Spezies.
Es wäre vorteilhaft, rekombinantes Hia-Protein zur Verwendung als Antigen, in immunogenen Präparationen einschließlich Impfstoffen, als Träger für andere Immunogene und bei der Erzeugung von diagnostischen Reagenzien bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Bereitstellung von trunkierten rekombinanten H. influenzae Adhäsin(rHia)-Proteinen gerichtet.
In Verbindung mit der Bereitstellung solcher rekombinanten Proteine stellt die vorliegende Erfindung gewisse isolierte und gereinigte Nukleinsäuremoleküle bereit. Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, welches ein N-trunkiertes Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Protein eines Stammes von Haemophilus influenzae codiert, das in Form von Einschlusskörpern exprimiert wird, wobei das N-trunkierte Protein die Fähigkeit aufweist, gegen eine Besiedlung zu schützen, und dieses das N-trunkierte Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Protein des Haemophilus influenzae-Stamms 33 ist, das an der Aminosäure V38 von SEQ ID No: 24 beginnt.
Ein solches Nukleinsäuremolekül kann in einen Vektor eingeschlossen werden, welcher ein Plasmidvektor sein kann.
Unter einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor zum Transformieren eines Wirtes bereitgestellt, welcher ein Nukleinsäuremolekül, welches das N-trunkierte Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Protein codiert, und einen Promotor, der operativ mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden ist, zur Expression des trunkierten Hia-Proteins und gegebenenfalls das cer-Gen von E. coli umfasst. Der Vektor kann ein Plasmidvektor sein, welcher die Identifizierungscharakteristika eines Plasmidvektors aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

DS-2340-2-3 wie in 8A gezeigt; und
DS-2448-17 wie in 9B gezeigt.

Die hierin bereitgestellten Vektoren können einen Replikationsvektor, einschließlich eines Vektors aus Salmonella, BCG, Adenovirus, Pockenvirus, Vaccinia- oder Poliovirus beinhalten.
Jeder der hierin bereitgestellten Vektoren kann eingesetzt werden, um eine geeignete Wirtszelle zur Expression eines schützenden Haemophilus influenzae Adhäsin (Hia)-Proteins eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus, welches in trunkierter Form vorliegt, in dieser zu transformieren. Ein solcher Wirt kann geeigneterweise E. coli sein. Eine solche Expression kann unter der Kontrolle des T7-Promotors stattfinden, und die Expression des rekombinanten Hia aus dem transformierten Wirt kann bewirkt werden, indem in einer induzierenden Konzentration von Lactose oder einem anderen geeigneten Induktionsmittel kultiviert wird.
Ebenfalls bereitgestellt von der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle, die durch den Vektor der vorliegenden Erfindung transformiert ist und ein schützendes N-trunkiertes Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Protein eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus exprimiert.
Weiterhin wird von der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes schützendes N-trunkiertes Hia-Protein bereitgestellt, welches bei der Aminosäure V38 der SEQ ID No: 24 (Haemophilus influenzae Stamm 33) beginnt.
Die rekombinanten N-trunkierten Hia-Proteine, die hierin bereitgestellt werden, sind als Antigene in immunogenen Zusammensetzungen, Träger für andere Immunogene, diagnostische Mittel und bei der Erzeugung von diagnostischen Mitteln nützlich. Die Nukleinsäuremoleküle, welche das N-trunkierte Hia-Protein codieren, sind ebenfalls als Sonden für eine diagnostische Verwendung und ebenfalls in immunogenen Zusammensetzungen nützlich.
Die vorliegende Erfindung stellt unter einem zusätzlichen Aspekt von dieser eine immunogene Zusammensetzung bereit, welche wenigstens eine immunologisch aktive Komponente, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem isolierten und gereinigten Nukleinsäuremolekül, wie es hierin bereitgestellt wird, und einem rekombinanten schützenden N-trunkierten Hia-Protein eines Stammes von Haemophilus, wie es hierin bereitgestellt wird, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger für diese umfasst.
Die hierin bereitgestellten immunogenen Zusammensetzungen können als ein Impfstoff (eine Vakzine) zur in vivo-Verabreichung an einen Wirt formuliert werden, um einen Schutz vor einer Erkrankung, die von H. influenzae verursacht wird, zu bieten. Für einen solchen Zweck können die Zusammensetzungen als eine Mikropartikel-, Kapsel-, ISCOM- oder Liposomenpräparation formuliert werden. Die immunogene Zusammensetzung kann in Kombination mit einem Zielmolekül zur Beförderung zu spezifischen Zellen des Immunsystems oder zu Schleimhautoberflächen bereitgestellt werden.
Die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung (einschließlich Impfstoffen) können weiterhin wenigstens ein anderes immunogenes oder immunstimulierendes Material umfassen, und das immunstimulierende Material kann wenigstens ein Hilfsmittel oder wenigstens ein Zytokin sein. Geeignete Hilfsmittel beinhalten (sind aber nicht beschränkt auf) Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, QS21, Quil A, Derivate und Komponente von diesen, eine ISCOM-Matrix, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, ein Glycolipidanalogon, einen Octadecylester einer Aminosäure, ein Muramyldipeptid, Polyphosphazen, ISCOPREP, DC-Chol, DDBA und ein Lipoprotein und andere Hilfsmittel.
Vorteilhafte Kombinationen von Hilfsmitteln werden in den parallelen U.S.-Patentanmeldungen, Aktenzeichen 08/261,194, angemeldet am 16. Juni 1994, und 08/483,856, angemeldet am 7. Juni 1995, welche der WO 95/34308 entsprechen, die am 21. November 1995 veröffentlicht wurde, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet unter noch einem zusätzlichen Aspekt von dieser ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung eines schützenden N-trunkierten Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Proteins eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus influenzae, welches umfasst:
das Transformieren eines Wirtes, wie z. B. E. coli, mit einem Vektor, welcher ein Nukleinsäuremolekül, das eine N-trunkierte Form des Haemophilus influenzae Adhäsin-Proteins, wie es hierin bereitgestellt wird, codiert, umfasst,
das Wachsenlassen des Wirtes, um das codierte trunkierte Hia zu exprimieren, und
das Isolieren und Reinigen des exprimierten Hia-Proteins.
Das codierte trunkierte Hia kann in Einschlusskörpern exprimiert werden. Der Isolations- und Reinigungsschritt kann bewirkt werden, indem die kultivierten transformierten Zellen aufgebrochen werden, um einen Überstand und die Einschlusskörper, welche das Hia enthalten, zu erzeugen, die Einschlusskörper nach Trennung von dem Überstand solubilisiert werden, um eine Lösung des rekombinanten Hia zu erzeugen, die Lösung des rekombinanten Hia chromatographisch gereinigt wird, so dass sie frei von Zelltrümmern ist, und das gereinigte rekombinante Hia-Protein isoliert wird.
Der Vektor, welcher die Wirtszelle wie z. B. E. coli transformiert, kann den T7-Promotor einschließen, und die E. coli- oder eine andere Wirtszelle kann in der Gegenwart einer induzierenden Menge von Lactose oder eines anderen geeigneten Induktionsmittels kultiviert werden.
Vorzugsweise wird die Isolation und Reinigung des exprimierten Hia bewirkt durch:
das Aufbrechen der kultivierten transformierten Zellen, um einen Überstand und die Einschlusskörper zu erzeugen,
das Solubilisieren der Einschlusskörper, um eine Lösung des rekombinanten Hia zu erzeugen,
das chromatographische Reinigen der Lösung des rekombinanten Hia, so dass sie frei von Zelltrümmern ist, und
das Isolieren des gereinigten rekombinanten Hia-Proteins.
Der Stamm von Haemophilus influenzae besteht aus dem nicht typisierbaren Stamm 33. Die spezifische Nukleinsäuresequenz für das Gen, welches das Hia-Protein aus einem solchen Stamm codiert, wird nachstehend beschrieben.
Die hierin bereitgestellten Nukleinsäuremoleküle sind in diagnostischen Anwendungen nützlich.
Die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung sind in Impfstoffen zur in vivo-Verabreichung nützlich, um vor einer Erkrankung, die durch Haemophilus verursacht wird, zu schützen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird besser verstanden werden aus der folgenden Beschreibung mit Bezug auf die Figuren, in welchen:
1A eine Restriktionskarte für das Plasmid DS-2008-2-3 zeigt, welches den T7-Promotor und das hia-Gen in voller Länge des NTHi-Stamms 11 enthält.
1B die Oligonukleotide zeigt, die verwendet wurden, um das hia-Gen des Stamms 11 mit PCR zu amplifizieren. Sinn-Strang (5038.SL): SEQ ID No: 1, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 2; Gegensinn-Strang (5039.SL): SEQ ID No: 3, komplementärer SEQ ID No: 4, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 5. Die Restriktionsenzymstellen sind: B, BamHI; Bg, BglII; H, HindIII; N, NdeI; Ps, PstI; Sty, StyI. Die anderen Abkürzungen sind: T7p, T7-Promotor; ApR, Ampicillinresistenz.
2 einen Immunoblot der Erkennung des rHia-Proteins in voller Länge durch einen anti-natives Adhäsin mit hohem Molekulargewicht von Moraxella catarrhalis-Antikörper zeigt. Bahn 1, DS-2043-1, nicht induziert; Bahn 2, DS-2043-1, für 4 h induziert; Bahn 3, DS-2043-2, nicht induziert; Bahn 4, DS-2043-2, für 4 h induziert; Bahn 5, Molekulargewichtsmarker. DS-2043-1 und DS-2043-2 sind unabhängige Klone von pT7-hia (11) in BL21 (DE3).
3 die Konstruktion der Plasmide DS-2092-1 und DS-2092-40 zeigt, die Tandemkopien der T7-hia-Genkassette für das hia-Gen des Stamms 11 enthalten. Die Restriktionsenzymstellen sind: B, BamHI; Bg, BglII; H, HindIII; Ps, PstI; Xb, XbaI. Die anderen Abkürzungen sind: CAP, alkalische Kalbsphosphatase; T7p, T7-Promotor; ApR, Ampicillinresistenz.
4 die Stellen der Trunkierung für das Hia-Protein des Stamms 11 (SEQ ID No: 6) zeigt.
5A die Konstruktion von Plasmiden zeigt, welche trunkierte hia-Gene aus dem Stamm 11 exprimieren. Die Restriktionsenzymstellen sind: B, BamHI; Bg, BglII; H, HindIII; N, NdeI; Nhe, NheI; Ps, PstI; R, EcoRI; Sty, StyI; Xb, XbaI. Die anderen Abkürzungen sind: T7p, T7-Promotor; ApR, Ampicillinresistenz; KanR, Kanamycinresistenz.
5B die Oligonukleotide zeigt, die verwendet wurden, um die 5'-Fragmente für die trunkierten Gene mit PCR zu amplifizieren. E21-Trunkierung: Sinn (5524.SL): SEQ ID No: 7, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 8; T33-Trunkierung: Sinn (5525.SL) SEQ ID No: 9, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 10; V38-Trunkierung: Sinn (5526.SL): SEQ ID No: 11, codierte Aminosäuren, SEQ ID No: 12; N52-Trunkierung: Sinn (5527.SL): SEQ ID No: 13, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 14; Gegensinn (5528.SL): SEQ ID No: 15; komplementär SEQ ID No: 16, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 17.
6A die Konstruktion des Plasmids BK-96-2-11 zeigt, welches das V38-hia-Gen aus dem NTHi-Stamm 11 und das E. coli cer-Gen enthält. Die Restriktionsenzymstellen sind: B, BamHI; Bg, BglII; K, KpnI; N, NdeI; P, PstI; R, EcoRI; S, SelI; Sm, SmaI; Sty, StyI; Xb, XbaI; Xho, XhoI. Die anderen Abkürzungen sind: T7p, T7-Promotor; ApR, Ampicillinresistenz; KanR, Kanamycinresistenz; CAP, alkalische Kalbsphosphatase; tt1 Transkriptionsterminator 1 aus trpA; tt2, Transkriptionsterminator 2 aus dem T7-Gen 10.
6B die Oligonukleotide zeigt, die verwendet wurden, um die multiple Klonierungsstelle und die Transkriptionsterminatoren zu konstruieren. "R" und "Ps" zeigen Enden an, die mit EcoRI- oder PstI-Enden überlappen werden aber die Stellen nicht neu erzeugen werden. Oberer Strang (SEQ ID No: 50), unterer Strang (SEQ ID No: 51).
7A die Konstruktion der Plasmide DS-2242-1 und DS 2242-2 zeigt, welche den T7-Promotor und das hia-Gen des NTHi-Stamms 33 in voller Länge, das E. coli cer-Gen und das Kanamycinresistenzgen enthalten. Die Restriktionsenzymstellen sind: A, AlwNI; B, BamHI; Bg, BglII; H, HindIII; K, KpnI; N, NdeI; Ps, PstI; R, EcoRI; S, SalI; Sm, SmaI; Xb, XbaI; Xho, XhoI. Die anderen Abkürzungen sind: T7p, T7-Promotor; ApR, Ampicillinresistenz; KanR, Kanamycinresistenz; tt1 Transkriptionsterminator 1 aus trpA; tt2, Transkriptionsterminator 2 aus dem T7-Gen 10.
7B die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das 5'-Ende des das hia-Gen des Stamms 33 codierenden Strangs (SEQ ID No: 52) zu erzeugen, den komplementären Strang (SEQ ID No: 53) und die codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 54) zeigt.
8A die Konstruktion des Plasmids DS-2340-2-3 zeigt, welches den T7-Promotor und das V38-hia-Gen aus dem Stamms 33, das E. coli cer-Gen und das Kanamycinresistenzgen enthält. Die Restriktionsenzymstellen sind: B, BamHI; Bg, BglII; H, HindIII; N, NdeI; Ps, PstI; R, EcoRI; S, SalI; Sn, SnaBI; Xb, XbaI. Die anderen Abkürzungen sind: T7p, T7-Promotor; ApR, Ampicillinresistenz; KanR, Kanamycinresistenz; tt1 Transkriptionsterminator 1 aus trpA; tt2, Transkriptionsterminator 2 aus dem T7-Gen 10.
8B die Oligonukleotide zeigt, die verwendet wurden, um das 5'-Ende des trunkierten hia-Gens mit PCR zu amplifizieren. Sinn (6286.SL): SEQ ID No: 60, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 61; Gegensinn (6287.SL) SEQ ID No: 18, komplementär SEQ ID No: 19, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 20.
9A und 9B die Konstruktion der Plasmide DS-2447-2 und DS 2448-17 zeigen, welche Tandemkopien der T7-V38-hia(11)- bzw. T7-V38-hia(33)-Gene enthalten. Die Restriktionsenzymstellen sind: B, BamHI; Bg, BglII; H, HindIII; Ps; PstI; R, EcoRI; S, SalI; Xb, XbaI. Die anderen Abkürzungen sind: T7p, T7-Promotor; ApR, Ampicillinresistenz; KanR, Kanamycinresistenz; CAP, alkalische Kalbsphosphatase; tt1 Transkriptionsterminator 1 aus trpA; tt2, Transkriptionsterminator 2 aus dem T7-Gen 10.
10 die Expression von rHia zeigt. Feld A: Bahn 1, rHia (11) in voller Länge, keine Induktion; Bahn 2, rHia (11) in voller Länge; Bahn 3, E21-rHia (11); Bahn 4, T33-rHia (11); Bahn 5, V38-rHia (11); Bahn 6, N52-rHia (11). Feld B: Bahn 1, V38-rHia (11), keine Induktion; Bahn 2, V38-rHia (11); Bahn 3, V38-rHia (11)/cer.
11 ein Reinigungsschema für rHia-Proteine zeigt. Die Abkürzungen sind: SP, Überstand; PPT, Präzipitat; DTT, Dithiothreitol; OG, Octylglucosid; (x) bedeutet verworfen.
12, mit den Feldern A und B, die SDS-PAGE-Analyse von gereinigtem rHia zeigt. Feld A zeigt gereinigtes V38-rHia-Protein aus dem Stamm 11, und Feld B zeigt gereinigtes V38-rHia-Protein aus dem Stamm 33. Bahn 1, Molekulargewichtmarker; Bahn 2, Ganzzelllysat; Bahn 3, Rohextrakt; Bahn 4, gereinigtes rHia-Protein.
13, mit den Feldern A, B und C, die Stabilität von V38-rHia (11) zeigt. Feld A zeigt Proben, die bei 4°C ohne Glycerol gelagert wurden. Feld B zeigt Proben, die bei 4°C in der Gegenwart von 20% Glycerol gelagert wurden. Feld C zeigt Proben, die bei –20°C in der Gegenwart von 20% Glycerol gelagert wurden. Bahn 0 zeigt t₀; die Bahnen 1 bis 8 zeigen Proben, die für 1 bis 8 Wochen gelagert wurden.
14, mit den Feldern A und B, die Immunogenität von V38-rHia (11) oder V38-rHia (33) in CD-1-Mäusen zeigt. Feld A zeigt die Antwort nach einer einzigen Immunisierung, und Feld B zeigt die Antwort einer Primär/Verstärkungs-Immunisierung.
15A und 15B die Immunogenität von V38-rHia (11) in BALG/c-Mäusen und Meerschweinchen zeigen. 15A zeigt die Antikörperantwort in Mäusen, und 15B zeigt die Antwort in Meerschweinchen.
16 das Schutzvermögen von V38-rHia (33) vor einer nasopharyngealen Besiedlung in einem Chinchillamodell darstellt.
17 die Oligonukleotide zeigt, die verwendet wurden, um zusätzliche hia-Gene mit PCR zu amplifizieren. Sinn (5040.SL), SEQ ID No: 21, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 22; Gegensinn (5039. SL), SEQ ID No: 3, komplementär SEQ ID No: 4, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 5.
18 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 23) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 24) des hia-Gens aus dem NTHi-Stamm 33 zeigt.
19 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 25) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 26) des hia-Gens aus dem NTHi-Stamm 32 zeigt.
20 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 27) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 28) des hia-Gens aus dem NTHi-Stamm 29 zeigt.
21 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 29) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 30) des hia-Gens aus dem NTHi-Stamm M4071 zeigt.
22 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 31) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 32) des hia-Gens aus dem NTHi-Stamm K9 zeigt.
23 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 33) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 34) des hia-Gens aus dem NTHi-Stamm K22 zeigt.
24 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 35) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 36) des hia-Gens aus dem Typ c-Stamm API zeigt.
25 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 37) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 38) des hia-Locus aus dem NTHi-Stamm 12 zeigt. Die überstrichenen oder unterstrichenen Sequenzen zeigen Oligonukleotide an, die verwendet wurden, um über die Verbindung der zwei orfs hinweg mit PCR zu amplifizieren. Sinn (6431.SL) SEQ ID No: 39, (6432.SL) SEQ ID No: 40; Gegensinn (6295.SL) SEQ ID No: 41, (6271.SL) SEQ ID No: 42.
26 die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 43) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 44) des hia-Locus aus dem NTHi-Stamm 11 zeigt, wie sie in dem U.S.-Patent Nr. 5,646,259 veröffentlicht ist.
27 die Ausrichtung (das Alignment) des stromaufwärts liegenden ORF aus dem hia-Locus des Stamms 12 (SEQ ID No: 45) mit einem Teil des HI1732-Proteins (SEQ ID No: 46) aus dem H. influenzae Typ b-Stamm Rd zeigt.
28 die Ausrichtung von Aminosäuresequenzen von Hia (SEQ ID No: 24, 26, 28, 34, 30, 44, 32), Hsf (SEQ ID No: 47) und partiellen Sequenzen von Moraxella catarrhalis-Proteinen mit hohem Molekulargewicht (200 kDa) aus den Stämmen 4223 und LES-1 (SEQ ID No: 48, 49) zeigt. Sternchen innerhalb der Sequenzen zeigen Stopp codons an, aber unterhalb der Sequenz zeigten sie eine Sequenzhomologie an. Punkte zeigen identische Reste an. Die Sequenzausrichtungen wurden durch direkten Vergleich der Aminosäuresequenzen der entsprechenden Proteine aufgestellt.
29 die Oligonukleotide zeigt, die verwendet wurden, um das 5'-Ende des hia-Gens an der S44-trunkierten Position mit PCR zu amplifizieren. Sinn (6817.SL) SEQ ID No: 55, codierende Aminosäuren SEQ ID No: 56; Gegensinn (6818.SL) SEQ ID No: 57, komplementär SEQ ID No: 58, codierte Aminosäuren SEQ ID No: 59.
30 die Konstruktion des Plasmids JB-2930-3 zeigt, welches das 544-hia-Gen aus dem NTHi-Stamm 11 und das E. coli cer-Gen und den T7-Promotor enthält. Die Restriktionsenzymstellen sind: B, BamHI; Bg, BglII; K, KpnI; N, NdeI; P, PstI; R, EcoRI; S, SalI; Sm, SmaI; Sty, StyI; Xb, XbaI; Xho, XhoI. Die anderen Abkürzungen sind: T7p, T7-Promotor; ApR, Ampicillinresistenz; KanR, Kanamycinresistenz; CAP, alkalische Kalbsphosphatase; tt1 Transkriptionsterminator 1 aus trpA; tt2, Transkriptionsterminator 2 aus dem T7-Gen 10.
31 die SDS-PAGE-Analyse der Expression von rHia ausgehend von S44 zeigt. Bahn 1, Expression aus dem pET-S44-Vektor zur Zeit 0 (keine Induktion); Bahn 2, Expression aus dem pET-S44-Vektor nach 4 Stunden Induktion; Bahn 3, Expression aus JB-2930-3 nach 4 Stunden Induktion.
32 eine schematische Darstellung der zwei Vektoren, JB-2930-3 und IA-191-3-1, die für die Expressionsstudie des S44-trunkierten rHia verwendet wurden, zeigt.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Da H. influenzae-Stamme geringe Mengen der Hia- und Hsf-Proteine erzeugen, wurde das hia-Gen aus NTHi-Stämmen in einen Expressionsvektor zur Überproduktion des rekombinanten Proteins in E. coli kloniert. Wenn das rekombinante Hia(rHia)-Protein in voller Länge exprimiert wurde, wurde es in relativ geringen Mengen erzeugt. Um zu bestätigen, dass es eine Expression des rekombinanten Proteins gab, wurde ein Immunoblot durchgeführt, welcher einen Antikörper verwendete, der gegen ein Adhäsinprotein mit hohem Molekulargewicht von Moraxella catarrhalis, welches in dem U.S.-Patent Nr. 5,808,024 als 200 kDa identifiziert wurde, hervorgerufen wurde.
Antikörper gegen das gelgereinigte native 200 kDa-Protein erkannten eine spezifische induzierte Bande in der rHia-Proteinprobe. Die Ausbeute an rHia wurde durch ein Erhöhen der Genkopienzahl der T7-hia-Genkassette nicht signifikant verbessert.
Es wurde gezeigt, dass das E. coli cer-Gen Plasmide stabilisiert, welche große Inserts enthalten (Ref. 15), aber die Ausbeute von rHia wurde nicht signifikant verbessert, indem das E. coli cer-Gen zu dem Expressionsvektor hinzugefügt wurde. Jedoch wurde beobachtet, dass die E. coli-Zellen während der Kultivierung verklumpten, was nahe legt, dass es eine Expression an der Oberfläche des Hia-Adhäsinproteins gab. Die apparente Toxizität des rHia-Proteins könnte überwunden werden, wenn es als Einschlusskörper erzeugt würde, und so wurden Trunkierungen an dem 5'-Ende des Gens durchgeführt, um mögliche Signalsequenzen zu entfernen. Diese Modifikation führte zu einer guten Produktion und Ausbeute von trunkiertem rHia, das an der V38-Position begann.
Das V38-trunkierte rHia-Protein und das in voller Länge waren immunogen, und die resultierenden anti-rHia-Antikörper waren in passiven Babyrattenmodellen der Bakterämie aufgrund von H. influenzae Typ a- oder Typ b-Stämmen schützend. Zusätzlich wurde gefunden, dass das trunkierte V38-rHia-Protein gegenüber einer nasopharyngealen Besiedlung in einem aktiven Herausforderungsmodell in Chinchillas teilweise schützend ist. Der Schutz, der von rHia geboten wurde, das von einem NTHi-Stamm abgeleitet ist, vor einer Erkrankung, die durch NTHi und eingekapselte Typ a- oder Typ b-Stämme verursacht wird, zeigt, dass es gemeinsame schützende Epitope geben könnte. Die Klonierung und Sequenzanalyse von zusätzlichen hia-Genen könnte helfen, konservierte Bereiche zu identifizieren. Die N-terminal trunkierten rHia-Proteine und die in voller Länge könnten als Impfstoffkomponenten verwendet werden, um vor einer Haemophilus influenzae-Erkrankung zu schützen.
Der nicht typisierbare Haemophilus-Stamm 33 kann geeigneterweise verwendet werden, um die gereinigten und isolierten Nukleinsäuremoleküle bereitzustellen (welche in der Form von DNA-Molekülen vorliegen können), wie durch Ausführungsfor men der vorliegenden Erfindung beispielhaft dargestellt wird. Ein solcher Stamm ist im Allgemeinen aus Klinikquellen und aus Bakterienkultursammlungen wie z. B. der American Type Culture Collection erhältlich.
In dieser Anmeldung wird der Ausdruck "Hia"-Protein verwendet, um eine Familie von Hia-Proteinen zu definieren, welche jene einschließt, die natürlich auftretende Variationen in ihren Aminosäuresequenzen aufweisen, wie sie in verschiedenen Stämmen von Haemophilus gefunden werden.
Was 1A betrifft, so wird dort eine Restriktionskarte des Plasmids DS-2008-2-3 dargestellt, welches ein hia-Gen in voller Länge aus dem nicht typisierbaren Haemophilus influenzae-Stamm 11, unter dem Einfluss des T7-Promotors, enthält. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID No: 43) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 44) des hia-Gens aus Stamm 11 werden in dem vorstehend erwähnten U.S.-Patent Nr. 5,646,259 beschrieben (und darin als "HA1" identifiziert). Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das hia-Gen ausgehend von dem ATG-Startcodon des Gens von Stamm 11 mit PCR zu amplifizieren, sind in 1B gezeigt.
Was 2 betrifft, so wird dort ein Immunoblot dargestellt, welcher die Erkennung des rHia(11)-Proteins durch einen anti-natives Adhäsin mit hohem Molekulargewicht von Moraxella catarrhalis-Antikörper demonstriert. Das Adhäsin mit hohem Molekulargewicht von M. catarrhalis oder das 200 kDa-Protein, das in dem vorstehend erwähnten U.S.-Patent Nr. 5,808,024 beschrieben wird, weist eine gewisse Sequenzhomologie mit den Hia- und Hsf-Proteinen, insbesondere an dem Carboxyterminus (28), auf.
Was 3 betrifft, so wird dort ein Konstruktionsschema für die Plasmide DS-2092-1 und DS-2092-40 dargestellt, welche Tandemkopien der T7-hia-Genkassetten enthalten, welche das hia-Gen aus dem NTHi-Stamm 11 in voller Länge umfassen. Solche Plasmide, die erhöhte Kopienzahlen von Genen enthalten, weisen oft erhöhte Produktionsspiegel für rekombinante Proteine auf. Jedoch wurde, wie man unten sieht, die niedrige Ausbeute des rekombinanten Hia durch ein Erhöhen der Genkopienzahl nicht signifikant verbessert.
Was 4 betrifft, so wird dort die N-terminale Sequenz des Proteins des NTHi-Stamms 11 und die Position von N-terminal trunkierten Hia-Proteinen dargestellt. Die N-terminale Trunkierung bis zu Position E21 deletiert einen langen hydrophoben Bereich, welcher einen Teil einer Signalsequenz für Hia bilden könnte. Die Deletion bis zu Position T33 beinhaltet einen langen hydrophoben Bereich und folgt einer potentiellen Ala-X-Ala-Signal-Spaltungsstelle. Die Deletion bis zu Position V38 beinhaltet einen langen hydrophoben Bereich und folgt einer potentiellen Ala-X-Ala-Signal-Spaltungsstelle. Das rekombinante Hia-Protein, das bei Position S44 beginnt, beinhaltet einen langen hydrophoben Bereich und folgt einer potentiellen Ala-X-Ala-Signal-Spaltungsstelle. Das rekombinante Hia-Protein, das bei Position N52 beginnt, ahmt den ungefähren Start des verwandten Adhäsins mit hohem Molekulargewicht (200 kDa) aus Moraxella catarrhalis nach, das in dem vorstehend erwähnten U.S.-Patent Nr. 5,808,024 beschrieben wird, wobei das rekombinante Protein überproduziert wird, wenn es an seinem N-Terminus so trunkiert wird, dass es bei V56 beginnt.
Was 5A betrifft, so wird dort das Konstruktionsschema für die Erzeugung der Plasmide DS-2186-1-1, DS-2201-1, DS-2186-2-1 und DS-2168-2-6 dargestellt, welche vier der N-terminal trunkierten rHia-Proteine erzeugen. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um die 5'-Fragmente mit PCR zu amplifizieren, sind in 5B gezeigt. In 30 wird das Konstruktionsschema für die Erzeugung des Plasmids JB-2930-3 dargestellt, welches die S44-Deletion erzeugt. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um die 5'-Fragmente mit PCR zu amplifizieren, sind in 29 gezeigt.
Was 6A betrifft, so wird dort ein Konstruktionsschema für die Erzeugung des Plasmids BK-96-2-11 dargestellt, welches das V38-hia-Gen aus dem NTHi-Stamm 11 wie auch das E. coli cer-Gen enthält, von welchem gezeigt wurde, dass es Plasmide stabilisiert. Von der Einführung des cer-Gens in Plasmide, die toxische Proteine erzeugen, wurde vorhergesagt, dass dieses die Proteinproduktion erhöht. Es wurde eine Änderung in der Morphologie der E. coli-Zellen, welche rHia in voller Länge in der Gegenwart des cer-Gens erzeugten, beobachtet, indem diese verklumpten. Dieses legt nahe, dass es eine verstärkte Expression des Adhäsins an der Oberfläche der Zellen gab, welche die Verklumpung verursachte. Das Expressionsplasmid BK 96-2-11 enthält ebenfalls Transkriptionsterminatoren stromaufwärts und stromab wärts der T7-V38-hia-Genkassette, von denen vorhergesagt wurde, dass sie die Stabilität des Gens erhöhen. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um die multiple Klonierungsstelle und die Transkriptionsterminatoren zu erzeugen, sind in 6B gezeigt.
Was 7A betrifft, so wird dort ein Konstruktionsschema für die Plasmide DS-2242-1 und DS-2242-2 dargestellt, welche ein hia-Gen in voller Länge aus dem nicht typisierbaren Haemophilus influenzae-Stamm 33 unter dem Einfluss des T7-Promotors enthalten. Die Expressionsplasmide enthalten ebenfalls das E. coli cer-Gen und Transkriptionsterminatoren stromaufwärts und stromabwärts der T7-hia(33)-Genkassette. Bei DS-2242-1 sind die Terminatoren auf demselben Strang codiert wie das T7-hia(33)-Gen. Jedoch gab es keinen zu beobachtenden Unterschied bei der Expression von rHia aus den zwei Plasmiden. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das authentische 5'-Ende des Gens aus dem NTHi-Stamm 33 zu konstruieren, sind in 7B gezeigt.
Was 8A betrifft, so ist dort ein Konstruktionsschema für das Plasmid DS-2340-2-3 dargestellt, welches das V38-hia-Gen aus dem NTHi-Stamm 33 wie auch das E. coli cer-Gen enthält. Es sind ebenfalls Transkriptionsterminatoren stromaufwärts und stromabwärts der T7-V38-hia-Genkassette auf demselben Strang lokalisiert. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um das hia-Gen des NTHi-Stamms 33 ausgehend von dem V38-Codon mit PCR zu amplifizieren, sind in 8B gezeigt.
Was 9 betrifft, so ist dort die Konstruktion der Plasmide DS-2447-2 und DS-2448-17 gezeigt, welche Tandemkopien der T7-V38-hia(11)- bzw. T7-V38-hia(33)-Genkassetten enthalten.
Was 10 betrifft, so ist dort in Feld A die Produktion von rHia-Proteinen aus Plasmiden dargestellt, welche hia-Gene aus dem NTHi-Stamm 11 in voller Länge oder trunkiert codieren. Die Produktion von rHia(11)-Protein in voller Länge war sehr gering. Es wurde ebenfalls eine geringe Expression für die E21- und T33-trunkierten rHia-Proteine beobachtet. Jedoch weisen die V38- und N52-trunkierten rHia-Proteine signifikant verbesserte Expressionsspiegel auf. Wie in 10, Feld B, gezeigt ist, scheint die Produktion von V38 rHia (11) verstärkt zu werden, wenn das E. coli cer-Gen zu dem Expressionsplasmid zugefügt wird.
Was 11 betrifft, so wird dort ein Reinigungsschema für rHia-Proteine dargestellt, welche als Einschlusskörper erzeugt werden. Zellen wurden durch Beschallung lysiert, und die Einschlusskörper durch Reihenextraktionen gereinigt. Die Einschlusskörper wurden in Guanidiniumchlorid solubilisiert und Verunreinigungen durch die Zugabe von Polyethylenglycol (PEG) ausgefällt. Die Zugabe von (NH₄)₂SO₄ führte zu der Ausfällung von rHia, und das rohe rHia wurde weiter durch Gelfiltration gereinigt.
Was 12 betrifft, so werden dort die gereinigten V38-rHia-Proteine aus den Stämmen 11 und 33 dargestellt. Die Einschlusskörper sind in Bahn 3 und das endgültige gereinigte Protein in Bahn 4 gezeigt. Die abgeschätzte Reinheit des gereinigten Proteins ist größer als ca. 90%, wie durch SDS-PAGE-Densitometrie bestimmt wurde.
Was 13 betrifft, so ist dort die SDS-PAGE-Analyse der Stabilität von rHia-Proteinen, die wie hierin beschrieben erzeugt wurden, während 8 Wochen Lagerung mit oder ohne Glycerol bei 4°C und mit Glycerol bei –20°C gezeigt. Das Protein ist unter jeder dieser Bedingungen stabil.
Was 14 betrifft, so wird dort die Immunogenität von V38-rHia-Proteinen aus den Stämmen 11 und 33 in CD-1-Mäusen dargestellt. Bei Dosen von 0,3 bis 10 μg gibt es bei jedem Protein nach ein oder zwei Dosen eine starke Immunantwort. Bei diesen Spiegeln gibt es keine offensichtliche Dosisantwort. Ähnliche Ergebnisse wurden in BALG/c-Mäusen (15A) und in Meerschweinchen (15B) beobachtet, was zeigt, dass rHia selbst bei 0,3 μg pro Dosis sehr immunogen war.
Was 16 betrifft, so ist dort der Schutz dargestellt, der von V38-rHia (33) vor einer Besiedlung durch den NTHi-Stamm 33 geboten wird. Wie von Yang et al. (Ref. 20) beschrieben wird, ist ein nasopharyngeales Besiedlungsmodell bei Chinchillas entwickelt worden, um einen Schutz vor diesem frühesten Stadium der Erkrankung festzustellen. Das Modell wurde ursprünglich für NTHi-Stämme eingerichtet, die hmw-Gene exprimieren, und musste für NTHi-Stämme, die hia-Gene exprimieren, angepasst werden. Für den Prototyp des hmw exprimierenden Stamms (NTHi 12) konnten 10² bis 10⁸ cfu verwendet werden, um eine Infektion einzuführen, aber 5 × 10⁸ cfu des NTHi-Stamms 33 wurden benötigt, und selbst bei diesem hohen Spiegel konnte mit dem Prototyp des hia exprimierenden Stamms 11 keine Infektion eingeführt werden. Bei einer Dosis von 100 μg ist es offensichtlich, dass es in der immunisierten Gruppe einen partiellen Schutz gibt, auch wenn es bei einer Dosis von 50 μg keinen Schutz gibt. Ein solcher Schutz vor den frühen Stadien der Erkrankung veranschaulicht den Nutzen der rHia-Adhäsine als Impfstoffantigene.
Was 17 betrifft, so werden dort die Oligonukleotide dargestellt, die verwendet wurden, um zusätzliche Haemophilus influenzae-hia-Gene mit PCR zu amplifizieren. Die Sequenzen basieren auf den konservierten amino- und carboxyterminalen Sequenzen der Hia- und Hsf-Proteine.
Was 18 betrifft, so wird dort die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens des NTHi-Stamms 33 dargestellt. Was 19 betrifft, so wird dort die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens des NTHi-Stamms 32 dargestellt. Was 20 betrifft, so wird dort die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens des NTHi-Stamms 29 dargestellt. Was 21 betrifft, so wird dort die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens des NTHi-Stamms M4071 dargestellt. Was 22 betrifft, so wird dort die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens des NTHi-Stamms K9 dargestellt. Was 23 betrifft, so wird dort die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens des NTHi-Stamms K22 dargestellt. Was 24 betrifft, so wird dort die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens des Haemophilus influenzae Typ c-Stamms API dargestellt. Was 25 betrifft, so werden dort die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Locus aus dem NTHi-Stamm 12 dargestellt. Das PCR-amplifizierte Fragment enthält das 3'-Ende eines Gens, das mit dem HI1733-Gen aus dem Haemophilus influenzae Typ d-Stamm Rd-Genom verwandt ist, verbunden mit dem 3'-Ende eines hia-Gens. Eine Ausrichtung des stromaufwärts liegenden ORF mit dem HI1733-Protein ist in 27 gezeigt.
26 zeigt die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens aus dem NTHi-Stamm 11, wie sie in der vorstehend erwähnten U.S. 5,646,259 veröffentlicht sind.
Was 28 betrifft, so wird dort eine Ausrichtung der abgeleiteten Proteinsequenzen von Hsf, Hia und der partiellen Sequenzen des M. catarrhalis 200 kDa-Proteins dargestellt.
Es ist für einen Fachmann klar ersichtlich, dass die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden bei Anwendungen auf den Gebieten der Impfung, Diagnose, Behandlung einer Haemophilus-Infektion und Erzeugung von immunologischen Mitteln. Eine weitere nicht beschränkende Diskussion solcher Verwendungen wird ferner nachstehend angegeben.
Herstellung eines Impfstoffs und Verwendung
Immunogene Zusammensetzungen, die geeignet sind, um als Impfstoff verwendet zu werden, können aus immunogenen rekombinanten Haemophilus influenzae Adhäsin (rHia)-Proteinen von nicht typisierbaren Haemophilus-Stammen, immunogenen Analogen und Fragmenten von diesen und/oder immunogenen Peptiden, wie sie hierin offenbart sind, hergestellt werden. Der Impfstoff ruft eine Immunantwort hervor, welche Antikörper, einschließlich anti-rHia-Antikörpern und Antikörpern, die opsonisierend oder bakterizid sind, erzeugt.
Immunogene Zusammensetzungen, einschließlich Impfstoffen, können zur Injektion, als flüssige Lösungen oder Emulsionen, hergestellt werden. Das rHia-Protein, immunogene Analoge und Fragmente von diesem und/oder immunogene Peptide können mit pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern gemischt werden, welche mit dem rHia-Protein, immunogenen Fragmenten, Analogen oder immunogenen Peptiden kompatibel sind. Solche Arzneimittelträger können Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder Kombinationen von diesen beinhalten.
Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können weiterhin Hilfssubstanzen wie z. B. Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-puffernde Mittel oder Hilfsmittel, um die Wirksamkeit der Impfstoffe zu erhöhen, enthalten.
Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können parenteral, durch subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Alternativ können die immunogenen Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurden, in einer Weise formuliert und befördert werden, dass sie eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorrufen. So können die immunogenen Zusammensetzungen beispielsweise über den nasalen oder oralen (intragastrischen) Weg an Schleimhautoberflächen verabreicht werden.
Die immunogene Zusammensetzung kann in Kombination mit einem Zielmolekül zur Beförderung zu spezifischen Zellen des Immunsystems oder zu Schleimhautoberflächen bereitgestellt werden. Einige solcher Zielmoleküle beinhalten Vitamin B12 und Fragmente von bakteriellen Toxinen, wie in der WO 92/17167 (Biotech Australia Pty. Ltd.) beschrieben wird, und monoklonale Antikörper, wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,194,254 (Barber et al.) beschrieben wird.
Alternativ können andere Arten der Verabreichung, einschließlich Suppositorien und oraler Formulierungen, wünschenswert sein. Für Suppositorien können Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkylenglycole oder Triglyceride einschließen. Orale Formulierungen können normalerweise eingesetzte Träger (incipients) wie z. B. Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat von pharmazeutischer Güte einschließen. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, verzögert freisetzenden Formulierungen oder Pulvern an und enthalten ca. 1 bis 95% des rHia-Proteins, der Fragmentanalogen und/oder Peptide.
Die Impfstoffe können in einer Weise verabreicht werden, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam, schützend und immunogen sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt, einschließlich z. B. der Kapazität des Immunsystems des Individuums ab, Antikörper zu synthetisieren, und wenn nötig, eine zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen. Die genauen Mengen des aktiven Bestandteils, die ver abreicht werden müssen, hängen von der Beurteilung des praktizierenden Arztes ab. Jedoch sind geeignete Dosisbereiche von einem Fachmann leicht zu bestimmen und können in der Größenordnung von Mikrogramm des rHia, der Analogen und Fragmente von diesem und/oder Peptide liegen. Geeignete Regimes zur Primärverabreichung und für Verstärkungsdosen sind ebenfalls variabel, können aber eine Primärverabreichung, gefolgt von anschließenden Verabreichungen, beinhalten. Die Dosis des Impfstoffs kann ebenfalls von dem Weg der Verabreichung abhängen und wird entsprechend der Größe des Wirtes variieren.
Die Nukleinsäuremoleküle, welche die rHia-Proteine von nicht typisierbaren Haemophilus codieren, können ebenfalls direkt zur Immunisierung durch Verabreichung der DNA direkt, beispielsweise durch Injektion zur genetischen Immunisierung oder durch Konstruieren eines Lebendvektors wie z. B. Salmonella, BCG, Adenovirus, Pockenvirus, Vaccinia- oder Poliovirus, welche das Nukleinsäuremolekül enthalten, verwendet werden. Eine Diskussion von gewissen Lebendvektoren, die verwendet worden sind, um heterologe Antigene in das Immunsystem zu tragen, ist beispielsweise in O'Hagen (1992) (Ref. 16) enthalten. Prozesse für die direkte Injektion der DNA in Testsubjekte zur genetischen Immunisierung werden z. B. in Ulmer et al. 1993 (Ref. 17) beschrieben.
Die Immunogenität kann signifikant verbessert werden, wenn die Antigene zusammen mit Hilfsmitteln verabreicht werden, die gewöhnlich als eine 0,05 bis 1,0 Prozent-Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung verwendet werden. Hilfsmittel verstärken die Immunogenität eines Antigens, sind aber nicht notwendigerweise selbst immunogen. Hilfsmittel können wirken, indem sie das Antigen lokal nahe der Verabreichungsstelle zurückhalten, um eine Depotwirkung zu erzeugen, welche eine langsame, verzögerte Freisetzung des Antigens an Zellen des Immunsystems erleichtert. Hilfsmittel können ebenfalls Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot hinziehen und solche Zellen stimulieren, um Immunantworten hervorzurufen.
Immunstimulatorische Mittel oder Hilfsmittel sind über viele Jahre verwendet worden, um die Immunantworten eines Wirts auf beispielsweise Impfstoffe zu verbessern. Intrinsische Hilfsmittel wie z. B. Lipopolysaccharide sind normalerweise die Komponenten von abgetöteten oder abgeschwächten Bakterien, die als Impfstoffe verwen det werden. Extrinsische Hilfsmittel sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht kovalent mit Antigenen verknüpft sind und formuliert sind, um die Immunantworten eines Wirts zu verstärken. So wurden Hilfsmittel identifiziert, welche die Immunantwort auf Antigene, die parenteral gegeben werden, verstärken. Einige dieser Hilfsmittel sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, was diese zur Verwendung in Menschen und vielen Tieren ungeeignet macht. In der Tat werden routinemäßig nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (zusammen üblicherweise als Alaun bezeichnet) als Hilfsmittel in Human- und Veterinärimpfstoffen verwendet. Die Effizienz von Alaun bei der Verstärkung von Antikörperantworten auf Diphterie- und Tetanustoxoide ist gut etabliert.
Ein weiter Bereich von extrinsischen Hilfsmitteln kann starke Immunantworten auf Antigene hervorrufen. Diese beinhalten die spezifischen Hilfsmittel, die oben detailliert angegeben sind, wie auch Saponine, die mit Membranproteinantigenen komplexiert sind (immunstimulierende Komplexe), pluronische Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mycobakterien und Mineralöl, Freund's vollständiges Adjuvans, bakterielle Produkte wie z. B. Muramyldipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS), wie auch Lipid A und Liposomen.
Um effizient humorale Immunantworten (HIR) und eine zellvermittelte Immunität (CMI) zu induzieren, werden Immunogene in Hilfsmitteln emulgiert. Viele Hilfsmittel sind toxisch, induzieren Granulome, akute und chronische Entzündungen (Freund's vollständiges Adjuvans, FCA), Zytolyse (Saponine und pluronische Polymere) und Pyrogenizität, Arthritis und Uveitis anterior (LPS und MDP). Obwohl FCA ein ausgezeichnetes Hilfsmittel ist und in der Forschung weithin verwendet wird, ist es zur Verwendung in Human- oder Veterinärimpfstoffen aufgrund seiner Toxizität nicht zugelassen.
Wünschenswerte Charakteristika von idealen Hilfsmitteln beinhalten:

(1) das Fehlen von Toxizität;
(2) die Fähigkeit, eine lang andauernde Immunantwort zu stimulieren;
(3) die Einfachheit der Herstellung und die Stabilität bei einer Langzeitlagerung;
(4) die Fähigkeit, sowohl CMI als auch HIR auf Antigene, die wenn nötig über verschiedene Wege verabreicht werden, hervorzurufen;
(5) die Synergie mit anderen Hilfsmitteln;
(6) die Fähigkeit, selektiv mit Populationen antigenpräsentierender Zellen (APC) wechselzuwirken;
(7) die Fähigkeit, spezifisch geeignete T_H1- oder T_H2-zellspezifische Immunantworten hervorzurufen; und
(8) die Fähigkeit, die Spiegel geeigneter Antikörperisotypen (z. B. IgA) gegen Antigene selektiv zu erhöhen.

Das U.S.-Patent Nr. 4,855,283 , das für Lockhoff et al. am B. August 1989 erteilt wurde, lehrt Glycolipidanaloge einschließlich N-Glycosylamiden, N-Glycosylharnstoffen und N-Glycosylcarbamaten, welche jeweils in dem Zuckerrest durch eine Aminosäure substituiert sind, als Immunmodulatoren oder Hilfsmittel. So berichteten Lockhoff et al. 1991 (Ref. 18), dass N-Glycolipidanaloge, die strukturelle Ähnlichkeiten mit den natürlich vorkommenden Glycolipiden, wie z. B. Glycosphingolipiden und Glycoglycerolipiden, zeigen, in der Lage sind, sowohl bei Herpes simplex-Virus-Impfstoff als auch Pseudorabies-Virus-Impfstoff starke Immunantworten hervorzurufen. Einige Glycolipide wurden aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren, die direkt mit den Zuckern durch das anomere Kohlenstoffatom verknüpft sind, synthetisiert, um die Funktionen der natürlich vorkommenden Lipidreste nachzuahmen.
Das U.S.-Patent Nr. 4,258,029 (ehrt, dass Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH) als ein Hilfsmittel fungiert, wenn es mit Tetanustoxoid und formalininaktiviertem Typ I, II und III Poliomyelitisvirus-Impfstoff komplexiert wird. Ebenfalls berichteten Nixon-George et al. 1990 (Ref. 19), dass Octadecylester von aromatischen Aminosäuren, die mit einem rekombinanten Hepatitis B-Oberflächenantigen komplexiert wurden, die Immunantworten eines Wirts auf Hepatitis B-Virus verstärkten.
Immuntests
Das rHia-Protein eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus, Analoge und Fragmente von diesem sind nützlich als Immunogene, als Antigene in Immuntests, einschließlich enzymverknüpften Immunsorbenztests (ELISA), RIAs und anderen nicht enzymverknüpften Antikörperbindungstests oder Prozeduren, die im Stand der Technik zum Nachweis von antibakteriellen, Haemophilus- und/oder Hia-Antikörpern bekannt sind. In ELISA-Tests wird das Hia-Protein, Analoge und Fragmente, auf einer ausgewählten Oberfläche immobilisiert, beispielsweise einer Oberfläche, die in der Lage ist, Proteine oder Peptide zu binden, wie beispielsweise den Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach einem Waschen, um unvollständig adsorbiertes Hia-Protein, Analoge und/oder Fragmente zu entfernen, kann ein nicht spezifisches Protein, wie z. B. eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) oder Casein, von dem bekannt ist, dass es in Bezug auf die Testprobe als Antigen neutral ist, an die ausgewählte Oberfläche gebunden werden. Dieses ermöglicht eine Blockierung der nicht spezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und verringert somit den Hintergrund, der durch nicht spezifische Bindungen von Antiseren an die Oberfläche verursacht wird.
Die immobilisierende Oberfläche wird dann mit einer zu testenden Probe, wie z. B. klinischen oder biologischen Materialien, in einer Weise in Kontakt gebracht, die für eine Immunkomplex(Antigen/Antikörper)-Bildung förderlich ist. Dieses kann das Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln wie z. B. BSA, Rindergammaglobulin (BGG) und/oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)/Tween einschließen. Die Probe wird dann für ca. 2 bis ca. 4 Stunden bei Temperaturen wie beispielsweise in der Größenordnung von ca. 25 bis ca. 37°C inkubieren gelassen. Nach der Inkubation wird die mit der Probe in Kontakt gebrachte Oberfläche gewaschen, um nicht immunkomplexiertes Material zu entfernen. Der Waschvorgang kann ein Waschen mit einer Lösung wie z. B. PBS/Tween oder einem Boratpuffer einschließen.
Nach der Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und dem gebundenen Hia-Protein, Analogen und/oder Fragmenten, und einer anschließenden Wäsche kann das Auftreten und sogar die Menge der Immunkomplexbildung bestimmt werden, indem der Immunkomplex einem zweiten Antikörper mit Spezifität für den ersten Antikörper ausgesetzt wird. Wenn die Testprobe menschlichen Ursprungs ist, ist der zweite Antikörper ein Antikörper mit Spezifität für menschliche Immunglobuline und im Allgemeinen IgG. Um Mittel zum Nachweis bereitzustellen, kann der zweite Antikörper eine assoziierte Aktivität wie beispielsweise eine enzymatische Aktivität aufweisen, die z. B. eine Farbentwicklung bei Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat erzeugen wird. Eine Quantifizierung kann dann erreicht werden, indem das Ausmaß der Farberzeugung gemessen wird, indem beispielsweise ein Spektrophotometer für sichtbare Spektren verwendet wird.
Verwendung von Sequenzen als Hybridisierungssonden
Die hierin beschriebenen Nukleotidsequenzen, welche die neu isolierten und charakterisierten Sequenzen der hia-Gene umfassen, erlauben die Identifizierung und Klonierung der hia-Gene aus anderen nicht typisierbaren Stämmen von Haemophilus.
Die Nukleotidsequenzen, welche die Sequenz der hierin beschriebenen hia-Gene umfassen, sind aufgrund ihrer Fähigkeit, selektiv Doppelstrangmoleküle mit komplementären Strängen anderer hia-Gene zu bilden, nützlich. Abhängig von der Anwendung kann eine Vielzahl von Hybridisierungsbedingungen eingesetzt werden, um variierende Grade an Selektivität der Sonde gegenüber den anderen hia-Genen in anderen Stämmen eines nicht typisierbaren Haemophilus zu erreichen. Für einen hohen Grad an Selektivität werden relativ stringente Bedingungen verwendet, um die Doppelstränge zu bilden, wie z. B. Bedingungen mit wenig Salz und/oder hoher Temperatur, wie sie beispielsweise durch 0,02 M bis 0,15 M NaCl bei Temperaturen zwischen ca. 50°C bis 70°C bereitgestellt werden. Für einige Anwendungen werden weniger stringente Hybridisierungsbedingungen benötigt, wie z. B. 0,15 M bis 0,9 M Salz, bei Temperaturen, die von zwischen 20°C bis 55°C reichen. Die Hybridisierungsbedingungen können ebenfalls durch die Zugabe von steigenden Mengen an Formamid, um den Hybriddoppelstrang zu destabilisieren, stringenter gemacht werden. So können die besonderen Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden und werden im Allgemeinen ein Verfahren der Wahl sein, das von den gewünschten Ergebnissen abhängt. Im Allgemeinen sind geeignete Hybridisierungstemperaturen in der Gegenwart von 50% Formamid und 0,15 M NaCl: 42°C für ein hia-Gen, welches zu ca. 95 bis 100% homolog zu dem Zielnukleinsäurefragment ist, 37°C für ca. 90 bis 95% Homologie und 32°C für ca. 85 bis 90% Homologie.
In einem klinischen diagnostischen Beispiel können die Nukleinsäuresequenzen der hia-Gene in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie z. B. einer Markierung, zur Bestimmung der Hybridisierung verwendet werden. Eine breite Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln ist im Stand der Technik bekannt, einschließlich radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, wie z. B. Avidin/Biotin, welche in der Lage sind, ein nachweisbares Signal zu liefern. Bei einigen diagnostischen Ausführungsformen kann eine Enzymmarkierung wie z. B. Uresse, alkalische Phosphatase oder Peroxidase an Stelle einer radioaktiven Markierung verwendet werden. In dem Fall von Enzymmarkierungen sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, welche eingesetzt werden können, um ein Mittel bereitzustellen, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um eine spezifische Hybridisierung mit Proben, die his-Gensequenzen enthalten, zu identifizieren.
Die Nukleinsäuresequenzen von his-Genen sind als Hybridisierungssonden bei Lösungshybridisierungen und bei Beispielen, die Festphasenprozeduren einsetzen, nützlich. Bei Beispielen, an denen Festphasenprozeduren beteiligt sind, wird die Test-DNA (oder RNA) aus Proben, wie z. B. klinischen Proben, einschließlich Exudaten, Körperflüssigkeiten (z. B. Serum, Amnionflüssigkeit, Mittelohreffusion, Sputum, Bronchioalveolarspülungsflüssigkeit) oder sogar Geweben, auf einer ausgewählten Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder in anderer Weise befestigt. Die befestigte, einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden, welche die Nukleinsäuresequenzen der hia-Gene oder von Fragmenten von diesen umfassen, unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die ausgewählten Bedingungen werden von den besonderen Umständen abhängen, die auf den benötigten bestimmten Kriterien basieren, die z. B. von dem G+C-Gehalt, dem Typ der Zielnukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde usw. abhängen. Nach dem Waschen der Hybridisierungsoberfläche, um so nicht spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die spezifische Hybridisierung mit Hilfe der Markierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert. Ein Beispiel wählt Nukleinsäuresequenzteile aus, welche bei den Spezies von Haemophilus konserviert sind. Die ausgewählte Sonde kann wenigstens 18 bp in der Länge aufweisen und kann in dem Bereich von 30 bis 90 bp Länge liegen.
Expression der Haemophilus influenzae Adhäsin-Gene
Plasmidvektoren, welche Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, welche von Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, können zur Expression der hia-Gene in Expressionssystemen verwendet werden. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikationsstelle wie auch markierende Sequenzen, welche in der Lage sind, in transformierten Zellen eine phänotypische Selektion bereitzustellen. Beispielsweise kann E. coli unter Verwendung von pBR322 transformiert werden, welches Gene für eine Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält und somit ein leichtes Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen bereitstellt. Das pBR322-Plasmid, oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder ein Phage, muss ebenfalls Promotoren enthalten oder modifiziert werden, um diese zu enthalten, welche von der Wirtszelle zur Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können.
Zusätzlich können Phagenvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die mit dem Wirt kompatibel sind, als ein transformierender Vektor in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Beispielsweise kann der Phage in Lambda GEM^TM-11 benutzt werden, um rekombinante Phagenvektoren zu erzeugen, welche verwendet werden können, um Wirtszellen wie z. B. E. coli LE392 zu transformieren.
Promotoren, die üblicherweise bei der Konstruktion rekombinanter DNA verwendet werden, beinhalten das β-Lactamase-(Penicillinase) und Lactosepromotorsystem und andere mikrobielle Promotoren wie z. B. das T7-Promotorsystem, das hierin in bevorzugten Ausführungsformen eingesetzt wird ( U.S.-Patent 4,952,496 ). Details bezüglich der Nukleotidsequenzen von Promotoren sind bekannt, was einer Fachkraft ermöglicht, diese funktional mit Genen zu verbinden. Der verwendete besondere Promotor wird im Allgemeinen eine Frage der Wahl sein, die von den gewünschten Ergebnissen abhängt. Wirte, die zur Expression des Hia-Proteins und immunologischer Fragmente oder Analoga von diesem geeignet sind, beinhalten E. coli, Bordetella-Spezies, Bacillus-Spezies, Haemophilus, Pilze, Hefe, oder es kann das Baculovirus-Expressionssystem verwendet werden. E. coli ist der bevorzugte Wirt, welcher hierin verwendet wird.
Hia-Proteine können durch rekombinante Verfahren erzeugt werden, insbesondere wenn das natürlich vorkommende Hia-Protein, wie es aus einer Kultur einer Spezies von Haemophilus gereinigt wird, Spurenmengen von toxischen Materialien oder andere Verunreinigungen beinhalten könnte. Dieses Problem kann vermieden werden, indem rekombinant erzeugtes Hia-Protein in heterologen Systemen verwendet wird, welches aus dem Wirt in einer Weise isoliert werden kann, dass Verunreinigungen in den gereinigten Materialien minimiert werden, indem speziell die hierin beschriebenen Konstrukte eingesetzt werden.
BIOLOGISCHE HINTERLEGUNGEN
Ein Vektor, welcher eine Nukleinsäure enthält, die für ein Protein mit hohem Molekulargewicht eines nicht typisierbaren Stammes von Haemophilus codiert, welches hierin beschrieben und auf welches hierin Bezug genommen wird, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), welche an dem University Boulevard, 10801 Manassas, Virginia 20110-2209, USA gelegen ist, gemäß dem Budapester Vertrag und vor der Einreichung dieser Anmeldung hinterlegt. Proben des hinterlegten Vektors werden der Öffentlichkeit zugänglich werden, und alle Beschränkungen, die für den Zugang zu den Hinterlegungen auferlegt wurden, werden bei Erteilung eines Patents auf der Basis dieser U.S.-Patentanmeldung entfernt werden. Zusätzlich wird die Hinterlegung ausgetauscht werden, wenn lebensfähige Proben von der Hinterlegungsstelle nicht abgegeben werden können. Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung soll im Umfang nicht durch die hinterlegten biologischen Materialien eingeschränkt werden, da die hinterlegte Ausführungsform nur als eine Veranschaulichung der Erfindung gedacht ist. Zusammenfassung der Hinterlegung

Plasmid ATCC Hinterlegungsdatum

BK-96-2-11 203771 11. Februar 1999
BEISPIELE
Die obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele werden lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben und sind nicht gedacht, um den Umfang der Erfindung zu beschränken. Änderungen in der Form und Austausch durch Äquivalente sind beabsichtigt, wie es die Umstände nahe legen können oder als zweckdienlich erscheinen lassen. Auch wenn hierin spezifische Ausdrücke eingesetzt wurden, sind solche Ausdrücke in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken der Beschränkung gedacht.
Von Verfahren der molekularen Genetik, Proteinbiochemie, Immunologie und Fermentationstechnologie, die in dieser Offenbarung und diesen Beispielen verwendet werden, aber nicht explizit beschrieben werden, wird in der wissenschaftlichen Literatur reichlich berichtet, und diese liegen ganz innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des Plasmids DS-2008-2-3, welches rHia-Proteine in voller Länge aus dem NTHi-Stamm 11 exprimiert.
Chromosomale DNA wurde aus dem NTHi-Stamm 11 gereinigt, und das hia-Gen in voller Länge wurde unter Verwendung der Oligonukleotide (5038.SL und 5039.SL), die in 1B beschrieben werden, mit PCR amplifiziert. Eine NdeI-Stelle wurde an dem 5'-Ende des Gens gentechnisch eingeführt, und eine BamHI-Stelle wurde an dem 3'-Ende zur Klonierung in den pT7-7-Expressionsvektor (Ref. 21) gentechnisch eingeführt. Das amplifizierte Fragment wurde mit NdeI/BamHI verdaut und in pT7-7 kloniert, welcher mit denselben Enzymen verdaut worden war. Das Plasmid DS-2008-2-3 enthält ein hia-Gen aus Stamm 11 mit 3,4 kb stromabwärts des T7-Promotors (1A). Das Plasmid wurde verwendet, um rekombinantes Hia zu exprimieren (Beispiel 9 unten).
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Erkennung von rHia durch einen anti-natives Adhäsin mit hohem Molekulargewicht aus Moraxella catarrhalis-Antikörper.
Es gibt eine gewisse Sequenzkonservierung, die zwischen den Haemophilus influenzae-Hia-Proteinen und einem Adhäsin mit hohem Molekulargewicht aus Moraxella catarrhalis, das in dem vorstehend erwähnten U.S.-Patent Nr. 5,808,024 als das M. catarrhalis 200 kDa-Protein identifiziert wurde, beobachtet wurde (28). Das native M. catarrhalis 200 kDa-Protein wurde wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,808,024 beschrieben gelgereinigt, und anti-natives 200 kDa-Antikörper aus Meerschweinchen wurde erzeugt. Das T7-hia-Gen wurde aus dem Plasmid DS-2008-2-3 exprimiert, und die Zellkultur, welche das rHia-Protein enthielt, wurde auf eine Nitrocellulosemembran elektrogeblottet. Eine Immunoblotanalyse unter Verwendung des anti-natives 200 kDa-Antikörpers zeigte, dass der Antikörper das rHia-Protein erkannte, wie man in 2 sieht.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion der Plasmide DS-2092-1 und DS-2092-40, welche Tandemkopien der T7-hia(11)-Genkassetten enthalten.
Um die Produktion von rekombinantem Hia-Protein in voller Länge zu verbessern, wurden Tandemkopien der T7-hia-Genkassette, welche das hia-Gen von Stamm 11 enthielt (Beispiel 1), in einen einzigen Vektor eingeführt. Das Plasmid DS-2008-2-3 wurde mit BglII linearisiert und dephosphoryliert. Das Plasmid DS-2008-2-3 wurde ebenfalls mit BglII und BamHI verdaut, um die T7-hia-Genkassette auszuschneiden. Das T7-hia-Fragment wurde in den linearisierten Vektor ligiert, um das Plasmid DS-2092-1, welches zwei Kopien des T7-hia-Gens in einer Gegenuhrzeigersinn-Orientierung (a, a) enthält, und das Plasmid DS-2092-40, welches Tandemkopien in entgegengesetzten Orientierungen (a, c) enthält, zu erzeugen (3). Es gab keine offensichtliche Verbesserung bei der Expression von rHia bei irgendeinem Konstrukt (siehe Beispiel 9 unten).
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, welche trunkierte hia-Gene aus Stamm 11 exprimieren.
Die Produktion des rHia-Proteins aus einzelnen oder Tandemkopien der T7-hia-Genkassette war sehr gering, und das Protein schien für E. coli toxisch zu sein (wie unten in Beispiel 9 beschrieben wird). Da H. influenzae Hia ein an der Oberfläche exponiertes Adhäsin-Molekül ist, muss es entweder eine Signalsequenz oder ein akzessorisches Protein(e) zur Sekretion benutzen, es sind aber keine bekannten akzessorischen Gene daran beteiligt. Wenn die Signalsequenz zur Expression des rekombinanten Proteins in E. coli entfernt würde, könnte das rHia in Form von Einschlusskörpern exprimiert werden und die toxische Wirkung verringert werden. Eine mutmaßliche Signalsequenz und Spaltungsstellen wurden identifiziert, und vier Konstrukte, die N-terminal trunkierte Hia-Proteine exprimierten, wurden entworfen (4). Es gibt eine einmalige StyI-Stelle in dem hia-Gen des Stamms 11, ca. 500 bp von dem Startcodon entfernt. Das Plasmid DS-2008-2-3 wurde mit NdeI und StyI verdaut und das Vektorfragment mit 5,7 kb gereinigt (5A). PCR-Primer wurden entworfen, um ausgehend von der Trunkierungsstelle bis zu der StyI-Stelle zu amplifizieren, und eine einmalige NheI-Stelle wurde in den Gegensinn-Primer eingeführt, um auf trunkierte Klone zu screenen (5B). Die amplifizierten Fragmente wurden zur leichteren Handhabung in pCRII subkloniert, was die Plasmide DS-2153R-1-2 (E21), DS-2165-4-8 (T33), DS-2153-3-5 (V38) und DS-2153-4-4 (N52) erzeugte. Die pCRII-hia-Plasmide wurden mit NdeI und StyI verdaut und die Fragmente mit dem Vektorstück aus DS-2008-2-3 ligiert. Die Plasmide DS-2186-1-1 (E21), DS-2201-1 (T33), DS-2186-2-1 (V38) und DS-2168-2-6 (N52) wurden erzeugt, welche den T7-Promotor und trunkierte hia-Gene enthielten, wie in Klammern angegeben ist. Diese Plasmide wurden verwendet, um rekombinantes Hia zu exprimieren (siehe Beispiel 9 unten).
Beispiel 5
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des Plasmids BK-96-2-11, welches die T7-V38-hia(11)-Kassette, das E. coli cer-Gen und das Kanamycinresistenzgen enthält.
Das Plasmid DS-1843-2 ist ein auf pBR328 basierendes Plasmid, in welches eine multiple Klonierungsstelle und zwei Transkriptionsterminatoren auf Oligonukleotiden zwischen den EcoRI- und PstI-Stellen eingeführt wurden, wodurch sowohl das Chloramphenicol- als auch das Ampicillinresistenzgen zerstört wurde (6B). Das Kanamycinresistenzgen aus pUC-4K wurde an der SalI-Stelle eingeführt, um das Plasmid DS-2147-1 zu erzeugen, welches kanamycinresistent und tetracyclinempfindlich ist. Das Plasmid DS-2224-1-4 ist ein pUC-Plasmid, welches ein synthetisches E. coli cer-Gen enthält (Ref. 15), das aus Oligonukleotiden konstruiert wurde und durch BamHI-Stellen flankiert ist. Das BamHI-Fragment mit 290 bp des cer-Gens wurde in die BamHI-Stelle von DS 2147-1 eingefügt, was das Plasmid BK-2-1-2 erzeugte. Dieses auf pBR basierende Plasmid enthält somit eine multiple Klonierungsstelle, das Kanamycinresistenzgen und das cer-Gen. Das Plasmid BK-2-1-2 wurde mit BglII linearisiert und dephosphoryliert. Das Plasmid DS-2186-2-1 wurde mit BglII und BamHI verdaut, und das T7-V38-hia-Fragment mit 3,6 kb wurde in BK-2-1-2 eingefügt, was das Plasmid BK 96-2-11 erzeugte (6A).
Beispiel 6
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion der Plasmide DS-2242-1 und DS-2242-2, welche das hia-Gen des NTHi-Stamms 33 in voller Länge in der Gegenwart des E. coli cer-Gens exprimieren.
Chromosomale DNA wurde aus dem NTHi-Stamm 33 gereinigt, und eine PCR-Amplifikation wurde durchgeführt, indem die Oligonukleotide 5039.SL und 5040.SL verwendet wurden (17). Der Sinn-Primer (5040.SL) wurde auf der Basis der 5'-flankierenden Sequenz von hia aus Stamm 11 und der konservierten aminoterminalen Sequenzen der NTHi-Hia- und Hib-Hsf-Proteine entworfen. Der Gegensinn-Primer (5039.SL) war derselbe wie der, der in Beispiel 1 beschrieben wird, und dieser basierte auf den konservierten carboxyterminalen Sequenzen der Hia- und Hsf-Proteine. Das hia-PCR-Fragment aus Stamm 33 mit 3 kb wurde in pCRII kloniert, was das Plasmid DS-1917-3-8 erzeugte.
Um das hia-Gen des Stamms 33 in voller Länge zu exprimieren, wurden ungefähr 106 bp des 5'-Endes des Gens ausgehend von dem Startcodon bis zu einer AlwNI-Stelle aus Oligonukleotiden synthetisiert (7B). Das Plasmid DS-1917-3-8 wurde mit AlwnI und BamHI verdaut, und das Fragment mit ungefähr 2,9 kb, welches das hia-Gen enthielt, wurde gereinigt. Das Plasmid pT7-7 wurde mit NdeI und BamHI verdaut. Die NdeI-AlwNI-Oligonukleotide und das AlwNI-BamHI-hia-Fragment wurden in den pT7-7-Vektor ligiert, was das Plasmid DS-2103-4 erzeugte.
Um das E. coli cer-Gen aufzunehmen und eine Kanamycinselektion zu benutzen, wurde das BglII-BamHI-Fragment, welches die T7-hia(33)-Genkassette enthielt, aus DS-2103-4 ausgeschnitten und in BK-2-1-1 kloniert, welches mit BglII verdaut und dephosphoryliert worden war. Die Plasmide DS-2242-1 und DS-2242-2 enthalten einzelne Kopien der T7-hia(33)-Genkassette in entgegengesetzten Orientierungen, das E. coli cer-Gen und das Kanamycinresistenzgen (7A).
Beispiel 7
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des Plasmids DS-2340-2-3, welches eine T7-hia-Genkassette mit einem trunkierten V38-hia-Gen aus Stamm 33, das E. coli cer-Gen und das Kanamycinresistenzgen enthält.
PCR-Primer wurden entworfen, um ein 250 bp-Fragment des 5'-Endes des hia-Gens aus NTHi-Stamm 33 ausgehend von einem V38-Startcodon bis zu einer inneren SnaBI-Stelle zu amplifizieren. Eine NdeI-Stelle wurde an dem 5'-Ende zu Klonierungszwecken angefügt, und das Fragment wurde amplifiziert, indem das Plasmid DS-2242-1 als Matrize verwendet wurde. Das Konstruktionsschema ist in 8A gezeigt, und die PCR-Primer sind in 8B gezeigt. Das Fragment wurde in pCRII kloniert, was das Plasmid DS-2328-1-1 erzeugte. DS-2242-1 wurde mit NdeI und SnaBI verdaut, und das Vektorfragment mit 8,5 kb gereinigt. DS-2328-1-1 wurde mit NdeI und SnaBI verdaut, und das 5'-hia-Fragment mit 0,25 kb wurde mit dem Vek torfragment mit 8,5 kb aus DS-2242-1 ligiert, um das Plasmid DS-2340-2-3 zu erzeugen.
Beispiel 8
Dieses Beispiel stellt die Konstruktion der Plasmide DS-2447-2 und DS-2448-17 dar, welche Tandemkopien der T7-V38-hia(11)- bzw. T7-V38-hia(33)-Genkassetten, das E. coli cer-Gen und ein Kanamycinresistenzgen enthalten.
Das Plasmid BK-96-2-11, welches eine T7-V38-hia(11)-Genkassette enthält, wurde mit BglII linearisiert und dephosphoryliert. Die BglII-BamHI-T7-V38-hia(11)-Genkassette aus DS-2186-2-1 wurde in BK-96-2-11 ligiert, was das Plasmid DS-2447-2 erzeugte, welches Tandemkopien des T7-V38-hia(11)-Gens in derselben Orientierung enthält (9A).
Das Plasmid DS-2340-2-3 wurde mit EcoRI verdaut, und die T7-V38-hia(33)-Genkassette wurde in pUC-BgXb subkloniert, welches mit EcoRI verdaut und dephosphoryliert worden war. Das resultierende Plasmid, DS-2440-2, wurde mit BglII und BamHI verdaut, um die T7-V38-hia(33)-Kassette freizusetzen, die mit DS-2340-2-3 ligiert wurde, welches mit BglII linearisiert und dephosphoryliert worden war. Das Plasmid DS-2448-17 enthält Tandem-T7-V38-hia(33)-Gene in derselben Orientierung (9B).
Beispiel 9
Dieses Beispiel veranschaulicht die Expression von rekombinanten hia-Genen in voller Länge und trunkiert.
DNA aus Expressionsplasmiden, die wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben hergestellt wurden, wurde in elektrokompetente E. coli BL21 (DE3)-Zellen unter Verwendung eines BioRad Elektroporators eingeführt. Die Zellen wurden bei 37°C in NZCYM-Medium unter Verwendung der geeigneten Antibiotikaselektion bis auf ein A₅₇₈ von 0,3 kultiviert, bevor Lactose für 4 Stunden bis auf 1,0% zugegeben wurde. Proben wurden mit SDS-PAGE-Lyse + Beladungspuffer auf 0,2 OD/μl eingestellt, und dieselbe Menge jeder Proteinprobe wurde auf SDS-PAGE-Gele geladen (Ref. 22). 10 stellt die relative Produktion von rHia(11)-Proteinen aus verschiedenen Konstrukten dar. Wie man in Feld A sieht, gibt es eine Zunahme bei der Produktion bei einer verringerten Größe von rHia. V38-(Bahn 5) und N52-trunkiertes rHia (Bahn 6) weisen signifikant höhere Expressionsspiegel auf als ihre längeren Gegenstücke (Bahnen 2, 3, 4). Zusätzlich zeigt Feld B, dass die Produktion von V38-rHia in der Gegenwart des cer-Gens offensichtlich zunimmt.
Beispiel 10
Dieses Beispiel stellt die Reinigung von rHia-Proteinen dar.
All die rekombinanten Hia-Proteine wurden als Einschlusskörper in E. coli exprimiert und wurden durch denselben Vorgang gereinigt (11). E. coli-Zellpellets aus 500 ml Kultur wurden in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 0,1 M NaCl, resuspendiert und durch Beschallung aufgebrochen. Der Extrakt wurde für 30 min bei 20.000 g zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde verworfen. Das Pellet (PPT₁) wurde weiter in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA, extrahiert, dann für 30 min bei 20.000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet (PPT₂) wurde weiter in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 1% Octylglucosid, extrahiert, dann für 30 min bei 20.000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen.
Das resultierende Pellet (PPT₃), das nach den obigen Extraktionen enthalten wurde, enthält die Einschlusskörper. Das Pellet wurde in 6 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 6 M Guanidin und 5 mM DTT, solubilisiert. Zwölf ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, wurden zu dieser Lösung zugegeben, und die Mischung wurde für 30 min bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand (SUP₄) wurde mit Polyethylenglycol (PEG) 4000 bei einer Endkonzentration von 7% ausgefällt. Das resultierende Pellet (PPT₅) wurde durch Zentrifugation für 30 min bei 20.000 g entfernt, und der Überstand wurde durch (NH₄)₂SO₄ bei 50% Sättigung ausgefällt. Der (NH₄)₂SO₄-Niederschlag wurde durch Zentrifugation für 30 min bei 20.000 g gesammelt. Das resultierende Pellet (PPT₆) wurde in 2 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 6 M Guanidin-HCl und 5 mM DTT, gelöst, und die klare Lösung wurde auf einer Superdex 200 Gelfiltrationssäule, wel che in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 2 M Guanidin-HCl, äquilibriert war, gereinigt. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und jene, welche das gereinigte rHia enthielten, wurden gepoolt und über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert, dann für 30 min bei 20.000 g zentrifugiert. Das Protein blieb unter diesen Bedingungen löslich, und Glycerol wurde zu der rHia-Präparation bei einer Endkonzentration von 20% zur Lagerung bei –20°C zugegeben. Eine SDS-PAGE-Analyse von gereinigtem V38-rHia(11) und V38-rHia(33) ist in 12 dargestellt. Die durchschnittliche Ausbeute der gereinigten V38-rHia-Proteine beträgt ca. 10 mg L^–1 Kultur.
Um die Stabilität von rHia zu untersuchen, wurde das gereinigte V38-rHia(11)-Protein bei 4°C mit oder ohne Glycerol und bei –20°C mit Glycerol gelagert. Es wurde gefunden, dass das Protein unter allen drei Bedingungen stabil war und bei wiederholtem Einfrieren und Auftauen für wenigstens acht Wochen intakt blieb (13).
Beispiel 11
Dieses Beispiel stellt die Immunogenität von V38-rHia(11)- und V38-rHia(33)-Proteinen dar.
Hyperimmunantiseren gegen rHia-Proteine wurden erzeugt, indem zwei Meerschweinchen (Charles River) intramuskulär (i.m.) mit 5 μg-Dosen von Antigen, das in Freund's vollständigem Adjuvans (CFA, Difco) emulgiert war, am Tag 1 immunisiert wurden. Die Tiere erhielten an den Tagen 14 und 28 5 μg-Dosen an Protein in Freund's unvollständigem Adjuvans (IFA) als Booster, und die Seren wurden am Tag 42 gesammelt. Anti-Hib-Stamm MinnA- und anti-Haemophilus Typ a-Stamm ATCC 9006-Antiseren wurden erzeugt, indem dieselbe Vorschrift verwendet wurde, außer dass eine hitzeinaktivierte Bakterienpräparation als das Immunogen (1 × 10⁸ cfu pro Dosis) verwendet wurde.
Um die Immunogenität der V38-rHia-Proteine zu untersuchen, wurden Gruppen von fünf CD-1-Mäusen (Charles River, Quebec) an den Tagen 1 und 28 mit 0,3, 1, 3 und 10 μg Antigen in der Gegenwart von AlPO₄ (Alaun) (1,5 mg pro Dosis) s.c. immunisiert. Blutproben wurden an den Tagen 1, 28 und 42 gesammelt. Mäuse erzeugten signifikante anti-V38-rHia-Antikörperantworten, selbst bei einer einzigen Injektion von 0,3 μg Antigen (14, Feld A), was nahe legt, dass beide Proteine die Immunogenität nach Extraktion der Einschlusskörper und Solubilisierung beibehielten. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied bei den Antikörpertitern gefunden, welche durch die V38-rHia-Proteine, die von den Stämmen 11 oder 33 abgeleitet waren, induziert wurden.
Um die Immunogenität des V38-rHia(11)-Proteins in BALG/c-Mäusen zu untersuchen, wurden Gruppen von fünf Tieren (Charles River, Quebec) an den Tagen 1, 28 und 42 mit 0,3, 1, 3 und 10 μg Antigen in der Gegenwart von AlPO₄(1,5 mg per Dosis) s.c. immunisiert. Blutproben wurden an den Tagen 1, 14, 28, 42 und 56 gesammelt. Hohe Antikörpertiter wurden in allen Gruppen beobachtet, was zeigt, dass das Protein selbst bei 0,3 μg pro Dosis sehr immunogen ist (15, Feld A).
Um die Immunogenität des V38-rHia(11)-Proteins in Meerschweinchen zu untersuchen, wurden Gruppen von fünf Tieren (Charles River, Quebec) an den Tagen 1, 28 und 42 mit 0,3, 1, 3, und 10 μg Antigen in der Gegenwart von AlPO₄ (1,5 mg pro Dosis) s.c. immunisiert. Blutproben wurden an den Tagen 1, 14, 28, 42 und 56 gesammelt. Es wurden bei allen Gruppen hohe Antikörpertiter beobachtet, was zeigt, dass das Protein ebenfalls in Meerschweinchen sehr immunogen ist (15, Feld B).
Beispiel 12
Dieses Beispiel stellt die Analyse des Schutzes dar, der durch anti-rHia-Antikörper in passiven Babyrattenmodellen der Bakterämie geboten wird.
Schwangere Wistar-Ratten wurden bei Charles River gekauft. Bei dem H. influenzae Typ b-Bakterämiemodell wurde Gruppen von 6 bis 10 fünf Tage alten Babyratten s.c. im Dorsalbereich 0,1 ml Meerschweinchen anti-rHia- oder anti-Stamm MinnA-Antiserum injiziert. Die Kontrolltiere erhielten Injektionen nur mit Präimmunserum. 20 Stunden später wurden die Tiere intraperitoneal (i.p.) mit 200 bis 240 koloniebildenden Einheiten (cfu) von frisch kultiviertem Hib-Stamm MinnA (0,1 ml) herausgefordert. Blutproben wurden 20 h nach der Herausforderung über eine Herzpunktion unter Betäubung mit Isofluran gesammelt und auf Schokoladen-Agar-Platten plattiert. Die Kolonien wurden nach einem Tag gezählt, und die Ergebnisse wurden statistisch durch den Exact-Test von Fischer analysiert.
Bei dem H. influenzae Typ a-Bakterämiemodell (Ref. 23) wurde Gruppen von 9 bis 10 fünf Tage alten Babyratten im Dorsalbereich 0,1 ml Meerschweinchen anti-rHia- oder anti-Stamm ATCC 9006-Antiserum injiziert. Den Tieren in der Kontrollgruppe wurde Meerschweinchen-Präimmunserum injiziert. Zwanzig Stunden später wurden die Tiere i.p. mit 100.000 cfu von frisch kultiviertem H. influenzae Typ a-Stamm ATCC 9006 (0,1 ml) herausgefordert. Blutproben wurden 20 h nach der Herausforderung gesammelt und wie oben beschrieben analysiert.
Wie in den Tabellen 1 und 2 unten gezeigt ist, waren die Babyratten, die passiv mit entweder Meerschweinchen anti-rHia(11)- oder anti-V38-rHia(11)-Antiseren immunisiert wurden, alle signifikant gegen eine von H. influenzae Typ a oder Typ b verursachte Bakterämie geschützt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die gegen leicht trunkiertes Hia-Protein (V38-rHia) hervorgerufen wurden, ebenso wirksam sind wie jene, die gegen das Protein in voller Länge hervorgerufen wurden, um Tiere gegen eine Bakterämie zu schützen, die durch H. influenzae Typ a oder Typ b hervorgerufen wird. Ein solcher Schutz, der von einem von NTHi abgeleiteten rekombinanten Protein vor einer invasiven Erkrankung, die durch eingekapselte Bakterien verursacht wird, geboten wird, veranschaulicht den Nutzen der rHia-Proteine als Impfstoffantigene.
Beispiel 13
Dieses Beispiel stellt den Schutz dar, der durch Immunisierung mit V38-rHia-Protein in einem Chinchillamodell der nasopharyngealen Besiedlung geboten wird.
Ein nasopharyngeales Besiedlungsmodell wurde von Yang et al. (Ref. 20) beschrieben. Das Modell arbeitet gut für jene NTHi-Stämme, die HMW-Adhäsine produzieren, aber eine reproduzierbare Besiedlung konnte mit Hia-produzierenden Stämmen unter denselben Bedingungen nicht erreicht werden. Wiederholte Versuche, mit dem Prototyp des Hia-produzierenden NTHi-Stamms 11 zu besiedeln, waren nicht erfolgreich. Eine Besiedlung wurde mit dem NTHi-Stamm 33 bei 5 × 10⁸ cfu pro Inokulum erreicht, im Vergleich zu nur 10⁸ cfu, die für den Prototyp des HMW-produzierenden NTHi-Stamms 12 benötigt wurden. Unter diesen Bedingungen wurde ein partieller Schutz bei Tieren beobachtet, die mit 100 μg V38-rHia(33) immunisiert wurden und mit dem homologen NTHi-Stamm 33 herausgefordert wurden.
Beispiel 14
Dieses Beispiel stellt die Klonierung und Sequenzanalyse von zusätzlichen hia-Genen aus H. influenzae-Stammen dar.
Oligonukleotide (5040.SL und 5039.SL) zur PCR-Amplifikation wurden auf der Basis des konservierten Promotors, der N-terminalen und C-terminalen Sequenzen der hia- und hsf-Gene und Proteine entworfen (17). Die Stämme, die zur PCR-Amplifikation ausgewählt wurden, wurden auf der Basis ihrer Reaktivität mit anti-rHia(11)-Antiseren ausgewählt.
Chromosomale DNA wurde aus den NTHi-Stämmen 12, 29, 32, M4071, K9 und K22 und dem Haemophilus Typ c-Stamm API hergestellt. Eine PCR-Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt: Jede Reaktionsmischung enthielt 5 bis 100 ng DNA, 1 μg jedes Primers, 5 Einheiten taq+ oder tsg+ (Sangon) oder taq plus Jong (Stratagene), 2 mM dNTPs, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100, BSA. Die Zyklusbedingungen waren: 95°C für 1 min, gefolgt von 25 Zyklen von 95°C für 30 Sek., 45°C für 1 min, 72°C für 2 min; dann 72°C für 10 min.
Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens aus dem Stamm 33 sind in 18 gezeigt. Das vorhergesagte Hia-Protein aus dem Stamm 33 weist ein Molekulargewicht von 103,6 kDa und einen pI von 9,47 auf. Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens aus dem Stamm 32 sind in 19 gezeigt. Das vorhergesagte Hia-Protein aus dem Stamm 32 weist ein Molekulargewicht von 70,4 kDa und einen pI von 5,67 auf. Es gibt eine KDEL-Sequenz, die zwischen den Resten 493 und 496 vorliegt. Solche Sequenzen wurden mit der Verankerung von Proteinen an dem endoplasmatischen Retikulum in Verbindung gebracht. Das abgeleitete Hia-Protein des Stamms 32 ist signifikant kleiner und weist einen signifikant verschiedenen pI auf, jedoch enthält es viele der Motive, die in anderen Hia-Molekülen vorliegen.
Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens aus dem Stamm 29 sind in 20 gezeigt. Das vorhergesagte Hia-Protein aus dem Stamm 29 weist ein Molekulargewicht von 114,4 kDa und einen pI von 7,58 auf. Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens aus dem Stamm K22 sind in 23 gezeigt. Das vorhergesagte Hia-Protein aus dem Stamm K22 weist ein Molekulargewicht von 114,4 kDa und einen pI von 7,58 auf. Es wurde gefunden, dass die abgeleiteten Hia-Sequenzen aus den NTHi-Stämmen 29 und K22 identisch waren. Der Stamm 29 wurde aus einem 7 Monate alten Kind mit Otitis media in Cleveland, Ohio, isoliert, während der Stamm K22 aus einem Aborigine nahe Kimberly, Australien, isoliert wurde.
Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens aus dem Stamm 4071 sind in 21 gezeigt. Das vorhergesagte Hia-Protein aus dem Stamm M4071 weist ein Molekulargewicht von 103,4 kDa und einen pI von 9,49 auf. Es gibt eine KDEL-Sequenz, die zwischen den Resten 534 und 537 vorliegt.
Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens aus dem Stamm K9 sind in 22 gezeigt. Das vorhergesagte Hia-Protein aus K9 weist ein Molekulargewicht von 113,8 kDa und einen pI von 6,45 auf.
Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Gens aus dem Typ c Haemophilus-Stamm API sind in 24 gezeigt. Das vorhergesagte Hia-Protein aus API weist ein Molekulargewicht von 249,4 kDa und einen pI von 5,34 auf. Die abgeleitete Hia/Hsf-Sequenz aus dem Typ c-Stamm API ist nahezu identisch mit der veröffentlichten Typ b-Hsf-Sequenz, außer für ein Insert mit 60 Resten. Da das auf NTHi basierende Hia-Protein, das hierin bereitgestellt wird, in passiven Modellen einer Typ a- und Typ b-Infektion schützt, ist es wahrscheinlich, dass es aufgrund der Sequenzähnlichkeit zwischen den Proteinen vom Typ b und Typ c ebenso gegen eine Typ c-Erkrankung schützen wird.
Die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des hia-Locus aus dem Stamm 12 sind in 25 gezeigt. Der NTHi-Stamm 12 produziert kein Hia. Jedoch kann ein Teil des hia-Gens PCR-amplifiziert werden, es gibt eine inkonsistente positive Reaktivität von SB12-Zelllysaten mit dem anti-rHia-Antikörper, und es gibt eine Reaktivität mit einer DNA-Sonde, die von dem 3'-Ende des hia-Gens des Stamms 11 abgeleitet ist, auf Southern Blots. Eine Analyse der PCR-amplifizierten DNA zeigte ein 1,8 kb-Fragment, welches 1 kb des 3'-Endes des stromaufwärts liegenden HI1732-verwandten Gens und 0,8 kb des 3'-Endes des hia-Gens enthält.
Eine PCR-Amplifikation, die Primer verwendete, die über die mutmaßliche Verknüpfung dieser zwei Gene in dem Stamm 12 hinweg amplifizieren würde, bestätigte die genetische Zusammensetzung des Locus. Somit würde es scheinen, dass der Stamm 12 kein Hia produziert, da er eine Deletion des 5'-Endes des hia-Gens erfahren hat. 27 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen dem stromaufwärts liegenden orf von Stamm 12 und dem aus dem Rd-Genom abgeleiteten HI1733-Protein. Über den Homologiebereich hinweg sind die zwei Proteine zu 95% identisch.
Eine Ausrichtung der abgeleiteten Hia-Sequenzen aus den NTHi-Stämmen 33, 32, 29, K22, M4071, 11 und K9 und dem Typ c-Stamm API im Vergleich mit H. influenzae Typ b-Hsf, dem aidA-ähnlichen (Hsf/Hia) HI1732-Gen aus dem Rd-Genom und dem M. catarrhalis 200 kDa-Protein aus den Stämmen 4223 und LES-1 ist in 28 gezeigt. Hier gibt es eine Rasterverschiebung bei der Rd-Genomsequenz, welche zu einer vorzeitigen Trunkierung des HI1732-Proteins führt. Eine zusätzliche stromabwärts liegende Sequenz, die mit hia verwandt ist, ist hier umfasst. Die Sterne unter der Sequenz zeigen konservierte Reste. Die N-terminalen (ungefähr 50 Reste) und C-terminalen Sequenzen (ungefähr 150 Reste) sind bei den Haemophilus-Stammen in hohem Maße konserviert, während eine gewisse Ähnlichkeit mit dem Gegenpart von M. catarrhalis ersichtlich ist. Eine Sequenzanalyse zeigt, dass es zwei potentielle Genfamilien von Hia-Proteinen gibt, von denen eine mit dem Prototypstamm 11 verwandt ist und die andere enger mit dem Stamm 33 verwandt ist. Die Proteine der Stämme 11 und K9 scheinen mehr Ähnlichkeit zu den Hsf-Proteinen aus den Haemophilus-Stammen vom Typ b, Typ c oder Typ d aufzuweisen, während die Proteine der Stämme 33, 32, 29, K22 und M4071 eine zweite Familie zu bilden scheinen.
Beispiel 15
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des Plasmids JB-2930-3, welches eine T7-hia-Genkassette mit einem trunkierten S44-hia-Gen des Stamms 11, das E. coli cer-Gen und das Kanamycin-Antibiotikaresistenzgen enthält, und die Expression von S44-Hia-Proteinen.
PCR-Primer wurden entworfen, um den S44-Hia-N-Terminus des hia-Gens des NTHi-Stamms 11 ausgehend von der Aminosäure S44 bis zu einer inneren StyI-Stelle zu amplifizieren (29). Eine NdeI-Stelle wurde an dem 5'-Ende zu Klonierungszwecken angefügt, und das Fragment wurde unter Verwendung des Plasmids DS-2242-1 als einer Matrize amplifiziert. Das Fragment wurde in pCRII kloniert, was das Plasmid JB-2910-1-1 erzeugte. Das Konstruktionsschema ist in 30 gezeigt. Das Plasmid JB-2910-1-1 wurde mit NdeI und StyI verdaut und das 5'-PCR-hia-Fragment isoliert. Das Plasmid IA-46-5, welches das V38-hia-Gen enthielt, wurde mit NdeI und StyI verdaut und das größere Fragment mit ungefähr 8,5 kb gereinigt. Die zwei gereinigten Fragmente wurden zusammen ligiert, um das Plasmid JB-2917-1 zu erzeugen. Dieses Plasmid wurde dann mit NdeI verdaut und mit Kalbsintestinumphosphatase (CAP) behandelt, und in dieses wurde der T7-Promotor aus dem Plasmid IA-46-5 kloniert. Der Promotor wurde herausgeschnitten, indem ein NdeI-Verdau von IA-46-5 verwendet wurde. Das resultierende Plasmid, JB-2925-3, wurde mit BglII und BamHI verdaut, und das hia-Gen wurde isoliert. Dieses Fragment wurde in das mit BglII/CAP behandelte Plasmid BK-2-1-2 ligiert, um das Plasmid JB-2930-3 zu erzeugen. Dieses Plasmid enthält den T7-Promotor, das S44-hia-Gen und das E. coli cer-Gen und eine Kanamycinresistenz.
Der rekombinante S44-hia-Vektor wurde für Expressionsstudien in E. coli BL21 (DE3) transformiert. Die Prozedur zur Expression in E. coli war wie in Beispiel 9 beschrieben. 31, eine SDS-PAGE-Analyse, zeigt die Expression von rekombinantem S44-hia aus zwei verschiedenen Vektoren, JB-2930-3 (oben beschrieben) und dem pET-Vektor IA-191-3-1. Das Plasmid IA-191-3-1 ist mit JB-2930-3 identisch, außer dass dieses ein pET-Vektor ist, welcher den lacI^q-Repressor enthält, und daher die produzierte Menge an S44-Hia niedriger als die des T7-S44 aus JB-2930-3 ist. Das Plasmid ist zusammen mit dem Plasmid JB-2930-3 gezeigt, 32. 31 zeigt das S44-Hia als eine Doubletbande (Bahn 3) bei ungefähr 116 kDa. Bei einer weiteren Analyse unter Verwendung von gereinigtem S44-hia aus JB-2930-3 wurde gefunden, dass die untere Bande des Doublets eine C-terminale Trunkierung von 94 Aminosäuren aufweist, während sie den erwarteten N-Terminus beibehielt. Der Reinigungsprozess, der zur Isolation des trunkierten Hia verwendet wurde, war wie in Beispiel 10 beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
Als Zusammenfassung dieser Offenbarung stellt die vorliegende Erfindung neue isolierte und gereinigte Nukleinsäuremoleküle bereit, welche N-terminal trunkierte Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Proteine aus Haemophilus codieren, welche ermöglichen, dass schützende Hia-Proteine rekombinant produziert werden.
REFERENZEN

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TABELLE 1 Schützende Wirkung von Meerschweinchen-anti-rHia(volle Länge)-Antiserum vor H. influenzae Typ a oder b in dem Babyrattenmodell der Bakterämie

Gruppe (#)	Meerschweinchen-serum	Anti-rHia-Antikörpertiter	Anzahl bakterämisch/Anzahl herausgefordert	Mittlere cfu/100 μl Blut
1 2 3	Anti-Typ a Anti-rHia Präimmun	nd 204.800 < 100	0/10* 1/10* 7/10	0 0 88
Gruppe (#)	Meerschweinchen-serum	Anti-rHia-Antikörpertiter	Anzahl bakterämisch/Anzahl herausgefordert	Mittlere cfu/2,5 μl Blut
4 5 6	Anti-MinnA Anti-rHia Präimmun	nd 204.800 < 100	0/10* 1/10* 10/10	0 2 600

Fünf Tage alte Babyratten wurden passiv s.c. mit 0,1 ml des angegebenen Meerschweinchen-Antiserums oder -Präimmunserums immunisiert. 20 Stunden später wurden die Babyratten i.p. mit entweder einem frisch kultivierten H. influenzae Typ a-Stamm ATCC 9006 (10⁵ cfu, 0,1 ml) für die Gruppen # 1 bis 3; oder mit frisch kultiviertem Hib-Stamm MinnA (240 cfu, 0,1 ml) für die Gruppen # 4 bis 6 herausgefordert. Infizierte Tiere sind definiert als > 20 cfu, die aus 100 μl Blut gewonnen wurden, für die Gruppen # 1 bis 3; oder > 30 cfu, die aus 2,5 μl Blut gewonnen wurden, für die Gruppen # 4 bis 6.

* Exact-Test von Fischer. Es wurde eine statistische Signifikanz im Vergleich zu Tieren in der Gruppe 3 oder 6 gefunden (P < 0,05).
** Student's unpaired t-Test. Es wurde eine statistische Signifikanz im Vergleich zu Tieren in der Gruppe 3 oder 6 gefunden (P < 0,05).
nd: nicht bestimmt.

Gruppe (#)	Meerschweinchen-serum	Anti-rHia-Antikörpertiter	Anzahl bakterämisch/Anzahl herausgefordert	Mittlere cfu/20 μl Blut
1 2 3	Anti-Typ a Anti-rHia Präimmun	nd 204.800 < 100	0/6* 1/9* 5/8	0 5 165
Gruppe (#)	Meerschweinchen-serum	Anti-rHia-Antikörpertiter	Anzahl bakterämisch/Anzahl herausgefordert	Mittlere cfu/2 μl Blut
4 5 6	Anti-MinnA Anti-rHia Präimmun	nd 204.800 < 100	0/6* 1/9* 10/10	0 2 820

Fünf Tage alte Babyratten wurden passiv s.c. mit 0,1 ml des angegebenen Meerschweinchen-Antiserums oder -Präimmunserums immunisiert. 20 Stunden später wurden die Babyratten i.p. mit entweder einem frisch kultivierten H. influenzae-Typ a-Stamm ATCC 9006 (10⁵ cfu, 0,1 ml) für die Gruppen # 1 bis 3; oder mit frisch kultiviertem Hib-Stamm MinnA (190 cfu, 0,1 ml) für die Gruppen #4 bis 6 herausgefordert. Infizierte Tiere sind definiert als > 20 cfu, die aus 20 μl Blut gewonnen wurden, für die Gruppen # 1 bis 3; oder > 30 cfu, die aus 2 μl Blut gewonnen wurden, für die Gruppen #4 bis 6.

Claims

Ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, welches ein N-trunkiertes Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Protein eines Stammes von Haemophilus influenzae codiert, das als Einschlusskörper exprimiert wird, wobei das N-trunkierte Protein die Fähigkeit aufweist, gegen eine Besiedlung zu schützen, und dieses das N-trunkierte Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Protein beginnend bei der Aminosäure V38 von SEQ ID NO: 24 (Haemophilus influenzae Stamm 33) ist.
Ein Vektor zum Transformieren eines Wirtes, umfassend das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 1.
Ein Plasmidvektor gemäß Anspruch 2.
Ein Vektor zum Transformieren eines Wirtes, welcher ein Nukleinsäuremolekül, welches ein N-trunkiertes Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Protein wie in Anspruch 1 beansprucht codiert, und einen Promoter, der operativ mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden ist, zur Expression des trunkierten Hia-Proteins umfasst.
Der Vektor, der in Anspruch 4 beansprucht wird, welcher weiterhin das cer-Gen von E. coli umfasst.
Der Vektor, der in Anspruch 4 oder 5 beansprucht wird, wobei der Vektor die Identifizierungscharakteristika eines Plasmidvektors aufweist, der ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: DS-2340-2-3, enthaltend eine T7-Hia-Genkassette, welche das trunkierte Hia-Gen von Anspruch 1 umfasst, wie in 8A gezeigt, und DS-2448-17, enthaltend Tandem-T7-Hia-Genkassetten, welche das trunkierte Hia-Gen von Anspruch 1 umfassen, wie in 9B gezeigt.
Eine Wirtszelle, die mit einem Vektor wie in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 6 beansprucht transformiert ist, und welche ein schützendes N-trunkiertes Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Protein beginnend bei der Aminosäure V38 der SEQ ID NO: 24 (nicht typisierbarer Stamm 33 von Haemophilus influenzae) exprimiert.
Ein rekombinantes schützendes N-trunkiertes Hia-Protein beginnend bei der Aminosäure V38 der SEQ ID NO: 24 Haemophilus influenzae Stamm 33).
Eine immunogene Zusammensetzung, umfassend wenigstens eine immunologisch aktive Komponente, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (A) einem isolierten und gereinigten Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1; (B) einem rekombinanten Protein gemäß Anspruch 8; und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür.
Ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung eines schützenden N-trunkierten Haemophilus influenzae Adhäsin(Hia)-Proteins beginnend bei der Aminosäure V38 der SEQ ID NO: 24 (nicht typisierbarer Stamm 33 von Haemophilus influenzae), welches umfasst: das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor wie in Anspruch 2 beansprucht, das Wachsen lassen der Wirtszelle, um das codierte trunkierte Hia zu exprimieren, und das Isolieren und Reinigen des exprimierten Hia-Proteins.
Das Verfahren, das in Anspruch 10 beansprucht wird, wobei die Wirtszelle E. coli ist.
Das Verfahren, das in Anspruch 10 oder 11 beansprucht wird, wobei das codierte trunkierte Hia in Einschlusskörpern exprimiert wird.
Das Verfahren, das in Anspruch 12 beansprucht wird, wobei die Isolation und Reinigung des exprimierten Hia bewirkt wird durch: das Aufbrechen der gewachsenen transformierten Zellen, um einen Überstand und die Einschlusskörper zu erzeugen, das Solubilisieren der Einschlusskörper, um eine Lösung des rekombinanten Hia zu erzeugen, das chromatographisches Reinigen der Lösung des rekombinanten Hia, so dass es frei von Zelltrümmern ist, und das Isolieren des gereinigten rekombinanten Hia-Proteins.
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13 beansprucht wird, wobei der Vektor den T7-Promoter beinhaltet und der Wirt E. coli ist, welcher in der Gegenwart einer induzierenden Menge an Lactose kultiviert wird.
Eine Vakzine zur in vivo-Verabreichung, um gegen eine Krankheit zu schützen, die durch Haemophilus verursacht wird, umfassend eine immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 9.