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Diese
Erfindung betrifft Impfstoff-(Vakzine)-Zusammensetzungen zur Verabreichung
an Schleimhaut-Oberflächen,
als auch Adjuvans-Zusammensetzungen zur Stimulierung oder Verstärkung der
immunogenen Schutzwirkungen eines gleichzeitig damit verabreichten
Antigens.
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Genauer
gesagt betrifft die Erfindung die Schleimhaut-immunogenen und Adjuvans-Eigenschaften einer
mutanten Form des Pertussistoxins (Keuchhusten-Toxins).
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Der
Großteil
der pathogenen Mikroorganismen löst
Infektionen aus, indem er sich an die Schleimhaut-Epithelzellen
anheftet, die den Magen-Darm-Trakt, den Mundrachen-Trakt, die Atemwege
oder den Urogenitaltrakt auskleiden. Einige Pathogene wie das Grippevirus,
Bordetella pertussis oder Vibrio cholerae können am oder im Schleimhautgewebe
zurückbleiben,
während
andere wie Salmonella typhi oder Hepatitis-A-Virus Mechanismen besitzen,
die ihnen das Vordringen in tiefere Gewebeschichten und das systemische
Ausbreiten ermöglichen.
Die spezifischen und nicht-spezifischen Abwehrmechanismen der Schleimhautmembranen
bieten einen Schutz an vorderster Linie gegen beide Pathogenarten.
Zu den nicht-spezifischen Effektoren zählen residente Makrophagen,
antimikrobielle Pepide, Lactoferrin und Lysozym, pH-Extremwerte,
Gallensäuren,
Verdauungsenzyme, Schleim, das Ausschütten von Epithelzellen, Ausspülmechanismen
(Peristaltik, Wimpernschläge,
Blasenentleerung etc.) und die Konkurrenz durch die lokale Flora.
Erfolgreiche Pathogene haben jedoch im allgemeinen Methoden zum Überleben
der nicht-spezifischen Abwehrmechanismen entwickelt, die an den
Stellen vorliegen, die durch sie infiziert werden. Daher ist es
das sekretorische Immunsystem, das eine Hauptrolle im Schutz gegen
Krankheiten spielt, die durch eine Vielzahl bakterieller und viraler
Pathogene verursacht werden, und das dabei möglicherweise den wichtigsten
Effektor gegen auf Schleimhaut-Oberfächen beschränkte Pathogene darstellt. Bei
Organismen, die sich systemisch ausbreiten, sind wahrscheinlich sowohl
lokale als auch systemische Immunreaktionen für eine optimale Immunität erforderlich.
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Daher
besteht Bedarf nach einer Methode zur Stimulierung der lokalen und
systemischen lymphatischen Gewebe für eine wirksame Immunisierung
gegen viele Erkrankungen. Unglücklicherweise
stimulieren die derzeitigen parenteralen Immunisierungstherapien
oftmals lediglich schwache oder nicht nachweisbare sekretorische
Reaktionen in der Schleimhaut. Um eine wirksame Stimulierung des
Schleimhautassoziierten lymphatischen Gewebes (MALT) zu erreichen,
muss das Immunogen der Schleimhaut-Oberfläche während des Impfvorgangs topisch
zugeführt
werden. Dies ist allerdings nicht so unkompliziert, wie es scheint.
Die meisten nicht-replizierenden Immunogene sind bei Einnahme oder
Inhalation schwach immunogen, wobei lösliche Proteine besonders ineffiziente
Schleimhaut-Immunogene sind. Daran besteht kein Zweifel, da die
nicht-spezifischen Abwehrmechanismen die meisten löslichen
Proteine ohne weiteres denaturieren, abbauen und ausschalten, was
dazu führt,
dass lediglich winzige Mengen dieser Immunogene das MALT erreichen.
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Von
der Verabreichung großer,
wiederholter Dosen eines bestimmten Proteins kann eine Verstärkung der
Immunantwort erwartet werden. Die Folge einer solchen Immunisierung
ist allerdings häufig
die Bewirkung eines Zustandes der immunologischen Unempfänglichkeit,
bekannt als orale Toleranz, bei dem das Individuum auf eine nachfolgende
parenterale Immunisierung mit demselben Antigen kaum reagiert (dies
würde genauer als
Schleimhaut-Toleranz bezeichnet werden, da die Inhalation großer Mengen
an löslichen
Proteinen diesen Zustand ebenfalls hervorruft). Die bei der Auslösung der
oralen Toleranz involvierten regulatorischen Mechanismen sind nur
wenig erklärt,
doch wird angenommen, dass sie zu dem Zwecke entstanden sind, Tiere
vor der Entwicklung unangemessener und möglicherweise schädigender
Immunreaktionen auf Umwelt- und Nahrungsproteine zu schützen. Eines
der Hauptziele der modernen Vakzinologie besteht daher in der Bereitstellung
der Mittel zur Auslösung starker
mukosaler und systemischer Immunantworten auf lösliche Proteine, ohne dabei
aber eine Schleimhaut-Toleranz zu bewirken.
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Von
einigen mikrobiellen Komponenten, wie etwa dem Choleraenterotoxin
(CT) oder dem E. coli-hitzelabilen Toxin (LT) oder den nicht-toxischen
Bindungsabschnitten dieser Toxine (CT-B und LT-B), wurde festgestellt,
dass sie potente Schleimhaut-Immunogene sind, die starke sekretorische
und zirkulierende Antikörper auslösen, wobei
Choleraen-terotoxin
als das potenteste bekannte Schleimhaut-Immunogen erachtet wird.
Allerdings ist der Grund dafür,
dass diese Moleküle
gute Schleimhaut-Immunogene sind, bis jetzt nicht völlig erklärt. Eine
Eigenschaft, die wichtig sein könnte,
ist die Fähigkeit
dieser Moleküle,
an Schleimhaut-Epithelzellen über
bestimmte Oberflächen-Rezeptoren
zu binden, obschon in Untersuchungen anderer Forscher festgestellt wurde,
dass nicht notwendigerweise ein Zusammenhang zwischen der Bindungsfähigkeit
eines Antigens an eukaryontische Zellen und seiner Schleimhaut-Immunogenität besteht.
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Daher
besteht, soweit uns bewusst, derzeit keine Möglichkeit, mit irgendeiner
Gewissheit vorherzusagen, ob ein gegebenes Antigen eine gute Schleimhaut-Immunogenität besitzen
wird.
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Choleraenterotoxin
(CT) ist bei mukosaler Verabreichung an die Schleimhaut nicht nur
immunogen, sondern auch ein Schleimhaut-Adjuvans, das die Reaktionen
auf gleichzeitig verabreichte Antigene verstärkt. Bei Mäusen sind lediglich winzige
Mengen an CT für
die Adjuvans-Wirkung erfolgreich. Ungünstigerweise verursacht eine
Dosis von 2 μg
CT bei Verabreichung an freiwillige Versuchspersonen Diarrhoe, und
eine Dosis von 5 μg
führt zu
einer von der klassischen Cholera nicht unterscheidbaren Darmentleerung.
Aktives CT ist daher eindeutig nicht zur Verabreichung an Menschen
geeignet.
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Bei
CT handelt es sich um zweiteiliges Toxin, bestehend aus einem Promotor
(CTA) und einem B-Pentamer (CTB). Bei CTA handelt es sich um die
enzymatische Komponente des CT, die für die kovalente Modifikation
der Wirts-G-Proteine und die daraus folgende Toxizität des CT
verantwortlich ist. CTB, das die Bindung des CT an seinen Rezeptor
(Gangliosid GM1) auf der Oberfläche der
eukaryontischen Zellen vermittelt, ist nicht giftig und außerdem ein
gutes Schleimhaut-Immunogen. CTB wurde als Schleimhaut-Adjuvans
durch viele Gruppen mit widersprüchlichen
Ergebnissen untersucht. Das aus dem Handel beziehbare CTB wird aus
CT hergestellt und enthält
oftmals Spurenmengen an CT, die für die von einigen Autoren berichtete
Adjuvantizität von
CTB verantwortlich sein könnte.
Darüber
hinaus wurde festgestellt, dass rekombinantes CTB und das in hohem
Maße verwandte
E. coli-hitzelabile Toxin-B-Pentamer (LTB), obschon selbst immunogen,
frei von Adjuvantizität
war. So haben Holmgren et al. (Vaccine, Bd. II, S. 1179–1184, 1993)
berichtet, dass dann, wenn hochgradig gereinigtes oder rekombinantes
CTB verwendet wurde, sie durchweg nicht in der Lage waren, eine Adjuvans-Wirkung
von CTB auf andere, damit vermischte Antigene zu beobachten. Holmgren
et al. folgerten, dass das gesamte CT-Molekül für die Adjuvans-Wirkung erforderlich
ist. Sie testeten auch eine mutante Form des E. coli-hitzelabilen
Toxins (LT), bei dem die B-Untereinheit identisch zu der der normalen
B-Untereinheit war, und die A-Untereinheit mit Ausnahme einer einzigen
Aminosäure-Substitution
bei Position 112 (Gluc → Lys)
identisch war. Die mutante Form jedoch, die keine ADP-ribosylierende Wirksamkeit
besaß und
nicht zu Flüssigkeitssekretion
bei Kaninchenligierten "Loops" führte, bewirkte
keinerlei signifikante, gegen sich selbst gerichtete IgA-Reaktionen und zeigte
keine Adjuvans-Eigenschaften.
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Pertussistoxin
(PTX) besitzt, ähnlich
wie CT, eine AB5-Struktur. Sowohl CT als
auch PTX sind ADP-ribosylierende Toxine, doch weisen verschiedene
zelluläre
Rezeptoren und Substrate auf. PTX kann unzählige biologische Wirkungen
zeigen und stellt eines der wichtigsten protektiven Antigene von
B. pertussis dar. Inaktivierte Formen des PTX stellen die Basis
der vorhandenen und experimentellen azellulären Keuchhusten-Impfstoffe dar.
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Vom
Pertussistoxin (PTX) wurden Adjuvans-Eigenschaften berichtet, doch
besteht, zusätzlich
zu seinen inhärenten
toxischen Eigenschaften, ein Hauptnachteil in seiner Eigenschaft,
die IgE-Produktion zu stimulieren und zu steigern, was zu einer
Anaphylaxie als Reaktion auf gleichzeitig verabreichte Proteine
führt – siehe
zum Beispiel Mu et al., Infection and Immunity, S. 2834–2840, Juli
1993.
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Von
der B-Untereinheit des Pertussistoxins wurden ebenfalls eine Schleimhaut-Adjuvans-Wirksamkeit berichtet,
siehe
Japanische Patentanmeldung
3-135923 , obschon keine immunogene Aktivität für die B-Untereinheit
als solche beschrieben wurde.
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In
US-A-5182109 sind
Impfstoff-Zusammensetzungen beschrieben, die einen Impfstoff und
ein Toxin oder eine Untereinheit davon umfassen. Beispiele dafür sind das
Choleraenterotoxin und das E. coli-hitzelabile Toxin.
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Daher
besteht nach wie vor Bedarf an einem Schleimhaut-Adjuvans, dem die
toxischen und oben beschriebenen unerwünschten Nebenwirkungen fehlen.
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In
WO 95/34323 , veröffentlicht
nach dem Einreichungsdatum dieser Anmeldung, ist ein genetisch detoxifiziertes
Pertussis-Holotoxin beschrieben, das als ein proteinartiges Adjuvans
dient, welches durch Mutagenese erhalten werden kann, zum Beispiel
durch multiple Aminosäure-Deletion
oder -Substitution unter bevorzugter Einbeziehung von Arg
9 und Glu
129 der
S
1-Untereinheit.
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Es
wurde nun festgestellt, dass einer bestimmten mutanten Form des
Pertussistoxins nicht nur die toxischen Eigenschaften des Wildtyp-Toxins
fehlen, sondern sie auch eine gute immunogene Wirksamkeit aufweist,
wenn auf dem intranasalen Wege verabreicht. Darüber hinaus stellt die mutante
Form des Pertussistoxins auch ein ausgezeichnetes Adjuvans dar.
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Bei
einer ersten Ausführungsform
wird durch die Erfindung die Verwendung einer nichttoxischen doppelmutanten
Form des Keuchhusten-Toxins, bei der die Glutaminsäure-129-Aminosäure in der
S1-Untereinheit durch eine andere Aminosäure substituiert
wurde, für
die Herstellung einer Adjuvans-Zusammensetzung zur Stimulierung
oder Verstärkung
einer protektiven Immunantwort auf ein gleichzeitig damit verabreichtes
Antigen bereitgestellt.
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Die
Adjuvans-Zusammensetzung ist vorzugsweise auf die Verabreichung
an eine Schleimhaut-Oberfläche,
und insbesondere auf die intranasale Verabreichung angepasst.
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Die
nicht-toxische doppelmutante Form des Pertussistoxins ist vorzugsweise
eine solche, bei der die Glutaminsäure-129 durch Glycin ersetzt
wurde.
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Ebenfalls
bevorzugt ist, dass die Arginin-9-Aminosäure durch eine andere Aminosäure, zum
Beispiel Lysin, ersetzt wurde.
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Eine
bevorzugte Impfstoff-Zusammensetzung ist eine solche, bei der das
Antigen das C-Fragment des Tetanustoxins ist.
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Spezielle
Beispiele der nicht-toxischen doppelmutanten Pertussistoxine zur
Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind beschrieben in der
Europäischen
Patentanmeldung
EP-A-0462534 (Sclavo
SpA). Ein bevorzugtes nicht-toxisches doppelmutantes Toxin ist die
in Beispiel 1 von
EP-A-0462534 beschriebene
Mutante, bei der der Arginin-9-Rest durch Lysin ersetzt wurde, und
der Glutaminsäure-129-Rest
durch Glycin ersetzt wurde. Diese Mutante wird im folgenden als
PT 9K/129G bezeichnet.
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Die
Impfstoff- und Adjuvans-Zusammensetzungen der Erfindung sind typischerweise
als eine wässrige
Lösung
zur Verabreichung als ein Aerosol oder Nasentropfen, oder als ein
Trockenpulver zum Beispiel zur Inhalation, formuliert.
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Zusammensetzungen
zur Verabreichung als Nasentropfen können einen oder mehrere Arzneimittelträger der
Art enthalten, wie sie gewöhnlich
in solche Zusammensetzungen aufgenommen werden, zum Beispiel Konservierungsstoffe,
Viskositäts-einstellende
Mittel, Tonizitäts-einstellende
Mittel, Puffermittel und ähnliches.
Das Antigen oder Gemisch der Antigene ist typischerweise so gewählt, dass
es für
einen Empfänger bei
den zur Auslösung
einer Immunantwort angewandten Konzentrationen nicht giftig ist.
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Die
Pertussistoxin-Doppelmutante und ein weiteres Antigen können getrennt
voneinander verabreicht werden, zum Beispiel kurz aufeinanderfolgend,
oder sie können
gleichzeitig miteinander verabreicht werden. Bei gleichzeitiger
Verabreichung werden sie als ein Gemisch der einzelnen Einheiten
formuliert. Die Impfstoff-Zusammensetzung kann außerdem ein
oder mehrere weitere Antigene, die Schleimhaut-immunogen aktiv sind, enthalten.
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Bei
einer speziellen Ausführungsform
der Erfindung kann die Pertussistoxin-Mutante mit einem oder mehreren
weiteren Pertussis-Antigenen kombiniert werden, zum Beispiel filamentösem Hämagglutinin
(FHA) und/oder dem 69-Kilodalton-Außenmembranprotein (P69 – auch bekannt
als Pertactin) von B. pertussis.
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Ein
weiteres Beispiel eines Antigens, das gleichzeitig mit dem mutanten
Pertussistoxin verabreicht werden kann, ist das C-Fragment von Tetanustoxin
(im folgenden bezeichnet als Frg C). Es wurde festgestellt, dass
die Immunogenität
von Frg C deutlich verstärkt
wird, wenn es gleichzeitig mit dem mutanten Pertussistoxin verabreicht
wird.
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Das
P.69-Außenmembranprotein
von B. pertussis ist ein Protein von etwa 61 KD Molekulargewicht; siehe
A. J. Makoff et al., "Protective
surface antigen P.69 of Bordetella pertussis: its characteristics
and very high level expression in Escherichia coli", Bio-Technology, 8, 1030
(1990).
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Es
kann hergestellt und isoliert werden gemäß der Methode, die bei P. Novotny
et al.: The Journal of Infectious Diseases, 164, 114 (1991) beschrieben
ist oder kann aus rekombinantem Material hergestellt werden, wie
gewonnen aus E. coli mittels der Methode, die im oben genannten
Artikel von A. J. Makoff et al. wiedergegeben ist. Es kann an eukaryontische
Zellen binden.
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Gereinigtes
filamentöses
Hämagglutinin
von B. pertussis enthält
gewöhnlich
Polypeptide eines unterschiedlichen Molekulargewichts im Bereich
von 98–220
KD, das aus Zellkultur-Überständen von
B. pertussis isoliert und ausgereinigt werden kann, wie zum Beispiel
im oben genannten Artikel von P. Novotny et al. beschrieben. Das
filamentöse
Hämagglutinin
ist zur Bindung an eukaryontische Zellen und Bewirkung der Häemagglutinierung
von Schafs-Erythrozyten fähig.
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Die
antigenen Moleküle
der vorliegenden Erfindung können
durch Isolieren und Ausreinigen aus dem Organismus, in dem sie natürlich vorkommen,
hergestellt werden oder können
mittels rekombinanter Methoden hergestellt und in einem geeigneten
Wert, z. B. E. coli, in bekannter Weise exprimiert werden. Wenn
mittels einer rekombi nanten Methode oder durch Synthese hergestellt,
können
ein oder mehrere Insertionen, Deletionen, Inversionen oder Substitutionen
der das Peptid darstellenden Aminosäuren vorgenommen werden.
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Die
zuvor genannten Antigene werden vorzugsweise in im wesentlichen
reinem Zustand verwendet. Die Menge des Gemischs der verabreichten
Antigene hängt
teilweise von der Reinheit der einzelnen Antigene ab. Daher würde bei
einer im wesentlichen reinen Form des nicht-toxischen doppelmutanten
Pertussistoxins oder des P.69-Außenmembranproteins typischerweise
eine Dosis im Bereich von etwa 1–100 Mikrogramm/Dosis an einen
Menschen verabreicht werden, wobei die tatsächliche Dosis von der Immunogenität des Präparats beim
Menschen bei Verabreichung an Schleimhaut-Oberflächen abhängt.
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Bei
einer im wesentlichen reinen Form des filamentösen B. pertussis-Hämagglutinins
läge ein
typischer Dosierungsbereich in der oben jeweils für das mutante
Pertussistoxin oder das P.69-Protein angegebenen Größenordnung.
Bei einem typischen Immunisierungsschema unter Verwendung der antigenen
Präparate der
vorliegenden Erfindung kann der Impfstoff in verschiedenen Dosen
(z. B. 1–4)
verabreicht werden, wobei jede Dosis 1–100 Mikrogramm jedes Antigens
enthält.
Das Immunisierungsschema kann eine Immunisierung rein auf dem Schleimhautwege
oder eine Kombination von mukosaler und parenteraler Immunisierung
umfassen. Die Dosierung hängt
im allgemeinen von der Immunogenität der verschiedenen Antigene
bei Verabreichung an die Atemwege von Tieren ab.
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Die
Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgend angegebenen
Beispiele und die begleitenden Abbildungen veranschaulicht, ohne
darauf beschränkt
zu sein, bei denen:
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1 die
Wirkungen der intranasalen und subkutanen Immunisierung mit PT 9K/129G
auf Bakterienmengen in den Lungen von BALB/c-Mäusen auf eine Provokation mit
B. pertussis hin veranschaulicht;
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2 die
Ergebnisse der Analyse der Bakterienzählung, wie aus einer Nasenspülung entnommen,
auf die intranasale und subkutane Immunisierung mit PT 9K/129G und
anschließende
Aerosol-Provokation mit B. pertussis hin, zeigt;
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3 die
Wirkung des Choleraenterotoxins (CT), Pertussistoxins (PTX) und
PT 9K/129G auf die Serum-IgG-Reaktion auf Fragment C des Tetanustoxins
hin veranschaulicht;
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4 die
Serum-IgG-Reaktion auf PTX, PT 9K/129G und CT bei intranasal immunisierten
Mäusen veranschaulicht;
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5 die
Wirkung von CT, PTX und PT 9K/129G auf die Serum-IgG-Reaktion auf
Fragment C und die Wirkung der Auffrischung veranschaulicht;
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6 die
Serum-Reaktion auf PTX, PT 9K/129G und CT bei intranasal immunisierten
Mäusen
und die Wirkung der Auffrischung veranschaulicht;
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7 die
Wirkung von CT, PTX und PT 9K/129G auf die sekretorische IgA-Reaktion
auf Fragment C in den Atemwegen von NIH:S-Mäusen veranschaulicht;
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8 die
sekretorische IgA-Reaktionen auf CT, PTX und PT 9K/129G in den Atemwegen
von NIH:S-Mäusen
veranschaulicht;
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9 die
Serum-Anti-Frg C-Reaktion bei BALB/c- und NIH:S-Mäusen veranschaulicht;
und
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10 die
Serum-Anti-PTX- oder PT 9K/129G-Reaktionen bei BALB/c- und NIH:S-Mäusen veranschaulicht.
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BEISPIEL 1
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Intranasale Immunisierung mit B. pertussis-PT
9K/129G-Mutante
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Die
Mäuse wurden
dreimal mit B. pertussis-PT 9K/129G-Mutante, wie erhalten von Sclavo
(4,4 Mikrogramm pro Dosis), oder Ovalbumin (10 Mikrogramm pro Dosis)
intranasal immunisiert, wobei die zweiten und dritten Dosen am Tag
28 bzw. 150 verabreicht wurden. Nach der zweiten und dritten Dosis
wurden ELISPOT-Analysen (siehe unten) vorgenommen, um die Immunreaktion
in den Lungen der Mäuse
zu bestimmen. Die Antikörper-Reaktionen
in den Lungen, wie 7 Tage nach der zweiten Dosis und 5 Tage nach
der dritten Dosis festgestellt, sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt.
Aus den Ergebnissen ist erkennbar, dass die Immunantwort auf die
intranasale Verabreichung des mutanten Pertussistoxins PT 9K/129G
wesentlich besser war als die durch Ovalbumin (OVA) stimulierte
Reaktion. Tabelle 1
| | Serum-Reaktion | Lungen-ELISPOT – 2. Dosis (ASC/108-Lymphozysten) | Lungen-ELISPOT – 3. Dosis (ASC/108-Lymphozysten) |
| | IgG | IgA | IgM | IgG | IgA | IgM |
| PT 9K/129G | 2500 | 2706 | < 50 | 39 | 4423 | 1231 | 115 |
| OVA | < 50 | < 40 | < 40 | 40 | 49 | < 49 | 244 |
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BEISPIEL 2
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Intranasale Immunisierung mit einer Kombination
von FHA, P69 und Pertussistoxin-Mutante
PT 9K/129G
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BALB/c-Mäuse wurden
intranasal mit 10 Mikrogramm jedes der obigen Antigene 36 und 14
Tage vor der Aerosol-Provokation mit B. pertussis BBC 26 immunisiert.
Das Außenmembranprotein
von B. pertussis, P.69, wurde intrazellulär in E. coli synthetisiert
und ausgereinigt, wie beschrieben bei A. J. Makoff et al., Bio-Technology
8, 1030 (1990). Filamentöses
Hämagglutinin
(FHA) wurde durch SKB aufgrund einer Vereinbarung über den
Austausch von Reagentien bereitgestellt. Die Antigene wurden unmittelbar
vor der Immunisierung in PBS verdünnt.
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Erwachsene
(6–8 Wochen)
Mäuse wurden
mit Metathan anästhesiert
und die Antigenlösung
in die äußeren Nasenlöcher der
Mäuse eingebracht,
als sie wieder zu Bewußtsein
kamen. Das Antigen wurde in die Atemwege durch Inhalation aufgenommen.
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Die
aus der Analyse der Kolonie-bildenden Einheiten von B. pertussis
in den Lungen erhaltenen Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Zu Vergleichszwecken sind auch die entsprechenden, aus der subkutanen Immunisierung
erhaltenen Zahlen gezeigt. Wie zu erkennen, ergab die Immunisierung über den
nasalen Weg Ergebnisse, die den mittels des subkutanen Wegs erhaltenen
Ergebnissen breit entsprachen.
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Die
Ergebnisse der Analyse der Bakterienzählungen von B. pertussis, wie
aus einer Nasenspülung
gewonnen, sind in 2 gezeigt. Auch hier sind die
durch die subkutane Verabreichung erhaltenen Zahlen zum Vergleich
gezeigt. Aus den Zahlen ist erkennbar, dass die Immunisierung auf
dem subkutanen Wege eine etwas größere Reduktion der Bakterienzählungen
als bei der intranasalen Verabreichung bis etwa zum Tag 10 ergab,
wohingegen vom Tage 10 an die Bakterienzählung eine größere Reduktion
bei auf dem intranasalen Wege immunisierten Tieren zeigte.
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BEISPIEL 3
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Serum- und sekretorische Immunreaktionen
auf Fragment C, PT, PT 9K/129G und CT bei intranasal immunisierten
Mäusen.
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Gruppen
erwachsener weiblicher, durch Kreuzung nicht-verwandter Tiere gezüchteter
NIH:S-Mäuse wurden
intranasal (I/N) mit 10 μg
des Fragments C (FRG C) alleine oder in Mischung mit 5 μg Choleraenterotoxin
(CT), aktivem Pertussistoxin (PTX) oder PT 9K/129G 25 d entfernt
immunisiert. Das Choleraenterotoxin wurde von Sigma (Dorset, UK)
bezogen; das aktive Pertussistoxin stammte von Calbiochem (Nottingham,
UK) oder NIBSC (Herts., UK); und das mutante Pertussistoxin PT 9K/129G
wurde von IRIS (Siena, Italy) erhalten.
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Vor
der Immunisierung wurden die Mäuse
mit Metathan anästhesiert
und das Antigen in die äußeren Nasenlöcher der
Mäuse eingebracht,
als sie wieder zu Bewußtsein
kamen. Das Antigen wurde in die Atemwege durch Inhalation aufgenommen.
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Als
ein Vergleich wurde eine Gruppe von Mäusen zweimal subkutan (S/C)
mit 10 μg
des an Aluminiumhydroxid-Gel (Alhydrogel) absorbierten Fragments
C immunisiert. Die Serumproben wurden 14 Tage nach Primärimmunisierung
und die Proben des Serums und der Nasenspülungen 14 Tage nach der Auffrischung genommen.
Die Antikörper-Reaktionen gegen
jede der Komponenten wurden mit ELISA bestimmt.
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Die
Serum-Anti-Frg C-IgG-Reaktionen im Anschluss an eine einzelne Immunisierung
sind in 3 dargestellt, worin jeder Punkt
auf dem Graphen für
einen von fünf
Mäusen
erhaltenen Mittelwert steht. Die Anti-Fragment C-Antikörper wurden
bei I/N mit Frg C oder Frg C + PTX immunisierten Mäusen nicht
nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wiesen Mäuse, die Frg C in Kombination
mit PT 9K/129G oder CT erhalten hatten, signifikante Mengen an Anti-Frg
C-Antikörpern
in ihrem Serum auf. Die Mengen der Anti-Frg C-Antikörper waren
in den beiden Gruppen ähnlich
und etwas geringer als die bei parenteral immunisierten Mäusen. Die
I/N mit Frg C und CT immunisierten Mäuse zeigten eine sehr starke
Serum-IgG-Reaktion auf CT (Titer größer 14.580, 4).
Anti-PTX-Antikörper
waren bei jenen Mäusen
vorhanden, die PT 9K/129G, doch nicht PTX, erhalten hatten (4).
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Um
die Wirkung der Auffrischung zu bestimmen, wurden die Mäuse zweimal
intranasal entweder mit Frg C + PTX, Frg C + PT 9K/129G, Frg C +
CT oder subkutan mit an Alhydrogel adsorbiertem Frg C immunisiert.
10 μg Frg
C wurden in jedem Fall verabreicht, plus 5 μg PTX, PT 9K/129G oder CT. Die
Serumproben wurden 14 Tage nach der zweiten Immunisierung genommen.
Die IgG-Reaktionen wurden mittels ELISA analysiert, wobei die Ergebnisse
in 5 und 6 gezeigt sind. In 5 und 6 zeigt
jeder Punkt den Mittelwert von 5 Mäusen + 1 SEM. Wie die Figuren
zeigen, serokonvertierte ein Teil der Mäuse nach der Auffrischung,
die Frg C alleine I/N erhalten hatten (2/5). Die Mäuse in der
Frg C + PTX-Gruppe zeigten ebenfalls eine Frg C-Reaktion im Anschluss
an die zweite Dosis, wobei diese größer war als die bei den Mäusen, die Frg
C alleine I/N erhalten hatten (5), was
aufzeigte, dass PTX als ein Adjuvans gewirkt hatte. Auch die Mäuse mit
Frg C + PTX-Auffrischung entwickelten zirkulierende Anti-PTX-Antikörper (6).
Allerdings war sowohl die Anti-Frg C- als auch die Anti-PTX-Reaktion
der bei Frg C + PT 9K/129G-Mäusen
beträchtlich
unterlegen (5 und 6). Die
stärksten
Reaktionen waren in der Frg C + CT-Gruppe zu erkennen. Die Anti-Frg C-Reaktion
war stärker
als bei S/C-immunisierten Mäusen,
wobei Anti-Frg C-IgG bei einer Serumverdünnung von 1/800.000 noch immer
nachweisbar war. Bei der entsprechenden Verdünnung hatte die Anti-CT-Reaktion
noch nicht zu titrieren begonnen.
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BEISPIEL 4
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Respiratorische IgA-Reaktionen
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Die
sekretorischen Reaktionen wurden in den Nasenspülungen von Mäusen untersucht,
die zweimal wie in Beispiel 3 beschrieben immunisiert worden waren.
Die Spülungen
wurden 14 Tage nach der zweiten Immunisierung vorgenommen und die
IgA-Reaktionen mittels ELISA analysiert. Die IgA-Reaktionen in einer 1/5-Verdünnung der
Nasenspülungen
sind in 7 und 8 gezeigt,
worin jeder Balken für
den Mittelwert von 5 Mäusen
+ 1 SEM steht. Wie die Figuren zeigen, war das IgA-Anti-Frg C in der Nasenspülung aller
Mäuse in
den Frg C + PTX, Frg C + PT 9K/129G und Frg C + CT-Gruppen vorhanden
(7). Wie im Serum war die Reaktion bei den Mäusen am
stärksten,
die CT als Adjuvans erhalten hatten. Es wurde sehr wenig Frg C-spezifisches
IgA aus den Nasenhöhlen
der Mäuse
erhalten, die Frg C nur I/N oder parenteral erhalten hatten. In jeder
Gruppe zeigte eine einzige Maus Anzeichen einer IgA-Reaktion, was
nur in der unverdünnten
Nasenspülung
nachweisbar war. Die entsprechenden IgA-Reaktionen auf PTX, PT 9K/129G
und CT waren stärker
als die gegen Frg C, wobei auch hier die Anti-CT-Reaktion die stärkste war
(8).
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BEISPIEL 5
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Vergleich der intranasalen Immunogenität und der
Adjuvantizität
von PTX und PT 9K/129G bei durch Inzucht erhaltenen Mäusen und
durch Kreuzung nicht-verwandter Tiere gezüchteten Mäusen
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Um
zu bestätigen,
dass sich der beobachtete Unterschied zwischen PTX und PT 9K/129G
bezüglich der
Immunogenität
und Adjuvantizität
auf die Quelle des PTX bezog, wurde eine Einzeldosis-Untersuchung
bei NIH:S-Mäusen
unter Verwendung von PTX von einem unterschiedlichen Lieferanten
(NIBSC) wiederholt. Um außerdem
zu untersuchen, ob der genetische Hintergrund des Wirts sowohl das
Adjuvans als auch die Immunogenität von aktivem und genetisch
inaktivem PTX beeinflusst, wurden auch die Reaktionen bei einem
durch Inzucht erhaltenen Stamm (BALB/c) untersucht. Die BALB/c-Mäuse wurden
deshalb ausgewählt,
weil zuvor berichtet worden war, dass dieser Stamm eine Serumreaktion,
wenn auch eine schwache, auf parenteral verabreichtes Pertussistoxin
entwickeln kann. Die Mäuse
wurden intranasal mit einer Einzeldosis von 10 μm des Frg C alleine oder kombiniert
mit PTX oder PT 9K/129G, oder mit einem an Alhydrogel adsorbiertem
Frg C, wie zuvor beschrieben, immunisiert. 18 Tage später wurden
Blutserumproben entnommen und mittels ELISA analysiert. Um zu bestimmen,
ob die Mäuse
eine Schutzimmunität
entwickelt hatten, wurden sie 22 Tage nach der Immunisierung mit
Tetanustoxin provoziert und die Todesfälle 4 Tage lang aufgezeichnet.
Die Ergebnisse sind in 9 und 10 gezeigt.
In 9 und 10 steht jeder Punkt für den Mittelwert
von 3 Mäusen
+ SEM.
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Sowohl
bei BALB/c- als auch NIH:S-Mäusen
provozierte das Vorhandensein von PT 9K/129G hohe Antikörper-Titer
gegen Fragment C (9). Im Gegensatz zur vorangegangenen
Studie zeigte PTX eine Adjuvans-Wirkung auf die Frg C-Serum-Reaktion
bei NIH:S-Mäusen,
ebenso wie bei BALB/c-Mäusen.
Bei beiden Mäusestämmen löste die
Kombination von Frg C und PT 9K/129G eine überlegene Serum-Frg C-Reaktion
im Vergleich zu Frg C + PTX aus, obschon der Unterschied kein großer war.
Bei den BALB/c-Mäusen,
anhand derer der Vergleich vorgenommen wurde, war die Kombination
von Frg C und PT 9K/129G bei I/N-Verabreichung fast ebenso wirksam
wie die S/C-Immunisierung mit an Alhydrogel adsorbiertem Frg C beim
Auslösen einer
Serumreaktion. Wie auch zuvor, reagierten die NIH:S-Mäuse auf
eine Einzeldosis von 10 μg des
Frg C bei I/N nicht. Eine der drei BALB/c-Mäuse, die I/N mit Frg C alleine
immunisiert worden waren, zeigte eine signifikante Serumreaktion,
was für
die großen
Fehler-Balken in 9, ebenso wie für die Schutzdaten
(siehe unten), verantwortlich ist.
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Beide
Mäusestämme zeigten ähnliche
Serumreaktionen auf PTX und PT 9K/129G (siehe 10).
Die PTX-Reaktion war messbar, wenn auch schwach. Die PT 9K/129G-Reaktion
war um mehrere Größenordnungen
größer, wie
auch bei früheren
Untersuchungen festgestellt.
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Die
Mäuse wurden
mit Tetanustoxin provoziert, um festzustellen, ob die durch I/N-Immunisierung ausgelösten Anti-Frg
C-Antikörper
protektiv waren, die Ergebnisse wessen in Tabelle 2 gezeigt sind.
Alle Mäuse, die
Frg C + PTX oder PT 9K/129G erhielten, waren geschützt. Die
einzige BALB/c-Maus, die auf die I/N-Immunisierung mit Frg C alleine
hin servokonvertierte, war geschützt,
wohingegen die verbliebenen BALB/c-Mäuse in dieser Gruppe, die ähnlich immunisierten
NIH:S-Mäuse
und die nicht-immunisierten
Kontroll-BALB/c-Mäuse
alle starben. TABELLE 2 Vergleich der Servokonversion auf Fragment
C und Schutz vor Tetanus-Provokation bei I/N-immunisierten BALB/c-
und NIH:S-Mäusen.
| BALB/c |
| | Frg
C | Frg
C + PTX | Frg
C + PT 9K/129G | Frg
C sub/cut | nicht-immunisiert |
| Serokonversion
(Positive/Gesamtzahl) | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 0/3 |
| Schutz
(Überlebende/Gesamtzahl) | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 0/3 |
| NIH:S |
| Serokonversion
(Positive/Gesamtzahl) | 0/3 | 3/3 | 3/3 | NB | 0/3 |
| Schutz
(Überlebende/Gesamtzahl) | 0/3 | 3/3 | 3/3 | NB | 0/3 |
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Die
Mäuse wurden
I/N mit einer Einzeldosis von Frg C, Frg C + PT, Frg C + PT 9K/129G,
Frg C + CT, oder S/C mit an Alhydrogel adsorbiertem Frg C immunisiert.
Sie erhielten 10 μg
Frg C und 5 μg
der anderen Proteine. Die Mäusen
wurden 15 Tage nach der Immunisierung zur Probenahme bluten gelassen
und 22 Tage nach der Immunisierung mit 10 LD50 von
Tetanustoxin provoziert, dann die Todesfälle 4 Tage lang aufgezeichnet.
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MATERIALIEN UND METHODEN
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AEROSOL-PROVOKATION MIT B. PERTUSSIS
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Die
Mäuse wurden
in Käfige
auf einer Rotationsscheibe in eine Plastik-Sichtkammer eingebracht,
wie beschrieben bei P. Novotny et al. Development for Biological
Standards, 61, 27 (1985). Eine bakterielle Suspension in PBS wurde
aus 2 bis 3 Tage alten Kulturen von B. pertussis BBC26, gezüchtet auf
CW-Blutagarplatten, hergestellt.
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Die
Mäuse wurden
einem Aerosol (erzeugt aus der bakteriellen Suspension) von 2 × 109 Kolonie-bildenden Einheiten (CFU) in PBS
mittels eines Turret-Mundstückröhrchens,
betrieben durch einen System-22-CR50-"high glow"-Kompressor (Medic-Aid, Pagham, West
Sussex, UK) ausgesetzt, der einen sehr feinen Nebel bei einem dynamischen
Fluss von 8,5 Litern pro Minute ergab. Der erzeugte Nebel wurde
durch eine Kammer mittels einer Vakuumpumpe bei einem Durchfluss
von ca. 12 l Luft pro Nebelgemisch pro Minute gezogen, was eine
relative Feuchtigkeit von 70% in der Kammer aufrechterhielt. Die
Aerosol-Benebelung dauerte 30 Minuten; daraufhin wurde eine Zeitspanne
von 10 Min. zum Lüften
der Kammer eingeräumt.
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Dann
wurde der Verlauf der Infektion durch Zählungen der lebensfähigen Bakterien
in den Lungen ausgewertet. Gruppen von vier Mäusen wurden in bestimmten Zeitabständen entnommen
und durch Halsdislokation getötet,
woraufhin ihre Lungen aseptisch entnommen und in einem Potter-Elvehjem-Homogenisator mit
2 ml PBS homogenisiert wurden. Verdünnungen des Homogenats wurden
auf Cohen-Wheeler(CW)-Blutagarplatten aufgetüpfelt und die Anzahl der CFU
für jeden
Lungensatz bestimmt.
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ELISPOT-Assay für spezifische Antikörper-sekretierende
Zellen (ASC) in Nager-Lungen
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Die
lokale Antikörper-Produktion
in der Nager-Lunge wurde unter Anwendung der ELISPOT-Technik bestimmt.
Die Lymphozyten wurden aus den Nager-Lungen wie folgt isoliert:
Die Lungen wurden kurz in PBS gewaschen, um Blutspuren zu entfernen,
und dann mit einem Skalpellmesser fein gehackt. 1 ml PBS, enthaltend
10 mM MgCl2, 0,5 E/ml Collagenase A (Boehringer
Mannheim, Lewes, UK) und 0,25 mg/ml DNase I (Boehringer) wurde jedem
Lungenpaar zugegeben und bei 37°C
unter leichtem Rütteln über 45 Min.
hinweg inkubiert. Das Gemisch wurde dann durch ein 40-Gauge-Sieb
passiert. Klümpchen
wurden durch das Sieb mit dem Taucher einer 5-ml-Spritze gedrückt. Die
Zellsuspension wurde in ein Zentrifugen-Röhrchen eingebracht und mehrere
Minuten lang stehengelassen, damit sich große Trümmer absetzen konnten. Der Überstand
wurde entfernt und die Zellen pelletiert und mehrmals gewaschen.
Rote Blutzellen und nicht-lebensfähige Zellen wurden mittels
Zentrifugation auf einem FicolRTM-Isopaque-Gradienten
(LSM, Flow Laborstories Ltd., Herts, UK) entfernt. Nach dem Waschen
wurde die Lebensfähigkeit
der Zellen mittels Trypan-Blau-Ausschluss bestimmt. Die Zellen wurden
schließlich
in RPM11640-Vollmedium (10% Kälberfötusserum,
Penicillin 100 IE/ml), Streptomycin 100 g/ml, L-Glutamin 2 mm; Flow)
suspendiert.
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Der
ELISPOT-Assay wurde wie folgt vorgenommen: Kurz gesagt wurden 24-Well-Gewebekulturplatten
(Costar) über
Nacht mit P.69, FHA oder OVA (0,5 ml an 1 g/ml in PBA) beschichtet.
Nach dem Waschen und Blockieren wurden Mengen von 0,5 ml der Verdünnungen
der Lymphozyten-Suspension in komplettem RPM1 1640 den Wells zugegeben
und bei 37°C/10%
CO2 über
3 Std. hinweg inkubiert. Nach dem Waschen wurde Ziege-Anti-Maus-IgG,
A oder M (1/1000, Sigma) aufeinanderfolgend zugegeben. Schließlich wurde Substratlösung (0,5
l an 1 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) in 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-(AMP)-Puffer,
Sigma) zugegeben und die Platten inkubiert, bis unter leistungsschwacher
Mikroskopie blaue Flecken sichtbar wurden.