DE69433120T2

DE69433120T2 - Methode zur Herstellung von Taxan-Typ Diterpen und Methode zur Gewinnung von Kulturzellen die Taxan-Typ Diterpen in hohen Ausbeuten herstellen

Info

Publication number: DE69433120T2
Application number: DE69433120T
Authority: DE
Inventors: Yukihito Kuga-gun Yukimune; Yosuhiro Kuga-gun Hara; Yosuke Kuga-gun Higashi; Naoto Kuga-gun Ohnishi; Homare Kuga-gun Tabata; Chuzo Kuga-gun Suga; Kouichi Kuga-gun Matsubara
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1993-11-15
Filing date: 1994-11-09
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2014-11-10
Also published as: HK1030021A1; US5637484A; EP0683232B1; EP1054065B1; CN1248629A; DE69431135T2; WO1995014103A1; CA2153986C; KR960700044A; DE69426692D1; EP1348764A1; CA2153986A1; EP1054065A1; CN1083012C; HK1029807A1; EP1063299A3; CN1119028A; CN1083011C; DE69431135D1; US6403343B2

Description

Diese Erfindung betrifft betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines taxanartigen Diterpens, einschließlich Taxol, das als therapeutisches Mittel gegen Eierstockkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und dergleichen verwendbar ist.
Taxol, das als therapeutisches Mittel gegen Eierstockkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und dergleichen verwendbar ist, ist ein taxanartiges Diterpen, das nach der Isolierung aus Taxus brevifolia NUTT identifiziert wurde, wobei es sich um eine Pflanze handelt, die zur Gattung Taxus, Familie Taxaceae, gehört und eine komplexe Estergruppe aufweist, die mit ihrer Wirksamkeit in Verbindung gebracht wird. Taxol kann in allen Teilen des Pflanzenkörpers von Taxus brevifolia NUTT gefunden werden, es wurde jedoch berichtet, dass der Gehalt des Taxols in der Rinde den aller anderen übersteigt. Gegenwärtig wird Taxol aus einem natürlichen oder einem kultivierten Pflanzenkörper gesammelt, jedoch wächst die zur Gattung Taxus gehörende Pflanze langsam, und es dauert mehr als 10 Jahre, um auf eine Höhe von 20 cm über dem Boden zu wachsen, und außerdem stirbt der Baum nach der Abnahme seiner Rinde, und somit war es schwierig, eine große Menge an Taxol einfach zu erhalten. Es wäre vorteilhaft, wenn ein taxanartiges Diterpen, wie Taxol und Baccatin III, das eine Vorstufe von Taxol ist, unter Verwendung einer Gewebekultur hergestellt werden kann, da ohne Fällen der Bäume eine große Menge an Taxol einfach erhalten werden kann.
Als ein übliches Verfahren zur Herstellung von Taxol unter Verwendung von kultivierten Pflanzenzellen veröffentlichte ein U.S.-Patent ein Herstellungsverfahren unter Verwendung von kultivierten Zellen von Taxus brevifolia NUTT (US-Patent Nr. 5,019,504), jedoch beträgt die Ausbeute der darin beschriebenen Taxolherstellung 1–3 mg/l, und das ist für die industrielle Herstellung ungenügend. Außerdem ist die Herstellung von Taxol durch die Zellkultur instabil, und sogar wenn durch Auswahl eine Primärzelle hoher Produktivität erhalten werden kann, ist es schwierig, ihren Gehalt durch Subkultivierung aufrechtzuerhalten [E. R. M. Wickremesine et al., World Congress on Cell and Tissue Culture (1992)].
Andererseits ist als eine Taxolherstellung des Standes der Technik ein halbsynthetisches Verfahren aus Baccatin III, das eine Vorstufe der Biosynthese von Taxol ist, in der von Holton et al. veröffentlichten Beschreibung von des US-Patents 5,015,744 offenbart. Unter Verwendung der Pflanzengewebekultur kann ein Rohmaterial für das halbsynthetische Verfahren, wie Baccatin III, hergestellt werden, und somit kann die Pflanzengewebekultur auch für die Taxolherstellung durch das vorstehend erwähnte halbsynthetische Verfahren verwendet werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines taxanartigen Diterpens, wobei Gewebe oder Zellen einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, unter Verwendung von sauerstoffhaltigem Gas, das 0,03 bis 10% Kohlendioxid enthält und in das Kultivierungsgefäß eingebracht werden soll, kultiviert werden, und das taxanartige Diterpen aus den so erhaltenen Kulturen zurückgewonnen wird.
Die Zufuhr eines Gases, das Sauerstoff enthält, zu einer Kulturflüssigkeit ist notwendig, um Gewebe oder Zellen einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, zu kultivieren. Normalerweise wird für diesen Zweck Luft verwendet, jedoch stellten die Erfinder nach einer intensiven Untersuchung fest, dass die Herstellung des taxanartigen Diterpens unter Verwendung eines Gases, das 0,03–10% und bevorzugt 0,1–5% Kohlendioxid enthält, als Gas, das zur Kultivierung der Gewebe oder Zellen der Pflanze, die das taxanartige Diterpen herstellen, in einen Tank eingebracht werden soll, effizient durchgeführt werden kann. Das vorliegende Verfahren kann mit einem der folgenden drei Verfahren zur Herstellung eines taxanartigen Diterpens kombiniert werden, die selbst kombiniert werden können, um ihre Wirksamkeit zu erhöhen.
Verfahren 1
Ein Verfahren zur Herstellung eines taxanartigen Diterpens, wobei Gewebe oder Zellen einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, in Gegenwart von mindestens einer Substanz, ausgewählt aus Jasmonsäuren, Verbindungen, die ein Schwermetall enthalten, Komplexionen, die ein Schwermetall enthalten, Schwermetallionen, Aminen und Antiethylenmitteln, kultiviert werden, und dann das taxanartige Diterpen aus den so erhaltenen Kulturen zurückgewonnen wird.
Verfahren 2
Ein Verfahren zur Herstellung eines taxanartigen Diterpens, wobei Gewebe oder Zellen einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, unter Regulierung der Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft von der Anfangsstufe der Kultivierung an oder unter Regulierung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in einem flüssigen Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt steht, auf weniger als die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur von der Anfangsstufe der Kultivierung an kultiviert werden, und dann das taxanartige Diterpen aus den so erhaltenen Kulturen zurückgewonnen wird.
Verfahren 3
Ein Verfahren zur Gewinnung von kultivierten Zellen, die ein taxanartiges Diterpen in einer hohen Ausbeute herstellen, wobei Zellen einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, nach dem Unterschied ihrer spezifischen Dichten in eine Vielzahl von Schichten fraktioniert werden, und die in mindestens einer Schicht enthaltenen Zellen kultiviert werden, und dann solche kultivierten Zellen, die das taxanartige Diterpen in einer hohen Ausbeute herstellen, aus diesen kultivierten Zellen ausgewählt werden.
Das taxanartige Diterpen, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist auf kein Diterpen besonders beschränkt, sofern es ein Taxangerüst aufweist, und veranschaulichende Beispiele schließen Taxol, 7-Epitaxol, Baccatin III, 7-Epibaccatin III, Cephalomannin, 7-Epicephalomannin, 10-Deacetylbaccatin III, 10-Deacetylcephalomannin, 10-Deacetyltaxol, Taxagifin, ein Analogon davon, Taxan 1a, ein Analogon davon, Xylosylcephalomannin, Xylosyltaxol und dergleichen ein.
Beispiele der Pflanze, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll und das taxanartige Diterpen herstellt, sind diejenigen, die zur Gattung Taxus gehören, wie Taxus baccata LINN, Taxus cuspidata SIEB. et ZUCC, Taxus cuspidata SIEB. et ZUCC var. nana REHDER, Taxus brevifolia NUTT, Taxus canadiensis MARSH, Taxus chinensis und Taxus media.
Im Fall des vorstehenden Verfahrens 1 kann die Kultivierung der vorstehend erwähnten Pflanze durch das vorbekannte Verfahren durchgeführt werden, außer dass das Gewebe oder die Zellen der Pflanze, die das taxanartige Diterpen herstellt, in Gegenwart von mindestens einer Substanz, ausgewählt aus Jasmonsäuren, Verbindungen, die ein Schwermetall enthalten, Komplexionen, die ein Schwermetall enthalten, Schwermetallionen, Aminen und Antiethylenmitteln, kultiviert werden.
Beispiele von Jasmonsäuren schließen eine Verbindung der allgemeinen Formel (I):
[wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e und R^1f jeweils ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
R², R³, R⁴, R⁵ und R^6a jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
die Seitenkette aus C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶ eine oder mehr Doppelbindungen enthalten kann;
R^6b eine Hydroxylgruppe oder einen -O-Kohlenhydratrest darstellt;
R⁷ eine Hydroxylgruppe, einen Rest OM (wobei M ein Alkalimetallatom, ein Erdalkalimetallatom oder eine Gruppe NH₄ ist), einen Rest NHR⁸ (wobei R⁸ ein Wasserstoffatom, einen Acylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Aminosäurerest darstellt), einen Rest OR⁹ (wobei R⁹ ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein Kohlenhydratrest ist) oder einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
n eine ganze Zahl von 1–7 ist;
und in dem vorstehend erwähnten fünfgliedrigen Ring zwischen den benachbarten Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung gebildet werden kann],
eine Verbindung der allgemeinen Formel (II):
[wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e und R^1f jeweils ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
die Seitenkette aus C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶ eine oder mehr Doppelbindungen enthalten kann;
R⁷ eine Hydroxylgruppe, einen Rest OM (wobei M ein Alkalimetallatom, ein Erdalkalimetallatom oder eine Gruppe NH₄ ist), einen Rest NHR⁸ (wobei R⁸ ein Wasserstoffatom, einen Acylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Aminosäurerest darstellt), einen Rest OR⁹ (wobei R⁹ ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein Kohlenhydratrest ist) oder einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
n eine ganze Zahl von 1–7 ist;
und in dem vorstehend erwähnten fünfgliedrigen Ring zwischen den benachbarten Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung gebildet werden kann],
und eine Verbindung der allgemeinen Formel (III):
[wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e und R^1f jeweils ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
die Seitenkette aus C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶ eine oder mehr Doppelbindungen enthalten kann;
R⁷ eine Hydroxylgruppe, einen Rest OM (wobei M ein Alkalimetallatom, ein Erdalkalimetallatom oder eine Gruppe NH₄ ist), einen Rest NHR⁸ (wobei R⁸ ein Wasserstoffatom, einen Acylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Aminosäurerest darstellt), einen Rest OR⁹ (wobei R⁹ ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein Kohlenhydratrest ist) oder einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt;
n eine ganze Zahl von 1–7 ist;
und in dem vorstehend erwähnten fünfgliedrigen Ring zwischen den benachbarten Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung gebildet werden kann], ein.
Bevorzugte Beispiele von Jasmonsäuren der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) schließen eine Verbindung der allgemeinen Formel (I') ein:
[wobei R^1' ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt;
die Seitenkette aus C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶ zwischen C¹ und C², zwischen C² und C³ oder zwischen C³ und C⁴ eine Doppelbindung enthalten kann;
R^6b eine Hydroxylgruppe oder einen -O-Kohlenhydratrest darstellt;
R^7' eine Hydroxylgruppe, einen Rest OM (wobei M ein Alkalimetallatom, ein Erdalkalimetallatom oder eine Gruppe NH₄ ist), einen Rest NHR^8' (wobei R^8' ein Wasserstoffatom, einen Acylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Aminosäurerest darstellt) oder einen Rest OR^9' (wobei R^9' einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Kohlenhydratrest darstellt) darstellt;
n eine ganze Zahl von 1–7 ist;
und in dem vorstehend erwähnten fünfgliedrigen Ring zwischen den benachbarten Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung gebildet werden kann], und bevorzugte Beispiele von Jasmonsäuren der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (II) schließen eine Verbindung der allgemeinen Formel (II') ein:
[wobei R^1' ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt;
die Seitenkette aus C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶ zwischen C¹ und C², zwischen C² und C³ oder zwischen C³ und C⁴ eine Doppelbindung enthalten kann;
R^7' eine Hydroxylgruppe, einen Rest OM (wobei M ein Alkalimetallatom, ein Erdalkalimetallatom oder eine Gruppe NH₄ ist), einen Rest NHR^8' (wobei R^8' ein Wasserstoffatom, einen Acylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Aminosäurerest darstellt) oder einen Rest OR^9' (wobei R^9' einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Kohlenhydratrest darstellt) darstellt;
n eine ganze Zahl von 1–7 ist;
und in dem vorstehend erwähnten fünfgliedrigen Ring zwischen den benachbarten Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung gebildet werden kann], und bevorzugte Beispiele von Jasmonsäuren der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (III) schließen eine Verbindung der allgemeinen Formel (III') ein:
[wobei R^1' ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt;
die Seitenkette aus C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶ zwischen C¹ und C², zwischen C² und C³ oder zwischen C³ und C⁴ eine Doppelbindung enthalten kann;
R^7' eine Hydroxylgruppe, einen Rest OM (wobei M ein Alkalimetallatom, ein Erdalkalimetallatom oder eine Gruppe NH₄ ist), einen Rest NHR^8' (wobei R^8' ein Wasserstoffatom, einen Acylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Aminosäurerest darstellt) oder einen Rest OR^9' (wobei R^9' einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Kohlenhydratrest darstellt) darstellt;
n eine ganze Zahl von 1–7 ist;
und in dem vorstehend erwähnten fünfgliedrigen Ring zwischen den benachbarten Kohlenstoffatomen eine Doppelbindung gebildet werden kann].
In den vorstehend erwähnten allgemeinen Formeln (I), (II) und (III) schließen Beispiele des durch R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e,R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R^6a, R⁷, R⁸ oder R⁹ dargestellten Alkylrestes mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, t-Butyl-, n-Pentyl- und n-Hexylgruppe ein.
In den vorstehend erwähnten allgemeinen Formeln (I), (II) und (III) schließen Beispiele des durch R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e oder R^1f dargestellten Alkoxyrestes mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen zum Beispiel eine Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, Isopropoxy-, n-Butoxy-, Isobutoxy-, sek.-Butoxy-, t-Butoxy-, n-Pentyloxy- und n-Hexyloxygruppe ein
Wenn R⁷ ein Rest OM ist, schließen Beispiele eines durch M dargestellten Alkalimetallatoms oder Erdalkalimetallatoms zum Beispiel Natrium, Kalium und Calcium ein.
Wenn R⁷ ein Rest NHR⁸ ist, kann der durch R⁸ dargestellte Acylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen entweder eine unverzweigte Kette oder eine verzweigte Kette aufweisen, und Beispiele schließen zum Beispiel eine Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Valeryl-, Hexanoyl- und Acryloylgruppe ein.
Wenn R⁷ ein Rest NHR⁸ ist, schließen Beispiele eines durch R⁸ dargestellten Aminsäurerestes eine Isoleucyl-, Tyrosyl- und Tryptophylgruppe ein.
Wenn R⁷ ein Rest OR⁹ ist, ist ein Beispiel eines durch R⁹ dargestellten Kohlenhydratrestes eine Glucopyranosylgruppe, und wenn R^6b in der vorstehend erwähnten allgemeinen Formel (I) ein -O-Kohlenhydratrest ist, ist ein Beispiel eines Kohlenhydratrestes eine Glucopyranosylgruppe.
In den Verbindungen der allgemeinen Formeln (I), (II) und (III) kann zwischen den benachbarten Kohlenstoffatomen in dem fünfgliedrigen Ring eine Doppelbindung gebildet werden.
Veranschaulichende Beispiele der Verbindung der allgemeinen Formel (I) schließen die im Folgenden gezeigten ein:
(Verbindung A)
(Verbindung B)
(Verbindung C)
(Verbindung D)
Veranschaulichende Beispiele der Verbindung der allgemeinen Formel (II) schließen die wie im Folgenden gezeigten ein:
(Verbindung E)
(Verbindung F)
(Verbindung G)
(Verbindung H)
Veranschaulichende Beispiele der Verbindung der allgemeinen Formel (III) schließen die wie im Folgenden gezeigten ein:
(Verbindung I)
R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e,R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶: H
Zwischen C³ und C⁴ wird eine Doppelbindung gebildet.
R⁷: -OH oder -OCH₃
n: 1 bis 3
(Verbindung J)
R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e,R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶: H
R⁷: -OH
n: 1
Veranschaulichende Beispiele der Verbindung der allgemeinen Formel (III), wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e oder R^1f eine Hydroxylgruppe ist, oder zwischen benachbarten Kohlenstoffatomen in dem fünfgliedrigen Ring eine Doppelbindung gebildet wird, schließen die nachstehend gezeigten ein:
(Verbindung K)
(Verbindung L)
(Verbindung M)
(Verbindung N)
Bevorzugte Beispiele einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), (II) oder (III) schließen die Verbindungen ein, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e,R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Hydroxylgruppe oder eine Methoxygruppe ist, und die Seitenkette aus C¹-C²-C³-C⁴-C⁵-C⁶ keine Doppelbindung enthält oder zwischen C¹ und C², zwischen C² und C³ oder zwischen C³ und C⁴ eine Doppelbindung enthält.
Jasmonsäuren der allgemeinen Formel (I), (II) oder (III) weisen verschiedene Stereoisomere (cis-trans-Isomere und optische Isomere) auf, und jedes Isomer kann allein oder in Form eines Gemisches verwendet werden.
Alle der vorstehend gezeigten Jasmonsäuren weisen die Wirkung der Verbesserung der Produktivität bei der Herstellung des taxanartigen Diterpens auf, jedoch sind Tuberonsäure, Tuberonsäuremethylester, Cucurbinsäure, Cucurbinsäuremethylester, Jasmonsäure und Jasmonsäuremethylester, die die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), (II) oder (III) sind, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e,R^1f, R², R³, R⁴, R⁵, und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Hydroxylgruppe oder eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und zwischen C³ und C⁴ eine Doppelbindung gebildet wird, vom Gesichtspunkt ihrer hohen Wirksamkeit bei der Verbesserung der Produktivität besonders bevorzugt.
Diese Jasmonsäuren werden durch Synthese oder Extraktion und dergleichen aus einer Pflanze hergestellt (H. Yamane et al., Agric. Biol. Chem., 44, 2857–2864 (1980)).
Im Übrigen gibt es eine Beschreibung, die angibt, dass Jasmonsäuren durch verschiedene Pflanzen selbst als phytohormonartige Substanz hergestellt werden, die verschiedene Reaktionen auslöst, die die Wachstumsförderung, die Gewebereifung und das Auftreten einer Resistenz gegenüber Krankheiten betreffen (Teruhiko Yoshihara, Shokubutsu Saibo Kogaku, Bd. 2, Nr. 4, 523–531 (1990)).
Folglich können die an dem Verfahren 1 beteiligten Jasmonsäuren nicht nur von außen in das Kultursystem gegeben werden, sondern auch durch die kultivierten Zellen oder kultivierten Gewebe selbst hergestellt werden. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Förderung der Herstellung solcher endogener Jasmonsäuren durch die kultivierten Zellen oder kultivierten Gewebe schließt die Zugabe von Kulturen aus Mikroorganismen, eines Extrakts oder einer wärmebehandelten Substanz davon oder eines Pflanzenextrakts zu einem Kulturmedium ein, und ein veranschaulichendes Beispiel eines solchen Verfahrens ist ein Verfahren der Zugabe einer Pilzzellwandfraktion, das von M. J. Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90 (16), 7490– 7494 (1993), beschrieben wurde. Es ist auch möglich, die Menge der hergestellten endogenen Jasmonsäure zu erhöhen, indem die kultivierten Zellen oder kultivierten Gewebe mechanisch oder durch ultraviolette Strahlung oder Wärme teilweise beschädigt werden, und ein veranschaulichendes Beispiel eines solchen Verfahrens ist eine mechanische Zellzerstörung eines Teils der Zellen (R. A. Cleeman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89(11), 4938–4941 (1989).
Da Jasmonsäuren in Wasser kaum löslich sind, werden sie in der Regel in einem organischen Lösungsmittel, wie Ethanol und Methanol, oder in einem oberflächenaktiven Mittel und dergleichen gelöst und dann zu einem Kulturmedium gegeben. Jasmonsäuren in freigesetzter Form können als solche verwendet werden, oder sie werden in Form eines Salzes verwendet, indem sie mit Alkali neutralisiert werden.
Von den Jasmonsäuren neigen die Verbindungen der Formel (I) oder (III) dazu, in der stabilen trans-Form als in der instabilen cis-Form vorzuliegen, da die Epimerisierung in der α-Stellung zur Carbonylgruppe in dem fünfgliedrigen Ring durch eine Säure, eine Base oder Wärme auftritt. In einem Gleichgewichtsexperiment unter Verwendung von natürlichen oder synthetisch hergestellten Jasmonsäuren liegt die trans-Form in einem Anteil von 90% und die cis Form in einem Anteil von 10% vor. Es wird allgemein angenommen, dass die cis-Form eine höhere Wirksamkeit aufweist, jedoch schließen die Jasmonsäuren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, alle Stereoisomere der Verbindungen der vorstehend erwähnten Formel (I) oder (III) und die Gemische davon ein.
Es ist erforderlich, dass die Jasmonsäuren in einem Kulturmedium eine Konzentration von 0,01– 1000 μM aufweisen, und gemäß der ersten Erfindung der vorliegenden Anmeldung wird die Konzentration der Jasmonsäuren besonders bevorzugt auf einen Bereich von 0,1 bis 500 μM reguliert.
Die Induktion einiger sekundärer Metaboliten durch die Zugabe von Jasmonsäuren zu Pflanzenzellkulturen ist in DE 4122208 C1 beschrieben, es gab jedoch keine Berichte über die Durchführung einer Gewebekultivierung einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, in Gegenwart von Jasmonsäuren als Mediumzusatz, und es konnte nicht erwartet werden, dass die Menge des hergestellten taxanartigen Diterpens, das einen völlig anderen Biosyntheseweg oder die Biosynthese regulierenden Mechanismus als den der sekundären Metaboliten aufweist, die in dem vorstehend erwähnten Patent offenbart wurden, durch das Verfahren 1 erhöht wurde.
In der internationalen Veröffentlichung WO Nr. 93/17121 gibt es eine Beschreibung, dass Jasmon oder Methyljasmon, das eine zu den Jasmonsäuren der Formel (I), (II) oder (III), die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, analoge Struktur aufweist, wirksam eine Taxolherstellung induziert. Diese Verbindungen weisen jedoch im Gegensatz zu den Jasmonsäuren keine Gruppe, wie eine Carboxylgruppe, auf, die in der Formel (I), (II) oder (III) durch die Formel -(CH₂)_n-CO-R⁷ dargestellt ist, und es wurde festgestellt, dass die Taxol induzierende Wirksamkeit dieser Verbindungen gering ist (siehe Vergleichsbeispiel Nr. 24).
Die Schwermetalle von Verfahren 1 sind auf kein Schwermetall besonders beschränkt, sofern es zur Kupfergruppe oder Eisengruppe gehört, wobei jedoch die Verwendung von Silber als Metall, das zur Kupfergruppe gehört, besonders bevorzugt ist, und die Verwendung von Cobalt als Metall, das zur Eisengruppe gehört, besonders bevorzugt ist. Zusätzlich dazu wird, wenn Silber oder Kobalt verwendet wird, es bevorzugt in Form einer Verbindung, die das Schwermetall enthält, eines Komplexions, das das Metall enthält, oder in Form des Metallions verwendet. Diese Verbindungen können allein oder in Kombination verwendet werden.
Veranschaulichende Beispiele der Verbindung, die Silber enthält, schließen Silbernitrat, Silbersulfat, Silberfluorid, Silberchlorat, Silberperchlorat, Silberacetat, Silbersulfat, Silberhexafluorphosphat(V), Silbertetrafluorborat, Diaminsilber(I)-sulfat, Kaliumdiaminoargentat(I) und dergleichen ein. Unter diesen können besonders bevorzugte Verbindungen durch Silbernitrat, Silbersulfat und dergleichen beispielhaft dargestellt werden.
Veranschaulichende Beispiele des Komplexions, das Silber enthält, schließen [Ag(S₂O₃)₂]^3–, [Ag(S₂O₃)₃]^5–, [Ag(NH₃)₂]⁺, [Ag(CN)₂]^–, [Ag(CN)₃]^2–, [Ag(SCN)₂]^–, [Ag(SCN)₄]^3– und dergleichen ein. Unter diesen können besonders bevorzugte Komplexionen durch [Ag(S₂O₃)₂]^3–, [Ag(S₂O₃)₃]^5– und dergleichen beispielhaft dargestellt werden.
Veranschaulichende Beispiele der Verbindung, die Kobalt enthält, schließen Cobaltchlorid, Cobaltnitrat, Cobaltsulfat, Cobaltfluorid, Cobaltperchlorat, Cobaltbromid, Cobaltiodid, Cobaltselenat, Cobaltthiocyanat, Cobaltacetat, Ammoniumcobaltsulfat, Cobalt(II)-kaliumsulfat, Hexaammincobalt(III)-chlorid, Pentaamminaquacobalt(III)-chlorid, Nitropentaammincobalt(III)-chlorid, Dichlortetraammincobalt(III)-chloridhemihydrat, Dinitrotetraammincobalt(III)-chlorid, Carbonatotetraammincobalt(III)-chlorid, Ammoniumtetranitrodiammincobaltat(III), Natriumhexanitrocobaltat(III), Tris(ethylendiamin)cobalt(III)-chloridtrihydrat, Dichlorbis(ethylendiamin)cobalt(III)-chlorid, Kaliumtris(oxalato)cobaltat(III)-trihydrat, Kaliumhexacyanocobaltat(III), Kalium(ethylendiamintetraacetato)cobaltat(III)-dihydrat, Hydridotetracarbonylcobalt(I), Dicarbonyl(cyclopentadienyl)cobalt(I), Octacarbonyldicobalt(0), Hexacarbonyl(acetylen)dicobalt(0), Bis(cyclopentadienyl)cobalt(I), (Cyclopentadienyl)(1,5-cyclooctadien)cobalt(I) und dergleichen ein. Unter diesen können besonders bevorzugte Verbindungen durch Cobaltchlorid, Cobaltnitrat, Cobaltsulfat und dergleichen beispielhaft dargestellt werden.
Veranschaulichende Beispiele des Komplexions, das Cobalt enthält, schließen das Pentaamminaquacobaltion, das Nitropentaammincobaltion, das Dichlortetraammincobaltion, das Dinitrotetraammincobaltion, das Carbonatotetraammincobaltion, das Tetranitrodiammincobaltion, das Hexanitrocobaltion, das Tris(ethylendiamin)cobaltion, das Dichlorbis(ethylendiamin)cobaltion, das Tris(oxalato)cobaltion, das Hexacyanocobaltion, das (Ethylendiamintetraacetat)cobaltion und dergleichen ein.
Von den Schwermetallen weist die Verbindung, die Silber enthält, das Komplexion, das Silber enthält, oder das Silberion bevorzugt eine Konzentration in dem Medium von 10^–8 M–10^–1 M auf, und die Konzentration wird ferner bevorzugt auf einen Bereich von 10^–7 M bis 10^–2 M eingestellt. Die Verbindung, die Cobalt enthält, das Komplexion, das Cobalt enthält, oder das Cobaltion weist bevorzugt eine Konzentration in dem Medium von 10^–6 M–10^–7 M auf, und die Konzentration wird ferner bevorzugt auf einen Bereich von 10^–5 M bis 10^–2 M eingestellt.
Bisher wurden keine Fälle berichtet, in denen die Gewebekultivierung einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, in Gegenwart einer Verbindung, die Silber enthält, eines Komplexions, das Silber enthält, oder eines Silberions als Zusatz zu dem Medium durchgeführt wird. Obwohl die Verbindungen, die Cobalt enthalten, oder Cobaltionen als eine der Mediumkomponenten für ein solches Medium enthalten sind, das im Allgemeinen als Medium für die Gewebekultivierung einer Pflanze, die zur Gattung Taxus gehört, wie das Linsmaier-Skoog-Medium, Murashige-Skoog-Medium und Gamborgs B-5-Medium, verwendet wird, werden sie in einer Konzentration von 1 × 10^–7 M–4 × 10^–7 M verwendet [Growth and breeding of a woody plant, herausgegeben vom aktuellen Komitee der Herausgeber vollständiger Biotechnologiearbeiten, Nogyo Tosho, S. 265–268], was eine viel niedrigere Konzentration als die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten ist. In der Zwischenzeit wurden keine Fälle berichtet, in denen die Gewebekultivierung einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, in Gegenwart einer Verbindung durchgeführt wird, die, wie im Fall der vorstehend erwähnten Silberverbindung, Cobalt oder Cobaltionen in einer so hohen Konzentration enthält, wie sie in der ersten Erfindung der vorliegenden Anmeldung verwendet wird. Zusätzlich dazu konnte nicht erwartet werden, dass die Menge des taxanartigen Diterpens, das hergestellt werden soll, durch die in Gegenwart solcher Schwermetalle durchgeführte Kultivierung erhöht wird.
Gemäß Verfahren 1 wird mit Aminen ein Amin oder ein Salz davon bezeichnet. Als Amine können sowohl Monoamine als auch Polyamine verwendet werden, jedoch ist die Verwendung von Polyaminen besonders bevorzugt.
Zusätzlich dazu schließen Beispiele der Amine Mono-, Di- oder Trialkylamine, wobei ein Teil der Wasserstoffatome in dem Alkylrest durch eine Hydroxylgruppe ersetzt sein kann, wie Methylamin, Ethylamin, Dimethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Diethanolamin, Triethanolamin oder ein Salz davon; Polymethylendiamin, wobei die Polymethyleneinheit durch eine Iminogruppe unterbrochen sein kann, und das Wasserstoffatom in der Aminogruppe durch einen Niederalkylrest ersetzt sein kann, wie Putrescin, Cadaverin, Spermidin, Spermin, Ethylendiamin, N,N-Diethyl-1,3-propandiamin, Triethylentetramin oder ein Salz davon; cyclische Alkylamine, wie Cyclopentylamin, Cyclohexylamin oder ein Salz davon, oder ein cyclisches Amin, wie Methenamin und Piperazin oder ein Salz davon, ein. Unter diesen Aminen können bevorzugte Amine durch Polyamine, wie Putrescin [NH₂(CH₂)₄NH₂], Cadaverin [Spermidin [NH₂(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH₂], Spermin NH₂(CH₂)₅NH₂], [NH₂(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NH₂], Ethylendiamin [NH₂(CH₂)₂NH₂], N,N-Diethyl-1,3-propandiamin [(C₂H₅)₂N(CH₂)₃NH₂], Diethylentriamin [NH₂(CH₂)₂NH(CH₂)₂NH₂] und dergleichen oder ein Salz davon, beispielhaft dargestellt werden.
Die Amine weisen in dem Medium bevorzugt eine Konzentration von 10^–8 M–10^–1 M auf, und die Konzentration wird ferner bevorzugt auf einen Bereich von 10^–7 M bis 10^–2 M eingestellt.
Ein veranschaulichendes Beispiel, in dem gezeigt wird, dass durch die Zugabe von Aminen zu den Pflanzengewebekulturen ein sekundärer Metabolit induziert wird, ist in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 4-262788 gezeigt, in der gezeigt wird, dass die Indolalkaloidherstellung durch die Zugabe von Aminen zu kultivierten Zellen von Catharanthus roseus induziert wird. Es wurden jedoch keine Fälle berichtet, in denen die Gewebekultivierung einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, wobei es sich um eine andere Pflanzenart als Catharanthus roseus handelt, in Gegenwart von Aminen als Zusatz zu dem Medium durchgeführt wurde, und es konnte nicht erwartet werden, dass die Menge des taxanartigen Diterpens, das hergestellt werden soll und einen völlig anderen Biosyntheseweg als den des Indolalkaloids aufweist, dadurch erhöht werden kann.
Das Antiethylenmittel von Verfahren 1 ist auf keine spezielle Substanz besonders beschränkt, sofern es eine Substanz ist, die den Ethylenbiosynthesemechanismus der Kulturen hemmt, und/oder eine Substanz ist, die das in den Kulturen verbliebene oder in der Gasphase oder in dem Medium in dem Kultivierungsgefäß, das die Kulturen enthält, vorhandene Ethylen entfernt.
Veranschaulichende Beispiele eines Verfahrens zur Hemmung des Ethylenbiosynthesemechanismus schließen ein Verfahren zur Hemmung der Aktivität eines Enzyms, das die Umwandlung von S-Adenosylmethionin in 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure katalysiert, und ein Verfahren zur Hemmung der Aktivität eines Enzyms, das die Umwandlung von 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure in Ethylen katalysiert, ein, und veranschaulichende Beispiele der Verbindung mit der erstgenannten Wirkungsweise schließen Aminoxyessigsäure, Acetylsalicylsäure, Rhizobitoxin, Aminoethoxyvinylglycin, Methoxyvinylglycin, α-Aminoisobuttersäure, 2,4-Dinitrophenol und dergleichen ein. Sie können auch ein Salz, einen Ester, ein Aminosäurederivat und ein Kohlenhydratderivat der Verbindung einschließen.
Veranschaulichende Beispiele des Salzes schließen Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze ein, veranschaulichende Beispiele des Esters schließen Methyl-, Ethyl-, Propyl, und Butylester ein, veranschaulichende Beispiele der Aminosäurederivate schließen Glycin-, Methionin- und Phenylalaninderivative ein, und veranschaulichende Beispiele des Kohlenhydratderivats schließen Glucose- und Maltosederivate ein. Das Salz, der Ester, das Aminosäurederivat und das Kohlenhydratderivat sind nicht auf die vorstehend erwähnten Verbindungen beschränkt.
Veranschaulichende Beispiele der Verbindung mit der letztgenannten Wirkungsweise schließen Gallussäure, ein Salz, einen Ester, ein Aminosäurederivat und ein Kohlenhydratderivat davon ein [Hiroshi Hyodo, Society of Horticulture Autumn Convention 1987 Symposium Summary, S. 122, Susumu Kuraishi, Phytohormone, Tokyo University Publication, S. 111].
Veranschaulichende Beispiele des Salzes schließen Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze ein, veranschaulichende Beispiele des Esters schließen Methyl-, Ethyl-, Propyl, und Butylester ein, veranschaulichende Beispiele der Aminosäurederivate schließen Glycin-, Methionin- und Phenylalaninderivative ein, und veranschaulichende Beispiele des Kohlenhydratderivats schließen Glucose- und Maltosederivate ein. Das Salz, der Ester, das Aminosäurederivat und das Kohlenhydratderivat sind nicht auf die vorstehend erwähnten Verbindungen beschränkt.
Veranschaulichende Beispiele der Substanz, die das in den Kulturen verbliebene oder in der Gasphase oder in dem Medium in dem Kultivierungsgefäß, das die Kulturen enthält, vorhandene Ethylen entfernt, schließen 1,5-Cyclooctadien und Isothiocyansäure, ein Salz, einen Ester (wie Isothiocyansäureallylester und Isothiocyansäurebenzylester), ein Aminosäurederivat und ein Kohlenhydratderivat davon ein [Megumi Munakata, Chemical control in plants, 29(1), 89–93 (1994)].
Veranschaulichende Beispiele des Salzes schließen Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze ein, veranschaulichende Beispiele des Esters schließen Methyl-, Ethyl-, Propyl, Butyl- und Allylester ein, veranschaulichende Beispiele der Aminosäurederivate schließen Glycin-, Methionin- und Phenylalaninderivative ein, und veranschaulichende Beispiele des Kohlenhydratderivats schließen Glucose- und Maltosederivate ein. Das Salz, der Ester, das Aminosäurederivat und das Kohlenhydratderivat sind nicht auf die vorstehend erwähnten Verbindungen beschränkt.
Es ist erforderlich, dass das Antiethylenmittel in dem Kulturmedium eine Konzentration von 10^–8 M–10^–1 M aufweist, und die Konzentration des Antiethylenmittels wird besonders bevorzugt auf einen Bereich von 10^–7 M bis 10^–2 M reguliert.
Es ist bekannt, dass Ethylen eines der Phytohormone ist und an verschiedenen physiologischen Phänomenen, die in der Pflanze hervorgerufen werden, wie Wachstum des Individuums, Morphogenese und Alterung, beteiligt ist. Ein Bericht von Kim, Dong II et al., Biotechnol. Bioeng., 38(4), 331–39 (1991) ist ein veranschaulichendes Beispiel, wo Ethylen zur Verbesserung der Produktivität des sekundären Metaboliten durch die Pflanze verwendet wird. In allen Beispielen, in denen die Regulierung von Ethylen zur Verbesserung der Produktivität des sekundären Metaboliten verwendet wird, ist es jedoch die Regulierung der Ethylenzufuhr zu den Pflanzengewebekulturen, wie typischerweise in dem vorstehend erwähnten Bericht gezeigt wurde, und bisher wurden keine Fälle berichtet, in denen die Regulierung der Hemmung der Ethylenherstellung verwendet wurde, um, wie im vorstehenden Verfahren 1, die Herstellung des sekundären Metaboliten zu verbessern.
Zusätzlich dazu wird das Antiethylenmittel im Allgemeinen als Mittel zur Beibehaltung der Frische für Blumen, Früchte und Gemüse verwendet, es wurden jedoch keine Fälle berichtet, in denen das Antiethylenmittel zum Zweck der Verbesserung der Herstellung des sekundären Metaboliten verwendet wurde.
Unter diesen Umständen stellten die Erfinder fest, dass Ethylen die Herstellung des taxanartigen Diterpens durch die Gewebe und Zellen der Pflanze, die das taxanartige Diterpen herstellt, stark hemmt. Auf Grundlage der vorstehend erwähnte Erkenntnis kultivierten die Erfinder folglich die Gewebekulturen in Gegenwart des Antiethylenmittels, und stellten fest, dass das Antiethylenmittel nicht nur die vorstehend erwähnte Hemmung reguliert, sondern auch die aus den Kulturen erhaltene Menge des taxanartigen Diterpens beachtlich verbessert. Es wurden keine Fälle berichtet, in denen die Herstellung des taxanartigen Diterpens durch die Kultivierung der Gewebekulturen einer Pflanze, die ein taxanartiges Diterpen herstellt, in Gegenwart eines Antiethylenmittels induziert wird, und es konnte nicht erwartet werden, dass die Produktivität des vorstehend erwähnten sekundären Metaboliten durch das Verfahren 1 sogar erhöht werden kann.
Beispiele des Mediums, das für das Verfahren 1 verwendet werden soll, schließen die bekannten Medien, die üblicherweise für die Pflanzengewebekultivierung verwendet werden, wie das Medium von Murashige & Skoog (1962), das Medium von Linsmaier Skoog (1965), das Woody Plant Medium (1981), das B-5-Medium von Gamborg und das M-9-Medium von Mitsui, ein.
Ein Phytohormon und, falls notwendig eine Kohlenstoffquelle, eine anorganische Komponente, Vitamine, Aminosäuren und dergleichen können ebenfalls zu diesen Medien gegeben werden.
Als Kohlenstoffquelle kann ein Disaccharid, wie Saccharose, Maltose und Lactose, ein Monosaccharid, wie Glucose, Fructose und Galactose, Stärke oder ein Gemisch aus zwei oder mehr Arten solcher Zuckerquellen, die in einem geeigneten Verhältnis gemischt wurden, verwendet werden.
Als anorganische Komponente schließen veranschaulichende Beispiele Phosphor, Stickstoff, Kalium, Calcium, Magnesium, Schwefel, Eisen, Mangan, Zink, Bor, Kupfer, Molybdän, Chlor, Natrium, Iod und Cobalt ein, und diese Komponenten können in Form einer Verbindung, wie Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Calciumnitrat, Kaliumchlorid, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Borsäure, Kupersulfat, Natriummolybdat, Molybdäntrioxid, Kaliumiodid, Kobaltchlorid und dergleichen, zugegeben werden.
Als Phytohormone können zum Beispiel Auxine, wie Indolessigsäure (IAA), Naphthalinessigsäure (NAA) und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), und Cytokinine, wie Kinetin, Zeatin und Dihydrozeatin, verwendet werden.
Als Vitamine können zum Beispiel Biotin, Thiamin (Vitamin B₁), Pyridoxin (Vitamin B₆), Pantothensäure, Inosit, Nicotinsäure und dergleichen verwendet werden.
Als Aminosäuren können zum Beispiel Glycin, Phenylalanin, Leucin, Glutamin, Cystein und dergleichen zugegeben werden.
Im Allgemeinen werden die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 30 g/l, die anorganische Komponente in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 100 mM, die Phytohormone in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 10 μM und die Vitamine beziehungsweise die Aminosäuren in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 100 mg/l verwendet.
Sowohl ein flüssiges Medium als auch ein festes Medium, das Agar und Gelangummi normalerweise in einer Menge von 0,1–1% enthält, kann verwendet werden, es ist jedoch in der Regel ein flüssiges Medium bevorzugt.
Zur Gewebekultivierung kann ein Stück eines Gewebes oder Zellen einer Wurzel, eines Wachstumspunkts, eines Blatts, eines Stängels, eines Samens, einer Polle, eines Staubbeutels, eines Blütenkelchs und dergleichen der Pflanze oder kultivierte Zellen, die durch die Gewebekultivierung davon in dem vorstehend erwähnten Medium oder einem anderen üblichen Medium erhalten werden, verwendet werden.
Dieses Verfahren kann auch auf neoplastische Zellen und/oder eine Haarwurzel angewendet werden, die durch Infizieren eines Pflanzengewebes mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes erhalten wurden.
Durch Kultivierung dieser Gewebe oder Zellen in Gegenwart von mindestens einer Substanz, ausgewählt aus Jasmonsäuren, Verbindungen, die ein Schwermetall enthalten, Komplexionen, die ein Schwermetall enthalten, Schwermetallionen, Aminen und Antiethylenmitteln, gemäß Verfahren 1 können kultivierte Gewebe oder kultivierte Zellen erhalten werden, die eine höhere Produktivität des taxanartigen Diterpens als die derjenigen aufweisen, die durch eine unter normalen Kultivierungsbedingungen durchgeführte Gewebekultivierung erhalten wurden.
Wenn mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus Verbindungen, die ein Schwermetall enthalten, Komplexionen, die ein Schwermetall enthalten, Schwermetallionen, Aminen und Antiethylenmitteln, zusammen mit Jasmonsäuren der vorstehend erwähnten allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III) verwendet wird, kann die Wirkung von Verfahren 1 gesteigert werden.
Das taxanartige Diterpen kann durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, aus den Kulturen, wie kultivierten Geweben, kultivierten Zellen und Kulturmedium, die gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren erhalten werden, fraktioniert werden. Es ist ebenfalls möglich, das taxanartige Diterpen kontinuierlich während der Kultivierung wiederzugewinnen, indem man gleichzeitig ein geeignetes Adsorptionsmittel oder ein organisches Lösungsmittel in dem Kulturmedium vorliegen lässt.
Ein bevorzugtes Beispiel der Gewebekultivierung kann wie folgt veranschaulicht werden.
Ein Stück eines Pflanzenkörpers einer Pflanze, die zur Gattung Taxus gehört, wie eine Wurzel, ein Wachstumspunkt, ein Blatt, ein Stängel, ein Samen und dergleichen, wird sterilisiert, auf ein mit Gelangummi verfestigtes Woody Plant Medium gegeben und etwa 14–60 Tage bei 10–35°C gehalten, so dass ein Teil des Gewebestücks zu einem Kallus verändert wird. Durch Subkultivierung des so erhaltenen Kallus wird die Wachstumsgeschwindigkeit nach und nach erhöht, und ein stabilisierter Kallus kann erhalten werden. Als stabilisierter Kallus wird ein Kallus bezeichnet, der während der Kultivierung im Kalluszustand bleibt, ohne eine Differenzierung zu einem Trieb oder einer Wurzel zu zeigen, und dessen Zellen eine einheitliche Wachstumsgeschwindigkeit aufweisen.
Dieser stabilisierte Kallus wird in ein flüssiges Medium, das für das Wachstum geeignet ist, wie flüssiges Woody Plant Medium, überführt, und man lässt ihn wachsen. Die Wachstumsgeschwindigkeit wird in dem flüssigen Medium weiter erhöht. Gemäß Verfahren 1 lässt man den stabilisierten Kallus oder die Zellen, die den vorstehend erwähnten Kallus bilden, in einem festen Medium oder flüssigen Medium in Gegenwart von mindestens einer Substanz, ausgewählt aus Jasmonsäuren, Verbindungen, die ein Schwermetall enthalten, Komplexionen, die ein Schwermetall enthalten, Schwermetallionen, Aminen und Antiethylenmitteln, wachsen. Und es ist ebenfalls möglich, den stabilisierten Kallus oder die Zellen, die den Kallus bilden, gemäß dem Unterschied ihrer spezifischen Dichten in eine Vielzahl von Schichten zu fraktionieren, und die in mindestens einer Schicht enthaltenen Zellen in einem Kulturmedium, das mindestens eine Substanz, ausgewählt aus Jasmonsäuren, Verbindungen, die ein Schwermetall enthalten, Komplexionen, die ein Schwermetall enthalten, Schwermetallionen, Aminen und Antiethylenmitteln, enthält, wachsen zu lassen.
In einem allgemein bekannten Verfahren zur Fraktionierung der Zellen gemäß ihrer spezifischen Dichten wird durch ein Medium zur Zentrifugaltrennung ein Dichtegradient gebildet, die Zellen werden darübergeschichtet, und dann wird die Zentrifugaltrennung durchgeführt.
Als Medium zur Zentrifugaltrennung werden Ficoll, Percoll (beide von Pharmacia LKB Biotechnology Co. Ltd., hergestellt), Saccharose, Cäsiumchlorid und dergleichen verwendet. In den Beispielen, einschließlich Beispiel Nr. 5, wurde der Dichtegradient unter Verwendung von Ficoll erzeugt, jedoch ist das Medium auf keine Substanz besonders beschränkt, sofern sie die Zellen nicht schädigt.
Die Zahl der Schichten, die den Dichtegradienten bilden, ist nicht besonders eingeschränkt. Der Unterschied zwischen den spezifischen Dichten der Schichten ist nicht besonders eingeschränkt, und jeder Unterschied der spezifischen Dichte kann gleich oder verschieden sein.
Folglich schließt die Definition des Dichtegradienten einen Fall ein, in dem sich der Gradient kontinuierlich ändert (der Zustand, in dem die Zahl der Schichten, die den Dichtegradienten bilden, nahe unendlich ist, und der Unterschied der spezifischen Dichte zwischen jeder Schicht nahe 0 ist).
Die Zellen können gemäß dem Unterschied ihrer spezifischen Dichten zu einer Vielzahl von Schichten fraktioniert werden, indem auf diese Weise der Dichtegradient gebildet wird, die Zellen darübergeschichtet werden, und die Zentrifugaltrennung durchgeführt wird.
Die spezifische Dichte der Schicht, die gebildet werden soll, liegt normalerweise im Bereich von 1,00 bis 1,20 g/ml und bevorzugt im Bereich von 1,03 bis 1,11 g/ml. Als Schicht für eine Kultivierung wird mindestens eine Schicht ausgewählt, es ist jedoch auch möglich, alle Schichten auszuwählen und sie zu kultivieren.
Wenn eine Vielzahl von Schichten ausgewählt wird, und die in den ausgewählten Schichten enthaltenen Zellen kultiviert werden, ist es möglich, die Zellen in diesen Schichten einzeln zu kultivieren, es ist jedoch auch möglich, die Zellen in zwei oder mehr Schichten der ausgewählten Vielzahl von Schichten zu mischen und sie zu kultivieren.
Die kultivierten Zellen mit einer hohen Produktivität des taxanartigen Diterpens können in der Regel unter Kultivierung der Zellen erhalten werden, die in einer Schicht, die eine spezifische Dichte von 1,07 oder weniger aufweist, enthalten sind, sie ist jedoch nicht immer auf diesen Bereich beschränkt, da sie abhängig von den Zellen, die kultiviert werden sollen, oder den Kultivierungsbedingungen schwanken kann. Es besteht auch eine Tendenz, dass die Zellen in einer Schicht, die eine höhere spezifische Dichte aufweist, zum Zeitpunkt der Durchführung der Fraktionierung gemäß dem Unterschied der spezifischen Dichten einen höheren Gehalt des taxanartigen Diterpens aufweisen. Um sicherzustellen, dass kultivierte Zellen, die das taxanartige Diterpen in einer hohen Ausbeute herstellen, erhalten werden können, ist es folglich wünschenswert, dass die Zellen in allen fraktionierten Schichten eine bestimmte Zeitdauer kultiviert werden, dann die Konzentration des taxanartigen Diterpens in den Zellen jeder Schicht gemessen wird, und die Schicht, die die kultivierten Zellen enthält, die das taxanartige Diterpen in einer hohen Ausbeute herstellen, aus diesen Schichten ausgewählt wird.
Es ist auch möglich, die kultivierten Zellen gemäß dem Unterschied der spezifischen Dichten in eine Vielzahl von Schichten zu fraktionieren, indem ein Medium, das eine besondere spezifische Dichte, wie zum Beispiel 1,07 g/ml, aufweist, zur Zentrifugaltrennung hergestellt wird, und die Zentrifugaltrennung gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren durchgeführt wird.
Ferner kann Verfahren 1 zusammen mit dem Verfahren 2 verwendet werden, wobei die Kultivierung unter Regulierung der Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft von der Anfangsstufe der Kultivierung an oder unter Regulierung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, auf weniger als die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur von der Anfangsstufe der Kultivierung an durchgeführt wird.
Mit Anfangsstufe der Kultivierung wird hier der Zeitpunkt, an dem die Kultivierung begonnen wurde, bis zum 7. Tag nach dem Start der Kultivierung bezeichnet, und die Regulierung der Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß oder die Regulierung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, wird bevorzugt von Beginn der Kultivierung an durchgeführt. Die Regulierungsdauer ist nicht besonders eingeschränkt, und die Regulierung unter diesen Bedingungen kann während der gesamten Kultivierungsdauer oder nur während eines Teils der gesamten Kultivierungsdauer durchgeführt werden, jedoch wird die Regulierung bevorzugt mindestens 3 Tage während der gesamten Kultivierungsdauer durchgeführt.
Es ist erforderlich, dass die Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß auf 4–15% reguliert wird, und sie wird besonders bevorzugt auf 6–12% reguliert. Es ist erforderlich, dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium auf 1–75% der Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur reguliert wird, und sie wird besonders bevorzugt auf 10–75% reguliert.
Es ist auch möglich, Verfahren 1, Verfahren 2 und Verfahren 3 miteinander zu kombinieren.
Gemäß Verfahren 1 ist es wirksam, Jasmonsäuren zuzugeben, wenn die kultivierten Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase oder in der stationären Phase sind, und besonders bevorzugt werden Jasmonsäuren in der Übergangszeit von der exponentiellen Wachstumsphase bis zur stationären Phase zugegeben. Dasselbe kann über den Zeitpunkt der Behandlung zur Erhöhung der Menge der endogenen Jasmonsäuren, die hergestellt werden sollen, gesagt werden. Wenn zum Beispiel Zellen alle 21 Tage subkultiviert werden, ist der 7.–16. Tag der geeignete Zeitpunkt für die Zugabe der Jasmonsäuren oder die Behandlung zur Erhöhung der Menge der endogenen Jasmonsäuren, die hergestellt werden sollen, und wenn die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase, zum Beispiel die am 7.–14. Tag, subkultiviert werden sollen, ist der geeignete Zeitpunkt direkt nach der Übertragung. Die Zugabe der Jasmonsäuren oder die Behandlung zur Erhöhung der Menge der endogenen Jasmonsäure, die hergestellt werden soll, kann auf einmal, in einer Vielzahl von Teilen oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Die Zugabe von Verbindungen, die ein Schwermetall enthalten, Komplexionen, die ein Schwermetall enthalten, oder Schwermetallionen nach dem Beginn der Kultivierung und vor der Übergangszeit der kultivierten Zellen von der exponentiellen Wachstumsphase zur stationären Phase ist wirksam, und sie werden besonders bevorzugt am Beginn der Kultivierung zugegeben.
Die Zugabe der Verbindungen oder Ionen kann auf einmal oder in einer Vielzahl von Teilen durchgeführt werden.
Die Zugabe von Aminen vor der Übergangszeit der Zellen von der exponentiellen Wachstumsphase zur stationären Phase ist wirksam, und sie werden besonders bevorzugt am Beginn der Kultivierung zugegeben. Die Zugabe der Verbindungen oder Ionen kann auf einmal oder in einer Vielzahl von Teilen durchgeführt werden.
Die Zugabe von Antiethylenmitteln vor der Übergangszeit der Zellen von der exponentiellen Wachstumsphase zur stationären Phase ist wirksam, und sie werden besonders bevorzugt direkt nach dem Übergang zur stationären Phase zugegeben. Die Zugabe der Verbindungen kann auf einmal oder in einer Vielzahl von Teilen durchgeführt werden.
Die Temperatur für die Gewebekultivierung gemäß der ersten Erfindung der vorliegenden Anmeldung beträgt gemäß der hohen Wachstumsgeschwindigkeit in der Regel etwa 10 bis etwa 35°C und bevorzugt etwa 23–28°C. Was die Kultivierungsdauer anbetrifft, sind 14–42 Tage bevorzugt.
Wenn zur Kultivierung gemäß Verfahren 1 ein flüssiges Medium verwendet wird, können, nachdem die Kultivierung beendet ist, die kultivierten Zellen aus dem Kulturmedium durch ein Verfahren, wie Dekantation oder Filtration, fraktioniert werden, und das gewünschte taxanartige Diterpen kann aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium durch ein Verfahren, wie Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, fraktioniert werden.
Das Verfahren 2 wird wie folgt erklärt.
Gemäß Verfahren 2 bedeutet die Kultivierung der Pflanze die Kultivierung eines Gewebes oder von Zellen der Pflanze, wobei die Kultivierung durch ein üblicherweise bekanntes Verfahren durchgeführt wird, außer dass die Kultivierung unter Regulierung der Sauerstoffkonzentration in der Gasphase des Kultivierungsgefäßes auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft von der Anfangsstufe der Kultivierung an oder unter Regulierung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, auf weniger als die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur von der Anfangsstufe der Kultivierung an durchgeführt wird.
Bisher gab es über die Kultivierung einer Pflanze, die das taxanartige Diterpen herstellt, keine Berichte, wobei die Kultivierung unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass die Sauerstoffkonzentration in der Gasphase, die dem Kultivierungsgefäß, in dem das Gewebe oder die Zellen kultiviert werden, zugeführt werden soll, oder die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft oder auf weniger als die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs reguliert wird, und es konnte nicht erwartet werden, dass die Menge des taxanartigen Diterpens, das hergestellt werden soll, dadurch erhöht wird.
Gemäß Verfahren 2 ist es erforderlich, dass die Sauerstoffkonzentration in der Gasphase des Kultivierungsgefäßes, in dem das Gewebe oder die Zellen kultiviert werden, auf 4–15% reguliert wird, und sie wird besonders bevorzugt auf 6–12% reguliert. Es ist erforderlich, dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs des flüssigen Mediums, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, auf 1–75% der Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur reguliert wird, und sie wird besonders bevorzugt auf 10–75% reguliert.
Beispiele eines Mediums, das in dem Verfahren 2 verwendet werden soll, schließen das üblicherweise für die Gewebekultivierung einer Pflanze bekannte Medium, wie das Medium von Murashige & Skoog (1962), das Medium von Linsmaier Skoog (1965), das Woody Plant Medium (1981), das B-5-Medium von Gamborg, das M-9-Medium von Mitsui und dergleichen, ein.
Ein Phytohormon und, falls notwendig, eine Kohlenstoffquelle, eine anorganische Komponente, Vitamine, Aminosäuren und dergleichen können ebenfalls zu diesen Medien gegeben werden.
Als Kohlenstoffquelle kann ein Disaccharid, wie Saccharose, Maltose und Lactose, ein Monosaccharid, wie Glucose, Fructose und Galactose, Stärke oder ein Gemisch aus zwei oder mehr Arten solcher Zuckerquellen, die in einem geeigneten Verhältnis gemischt wurden, verwendet werden.
Als anorganische Komponente schließen veranschaulichende Beispiele Phosphor, Stickstoff, Kalium, Calcium, Magnesium, Schwefel, Eisen, Mangan, Zink, Bor, Kupfer, Molybdän, Chlor, Natrium, Iod und Cobalt ein, und diese Komponenten können in Form einer Verbindung, wie Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Calciumnitrat, Kaliumchlorid, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Borsäure, Kupersulfat, Natriummolybdat, Molybdäntrioxid, Kaliumiodid, Kobaltchlorid und dergleichen, zugegeben werden.
Als Phytohormon können zum Beispiel Auxine, wie Indolessigsäure (IAA), Naphthalinessigsäure (NAA) und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), und Cytokinine, wie Kinetin, Zeatin und Dihydrozeatin, verwendet werden.
Als Vitamine können zum Beispiel Biotin, Thiamin (Vitamin B₁), Pyridoxin (Vitamin B₆), Pantothensäure, Inosit, Nicotinsäure und dergleichen verwendet werden.
Als Aminosäuren können zum Beispiel Glycin, Phenylalanin, Leucin, Glutamin, Cystein und dergleichen zugegeben werden.
Im Allgemeinen werden die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 30 g/l, die anorganische Komponente in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 100 mM, die Phytohormone in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 10 μM und die Vitamine beziehungsweise die Aminosäuren in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 100 mg/l verwendet.
Gemäß Verfahren 2 kann sowohl ein flüssiges Medium als auch ein solches festes Medium, das normalerweise Agar und Gelangummi in einer Menge von 0,1 bis 1% enthält, verwendet werden.
Gemäß der Gewebekultivierung von Verfahren 2 können ein Stück eines Gewebes oder Zellen einer Wurzel, eines Wachstumspunkts, eines Blatts, eines Stängels, eines Samens, einer Polle, eines Staubbeutels, eines Blütenkelchs und dergleichen der Pflanze oder kultivierte Zellen, die durch Gewebekultivierung davon in dem vorstehend erwähnten Medium oder einem anderen üblichen Medium erhalten werden, verwendet werden.
Verfahren 2 kann auch auf neoplastische Zellen und/oder eine Haarwurzel angewendet werden, die durch Infektion mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes erhalten wurden.
Wenn diese Gewebe oder Zellen unter Regulierung der Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft von der Anfangsstufe der Kultivierung an oder unter Regulierung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, auf weniger als die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur von der Anfangsstufe der Kultivierung an kultiviert werden, können kultiviertes Gewebe oder kultivierte Zellen mit einer höheren Produktivität des taxanartigen Diterpens als die derjenigen erhalten werden, die durch eine unter normalen Kultivierungsbedingungen durchgeführte Gewebekultivierung erhalten werden.
Gemäß Verfahren 2 wird mit Anfangsstufe der Kultivierung der Zeitpunkt, an dem die Kultivierung begonnen wurde, bis zum 7. Tag nach dem Start der Kultivierung bezeichnet, und die Regulierung der Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß oder die Regulierung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, wird bevorzugt von Beginn der Kultivierung an durchgeführt.
Die Regulierungsdauer ist nicht besonders eingeschränkt, und die Regulierung unter diesen Bedingungen kann während der gesamten Kultivierungsdauer oder nur während eines Teils der gesamten Kultivierungsdauer durchgeführt werden, jedoch wird die Regulierung bevorzugt mindestens 3 Tage während der gesamten Kultivierungsdauer durchgeführt.
Das Herstellungsverfahren gemäß Verfahren 2 kann zusammen mit einem Kultivierungsverfahren verwendet werden, das in Gegenwart verschiedener Arten von Substanzen, die die Herstellung taxanartiger Diterpene fördern, durchgeführt wird, um die Produktivität des taxanartigen Diterpens weiter zu erhöhen.
Beispiele der Substanz, die die Herstellung taxanartiger Diterpene fördert, schließen zum Beispiel Jasmonsäuren der vorstehend erwähnten allgemeinen Formeln (I), (II) oder (III), Verbindungen, die ein Schwermetall enthalten, Komplexionen, die ein Schwermetall enthalten, Schwermetallionen, Amine und Antiethylenmittel, die für das vorstehend erwähnte Verfahren 1 verwendet werden sollen, ein.
Auch kann das Verfahren 2 zusammen mit dem Verfahren 3, das später ausführlich beschrieben wird, verwendet werden, wobei die Zellen gemäß dem Unterschied ihrer spezifischen Dichten in eine Vielzahl von Schichten fraktioniert werden, und die in mindestens einer Schicht enthaltenen Zellen kultiviert werden.
Das Herstellungsverfahren gemäß Verfahren 2 kann sowohl zusammen mit dem Verfahren gemäß Verfahren 1, wobei die Kultivierung in Gegenwart von Jasmonsäuren und dergleichen durchgeführt wird, als auch dem Verfahren 3 verwendet werden, wobei die Zellen gemäß dem Unterschied ihrer spezifischen Dichten in eine Vielzahl von Schichten fraktioniert werden, und die in mindestens einer Schicht enthaltenen Zellen kultiviert werden.
Das taxanartige Diterpen kann aus den Kulturen, wie kultivierten Geweben, kultivierten Zellen und Kulturmedium fraktioniert werden, die gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, erhalten werden.
Ein bevorzugtes Beispiel der Gewebekultivierung gemäß Verfahren 2 kann wie folgt veranschaulicht werden.
Ein Stück eines Pflanzenkörpers einer Pflanze, die zur Gattung Taxus gehört, wie eine Wurzel, ein Wachstumspunkt, ein Blatt, ein Stängel, ein Samen und dergleichen, wird sterilisiert, auf ein mit Gelangummi verfestigtes Woody Plant Medium gegeben und etwa 14–60 Tage bei 10–35°C gehalten, so dass ein Teil des Gewebestücks zu einem Kallus verändert wird. Durch Subkultivierung des so erhaltenen Kallus wird die Wachstumsgeschwindigkeit nach und nach erhöht, und ein stabilisierter Kallus kann erhalten werden. Mit stabilisiertem Kallus wird ein Kallus bezeichnet, der während der Kultivierung im Kalluszustand bleibt, ohne eine Differenzierung zu einem Trieb oder einer Wurzel zu zeigen, und dessen Zellen eine einheitliche Wachstumsgeschwindigkeit aufweisen.
Dieser stabilisierte Kallus wird in ein flüssiges Medium, das für das Wachstum geeignet ist, wie flüssiges Woody Plant Medium, überführt und man lässt ihn wachsen. Die Wachstumsgeschwindigkeit wird in dem flüssigen Medium weiter erhöht. Gemäß Verfahren 2 lässt man den stabilisierten Kallus oder die Zellen, die den vorstehend erwähnten Kallus bilden, unter den Kultivierungsbedingungen wachsen, wobei die Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß von der Anfangsstufe der Kultivierung an auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft reguliert wird, oder die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, auf weniger als die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur von der Anfangsstufe der Kultivierung an reguliert wird.
Das Gewebe oder die Zellen gewinnen die zur Aufrechterhaltung und zum Wachstum des Individuums notwendige Energie durch Sauerstoffverbrauch (Atmung). Es ist allgemein bekannt, dass, wenn ein Gewebe oder Zellen kultiviert werden, die Zellmasse erhöht wird, und die Menge des Sauerstoffverbrauchs ebenfalls mit dem Ablauf der Kultivierungsdauer erhöht wird. Folglich nimmt im Verlauf der Kultivierungsdauer die Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß, wie einem Kolben, in dem das Gewebe oder die Zellen enthalten sind, oder die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, naturgemäß auf einen geringeren Wert als die Sauerstoffkonzentration in der Luft oder die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur ab, wenn nicht gezwungenermaßen ein Belüftungsgas von außerhalb des Systems zugeführt wird.
Verfahren 2 unterscheidet sich von der vorstehend erwähnten Erkenntnis in dem Punkt, dass die Kultivierung unter aktiver Regulierung der Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß, das das Gewebe oder die Zellen enthält, oder der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Kulturmedium auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft oder die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur durchgeführt wird.
In einem veranschaulichenden Verfahren zur Steigerung der Wirkung von Verfahren 2 wird vor der Subkultivierung des Gewebes oder der Zellen in dem Kultivierungsgefäß die Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß oder die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft oder die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur reguliert.
Wie vorstehend erwähnt, ist die Regulierungsdauer nicht besonders eingeschränkt, jedoch wird die Regulierung bevorzugt mindestens 3 Tage lang während der gesamten Kultivierungsdauer durchgeführt wird.
Zusätzlich dazu ist das Regulierungsverfahren nicht besonders auf irgendeines beschränkt, sofern es ein Verfahren ist, bei dem die Sauerstoffkonzentration in der Gasphase in dem Kultivierungsgefäß, das das Gewebe oder die Zellen enthält, oder die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem flüssigen Medium, das mit dem Gewebe oder den Zellen in Kontakt ist, auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Luft oder die Sättigungskonzentration des gelösten Sauerstoffs bei dieser Temperatur reguliert werden kann, und in einigen Beispielen eines solchen Verfahrens wird ein Gas, das eine regulierte Sauerstoffkonzentration aufweist und durch Mischen von Luft mit Stickstoff und dergleichen erhalten wird, um die Sauerstoffkonzentration zu senken, direkt in die Gasphase in dem Kultivierungsgefäß oder in das Kulturmedium geleitet oder ein solches Gas wird direkt in das Kulturmedium außerhalb des Kultivierungsgefäßes, d. h. in einen Belüftungstank und dergleichen, geleitet, und dann wird das Kulturmedium in das Kultivierungsgefäß gegossen oder ein Gas, wie Luft, das dem Kultivierungsgefäß zugeführt werden soll, wird unter Regulierung der Zufuhrgeschwindigkeit direkt in die Gasphase oder in das Kulturmedium geleitet oder ein solches Gas wird direkt in das Kulturmedium außerhalb des Kultivierungsgefäßes, d. h. in einen Belüftungstank und dergleichen, geleitet, und dann wird das Kulturmedium in das Kultivierungsgefäß gegossen oder das Kultivierungsgefäß wird zur Durchführung der Kultivierung unter einen geringen Sauerstoffdruck gesetzt oder die Kultivierung wird in Gegenwart eines Sauerstoffadsorptionsmittels durchgeführt.
Die Temperatur für die Gewebekultivierung gemäß der vorligenden Erfindung beträgt gemäß der hohen Wachstumsgeschwindigkeit in der Regel etwa 10 bis etwa 35°C und bevorzugt etwa 23– 28°C. Was die Kultivierungsdauer anbetrifft, sind 14–42 Tage bevorzugt.
Wenn zur Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung ein flüssiges Medium verwendet wird, können nach Beendigung der Kultivierung die kultivierten Zellen durch ein Verfahren wie Dekantation oder Filtration aus dem Kulturmedium fraktioniert werden, und das gewünschte taxanartige Diterpen kann durch ein Verfahren, wie Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium fraktioniert werden. Es ist ebenfalls möglich, die gewünschte Verbindung kontinuierlich während der Kultivierung wiederzugewinnen, indem man gleichzeitig ein Adsorptionsmittel oder ein geeignetes organisches Lösungsmittel in dem Kultivierungssystem vorliegen lässt.
Verfahren 3 wird wie folgt erklärt.
Gemäß Verfahren 3 kann eine Schicht, die die kultivierten Zellen enthält und nach der Kultivierung eine hohe Produktivität des taxanartigen Diterpens zeigt, durch eine Schicht, die eine spezifische Dichte von 1,07 oder weniger aufweist, beispielhaft dargestellt werden.
In einem allgemein bekannten Verfahren zur Fraktionierung der Zellen gemäß ihrer spezifischen Dichten wird durch ein Medium zur Zentrifugaltrennung ein Dichtegradient gebildet, die Zellen werden darübergeschichtet, und dann wird die Zentrifugaltrennung durchgeführt.
Als Medium zur Zentrifugaltrennung werden Ficoll, Percoll (beide von Pharmacia LKB Biotechnology Co. Ltd., hergestellt), Saccharose, Cäsiumchlorid und dergleichen verwendet. In den Beispielen wurde der Dichtegradient unter Verwendung von Ficoll erzeugt, jedoch ist das Medium auf keine Substanz besonders beschränkt, sofern sie die Zellen nicht schädigt. Ficoll wurde zur Trennung von Zellgranulaten und dergleichen (Hess, R. et al., Nature 208 (1965), 856–858) oder zur Trennung von Tierzellen (Walder, I. A. et al., Proc. Soc. exptl. Biol. Med., 112 (1963) 494–496) und dergleichen verwendet.
Die Zahl der Schichten, die den Dichtegradienten bilden, ist nicht besonders eingeschränkt.
In den Beispielen wird durch die Schichten, die eine spezifische Dichte von 1,03, 1,05, 1,07, 1,09 und 1,11 (g/ml) aufweisen, ein Dichtegradient gebildet, wobei der Unterschied der spezifischen Dichte zwischen jeder Schicht 0,02 beträgt, jedoch ist der Unterschied der spezifischen Dichte nicht auf diesen Wert beschränkt, und der Unterschied der spezifischen Dichte zwischen jeder Schicht kann gleich oder verschieden sein.
Folglich schließt die Definition des Dichtegradienten einen Fall ein, in dem sich der Gradient kontinuierlich ändert (der Zustand, in dem die Zahl der Schichten, die den Dichtegradienten bilden, nahe unendlich ist, und der Unterschied der spezifischen Dichte zwischen jeder Schicht nahe 0 ist).
Die Zellen können gemäß dem Unterschied ihrer spezifischen Dichten in eine Vielzahl von Schichten fraktioniert werden, indem auf diese Weise der Dichtegradient gebildet wird, die Zellen darübergeschichtet werden, und die Zentrifugaltrennung durchgeführt wird.
Die spezifische Dichte der Schicht, die gebildet werden soll, liegt normalerweise im Bereich von 1,00 bis 1,20 g/ml und bevorzugt im Bereich von 1,03 bis 1,11 g/ml. Als Schicht für eine Kultivierung wird mindestens eine Schicht ausgewählt, es ist jedoch auch möglich, alle Schichten auszuwählen und sie zu kultivieren.
Wenn eine Vielzahl von Schichten ausgewählt wird, und die in den ausgewählten Schichten enthaltenen Zellen kultiviert werden, ist es möglich, die Zellen in diesen Schichten einzeln zu kultivieren, es ist jedoch auch möglich, die Zellen in zwei oder mehr Schichten der ausgewählten Vielzahl von Schichten zu mischen und sie zu kultivieren.
Die kultivierten Zellen mit einer hohen Produktivität des taxanartigen Diterpens können in der Regel durch Kultivierung der Zellen erhalten werden, die in einer Schicht, die eine spezifische Dichte von 1,07 oder weniger aufweist, enthalten sind, sie ist jedoch nicht immer auf diesen Bereich beschränkt, da er abhängig von den Zellen, die kultiviert werden sollen, oder den Kultivierungsbedingungen schwanken kann. Es besteht auch eine Tendenz, dass die Zellen in einer Schicht, die eine höhere spezifische Dichte aufweist, zum Zeitpunkt der Durchführung der Fraktionierung gemäß dem Unterschied der spezifischen Dichten einen höheren Gehalt des taxanartigen Diterpens aufweisen. Um sicherzustellen, dass kultivierte Zellen, die das taxanartige Diterpen in einer hohen Ausbeute herstellen, erhalten werden können, ist es folglich wünschenswert, dass die Zellen in allen fraktionierten Schichten eine bestimmte Zeitdauer kultiviert werden, dann die Konzentration des taxanartigen Diterpens in den Zellen jeder Schicht gemessen wird, und die Schicht, die die kultivierten Zellen enthält, die das taxanartige Diterpen in einer hohen Ausbeute herstellen, aus diesen Schichten ausgewählt wird.
Bisher wurden keine Fälle berichtet, in denen die kultivierten Zellen einer Pflanze, die das taxanartige Diterpen herstellt, nach der Fraktionierung gemäß der spezifischen Dichte der Zellen kultiviert werden, und es konnte nicht erwartet werden, dass die Zellen durch den Unterschied der spezifischen Dichten in Schichten von Zellen mit einer jeweils anderen Produktivität des taxanartigen Diterpens fraktioniert werden können, und dass die Zellen, die das taxanartige Diterpen in einer hohen Ausbeute herstellen, durch Kultivierung von Zellen erhalten werden können, die in einer Schicht, die eine spezifische Dichte von 1,07 oder weniger aufweist, enthalten sind, und deren Gehalt an taxanartigem Diterpen zum Zeitpunkt ihrer Fraktionierung nicht so hoch ist.
Gemäß Verfahren 3 ist es auch möglich, die kultivierten Zellen gemäß dem Unterschied der spezifischen Dichten in eine Vielzahl von Schichten zu fraktionieren, indem ein Medium zur Zentrifugaltrennung hergestellt wird, das eine besondere spezifische Dichte, wie zum Beispiel 1,07 g/ml, aufweist, und die Zentrifugaltrennung gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren durchgeführt wird.
Das Kulturmedium, das für die vorliegende Erfindung verwendet werden soll, schließt typische Komponenten eines Kulturmediums ein. Als eine solche Komponente werden typischerweise eine anorganische Komponente und eine Kohlenstoffquelle verwendet, und Phytohormone, Vitamine und, falls notwendig, Aminosäuren können ebenfalls zugegeben werden. Als Kohlenstoffquelle kann ein Disaccharid, wie Saccharose, Maltose und Lactose, ein Monosaccharid, wie Glucose, Fructose und Galactose, Stärke oder ein Gemisch aus zwei oder mehr Arten solcher Zuckerquellen, die in einem geeigneten Verhältnis gemischt werden, verwendet werden.
Als anorganische Komponente schließen veranschaulichende Beispiele Phosphor, Stickstoff, Kalium, Calcium, Magnesium, Schwefel, Eisen, Mangan, Zink, Bor, Kupfer, Molybdän, Chlor, Natrium, Iod und Cobalt ein, und diese Komponenten können in Form einer Verbindung, wie Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Calciumnitrat, Kaliumchlorid, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Borsäure, Kupersulfat, Natriummolybdat, Molybdäntrioxid, Kaliumiodid, Kobaltchlorid und dergleichen, zugegeben werden.
Als Phytohormone können zum Beispiel Auxine, wie Indolessigsäure (IAA), Naphthalinessigsäure (NAA) und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), und Cytokinine, wie Kinetin, Zeatin und Dihydrozeatin, verwendet werden.
Als Vitamine können zum Beispiel Biotin, Thiamin (Vitamin B₁), Pyridoxin (Vitamin B₆), Pantothensäure, Inosit, Nicotinsäure und dergleichen verwendet werden.
Als Aminosäuren können zum Beispiel Glycin, Phenylalanin, Leucin, Glutamin, Cystein und dergleichen zugegeben werden.
Im Allgemeinen werden die anorganische Komponente in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 100 mM, die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 30 g/l, die Phytohormone in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 10 μM und die Vitamine beziehungsweise die Aminosäuren in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 100 mg/l verwendet.
Beispiele eines Mediums, das für Verfahren 3 verwendet werden soll, schließen die bekannten Medien, die üblicherweise für die Pflanzengewebekultivierung verwendet werden, wie das Medium von Murashige & Skoog (1962), das Medium von Linsmaier Skoog (1965), das Woody Plant Medium (1981), das B-5-Medium von Gamborg und das M-9-Medium von Mitsui, ein, zu denen das vorstehend erwähnte Phytohormon und, falls notwendig, die vorstehend erwähnte Kohlenstoffquelle, Vitamine und Aminosäuren gegeben werden.
Gemäß Verfahren 3 können sowohl ein flüssiges Medium als auch ein solches festes Medium, das normalerweise Agar und Gelangummi in einer Menge von 0,1–1% enthält, verwendet werden, in der Regel ist jedoch ein flüssiges Medium bevorzugt.
Gemäß der Gewebekultivierung von Verfahren 3 können ein Stück eines Gewebes oder Zellen einer Wurzel, eines Wachstumspunkts, eines Blatts, eines Stängels, eines Samens, einer Polle, eines Staubbeutels, eines Blütenkelchs und dergleichen der Pflanze oder kultivierte Zellen, die durch Gewebekultivierung davon in dem Medium oder einem anderen üblichen Medium erhalten werden, verwendet werden.
Durch Fraktionierung dieser Zellen in besondere Bereiche der spezifischen Dichte und ihre anschließende Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung können kultivierte Zellen mit einer höheren Produktivität des taxanartigen Diterpens im Vergleich zu denen im Kontrollbereich, in dem keine Fraktionierung durchgeführt wurde, erhalten werden. Das taxanartige Diterpen kann durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, aus diesen kultivierten Zellen fraktioniert werden
Ein bevorzugtes Beispiel einer solchen Gewebekultivierung kann wie folgt veranschaulicht werden.
Ein Stück eines Pflanzenkörpers einer Pflanze, die zur Gattung Taxus gehört, wie eine Wurzel, ein Wachstumspunkt, ein Blatt, ein Stängel, ein Samen und dergleichen, wird sterilisiert, auf ein mit Gelangummi verfestigtes Woody Plant Medium gegeben und 14–60 Tage bei 10–35°C gehalten, so dass ein Teil des Gewebestücks zu einem Kallus verändert wird. Durch Subkultivierung des so erhaltenen Kallus wird die Wachstumsgeschwindigkeit nach und nach erhöht, und ein stabilisierter Kallus kann erhalten werden. Mit stabilisiertem Kallus wird ein Kallus bezeichnet, der während der Kultivierung im Kalluszustand bleibt, ohne eine Differenzierung zu einem Trieb oder einer Wurzel zu zeigen, und dessen Zellen eine einheitliche Wachstumsgeschwindigkeit aufweisen.
Dieser stabilisierte Kallus wird in ein flüssiges Medium, das für das Wachstum geeignet ist, wie flüssiges Woody Plant Medium, überführt und man lässt ihn wachsen. Die Wachstumsgeschwindigkeit wird in dem flüssigen Medium weiter erhöht.
Die Temperatur für die Gewebekultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt gemäß der hohen Wachstumsgeschwindigkeit in der Regel etwa 10 bis etwa 35°C und bevorzugt etwa 23–28°C. Was die Kultivierungsdauer anbetrifft, sind 14–42 Tage bevorzugt.
Wenn zur Kultivierung gemäß Verfahren 3 ein flüssiges Medium verwendet wird, können nach Beendigung der Kultivierung die kultivierten Zellen aus dem Kulturmedium durch ein Verfahren wie Dekantation oder Filtration fraktioniert werden, und das gewünschte taxanartige Diterpen kann durch ein Verfahren, wie Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, daraus fraktioniert werden.
Gemäß Verfahren 1 und Verfahren 2 kann ein taxanartiges Diterpen in einer großen Menge einfach erhalten werden.
Gemäß Verfahren 3 können kultivierte Zellen, die das taxanartige Diterpen in einer hohen Ausbeute herstellen, durch einen einfachen Vorgang erhalten werden.
Wenn die Verfahren 1, 2 oder 3 industriell durchgeführt werden soll, kann durch Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wobei ein sauerstoffhaltiges Gas, das 0,03 bis 10% Kohlendioxid enthält, in das Kultivierungsgefäß eingebracht wird, die Effizienz weiter gesteigert werden. Ferner kann die Effizienz der vorliegenden Verfahren in Kombination mit einem oder mehreren der Verfahren 1, 2 und 3 weiter erhöht werden, indem eines oder mehrere der folgenden Verfahren 4, 5 oder 6 angewendet werden.
Verfahren 4
Die Produktivität das taxanartigen Diterpens in den Kulturen kann beachtlich verbessert werden, und die Schwankung der Produktivität des taxanartigen Diterpens aufgrund der Subkultivierung kann reguliert werden, indem eine Zweistufenkultivierung des Gewebes oder der Zellen der Pflanze, die das taxanartige Diterpen herstellt, durchgeführt wird, umfassend eine erste Stufe unter Verwendung eines Mediums, zu dem ein Oxidationsmittel oder eine wasserlösliche organische Verbindung, die Sauerstoff enthält, gegeben wird, um die Gewebe oder die Zellen zu erhalten, die zur Herstellung des taxanartigen Diterpens in der nachfolgenden Stufe aktiviert sind, und eine zweite Stufe, die unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, die die Herstellung des taxanartigen Diterpens fördern. Hier schließen Beispiele des Oxidationsmittels Peroxodisulfate, wie Kaliumperoxodisulfat und Wasserstoffperoxid, ein, und Beispiele der wasserlöslichen organischen Verbindung, die Sauerstoff enthält, schließen Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Ethylenglycol und dergleichen ein. Die Gesamtkonzentration des vorstehend erwähnten Zusatzes in dem Kulturmedium beträgt direkt nach der Zugabe bevorzugt 10^–6 M– 10^–1 M, und die Konzentration wird ferner bevorzugt auf einen Bereich von 10^–5 M bis 10^–2 M reguliert.
Es wurde ebenfalls festgestellt; dass die Kultivierung des Gewebes oder der Zellen der Pflanze, die das taxanartige Diterpen herstellt, mit hoher Dichte durch Inokulieren der Gewebe oder der Zellen in ein Kulturmedium, das ein Saccharid in einer Konzentration von 2–50 g/l und bevorzugt 10–30 g/l, und/oder ein Nitration in einer Konzentration von 2–50 mmol/l und bevorzugt 10–30 mmol/l enthält, und durch anschließende kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe einer Lösung einer Nährstoffquelle, die das Saccharid in einer Menge von 0,2–5 g/l und bevorzugt 0,5–3 g/l und/oder ein Nitration in einer Menge von 0,2–5 mmol/l und bevorzugt 0,5–3 mmol/l enthält, pro Tag im Hinblick auf das Anfangsvolumen des Kulturmediums zu dem Kulturmedium durchgeführt werden kann, wodurch das Herstellungsvolumen des taxanartigen Diterpens pro Kultivierungsgefäß beachtlich erhöht und die sechste Erfindung der vorliegenden Anmeldung vollendet werden kann. Mit Dichte wird hier die Zellmasse pro Volumen der Kulturlösung in dem Kultivierungsgefäß bezeichnet, die bezogen auf die Masse der trockenen Zellen (g) pro Liter der Kulturlösung angegeben wird. Gemäß Verfahren 5 wird die Kultivierung bevorzugt durchgeführt während das Kulturmedium durch die Zugabe einer Lösung einer Nährstoffquelle erneuert wird, und gleichzeitig dasselbe Volumen des Mediums aus den Geweben oder den Zellen abgetrennt und entfernt wird, und das taxanartige Diterpen aus mindestens einer/einem der folgenden wiedergewonnen wird: einer Kultur, die aus den so erhaltenen Kulturen ausgewählt wurde, dem Medium, das durch die Entfernung während der Kultivierung wiedergewonnen wird und dem Medium am Ende der Kultivierung. Verfahren 5 ist zur Verbesserung der Produktivität des taxanartigen Diterpens bei der Kultivierung mit hoher Dichte besonders wirksam, wobei die Dichte des Gewebes oder der Zellen der vorstehend erwähnten Pflanze zu Beginn der Kultivierung im Hinblick auf das Volumen des Mediums 50 g Frischgewicht/I oder mehr beträgt.
Obwohl normalerweise die Kultivierung beendet ist, wenn die Zellen hoher Dichte erhalten werden, erreichten die Erfinder ferner durch die intensive Untersuchung eine kontinuierliche Kultivierung, indem die Kultivierung fortgesetzt wird, während die Zellen entfernt werden, und vollendeten nach einer weiteren Untersuchung schließlich ein kontinuierliches Kultivierungsverfahren, das Verfahren 6 darstellt. Das bedeutet, das taxanartige Diterpen kann in einer so hohen Ausbeute hergestellt werden, die mit dem üblichen Verfahren kaum erzielt werden konnte, indem das frische Medium kontinuierlich oder diskontinuierlich auf eine solche Art und Weise zugegeben wird, dass das spezifische Erneuerungsverhältnis, das durch die dimensionslose Zahl F = V_I/V/μ definiert ist (wobei V das Gesamtvolumen des Kulturmediums in dem Kultivierungstank ist, V_I die Zufuhrgeschwindigkeit des frischen Mediums ist, und μ die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit der Gewebe oder Zellen ist), im Bereich von 0,1 bis 10 liegt, und indem das taxanartige Diterpen aus dem Kulturmedium, das die Gewebe oder die Zellen enthält und kontinuierlich oder diskontinuierlich aus dem Tank entnommen wird, und/oder der Kulturlösung, die weder das Gewebe noch die Zellen enthält und kontinuierlich oder diskontinuierlich aus dem Tank entnommen wird, wiedergewonnen wird. Das spezifische Erneuerungsverhältnis F des Kulturmediums wird ferner bevorzugt auf 0,5–5 eingestellt. Die Saccharidkonzentration in der Kulturlösung beträgt bevorzugt 5–40 g/l, und die Nitrationenkonzentration in der Kulturlösung beträgt bevorzugt 10–40 mmol/l. Verfahren 6 kann bei einer Zelldichte, bezogen auf das Gewicht der frischen Zellen pro Liter, von 50–500 g wirksam sein, je höher jedoch die Dichte ist, sofern sie in einem Bereich liegt, in dem kein sehr kräftiges Rühren erforderlich ist, umso wirksamer kann das taxanartige Diterpen hergestellt werden, und somit ist die bevorzugte Dichte 200 g oder höher pro Liter.
Um die vorliegende Erfindung allein oder in Kombination mit den Verfahren 4, 5 und 6 mit dem vorstehend erwähnten Verfahren 3 zu verwenden, können die gemäß Verfahren 3 erhaltenen Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit den Verfahren 4, 5 und 6 kultiviert werden, um das gewünschte taxanartige Diterpen herzustellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Änderung der Ausbeute des Taxols in dem Kulturmedium nach der Zugabe von 100 μM Jasmonsäuremethylester zeigt.
2 ist ein Diagramm, das die Änderung der Ausbeute des Baccatins III in dem Kulturmedium nach der Zugabe von 100 μM Jasmonsäuremethylester zeigt.
3 ist ein Diagramm, das ein Beispiel einer Kultivierungsvorrichtung veranschaulicht, die zur Durchführung der Gewebekultivierung gemäß der zweiten Erfindung der vorliegenden Anmeldung verwendet wurde. Jede in der 3 verwendete Zahl hat die folgende Bedeutung.

1: Luftzuleitungsrohr
2: Stickstoffzuleitungsrohr
3: Kultivierungsgefäß
4: Verteilereinrichtung zur Zufuhr von sauerstoffhaltigem Gas
5: Elektrode für gelösten Sauerstoff
6: Regler der Konzentration an gelöstem Sauerstoff
7: Belüftung
8: Ventil
9: Ventil zur Regulierung des Sauerstoffflusses
10: Luftfilter
11: Impeller

4 ist ein Diagramm, das das Wachstum in der Kultur nach der Fraktionierung zeigt.
5 ist ein Diagramm, das den Taxangehalt in der Kultur nach der Fraktionierung zeigt.
6 ist ein Diagramm, das die Verteilung der Zellen bei der Fraktionierung zeigt.
7 ist ein Diagramm, das den Taxangehalt (in den Zellen) bei der Fraktionierung zeigt.
8 ist ein Diagramm, das ein Beispiel einer Kultivierungsvorrichtung veranschaulicht, die zur Durchführung der Gewebekultivierung gemäß der 6. oder 7. Erfindung der vorliegenden Anmeldung verwendet wurde. Jede in 8 verwendete Zahl und jeder in 8 verwendete Buchstabe hat die folgende Bedeutung.

12: Zuleitungsrohr für das Medium
13: Zuleitungsöffnung für das Medium
14: Öffnung mit einem Filter zur Entnahme des Kulturmediums allein (das Kulturmedium, das keine Gewebe und auch keine Zellen enthält)
15: Auslassrohr für das Kulturmedium
16: Verteilereinrichtung zur Zufuhr von sauerstoffhaltigem Gas
17: Impeller
18: Ableitungsrohr für das Kulturgemisch (die Kulturlösung, die Gewebe oder Zellen enthält)
19: Druckflüssigkeitseinlass
a, b, c, d und e: Ventile

Beste Durchführungsart der Erfindung
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele weiter veranschaulicht, jedoch sollen diese Beispiele den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
[Beispiel 1] – Kein Beispiel der Erfindung
Ein Teil des Stängels von Taxus baccata LINN, der zuvor mit 2%iger Antiforminlösung oder 70%iger Ethanollösung und dergleichen sterilisiert worden war, wurde auf festes Woody Plant Medium (das 0,25 Gew.-% Gelangummi enthielt) gegeben, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine statische Kultivierung wurde bei 25°C an einem dunklen Ort durchgeführt, wobei ein Kallus von Taxus baccata LINN bereitgestellt wurde. 1 g (Frischgewicht) des Kallus wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde mit einer Umlaufschüttelmaschine (Stellfaktor 25 mm, 120 UpM) durchgeführt, und der Kallus wurde alle 21 Tage subkultiviert, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhöhen.
1 g (Frischgewicht) der so erhaltenen kultivierten Zellen wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde 14 Tage bei 25°C durchgeführt. Am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung wurde der Methylester von Tuberonsäure (der eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R^6a Wasserstoffatome sind, R^6b eine Hydroxylgruppe ist, R⁷ eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen) als die Verbindung der allgemeinen Formel (I) zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 0,01–1000 μM ergab, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen von Taxus baccata LINN durch Filtration geerntet und lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Ausbeute der kultivierten Zellen pro Liter des flüssigen Mediums zu erhalten. Die taxanartigen Diterpene wurden mit Methanol und dergleichen aus dem getrockneten Kallus extrahiert, und sie wurden durch den Vergleich mit Standardtaxol, Cephalomannin und Baccatin III unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, um die Ausbeuten der taxanartigen Diterpene zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 1]
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Tuberonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
[Beispiel 2] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Tuberonsäure nach und nach insgesamt viermal alle zwei Tage, beginnend am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung, zugegeben wurde (wobei sich jedes Mal eine Endkonzentration von 25 μM ergab, und wobei sich eine Gesamtkonzentration von 100 μM ergab). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
[Beispiel 3] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer dass 100 μM des Methylesters von Tuberonsäure am 1. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurden, und dann die Kultivierung ferner weitere 20 Tage durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
[Beispiel 4] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer dass 100 μM des Methylesters von Tuberonsäure am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurden, und die Kultivierung ferner weitere 14 Tage durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
[Beispiel 5] – Kein Beispiel der Erfindung
Die Zellen mit erhöhter Wachstumsgeschwindigkeit, die durch das Verfahren von Beispiel 1 erhalten wurden, wurden zuerst mit einem Edelstahlsieb fraktioniert, und Zellcluster mit einer Größe von 250–840 μm wurden erhalten. Ein Medium, das eine spezifische Dichte von 1,07 (g/ml) aufwies, wurde unter Verwendung von Ficoll hergestellt, und die vorstehend erwähnten Zellen wurden darübergeschichtet und 6 Minuten mit 700 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden gemäß dem Unterschied der spezifischen Dichte in zwei Schichten fraktioniert. Die Zellen, die in der Schicht von 1,07 g/ml oder weniger enthalten waren, wurden fraktioniert und dreimal oder mehr mit 2%iger Saccharoselösung gewaschen, um das Ficoll wegzuwaschen. Nach dem Waschen wurde 1 g (Frischgewicht) der Zellen in einen Erlenmeyerkolben, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, überführt, und eine Schüttelkultivierung wurde 14 Tage bei 25°C durchgeführt. Am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung wurde der Methylester von Tuberonsäure zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 250 μM ergab, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Produktivität der taxanartigen Diterpene konnte durch die Kombination der Auswahl von Zellen, die eine besondere spezifische Dichte aufwiesen, und der Zugabe des Methylesters von Tuberonsäure stark verbessert werden.
[Vergleichsbeispiel 2]
Das Verfahren von Beispiel 5 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Tuberonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
[Beispiel 6] – Kein Beispiel der Erfindung
250 μM des Methylesters von Tuberonsäure wurden zu kultivierten Zellen von Taxus brevifolia NUTT gegeben, die am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung durch das Verfahren von Beispiel 1 erhalten wurden, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 3]
Das Verfahren von Beispiel 6 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Tuberonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
[Beispiel 7] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 6 wurde durchgeführt, außer dass kultivierte Zellen von T. media verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 4]
Das Verfahren von Beispiel 7 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Tuberonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
[Beispiel 8] – Kein Beispiel der Erfindung
Ein Teil des Stängels von Taxus baccata LINN, der zuvor mit 2%iger Antiforminlösung oder 70 %iger Ethanollösung und dergleichen sterilisiert worden war, wurde auf festes Woody Plant Medium (das 0,25 Gew.-% Gelangummi enthielt) gegeben, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine statische Kultivierung wurde bei 25°C an einem dunklen Ort durchgeführt, wobei ein Kallus von Taxus baccata LINN bereitgestellt wurde. 1 g (Frischgewicht) des Kallus wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde mit einer Umlaufschüttelmaschine (Stellfaktor 25 mm, 120 UpM) durchgeführt, und der Kallus wurde alle 21 Tage subkultiviert, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhöhen.
1 g (Frischgewicht) der so erhaltenen kultivierten Zellen wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde 14 Tage bei 25°C durchgeführt. Am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung wurde der Methylester von Cucurbinsäure (der eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen) als eine der Jasmonsäuren zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 0,01–1000 μM ergab, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen von Taxus baccata LINN durch Filtration geerntet und lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Ausbeute der kultivierten Zellen pro Liter des flüssigen Mediums zu erhalten. Die taxanartigen Diterpene wurden mit Methanol und dergleichen aus dem getrockneten Kallus extrahiert, und sie wurden durch den Vergleich mit Standardtaxol, Cephalomannin und Baccatin III unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, um die Ausbeuten der taxanartigen Diterpene zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 5]
Das Verfahren von Beispiel 8 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Tuberonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
[Beispiel 9] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 8 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Cucurbinsäure nach und nach insgesamt viermal alle zwei Tage, beginnend am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung, zugegeben wurde (wobei sich jedes Mal eine Endkonzentration von 25 μM ergab, und wobei sich eine Gesamtkonzentration von 100 μM ergab). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
[Beispiel 10] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 8 wurde durchgeführt, außer dass 100 μM des Methylesters von Cucurbinsäure am 1. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurden, und dann die Kultivierung ferner weitere 20 Tage durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
[Beispiel 11] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 8 wurde durchgeführt, außer dass 100 μM des Methylesters von Cucurbinsäure am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurden, und die Kultivierung ferner weitere 14 Tage durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
[Beispiel 12] -Kein Beispiel der Erfindung
Die Zellen mit erhöhten Wachstumsgeschwindigkeiten, die durch das Verfahren von Beispiel 8 erhalten wurden, wurden zuerst mit einem Edelstahlsieb fraktioniert, und Zellcluster mit einer Größe von 250–840 μm wurden erhalten. Ein Medium, das eine spezifische Dichte von 1,07 (g/ml) aufwies, wurde unter Verwendung von Ficoll hergestellt, und die vorstehend erwähnten Zellen wurden darübergeschichtet und 6 Minuten mit 700 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden gemäß dem Unterschied der spezifischen Dichte in zwei Schichten fraktioniert. Die Zellen, die in der Schicht von 1,07 g/ml oder weniger enthalten waren, wurden fraktioniert und dreimal oder mehr mit 2%iger Saccharoselösung gewaschen, um das Ficoll wegzuwaschen. Nach dem Waschen wurde 1 g (Frischgewicht) der Zellen in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, und eine Schüttelkultivierung wurde 14 Tage bei 25°C durchgeführt. Am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung wurde der Methylester von Cucurbinsäure zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 250 μM ergab, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 8 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Produktivität der taxanartigen Diterpene konnte durch die Kombination der Auswahl von Zellen, die eine besondere spezifische Dichte aufwiesen, und der Zugabe des Methylesters von Tuberonsäure stark verbessert werden.
[Vergleichsbeispiel 6]
Das Verfahren von Beispiel 12 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Cucurbinsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
[Beispiel 13] – Kein Beispiel der Erfindung
250 μM des Methylesters von Cucurbinsäure wurden zu kultivierten Zellen von Taxus brevifolia NUTT gegeben, die am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung durch das Verfahren von Beispiel 8 erhalten wurden, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 8 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 7]
Das Verfahren von Beispiel 13 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Cucurbinsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
[Beispiel 14] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 13 wurde durchgeführt, außer dass kultivierte Zellen von T. media verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 8]
Das Verfahren von Beispiel 14 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Cucurbinsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
[Beispiel 15] – Kein Beispiel der Erfindung
Ein Teil des Stängels von Taxus baccata LINN, der zuvor mit 2%iger Antiforminlösung oder 70%iger Ethanollösung und dergleichen sterilisiert worden war, wurde auf festes Woody Plant Medium (das 0,25 Gew.-% Gelangummi enthielt) gegeben, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine statische Kultivierung wurde bei 25°C an einem dunklen Ort durchgeführt, wobei ein Kallus von Taxus baccata LINN bereitgestellt wurde. 1 g (Frischgewicht) des Kallus wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde mit einer Umlaufschüttelmaschine (Stellfaktor 25 mm, 120 UpM) durchgeführt, und der Kallus wurde alle 21 Tage subkultiviert, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhöhen.
1 g (Frischgewicht) der so erhaltenen kultivierten Zellen wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde 14 Tage bei 25°C durchgeführt. Am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung wurde der Methylester von Jasmonsäure (der eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen, wobei 90% davon in der trans-Form und 10% davon in der cis-Form vorliegen) als eine der Jasmonsäuren zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 0,01–1000 μM ergab, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen von Taxus baccata LINN durch Filtration geerntet und lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Ausbeute der kultivierten Zellen pro Liter des flüssigen Mediums zu erhalten. Die taxanartigen Diterpene wurden mit Methanol und dergleichen aus dem getrockneten Kallus extrahiert, und sie wurden durch den Vergleich mit Standardtaxol, Cephalomannin und Baccatin III unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, um die Ausbeuten der taxanartigen Diterpene zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 9]
Das Verfahren von Beispiel 15 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
[Beispiel 16] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 15 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure nach und nach insgesamt viermal alle zwei Tage, beginnend am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung, zugegeben wurde (wobei sich jedes Mal eine Endkonzentration von 25 μM ergab, und wobei sich eine Gesamtkonzentration von 100 μM ergab). Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
[Beispiel 17] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 15 wurde durchgeführt, außer dass 100 μM des Methylesters von Jasmonsäure am 1. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurden, und dann die Kultivierung ferner weitere 20 Tage durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
[Beispiel 18] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 15 wurde durchgeführt, außer dass 100 μM des Methylesters von Cucurbinsäure am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurden, und die Kultivierung ferner weitere 14 Tage durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
[Beispiel 19]
Das Verfahren von Beispiel 15 wurde durchgeführt, außer dass Jasmonsäure (die eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Hydroxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen, wobei 90% davon in der trans-Form und 10% davon in der cis-Form vorliegen) als eine der Jasmonsäuren zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 0,01–1000 μM ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 10]
Das Verfahren von Beispiel 19 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
[Beispiel 20] – Kein Beispiel der Erfindung
Die Analysenergebnisse des taxanartigen Diterpens, die in dem Kulturmedium von Beispiel 15 vor der Zugabe von 100 μM Jasmonsäuremethylester am 3. Tag nach der Zugabe und am 7. Tag nach der Zugabe vorlagen, sind in 1 und 2 gezeigt. Am 7. Tag der Kultivierung wurden etwa die Hälfte des Taxols und etwa 70% des Baccatin III in das Medium getropft.
[Vergleichsbeispiel 11]
Das Verfahren von Beispiel 20 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in 1 und 2 gezeigt.
[Beispiel 21] – Kein Beispiel der Erfindung
Die Zellen mit der erhöhten Wachstumsgeschwindigkeit, die durch das Verfahren von Beispiel 15 erhalten wurden, wurden zuerst mit einem Edelstahlsieb fraktioniert, und Zellcluster mit einer Größe von 250–840 μm wurden erhalten. Ein Medium, das eine spezifische Dichte von 1,07 (g/ml) aufwies, wurde unter Verwendung von Ficoll hergestellt, und die vorstehend erwähnten Zellen wurden darübergeschichtet und 6 Minuten mit 700 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden gemäß dem Unterschied der spezifischen Dichte in zwei Schichten fraktioniert. Die Zellen, die in der Schicht von 1,07 g/ml oder weniger enthalten waren, wurden fraktioniert und dreimal oder mehr mit 2%iger Saccharoselösung gewaschen, um das Ficoll abzuwaschen. Nach dem Waschen wurde 1 g (Frischgewicht) der Zellen in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, und eine Schüttelkultivierung wurde 14 Tage bei 25°C durchgeführt. Am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung wurde der Methylester von Jasmonsäure zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 250 μM ergab, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 15 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Die Produktivität der taxanartigen Diterpene konnte durch die Kombination der Auswahl von Zellen, die eine besondere spezifische Dichte aufwiesen, und der Zugabe des Methylesters von Jasmonsäure stark verbessert werden.
[Vergleichsbeispiel 12]
Das Verfahren von Beispiel 21 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
[Beispiel 22] – Kein Beispiel der Erfindung
250 μM des Methylesters von Jasmonsäure wurden zu kultivierten Zellen von Taxus brevifolia NUTT gegeben, die am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung durch das Verfahren von Beispiel 15 erhalten wurden, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage durchgeführt. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 15 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 13]
Das Verfahren von Beispiel 22 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
[Beispiel 23] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 22 wurde durchgeführt, außer dass kultivierte Zellen von T. media verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 14]
Das Verfahren von Beispiel 23 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 7
Tabelle 8
Tabelle 9
Tabelle 10
[Beispiel 24] – Kein Beispiel der Erfindung
Ein Teil des Stängels von Taxus baccata LINN, der zuvor mit 2%iger Antiforminlösung oder 70%iger Ethanollösung und dergleichen sterilisiert worden war, wurde auf festes Woody Plant Medium (das 0,25 Gew.-% Gelangummi enthielt) gegeben, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine statische Kultivierung wurde bei 25°C an einem dunklen Ort durchgeführt, wobei ein Kallus von Taxus baccata LINN bereitgestellt wurde. 1 g (Frischgewicht) des Kallus wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde mit einer Umlaufschüttelmaschine (Stellfaktor 25 mm, 120 UpM) durchgeführt, und der Kallus wurde alle 21 Tage subkultiviert, um seine Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhöhen.
1 g (Frischgewicht) der so erhaltenen kultivierten Zellen wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und [Ag(S₂O₃)₂]^3– wurde als Verbindung, die das Schwermetall enthielt, zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–9 M–1 M ergab. Dann wurde 21 Tage bei 25°C eine Schüttelkultivierung durchgeführt.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen von Taxus baccata LINN durch Filtration geerntet und lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhalten. Die taxanartigen Diterpene wurden mit Methanol und dergleichen aus dem getrockneten Kallus extrahiert, und sie wurden durch den Vergleich mit Standardtaxol, Cephalomannin und Baccatin III unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, um die Ausbeuten der taxanartigen Diterpene zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 25] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass [Ag(S₂O₃)₂]^3– am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–3 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 14 Tage durchgeführt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 24 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 26] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass [Ag(S₂O₃)₂]^3– am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–3 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 7 Tage durchgeführt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 24 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 27] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass [Ag(S₂O₃)₂]^3– am 18. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–3 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 3 Tage durchgeführt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 24 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 28] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass [Ag(S₂O₃)₂]^3– nach und nach insgesamt fünfmal in Zeitabständen von 4 Tagen, beginnend am Start (0. Tag) der Kultivierung, zugegeben wurde (wobei sich zu jedem Zeitpunkt eine Endkonzentration von 2 × 10^–4 M ergab, und wobei sich eine Gesamtkonzentration von 10^–3 M ergab). Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 29] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass Jasmonsäuremethylester (der eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen) am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–4 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 30] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass der Kolben in ein Gefäß (Fassungsvermögen 3000 ml), das eine Gaszuleitungsöffnung und eine Gasableitungsöffnung aufwies, gegeben wurde, dann das Gefäß hermetisch verschlossen wurde, und Luft so mit Stickstoff gemischt wurde, dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, 10% betrug, und das Gas durch die Zuleitungsöffnung mit einer Geschwindigkeit von 25 ml pro Minute zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 31] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 30 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure am 14. Tag der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–4 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 32] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass 10^–3 M Ag(NO₃) anstelle von [Ag(S₂O₃)₂]^3– am Start (0. Tag) der Kultivierung zugegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 33] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 32 wurde durchgeführt, außer dass 10^–3 M Silbernitrat am 14. Tag der Kultivierung zugegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 15]
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass [Ag(S₂O₃)₂]^3– nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
[Beispiel 34] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass Cobaltchlorid (CoCl₂) anstelle von [Ag(S₂O₃)₂]^3– als Verbindung, die das Schwermetall enthielt, zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–9 M–1 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
[Beispiel 35] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 34 wurde durchgeführt, außer dass Cobaltchlorid (CoCl₂) anstelle von [Ag(S₂O₃)₂]^3– zugegeben wurde, wobei sich am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 14 Tage durchgeführt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 34 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
[Beispiel 36] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 34 wurde durchgeführt, außer dass Cobaltchlorid zugegeben wurde, wobei sich am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 7 Tage durchgeführt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 34 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
[Beispiel 37] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 34 wurde durchgeführt, außer dass Cobaltchlorid zugegeben wurde, wobei sich am 18. Tag nach dem Start der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 3 Tage durchgeführt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 34 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
[Beispiel 38] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 34 wurde durchgeführt, außer dass Cobaltchlorid nach und nach insgesamt fünfmal in Zeitabständen von 4 Tagen, beginnend am Start (0. Tag) der Kultivierung, zugegeben wurde (wobei sich zu jedem Zeitpunkt eine Endkonzentration von 2 × 10^–6 M ergab, und wobei sich eine Gesamtkonzentration von 10^–5 M ergab). Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
[Beispiel 39] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 34 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure (der eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ Wasserstoffatome sind, R⁸ eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen) als eine der Jasmonsäuren zugegeben wurde, wobei sich am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–4 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
[Beispiel 40] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 34 wurde durchgeführt, außer dass der Kolben in ein Gefäß (Fassungsvermögen 3000 ml), das eine Gaszuleitungsöffnung und eine Gasableitungsöffnung aufwies, gegeben wurde, dann das Gefäß hermetisch verschlossen wurde, und Luft so mit Stickstoff gemischt wurde, dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, 10% betrug, und das Gas durch die Zuleitungsöffnung mit einer Geschwindigkeit von 25 ml pro Minute zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
[Beispiel 41] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 40 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure zugegeben wurde, wobei sich am 14. Tag der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–4 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
[Beispiel 42] – Kein Beispiel der Erfindung
Ein Teil des Stängels von Taxus baccata LINN, der zuvor mit 2%iger Antiforminlösung oder 70%iger Ethanollösung und dergleichen sterilisiert worden war, wurde auf festes Woody Plant Medium (das 0,25 Gew.-% Gelangummi enthielt) gegeben, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine statische Kultivierung wurde bei 25°C an einem dunklen Ort durchgeführt, wobei ein Kallus von Taxus baccata LINN bereitgestellt wurde. 1 g (Frischgewicht) des Kallus wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben wurde, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde mit einer Umlaufschüttelmaschine (Stellfaktor 25 mm, 120 UpM) durchgeführt, und der Kallus wurde alle 21 Tage subkultiviert, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhöhen.
1 g (Frischgewicht) der so erhaltenen kultivierten Zellen wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben worden war, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und dann wurde Spermidin als Amin zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–9 M–1 M ergab. Dann wurde 21 Tage bei 25°C eine Schüttelkultivierung durchgeführt.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen von Taxus baccata LINN durch Filtration geerntet und lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhalten. Die taxanartigen Diterpene wurden mit Methanol und dergleichen aus den getrockneten Zellen extrahiert, und sie wurden durch den Vergleich mit Standardtaxol, Cephalomannin und Baccatin III unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, um die Ausbeuten der taxanartigen Diterpene zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
[Beispiel 43] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass Spermidin zugegeben wurde, wobei sich am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 14 Tage fortgesetzt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 42 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
[Beispiel 44] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass Spermidin zugegeben wurde, wobei sich am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 7 Tage fortgesetzt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 42 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
[Beispiel 45] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass Spermidin zugegeben wurde, wobei sich am 18. Tag nach dem Start der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 3 Tage fortgesetzt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 42 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
[Beispiel 46] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass Spermidin nach und nach insgesamt fünfmal in Zeitabständen von 4 Tagen, beginnend am Start (0. Tag) der Kultivierung, zugegeben wurde (wobei sich zu jedem Zeitpunkt eine Endkonzentration von 2 × 10^–6 M ergab, und wobei sich eine Gesamtkonzentration von 10^–5 M ergab). Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
[Beispiel 47] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure (der eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen) als eine der Jasmonsäuren am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–4 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
[Beispiel 48] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass der Kolben in eine Kammer (Fassungsvermögen 3000 ml), die eine Gaszuleitungsöffnung und eine Gasableitungsöffnung aufwies, gegeben wurde, dann die Kammer hermetisch verschlossen wurde, und Luft so mit Stickstoff gemischt wurde, dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, 10% betrug, und das Gas durch die Zuleitungsöffnung mit einer Geschwindigkeit von 25 ml pro Minute zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
[Beispiel 49] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 48 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure zugegeben wurde, wobei sich am 14. Tag der Kultivierung eine Endkonzentration von 10^–4 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 16]
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass Spermidin nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 13–15 gezeigt.
[Beispiel 50]
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass Spermin anstelle von Spermidin zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–9 M–1 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt.
[Beispiel 51] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 42 wurde durchgeführt, außer dass Putrescin anstelle von Spermin zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–9 M–1 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 gezeigt.
Tabelle 14
Tabelle 15
[Beispiel 52] – Kein Beispiel der Erfindung
Ein Teil des Stängels von Taxus baccata LINN, der zuvor mit 2%iger Antiforminlösung oder 70%iger Ethanollösung und dergleichen sterilisiert worden war, wurde auf festes Woody Plant Medium (das 0,25 Gew.-% Gelangummi enthielt) gegeben, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine statische Kultivierung wurde bei 25°C an einem dunklen Ort durchgeführt, wobei ein Kallus von Taxus baccata LINN bereitgestellt wurde. 1 g (Frischgewicht) des Kallus wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben worden war, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde mit einer Umlaufschüttelmaschine (Stellfaktor 25 mm, 100 UpM) durchgeführt, und der Kallus wurde alle 21 Tage subkultiviert, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhöhen.
1 g (Frischgewicht) der so erhaltenen kultivierten Zellen wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben worden war, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde 14 Tage bei 25°C durchgeführt. Acetylsalicylsäure (HOOCC₆H₄OCOCH₃) wurde als Antiethylenmittel am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–9 M–1 M ergab, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage fortgesetzt.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen von Taxus baccata LINN durch Filtration geerntet und lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhalten. Die taxanartigen Diterpene wurden mit Methanol und dergleichen aus den getrockneten Zellen extrahiert, und sie wurden durch den Vergleich mit Standardtaxol, Cephalomannin und Baccatin III unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, um die Ausbeuten der taxanartigen Diterpene zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Beispiel 53] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass Acetylsalicylsäure am Start (0. Tag) der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung weitere 21 Tage durchgeführt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 52 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Beispiel 54] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass Acetylsalicylsäure am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 14 Tage fortgesetzt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 52 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Beispiel 55] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass Acetylsalicylsäure am 18. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–5 M ergab, und die Kultivierung ferner weitere 3 Tage fortgesetzt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurde das Verfahren von Beispiel 52 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Beispiel 56] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass Acetylsalicylsäure nach und nach insgesamt fünfmal in Zeitabständen von 2 Tagen, beginnend am 7. Tag nach dem Start der Kultivierung, zugegeben wurde (wobei sich zu jedem Zeitpunkt eine Endkonzentration von 2 × 10^–6 M ergab, und wobei sich eine Gesamtkonzentration von 10^–5 M ergab). Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Beispiel 57]– Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure (der eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen) am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–4 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Beispiel 58] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass der Kolben in eine Kammer (Fassungsvermögen 3000 ml), die eine Gaszuleitungsöffnung und eine Gasableitungsöffnung aufwies, gegeben wurde, dann die Kammer hermetisch verschlossen wurde, und Luft so mit Stickstoff gemischt wurde, dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, 10% betrug, und das Gas durch die Zuleitungsöffnung mit einer Geschwindigkeit von 25 ml pro Minute zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Beispiel 59] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 58 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure am 14. Tag der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–4 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 17]
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass Acetylsalicylsäure nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Referenzbeispiel 1]
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass 10^–3 M Ethrel (C₂H₆O₃ClP) anstelle von Acetylsalicylsäure als Ethylenerzeugungsmittel am Start (0. Tag) der Kultivierung zugegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Referenzbeispiel 2]
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass 10^–3 M Ethrel anstelle von Acetylsalicylsäure am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt.
[Beispiel 60] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass Aminoxyessigsäurehydrochlorid [(H₂NOCH₂COOH)₂HCl] als Antiethylenmittel zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–9 M–1 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt.
[Beispiel 61] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 52 wurde durchgeführt, außer dass Gallussäurepropylester [(HO)₃C₆H₂COOCH₂CH₂CH₃] als Antiethylenmittel zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10^–9 M–1 M ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 gezeigt.
Tabelle 17
Tabelle 18
[Beispiel 62] – Kein Beispiel der Erfindung
Ein Teil des Stängels von Taxus baccata LINN, der zuvor mit 2%iger Antiforminlösung oder 70 %iger Ethanollösung und dergleichen sterilisiert worden war, wurde auf festes Woody Plant Medium (das 0,25 Gew.-% Gelangummi enthielt) gegeben, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine statische Kultivierung wurde bei 25°C an einem dunklen Ort durchgeführt, wobei ein Kallus von Taxus baccata LINN bereitgestellt wurde. 1 g (Frischgewicht) des Kallus wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben worden war, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde mit einer Umlaufschüttelmaschine (Stellfaktor 25 mm, 100 UpM) durchgeführt, und der Kallus wurde alle 21 Tage subkultiviert, um die Wachstumsgeschwindigkeit des Kallus zu erhöhen.
1 g (Frischgewicht) der so erhaltenen kultivierten Zellen wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben worden war, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und der Kolben wurde in eine Kammer (Fassungsvermögen 3000 ml), die eine Gaszuleitungsöffnung und eine Gasableitungsöffnung aufwies, gegeben, dann wurde die Kammer hermetisch verschlossen, und Luft wurde so mit Stickstoff gemischt, dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, 4–15% betrug, und während das Gas durch die Zuleitungsöffnung mit einer Geschwindigkeit von 25 ml pro Minute zugeführt wurde, wurde bei 25°C 21 Tage eine Schüttelkultivierung durchgeführt.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen von Taxus baccata LINN durch Filtration geerntet und lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhalten. Die taxanartigen Diterpene wurden mit Methanol und dergleichen aus den getrockneten Zellen extrahiert, und sie wurden durch den Vergleich mit Standardtaxol, Cephalomannin und Baccatin III unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, um die Ausbeuten der taxanartigen Diterpene zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 18]
Das Verfahren von Beispiel 62 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, auf 20% reguliert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 gezeigt.
[Referenzbeispiel 3]
Das Verfahren von Beispiel 62 wurde durchgeführt, außer dass die kultivierten Zellen, die in den Kolben inokuliert wurden, an der Luft kultiviert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 gezeigt.
[Beispiel 63] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 62 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, auf 10% reguliert wurde, und das gemischte Gas vom Start der Kultivierung an 3 Tage zugeführt wurde, und dann bis zum Ende der Kultivierung (18 Tage) Luft zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 gezeigt.
[Beispiel 64] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 62 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, auf 10% reguliert wurde, und das gemischte Gas vom Start der Kultivierung an 7 Tage zugeführt wurde, und dann bis zum Ende der Kultivierung (14 Tage) Luft zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 gezeigt.
[Beispiel 65] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 62 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des Sauerstoffs in dem Gas, das den zu kultivierenden Zellen zugeführt werden soll, auf 10% reguliert wurde, und das gemischte Gas vom Start der Kultivierung an 14 Tage zugeführt wurde, und dann bis zum Ende der Kultivierung (7 Tage) Luft zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 gezeigt.
[Beispiel 66] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 62 wurde durchgeführt, außer dass der Methylester von Jasmonsäure (der eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) ist, wobei R^1a, R^1b, R^1c, R^1d, R^1e, R^1f, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoffatome sind, R⁷ eine Methoxygruppe ist, n 1 ist, und C³ und C⁴ eine Doppelbindung zwischen sich aufweisen, wobei 90% davon in der trans-Form und 10% davon in der cis-Form vorliegen) als eine der Jasmonsäuren am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 10–1000 μM ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 gezeigt. Die Produktivität des taxanartigen Diterpens konnte durch die Kombination der Zufuhr von Sauerstoff in niedriger Konzentration und der Zugabe des Methylesters von Jasmonsäure stark verbessert werden.
[Beispiel 67] – Kein Beispiel der Erfindung
85 g (Frischgewicht) der kultivierten Zellen mit einer erhöhten Wachstumsgeschwindigkeit, die in Beispiel 62 erhalten wurden, wurden zur Tankkultivierung unter Rühren in einen Tank (Fassungsvermögen 3000 ml) inokuliert, der eine Elektrode für die Konzentration des gelösten Sauerstoffs und einen Regler für die Konzentration des gelösten Sauerstoffs aufwies und in den 1700 ml flüssiges Woody Plant Medium gegossen worden waren. Dann wurde die Tankkultivierung unter Rühren 21 Tage bei 25°C durchgeführt, während die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Medium auf 0,1 ppm oder weniger reguliert wurde, indem das Mischungsverhältnis aus Luft und Stickstoff eingestellt wurde. Eine schematische Abbildung der Kultivierungsvorrichtung ist in 3 gezeigt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
[Beispiel 68] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 67 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch Einstellen des Mischungsverhältnisses auf 1 ppm oder weniger reguliert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
[Beispiel 69] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 67 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch Einstellen des Mischungsverhältnisses auf 2 ppm oder weniger reguliert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
[Beispiel 70] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 67 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch Einstellen des Mischungsverhältnisses auf 4 ppm oder weniger reguliert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
[Beispiel 71] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 67 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch Einstellen des Mischungsverhältnisses auf 6 ppm oder weniger reguliert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 19]
Das Verfahren von Beispiel 67 wurde durchgeführt, außer dass Luft zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
[Beispiel 72] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 67 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Medium vom Start der Kultivierung an 3 Tage durch Einstellen des Mischungsverhältnisses auf 4 ppm oder weniger reguliert wurde, und Luft bis zum Ende der Kultivierung (18 Tage) zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
[Beispiel 73] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 67 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Medium vom Start der Kultivierung an 7 Tage durch Einstellen des Mischungsverhältnisses auf 4 ppm oder weniger reguliert wurde, und Luft bis zum Ende der Kultivierung (14 Tage) zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
[Beispiel 74] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 67 wurde durchgeführt, außer dass die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Medium vom Start der Kultivierung an 14 Tage durch Einstellen des Mischungsverhältnisses auf 4 ppm oder weniger reguliert wurde, und Luft bis zum Ende der Kultivierung (7 Tage) zugeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt.
Tabelle 19
Tabelle 20
Tabelle 21
[Beispiel 75] – Kein Beispiel der Erfindung
Ein Teil des Stängels von Taxus baccata LINN, der zuvor mit 2%iger Antiforminlösung oder 70%iger Ethanollösung und dergleichen sterilisiert worden war, wurde auf festes Woody Plant Medium (das 0,25 Gew.-% Gelangummi enthielt) gegeben, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine statische Kultivierung wurde bei 25°C an einem dunklen Ort durchgeführt, wobei ein Kallus von Taxus baccata LINN bereitgestellt wurde. 1 g (Frischgewicht) des Kallus wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem die vorstehend erwähnte Komponente gegeben worden war, wobei sich dieselbe Konzentration ergab, und eine Schüttelkultivierung wurde mit einer Umlaufschüttelmaschine (Stellfaktor 25 mm, 100 UpM) durchgeführt, und der Kallus wurde alle 21 Tage subkultiviert, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon zu erhöhen.
1 g (Frischgewicht) der so erhaltenen kultivierten Zellen wurde zuerst mit einem Edelstahlsieb fraktioniert, und Zellcluster, die eine Größe von 250–840 μm aufwiesen, wurden erhalten. Ein Dichtegradient, der die spezifischen Dichten von 1,03, 1,05, 1,07, 1,09 und 1,11 (g/ml) aufwies, wurde unter Verwendung von Ficoll hergestellt, und die vorstehend erwähnten Zellen wurden darübergeschichtet und 6 Minuten mit 700 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden gemäß dem Unterschied der spezifischen Dichte in die jeweilige Schicht fraktioniert. Die Zellen, die in der jeweiligen Schicht enthalten waren, wurden so fraktioniert, dass sie nicht miteinander gemischt wurden, und sie wurden dreimal oder mehr mit 2%iger Saccharoselösung gewaschen, um das Ficoll wegzuwaschen. Nach dem Waschen wurden etwa 0,1 g (Frischgewicht) der Zellen in eine Kulturvertiefung überführt, die einen Innendurchmesser von 18 mm aufwies und 0,8 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, und eine Schüttelkultivierung wurde 21 Tage bei 25°C durchgeführt. Nach 21-tägiger Kultivierung wurde die Gesamtmenge der Zellen in eine Kulturvertiefung überführt, die einen Innendurchmesser von 36 mm aufwies und 3 ml des vorstehend erwähnten flüssigen Mediums enthielt, und eine Schüttelkultivierung wurde ferner weitere 28 Tage bei 25°C fortgesetzt.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen von Taxus baccata LINN durch Filtration geerntet und lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Wachstumsgeschwindigkeit davon pro Liter des flüssigen Mediums zu erhalten. Die taxanartigen Diterpene wurden mit Methanol und dergleichen aus dem getrockneten Kallus extrahiert, und sie wurden durch den Vergleich mit Standardtaxol, Cephalomannin und Baccatin III unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt, um die Ausbeuten der taxanartigen Diterpene zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22, 4 und 5 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 20]
Das Verfahren von Beispiel 75 wurde durchgeführt, außer dass die Fraktionierung gemäß dem Dichtegradienten nach der Abtrennung der Zellcluster durch das Edelstahlsieb nicht durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22, 4 und 5 gezeigt.
[Beispiel 76] – Kein Beispiel der Erfindung
Das Verfahren von Beispiel 75 wurde durchgeführt, außer dass kultivierte Zellen verwendet wurden, die dieselbe Ausgangspflanze aufwiesen, bei denen jedoch der Kallus in verschiedenen Stufen induziert wurde. Mit der Maßgabe, dass die in einer Schicht enthaltenen Zellen eine spezifische Dichte von 1,07 oder mehr aufwiesen, wurden sie in einer Gruppe gesammelt und kultiviert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 21]
Das Verfahren von Beispiel 76 wurde durchgeführt, außer dass die Fraktionierung gemäß dem Dichtegradienten nach der Abtrennung der Zellcluster durch das Edelstahlsieb nicht durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 gezeigt.
Tabelle 22
[Referenzbeispiel 4]
Etwa 0,2 g (Frischgewicht) der in Beispiel 75 erhaltenen Zellen, die nach der Fraktionierung in eine Schicht, die einen Bereich der spezifischen Dichte von 1,03 oder weniger aufwies (Tabelle 22), kultiviert wurden, wurden in eine Kulturvertiefung inokuliert, die einen Innendurchmesser von 36 mm aufwies und 3 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, und eine Schüttelkultur wurde weitere 28 Tage bei 25°C durchgeführt. Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen erneut durch den Dichtegradienten, der die spezifischen Dichten von 1,03, 1,05, 1,07, 1,09 und 1,11 (g/ml) aufwies, fraktioniert. Direkt nach der Dichtegradientenfraktionierung wurden die Zellen gesammelt, und die Verteilung der fraktionierten Zellen und der Gehalt der taxanartigen Diterpene wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 23, 6 und 7 gezeigt.
Tabelle 23
[Beispiel 77] – Kein Beispiel der Erfindung
1 g (Frischgewicht) derselben kultivierten Zellen, die in Beispiel 1 verwendet wurden, wurde in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml einer Flüssigkeit mit 10^–5 M–10^–2 M Kaliumperoxodisulfat enthielt, und 21 Tage bei 25°C geschüttelt, um die erste Stufe der Kultivierung durchzuführen.
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen durch Filtration geerntet, und ein Teil der Zellen wurde als Impfzellen für die zweite Stufe der Kultivierung verwendet, und der Rest der Zellen wurde einer Messung der Ausbeute an Zellen und des Taxangehalts in den Zellen unterzogen. Folglich wurde 1 g (Frischgewicht) der kultivierten Zellen in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der 20 ml flüssiges Woody Plant Medium enthielt, zu dem Naphthalinessigsäure gegeben worden war, wobei sich eine Konzentration von 10^–5 M ergab, und eine Schüttelkultur wurde 14 Tage bei 25°C durchgeführt. Am 14. Tag der Kultivierung wurde Jasmonsäuremethylester zu dem Medium gegeben, wobei sich ein Konzentration in dem Medium von 100 μM ergab, und die Kultivierung wurde ferner weitere 7 Tage fortgesetzt. Andererseits wurde der Rest der Zellen, der in der ersten Stufe der Kultivierung erhalten wurde, lyophilisiert, und dann wurde das Trockengewicht gemessen, um die Ausbeute an Zellen davon pro Liter des flüssigen Mediums zu erhalten. Der Gehalt an Taxol in den getrockneten Zellen wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gemessen. Die Ausbeute der Zellen und die Ausbeute an Taxol wurden für die Zellen, die durch die zweite Stufe der Kultivierung erhalten wurden, auf dieselbe Art und Weise, wie die für die Zellen, die in der ersten Stufe der Kultivierung erhalten wurden, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 22]
Das Verfahren von Beispiel 77 wurde durchgeführt, außer dass Kaliumperoxodisulfat nicht verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 gezeigt.
Tabelle 24
[Beispiel 78] – Kein Beispiel der Erfindung
100 g (Frischgewicht) derselben kultivierten Zellen, die in Beispiel 1 verwendet wurden, wurden zur Tankkultivierung unter Rühren in einen mit 1 l des flüssigen Woody Plant Standardmediums (Saccharosekonzentration: 20 g/l, Nitrationenkonzentration: 14,7 mM, α-Naphthalinessigsäure: 10^–5 M) gefüllten Tank (Fassungsvermögen 2 l; 8) inokuliert, zu dem 2 mM [Ag(S₂O₃)₂]^3– gegeben worden waren, und die Kultivierung wurde bei 25°C im Dunkeln mit einer Rührgeschwindigkeit von 40 UpM begonnen, während Luft mit 0,1 l pro Minute zugeführt wurde, und ein Medium, das 20 g/l Saccharose und 20 mM Natriumnitrat enthielt, wurde kontinuierlich während einer Dauer, beginnend am 2. Tag bis zum 14. Tag der Kultivierung, auf solche An und Weise zugeführt, dass die Menge der an einem Tag zugegebenen Saccharose 2 g/l betrug, und die Menge der an einem Tag zugegebenen Nitrationen 2 mmol/l betrug, und die Kulturlösung wurde kontinuierlich aus der Ableitungsöffnung, die sich von der Zuleitungsöffnung für die Nährstoffquelle unterschied, und an der ein Edelstahlfilter mit Siebgröße 100 befestigt war, mit derselben Geschwindigkeit, wie die der Zugabe einer Lösung der Nährstoffquelle entnommen (das Erneuerungsverhältnis des Mediums in dem Kultivierungsgefäß betrug 10% pro Tag), um 21 Tage eine Tankkultivierung unter Rühren durchzuführen. Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die kultivierten Zellen und das Medium gesammelt, und die Ausbeute an Taxol wurde auf dieselbe Art und Weise, wie die in Beispiel 1 verwendete, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 23]
Das Verfahren von Beispiel 78 wurde durchgeführt, außer dass die Nährstoffquelle nicht auf halbem Weg zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 gezeigt.
Tabelle 25
[Beispiel 79] – Kein Beispiel der Erfindung
50 g (Frischgewicht) derselben kultivierten Zellen, die in Beispiel 1 verwendet wurden, und 1 l flüssiges Woody Plant Medium wurden in einen Kultivierungstank (Fassungsvermögen 2 l) überführt, und die Kultivierung wurde 14 Tage bei 25°C im Dunkeln mit einer Rührgeschwindigkeit von 40 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,1 l pro Minute durchgeführt. Das gefällte Zellvolumen (PCV), das am 14. Tag nach dem Start der Kultivierung gemessen wurde, betrug 0,2 l. Vom 14. Tag an wurden mit der Zufuhr von frischem Medium, wobei 3 mM [Ag(S₂O₃)₂]^3– zu einem Medium mit derselben Zusammensetzung wie der des Ausgangsmediums gegeben worden war, sowie mit der Entnahme einer zellfreien Kulturlösung begonnen. Die Menge des frischen Mediums, die pro Tag zugeführt werden soll, betrug 2/5 des PCV zu diesem Zeitpunkt, und die Menge der zellfreien Kulturlösung, die entnommen werden soll, wurde auf 1 l reguliert. Am 35. Tag nach dem Start der Kultivierung erreichte das PCV 0,6 l. Danach wurde der stationäre Zustand aufrechterhalten, indem die zellhaltige Kulturlösung einmal am Tag entnommen wurde, um das mittlere PCV bei 0,6 l zu halten, und indem die zellfreie Kulturlösung entnommen wurde, um die Menge der Kulturlösung bei 1 l zu halten. Die Kultivierung wurde nach dem Start der Kultivierung 90 Tage durchgeführt. Die Menge des frischen Mediums, die während des stationären Zustands von 60 Tagen zugeführt wurde, betrug 15 l, die Menge des Mediums, die aus dem Kultivierungstank entnommen wurde, betrug 14 l, und die Menge der erhaltenen Zellen betrug 0,15 kg (Trockengewicht), die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit μ betrug 0,08 (Tag^–1), und das mittlere Erneuerungsverhältnis des Mediums betrug 2,88. Die Ergebnisse der Analyse der Zellen und des Mediums, die während des stationären Zustands aus dem Kultivierungstank entnommen wurden, zeigten, dass 525 mg Taxol hergestellt wurden. Dies entsprach einer Produktivität von 8,8 mg/Liter/Tag.
Die Menge des Taxols, das in den Zellen und im Medium enthalten war, wurde auf dieselbe Art und Weise, wie die in Beispiel 1 verwendete, gemessen.
[Beispiel 80]
50 g (Frischgewicht) derselben kultivierten Zellen, die in Beispiel 1 verwendet wurden, und 1 l flüssiges Woody Plant Medium wurden in einen Kultivierungstank (Fassungsvermögen 2 l) überführt, und die Kultivierung wurde 14 Tage bei 25°C im Dunkeln mit einer Rührgeschwindigkeit von 40 UpM durchgeführt, während Luft, der 2% Kohlendioxidgas hinzugefügt worden war, mit 0,1 l pro Minute zugeführt wurde. Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen und das Medium gesammelt, und 15,2 g trockene Zellen wurden erhalten. Die Bestimmung der in den Zellen und in dem Medium enthaltenen Menge an Taxol, die auf dieselbe Art und Weise wie die in Beispiel 1 verwendete durchgeführt wurde, zeigte, das 31 mg Taxol hergestellt wurden.
[Vergleichsbeispiel 24]
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer dass Jasmon anstelle von Tuberonsäuremethylester zugegeben wurde, wobei sich eine Endkonzentration von 0,1–1000 μM ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26 gezeigt.
[Vergleichsbeispiel 25]
Das Verfahren von Vergleichsbeispiel 24 wurde durchgeführt, außer dass Jasmon nicht zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26 gezeigt.
Tabelle 26
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die industrielle Herstellung eines taxanartigen Diterpens, einschließlich Taxol, das als therapeutisches Mittel gegen Eierstockkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und dergleichen verwendbar ist.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines taxanartigen Diterpens, wobei Gewebe oder Zellen einer Pflanze, die taxanartige Diterpene herstellen, unter Verwendung von sauerstoffhaltigem Gas, welches 0,03 bis 10% Kohlendioxid enthält und in das Kultivierungsgefäß eingebracht wird, kultiviert werden, und das taxanartige Diterpen aus den erhaltenen Kulturen zurückgewonnen wird.