KR100266448B1 - 식물세포 배양 중의 온도변화에 의한 택솔의 대량생산 방법 - Google Patents

식물세포 배양 중의 온도변화에 의한 택솔의 대량생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물세포의 배양 중 배양 온도를 변화시킴에 의해 택솔의 생산성을 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것으로, (i) 택서스(Taxus)속 식물세포를 배지에 접종한 배양액을 20℃ 내지 25℃에서 배양하는 단계; 및 (ii) 전기 배양액의 배양 개시 후, 26℃ 내지 32℃로 배양 온도를 변화시켜 배양을 계속하는 단계로 이루어진다. 또 본 발명은 추가로 세포 배양에서 초기 세포 접종량과 배지의 당농도를 증가시키는 것으로 이루어진다. 본 발명은 이와 같은 간편한 방법으로 택솔을 높은 수율로 대량 생산할 수 있으므로, 택솔의 산업화에 크게 기여할 수 있다.

Description

식물세포 배양 중의 온도 변화에 의한 택솔에 대량생산 방법
본 발명은 배양조건의 하나인 온도의 변화를 통해 식물세포배양의 이차대사산물인 택솔의 대량생산 방법에 관한 것이다.
택솔(taxol)은 택서스속 식물체의 줄기에서 분리된 택세인(taxane) 계열의 화합물로서, 세포분열시 방추사의 작용을 방해하여 백혈병 및 암에 치료효과를 나타내며, 난소암 환자의 약 30% 이상, 유방암 환자의 약 50% 및 폐암 환자의 약 20% 정도를 치유하는 효과가 있다고 보고 되고 있다.
일반적으로, 택솔 제조를 위한 방법으로는 화학적으로 택솔을 합성하는 전합성(全合成)법, 합성시 바카틴(baccatin) 드의 전구체를 이용하는 반합성(半合成)법, 택서스속 식물로부터 택솔을 직접 추출하는 추출법 및 택솔 생산 세포주를 배양하여 택솔을 수득하는 배양법 등이 알려져 있다. 이들 중에서, 식물세포의 배양법은 ① 추출법과 같이 병충해 및 자연재해 등에 의한 원료식물공급의 기복에 영향을 받지 않고 일정량의 택솔을 계속적으로 공급할 수 있으며, ② 택솔의 복잡한 화학구조상 비용이 많이 들고 수율이 높지 못한 전합성법 및 반합성법과 비교할 때, 세포배양을 발효조에서 수행하여 외부조건을 조정하는 간단한 방법으로 택솔의 대량생산을 유도할 수 있고, ③ 식물체로부터의 직접 추출시보다 식물세포의 배양시에 생성되는 화합물의 수가 적으므로 택솔의 분리 및 정제가 용이하며, ④ 여러가지 변화에 대한 적응이 빠르고, ⑤ 택솔 외에 바카틴과 같은 택세인 전구체도 생산할 수 있는 등의 장점을 지니고 있다.
세포배양에 의해 택솔을 생산하는 방법에 대해서는 몇몇 보고되어 있는 선행기술들이 있다. 예를 들면, 미합중국 특허 제5,019,504호는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 세포 배양에 의한 택세인 및 택세인과 유사한 화합물의 제조에 대하여 개시하고 있다. 그러나, 상기 기술에 의하여 배양된 식물세포는 배양 후 2 내지 4주내에 1 내지 3㎎/ℓ라는 적은 양의 택솔을 생산하며, 생물량(biomass)이 2배로 되는데 걸리는 배양시간은 7 내지 12일 정도로 길기 때문에 산업화에 부적당하고, 더우기 세포주의 택솔 생산능이 안정되지 못하여, 계대배양이 거듭되면 세포주가 높은 생산성을 유지하지 못하는 것으로 보고되고 있다(참조 : E. R. M. Wickremesins et al., World Congress on Cell and Tissue Culture(1992)).
또한, 국제특허 공개 제 WO 93/17121호는 배양배지의 구성성분 등을 변화시키면서 여러가지 택서스속 식물체를 세포배양한 후, 세포주의 성장속도 및 택솔 생산율을 비교하고 그 결과에 의거한 다량의 택솔을 제조하기 위한 조건을 개시하고 있는데, 택서스 취넨시스(Taxus chinensis)의 경우 배양 18일에 24.1㎎/ℓ의 택솔을 생한하며, 생물량이 2배로 되는데 걸리는 배양시간은 2.5일 정도로 보고하고 있다.
현재까지 택솔 생산을 위한 세포 배양온도는 대부분 25℃ 내외로 보고되어 있으며, 온도 변화에 따른 생육 조건 또는 생산 조건 변화에 대한 보고는 없다.
본 발명의 목적은 간편하고 효율적인 택솔의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 식물 세포주의 배양시 온도 변화를 줌으로써, 택솔을 간편하게 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 식물 세포주의 배양시 접종 균주를 고농도로 접종함으로써, 택솔 생산성을 향상시키는 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
제1도는 택솔 생상 세포주인 택서스 취넨시스(Taxus chinensis) SYG-1의 생욕에 미치는 온도의 영향을 나타낸 것이다
제2도는 택서스 취넨시스 SYG-1 배양 중 온도 변화가 택솔의 생산성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
제3도는 택서스 취넨시스 SYG-1 배양 중 온도 변화 시점이 생육에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 식물세포 배양 중에 배양 온도를 변화시킴으로써 택솔의 생산성을 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 택서스(Taxus)속 식물세포의 배양시 상온에서 세포 생육을 상당히 또는 충분히 진행시킨 후, 배양온도를 변화시켜 배양을 계속 진행시키는 간편한 방법에 의해 높은 수율로 택솔을 대량생산하는 방법에 관한 것이다.
일반적인 식물체로부터의 2차 대사산물은 식물의 생장과는 무관하게 생성되며, 이들 중 일부는 주로 식물의 방버기작에 관여하는 물질로서, 외부로부터의 자극에 대하여 식물체를 보호하는 역할을 하게 된다. 식물세포 배양의 경우도, 식물체의 방어기작에 관련된 대사과정을 조절함으로써 원하는 이차대사산물의 생산성을 향상시킬 수 있다. 본 발명에서는 배양온도조건의 변화를 근간하여 택솔 생산을 최대로 할 수 있는 공정을 개발하였다. 또한 본 발명에서는 세포 배양에서 초기 세포 접종량의 변화는 물질대사에 영향을 줄 수 있다는 점에 기초하여, 세포 배양에서 초기 세포 접종량과 배지의 당 농도를 증가시킴에 의해 택솔 생산량을 증가시키는 공정을 개발하였다.
본 발명자들은, 우선 세포생육에 최적인 온도를 규명하고, 이후에 생육 저해로 인한 택솔 생산 증가를 초래할 수 있는 배양 온도를 추론하고자 하였다. 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은, 일단 택서스속 식물세포를 생육 최적 온도로 일정 시간 배양하여 충분히 생육시킴으로써 생물량을 늘린 후에 배양 온도를 변화시켜 생육을 계속함으로써 택솔을 비롯한 2차 대사산물의 생산성을 최대화하였다.
본 발명에 따른 택솔의 대량 생산방법은 다음 단계로 이루어진다.
(i) 택서스속 식물세포를 배지에 접종한 배양액을 약 20℃ 내지 25℃, 바람직하게는 약 20-24℃ 에서 배양하는 단계, 및,
(ii) 전기 배양액의 배양 개시 후 세포의 생육이 진행되었을 때, 약 26℃ 내지 32℃, 바람직하게는 약 28-30℃로 배양 온도를 변화시켜 배양을 계속하는 단계,
세포 생육이 충분히 진행되는 시점은 배양온도, 배지 조성 등의 조건에 따라 달라질 수 있으며, 본 발며의 구체예에 따라 예를 들어 배양 개시 후 약 10일 이후에, 바람직하게는 약 14일 이후에, 더욱 바람직하게는 약 20일 이후에 배양 온도를 변화시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 낮은 온도에서 세포 생육을 어느정도 또는 충분히 진행시킨 후 배양 온도를 상승시키면 택솔 생성량이 증대됨을 알 수 있다. 세포를 생육시킨 후 생육 온도보다 높은 온도인 약 26℃ 내지 32℃, 바람직하게는 약 28-30℃로 배양하는 것이 바람직하다. 이와 같이 변화된 배양 온도는 택솔 생합성에 관여하는 효소를 새로 생성시키는 데에 적당한 온도이거나, 또는 이미 존재하는 택솔 생합성에 관여하는 효소의 최적온도에 가까울 것이라고 사료된다.
본 발명의 방법은 특별한 한정 없이 택서스속의 식물체에 적용될 수 있으며, 예를 들어 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 커스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 왈리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 및 택서스 취넨시스(Taxus chinensis) 등에 적용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 식물세포 배양을 위하여 사용되는 배치는 카제인 가수분해물을 함유하는 B5 배지(참조 : Gamborg et al., Can. J. Biochem., 45 : 417-421(1968))가 사용될 수 있으며, 택솔 생산을 위해서는 표 1에 기재된 바와 같은 변형된 B5 배지가 바람직하다. 아울러, 택솔의 생산을 촉진시키기 위하여 당, 바람직하게는 말토스를 배양 5 내지 30일 후에, 보다 바람직하게는 7 내지 12일 후 및 18 내지 24일 후 2회에 걸쳐서 한 회당 10 내지 100g/ℓ, 보다 바람직하게는 10 내지 40g/ℓ를 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법은 추가로 세포 배양시 초기 세포 접종량을 정상적인 식물세포 배양에서의 접종량보다 높은 농도로, 예를 들어 세포건조중량으로 4g/ℓ 이상으로 접종하는 것으로 이루어진다. 이와 같이 고농도로 세포를 접종하여 배양하는 경우, 초기 배지의 당 농도를 예를 들어 40g/ℓ 이상으로 하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 이들 싱시에는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시에에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
배양온도가 택서스 속 세포의 생육과 택솔 생산에 미치는 영향 250㎖의 삼각플라스크에 각각 표 1의 배지 75㎖와, 카제인 가수분해물 500㎎/ℓ를 포함하는 B5 배지에서 15일 동안 배양한 택서스 치넨시스 Hu-1, 택서스 치넨시스 SYG-1(KCTC-0232BP), 택서스 바카타, 택서스 x 메디아, 택서스 쿠스피다타 배양액 25㎖를 넣고 24℃ 에서 20일간 배양한 후, 29℃로 온도를 변화시켜 배양하였다. 21일과 42일째에 세포건조중량과 택솔 생산량을 측정하여 표 3 에 나타내었다. 세표건조중량을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
먼저, 5.5 ㎝ 직경의 거름종이(No. 541, Whatman사, 미합중국)를 흡인 플라스크(suction flask)가 장착된 다공성 주발에 옮긴 후, 증류수를 가하여 주발과 거름종이를 완전이 밀착시켰다. 그런다음, 분석하고자 하는 식물세포의 배양액 5㎖를 취하여 준비된 거름종이 상에 도포하고, 플라스크에 흡인력을 가하여 거름종이 상의 수분을 제거하였다. 이 수분이 제거된 거름종이를 알루미늄 호일 접시에 담아 80℃의 오븐에서 24시간 동안 건조시키고, 건조가 끝나면 오븐에서 꺼내어 10분 동안 상온에서 방치한 후 알루미늄 호일 접시 거름종이 전체의 무게를 측정하였다. 이 측정 결과에서 미리 측정해 둔 알루미늄 호일 접시 및 거름종이의 건조중량을 감하고, 여기에 200을 곱함으로써 배양액 1리터 당 세포건조중량을 구하였다.
택솔 생성량은 HPLC를 사용하여 아래 표 2의 조건에서 정량분석하였다.
[실시예 2. 식물세포 생육에 미치는 온도의 영향]
250㎖의 삼각플라스크에 각각 표 1의 배지 75㎖와, 카제인 가수분해물 500㎖/ℓ를 포함하는 B5 배지에서 15일 동안 배양한 SYG-1의 배양액(세포건조중량 : 약 12g/ℓ) 25㎖를 넣고 플라스크의 배양온도를 각각 20℃, 24℃, 29℃, 32℃ 및 36℃로 달리하여 20일 동안 배양하면서 세포건조중량을 실시예 1의 방법으로 측정하여서, 식물세포 생육시의 최적 온도를 확인하였다. 세포건조중량의 측정 결과는 제1도에 나타낸다(-- : 20℃; -- : 24℃; -- : 29℃; -- : 32℃; -◆- : 36℃).
제1도에서 보는 바와 같이, 각 온도에서 배양된 식물세포의 세포건조중량은, 배양 13일째에 20℃로 배양한 식물세포의 세포건조중량이 8.23g/ℓ 이었고, 24℃로 배양한 식물세포의 세포건조중량이 12.3g/ℓ, 29℃, 32℃ 및 36℃로부터의 세포건조 중량이 각각 6g/ℓ, 4.5g/ℓ 및 3.8g/ℓ이었다.
[실시예 3. 식물세포 배양 도중의 온도 변화가 세포생육 및 택솔 생산량에 미치는 영향]
생육 온도를 24℃로 유지하면서 일정 시간 배양하여 충분히 생육시킨 후에, 배양 온도를 변화시켜 배양을 계속함으로써 택솔의 생산성을 증가시킬 수 있는 온도를 확인하기 위하여, 식물세포로 택서스 치넨시스 SYG-1를 사용하여 (1) 배양개시일로부터 24℃로 배양한 배양액(이하, '24℃ 대조구'라고 함), (2) 배양개시일로부터 21일까지는 24℃로 배양하고 21일 이후에는 29℃로 배양한 배양액(이하, '24℃-29℃ 실험구'라고 함), (3) 배양개시일로부터 21일까지는 24℃로 배양하고 21일 이후에는 32℃로 배양한 배양액(이하, '24℃-32℃ 실험구'라고 함), 및 (4) 배양개시일로부터 21일까지는 24℃로 배양하고 21일 이후에는 20℃로 배양한 배양액(이하, '24℃-20℃ 실험구'라고 함)을 얻었으며, 각각의 세포건조중량 및 택솔 생성량을 분석하였다.
250㎖의 삼각플라스크에 각각 표 1의 배지 75㎖와, 카제인 가수분해물 500㎎/ℓ를 포함하는 B5 배지에서 14일 동안 배양한 SYG-1의 배양액 25㎖를 넣고 24℃로 배양하면서, 배양 후 7일 경과시 모든 플라스크에 10g/ℓ의 말토오스를 첨가하고 배양을 계속하였다. 배양 후 21일 지난 때에 모든 플라스크에 20g/ℓ의 말토오스를 첨가하고, 네 개의 실험구 중 하나는 배양온도를 24℃로 유지하고, 하나는 배양온도를 29℃로(24℃-29℃ 실험구), 하나는 배양온도를 32℃(24℃-32℃ 실험구), 하나는 배양온도를 20℃로(24℃-20℃ 실험구) 하여 계속 배양하였다. 배양 후 세포배양액 7㎖씩을 취하여 실시예 1의 방법 및 조건에 따라 세포건조중량과 택솔 생성량을 분석하였다. 그 결과를 표 4와 제2도에 나타낸다(-- : 24℃ 대조구; -- : 24℃-29℃실험구; -- : 24℃-32℃ 실험구; -◆- : 24℃-20℃ 실험구). 24℃-29℃ 실험구 및 24℃-32℃ 실험구가 높은 택솔 생성량을 나타내었다.
[실시예 4. 식물세포 배양 도중의 온도 변화 시기가 세포생육 및 택솔 생산량에 미치는 영향]
온도 변화시기 및 배양 온도를 달리하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 수행하면서, 배양 온도 변화시점을 다양하게 하여 배양을 계속하여 세포를 수득하여, 각각의 세포건조중량 및 택솔 생성량을 분석하였다.
49일 동안 24℃로 배양한 배양액, 49일 동안 29℃로 배양한 배양액, 7일 째부터 29℃로 배양한 배양액, 14일 째부터 29℃로 배양한 배양액, 21일 째부터 29℃로 배양한 배양액을 수득하여, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 각각의 세포건조중량 및 택솔 생성량을 분석하였다. 결과를 제3도 및 표 5에 나타낸다.
[실시예 5. 고농도 접종의 효과]
고농도의 접종과 배양 중 온도 변화가 세포의 생장과 택솔의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 실험구 1은 카제인 가수분해물 500 ㎖/ℓ를 포함하는 B5 배지에서 14일 간 배양한 SYG-1 세포(세포건조중량 : 약 11.5g/ℓ)를 1 : 4의 비율로 표 1의 배지에 접종하여 24℃에서 배양한 후 14일 후에 3% 말토오스를 첨가하여 24℃에서 배양하였다. 실험구 2는 14일 후 온도를 29℃로 옮겨 배양한 것을 제외하고는 실험구 1과 같이 배양하였다. 실험구 3은 초기에 세포 양을 2배로 농축하여 접종하여 24℃에서 배양을 시작하였다. 실험구 4는 배양 14일 후 29℃로 배양하는 것을 제외하고는 실험구 3과 같이 배양하였다. 배양 14일, 28일 및 42일 째에 배양액을 수득하여 실시예 1에 기재된 방법에 따라 각각의 세포건조중량 및 택솔 생성량을 분석하였다. 결과를 표 6 및 표 7에 나타낸다.
[실시예 6. 고농도 접종과 고농도 당의 효과]
고농도의 접종과 배양 중 온도 변화와 함께 고농도 당의 효과를 관찰하였다. 실험구 1은 카제인 가수분해물 500 ㎖/ℓ를 포함하는 B5 배지에서 14일간 배양한 SYG-1 세포(세포건조중량 : 약 12 g/ℓ)를 1 : 4의 비율로 표 1의 배지에 접종하여 24℃에서 배양한 후 14일 후에 3% 말토오스를 첨가하여 24℃에서 배양하였다. 실험구 2는 초기 배지로 3% 자당이 아닌 6% 자당을 함유하는 배지를 사용하였으며 배양도중에는 당을 첨가하지 않고 배양하였다. 실험구 3은 초기에 세포 양을 2배로 농축하여 접종하는 것을 제외하고는 실험구 2과 같이 배양하였다. 실험구 4는 배양 14일 후 29℃로 배양하는 것을 제외하고는 실험구 3과 같이 배양하였다. 배양 14일, 28일 및 42일 째에 배양액을 수득하여 실시예 1에 기재된 방법에 따라 각각의 세포 건조중량 및 택솔 생성량을 분석하였다. 결과를 표 8 및 표 9에 나타낸다.
본 발명에 의하여, 택솔을 높은 수율로 대량생상할 수 있으므로, 택솔의 산업화에 크게 기여할 수 있다.

Claims (4)

  1. (i) 택서스(Taxus)속 식물세포를 20℃ 내지 25℃에서 배양하는 단계, 및,
    (ii) 상기 배양 개시 후 세포가 대수기에 있는 때에 26℃ 내지 32℃로 배양 온도를 변화시켜 배양을 계속하는 단계로 이루어지는, 택솔의 대량 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배양 개시 후 5 내지 30일에 최소한 1회 이상 탄소원을 10 내지 100g/ℓ 첨가하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 택솔의 대량 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (i) 단계에서 택서스속 식물세포를 건조중량으로 4 g/ ℓ ∼ 10 g/ℓ의 농도로 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 택솔의 대량 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (i) 단계에서 사용하는 배지가 40 g/ℓ ∼ 100 g/ℓ의 당을 함유하는 것을 특징으로 하는 택솔의 대량 생산 방법.
KR1019980009384A 1997-06-26 1998-03-12 식물세포 배양 중의 온도변화에 의한 택솔의 대량생산 방법 KR100266448B1 (ko)

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