DE69433010T2 - Verfahren zur darstellung von oligonukleotiden - Google Patents
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Description
- Technisches Gebiet
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Darstellung von Oligonucleotiden und im Besonderen Verfahren, die Verwendung als potentielle neue therapeutische Methoden zur Behandlung von Viruserkrankungen, Krebs, genetischen Funktionsstörungen und dergleichen haben, sowie auch diagnostische Anwendungen von Oligonucleotiden.
- Hintergrund der Erfindung
- Antisense-Oligonucleotide haben nachweislich ein Potential als neue Typen therapeutischer Agentien zur Behandlung solcher Erkrankungen und Funktionsstörungen wie Viruserkrankungen, Krebs, genetische Funktionsstörungen, sowie auch anderer Erkrankungen und Funktionsstörungen1. Ausgiebige Untersuchungen in industriellen und akademischen Laboratorien sind bislang durchgeführt worden und werden auch fortgeführt, um dieses Potential2 zu erforschen.
- Ein Problem, welches im Zusammenhang mit dem Ansatz der Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden als therapeutische Agentien aufgeworfen wurde, betrifft die Selektivität des Agens in vivo. Im Hinblick auf die niedrigen Konzentrationen von intrazellulären Polynucleotidtargets und die niedrigen Konzentratio nen von therapeutischen Oligonucleotiden, welche in Zellen eingeführt werden können, wurde erkannt, dass ein Bedarf an Oligonucleotiden mit hohen Bindungsaffinitäten besteht. Die Bindungsaffinität bezieht sich auf die Länge der Oligonucleotide, vorzugsweise 20-mer und länger. Im Fall von langen Oligonucleotiden jedoch ist eine Fehlanpassung der Basenpaarung weniger destabilisierend als im Falle eines kurzen Oligonucleotids. In Folge dessen wird der gewünschte destabilisierende Effekt durch die Verwendung von längeren Oligonucleotiden vermindert, während die Selektivität erhöht wird.
- Fachleute haben festgestellt, dass „hohe Sequenzspezifizität" und „hohe Affinität" einander im Widerspruch stehende Anforderungen sind3. Ferner ist man zu dem Schluss gekommen, dass auf Grundlage des Ausmaßes, in welchem Antisense-Oligonucleotide eine Spaltung von RNAs an unvollkommen gepaarten Targetseiten bewirken können, in den untersuchten Systemen es vermutlich nicht möglich war, eine spezifische Spaltung einer vorgesehenen Ziel-RNA zu erreichen, ohne gleichfalls zumindest die teilweise Zerstörung von vielen nicht zielgerichteten RNAs4 zu bewirken. Infolge dessen haben Fachleute auf diesem Gebiet auf Grundlage durchgeführter Untersuchungen gefolgert, dass die zueinander in Konflikt stehenden Erfordernisse der Spezifizität und der Affinität hohe zu überwindende Hürden sind.
- Es wurde bereits über viele Verfahren zur kovalenten Bindungsknüpfung von Oligonucleotidblöcken in wässrigen Medien berichtet5a–l. All diese Methoden erfordern ein zusätzliches chemisches Agens, um ein fest ligiertes Produkt zu ergeben. In Abhängigkeit von der Methode kann das hinzugefügte Reagens ein „Aktivierungsreagens" sein wie beispielsweise ein wasserlösliches Carbodiimid oder ein Cyanoimidazol5a–k oder es kann ein reduzierendes Agens sein wie beispielsweise Natriumcyanoborhydrid5l. In beiden Fällen verhindert der Bedarf an dem dritten Reagenz eine chemische Ligation in vivo, da derartige Stoffe toxisch sind, mit Wasser reagieren und nicht in ausrei chenden Mengen in lebende Systeme eingebracht werden können, um die gewünschte Kopplungsreaktion zu bewirken.
- Die vorliegende Erfindung liefert ein neues Verfahren zur kovalenten Bindungsknüpfung von Oligonucleotidblöcken, die in geringen Konzentrationen in einem wässrigen Medium vorliegen, ohne den Bedarf an einem zusätzlichen kondensierenden oder stabilisierenden Reagenz. Es eröffnet sich daher der Einstieg für die in situ chemische Ligation in lebenden Systemen. Da die Reaktionen in Gegenwart einer komplementären Oligonucleotidsequenz außerordentlich beschleunigt werden, ist es prinzipiell möglich, lange Oligonucleotidstränge selektiv in vivo zu bilden, wenn ein Zielpolynucleotid (beispielsweise m-RNA oder DNA einer Virus- oder Krebszelle) mit aufeinanderfolgenden Nucleotidsequenzen, die komplementär zu dem individuellen Oligonucleotidsträngen sind, anwesend ist. Lange Oligonucleotidstränge, welche mit hoher Affinität binden, würden daher von kürzeren Strängen, welche mit niedrigerer Affinität binden, in situ generiert werden, wenn das Zielpolynucleotid anwesend ist. Diese Erfindung könnte daher das Problem des Konflikts sowohl der Erreichung einer hohen Affinität als auch einer hohen Spezifizität in therapeutischen und ebenfalls auch in diagnostischen Anwendungen lösen.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Darstellung eines Oligonucleotids durch irreversibel kovalente Bindungsknüpfung zumindest zweier Oligomere bereitgestellt, welche jeweils selbst reversibel über Wasserstoffbrückenbindungen in gegenüberliegenden Positionen an einem Zielpolynucleotid gebunden sind, wobei das Polynucleotid eine Nucleosidbasensequenz enthält, die komplementär zu den Sequenzen des Oligomerpaares ist, und wobei eines der Oligonucleotide ein Nucleotid mit einer ersten reaktiven Gruppe, enthaltend ein Bromacetylamin gegenüberliegend zu einem Nucleotid des anderen Oligomers umfasst, welches eine zweite reaktive Gruppe umfassend ein Phosphorothioat beinhaltet, die zur spontanen Ausbildung einer kovalenten Thiophosphorylacetylamino-Bindung mit der ersten reaktiven Gruppe fähig ist. Die Oligonucleotide sind dadurch kovalent miteinander verbunden, dass durch Binden der Oligonucleotide an dem Polynucleotid die erste und die zweite reaktive Gruppe in Nachbarschaft zueinander gebucht wurden.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung zumindest eines ersten und eines zweiten Oligonucleotids zur Herstellung eines Medikaments oder einer Oligonucleotidsonde zur Therapie oder Diagnose bereit, dadurch gekennzeichnet, dass
- – das erste Oligonucleotid eine Vielzahl von Nucleotidbaseneinheiten umfasst und eine erste reaktive Gruppe enthaltend ein 3'- oder 5'-terminales Bromoacetylamin aufweist, und dass die Nucleotidbaseneinheiten des ersten Oligonucleotids im Wesentlichen zu einer ersten Sequenz von Baseneinheiten eines Zieloligonucleotids oder Polynucleotids komplementär sind;
- – das zweite Oligonucleotid eine Vielzahl von Nucleotidbaseneinheiten umfasst und eine zweite reaktive Gruppe enthaltend ein 5'- oder 3'-terminales Phosphorothioat aufweist, und dass die Nucleotidbaseneinheiten des zweiten Oligonucleotids im Wesentlichen zu einer zweiten Sequenz von Baseneinheiten des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids komplementär sind, wobei die erste und die zweite Basensequenz in benachbarten Positionen des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids sind;
- – so das erste und das zweite Oligonucleotid reversibel an die benachbarten Positionen des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids binden kann, wobei die erste und die zweite reaktive Gruppe in Nähe zueinander gebracht werden, sodass eine kovalente Thiophosphorylacetylamino bindung zwischen dem 3'- oder 5' Bromoacetylamin des ersten Oligonucleotids und dem 5'- oder 3' Phosphorothioat des zweiten Oligonucleotids in Abwesenheit von einem zugesetzten Reagens spontan ausgebildet werden kann.
- Kurzbeschreibung der Figuren
- Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden schnell dadurch ersichtlich, dass die Erfindung mit Hinweis auf die nachfolgende detaillierte Beschreibung in Zusammenschau mit den begleitenden Figuren betrachtet werden wird, wobei:
-
1 zeigt die Kopplung von zwei kurzen Oligomeren im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines Zieltemplats. -
2 zeigt die einfache Reaktion eines Oligonucleotid-Phosphorothioats mir einem α-Halogenacyl-Oligonucleotid-Derivat im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. -
3 zeigt das Ergebnis einer Ionenaustausch-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (IE HPLC) der Produkte aus dem Experiment 1, wobei: - (A) nach zwei Stunden Lösung bei 0°C;
- (B) nach zwei Tagen bei 0°C; und
- (C) nach dem letzten Schritt, wobei die Lösung eingefroren und bei –18°C für fünf Tage gelagert wurde, und die Peaks bei näherungsweise 17, 21 und 24 Minuten jeweils mit den Verbindungen 1, 2 und 3 in dieser Reihenfolge korrespondieren.
-
4 zeigt ein IE HPLC Diagramm der Produkte des zweiten Experiments (gefroren, –18°C durchweg) danach; wobei: - (A) nach zwei Stunden in einer Lösung bei 0°C;
- (B) nach zwei Tagen bei 0°C und
- (C) danach:
- (A) fünf Stunden;
- (B) zwei Tage; und
- (C) fünf Tage
-
5 zeigt folgendes: - (A) IE HPLC-Diagramm der Reaktionsprodukte der Verbindungen 1 und 2 in Anwesenheit des Templats 4 bei 0°C nach zwei Stunden, die großen Peaks korrespondieren mit dem Kopplungsprodukt 3 und Templat 4, bemerkend, dass Verbindung 1 (Peak bei 17 Minuten) annähernd vollständig verbraucht wurde;
- (B) dieselben Produkte nach Behandlung mit KI3 gefolgt von Dithiothreitol (DTT); bemerkend, dass Verbindung 3 durch zwei Oligonucleotidspaltungsprodukte ersetzt wurde, eluiert nach 18 und 22 Minuten.
- Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Darstellung von Oligonucleotiden allgemein bereitgestellt durch die Schritte einer Anordnung zweier Oligonucleotide in wässriger Lösung, wobei eines der Oligonucleotide eine Bromacetylamingruppe aufweist und das andere der Oligonucleotide eine Phosphorothioatgruppe aufweist, und einer nachfolgenden kovalenten Bindungsknüpfung der Oligonucleotide zusammen durch die Bromocetylamino-Gruppe und die Phosphorothiatgruppe unter spontaner Ausbildung einer Thiophosphorylacetylaminogruppe zwischen diesen.
- Dieses Verfahren fußt auf der Tatsache, dass die hierin beschriebene Kopplungsreaktion in sehr verdünnten wässrigen Lösungen sehr langsam ist, aber in Gegenwart eines Templat-Polynucleotids schnell verläuft. Das bedeutet, dass die Reaktion in Anwesenheit eines Zielpolynucleotids, welches den Sequenzabschnitt, welcher komplementär zu der Sonde der Oligomeren ist, beschleunigt wird. In der vorliegenden Erfindung werden als ein therapeutisches Agens zwei kurze Oligomere (beispielsweise 8- bis 20-Mer) eingesetzt, welche nach Bindung an gegenüberliegenden Positionen auf dem Zielpolynucleotid spontan miteinander kovalent verknüpft werden. Anhand dieses Systems wird man sich der Bindungsaffinität und den Erkennungseigenschaften einer längeren Oligomersonde wie beispielsweise eines zwischen 16- bis 40-Mers annähern, aber die Abhängigkeit und die Basenpaarungseigenschaften der kürzeren Sonden (8- bis 20-Mer) beibehalten. Mit anderen Worten, stellt die vorliegende Erfindung die Spezifizität kürzerer Polynucleotide bereit, während sie die Wirkung von längeren Polynucleotiden besitzt.
- In der vorliegenden Erfindung ist der Bedarf und die Verwendung von Polynucleotiden, die reaktive Gruppen einschließen, welche spontan unter Ausbildung einer kovalenten Bindung, zwischen diesen reagieren, wenn die Gruppen in räumliche Nachbarschaft zueinander gebracht werden, immanent. Insbesondere verwendet die vorliegende Erfindung zumindest zwei Oligonucleotide, wobei ein Satz von Oligonucleotiden die erste reaktive Gruppe aufweist und der zweite Satz Oligonucleotide die zweite reaktive Gruppe aufweist, sodass die Gruppen bei Zusammenführung in Nachbarschaft zueinander spontan unter Ausbildung einer stabilen kovalenten Bindung reagieren. Die vorliegende Erfindung verwendet eine Bromoacetylaminogruppe und eine Thiophosphorylgruppe, welche in verdünntem wässrigen Medium effizient, selektiv und irreversibel eine Thiophosphorylacetylaminobrücke ausbilden. Wie bereits oben dargelegt, sind die Produkte in Wasser stabil und hybridisieren gut an komplementären Polynucleotiden.
- Bei niedrigen Oligomerkonzentrationen wie beispielsweise < 1 μM und in Abwesenheit eines komplementären Templats sind die Reaktionen sehr langsam, können aber innerhalb einiger Tage bei Einfrieren der Lösung mit hoher Umwandlung realisiert werden. Die Techniken des Einfrierens sind weiter unten detailliert beschrieben. Die Kopplung verläuft recht schnell (größer als 90 Umwandlung in 20 Minuten), wenn sie in Lösung bei Anwesenheit eines komplementären Oligonucleotids, welches als ein Templat dient, durchgeführt wird, so wie es weiter unten in den Beispielen beschrieben ist.
- Die Selektivität ist ebenfalls ein wichtiger Punkt in den diagnostischen Anwendungen der vorliegenden Erfindung und im allgemeinen in der Verwendung von Oligonucleotiden. Eben diese Eigenschaften der vorliegenden Erfindung sind es, die die neuartige Chemie der vorliegenden Erfindung so attraktiv für therapeutische Anwendungen und ebenso attraktiv für diagnostische Verwendungen macht. Zum Beispiel kann die vorliegende Erfindung in einem wie nachfolgend beschriebenen diagnostischen System angewendet werden.
- Mit Hinblick auf die
1 ist A ein Oligomer, bestehend aus beispielsweise einem 10-Mer mit einem Marker (*) in der Kette und einer Bromoacetylaminogruppe an dem 3'-Terminus. B ist ein weiteres kurzes Oligomer mit einer Thiophosphorylgruppe an dem 5'-Ende. C ist eine Ziel-Oligonucleotidsequenz mit einer Sequenz, welche komplementär zu A + B ist. Bei Abwesenheit des Templats ist die Kopplung von A und B in einer verdünnten Lösung hinreichend langsam im Vergleich zur Kopplung bei Anwesenheit des Templats, wobei nur die Kopplung an dem Templat signifikant dafür sein wird. Dieses chemische Ligationssystem kann deshalb in der Verstärkung und Detektion analog zu dem enzymatischen Ligationssystem (Ligase-Ketten-Reaktion, oder LCR) ver wendet werden. Das System hat die Möglichkeit besser zu sein, da irgendeine nicht-spezifischen Kopplung eine Fehlerquelle in den enzymatischen Ablauf einbringt. Die Tatsache, dass bei sehr geringen Konzentrationen an Oligonucleotiden (d.h. im Bereich des Interesses für diagnostische Anwendungen) die Reaktionsrate der chemischen Ligation in Abwesenheit des Templats sehr gering wird, zeigt, dass die nicht-templatgesteuerte Kopplung in diesem Fall unwichtig ist. - Beispiele
- Wie in
2 dargelegt, zeigt die Ligation in der Gleichung 1 für die Oligomeren1 und2 die Ausnutzung der einfachen Reaktion eines Phosphorothioats mit einem α-Halogenacyl-Derivat. - Insbesondere die Verbindung 1 (Seq. ID 1) in
2 weist eine 3'-(Bromoacetylamino)-3'-deoxythymidineinheit an dem 3'-Terminus auf. Zur Darstellung der Verbindung 1 wurden 15 μL einer 0,4 M wässrigen N-Succinimidylbromoacetatlösung (erhältlich von Calbiochem) zu 4,9 A260-Einheiten des 3'-Aminodeoxyribo-Oligonucleotide-Precursors, ACACCCAATT-NH2, hinzugefügt. Das Verfahren zur Darstellung wurde beschrieben von Gryaznov et al. 19926. Die Reaktion wurde in 10 μL einer 0, 2 M Natriumborat-Puffer-Lösung bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach 35 Minuten wurde das Gemisch mit 0,5 mL Wasser verdünnt, durch Gelfiltration und auf einer NAP-5-Säüle (hergestellt von Pharmacia) entsalzt und durch RP HPLC Hochdruckflüssigkeits-Chromatography und wiederholter Entsalzung gereinigt, ergebend 4 A260-Einheiten der Verbindung 1. Die Elutionszeiten sind wie folgt: RP HPLC, 17,4 Minuten; IE HPLC, 17,4 Minuten. - Die oben durchgeführte IE HPLC sowie sämtliche nachfolgend dargestellten vergleichbaren Prozeduren wurden auf einer Dionex Omni Pak NA100 4 × 250 mm Säule bei pH 12 (10 mM Natriumhydroxid) mit einem 2% pro Minute Gradienten von 1,0 M Natriumchlorid in 10 M Natriumhydroxid-Lösung durchgeführt. Für die RP HPLC wurde eine Hypersil ODS Säule (4,6 × 200mm) verwendet mit einem 1% pro Minute Gradient von Acetonitril in 0,03 M Triethylammoniumacetat-Puffer bei pH 7,0.
- Die Verbindung 2 (Seq. ID 2) wurde synthetisiert in einem 1 μMol-Maßstab mittels eines Milligen/Biosearch Cyclone DNA-Synthesizers unter Verwendung einer LCAA CPG Festphase mit einem 5'-Dimethoxytrityl-N-isobutyryldeoxyguanosin. Es wurde die Standard Cyanoethyl-phosphoramidit-Chemie verwendet. Wenn die Kettenverlängerung beendet war, wurde die terminale 5'-Hydroxylgruppe phosphityliert (5 Minuten) mit 150 μL einer 0,1 M Lösung des „Phosphate ONTM" Reagens (von Cruachem) in Acetonitril und 150 μL einer 0,5 M Tetrazol-Lösung in Acetonitril. Das sich ergebende Phosphit wurde sulfuriert durch Behandlung mit einer 5%-igen Lösung von Schwefel in Pyridin/Kohlendisulfid (1:1, v/v, 45 Minuten bei Raumtemperatur). Nach Spaltung der DMT-Gruppe (3% DCA in Dichloromethan, 1,5 Minuten) wurde das auf dem Träger befindliche Polymer behandelt wie im Fall von Verbindung 1.
- Die Reaktion eines Thiophosphoryl-Oligonucleotids mit einem Halogenacetylamino-aromatischen Derivats in DMSO und Wasser wurde bei der Herstellung von Farbstoff-Oligonucleotid-Konjugaten7 angewendet.
- In Abhängigkeit von der Verwendung der vorliegenden Erfindung und den gewünschten Kinetiken kann die Kopplung der Oligonucleotide entweder in wässriger Lösung in einem gefrorenen Zustand in Eis oder in wässriger Lösung in der Anwesenheit des Templats, wie oben beschrieben und unten exemplarisch ausgeführt, durchgeführt werden.
- In einem ersten Experiment wurden 1,0 mL einer Lösung (pH 7,05, 15 mM Phosphat, 85 mM NaCl) enthaltend die Verbindungen 1 (0,39 A260-Einheiten, 4 μM) und 2 (0,41 A260 Einheiten, 4 μM) hergestellt und bei 0°C 5 Tage gelagert. Die Lösung wurde auf 50°C für 2½ Stunden erwärmt und abschließend eingefroren und bei –18°C für weitere 5 Tage gelagert. Analysen durch IE HPLC der Proben nach 2 Stunden und 48 Stunden zeigten die Bildung eines langsamer eluierenden Produkts, Oligomer 3 (
2 ), in Ausbeuten von etwa 25% und 80% jeweils. Nach weiteren; 3 Tagen bei 0 °C oder Erwärmung auf 50 °C wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet. Jedenfalls wurde die Reaktion in dem eingefrorenen Stadium fortgeführt und ergab eine hohe Umsetzung zu Verbindung 3 (Seq. ID 3) innerhalb von 5 Tagen, wie dargelegt in3 . Das erweiterte Ausmaß der Reaktion in der Eismatrix kann auf die hohe örtliche Konzentration der Oligonucleotidreaktanden in den Hohlräumen im Eis zurückgeführt werden. Andere Reaktionen wurden in ähnlicher Weise in einer Eismatrix8 durchgeführt. - Angesichts dieses Ergebnisses wurde ein äquimolares Gemisch der Verbindungen 1 und 2 (2 μM jeweils) in demselben Puffer direkt eingefroren und bei –18°C gehalten. Die HPLC-Profile, welche von den Proben nach 5 Stunden und täglich danach erhalten wurden, zeigten ein Anwachsen in der Bildung einer hohen Ausbeute von 3 in 5 Tagen,
4 zeigt die repräsentativen Daten. - Die Daten zur Kopplung der Verbindungen 1 und 2 in Lösung in Anwesenheit eines komplementären Oligonucleotidtemplats (CCATTTTCAGAATTGGGTGT; Verbindung 4 (Seq. ID 4)) sind in
5 dargestellt. Das System war das gleiche wie in dem ersten Experiment mit Ausnahme vom Templat 4, welches ebenfalls anwesend war (4 μM). In diesem Fall setzte sich die Reaktion fort bis zu einer > 90%-ige Komplettierung innerhalb von 20 Minuten und war im wesentlichen vollendet innerhalb von 2 Stunden. - Die der Verbindung 3 zugeordnete Struktur wird durch die Eigenschaften einer Modellverbindung (T-NHC(O)CH2-SP(O)(O–)O-T, dar gestellt in Lösung in größerem Maßstab, als für Verbindung 3 verwendet wurde), durch die Lauffähigkeit von Verbindung 3 in der Gelelektrophorese (Rm 0,58, im Vergleich zu Rm 0,89, 0,95 und 0,61 für die Verbindungen 1, 2 und 4, in dieser Folge) und durch die Stabilität des gebildeten Komplexes mit dem komplementären Oligonucleotid 4 gestützt. Retentionszeit, RP HPLC 10,5 Minuten; FAB+ Massenspektrum, M+H+ 620, M+Na+ 642; 31P-NMR, δ in D2O, 18,7 ppm, frühere Referenzen beschrieben Eigenschaften für die Alkylthiophsphatgruppe9.
- Die Rm-Messwerte beziehen sich auf Bromphenolblau in einem 20% Polyacrylamid/ 5% bis-Acrylamid-Gel. Der Tm-Messwert, 56°C in 0,1 M NaCl-Lösung, weist daraufhin, dass der Komplex aus dem korrespondierenden Gesamt-Phosphodiester-20-mer und der Verbindung 4 (60°C)10 gebildet wurde und sich deutlich von den Messwerten für Komplexe, welche aus den Verbindungen 1 oder 2 mit der Verbindung 4 (37°C und 31°C) gebildet wurden, unterscheidet. Zusätzlich wurde es gefunden, dass die Zwischennucleotid –NH(CO)(CH2SP(O)(o–)-Bindung selektiv durch Oxidation mit KI3 (
5 ) gespalten wurde9. Mehr spezifisch wurde der Duplex, enthaltend die Verbindungen 3 und 4 (0,3 A260 Einheiten jeweils) in 100 μL Wasser mit 100 μL einer 0,2 M wässrigen KI3-Lösung für 15 Minuten bei 50°C behandelt. Danach wurden 10 μL einer 1M wässrigen DTT-Lösung zu der Lösung hinzugeführt. Nach 5 Minuten wurde das Gemisch auf einer NAP-5-Säu1e entsalzt und durch IE HPLC analysiert. - Die obige Experimentdurchführung liefert den Hinweis, dass die vorliegende. Erfindung eine neue Chemie darstellt, welche ein zweckmäßiges Mittel zur selektiven und irreversiblen Kopplung von Oligonucleotiden in wässriger Lösung in dem Bereich von 4 μM Oligomer-Konzentration oder größer bereitstellt. Die Produkte ließen sich in neutraler Lösung und für einige Stunden auch bei pH 12 bei Raumtemperatur als stabil nachweisen. Bei Konzentrationen unterhalb von 1 μM wird die Reaktionsrate in der flüssigen Phase sehr langsam. Jedenfalls können die Reaktionen bis annähernd zur Vollständigkeit in dem gefrorenen Zustand durchgeführt werden. Die Reaktionsrate der Kopplung wird merklich durch die Anwesenheit eines komplementären Oligonucleotidtemplats beschleunigt. Diese Eigenschaften liefern basierend auf bekannter Chemie das Potential zum Design von chemischen Amplifikationssystemen und der in situ Ligation in Antisense-Anwendung als auch in der Bildung komplexer Strukturen aus Oligonucleotidblöcken.
- FUNDSTELLEN
-
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- 2. Proceedings, International Conference on Nucleic Acid Medical Applications, Cancun, Mexico, Jan 26–30, 1993; P.O.P. Ts'o und P.S. Miller, Organizers, John Hopkins University, Baltimore, M.D.
- 3. Proceedings, International Conference on Nucleic Acid Medical Applications, Cancun, Mexico, January, 1993, pg. 60.
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- Sequenzauflistung
- (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN
-
- (i) Anmelder: Letsinger, Robert L. Gryaznov. Sergei M.
- (ii) Titel der Erfindung: Verfahren zu Darstellung von Oligonucleotiden
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 4
- (iv) Korrespondenzadresse: (A) Adresse: Reising, Ethingthon, Barnard, Perry & Milton (B) Straße: P.O.Box 4390 (C) Stadt: Troy (D) Staat: Michigan (E) Land: USA (F) PLZ: 48099
- (v) Computerlesbare Form: (A) Art des Mediums: Diskette (B) Computer: IBM PC kompatibel (C) System: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
- (vi) Aktuelle Anmeldungsdaten: (A) Anmeldungsnummer: US 08/046,032 (B) Einreichungsdatum: 12. April 1993 (C) Klassifikation:
- (vii) Anwaltsinformationen: (A) Name: Kohn, Kenneth I. (B) Kennzeichnungsnummer: 30.955 (C) Kennzeichnung: NU9310
- (viii) Telekommunikationsinformationen: (A) Telefon: (313) 689–3554 (B) Telefax: (313) 689–4071
- (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:1:
-
- (i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 11 Basenpaare (B) Typus: Nucleinsäure (C) Strängigkeit: beide (D) Topologie: beide
- (ii) Molekültypus: DNA (genomisch)
- (ix) Besonderheit: (A) Name/Schlüssel: misc difference (B) Lage: ersetze (1..11, '''') (C) Andere Info: /note = "N ist eine Bromoacetylaminogruppe
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:1: ACACCCAATT N
- (3) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:2:
-
- (i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 11 Basenpaare (B) Typus: Nucleinsäure (C) Strängigkeit: beide (D) Topologie: beide
- (ii) Molekültypus: DNA (genomisch)
- (ix) Besonderheit: (A) Name/Schlüssel: misc_difference (B) Lage: ersetze (1..2, '''') (C) Andere Info: /note = "N ist eine Thiophosphorylgruppe
- (xii) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:2: NCTGAAAATG G
- (4) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:3:
-
- (i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 22 Basenpaare (B) Typus: Nucleinsäure (C) Strängigkeit: beide (D) Topologie: beide
- (ii) Molekültypus: DNA (genomisch)
- (x) Besonderheit: (A) Name/Schlüssel:misc difference (B) Lage: ersetze (11..12, '''') (C) Andere Info: /note = "NN ist eine Thio-Phosphorylacetylaminogruppe
- (xiii) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:3: ACACCCAATT NNCTGAAAAT GG
- (5) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO:4:
-
- (i) Sequenzeigenschaften: (A) Länge: 20 Basenpaare (B) Typus: Nucleinsäure (C) Strängigkeit: beide (D) Topologie: beide
- (ii) Molekültypus: DNA (genomisch)
- (xi) Besonderheit: (A) Name/Schlüssel: misc_feature (B) Lage: 1..20 (C) Andere Info: /note = komplementär zu Seq. 3 ohne NN"
- (xiv) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:4: CCATTTTCAG AATTGGGTGT
Claims (13)
- Verwendung von zumindest einem ersten und einem zweiten Oligonucleotid zur Herstellung eines Medikamentes oder einer Oligonucleotidsonde zur Therapie oder Diagnose, dadurch gekennzeichnet, dass – das erste Oligonucleotid eine Vielzahl von Nucleotidbaseneinheiten umfasst und eine erste reaktive Gruppe enthaltend ein 3'- oder 5'-terminales Bromoacetylamin aufweist, und dass die Nucleotidbaseneinheiten des ersten Oligonucleotids im Wesentlichen zu einer ersten Sequenz von Baseneinheiten eines Zieloligonucleotids oder Polyoligonucleotids komplementär sind; – das zweite Oligonucleotid eine Vielzahl von Nucleotidbaseneinheiten umfasst und eine zweite reaktive Gruppe enthaltend ein 5'- oder 3'-terminales Phosphorothioat aufweist, und dass die Nucleotidbaseneinheiten des zweiten Oligonucleotids im Wesentlichen zu einer zweiten Sequenz von Baseneinheiten des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids komplementär sind, wobei die erste und die zweite Basensequenz in benachbarten Positionen des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids sind; – so das erste und das zweite Oligonucleotid reversibel an die benachbarten Positionen des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids binden kann, wobei die erste und die zweite reaktive Gruppe in Nähe zueinander gebracht werden, sodass eine kovalente Thiophosphorylacetylaminobindung zwischen dem 3'- oder 5' Bromoacetylamin des ersten Oligonucleotids und dem 5'- oder 3' Phosphorothioat des zweiten Oligonucleotids in Abwesenheit von einem zugesetzten Reagenz spontan ausgebildet wird.
- Verwendung nach Anspruch 1, wobei jedes der beiden des ersten und des zweiten Oligonucleotids im Wesentlichen aus 8 bis 20 Nucleotidbasen besteht.
- Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Bromoacetylamin an dem 3'-Terminus des ersten Oligonucleotids und das Phosphorothioat an dem 5'-Terminus des zweiten Oligonucleotids vorgesehen ist.
- Verwendung nach Anspruch 3, wobei das erste Oligonucleotid ACACCCAATT – NHC(= O)CH2Br ist und das zweite Oligonucleotid SPO3 – CTGAAAATGG ist.
- Produkt umfassend zumindest ein erstes und ein zweites Oligonucleotid zur Verwendung als ein Medikament oder als eine Oligonucleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, dass – das erste Oligonucleotid eine Vielzahl von Nucleotidbaseneinheiten umfasst und eine erste reaktive Gruppe enthaltend ein 3'- oder 5'-terminales Bromoacetylamin aufweist, und dass die Nucleotidbaseneinheiten des ersten Oligonucleotids im Wesentlichen zu einer ersten Sequenz von Baseneinheiten eines Zieloligonucleotids oder Polynucleotids komplementär sind; – das zweite Oligonucleotid eine Vielzahl von Nucleotidbaseneinheiten umfasst und eine zweite reaktive Gruppe enthaltend ein 5'- oder 3'-terminales Phosphorothioat aufweist, und dass die Nucleotidbaseneinheiten des zweiten Oligonucleotids im Wesentlichen zu einer zweiten Sequenz von Baseneinheiten des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids komplementär sind, wobei die erste und die zweite Basensequenz in benachbarten Positionen des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids sind; – so das erste und das zweite Oligonucleotid reversibel an die benachbarten Positionen des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids binden kann, wobei die erste und die zweite reaktive Gruppe in Nähe zueinander gebracht werden, sodass eine kovalente Thiophosphorylacetylaminobindung zwischen dem 3'- oder 5'-Bromoacetylamin des ersten Oligonucleotids und dem 5'- oder 3'-Phosphorothioat des zweiten Oligonucleotids in Abwesenheit von einem zugesetzten Reagenz spontan ausgebildet wird.
- Produkt nach Anspruch 5, wobei jedes der beiden des ersten und des zweiten Oligonucleotids im Wesentlichen aus 8 bis 20 Nucleotidbasen besteht.
- Produkt nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Bromoacetylamin an dem 3'-Terminus des ersten Oligonucleotids und das Phosphorothioat an dem 5'-Terminus des zweiten Oligonucleotids vorgesehen ist.
- Produkt nach Anspruch 7, wobei das erste Oligonucleotid ACACCCAATT – NHC(= O)CH2Br und das zweite Oligonucleotid SPO3 – CTGAAAATGG ist.
- Ein Verfahren zur in vitro Darstellung einer diagnostischen Oligonucleotidsonde, wobei das Verfahren umfasst: a) ein reversibles Binden zumindest eines ersten und zweiten Oligonucleotids an benachbarte Positionen eines Zieloligonucleotids oder Polynucleotids; wobei – das erste Oligonucleotid eine Vielzahl von Nucleotidbaseneinheiten umfasst und eine erste reaktive Gruppe enthaltend ein 3'- oder 5'-terminales Bromoacetylamin aufweist, und dass die Nucleotidbaseneinheiten des ersten Oligonucleotids im Wesentlichen zu einer ersten Sequenz von Baseneinheiten des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids komplementär sind; – das zweite Oligonucleotid eine Vielzahl von Nucleotidbaseneinheiten umfasst und eine zweite reaktive Gruppe enthaltend ein 5'- oder 3'-terminales Phosphorothioat aufweist, und dass die Nucleotidbaseneinheiten des zweiten Oligonucleotids im Wesentlichen zu einer zweiten Sequenz von Baseneinheiten des Zieloligonucleotids oder Polynucleotids komplementär sind, wobei die erste und die zweite Basensequenz in benachbarte Positionen des Zieloligonucleotids oder Polyoligonucleotids sind; b) kovalente Bindungsknüpfung des ersten und des zweiten Oligonucleotids miteinander durch die erste und die zweite reaktive Gruppe, welche durch das Binden der Oligonucleotide an das Zieloligonucletid oder Polynucleotid in Nähe zueinander gebracht wurden, um eine kovalente Thiophosphorylacetylaminobindung in Abwesenheit von einem hinzugefügten Reagenz spontan auszubilden.
- Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Schritte a) und b) in wässriger Lösung erfolgen.
- Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei jedes der beiden des ersten und des zweiten Oligonucleotids im Wesentlichen aus 8 bis 20 Nucleotidbasen besteht.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Bromoacetylamin an dem 3'-Terminus des ersten Oligonucleotids und das Phosphorothioat an dem 5'-Terminus des zweiten Oligonucleotids vorgesehen ist.
- Verfahren nach Anspruch 12 wobei das erste Oligonucleotid ACRCCCAATT – NHC(= O)CH2Br und das zweite Oligonucleotid SPO3 – CTGAAARTGG ist.
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