DE19610255A1 - Nukleinsäuresequenzen und Verfahren zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren zum Nach­ weis von Translokationsbruchpunkten bzw. -stellen auf Chromosomen und deren Herstellungsverfahren sowie ein Verfahren zum Nachweis von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen bzw. von Translokationen zwischen Chromosomen.

Austausche von Material zwischen verschiedenen Chromosomen (Translokationen) sind für verschiedene Gebiete der medizi­ nischen Forschung und Diagnostik von großer Bedeutung. Bei­ spielsweise können strahlungsinduzierte Translokationen zur biologischen Dosimetrie auch lange zurückliegender oder ku­ mulativer Strahlungsexpositionen benutzt werden. In der kli­ nischen Diagnostik ist die Feststellung von Translokationen und der Translokationsbruchstellen bzw. von Translokations­ ereignissen auf den entsprechenden Chromosomen wesentlich, da ein enger Zusammenhang zwischen dem Auftreten von be­ stimmten Translokationen und Malignität besteht (z. B. bei Leukämien).

Zur Feststellung solcher Translokationsereignisse sind im Stand der Technik insbesondere drei Verfahren bekannt:

• (1) Die Analyse von Metaphasezellen der zu untersuchenden Personen mithilfe von klassischer Bänderungstechnik (F. Vogel, Human Genetics; Springer, Heidelberg (1992)).
• (2) Die Analyse von Zellen in Metaphase oder von Zellkernen der betroffenen Personen durch Fluoreszenz-in-situ-Hy­ bridisierung (FISH) mit einer FISH-Farbe, oder mit Mehr­ farben-FISH (T. Cremer et al., Human Genetics 80: 235 (1988); T. Cremer et al., Cytometry 11 : 110 (1990); D.C. Tkachuk et al., Science 250: 559 (1990); S.Popp & T. Cremer, J. of Radiation Research Japan (Suppl.) 33 : 61 (1992); C. Cremer et al., J. Radiation Research Japan (Suppl.) 33 : 189 (1992); J.N. Lucas et al., Cytogenetics & Cell Genetics 62 : 11 (1993)).
• (3) Die Analyse der DNA von Zellen betroffener Personen mit­ hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, "Polymerase Chain Reaction") unter Verwendung von Startern ("Primern") für bereits identifizierte Bruchpunktregio­ nen (A.J. Fishleder et al., Leukemia 3 : 746 (1989); C.R. Bartram et al., J. Exp. Med. 164 : 1389 (1986); S. Hi­ roswa et al., Am. J. Hematol. 28 : 133 (1988); M.S. Lee et al., Blood 73: 2165 (1989); E.S. Kawasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5698 (1988)).

Die vorstehend aufgeführten Verfahren sind unter geeigneten Bedingungen - d. h. (i) die Zellen der Spender können unter geeignet schonenden Bedingungen entnommen und für die Ana­ lyse kultiviert bzw. auf Objektträgern fixiert werden (vgl. Verfahren (1) und (2)), oder (ii) die DNA-Analyse kann auf einige wenige Bruchpunktregionen beschränkt werden, (vgl. Verfahren (2) und (3)) - anwendbar.

Diese Bedingungen sind jedoch vielfach nicht erfüllt. Bei­ spielsweise stehen in klinisch weniger erschlossenen Regio­ nen oftmals nur Blutproben zur Verfügung, die zwar noch eine DNA-Gewinnung erlauben, nicht aber eine zufriedenstellende Zellpräparation. Ferner wird das vorstehend aufgeführte Verfahren (3) unter Verwendung der PCR zur Analyse von iso­ lierter DNA außerordentlich aufwendig, wenn eine große Zahl möglicher Bruchpunktregionen von Translokationsereignissen in Frage kommt, wie z. B. bei strahlengeschädigten Zellen oder bei einem noch nicht molekularbiologisch näher einge­ grenzten Tumor.

Die im Stand der Technik bekannte CGH ("Comparative Genomic Hybridization")-Methode ermöglicht, ausgehend von reiner ge­ nomischer DNA eines Spenders, den Nachweis beliebiger Über- oder Unterrepäsentationen von DNA gegenüber dem normalen Zu­ stand als Kontrolle bei einer Mindestgröße der zu detektie­ renden Abschnitte von derzeit jeweils einigen Megabasenpaa­ ren (mbp) Länge in mindestens 30% der untersuchten Zellen. Jedoch können mit der CGH-Methode die klinisch und wissen­ schaftlich ebenfalls außerordentlich wichtigen Transloka­ tionen bzw. ihre Bruchpunkte nicht nachgewiesen werden (A.Kallionemi et al., Science 258 : 818 (1992); S.du Manoir et al., Hum. Genet. 90 : 590 (1993); S. du Manoir et al., Cy­ tometry 19 : 27 (1995)).

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues System zum Nachweis von insbesondere häufiger vor­ kommenden Translokationen zwischen Chromosomen bzw. von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen bei Vorliegen von isolierter, genomischer DNA eines Spenders bereitzustellen, das die vorstehend aufgeführten Nachteile der im Stand der Technik bekannten Nachweisverfahren beseitigt.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen 1 bis 16 ge­ kennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird eine für einen Translokationsbruchpunkt auf einem Chromosom spezifische Nukleinsäuresequenz bereitge­ stellt, umfassend

• (1) einen ersten Sequenzabschnitt, der
• (i) zu einer DNA-Sequenz eines ersten Chromosoms kom­ plementär ist,
• (ii) zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und
• (iii) mindestens eine erste Markierung aufweist, und
• (2) einen zweiten Sequenzabschnitt, der
• (i) zu einer DNA-Sequenz eines zweiten Chromosoms kom­ plementär ist,
• (ii) zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und
• (iii) mindestens eine zweite Markierung aufweist,

wobei die erste und die zweite Markierung unterschiedlich sind.

Der Begriff "Translokationsbruchpunkt" bedeutet molekularge­ netisch diejenige Stelle in der DNA-Sequenz eines Transloka­ tionschromosoms, an der Sequenzen eines ersten Chromosoms mit den Sequenzen eines zweiten Chromosoms kovalent verbun­ den sind; cytogenetisch bedeutet "Translokationsbruchpunkt" diejenige mikroskopisch identifizierbare Region, die diese Bindungsstelle enthält. Der Begriff "Translokationsereignis" bedeutet die durch den Materialaustausch zwischen einem er­ sten Chromosom und einem zweiten (ggf. auch weiteren Chromo­ somen) herbeigeführte neue Chromosomenkonfiguration.

Der Begriff "Nukleinsäuresequenz" bedeutet ein halbsynthe­ tisches, synthetisches oder modifiziertes Nuklein­ säuremolekül aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden, wie z. B. einen durch Oligonukleotidsynthese mit fluoreszenzmar­ kierten Nukleotiden gewonnenen Abschnitt aus einer bekannten Bruchpunktregion, oder ein durch Verwendung einer komplemen­ tären Nukleinsäure als Matrize unter Verwendung oder Mitver­ wendung modifizierter Nukleotide synthetisiertes Nukleinsäu­ remolekül.

Der Ausdruck "zur Hybridisierung an eine DNA-Sequenz eines Chromosoms befähigter Sequenzabschnitt" bedeutet einen spe­ zifischen, einzelsträngig vorliegenden, vorzugsweise 100 bis 1000 Basenpaaren langen Sequenzbereich der Nukleinsäurese­ quenz, der sich an einen komplementären Bereich eines Chro­ mosoms bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise bei 70°C oder weniger, und bei einer geeigneten Salzkonzentra­ tion, die vorzugsweise 50 bis 300 mmol/l einwertige Ionen und 0-10 mmol/l zweiwertige Ionen enthält, unter Ausbil­ dung von Wasserstoffbrücken anlagert.

Der Begriff "Markierung" bedeutet geeignete, direkt oder indirekt nachweisbare Atome oder Moleküle, die in die ent­ sprechenden Sequenzabschnitte der Nukleinsäuresequenz einge­ baut oder damit verbunden sind. Geeignete Markierungen sind beispielsweise solche, die an Nukleotide gekoppelte Fluoreszenzfarbstoffe und/oder Biotin und/oder Digoxigenin und/oder mit radioaktiven Isotopen markierte Nukleotide um­ fassen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erste und die zweite Markierung Fluoreszenzfarbstoffe mit einem zur Detektion kleiner Substanzmengen ausreichenden Unter­ schied im Fluoreszenzverhalten der Emissionsspektren, wie z. B. Cumarine und Rhodamine, und/oder der Fluoreszenzlebens­ dauern, wie z. B. Fluoresceinisothiocyanate und Europium-Chelat-markierte und/oder Porphyrin-markierte Avidine.

Der Ausdruck "Sequenzabschnitt mit einer Markierung" bedeu­ tet eine kovalent verknüpfte lineare Sequenz von Nukleotiden mit einer oder mehreren der vorstehend definierten Markie­ rungen innerhalb des Sequenzabschnitts. Bespielsweise kann ein 5′-endständig lokalisierter Sequenzabschnitt der Nukleinsäuresequenz nur eine 5′-endständige Markierung auf­ weisen oder alle Nukleotide des Sequenzabschnitts oder ein Teil von ihnen können markiert sein.

Die Begriffe "erster Sequenzabschnitt" und "zweiter Se­ quenzabschnitt" bedeuten, daß der erste Sequenzabschnitt bei geeigneten Stringenz-Bedingungen im wesentlichen nicht zur Hybridisierung an die für den zweiten Sequenzabschnitt kom­ plementäre Sequenz in einem zweiten Chromosom bzw. an die aus einem zweiten Chromosom stammende, für den zweiten Se­ quenzabschnitt komplementäre Sequenz in einem ersten Chromo­ som befähigt ist. Dies gilt auch mutatis mutandis für den zweiten Sequenzabschnitt, d. h. der zweite Sequenzabschnitt lagert sich unter geeigneten Stringenz-Bedingungen im we­ sentlichen nicht an die für den ersten Sequenzabschnitt kom­ plementäre Sequenz in einem ersten Chromosom bzw. an die aus einem ersten Chromosom stammende, für den ersten Sequenzab­ schnitt komplementäre Sequenz in einem zweiten Chromosom an. Die Sequenzabschnitte können innerhalb und/oder endständig in der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz lokalisiert sein. Die Sequenzabschnitte sind direkt, vorzugsweise über eine 3′,5′-Phosphodiesterbindung, oder über eine Bindung oder eine Nukleinsäuresequenz, welche die vorstehend defi­ nierte Hybridisierung des ersten und zweiten Se­ quenzabschnitts nicht nachteilig beeinflussen, verbunden.

Die Begriffe "erste Markierung" und "zweite Markierung" be­ deuten, daß sich die erste Markierung in mindestens einem, für einen Nachweis geeigneten Parameter, beispielsweise ei­ ner unterschiedlichen Wellenlänge der Fluoreszenz, oder der Fluoreszenzlebensdauer, oder dem emittierten Fluoreszenz­ spektrum, so stark unterscheidet, daß eine Detektion der er­ sten Markierung auch bei Gegenwart einer großen Menge ("Überschuß") der zweiten Markierung möglich ist. Wird bei­ spielsweise bei der Detektion eine herkömmliche Epifluo­ reszenzoptik mit einer Auflösung von 150 nm verwendet, so ergibt sich, daß eine Detektion der ersten Markierung auch bei Gegenwart einer bis zu vier Größenordnungen größeren Menge, gemessen z. B. in Anzahl markierter Nukleotide, mög­ lich sein muß.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend definierten Nu­ kleinsäuresequenz, umfassend die Schritte:

• (a) Spaltung von genomischer DNA, die mindestens einen Translokationsbruchpunkt zwischen zwei Chromosomen auf­ weist, in DNA-Fragmente,
• (b) Denaturierung der DNA-Fragmente in Einzelstränge,
• (c) Hybridisierung der Einzelstränge in Lösung mit einem er­ sten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung auf­ weisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spe­ zifisch sind, in einem Reaktionsansatz,
• (d) Synthese der Nukleinsäuresequenz unter Verwendung der an die DNA-Fragmente hybridisierten DNA-Sonden als Starter in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nukleinsäuren geeigneten Agens und einem zur Verknüpfung ("Ligierung") von Nukleinsäuren, vorzugsweise über 3′,5′-Phosphodiesterbindungen, ge­ eigneten Agens, und
• (e) Isolierung der synthetisierten Nukleinsäuresequenz aus dem Reaktionsansatz, insbesondere von dem zu seiner Syn­ these verwendeten DNA-Fragment, wobei der erste Se­ quenzabschnitt der Nukleinsäuresequenz eine DNA-Sonde vom ersten Satz und der zweite Sequenzabschnitt der Nu­ kleinsäuresequenz eine DNA-Sonde vom zweiten Satz um­ faßt.

Der Begriff "Spaltung von genomischer DNA" bedeutet chemi­ sche und/oder physikalische und/oder enzymatische Spaltung von genomischer DNA eines Spenders, beispielsweise von homo sapiens sapiens.

Die genomische DNA kann vor Schritt (a) durch Isolation aus einem geeigneten Spenderorganismus gewonnen werden. Die Iso­ lierung von genomischer DNA umfaßt die Abtrennung der DNA aus Spenderzellen von den Proteinen der Spenderzellen. Die genomische DNA kann nach den im Stand der Technik bekannten Methoden aus kernhaltige Zellen enthaltenen Bestandteilen, wie Blut-oder Gewebeproben des Spenders, isoliert werden (z. B. A. Kallionemi et al., Science 258 : 818 (1992). Es sind auch im Handel erhältliche Verfahrenweisen etabliert, wie z. B. Quiagen-DNA-Isolationskit von DIAGEN. Die genomische DNA des Spenders kann nach der Isolierung gegebenenfalls in geeigneter Weise amplifiziert werden, beispielsweise mit­ hilfe von DOP ("Degenerated Oligo-Primer-PCR")-PCR (H. Tele­ nius et al., Genes, Chromosomes & Cancer 4 : 257 (1992).

Als Beispiele zur Spaltung von genomischer DNA können alka­ lische Verbindungen, die Anwendung von Scherkräften oder Ul­ traschall, Endonukleasen oder andere Nukleinsäure-spaltende Agentien genannt werden. Bei Vorliegen nur geringer vom Spender direkt isolierter genomischer DNA kann die gesamte DNA zunächst auch durch PCR mit degenerierten Primern nach bekannten Verfahren (H. Telenius et al., Genes, Chromosomes & Cancer 4 : 257 (1992)) amplifiziert werden.

Der Begriff "Denaturierung" bedeutet die Überführung von doppelsträngig vorliegender DNA in Einzelstränge, beispiels­ weise durch thermische Behandlung unter geeigneten Pufferbe­ dingungen (J. Marmur & P. Doty, J. Mol. Biol. (1962) 5 : 109) und/oder durch denaturierende chemische Agentien.

Der Begriff "Hybridisierung" bzw. "Anlagerung" bedeutet die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Bereichen von verschiedenen Nukleinsäuremolekülen, insbeson­ dere zwischen den erfindungsgemäß verwendeten DNA-Sonden und den DNA-Fragmenten bei einer geeigneten Temperatur, vorzugs­ weise bei 70°C oder weniger, und bei einer geeigneten Salzkonzentration, die vorzugsweise 50 bis 300 mmol/l ein­ wertige Ionen und 0-10 mmol/l zweiwertige Ionen enthält. Die Bedingungen sind so zu wählen, daß die Gesamtzahl der zwischen komplementären Basen gebildeten Wasserstoffbrücken ausreichend ist, um bei den gewählten Stringenzbedingungen eine stabile Bindung zu ermöglichen.

Der Begriff "Satz von DNA-Sonden" bedeutet DNA-Moleküle, die von einem spezifischen, zu untersuchenden Chromosom stammen, beispielsweise von einer im Handel erhältlichen chromosomen­ spezifischen DNA-Bibliothek von homo sapiens sapiens, wobei dieses Chromosom als "normales Chromosom" keine Transloka­ tionen aufweist. Die DNA-Sonden sind gemäß der vorstehenden Definition zur Hybridisierung bzw. Anlagerung befähigt und liegen im Reaktionsansatz vor der Hybridisierung einzel­ strängig vor. Ferner können die DNA-Sonden flankierende Se­ quenzen aufweisen, die im wesentlichen keinen Beitrag zur Anlagerung bzw. Hybridisierung leisten.

Ferner können chromosomenspezifische DNA-Bibliotheken auch durch laseraktivierte flußzytometrische Sortierung oder Mi­ krodissektionsverfahren von spezifischen Chromosomen und nachfolgender Amplifikation der chromosomalen DNA gewonnen werden. Statt chromosomenspezifischen DNA-Bibliotheken von homo sapiens sapiens können auch Bibliotheken anderer Spe­ zies eingesetzt werden. Beispielsweise können für die Her­ stellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz für Un­ tersuchungen mit menschlicher genomischer Spender-DNA auch Chromosomenbibliotheken nahe verwandter Spezies verwendet werden.

Die Begriffe "erster Satz von DNA-Sonden" und "zweiter Satz von DNA-Sonden" bedeuten, daß die beiden Sätze jeweils von einem unterschiedlichen Chromosom der Gattung des Spenders stammen, z. B. homo sapiens sapiens. Beispielsweise kann der erste Satz von DNA-Sonden von einem menschlichen Chromosom 9 und der zweite Satz von DNA-Sonden von einem menschlichen Chromosom 22 stammen, oder der erste Satz von DNA-Sonden stammt von einem menschlichen Chromosom 1 und der zweite Satz von DNA-Sonden stammt von einem menschlichen Chromosom 2. Die Sätze von DNA-Sonden können nach bekannten Verfahren gewonnen werden (K.E.Davies et al., Nature 293 : 374 (1981); C.R. Müller et al., Hum. Genet. 64 : 110 (1983); C. Cremer et al., Cytometry 5 : 572 (1984); J.C. Fuscoe et al., Cytoge­ net. Cell Genet. 43 : 79 (1986); M.A. van Dilla et al., Bio­ technology 4: 537 (1986), P. Lichter et al., Genet. Anal. Technol. Appl. 8 : 24 (1991); B.Trask, Trends Genet. 7 : 149 (1991)), oder sind im Handel erhältlich (z. B. von Oncor oder Vysis). Erfindungsgemäß können als Sätze von DNA-Sonden auch DNA von Chromosomen anderer Spezies verwendet werden. Beispielsweise kann es für tierexperimentelle strahlenbiolo­ gische oder onkologische Studien wünschenswert sein, chromo­ somenspezifische DNA-Bibliotheken der untersuchten Tierart zu verwenden. Auch für die Herstellung einer erfindungsgemä­ ßen Nukleinsäuresequenz für die Untersuchung menschlicher Spender DNA kann es vorteilhaft sein, als Sätze von DNA-Son­ den DNA von Chromosomen anderer, insbesondere nahe verwand­ ter Spezies, zu verwenden. Im letzteren Falle besteht der Verfahrensvorteil in einer vereinfachten Eliminierung ubi­ quitärer repetitiver Sequenzen.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können statt zwei Sätzen von DNA-Sonden mit einer ersten und einer zweiten Markierung weitere Sätze von DNA-Sonden mit einer dritten, vierten Markierung usw., die von einem dritten, vierten usw. Chromosom stammen, verwendet werden.

Der Begriff "Reaktionsansatz" bedeutet ein Reaktionsgemisch, das neben den Nukleotiden und ATP mindestens ein zur Syn­ these der Nukleinsäuresequenz geeignetes Agens, mindestens ein zur Verknüpfung von Nukleinsäuren geeignetes Agens, min­ destens eine oder mehrere DNA-Sonden von einem ersten Satz und eine oder mehrere DNA-Sonden von einem zweiten oder wei­ teren Satz und ein oder mehrere DNA-Fragmente als Matrizen enthält, wobei weitere, nicht an dem erfindungsgemäßen Ver­ fahren beteiligte Nukleinsäuren vorhanden sein können. Die Konzentrationen der DNA-Sonden und/oder der DNA-Fragmente im Reaktionsansatz werden nach bekannten Verfahren eingestellt (P. Lichter et al., Hum. Genet. 80 : 224 (1988); B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, Garland Publ., New York & London (1994)).

Der Begriff "Synthese der Nukleinsäuresequenz" umfaßt (i) die Herstellung eines "Verlängerungsprodukts", das an die 5′-endständige, an die komplementäre Sequenz eines DNA-Frag­ ments angelagerte DNA-Sonde vom ersten oder zweiten Satz als Starter über beispielsweise eine Phosphodiester-, Thioester- oder Amidbindung kovalent gebunden ist, und (ii) das Ver­ knüpfen des Verlängerungsprodukts mit einer an die komple­ mentäre Sequenz des DNA-Fragments angelagerten DNA-Sonde des entsprechenden anderen Satzes, wobei die Primärsequenz des resultierenden Reaktionsprodukts komplementär zu der ent­ sprechenden Sequenz des DNA-Fragments als Matrizenmolekül ist. Als Nukleotide bei dieser Reaktion können nicht-mar­ kierte und/oder markierte Nukleotide verwendet werden. Das Reaktionsprodukt dieser "Synthese" ist somit die erfindungs­ gemäße Nukleinsäuresequenz, welche mindestens eine DNA-Sonde vom ersten Satz, eine DNA-Sonde vom zweiten Satz und ein zwischen diesen DNA-Sonden angeordnetes, "synthetisiertes" Verlängerungsprodukt enthält. Vor der Isolierung bzw. Gewin­ nung aus dem Reaktionsgemisch bildet die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz mit der entsprechenden komplementären Sequenz des als Matrize verwendeten DNA-Fragments ein doppelsträngiges Molekül.

Der Begriff "ein zur Synthese der Nukleinsäuresequenz ge­ eignetes Agens" bedeutet ein natives Enzym oder ein synthe­ tisch hergestelltes Agens, welches bei der Synthese des Ver­ längerungsproduktes als Katalysator wirkt, in Verbindung mit geeigneten Pufferbedingungen und anderen für die Reaktion erforderlichen, bekannten Verbindungen. Beispiele für native Enzyme sind die Taq-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, die E. coli DNA-Polymerase I und die Reverse Transkriptase. Beispiele für "geeignete Pufferbedingungen" sind die im Stand der Technik bekannten Pufferbedingungen der PCR. Beispiele für "andere Verbindungen" sind Salze wie MgCl₂.

Der Begriff "ein zur Verknüpfung von Nukleinsäuren, vorzugs­ weise über 3′,5′-Phosphodiesterbindungen, geeignetes Agens" bedeutet ein natives Enzym oder ein synthetisch hergestell­ tes Agens, welches bei der Verknüpfung von zwei Molekülen als Katalysator wirkt. Beispiele für native Enzyme sind DNA-Ligasen wie T4-DNA Ligase oder E. coli Ligase.

Der Begriff "Isolierung der Nukleinsäuresequenz" bedeutet ein Verfahren, nach dessen Durchführung die Nukleinsäurese­ quenz für eine in situ Hybridisierungsreaktion an Chromoso­ men oder chromosomaler DNA (im folgenden auch "Targets" ge­ nannt) eingesetzt werden kann. Nachfolgend werden als Bei­ spiele zwei Isolierungsverfahren näher erläutert.

Isolierungsverfahren I

Die Nukleinsäuresequenz und die übrigen in dem Reaktionsge­ misch enthaltenen, doppelsträngigen Sequenzen werden durch thermische Behandlung unter geeigneten Pufferbedingungen und/oder der Zugabe von chemischen denaturierenden Agentien von ihrer Matrize bzw. von ihren komplementären Sequenzen gelöst und mit den ebenfalls denaturierten Targets bzw. Zielsequenzen zum Zwecke der in situ Hybridisierung in Ver­ bindung gebracht, ggf. unter Zugabe nicht-markierter repeti­ tiver DNA (z. B. menschliche Cot I DNA) zum Zwecke der Sup­ pression nach bekannten Verfahren (P. Lichter et al., Hum. Genet. (1988) 80 : 224; T. Cremer et al., Hum. Genet. (1988) 80 : 235)). Die Zugabe von supprimierender DNA kann unter­ bleiben, wenn die zur Herstellung der Nukleinsäuresequenz verwendeten DNA-Sequenzen eines ersten und zweiten Chromo­ soms keine repetitiven Sequenzen enthalten, die unter den gewählten in situ Hybridisierungsbedingungen an komplemen­ täre Sequenzen der Targets binden würden. Verfahren zur Iso­ lierung und in situ Hybridisierung solcher DNA Sequenzen sind bekannt (M.Schardin et al., Hum. Genet. (1985) 71 : 281; D. Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 2934; J. Wienberg et al., III. Plenary workshop of the Euro­ pean Concerted Action "Automation in Molecular Cytogenetic Analyses", Ghent, 16-18 November, 1995)).

Isolierungsverfahren II

Es wird eine Abtrennung der Nukleinsäuresequenz von den üb­ rigen Sequenzen des Reaktionsgemisches vorgenommen, um die in situ Hybridisierungseffizienz zu erhöhen. Dafür können verschiedene Methoden angewandt werden:

• (i) Die Markierung wird so vorgenommen, daß nach Denaturie­ rung der doppelsträngigen DNA Sequenzen des Reaktions­ gemisches eine Trennung der doppelt markierten Nuklein­ säuresequenz von den nicht-markierten Sequenzen und von den einfach markierten Sequenzen durch Dichtegradien­ tenzentrifugation durchgeführt wird.
• (ii) Die Markierung wird so vorgenommen, daß die Nukleinsäu­ resequenz durch säulenchromatographische Verfahren ab­ getrennt wird.

In einer Ausführungsform von Punkt (ii) werden zunächst diejenigen DNA Sequenzen säulenchromatographisch ge­ bunden, die eine erste Markierung tragen. Damit erfolgt die Isolierung derjenigen DNA Sequenzen, die entweder keine Markierung oder eine zweite Markierung tragen. Die gebundenen DNA Sequenzen tragen entweder nur eine erste Markierung oder eine erste und eine zweite Mar­ kierung. Diese DNA Sequenzen werden anschließend elu­ iert und dann einer zweiten säulenchromatographischen Trennung unterworfen, bei der die DNA-Sequenzen gebun­ den werden, bei denen eine Affinität zwischen Säule und zweiter Markierung besteht. Damit erfolgt die Isolie­ rung derjenigen DNA-Sequenzen, die nur eine erste Mar­ kierung tragen, von denjenigen, im zweiten Schritt ge­ bundenen DNA-Sequenzen, die eine erste und eine zweite Markierung haben. Mit der Eluierung der letzteren DNA-Sequenzen ist die Isolierung der erfindungsgemäßen Nu­ kleinsäuresequenz gemäß dieser Ausführungsform abge­ schlossen. Erfindungsgemäß kann die isolierte Nuklein­ säuresequenz gegebenenfalls vor der in situ Hybridisie­ rung noch mithilfe von PCR-Methoden (H. Telenius et al., Genes, Chromosomes & Cancer 4 : 257 (1992)) ampli­ fiziert werden.

In einer anderen Ausführungsform von Punkt (ii) werden die erste und zweite Markierung so gewählt, daß zu­ sätzlich zu den erfindungsgemäß gewählten optischen Ei­ genschaften Unterschiede in der elektrophoretischen Be­ weglichkeit auftreten. Die Trennung erfolgt dann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren der zweidimensio­ nalen Gelelektrophorese.

Erfindungsgemäß kann das Isolierungsverfahren II so modifi­ ziert werden, daß Isolierungen von Nukleinsäuresequenzen möglich sind, bei denen erste und zweite Markierungen bzw. dritte und vierte Markierungen usw. auftreten. Das Isolie­ rungsverfahren kann für diesen Fall zum Beispiel so modifi­ ziert werden, daß parallel oder seriell in einer ersten Säule alle Nukleinsäuren mit einer ersten Markierung gebun­ den werden, in einer zweiten Säule alle Nukleinsäuren mit einer zweiten Markierung gebunden werden, in einer dritten Säule alle Nukleinsäuren mit einer dritten Markierung gebun­ den werden, usw. In einem zweiten Verfahrensschritt werden Säulen verwendet, in denen die im ersten Schritt abgetrenn­ ten Nukleinsäuren mit einer ersten Markierung verwendet und von diesen alle Nukleinsäuren gebunden werden, die auch eine zweite Markierung oder auch eine dritte Markierung usw. enthalten. In einer weiteren Säule werden die Nukleinsäuren mit einer dritten, vierten usw. Markierung abgetrennt, die im ersten Verfahrensschritt aufgrund einer zweiten Markie­ rung abgetrennt wurden, usw. Insgesamt sind alle Verfahren erfindungsgemäß, die zu einer Trennung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit einer ersten und zweiten Markie­ rung, mit einer ersten und dritten Markierung usw., mit ei­ ner zweiten und dritten Markierung, mit einer zweiten und vierten Markierung usw., von DNA-Molekülen mit nur einer Art von Markierung führen.

Nachfolgend werden, soweit erforderlich, die einzelnen Ver­ fahrensschritte (a) bis (e) näher erläutert.

In Schritt (a) wird die, ggf. amplifizierte, genomische DNA mit beispielsweise geeigneten Restriktionsendonukleasen in genügend lange, z. B. etwa 1-2 kbp, doppelsträngige DNA-Fragmente in einer geeigneten Pufferlösung, z. B. 1 × SSC, PBS etc., nach bekannten Verfahren (A. Kallionemi et al., Science 258 : 818 (1992); S. du Manoir et al., Hum. Genet. 90 : 590 (1993)) in DNA-Fragmente gespalten.

In Schritt (b) wird die DNA-Fragmente enthaltende Lösung von Schritt (a), vorzugsweise ohne Zugabe denaturierender Agen­ tien, denaturiert, z. B. durch Erhitzen auf etwa 85-95°C, wobei nach der Denaturierung die DNA-Fragmente im wesentli­ chen einzelsträngig vorliegen.

In Schritt (c) wird die einzelsträngige DNA-Fragmente ent­ haltende Lösung von Schritt (b) einer Hybridisierung in Lö­ sung unterworfen. Die zugefügten Hybridisierungpartner sind beispielsweise etwa 100 bis 300 Basen lange, markierte DNA-Sonden von mindestens zwei unterschiedlichen Sätzen, z. B. aus chromosomenspezifischen DNA-Bibliotheken normaler Chromosomen. Die "Hybridisierung" bzw. "Anlagerung" erfolgt bei einer Temperatur, die jeweils von der Art der im Reaktionsansatz vorliegenden Nukleinsäuren abhängt. Bei­ spielsweise kann die Hybridisierung bei etwa 50 bis 70°C erfolgen. Bei Vorliegen von Translokationsbruchpunkten in den untersuchten Chromosomen des Spenders liegen in der "Hybridisierungslösung" u. a. Translokationsbruchpunkte ent­ haltende DNA-Fragmente vor, an welche sich eine oder mehrere DNA-Sonden aus einem ersten Satz von DNA-Sonden und eine oder mehrere DNA-Sonden aus einem zweiten Satz von DNA-Son­ den angelagert haben, wobei die angelagerten DNA-Sonden un­ terschiedlich markiert sind.

Die erfindungsgemäße Hybridisierung kann auch mit mehr als zwei Sätzen von DNA-Sonden durchgeführt werden. Beispiels­ weise kann ein mit einer ersten Markierung versehener Satz von DNA-Sonden aus einer chromosomenspezifischen DNA-Biblio­ thek eines ersten Chromosoms, ein mit einer zweiten, drit­ ten, vierten, usw. Markierung versehener Satz von DNA-Sonden aus einer chromosomenspezischen DNA-Bibliothek eines zwei­ ten, dritten, vierten, usw. Chromosoms gleichzeitig für die Hybridisierung verwendet werden. In diesem Falle lagern sich DNA-Sonden unterschiedlicher Markierung an Translokations­ bruchpunkte enthaltende DNA-Fragmente der betreffenden Chro­ mosomen an. Beispielsweise befinden sich in der Lösung bei Vorliegen eines Translokationsbruchpunktes zwischen einem dritten und vierten Chromosom DNA-Fragmente, bei denen eine Nukleotidsequenz eines dritten Chromosoms mit einer Nukleo­ tidsequenz eines vierten Chromosoms über kovalente Bindungen verknüpft ist. Im Verlauf der Hybridisierungsreaktion lagern sich an diese DNA-Fragmente DNA-Sonden eines dritten Chromo­ soms mit einer dritten Markierung sowie DNA-Sonden eines vierten Chromosoms mit einer vierten Markierung an.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Schritte (a), (b) und (c) im gleichen Reaktionsgefäß durch­ geführt werden.

In Schritt (d) wird die Synthese des Verlängerungsproduktes ("Elongation") bei einer Temperatur durchgeführt, die insbe­ sondere von dem zur Synthese geeigneten Agens abhängt, wobei Reaktionsprodukte gemäß der vorstehend aufgeführten Defini­ tion erhalten werden. Beispielsweise erfolgt die Synthese bei Verwendung der Taq-Polymerase bei einer Temperatur zwi­ schen etwa 70 bis etwa 80°C, vorzugsweise 72°C, für etwa 1 bis 15 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten.

Insbesondere werden mithilfe von beispielsweise spezifischen Polymerasen und der Zugabe von Nukleotiden und ATP die Lüc­ ken zwischen den angelagerten DNA-Sonden von Schritt (c) ge­ schlossen, wobei ein kovalent verbundener, aber zwei unter­ schiedliche Markierungen aufweisender, an das als Matrize dienende DNA-Fragment angelagerter DNA-Strang als Reaktions­ produkt entsteht.

Der Reaktionsansatz hat ein geeignetes Volumen, beispiels­ weise 20 bis 200 µl, und enthält (1) eine für die Synthese des Verlängerungsproduktes geeignete Konzentration an ge­ wünschten Nukleotiden, vorzugsweise 5 bis 100 nmol, mehr be­ vorzugt etwa 20 nmol, (2) für die Synthese des Verlänge­ rungsproduktes ausreichende Einheiten eines synthetisieren­ den Agens, beispielsweise 1 bis 15 Einheiten, vorzugsweise 5 Einheiten Taq-Polymerase, (3) für die Verknüpfung der Nu­ kleinsäuren ausreichende Einheiten eines geeigneten Agens (z. B. eine im Handel erhältliche Ligase) sowie DNA-Sonden und DNA-Fragmente in einer geeigneten Reaktionslösung unter Verwendung bekannter Verfahrensprotokolle (P. Leder et al., Science 196: 175 (1977); C.R. Müller et al., Hum. Genet. 64 : 110 (1983). Außer den genannten Verbindungen enthält die Reaktionslösung MgCl₂ (1 bis 200 mmol, bevorzugt 1 bis 50 mmol, mehr bevorzugt 1 bis 20 mmol und am meisten bevorzugt 3 mmol), NaCl (30 bis 300 mmol, bevorzugt 50 bis 250 mmol, mehr bevorzugt 100 bis 200 mmol und am meisten bevorzugt 160 mmol) und/oder KCl (10 bis 70 mmol, bevorzugt 30 bis 70 mmol, mehr bevorzugt 40 bis 60 mmol und am meisten bevorzugt 50 mmol) und/oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan ("Tris"; 5 bis 50 mmol, bevorzugt 5 bis 30 mmol, mehr bevorzugt 5 bis 20 mmol und am meisten bevorzugt 10 mmol) und/oder Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) (0,01 bis 0,1 Vol.-%, be­ vorzugt 0,01 bis 0,06 Vol.-%, mehr bevorzugt 0,01 bis 0,04 Vol.-% und am meisten bevorzugt 0,02 Vol.-%) und gegebenen­ falls Gelatine (0,1 bis 1 mmol). Der pH-Wert der Reaktionslösung liegt in einem geeigneten, insbesondere von dem synthetisierenden Agens abhängigen Bereich, vorzugsweise zwischen 6 und 8.

In Schritt (d) kann gegebenenfalls als positive Kontrolle der Synthese ein Teil der Nukleotide im Reaktionsansatz mar­ kiert sein. Geeignete Markierungen sind beispielsweise mit Biotin, Digoxigenin oder Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. Rhoda­ minfarbstoffe, Cumarinfarbstoffe) gekoppelte Nukleotide. Diese Markierungen der bei der Synthese verwendeten Nukleo­ tide können zu den Markierungen der Sequenzabschnitte unter­ schiedlich sein. Erfindungsgemäß können die Nukleotide im Reaktionsansatz auch in ihrer nativen Form verwendet werden.

In Schritt (e) werden die im Reaktionsgemisch enthaltenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen von den zu ihrer Synthese verwendeten Matrizenmolekülen und gegebenenfalls auch von den anderen im Reaktionsgemisch enthaltenen Sequen­ zen abgetrennt. Dies kann nach den oben beschriebenen Iso­ lierungsverfahren I oder II durchgeführt werden. Erfindungs­ gemäß kann auch eine Denaturierung, wie in Schritt (b) be­ schrieben, durchgeführt werden. Von Vorteil für eine erfin­ dungsgemäße in situ Hybridisierung ist insbesondere eine Isolierung der Nukleinsäuresequenzen aufgrund ihrer Doppel­ markierungen.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kann auch bei Kenntnis der Primärsequenz, beispielsweise durch Sequenzie­ rung einer durch das vorstehend aufgeführte Verfahren herge­ stellten Nukleinsäuresequenz mit im Stand der Technik be­ kannten Methoden, chemisch synthetisiert werden. Beispiels­ weise können jeweils 1 kbp lange, synthetisierte Marker-Se­ quenzen aus einem ersten Chromosom mit einem Abstand von je­ weils ca. 2 Mpb voneinander in durch molekularbiologische Verfahren in statistischer Weise mit jeweils 1 kbp langen, synthetisierten Markersequenzen aus einem zweiten Chromosom mit einem Abstand von ebenfalls ca. 2 Mbp kombiniert werden. Das so entstandene Gemisch enthält dann einen großen oder den größten Teil der cytogenetisch nachweisbaren möglichen Translokationsbruchpunkte zwischen dem ersten Chromosom und dem zweiten Chromosom. Solche erfindungsgemäßen, syntheti­ schen, Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise für in situ Hybridisierungen nach dem unten beschriebenen COMET ASSAY von Interesse.

In Verbindung mit in situ Hybridisierungsverfahren kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz zum Nachweis von Translationsbruchpunkten auf Chromosomen verwendet werden. Insbesondere kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz zum Nachweis strahlungsinduzierter ("biologische Dosime­ trie") oder von chemisch induzierten Translokationsbruch­ punkten sowie von Translokationsbruchpunkten in Zellen von Tumorgeweben oder in vereinzelten Tumorzellen verwendet wer­ den. Translokationsbruchpunkte sind u. a. ein Maß für Trans­ lokationen. Beispielsweise werden zwei Sätze von markierten DNA-Sonden eingesetzt, wobei der erste Satz mit einer ersten Markierung von einem normalen Chromosom 9 und der zweite Satz mit einer zweiten Markierung von einem Chromosom 22 stammt. Bei Verwendung von DNA-Fragmenten von einem Spender mit einer Translokation von Chromosom 9 auf 22 und von Chro­ mosom 22 auf Chromosom 9, wie es bei Patienten mit chroni­ scher myeloischer Leukämie typisch ist, werden bei Durchfüh­ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf einem normalen Chromosom 9 eine Nukleinsäuresequenz mit einer zweiten Mar­ kierung und auf einem normalen Chromosom 22 eine Nuklein­ säuresequenz mit einer ersten Markierung detektiert. Dies zeigt entsprechende Translokationsbruchpunkte in den Chromo­ somen 9 und 22 des Spenders an.

Die Häufigkeit von Translokationen nimmt mit der applizier­ ten Dosis ionisierender Strahlung zu (Awa et al., J. Radiat. Res. (Japan) 19 : 126 (1978)). Daraus ergibt sich die Mög­ lichkeit einer Dosisabschätzung, wenn die physikalische Do­ sis nicht bekannt ist. Translokationen werden auch nach Ein­ wirkung chemischer Verbindungen beobachtet (G.A. Folle & G. Obe, Intern. J. Radiat. Biol. 68 : 437 (1995)). Da bestimmte Translokationen bzw. Translokationsbruchstellen eng mit der Bildung bösartiger Tumoren korreliert sind (D.C. Tkachuk et al., Science 250 : 559 (1990)), hat die Analyse von Translo­ kationen bzw. Translokationsbruchstellen ferner eine hohe klinisch-diagnostische Bedeutung bei der Diagnostik, Pro­ gnose und Verlaufskontrolle von Krebserkrankungen.

In situ Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von DNA-Sonden eines ersten (oder mehrerer) Chromosomen mit einer ersten Markierung und einer zweiten (oder weiteren) DNA-Son­ den mit einer zweiten (oder weiteren) Markierung(en) eines zweiten (oder weiterer) Chromosomen zur direkten Identifi­ zierung von Translokationen auf Chromosomen von Zellen nach Einwirkung ionisierender Strahlung oder von Tumorzellen sind bekannt (T. Cremer et al., Hum. Genet. 80 : 235 (1988); T. Cremer et al., Cytometry 11: 110 (1990); S. Popp et al., Kerntechnik 55 : 204 (1990); Lucas et al., Intern. J. Radiat. Biol. 62: 53 (1992); C. Cremer et al., J. Radiat. Res. (Japan) 33 (Suppl.): 189 (1992); Lucas et al., Cytogenet. Cell Genet. 62 : 11 (1993)).

Im Gegensatz zu den genannten in situ Hybridisierungsverfah­ ren erlaubt die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz jedoch die Identifizierung von Translokationsbruchstellen, die in Zellen des Spenders vorliegen, beispielsweise nach Einwir­ kung von Strahlen und/oder chemischen Agentien und/oder auf­ grund des Vorhandenseins von Tumoren, durch in situ Hybri­ disierung an "normale" Chromosomen bzw. an "normale" DNA. Damit wird eine erfindungsgemäße Detektion von Translokatio­ nen auch in denjenigen Fällen durchführbar, bei welchen nur DNA-Material gewonnen werden kann, beispielsweise bei Popu­ lationen in Katastrophengebieten ohne die Möglichkeit einer ausreichenden Zellpräparation.

Eine andere Anwendung betrifft die Verwendung von isolierter DNA von Tumorgewebe oder Tumorzellen enthaltenden Geweben zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz. Mithilfe der in situ Hybridisierung der Nukleinsäuresequenz an normale Chromosomen bzw. an normale DNA können die Trans­ lokationsbruchpunkte der gewählten ersten und zweiten Chro­ mosomen (ggf. auch weiterer Chromosomen) identifiziert wer­ den, die in den Zellen des untersuchten Gewebes vorliegen. Dies ist von erheblicher klinischer Bedeutung für Diagnose, Prognose, und Therapie-Verlaufskontrolle bei Tumorerkrankun­ gen. Ferner ist dieses Verfahren von erheblicher Bedeutung für a posteriori Untersuchungen von Translokationen an Ar­ chivmaterial von Zellen nach Einwirkung ionisierender Strah­ len und/oder chemischer Agentien, oder an Archivmaterial von Tumorzellen enthaltenden Geweben. Dies ist zum Beispiel für die Tumorforschung von großem Interesse.

Erfindungsgemäß kann durch Vielfarbenmarkierung der gleich­ zeitige Nachweis von Translokationsbruchpunkten an mehr als zwei Chromosomen durchgeführt werden. Hierzu werden DNA-Son­ den eines ersten Chromosoms mit einer ersten Markierung, DNA-Sonden eines zweiten Chromosoms mit einer zweiten Mar­ kierung, DNA-Sonden eines dritten Chromosoms mit einer drit­ ten Markierung etc. verwendet. Die Markierungen haben so zu erfolgen, daß jede Markierung von allen anderen unterschie­ den werden kann. Die Synthese der erfindungsgemäßen Nuklein­ säuresequenzen erfolgt in der oben beschriebenen Weise, mit dem Unterschied, daß mehr als zwei Typen von markierten DNA-Sonden im Reaktionsgemisch vorhanden sind. Bei Verwendung von DNA-Sonden eines ersten bis vierten Chromosoms bei­ spielsweise und Translokationsbruchpunkten zwischen erstem und zweitem sowie zwischen drittem und viertem Chromosom er­ hält man Nukleinsäuresequenzen mit einer ersten und zweiten Markierung, sowie mit einer dritten und vierten Markierung. Das Isolierungungsverfahren I kann wie oben beschrieben durchgeführt werden. Das Isolierungsverfahren II ist ent­ sprechend zu modifizieren. Beispielsweise können bei dem er­ sten säulenchromatographischen Trennschritt die Sequenzen mit einer ersten und dritten Markierung gebunden werden, bei dem zweiten säulenchromatographischen Trennschritt die Se­ quenzen mit einer zweiten und vierten Markierung. Nach er­ folgtem Trennverfahren werden für eine nachfolgende in situ Hybridisierung erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen ver­ wendet, die entweder eine erste und zweite Markierung, oder eine dritte und vierte Markierung aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen und von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen. Die er­ findungsgemäße Anwendung eines solchen Kits führt zu einer in situ Hybridisierungsmixtur, die mindestens die vorste­ hend definierte Nukleinsäuresequenz in einem geeigneten Puf­ fer enthält.

Ferner ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfin­ dung ein Verfahren zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen und von Translokationsbruchpunkten auf Chro­ mosomen, umfassend die Schritte:

• (a) Isolierung von zu untersuchender genomischer DNA aus ge­ eignetem zellulären Material eines Spenders, vorzugs­ weise eines Säugers wie homo sapiens sapiens,
• (b) Spaltung der genomischen DNA in doppelsträngige DNA-Fragmente,
• (c) Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Fragmente in Ein­ zelstränge,
• (d) Hybridisierung der Einzelstränge mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung aufweisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz,
• (e) Synthese von Nukleinsäuren unter Verwendung der einzel­ strängig vorliegenden DNA-Fragmente als Matrize und der DNA-Sonden als Starter in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nukleinsäuren geeigne­ ten Agens und einem zur Verknüpfung von Nukleinsäuren, vorzugsweise über 3′,5′-Phosphodiesterbindungen, ge­ eigneten Agens, wobei doppelsträngig vorliegende Reakti­ onsprodukte hergestellt werden,
• (f) Denaturierung der doppelsträngig vorliegenden Reak­ tionsprodukte in Einzelstränge, wobei nach der Denatu­ rierung im Reaktionsgemisch einzelsträngige Nukleinsäu­ ren mit der ersten Markierung, einzelsträngige Nukleinsäuren mit der zweiten Markierung und, bei Vorhandensein einer Translokation zwischen der DNA des ersten Chromosoms und der DNA des zweiten Chromosoms in den zu analysierenden Zellen des Spenders, erfindungs­ gemäße Nukleinsäuresequenzen vorliegen,
• (g) in situ Hybridisierung der gegebenenfalls durch weitere Verfahrensschritte angereicherten, in der Hybridisie­ rungsmixtur vorliegenden einzelsträngigen Nukleinsäure­ sequenzen, mit einem ersten und zweiten Kontroll-Chromosom ohne Translokationen oder mit durch Ein­ zelzellgelelektrophorese aufgetrennter DNA und
• (h) Auswertung der in situ Hybridisierung über die un­ terschiedlichen Markierungen der in Schritt (f) abge­ trennten Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise mit Metho­ den der Fluoreszenzlebensdauermikroskopie oder Verfahren der konfokalen Laserscanningfluoreszenzmikroskopie oder Verfahren der Fluoreszenznahfeldmikroskopie.

Der Begriff "in situ Hybridisierung" bedeutet allgemein die durch Wasserstoffbrücken realisierte, sequenzspezifische An­ lagerung von DNA-Sonden und/oder RNA-Sonden und/oder DNA-Analog-Sonden, an DNA-Targets oder RNA-Targets, oder chromo­ somale Targets in situ. DNA-Sonden sind Desoxyribonuklein­ säuren geeigneter Länge mit einer für die in situ Hybridi­ sierung geeigneten Basenabfolge und mit einer für den ge­ wählten Nachweis adäquaten Markierung. RNA-Sonden sind Ribonukleinsäuren geeigneter Länge mit einer für die in situ Hybridisierung geeigneten Basenabfolge und mit einer für den gewählten Nachweis adäquaten Markierung. DNA-Analog-Sonden sind lineare Moleküle mit einer für die in situ Hybridisie­ rung geeigneten Abfolge von Basen (z. B. Adenin, Thy­ min/Uracil, Guanin, Cytosin), bei denen die kovalente Ver­ bindung zwischen den Basen strukturell homomorph ist mit ei­ nem Desoxyribose- oder einem Ribose-Rückgrat, und mit einer für den jeweiligen Nachweis adäquaten Markierung. Eine be­ vorzugte Ausführungsform von DNA-Analog-Sonden sind PNA-Mo­ leküle, bei denen die Basen mit einem Rückgrat aus N-(2-ami­ noethyl)glycin-Einheiten verbunden werden (M. Egholm et al., Nature 365 : 566 (1993)).

Der Begriff "in situ" bedeutet, daß die Hybridisierungsreak­ tion direkt am Ort des Targets in den einzelnen biologischen Untersuchungsobjekten (z. B. Zellen, Chromosomen) oder in ih­ rer unmittelbarer Nähe (im Bereich bis zu etwa 300 µm) durchgeführt wird. Beispielsweise ist eine in situ Hybridi­ sierung dann gegeben, wenn eine Sonde an ein Chromosom in der Metaphase oder an einen Chromosomenbereich in der In­ terphase hybridisiert wird (T. Cremer et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 58 : 777 (1993)). Von in situ Hybri­ disierung spricht man auch, wenn als Target nicht Chromoso­ men, sondern von Histonen und Nichthistonproteinen weitge­ hend freie Nukleinsäuren außerhalb der Chromosomen dienen, sofern noch ein unmittelbarer räumlicher Zusammenhang mit dem biologischen Untersuchungsobjekt (z. B. auch normale Zel­ len, normale DNA) besteht.

Der Begriff "Auswertung" bedeutet den optischen Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz auf normalen ersten und/oder zweiten Chromosomen (Kontroll-Chromosomen) A und/oder B oder auf durch Einzelzellgelelektrophorese aufge­ trennter normaler DNA von A und/oder B (auch als "COMET ASSAY" bezeichnet) nach in situ Hybridisierung. Liegt beim Spender z. B. eine reziproke Translokation (gegenseitiger Austausch von chromosomalem Material) zwischen A und B vor, so werden die Targets an den Orten, die den jeweiligen Translokationsbruchpunkten entsprechen, bei Analyse einer ausreichenden Anzahl von Chromosomen/DNA-Strängen in situ durch die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz markiert. Der Nachweis erfolgt vorzugsweise mit Verfahren der digitalen Mikroskopie. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Me­ thoden der Fluoreszenzlebensdauermikroskopie oder der konfo­ kalen Laserscanningfluoreszenzmikroskopie oder der optischen Fluoreszenznahfeldmikroskopie oder eine Kombination dieser Verfahren verwendet. Bei Verwendung weiterer Nukleinsäure­ sequenzen mit dritten, vierten Markierungen usw. bedeutet der Begriff "Auswertung" die Identifizierung und Lokalisie­ rung der weiteren Nukleinsäuresequenzen auf den Kontroll­ chromosomen bzw. der DNA-Stränge beim COMET ASSAY. Die Iden­ tifizierung geschieht aufgrund einer unterscheidenden Mar­ kierung, zum Beispiel einer unterscheidenden Fluoreszenzlinie und/oder eines unterscheidenden Fluoreszenzspektrums und/oder einer oder mehrerer unterscheidenden Fluoreszenzle­ bensdauern oder einer Kombination dieser Verfahren.

Nachfolgend werden die einzelnen Verfahrensschritte weiter erläutert.

In Schritt (a) wird genomische DNA aus geeignetem zellulären Material eines Spenders, vorzugsweise eines Säugers wie ein Mensch, oder z. B. auch Maus, Ratte, Chinesischer Hamster, nach im Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert; vgl. auch vorstehende Ausführungen zum Begriff "Isolierung von genomischer DNA". Beispielsweise wird bei einem Patienten mit Verdacht auf einen noch nicht näher eingegrenzten Blut­ tumor eine Blutprobe entnommen und die genomische DNA iso­ liert und gegebenenfalls amplifiziert.

Für die Schritte (b) bis (e) wird auf das vorstehend aufge­ führte Verfahren, insbesondere auf die Ausführungen zu den Schritten (a) bis (d) und dessen bevorzugte Ausführungsfor­ men zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese­ quenz verwiesen.

Zu Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ange­ merkt, daß die ersten und zweiten Chromosomen zwei beliebige normale Chromosomen des Genoms der Spezies des Spenders sind. Erfindungsgemäß können ferner auch DNA-Sonden dritter, vierter oder weiterer Chromosomen mit einer dritten, vierten oder weiteren Markierungen verwendet werden.

Zu Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ange­ merkt, daß die Denaturierung der doppelsträngig vorliegenden Reaktionsprodukte in Einzelstränge auf Grundlage der Ausfüh­ rungen zu Schritt (b) des vorstehend aufgeführten Verfahrens und dessen bevorzugte Ausführungsformen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz durchgeführt werden kann. Bei Verwendung dritter, vierter und weiterer unter­ scheidbare Markierungen enthaltender DNA-Sonden liegen zu­ sätzlich erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen mit dritten, vierten und weiteren Markierungen vor.

Insbesondere werden in Schritt (f) als Vorbereitung für die Durchführung von Schritt (g) beispielsweise im vorstehend beschriebenen Isolierungsverfahren I die im Reaktionsgemisch doppelsträngig vorliegenden Reaktionsprodukte in einzel­ strängige Nukleinsäuremoleküle nach im Stand der Technik be­ kannten Verfahren, wie Hitze-Denaturierung oder pH-abhängige Denaturierung mit HCl oder NaOH, überführt. Vorzugsweise wird eine Denaturierung ohne denaturierende Agentien durch­ geführt. Beispielsweise kann das Trennen der Reaktionspro­ dukte in Einzelstränge durch Erhitzen des Reaktionsgemisches ("Denaturierung") auf etwa 90 bis 100°C, vorzugsweise 95°C, für etwa 1 bis 15 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, er­ reicht werden.

In einer anderen Ausführungsform kann es nach Beendigung von beispielsweise Isolierungsverfahrens II für die Durchführung von Schritt (g) erforderlich sein, eine Denaturierung der angereicherten Nukleinsäuresequenzen wie oben beschrieben durchzuführen.

In Schritt (g) wird eine in situ Hybridisierung an normale erste und/oder zweite Chromosomen oder an normale DNA aus ersten und/oder zweiten Chromosomen durchgeführt. Bei Vor­ liegen einer Translokation zwischen DNA eines ersten und DNA eines zweiten Chromosoms in den zu analysierenden Zellen des Spenders enthält die in situ Hybridisierungsmixtur minde­ stens die erfindungsgemäße einzelsträngige Nukleinsäurese­ quenz in einem für die in situ Hybridisierung geeigneten Puffer.

Im COMET ASSAY erfolgt die in situ Hybridisierung an elek­ trophoretisch in situ getrennte DNA-Fragmente aus Spender-DNA bzw. an elektrophoretisch in situ getrennte Kontroll-DNA von Zellen ohne Translokationsbruchpunkte zwischen den be­ treffenden Chromosomen.

Bei zusätzlicher Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit dritten, vierten und weiteren Markierungen erfolgt die in situ Hybridisierung zusätzlich mit dritten, vierten und wei­ teren Kontrollchromosomen, bzw. mit in situ getrennten DNA-Fragmenten.

Die Kontrollchromosomen können sich in Metaphasepräparaten befinden, die von sich teilenden Zellen der Spenderspezies nach bekannten Verfahren gewonnen wurden. Ein anderes erfin­ dungsgemäßes Verfahren besteht in der Verwendung von Kon­ trollchromosomen, die nach flußzytometrischer Sortierung isolierter Chromosomen auf Objektträgern deponiert wurden. Die Deponierung erfolgt in der Weise, daß die Kontrollchro­ mosomen der verschiedenen Typen räumlich voneinander ge­ trennt werden. Erfindungsgemäß können die Chromosomen zur besseren Lokalisierung der Nukleinsäuresequenzen zusätzlich markiert werden, z. B. mit DNA-Farbstoffen ohne Sequenzspe­ zifität, oder durch in situ Hybridisierung mit Kontroll-DNA-Sonden, die eine bei der Synthese der Nukleinsäuresequenz nicht verwendete Markierung tragen. Beispielsweise ist es nützlich, die Zentromerregion sowie die Telomerregionen von langem und kurzem Chromosomenarm unterschiedlich zu markie­ ren.

Bei Verwendung des vorstehend beschriebenen Isolierungsver­ fahrens I für die Nukleinsäuresequenz enthält die in situ Hybridisierungsmixtur zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz noch andere Nukleinsäuren. Bei zwei Mar­ kierungen sind dies insbesondere die im Reaktionsgemisch Schritt (f) vorliegenden nicht-markierten DNA-Fragmente, markierte DNA-Sonden eines ersten und eines zweiten Chromo­ soms, sowie weitere einfach markierte Nukleinsäuren als Er­ gebnis des Reaktionsprozesses von DNA-Sonden und DNA-Frag­ menten. In diesem Falle ist die Konzentration der erfin­ dungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in der in situ Hybridisie­ rungsmixtur wesentlich geringer als die Gesamtkonzentration der übrigen hier genannten Nukleinsäuresequenzen.

Bei Verwendung des vorstehend beschriebenen Isolierungsver­ fahrens II für die Nukleinsäuresequenz liegt diese in einer im Vergleich zu Isolierungsverfahren I stark angereicherten Konzentration vor .

Für die allgemeinen Reaktionsbedingungen einer in situ Hy­ bridisierung sind zahlreiche Protokolle bekannt. Im Folgen­ den sollen zur Durchführung der in situ Hybridisierungsreak­ tion einige Beispiele aufgeführt werden:

In situ Hybridisierungsbeipiel 1

(vgl. D. Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 9138 (1988); P. Lichter u. T. Cremer, Human Cytogenetics, D.E. Rooney and B.H. Czepul­ kowski, eds., IRL Press Oxford, pp. 157ff (1992); C. Len­ gauer et al., Cancer Res. 52 : 2590 (1992); A. Hagemeÿer et al., Genes, Chromosomes & Cancer 8 : 237 (1993); P.M. Kroisel et al., Cytogenet. Cell Genet. 65 : 97 (1994); H. Yokota et al., J. Cell Biology 130 : 1239 (1995)):

Chromosomenpräparationen nach Methanol/Eisessigfixierung auf Glasobjektträgern oder Deckgläsern werden mit RNase A und Pepsin vorbehandelt, für 10 min in 3% Paraformaldehyd nach­ fixiert, und in 70% Ethanol aufbewahrt. Für die in situ Hy­ bridisierungsreaktion wird eine 10 µl bis 30 µl Hybridisie­ rungsmixtur von 25-50 ng, oder 100-150 ng der erfin­ dungsgsgemäßen, fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresequenz in Gegenwart von 3 bis 5 µg, oder 10 µg, oder 30 bis 100 µg un­ markierter, im Handel erhältlicher Cot1 DNA in 50% Formamid, 10% Dextransulfat in 1× SSC oder 2× SSC verwendet. 1×SSC ist eine wäßrige Lösung von 150 mM NaCl und 15 mM Natrium­ citrat. Die Hybridisierungsmixtur wird nach einer Behandlung von 2 bis 5 Minuten bei 70°C zur Denaturierung der DNA für 1-3 Stunden bei 37°C für das "Preannealing" belassen. Die Chromosomenpräparationen werden für 2 bis 5 Minuten bei 65-75°C in einer Denaturierungsmixtur von 50-70% deionisier­ tem Formamid in 1× bis 2× SSC, pH 7-7,5, behandelt und an­ schließend mit einer Alkoholreihe von 70%, 90% und 100% Ethanol bei 0 bis 10°C dehydratisiert und luftgetrocknet. Statt der Alkohol-Dehydratisierung können die Chromosomen­ präparationen auch in 70% Formamid/2× SSC aufbewahrt werden. Die in situ Hybridisierungsreaktion erfolgt anschließend durch Kombination der Chromosomenpräparation mit der Hybri­ disierungsmixtur nach Ende des "Preannealing" bei etwa 37 bis 42°C für etwa 12 bis 96 Stunden. Anschließend erfolgen Waschschritte, z. B. dreimal je 10 Minuten in 50% Formamid, 2× SSC und 0,5% Tween 20 bei 44°C, gefolgt von jeweils 5 Minuten-Waschungen in 4× SSC, 0,05% Tween 20 bei 44°C so­ wie bei Raumtemperatur.

In situ Hybridisierungsbeispiel 2

(vgl. DE-A-47 69 546; D. Celeda et al., Cytometry 17 : 13 (1994); F. Haar et al., Bio­ techniques 17 : 346 (1994); M. Durm et al. Exp. Techn. Phy­ sics, im Druck; M. Durm et al., Z. f. Naturforsch., im Druck; M. Durm et al., zur Veröff. eingereicht)):

Es werden herkömmliche Chromosomenpräparationen nach Metha­ nol/Eisessig Fixierung 1 : 3 verwendet. Die 10 bis 30 µl Hy­ bridisierungsmixtur enthält 10-50 ng der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in 10 mmol/l Tris-HCl, 3 mmol/l MgCl₂, 50 mmol/l KCl, 1 mg/l Gelatine, 2×SSC in deionisiertem Wasser (pH 7-8). Die Hybridisierungsmixtur wird bei 15 bis 25°C auf die auf einem Objektträger befindliche Chromoso­ menpräparation aufgebracht, mit einem Deckglas bedeckt und das Deckglas mit einem Gummimaterial abgedichtet. Das so er­ haltene, Chromosomenpräparation und Hybridisierungsmixtur enthaltende Präparat wird in einem Wasserbad für 5 Minuten auf etwa 85-95°C erhitzt; alternativ oder zusätzlich kann auch elektromagnetische Mikrowellenstrahlung eingesetzt wer­ den. Anschließend wird das Präparat in geeigneter Weise auf Temperaturen über 55°C aber unter 77°C für etwa 15 bis 150 Minuten abgekühlt. Nach der Hybridisierungsreaktion wird das Deckglas entfernt und die hybridisierte Chromosomenpräpara­ tion für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Waschpuffer von 1× SSC oder mit 1× PBS ("Phosphate buffered Saline", Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung): 0,2 g/l KCl, 0,2 g/l KH₂PO₄, 8 g/l NaCl, 2,16 g/l Na₂HPO₄×7H₂O; pH 7) und 0,2% Tween 20 behandelt, oder für 5 Minuten in einer Lösung von 0,9% NaCl und 0,2% Tween 20 gewaschen.

In situ Hybridisierungsbeispiel 3

(vgl. M. Durm et al., Exp. Technique of Physics, im Druck; M. Kraus et al., Exp. Tech­ nique of Physics, im Druck):

Dieses Niedrigtemperaturverfahren eignet sich nur für be­ stimmte erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere für solche, die mit doppelsträngiger DNA Triplestränge ausbilden können.

Nach Standardverfahren fixierte Chromosomenpräparationen werden nach Behandlung mit Methanol/Eisessig 1 : 3 mit 100% Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Die Hybridisierungs­ mixtur (siehe in situ Hybridisierungsbeispiel 2) wird für 5 Minuten bei 94°C, oder für 10 Minuten bei 84°C erhitzt. Die Chromosomenpräparation wird auf Temperaturen zwischen etwa 37 und 52°C erwärmt. Die Hybridisierungsmixtur (pH 7-7,5) wird nach Abkühlung auf 52°C hinzugegeben (siehe in situ Hybridisierungsbeispiel 2). Die Hybridisierungsreaktion des Präparates bestehend aus Chromosomenpräparation und Hybridisierungsmixtur wird ebenfalls bei Temperaturen zwi­ schen etwa 37 und 52°C durchgeführt. Die Waschprozedur er­ folgt gemäß in situ Hybridisierungsbeispiel 2.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die im Reaktionsgemisch vorliegenden einfach markierten Nukleinsäuren und, bei Vorliegen einer Transloka­ tion, doppelmarkierten Nukleinsäuresequenzen mit Fluores­ zenzfarbstoffen markiert und somit wird eine Fluoreszenz-in situ Hybridisierung ("FISH") durchgeführt.

Die oben genannten in situ Hybridisierungsbeispiele sollen bei der Vielzahl der bekannten Möglichkeiten lediglich Aus­ kunft über die Ausführbarkeit des Verfahrens geben und sind in keiner Weise als Beschränkung der vorliegenden Erfindung anzusehen. Die dabei verwendete FISH-Technik wird vorzugs­ weise ohne die Verwendung denaturierender Agentien durchge­ führt (siehe in situ Hybridisierungsbeispiele 2 und 3). Es können jedoch auch herkömmliche FISH-Verfahren angewendet werden (siehe in situ Hybridisierungsbeispiel 1).

Als Targets für derartige "Mehrfarben-in situ Hybridi­ sierungen" können normale Metaphasechromosomen aus normalen Zellen (Metaphasepräparate) oder normale Metaphasechromoso­ men aus normalen Zellen nach Anreicherung durch fluoreszen­ zaktivierte Sortierung verwendet werden. Die erfindungsge­ mäße in situ Hybridisierung kann formal durch die Stringenz der in situ Hybridisierungsreaktion beschrieben werden. Der Begriff "Stringenz" umfaßt hier das Ausmaß der komplementä­ ren Paarung der Nukleinsäuresequenz oder eines zusammen­ hängenden Teiles von ihr mit der DNA des chromosomalen Tar­ gets bzw. der Target-DNA beim COMET ASSAY. Eine Stringenz von beispielsweise 90% bedeutet, daß von 100 aufeinanderfol­ genden Basen der Nukleinsäuresequenz 90 in komplementärer Weise gepaart sind. Durch die Kinetik der in situ Hybridi­ sierungsreaktion kann die Stringenz in ihrem zeitlichen Ver­ lauf geändert werden. Die Parameter der Reaktion sind so zu wählen, daß nach der Hybridisierungszeit t die zeitabhängige Stringenz S(t) zu der erfindungsgemäßen in situ Hybridisie­ rungsmarkierung führt.

Die Stringenz S(t) der in situ Hybridisierung kann zum Bei­ spiel durch die Konzentration der zugesetzten Menge an dena­ turierenden Agentien variiert werden. Bei in situ Hybridi­ sierungsverfahren ohne denaturierende Agentien kann die Stringenz insbesondere durch Abänderung der Parameter (i) Hybridisierungstemperatur und (ii) Hybridisierungszeit vari­ iert werden. Weitere Parameter sind zum Beispiel die Ionen­ stärke der Hybridisierungsmixtur, der Kondensationsgrad der Targets, die Länge der DNA-Sonden, sowie deren Markierungs­ art. Bei in situ Hybridisierung an Kontrollchromosomen wird die Stringenz der in situ Hybridisierung so geregelt, daß eine komplementäre Paarung eines zusammenhängenden Teiles der Basensequenz der Nukleinsäuresequenz für die Bindung ausreichend ist. Beispielsweise kann die Stringenz so ge­ wählt werden, daß die Bindung von 300-500 aufeinander fol­ genden Basen der Nukleinsäuresequenz genügt.

Bei in situ Hybridisierung an elektrophoretisch getrennte DNA-Targets im COMET ASSAY wird die Stringenz so hoch ge­ wählt, daß eine stabile Bindung der erfindungsgemäßen, nach beispielsweise Isolierungsverfahren II isolierten Nuklein­ säuresequenz nur dann zustande kommt, wenn die Nukleinsäure­ sequenz in ihrer gesamten Länge mit hoher Komplementarität hybridisiert.

Außer chromosomalen Targets wird als ein weiteres erfin­ dungsgemäßes Target für die in situ Hybridisierung auch die mithilfe des COMET ASSAY oder verwandter Verfahren präpa­ rierte DNA individueller Zellen angesehen. Bei dem COMET ASSAY (O. Östling and K.J. Johanson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 : 291 (1984); P.L. Olive and J.P. Banath, Exp. Cell Res. 221 : 19 (1995)) werden Zellen nach Einbettung in flüssige Agarose auf einem Träger ausplattiert und nach Aus­ bildung eines Agarose-Gels in situ lysiert. Die DNA der ein­ zelnen Zellen wird dann in einem elektrischen Feld in situ getrennt. Je kleiner die Fragmentlänge ist, umso größer ist der Anteil der migrationsfähigen DNA. Für die in situ Hybri­ disierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen an die elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Targets nach Durchfüh­ rung der COMET ASSAY Präparation werden beispielsweise nach Isolierungsverfahren II gewonnene Nukleinsäuresequenzen ver­ wendet. Die Denaturierung der DNA-Targets bzw. die in situ Hybridisierungsreaktion kann hier ohne weitere Maßnahmen nicht bei hohen Temperaturen (siehe in situ Hybridisierungs­ beispiele 1 und 2 zur FISH-Technik) erfolgen, da sonst das Agarose-Gel schmilzt und die Zellen sowie die elektrophore­ tisch getrennten DNA-Targets weggespült werden können. Eine ausführbare Lösung besteht darin, die Denaturierung der DNA-Targets unterhalb von etwa 40 bis 45°C mithilfe von chemi­ schen Agentien durchzuführen, z. B. 0,1 mol/l HCl oder 1 mol/l NaOH. Die Denaturierung der erfindungsgemäßen Nuklein­ säuresequenz erfolgt getrennt; vgl. in situ Hybridisierungs­ beispiele 1 und 2 zur FISH-Technik. Die Stringenz der in situ Hybridisierungsbedingungen wird so gewählt, daß nur solche Nukleinsäuresequenzen an das DNA-Target binden, die mit der überwiegenden Mehrheit ihrer Basen eine komplemen­ täre Verbindung eingegangen sind. In diesem Falle zeigt eine Detektion einer zweifach markierten Nukleinsäuresequenz in der DNA der Zellen nach dem COMET ASSAY einen Translokati­ onsbruchpunkt an. Dieser Translokationsbruchpunkt ist iden­ tisch mit einem Translokationsbruchpunkt in den Zellen, aus welchen die für die Synthese der Nukleinsäuresequenz verwen­ deten genomischen DNA Fragmente isoliert wurden.

Beispielsweise werden erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von DNA aus Tumorgewebe T1 isoliert. Nach dem COMET ASSAY werden Zellen aus einem Tumorgewebe T2 iso­ liert und als Target für die in situ Hybridisierung, wie oben beschrieben, verwendet. Eine Bindung der durch ihre Markierung detektierbaren Nukleinsäuresequenz zeigt das Vor­ handensein der spezifischen Translokation von T1 auch in T2 an. Dies ist zur vergleichenden Charakterisierung von Tumor­ gewebe von erheblichem, auch klinischem Interesse. Ein An­ wendungsbeispiel wäre die Kontrolle von therapeutischen Maß­ nahmen. Zum Beispiel kann die erfindungsgemäße Sequenz nach beispielsweise Isolierungsverfahren II aus DNA von Tumorge­ webe eines Patienten vor Beginn der Behandlung isoliert wer­ den, sowie zu verschiedenen Zeiten während der Therapie. Der Vorteil des COMET ASSAY besteht darin, daß hier keine Chro­ mosomenpräparationen benötigt werden. Der damit verbundene Verzicht auf chromosomale Zuordnung kann in bestimmten Fäl­ len hingenommen werden.

In Schritt (h) wird die in situ Hybridisierung ausgewertet. Beispielsweise werden bei in situ Hybridisierung an Chromo­ somen in Metaphasepräparaten unter Verwendung von beispiels­ weise nach Isolierungsverfahren I gewonnenen Nukleinsäurese­ quenzen in einem ersten Auswertungsschritt die Chromosomen identifiziert, die überwiegend eine erste Markierung, eine zweite Markierung, usw., tragen. Bei Verwendung sortierter Kontrollchromosomen kann dieser Auswertungsschritt entfal­ len, da die Chromosomen bereits aufgrund des Sortierungsver­ fahrens identifiziert wurden. In diesem Falle oder bei Ver­ wendung anderweitig identifizierter Kontrollchromosomen ist es vorteilhaft, nach Isolierungsverfahren II gewonnene Nu­ kleinsäureserquenzen einzusetzen. In einem zweiten Verfah­ rensschritt werden die Orte der erfindungsgemäßen Nuklein­ säuresequenzen auf den Kontrollchromosomen detektiert. Die Identifikation einer Nukleinsäuresequenz auf einem ersten Kontrollchromosom erfolgt beispielsweise aufgrund seiner zweiten Markierung, gegebenenfalls auch weiterer, von der er­ sten unterscheidbaren Markierungen. Die Identifikation einer Nukleinsäuresequenz auf einem zweiten Kontrollchromosom er­ folgt beispielsweise aufgrund seiner ersten Markierung, ggf. auch weiterer, von der zweiten Markierung unterscheidbaren Markierungen, usw. Die Ortsbestimmung der Nukleinsäurese­ quenzen auf den Kontrollchromosomen erfolgt durch Angabe ih­ rer relativen Position auf langem bzw. kurzem Arm in Bezug auf Zentromer, Telomere, sowie ggf. weiterer Kontrollmarkie­ rungen.

Da bei erfindungsgemäßer Hybridisierung jede Nukleinsäurese­ quenz nur eine Bindungsstelle pro individuellem Chromosom besitzt, sind in der Regel mehrere, ggf. auch viele Chromo­ somen auszuwerten, um zu einem sicheren Ergebnis über Vor­ handensein und Ort einer Translokationsbruchstelle zu gelan­ gen. Beispielsweise befinden sich bei dem Isolierungungsver­ fahren I für die Nukleinsäuresequenz noch weitere Nuklein­ säuremoleküle in der Hybridisierungsmixtur, die mit der Nu­ kleinsäuresequenz um dieselbe Bindungsstelle auf den Kon­ trollchromosomen konkurrieren. Bei der Bindungsstelle auf einem ersten Kontrollchromosom sind beispielsweise diese weiteren Nukleinsäuremoleküle: (i) die DNA-Sonde mit einer ersten Markierung und (ii) das zu der Bindungsstelle komple­ mentäre, nicht-markierte DNA-Fragment. Wie häufig eine Bin­ dung der Nukleinsäuresequenz an die Bindungsstelle erfolgen kann, hängt von ihrer relativen Häufigkeit in der Hybridi­ sierungsmixtur ab. Bei Verwendung des Isolierungsverfahrens II kann diese relative Häufigkeit erheblich vergrößert und damit die Anzahl der auszuwertenden Chromosomen erheblich reduziert werden. Die Auswertung kann durch Verfahren der automatischen digitalen Bildanalyse unterstützt werden, die eine Identifizierung von Chromosomen sowie einzelner Hybri­ disierungsorte ermöglichen (P. Emmerich et al., Exp. Cell Res. 181: 126 (1989); S.Popp et al., Kerntechnik 55: 204 (1990); C. Cremer et al., J. Radiat. Res. (Japan), Suppl., 33 : 189 (1992); J.A. Fantes et al., Int. J. Radiat. Biol. 68 : 263 (1995)).

Zur Auswertung gibt es im Stand der Technik bekannte Verfah­ ren, z. B. auf cytochemischer Basis oder zeitaufgelöste mi­ kroskopische Fluoreszenzverfahren (L. Seveus et al., Cytome­ try 13 : 329 (1992); T. Gadella et al., Biophys. Chemistry 48 : 221 (1993)). Diese Verfahren erlauben es, die Autofluo­ reszenz eines biologischen Objektes bzw. die Fluoreszenz ei­ nes anderen Farbstoffes mit Fluoreszenz-Emission gleicher Wellenlänge von der Fluoreszenz des Hybridisierungssignals zu trennen. Voraussetzung hierfür ist ein ausreichender Un­ terschied in den Fluoreszenzabklingzeiten. Beispielsweise beträgt die Fluoreszenzabklingzeit der Autofluoreszenz 100 Nanosekunden und weniger. Die Abklingzeiten von Fluoreszein und Rhodaminen beträgt weniger als 10 Nanosekunden. Die Fluoreszenzabklingzeiten von Lanthanid-Chelat-Verbindungen hingegen betragen 10 bis 1000 Mikrosekunden. Derartige Fluo­ rochrome mit sehr unterschiedlichen Abklingzeiten können di­ rekt oder indirekt an DNA-Sonden gekoppelt werden. Bei­ spielsweise kann eine Europium-Verbindung bei einem Über­ schuß eines anderen Fluorochroms mit stark unterschiedlicher Abklingzeit noch bei einem Überschuß von 1×10⁶ detektiert werden. Ein normales Metaphasechromosom, beispielsweise das menschliche X-Chromosom, besteht aus etwa 160 Millionen Ba­ senpaaren, die in Chromosomenpräparaten ein Volumen von ca. 10 µm³ einnehmen. Das bei einem herkömmlichen Fluo­ reszenzmikroskop aufgrund der Auflösung detektierte Volumen des Metaphasechromosoms beträgt ca. 1 µm³, worin sich etwa 16 Millionen Basenpaare mit Autofluoreszenz oder anderer Markierung stark unterschiedlicher Abklingzeit befinden. Geht man beispielsweise von einer zu detektierenden, erfin­ dungsgemäßen Nukleinsäuresequenz von 200 bis 500 Basenpaaren aus, so ist der Überschuß an anderweitig gefärbter DNA in dem zu analysierenden Volumen ca. 3×10⁴ mal bis 8×10⁴ mal, also um mehr als eine Größenordnung geringer als der tole­ rierbare Überschuß von 1×10⁶ mal. Durch konfokale Laser- Scanning-Fluoreszenzverfahren kann das Detektionsvolumen und damit der zu tolerierende Überschuß noch erheblich weiter eingeschränkt werden. Dieses Beispiel soll lediglich die Ausführbarkeit des Detektionsverfahrens zeigen. Alternative Detektionsverfahren sind ebenfalls im Schutzbereich der vor­ liegenden Erfindung, sofern sie zu einem Nachweis der Nu­ kleinsäuresequenz auf Metaphasechromosomen bzw. in COMET ASSAY Präparationen führen.

Erfindungsgemäß verwendete Detektionsverfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Nachweis von fluoreszenzmar­ kierten DNA-Strängen von einigen hundert Basen und weniger bei Fluoreszenz-in situ Hybridisierungsverfahren (FISH) er­ lauben.

Beispielsweise können die an ein erstes Chromosom hybridi­ sierten, mit Fluoreszenzfarbstoffen einfach markierten Nu­ kleinsäuren und, bei Vorliegen einer Translokation, die hy­ bridisierten, mit Fluoreszenzfarbstoffen doppelmarkierten Nukleinsäuresequenzen einer hochempfindlichen Fluoreszenzde­ tektion, wie oben beschrieben, unterworfen werden. Hierbei ist unter geeigneten Stringenzbedingungen und bei Vorliegen einer Translokation der nicht-hybridisierende Teil der dop­ peltmarkierten Nukleinsäuresequenz komplementär zu einem Ab­ schnitt auf einem zweiten Chromosom; d. h. die an das chromo­ somale Target bzw. gebundene, doppelmarkierte Nu­ kleinsäuresequenz stellt die Bruchpunktregion dar. In diesem Zusammenhang sollte angemerkt werden, daß auch bei hoher Stringenz eine Anlagerung eines nur in einem zusammenhängen­ den Teilabschnitt komplementären Moleküls erreicht werden kann. Dies ergibt sich aus der bekannten Tatsache, daß in situ Hybridisierungen mit Phagen-DNA, die komplementäre men­ schliche DNA-Abschnitte ("Inserts") enthalten, an menschli­ che chromosomale Targets zu in situ Markierungen mit hoher Stringenz der Hybridisierung des Inserts realisiert werden können.

Unter Verwendung höherer Stringenzbedingungen kann bei Ver­ wendung des COMET ASSAY erreicht werden, daß eine nach Iso­ lierungsverfahren II gewonnene, doppeltmarkierte Nukleinsäu­ resequenz mit der überwiegenden Mehrheit ihrer Basenaufüh­ rer ganzen Länge an das DNA-Target bindet. Auf diese Weise werden Nukleinsäuremoleküle des Spenders markiert, die einen entsprechenden Translokationsbruchpunkt enthalten.

Mit hochempfindlichen Detektionsverfahren wird dann der Ort der gemischtfarbigen bzw. doppelmarkierten Moleküle auf den normalen Chromosomen detektiert. Die hierzu erforderliche Ausrüstung ("Hardware") kann in verschiedenen Ausführungen gewählt werden. Im folgenden werden einige Ausführungsbei­ spiele aufgezeigt.

Auswertungsbeispiel 1 (L. Seveus et al., Cytometry 13 : 329 (1992))

Es wird ein herkömmliches Epifluoreszenzmikroskop verwendet, das für zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion eingerichtet ist. Bei Markierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese­ quenz mit langlebigen Fluorochromen im Bereich von einigen hundert Mikrosekunden wird beispielsweise eine gepulste Xe­ non-Blitzlampe zur Anregung verwendet. Im Strahlengang der Fluoreszenzemission befindet sich eine rotierende Chopper­ platte. Diese erlaubt es, das Fluoreszenzlicht mit einer ge­ wissen Zeitverzögerung nach dem Anregungspuls zu detektie­ ren. Zur Detektion kann eine gekühlte CCD ("Charged Coupled Device")-Kamera verwendet werden.

Auswertungsbeispiel 2 (T. Gadella et al., Biophys. Chemistry 48 : 221 (1993))

Es wird eine kontinuierliche Laseranregungsquelle in Verbin­ dung mit einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop verwen­ det, die mit hoher Frequenz, z. B. 25-80 MHz, moduliert wird. Die Lebensdauer der modulierten Fluoreszenzemission kann aus der Phasenverzögerung und der Modulationstiefe des Fluoreszenzsignals relativ zu dem Signal des Anregungs­ lichtes bestimmt werden, wobei zur Detektion eine gekühlte, hochsensitive CCD-Kamera mit Bildverstärker verwendet wird. Es sind hiermit Lebensdauermessungen im Bereich von wenigen Nanosekunden, zum Beispiel von Rhodamin-Farbstoffen, mög­ lich.

Auswertungsbeispiel 3

Es wird eine Epifluoreszenzbeleuchtungseinrichtung einge­ setzt, bei der die Emission eines gepulsten Titan-Saphirla­ sers mit Pulsen im 100 Femtosekundenbereich (vgl. P. Hänni­ nen et al., Appl. Phys. Lett. 66 : 1698 (1995)) statt einer xenonblitzlampe, und eine Streak-Kamera zur hoch-zeitaufge­ lösten Detektion der spektralen Fluoreszenzemission verwen­ det wird. Damit ist es ebenfalls möglich, Fluorochrome mit Lebensdauerhalbwertszeiten im Nanosekundenbereich, zum Bei­ spiel Rhodaminderivate, zu verwenden.

Auswertungsbeispiel 4

Zur Registrierung bzw. Aufzeichnung der Fluoreszenzemission der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz wird ein konfoka­ les Laserscanning-Fluoreszenzmikroskop (vgl. C. Cremer u. T., Cremer, Microsc. Acta 81: 31 (1978); G.Brakenhoff et al., Nature 317 : 748 (1985); R.W. Wÿnaendts van Resandt et al., J. Microsc. 138 : 29 (1985)) verwendet, wobei die Scan­ ning-Geschwindigkeit, die Repetitionsrate, die Optik des De­ tektionsstrahlenganges, sowie die Lichtdetektionselemente und ihr Rauschverhalten so angepaßt werden, daß eine ausrei­ chende Fluoreszenzquantenstatistik bei ausreichendem Si­ gnal/Rausch-Verhältnis realisiert wird. Geht man von einem effektiven konfokalen Detektionsvolumen von 0,02 µm³ aus, so wird bei Verwendung einer herkömmlichen Chromosomenpräpara­ tion die Fluoreszenzemission von insgesamt etwa 3×10⁵ Basen­ paaren detektiert. Da mit der konfokalen Detektionsmethode auch bei Verwendung von Fluorochromen gleicher Fluoreszenz­ lebensdauer, aber verschiedener spektraler Fluoreszenzemis­ sion, ein DNA-Abschnitt mit einer Markierung "1" bei Vor­ liegen eines 1000-fachen Überschusses von DNA-Abschnitten einer Markierung "2" gemessen werden kann, kann eine erfin­ dungsgemäße Nukleinsäuresequenz detektiert werden. Sofern im vorliegenden Beispiel von einem solchen Verhältnis ausgegan­ gen wird, kann noch ein 300 bp langer DNA-Abschnitt mit einer Markierung "1" detektiert werden.

Auswertungsbeispiel 5

Für die Fluoreszenzdetektion wird ein optisches Fluoreszenz­ nahfeldmikroskop verwendet (vgl. E.Betzig et al., Bioimaging 1: 129 (1993); E. Monson et al., Ultramicroscopy 57: 257 (1995); G. Tarrach et al., Rev. Sci. Instr. 66 : 3569 (1995)). In einer bevorzugten Ausführungsform der Fluoreszenznahfeld­ mikroskopie wird das Objekt mithilfe einer feinen Spitzen­ apertur zur Bündelung des anregenden Laserlichtes Punkt für Punkt beleuchtet. Die Fluoreszenzemission wird von einem Mikroskopobjektiv hoher numerischer Apertur gesammelt und mit hochlichtempfindlichen Sensoren registriert.

Durch die Fluoreszenznahfeldmikroskopie kann das effektive Detektionsvolumen auf etwa 0,0003 bis 0,00003 µm³ ein­ geschränkt werden. Bei einer wie oben angenommenen DNA-Dichte von 16 Millionen Basenpaaren pro µm³ werden dann etwa 5.000 bis 500 Basenpaare registriert. Befindet sich die er­ findungsgemäße Nukleinsäuresequenz im Detektionsvolumen, so beträgt der Überschuß der nicht-informativen DNA-Moleküle bei einem Detektionsvolumen von 0,0003 µm³ höchstens einen Faktor von etwa zehnmal. Bei dem kleineren Detektionsvolumen von 0,00003 µm³ trägt praktisch nur noch die erfindungsge­ mäße Nukleinsäuresequenz zur detektierten Fluoreszenzemis­ sion bei. In beiden Fällen ergibt sich ein besonders hoher Kontrast zwischen chromosomalen bzw. DNA-Orten mit und ohne die Bindung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz.

Werden statt chromosomaler Targets die DNA COMET ASSAY-Tar­ gets untersucht, so kann die Detektion der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz vereinfacht werden, wenn der Überschuß an anderen markierten DNA-Sequenzen wegen der geringeren Konzentration aufgrund der elektrophoretischen Trennung ge­ ringer ist.

Bei Vorliegen einer oder mehrerer Translokationen zwischen einem ersten und zweiten Chromosom können auf dem ersten Chromosom der Ort bzw. die Orte einer bis hinunter zu eini­ gen hundert bp langen Sequenz der zweiten Fluoreszenzmarkie­ rung und auf dem zweiten Chromosom der Ort bzw. die Orte einer bis hinunter zu einigen hundert bp langen Sequenz der ersten Fluoreszenzmarkierung nachgewiesen werden. Die Bruch­ stellen können ggf. nunmehr isoliert, amplifiziert, und ihre Zuordnung zu anderen Sequenzen bzw. ihre Lokalisation auf diesen Chromosomen näher untersucht werden.

Liegt eine große Zahl zufallsverteilter Translokationsbruch­ punkte vor, so kann zwischen dem ersten und dem zweiten Chromosomen ein Fluoreszenzverhältnis von zweiter Markie­ rung/erster Markierung bzw. erster Markierung/zweiter Mar­ kierung berechnet werden, das von dem der anderen Chromoso­ men abweicht. Bei Auftreten von Häufungsstellen der Translo­ kationsbruchpunkte wird die lokale Verteilung der zweiten Markierung auf dem ersten Chromosom bzw. der ersten Markie­ rung auf dem zweiten Chromosom unterschiedlich sein, d. h. von einer homogenen Mischfärbung abweichen.

Die in situ Hybridisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mit verschiedenen DNA- oder Chromosomen-Präparaten durchgeführt werden. Beispielsweise werden bei der Einzel­ zell-Gelelektrophorese die Zellen nach Einwirkung DNA-schädigender Substanzen in situ lysiert und eine Elektropho­ rese durchgeführt (vgl. vorstehend beschriebenen COMET ASSAY). Liegt eine Fragmentierung von DNA der betreffenden Zellen vor, so entsteht eine Art "Kometenschweif" in der Nähe der betreffenden Zellen. Bislang wurde lediglich die Bruchstückverteilung gemessen. Die Anwendung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens, insbesondere die in situ Hybridi­ sierung nach Schritt (g) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann Aufschluß darüber geben, wie häufig in der fragmen­ tierten DNA der "Kometenschweife" entsprechende Transloka­ tionen auftreten.

Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf normale Zellen eines Spenders (z. B. aus archiviertem Material) ist ebenfalls von Interesse. Bei bekannten Bruchpunktregionen bietet die herkömmliche Fluoreszenz-in situ Hybridisierung an Interphasekerne eine überlegene Möglichkeit der Analyse. Das Verfahren ist jedoch ohne Kenntnis der genauen Bruch­ punktsequenzen nicht ökonomisch. Dieser Nachteil kann durch das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt werden, worin in Schritt (g) eine in situ Hybridisierung an normale Chromoso­ men des Spenders durchgeführt wird. Die in situ Hybridisie­ rung an zelluläre DNA des Spenders (z. B. aus archiviertem Biopsie-Material) nach Durchführung des COMET ASSAY kann In­ formationen über die Variabilität des Auftretens von Trans­ lokationsereignissen in dem untersuchten Gewebe ergeben und so von prognostischer Bedeutung sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Translokati­ onsbruchpunkten auf Chromosomen kann auch mit mehr als zwei Chromosomen, insbesondere bei Verwendung fluoreszenzmarkier­ ter Nukleinsäuresequenzen und Auswertung über Fluoreszenzle­ bensdauermessungen, durchgeführt werden.

Beispielsweise werden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen außer DNA-Sonden, die für ein erstes Chromosom spezifisch sind und eine erste Markierung tragen, und DNA-Sonden, die für ein zweites Chromosom spezifisch sind und eine zweite Markierung tragen, zusätzlich noch DNA-Sonden eines dritten Chromosoms mit einer dritten Markie­ rung, eines vierten Chromosoms mit einer vierten Markierung usw. genommen. Beispielsweise können fünf verschiedene Mar­ kierungen aufgrund ihres Fluoreszenzemissionsspektrums von­ einander unterschieden werden. Damit können mindestens fünf verschiedene Markierungen durchgeführt werden. Eine Translo­ kation liegt vor, wenn bei in situ Hybridisierung mit den in analoger Weise wie bei zwei Markierungen hergestellten Nu­ kleinsäuresequenzen auf einem normalen Chromosom mit einer bestimmten Markierung, z. B. einer dritten Markierung, eine hybridisierte DNA-Sonde mit einer ersten oder zweiten oder vierten oder fünften Markierung detektiert wird. Damit kön­ nen gleichzeitig Translokationsbruchstellen von fünf ver­ schiedenen Chromosomen nachgewiesen werden.

Bei zusätzlicher Verwendung von Markierungen mit unter­ schiedlichen Lebensdauern können noch weitere Translokati­ onsbruchstellen detektiert werden. Eine erste Markierung kann z. B. mit einer Fluoreszenzemission F1 und einer Fluo­ reszenzlebensdauer T1 erfolgen; eine zweite Markierung kann mit F1 und einer Fluoreszenzlebensdauer T2 erfolgen; eine dritte Markierung mit F1, T3; eine vierte mit F1, T4; eine fünfte mit F1, T5; eine sechste mit einer Fluoreszenzemission F1, T1; eine sechste mit F1, T2; . . . eine (n)te mit Fn, Tn. Translokationsbruchpunkte zwischen Material von beispiels­ weise einem 9. und einem 22. Chromosoms bei erfindungsgemä­ ßer Hybridisierung an normale Chromosomenpräparate werden demgemäß dadurch detektiert, daß auf einem normalen Chromo­ som mit einer 9. Markierung eine hybridisierte DNA-Sonde mit einer 22. Markierung entdeckt wird, sowie auf einem normalen Chromosom mit einer 22. Markierung eine hybridisierte DNA-Sonde mit einer 9. Markierung nachgewiesen wird.

Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren derart modifiziert werden, daß gleichzeitig Translokationsbruchpunkte von bei­ spielsweise allen 24 menschlichen Chromosomentypen detek­ tiert werden können.

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nach­ weis von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen.

Um eine möglichst große Klarheit der schematischen Darstel­ lung zu ermöglichen, wird die zeichnerische Darstellung im folgenden auf DNA-Moleküle beschränkt, die von einem ersten normalen Chromosom (Chr A) und einem zweiten normalen Chro­ mosom (Chr B) stammen. Die Erweiterung des Verfahrens auf weitere Chromosomen ist vorstehend ausführlich erläutert worden.

Fig. 1A zeigt genomische, doppelsträngige DNA-Moleküle ei­ nes Spenders nach Isolierung und ggf. Amplifizierung. Dop­ pelsträngige DNA-Moleküle, die nicht von Chr A oder Chr B stammen, werden als "übrige" DNA-Moleküle bezeichnet; vgl. Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Fig. 1B zeigt doppelsträngige DNA-Bruchstücke der Spender-DNA nach Fragmentierung auf z. B. 1-2 kbp lange Bruchstücke, beispielsweise mithilfe von Restriktionsendonukleasen.

Die Lösung enthält: DNA-Fragmente (A) von Spender-DNA, die in ihrer Basenabfolge Sequenzen eines ersten normalen Chro­ mosoms (Chr A) entsprechen; DNA-Fragmente (B) von Spender-DNA, die in ihrer Basenabfolge Sequenzen eines zweiten nor­ malen Chromosoms (Chr B) entsprechen; DNA-Fragmente (AB) von Spender-DNA, in denen eine Fusion bzw. Translokation von Se­ quenzen aus Chr A und Chr B vorliegt; diese letzteren Stücke repräsentieren die Spender-DNA an einem Translokationsbruch­ punkt zwischen DNA eines ersten Chromosom Chr A und DNA ei­ nes zweiten Chromosoms Chr 13; übrige DNA-Fragmente, die we­ der von Chr A noch von Chr B stammen; vgl. Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Fig. 1C zeigt die DNA-Fragmente der Spender-DNA von Fig. 1B nach der Denaturierung. Als Ergebnis befinden sich in der Lösung: einzelsträngige DNA-Moleküle (A) aus der Denaturie­ rung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten (A); einzelsträn­ gige DNA-Moleküle (B*) aus der Denaturierung von doppel­ strängigen DNA-Fragmenten (B); einzelsträngige DNA-Moleküle (A*B*) aus der Denaturierung von doppelsträngigen DNA-Frag­ menten (AB); einzelsträngige DNA-Moleküle mit "übrigen" Se­ quenzen der Spender-DNA; vgl. Schritt (c) des erfindungsge­ mäßen Verfahrens.

Fig. 1D zeigt die Hybridisierung unter Verwendung der in Fig. 1C dargestellten, denaturierten DNA-Fragmente, auch Einzelstränge genannt, als Matrize, sowie DNA-Sonden, die von einem ersten normalen Chromosom (Chr A) stammen und eine erste Markierung Fl(A) tragen, sowie DNA-Sonden, die von ei­ nem zweiten normalen Chromosom (Chr B) stammen und eine zweite Markierung Fl(B) tragen. Die DNA-Sonden von Chr A hy­ bridisieren an denaturierte DNA-Fragmente (A*), sowie an den zu ihnen komplementären Abschnitt der denaturierten DNA-Fragmente (A*B*); die DNA-Sonden von Chr B hybridisieren an denaturierte DNA-Fragmente (B*), sowie zu den zu ihnen komplementären Abschnitt der denaturierten DNA-Fragmente (A*B*). Unter geeigneten Reaktionsbedingungen enthält die Lösung noch "übrige" DNA-Moleküle, die nach Ende der Reak­ tion meist doppelsträngig vorliegen und die weder eine Fluoreszenzmarkierung Fl(A) noch eine Fluoreszenzmarkierung Fl(B) tragen; vgl. Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfah­ rens.

Fig. 1E zeigt die Synthese der erfindungsgemäßen Nuklein­ säuresequenz unter Verwendung der an die Einzelstränge (A*B*) hybridisierten DNA-Sonden von Chr A und Chr B; vgl. Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Fig. 1F zeigt die Isolierung der erfindungsgemäßen Nuklein­ säuresequenz. Als Beispiel ist das Isolierungsverfahren I dargestellt, das auf einer einfachen Denaturierung beruht. Insbesondere befindet sich in der Lösung nach Durchführung des Denaturierungsschrittes die einzelsträngige, erfindungs­ gemäße Nukleinsäuresequenz mit ersten Fluoreszenzmarkierun­ gen Fl(A) und zweiten Fluoreszenzmarkierungen Fl(B); die Nukleinsäuresequenz hat eine zu dem als Matrize dienenden Einzelstrang (A*B*) komplementäre Basenabfolge. Darüber hin­ aus befinden sich bei Isolierungsverfahren I noch in der Lö­ sung: mit Fl(A) markierte DNA-Moleküle mit einer zu (A*) komplementären Basenabfolge; mit Fl(B) markierte DNA-Mole­ küle mit einer zu (B*) komplementären Basenabfolge; sowie übrige nicht-markierte einzelsträngige Sequenzen anderer Chromosomen als Chr A oder Chr B. Sequenzen anderer Chromo­ somen mit einer auch auf Chr A oder Chr B vorkommenden Ba­ senabfolge können ebenfalls mit Fl(A) oder Fl(B) markiert sein. Dies betrifft insbesondere repetitive Sequenzen (R); vgl. Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Fig. 1G zeigt das Ergebnis der Auswertung der gemäß Schritt (g) durchgeführten in situ Hybridisierung der nach Isolie­ rungsverfahren I oder II gewonnenen Nukleinsäuresequenz an normale erste Chromosomen Chr A und zweite normale Chromoso­ men Chr B.

Bei einer erfindungsgemäßen Ausführung sind die Translokati­ onsbruchstellen durch das Auftreten von zweiten Markierungen Fl(B) auf ersten Chromosomen Chr A bzw. von ersten Markie­ rungen Fl(A) auf zweiten Chromosomen Chr B zu erkennen. Die übrigen Chromosomen, soweit in der Präparation vorhanden, tragen bei erfindungsgerechter Durchführung der in situ Hy­ bridisierung keine erste oder zweite Markierung. Insbeson­ dere bei Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach Isolie­ rungsverfahren I ist hierzu die Suppression repetitiver Se­ quenzen vorteilhaft; vgl. Schritt (h) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Claims (17)

1. Nukleinsäuresequenz, die für einen Translokationsbruch­ punkt auf einem Chromosom spezifisch ist, umfassend einen ersten Sequenzabschnitt, der zu einer DNA-Sequenz eines ersten Chromosoms komplementär ist, zur Hybridi­ sierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und mindestens eine erste Markierung aufweist, und einen zweiten Se­ quenzabschnitt, der zu einer DNA-Sequenz eines zweiten Chromosoms komplementär ist, zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und mindestens eine zweite Mar­ kierung aufweist, wobei die erste und die zweite Markie­ rung unterschiedlich sind.

2. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, wobei die Markie­ rungen an Nukleotide gekoppelte Fluoreszenzfarbstoffe und/oder Biotin und/oder Digoxigenin und/oder mit radio­ aktiven Isotopen markierte Nukleotide umfassen.

3. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei die erste und die zweite Markierung Fluoreszenzfarbstoffe sind.

4. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Schritte:

• (a) Spaltung von genomischer DNA, die mindestens einen Translokationsbruchpunkt zwischen zwei Chromosomen aufweist, in DNA-Fragmente,
• (b) Denaturierung der DNA-Fragmente in Einzelstränge,
• (c) Hybridisierung der Einzelstränge mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung auf­ weisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz,
• (d) Synthese der Nukleinsäuresequenz unter Verwendung der Einzelstränge als Matrize in Gegenwart von Nu­ kleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nu­ kleinsäuren geeigneten Agens und einem zur Verknüp­ fung von Nukleinsäuren geeigneten Agens,
• (e) Isolierung der Nukleinsäure aus dem Reaktionsge­ misch,

wobei der erste Sequenzabschnitt der Nukleinsäuresequenz eine DNA-Sonde vom ersten Satz und der zweite Sequenzab­ schnitt der Nukleinsäuresequenz eine DNA-Sonde vom zwei­ ten Satz umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das zur Synthese von Nukleinsäuren geeignete Agens die Taq-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, die E. coli DNA-Polymerase I oder die Reverse Transkriptase ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das zur Verknüp­ fung von Nukleinsäuren geeignete Agens die T4-DNA Li­ gase, E. coli Ligase, oder eine andere zur Verknüpfung geeignete Polymerase ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die erste und zweite Markierung unterschiedliche Fluores­ zenzfarbstoffe sind.

8. Kit zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromoso­ men und von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen, enthaltend mindestens die Nukleinsäuresequenz von einem der Ansprüche 1 bis 3.

9. Verwendung der Nukleinsäuresequenz von einem der Ansprü­ che 1 bis 3 zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen und von Translationsbruchpunkten auf Chromo­ somen.

10. Verwendung nach Anspruch 9 zum Nachweis strahlungsindu­ zierter oder chemisch induzierter Translokationen und von Translokationen, die mit einer Malignität verbunden sind.

11. Verfahren zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen und von Translokationsbruchpunkten auf Chro­ mosomen, umfassend die Schritte:

• (a) Isolierung von zu untersuchender genomischer DNA aus geeignetem zellulären Material eines Spenders,
• (b) Spaltung der genomischen DNA in doppelsträngige DNA-Fragmente,
• (c) Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Fragmente in Einzelstränge,
• (d) Hybridisierung der Einzelstränge mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung auf­ weisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz,
• (e) Synthese von Nukleinsäuren unter Verwendung der Ein­ zelstränge als Matrize in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nukleinsäuren geeigneten Agens und einem zur Verknüpfung von Nuk­ leinsäuren geeigneten Agens, wobei doppelsträngig vorliegende Reaktionsprodukte hergestellt werden,
• (f) Denaturierung der doppelsträngig vorliegenden Reak­ tionsprodukte in Einzelstränge, wobei im Reaktions­ gemisch einzelsträngige Nukleinsäuren mit der ersten Markierung, einzelsträngige Nukleinsäuren mit der zweiten Markierung und, bei Vorhandensein eines Translokation zwischen dem ersten und dem zweiten Chromosom des Spenders, Nukleinsäuresequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 vorliegen,
• (g) in situ Hybridisierung der einzelsträngigen Nuklein­ säuresequenzen mit einem ersten und zweiten Kon­ troll-Chromosom ohne Translokationen, oder mit durch Einzelzellgelektroporese getrennter DNA und
• (h) Auswertung der in situ Hybridisierung über die un­ terschiedlichen Markierungen der Nukleinsäuresequen­ zen von Schritt (f).

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das zur Synthese von Nukleinsäuren geeignete Agens die Taq-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, die E. coli DNA-Polymerase I oder die Reverse Transkriptase ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das zur Verknüpfung von Nukleinsäuren geeignete Agens die T4-DNA Ligase, E. coli Ligase, oder eine andere zur Verknüpfung geeignete Polymerase ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die erste und zweite Markierung unterschiedliche Fluores­ zenzfarbstoffe sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei der Spender ein Mensch ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei der Spender nichtmenschlich ist und der Gruppe der Mammalia angehört.