DE69432122T2

DE69432122T2 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis von hämolysis in flüssigen proben

Info

Publication number: DE69432122T2
Application number: DE69432122T
Authority: DE
Inventors: Graham Davis
Original assignee: iStat Corp
Current assignee: Abbott Point of Care Inc
Priority date: 1993-10-04
Filing date: 1994-09-28
Publication date: 2003-10-16
Anticipated expiration: 2014-09-29
Also published as: CA2173461A1; JP3527741B2; DE69432122D1; EP0722569A1; WO1995010044A1; AU7875894A; CN1135260A; JPH09504608A; EP0722569A4; KR100247327B1; KR960705213A; EP0722569B1; US5593638A; AU696428B2; ATE232606T1; US5416026A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Hämolysenachweis in einer Gesamtblutprobe, ein Verfahren zur Bestimmung eines Anstiegs der Kaliumionenkonzentration einer Gesamtblutprobe, eine Vorrichtung zum Hämolysenachweis in einer flüssigen Probe, eine Vorrichtung zum Hämolysenachweis im einer Gesamtblutprobe, eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Anstiegs der Kaliumionenkonzentration einer Gesamtblutprobe und eine Patrone für den Einmalgebrauch, die eine Vielzahl von mikrohergestellten Biosensoren enthält und ferner eine Hämolysenachweiseinheit enthält.

Hintergrund der Erfindung

Eine Reihe von Analyten in biologischen Flüssigkeiten liegen in Mengen vor, die sich dramatisch von ihrer Konzentration in roten Blutzellen unterscheiden. Beispielsweise beträgt die Kaliumkonzentration innerhalb intakter roter Blutzellen gewöhnlich etwa 150 mM und die Kaliumkonzentration in einer Plasmafraktion eines normalen Patienten beträgt gewöhnlich etwa 4,0 mM.
Verfahren zur Manipulation von Zellen oder Proben biologischer Flüssigkeiten, die Zellen enthalten, können manchmal zu einem Aufbrechen der Zellen führen, ein Phänomen, das im Stand der Technik als "Lyse" bekannt ist. Dieses Phänomen ist besonders verbreitet bei roten Blutzellen. Wenn intakte rote Blutzellen physikalisch beschädigt werden und aufbrechen, ist das Phänomen als "Hämolyse" bekannt. Beispielsweise kann eine Hämolyse stattfinden, wenn eine Blutprobe einem Patienten entnommen wird. Die Hämolyse führt zum Mischen des Inhalts der roten Blutzellen, welche relativ hohe Konzentrationen an Kalium und Hämoglobin (neben anderen Analyten) enthalten, mit der Plasmafraktion der Blutprobe.
Hämolyse ist bei Blutproben verbreitet und kann stattfinden, wenn das Blut in Kontakt mit fremden Oberflächen kommt. Eine Hämolyse kann unvermeidbar sein, insbesondere während eines Eingriffs am Herzen oder eines Herz-Bypasses, wenn eine Transfusion oder eine extrakorporale Zirkulation stattfindet. Hämolyse kann auch das Ergebnis einer unsachgemäßen Entnahme und Handhabung von Proben biologischer Flüssigkeiten sein und kann sogar während Zentrifugations- und Trennungsverfahren auftreten. Deshalb müssen klinische Chemiker wissen, ob eine Hämolyse die von Ärzten angeordneten Analysen beeinflusst. Viele Labors verwerfen alle hämolysierten Proben ohne Erwägung, ob diese Vorgehensweise gerechtfertigt ist.
Beispielsweise wird in der klinischen Medizin die Kaliumkonzentration in einer Gesamtblutprobe bestimmt, indem die Kaliumkonzentration in der Plasmafraktion der Gesamtblutprobe gemessen wird. In Anbetracht der Tatsache, dass die Kaliumkonzentration innerhalb roter Blutzellen 25 bis 75mal höher als die Kaliumkonzentration in Blutplasma sein kann, wird die Hämolyse von nur einigen wenigen roten Blutzellen zu einem künstlichen Anstieg der Kaliumkonzentration in der Plasmafraktion führen.
In der Medizin ist im allgemeinen nur die Kaliumkonzentration in der Plasmafraktion zur Bestimmung des Elektrolyten-Gleichgewichts eines Patienten von Bedeutung. Die Kaliumkonzentration in der Plasmafraktion wird beispielsweise verwendet, um das Natrium/Kalium-Gleichgewicht, einen wichtigen Indikator richtiger Nervenleitung, und andere wesentliche Verhältnisse in Bezug auf eine akute Versorgung festzustellen, die medizinischen Fachleuten bekannt sind. Folglich kann eine Hämolyse während der Probenentnahme zu einer Überschätzung der tatsächlichen Plasma-Kaliumkonzentration führen. Dies kann besonders schwerwiegend sein, falls ein Patient tatsächlich eine niedrige Plasma-Kaliumkonzentration aufweist, die einer dringenden Behandlung bedarf. In diesem Szenario kann eine kleine Anzahl hämolysierter roter Blutzellen die Plasma-Kaliumkonzentration in den normalen Bereich erhöhen, was zu keiner Behandlung führt, wenn eine dringende Behandlung erforderlich ist.
Neben Kalium werden Messungen der Konzentration an Lactatdehydrogenase und saurer Phosphatase durch Hämolyse signifikant beeinflusst und eine Erhöhung der Cholesterinspiegel kann beobachtet werden, wenn eine schwere Hämolyse vorliegt.
Erythrozyten (rote Blutzellen) enthalten etwa 160mal mehr Lactatdehydrogenase, 68mal mehr saure Phosphatase, 40mal mehr Aspartataminotransferase und 6,7mal mehr Alaninaminotransferase als Blutplasma (Caraway, Chemical and diagnostic specificity of laboratory tests, Am. J. Clin. Pathol., 1961, 37: 445-64). Lactatdehydrogenase und saure Phosphatase sind die klinisch bedeutsamsten Enzyme, welche beträchtliche Erhöhungen aufgrund von Hämolyse zeigen. Saure Prostata-Phosphatase (Tartrat-inhibierte saure Phosphatase) wird ebenfalls durch Hämolyse beeinflusst. Es wird angenommen, dass Tartrat die Erhöhung der Enzymaktivität, welche das Ergebnis von Hämolyse ist, nicht inhibieren könnte (siehe Yucel et al., Effect on in vitro hemolysis on 25 common biochemical tests; Clinical Chemistry, 1993, 38: 575-577).
Aus diesem Grund wird Phlebotomisten und anderem medizinischem Personal, welches für die Entnahme von Blutproben verantwortlich ist, Techniken gelehrt, welche eine Hämolyse minimieren. Beispielsweise ist bekannt, dass bei der Gewinnung einer Probe mit Hilfe eines Fingers oder eines Heilstabs das Drücken der Stelle zur Förderung des Blutstroms Hämolyse verursacht, und sollte vermieden werden.
Das Standardlaborverfahren der klinischen Chemie zur Feststellung, ob eine Blutprobe eine signifikante Hämolyse aufweist, ist das Schleudern der Probe in einer Zentrifuge, um die Plasmafraktion von den roten Blutzellen zu trennen, und dann die visuelle Überprüfung der Plasmafraktion. Hämolyse führt dazu, dass die Plasmafraktion mit Hämoglobin kontaminiert ist, was dem sonst gelben Plasma eine offenkundige rote Farbe gibt. In einem typischen klinischen chemischen Labor basieren praktisch alle durchgeführten Bluttests auf Plasmamessungen. Dementsprechend ist die Zentrifugation der Blutprobe eine zufriedenstellende Maßnahme, um Hämolyse in einem klinischen Labor festzustellen.
Als Ergebnis wird, falls ein von einem Arzt angeordneter Test bekanntermaßen von Hämolyse gestört werden kann (z. B. Kalium, Lactatdehydrogenase, saure Phosphatase; siehe Yucel et al.) und das Ergebnis anormal ist, die Farbe der Plasmaprobe von einem Labortechniker überprüft werden. Falls die Plasmafraktion ein Anzeichen von Hämolyse zeigt, wird im allgemeinen eine frische Blutprobe erhalten werden.
Obwohl die Wirkungen der Hämolyse methodenabhängig sind (Frank et al., Effect of in vitro hemolysis on chemical values for serum, Clin. Chem., 1978, 24: 1966-1970), müssen die Ergebnisse für Lactatdehydrogenase, saure Phosphatase, Prostata-Phosphatase und Kalium-Analysen sogar verworfen werden, wenn die Proben nur leicht hämolysiert sind.
Die Konzentration an freiem Hämoglobin (Hb) in Serum kann als Maß für die Hämolyse verwendet werden (Yucel et al.). Beispielsweise zeigt Serum oder Blutplasma einen visuellen Hinweis auf Hämolyse, wenn die Hämoglobinkonzentration 20 mg/dl übersteigt oder größer als 3,1 AMol/l ist (Caraway, oben; Sonntag et al., Haemolysis as an interference factor in clinical chemistry, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1986, 24: 127-139). Hämolyse hat wenig Auswirkungen auf Bestandteile, welche in Erythrozyten in niedrigeren Konzentrationen als in Plasma vorliegen, jedoch kann eine deutliche Wirkung bei Bestandteilen beobachtet werden, welche in Erythrozyten in höherer Konzentration als im Plasma vorliegen (Sonntag et al., oben; Frank et al., oben; Brydon et al., The effect of haemolysis on the determination of plasma constituents, Clin. Chem. Acta, 1972, 41: 435-438). Hb kann auch die kolorimetrische Bestimmung von Bestandteilen stören, wenn bestimmte chromogene Reagenzien, die einer Oxidation durch Hb zugänglich sind, verwendet werden, um einen visuellen Hinweis auf die Anwesenheit und/oder Konzentration der Bestandteile zu liefern.
Neben den oben beschriebenen Analyten (Kalium, Lactatdehydrogenase, Cholesterin, Prostata-Phosphatase, Aspartataminotransferase und Alaninaminotransferase) werden Konzentrationen oder Aktivitäten von Aldolase, gesamter saurer Phosphatase, Isocitrathydrogenase, Magnesium und Phosphat ebenfalls durch eine Hämolyse in Proben biologischer Flüssigkeiten erhöht.
Beispielsweise nimmt, wenn die biologische Flüssigkeit Gesamtblut ist, die Konzentration an anorganischem Phosphat in der entsprechenden Plasmafraktion schnell zu, wenn die organischen Ester in den Zellen hydrolysiert werden. Die Aspartataminotransferase-Aktivität wird für jeweils 10 mg Hämoglobin pro dl Probe biologischer Flüssigkeit (Hb/dl) um 2% erhöht. Wenn kolorimetrische Verfahren ohne Extraktion eingesetzt werden, werden 10 mg Hb/dl die scheinbare Cholesterinkonzentration um 5 mg/dl erhöhen. 10 mg Hämoglobin pro dl Probe biologischer Flüssigkeit werden die Serumlactatdehydrogenase um etwa 10% erhöhen und das Serumkalium um etwa 0,6% (siehe Tietz, "Textbook of Clinical Chemistry", W. G. Saunders und Co. (1986), S. 488).
Ein Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung der Anwesenheit von Hämoglobin in Urin ist bekannt (HEMASTIXTM, hergestellt von Miles Ames, Elkart, Indiana). Jedoch ist der HEMASTIXTM-Test nur halbquantitativ. Ferner besteht kein Bedarf zur Unterscheidung zwischen roten Blutzellen und Hb in dem HEMASTIXTM-Test und folglich brauchen die roten Blutzellen vor der Verwendung von HEMASTIXTM-Streifen nicht abgetrennt zu werden. Darüber hinaus besitzt Urin gewöhnlich einen sauren pH-Wert, wohingegen Blutserum oder Plasma einen pH-Wert von 7,4 aufweist. Somit erfüllen das Verfahren und der Teststreifen, welche zur Bestimmung der Anwesenheit von Hb in Urin verwendet werden, nicht die Anforderungen für ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Hämolyse in Gesamtblut.
Ferner sind Verfahren zur Abtrennung von Plasma oder Serum aus Gesamtblut unter Verwendung eines Materials, welches Blutplasma oder Serum von Erythrozyten und Leukozyten oder von Gesamtblut trennt, ebenfalls bekannt (US-Patente Nr. 4,477,575 und 4,816,224). Diese Verfahren und Vorrichtungen wurden jedoch nicht zur Bestimmung der Anwesenheit von Hämoglobin oder eines Anstiegs in der Konzentration eines Blut-Analyten aufgrund von Hämolyse roter Blutzellen eingesetzt.
Derzeit gibt es kein praktisches Verfahren zur Feststellung, ob eine Blutprobe hämolysiert ist, wenn sie mit irgendeinem analytischen System getestet wird, welches:
(i) mit Gesamtblut arbeitet, und
(ii) am Bett des Patienten verwendet wird, wo keine Zentrifuge zur Verfügung steht.
Die vorliegende Erfindung sucht dieses Problem zu lösen durch Schaffung eines einfachen Verfahrens und einer einfachen Vorrichtung zur Identifizierung von Blutproben, in denen Hämolyse bis zu einem ausreichenden Maß stattgefunden hat, um zu fehlerhaften Messungen von Plasma-Analyten-Konzentrationen oder -Aktivitäten zu führen.
Eine weitere Vorrichtung und ein Verfahren zur Trennung von Plasma von den roten Blutzellen, die in einer Gesamtblutprobe enthalten sind, wird im US-Patent Nr. 4,753,776 beschrieben. Gemäß diesem Dokument wird die Gesamtblutprobe auf ein Glasfilterkissen aufgebracht (siehe Fig. 1, Spalte 4, Zeile 61 - Spalte 5, Zeile 9, und Spalte 7, Zeilen 3-31) und Plasma durch Saugwirkung abgetrennt. Das Dokument beschreibt nicht den Nachweis von extrazellulärem Hämoglobin (Hämolyse) auf demselben Filterstück. Es wird nur die Hämolyse gemessen, nachdem das Plasma den Filterteil der Bluttrennvonrichtung verlassen hat (siehe Spalte 9, Zeilen 49-59). In Anbetracht dieses Dokuments sucht die vorliegende Erfindung ferner ein vereinfachtes Verfahren und eine vereinfachte Vorrichtung zum Nachweis von extrazellulärem Hämoglobin zur Verfügung zu stellen.

Offenbarung der Erfindung

Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines neuen Verfahrens und einer neuen Vorrichtung zum Hämolysenachweis in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, welches qualitativ bestimmt, ob eine ausreichende Anzahl oder Konzentration intakter roter Blutzellen hämolysiert wurde, um anschließende Analyt- Messungen unter Verwendung der Probe biologischer Flüssigkeit zu erhöhen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens und einer neuen Vorrichtung zum Hämolysenachweis in einer Gesamtblutprobe, welches qualitativ bestimmt, ob eine ausreichende Anzahl oder Konzentration intakter roter Blutzellen hämolysiert wurde, um anschließende Analyt-Messungen unter Verwendung der Probe biologischer Flüssigkeit zu erhöhen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens und einer neuen Vorrichtung zur Schätzung des Ausmaßes der Hämolyse oder der Anzahl hämolysierter roter Blutzellen pro Einheitsvolumen in einer Probe biologischer Flüssigkeit.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens und einer neuen Vorrichtung zur Schätzung des Ausmaßes der Hämolyse oder der Anzahl hämolysierter roter Blutzellen pro Einheitsvolumen in einer Gesamtblutprobe.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens und einer neuen Vorrichtung zur Schätzung des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration in einer Probe biologischer Flüssigkeit aufgrund von Hämolyse.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens und einer neuen Vorrichtung zur Schätzung des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration in einer Gesamtblutprobe aufgrund von Hämolyse.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer verbesserten Patrone für den Einmalgebrauch, umfassend eine Vielzahl von mikrohergestellten Biosensoren, welche qualitativ und/oder quantitativ einen Anstieg der Konzentration eines Analyten aufgrund von Hämolyse misst, wobei der Analyt eine relativ höhere Konzentration in intakten roten Blutzellen und eine relativ niedrigere Konzentration in der Plasmafraktion aufweist.
Diese und andere Aufgaben, welche bei der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen ersichtlich sein werden, wurden von einem neuen Verfahren und einer neuen Vorrichtung zum Hämolysenachweis in einer Gesamtblutprobe gelöst, wobei das Verfahren die folgenden Schritte (a)-(c) umfasst:
(a) in Kontakt bringen einer die intakten roten Blutzellen enthaltenden Gesamtblutprobe mit einem trockenen Trennmaterial, das eine Stelle, wo die Gesamtblutprobe eingegeben wird, und einen Restbereich aufweist, wobei das Material physikalische Eigenschaften im Hinblick darauf aufweist, eine Fraktion, die extrazelluläres Hämoglobin, das in der Probe vorhanden sein kann, von den intakten roten Blutzellen durch Saugwirkung effektiv zu trennen;
(b) in Kontakt lassen der Probe mit dem Material für einen Zeitraum, der ausreicht, die Trennung zu bewirken, und
(c) Nachweisen der Gegenwart von extrazellulärem Hämoglobin in der Fraktion an einem Ort in dem Restbereich,
und wobei die Vorrichtung die folgenden Merkmale (a) und (b) umfasst:
(a) ein trockenes Trennmaterial, das eine Stelle, auf welche die flüssige Probe aufgetragen wird, und einen Restbereich aufweist, wobei das Material physikalische Eigenschaften im Hinblick darauf aufweist, eine Fraktion der Probe durch Saugwirkung effektiv zu trennen, welche Fraktion eine repräsentative Konzentration von extrazellulärem Hämoglobin, das in der Probe vorhanden sein kann, enthalten würde, und
(b) eine Nachweisvorrichtung zur Ermittlung der Konzentration des extrazellulären Hämoglobins in der Fraktion an einem Ort in dem Restbereich.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Man wird unschwer zu einer vollständigeren Würdigung der Erfindung und vieler der damit einhergehenden Vorteile kommen, wenn dieselbe durch Heranziehung der folgenden detaillierten Beschreibung besser verstanden wird, wenn sie in Verbindung mit den Begleitzeichnungen betrachtet wird, worin:
Fig. 1 eine Ausführungsform der vorliegenden Vorrichtung zeigt;
Fig. 2 eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Vorrichtung zeigt;
Fig. 3 eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Vorrichtung zeigt, die zur Verwendung in einer Ausführungsform der vorliegenden Patrone für den Einmalgebrauch geeignet ist;
Fig. 4A und 4B Ausführungsformen der vorliegenden Hämolysenachweisvorrichtung zeigen, die beide ein chromogenes Reagenz und ein "Stop-" oder Quenchreagenz inkorporieren;
Fig. 5 eine Draufsicht einer Ausführungsform der vorliegenden Patrone für den Einmalgebrauch ist, bei der die Hämolysenachweisvorrichtung von Fig. 3 verwendet wird;
Fig. 6A eine Seitenansicht der Patrone für den Einmalgebrauch von Fig. 5 ist und Fig. 6B eine vergrößerte Seitenansicht der darin verwendeten Hämolysenachweisvorrichtung von Fig. 3 ist;
Fig. 7 eine Draufsicht einer Patrone für den Einmalgebrauch gemäß der vorliegenden Erfindung ist, die eine modifizierte Hämolysenachweisvorrichtung gemäß Fig. 2 inkorporiert hat;
Fig. 8 eine Ansicht der Patrone für den Einmalgebrauch von Fig. 7 von unten ist; und
Fig. 9A eine Seitenansicht der Ausführungsfarm der in Fig. 7 gezeigten Patrone für den Einmalgebrauch zeigt und Fig. 9B vergrößerte Details der darin befindlichen Hämolysenachweisvorrichtung zeigt.

Beste Ausführungsform der Erfindung

In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Begriff "Gesamtblut" auf frisch entnommenes Blut, welches getestet wird, bevor es gerinnt, oder auf eine in herkömmlicher Weise entnommene Blutprobe, welche in einen "Vacutainer" gezogen sein könnte und welche ein Antikoagulans, wie z. B. Lithium-Heparin etc., enthalten könnte, oder welcher ein oder mehrere andere(s) klinische(s) Standardreagenz(ien) im Verlauf einer klinischen Routineuntersuchung zugesetzt sein kann/können.
Der Begriff "etwa" bezieht sich im allgemeinen auf eine vernünftigerweise erwartete Schwankung der experimentell bestimmten Werte verschiedener Analyten, die Fachleuten auf dem Gebiet der klinischen Chemie wohlbekannt ist. Solche vernünftigerweise erwarteten Schwankungen können je nach der Genauigkeit und der Sensitivität der eingesetzten Techniken variieren.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich entweder "Serum" oder "Plasma" auf die Fraktion des Gesamtbluts, die von den roten Blutzellen getrennt ist. "Serum" bezieht sich im allgemeinen auf die Fraktion des Gesamtbluts, der ein oder mehrere Antikoagulantien, wie z. B. Lithium-Heparin, zugesetzt wurden (antikoaguliertes Gesamtblut) und bei der rote Blutzellen entfernt wurden. Typischerweise wird Serum auf dem Gebiet der Medizin und klinischen Medizin zur Messung von Analyten verwendet. "Plasma" bezieht sich im allgemeinen auf die Fraktion von Gesamtblut, bei der keine Antikoagulation erfolgte, bei der jedoch die roten Blutzellen entfernt wurden. Plasma wird typischerweise auf dem Gebiet der Medizin und klinischen Medizin verwendet, um Blut in Patienten zu ersetzen, gewöhnlich intravenös oder mittels Injektion.
In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Begriff "Anstieg" auf die Erhöhung der Konzentration eines Analyten über die Konzentration, die sonst in der Fraktion vorliegen würde, wenn die Flüssigkeitsprobe frei von Hämolyse gewesen wäre.

I. Verfahren zum Hämolysenachweis in einer Gesamtblutprobe

In der Medizin und klinischen Medizin besteht Bedarf für ein Verfahren, welches schnell feststellt, ob eine Probe biologischer Flüssigkeit hämolysierte rote Blutzellen enthält, und welches nicht die Verwendung einer Zentrifuge erfordert. Der Bedarf ist besonders stark bei Verfahren, welche die Anwesenheit oder Konzentration von Analyten in Gesamtblutproben bestimmen. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hämolysenachweis in einer Gesamtblutprobe, welches die Schritte (a), (b) und (c) wie oben definiert umfasst.
Bei dem vorliegenden Verfahren umfasst die Fraktion, die von intakten roten Blutzellen getrennt ist, Plasma und Serum. Die Probe kann verdünnt sein, mit einer Lösung oder einem Reagenz behandelt sein oder einen internen Standard zugesetzt aufweisen, solange eine solche Behandlung die Analyten nicht chemisch modifiziert oder das Trennungsverhalten der getrennten Fraktion beeinflusst. Beispielsweise kann physiologische Salzlösung zugesetzt werden, um die Probe zu verdünnen. Jedoch sollte entionisiertes Wasser der Probe nicht zugesetzt werden, da die Zugabe von entionisiertem Wasser zu Gesamtblut zu Hämolyse führen kann.
Der Nachweisschritt in dem Verfahren kann die visuelle Untersuchung der Fraktion auf das Vorhandensein eines Farbtons umfassen. Bei dieser Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens entspricht der Farbton einer geschätzten Konzentration des extrazellulären Hämoglobins von etwa 20 mg/dl, was einer Lyse von etwa 100 roten Blutzellen pro ul Gesamtblut entspricht. Wie oben beschrieben, zeigt Blutplasma einen visuellen Hinweis auf Hämolyse, wenn die Hämoglobinkonzentration 20 mg/dl übersteigt (Tietz, S. 488), was zu einer Farbänderung von einem gelben Farbton zu einem roten oder rosa Farbton führt.

II. Verfahren zur Schätzung der Hämoglobinkonzentration in einer Gesamtblutprobe durch Vergleich der Farbe der getrennten Fraktion mit einem externen Farbton

Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Schätzung der Konzentration von Hb in einer Gesamtblutprobe und dementsprechend der Anzahl hämolysierter roter Blutzellen pro Einheitsvolumen oder der Konzentration von hämolysierten roten Blutzellen in einer Gesamtblutprobe durch Vergleich des Farbtons der getrennten Fraktion mit einer Reihe von verschiedenen Farbtönen auf einer Karte. Die Karte zeigt eine Reihe charakteristischer Farbtöne entsprechend den Farben, die mit einem Spektrum vorgegebener Hb- Konzentrationen in Plasma assoziiert sind. Somit kann das vorliegende Verfahren ferner den Vergleich des Farbtons der getrennten Fraktion mit einer Farbkarte umfassen, die eine Vielzahl von Farbtönen zeigt, wobei jeder der Farbtöne ein Indikativ für eine geschätzte Konzentration des extrazellulären Hämoglobins, das in einer gegebenen getrennten Fraktion vorhanden ist, ist.
Alternativ kann der vorliegende Nachweisschritt das Kontaktieren der getrennten Fraktion mit einem chromogenen Reagenz umfassen. Etwaiges extrazelluläres Hämoglobin, das in der getrennten Fraktion vorliegen kann, reagiert mit dem chromogenen Reagenz, um eine Farbänderung zu ergeben. Vorzugsweise ist die Farbänderung visuell nachweisbar.
Der Nachweis von Hämoglobin in dieser Ausführungsform hängt von der Peroxidase-Aktivität von Häm-Proteinen ab, welche die Reduktion eines Peroxids katalysieren. Diese Reaktion erfordert ein organisches Peroxid und einen Wasserstoffdonor (reduziertes Chromogen). Solche Moleküle schließen o-Toluidin, Guaiac, Diisopropylbenzoldihydroperoxid und Tetramethylbenzidin ein. Nach der Umsetzung mit Hb ergeben die oxidierten Chromogene die gewünschte Farbänderung.
Das chromogene Reagenz kann mit einem Quenchmittel nach einem bestimmten Zeitraum, der von der Geschwindigkeit, mit der die getrennte Fraktion das Trennmaterial durchquert und sowohl das chromogene Reagenz als auch das Quenchmittel kontaktiert, und der Geschwindigkeit, mit der das Quenchmittel und das chromogene Reagenz durch die getrennte Fraktion diffundieren, um miteinander zu reagieren, abhängt, gequencht werden. Diese Ausführungsform liefert Endpunkt-Messungen ("Stops"), so dass die Konzentration an Hb zur Intensität der nach einem bestimmten Zeitraum entwickelten Endfarbe in Beziehung steht. Bei einem "Stop"-Verfahren, das auf Zeit oder Geschwindigkeit basiert, kann nach einer vorgegebenen Zeitspanne die Intensität der Endfarbe gemessen werden oder alternativ eine elektrochemische Messung vorgenommen werden, um die Konzentration an Hb zu bestimmen.
Ein Reagenzsystem, welches zur Bestimmung der Anwesenheit von Cholesterin in Serum eingesetzt wird, ist ein Cholesterinesterasecholesterinoxidase-Peroxidase-System (beispielsweise wie in den US-Patenten Nr. 4,477,575 und 4,816,224 beschrieben). Die Peroxidase- Aktivität von Hb stört einen solchen Test. Dementsprechend kann das vorliegende Verfahren in Verbindung mit dem Verfahren der kolorimetrischen Analyse von Serumcholesterin, beschrieben in US-Patenten 4,477,575 und 4,816,224, durchgeführt werden, um den Anstieg der Peroxidase-Aktivität aufgrund von Hb zu bestimmen.
o-Toluidin wird in sehr kleinen Mengen in einem im Handel erhältlichen Tauchstab (HEMASTIXTM, Miles Ames Company, Elkhart, Indiana) eingesetzt, welcher zur Bestimmung der Anwesenheit von Hämoglobin oder Myoglobin in Urin verwendet wird. Die Menge an o- Toluidin, die in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist vorzugsweise sehr klein.
o-Toluidin spricht auf etwa 2 mg Hb/dl Urin an, entsprechend etwa 10 Erythrozyten/pl Urin bzw. 10 Erythrozyten/ul Gesamtblut. Somit ist o-Toluidin sehr sensitiv gegenüber Hb (Tietz, S. 1562). Ein negativer Test (die Abwesenheit irgendeiner blauen oder grünlichen Farbe) bedeutet, dass keine signifikante Hämolyse in der untersuchten Probe stattgefunden hat. Ein positiver Test (die Anwesenheit einer blauen oder grünlichen Farbe) bedeutet, dass eine signifikante Hämolyse in der untersuchten Probe stattgefunden hat. Spezieller bedeutet ein negativer Test, dass die geschätzte Konzentration an extrazellulärem Hämoglobin weniger als 2 mg/dl der getrennten Fraktion beträgt, während ein positiver Test bedeutet, dass die geschätzte Konzentration an extrazellulärem Hämoglobin mindestens 2 mg/dl beträgt oder, alternativ, dass etwa 10 Erythrozyten/pl Gesamtblut hämolysiert wurden.
Zur Optimierung der Sensitivität des Tests wird die Nachweisfläche des Streifens in allmählich zunehmenden Mengen mit dem chromogenen Reagenz imprägniert, bis ausreichend chromogenes Reagenz vorhanden ist, um mit einer beliebigen Menge an Hämoglobin zu reagieren, welche in der getrennten Fraktion vorliegen kann. Bei der Optimierung des Tests werden mehrere Streifen, die jeweils eine unterschiedliche Menge an chromogenem Reagenz enthalten, individuell getestet. Es kann dann eine Konzentration an chromogenem Reagenz ausgewählt werden, welche die gewünschte Farbentwicklung in einer gewünschten Zeitspanne ergibt. Die Farbentwicklung ist somit unabhängig von dem trockenen Trennmaterial, jedoch abhängig von dem Ausmaß der Hämolyse.
Es können jedoch falsche positive Ergebnisse beobachtet werden, wenn der Probenbehälter mit Hypochloritlösung kontaminiert wurde oder wenn Peroxidase-enthaltende Bakterien in der Probe vorliegen. Positive Ergebnisse können auch auftreten, wenn freies Myoglobin oder intakte Erythrozyten in der Probe vorliegen. Wie im folgenden erörtert werden wird, ist es deshalb essentiell, dass das trockene Trennmaterial intakte rote Blutzellen von der Fraktion trennt, welche Hb enthalten kann. Jedoch wird freies Myoglobin typischerweise nur in Proben gefunden, die von Herzinfarkt-Patienten erhalten wurden. Dementsprechend kann eine Blutprobe, die von einem Patienten mit einem bekannten oder vermuteten Herzinfarkt genommen wurde, vor dem Hämolysenachweis mit Anti-Myoglobin-Antikörpern behandelt werden.
Der Nachweisschritt des vorliegenden Verfahrens kann alternativ mit Hilfe eines Remissionsmessers durchgeführt werden, wobei die Messvorrichtung eine Ablesung ergibt, die eine Funktion der Konzentration des extrazellulären Hämoglobins ist, das in der Fraktion vorliegt. So kann das vorliegende Verfahren ferner die Schritte der Bestrahlung der getrennten Fraktion mit Licht und der Bestimmung der Lichtremission aufgrund von Hämoglobin in der getrennten Fraktion umfassen.
Wenn die Remission aufgrund von Hämoglobin in der getrennten Fraktion direkt gemessen wird (wenn kein chromogenes Reagenz vorliegt), kann das Licht eine Wellenlänge besitzen, für die Hämoglobin eine maximale Extinktion aufweist. Typischerweise wird jedoch breitbandiges sichtbares Licht zur Messung der Remission eingesetzt. Die Remission wird gegen eine weiße Oberfläche geeicht (z. B. das nicht-verwendete trockene Trennmaterial). Die Remission des trockenen Trennmaterials, das eine getrennte Serum- oder Plasmafraktion enthält, basiert dann auf einer Grauskala (z. B. je weniger weiße Farbe, desto geringer die Remission). Weitere Messungen, durchgeführt mit Proben, die eine bekannte Hb-Konzentration aufweisen, ergeben Datenpunkte, auf denen quantitative Remissionsmessungen basieren können. Ein Diagramm der Remission gegen die Hb-Konzentration wird graphisch dargestellt. Das Diagramm kann dann dazu verwendet werden, die Hb- Konzentration der getrennten Fraktion einer Gesamtblutprobe auf Grundlage der Remission der getrennten Fraktion zu bestimmen.

III. Verfahren zur Schätzung des Anstiegs eines Analyten in einer Gesamtblutprobe aufgrund von Hämolyse

Das vorliegende Verfahren kann ferner, nach dem Nachweisschritt, den Schritt der Schätzung des Anstiegs eines Analyten in der Probe, der auf die Hämolyse von roten Blutzellen zurückzuführen ist, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform schätzt das vorliegende Verfahren den Anstieg eines Analyten, welcher aus der Gruppe, die aus Kaliumionen, Lactatdehydrogenase und saurer Phosphatase besteht, ausgewählt ist. Die vorliegende Erfindung ist besonders geeignet zur Schätzung des Anstiegs von Kaliumionen aufgrund der Hämolyse von roten Blutzellen.
In der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche ferner den Schritt der Schätzung des Anstiegs eines Analyten in der Probe umfasst, kann das Verfahren ferner den Schritt der Einstellung der scheinbaren Konzentration des Analyten zur Berücksichtigung des Anteil davon, welcher auf die Hämolyse roter Blutzellen zurückzuführen ist, nach dem Schätzungsschritt umfassen.
Mikrohergestellte Biosensoren zur Verwendung für den Nachweis und die Bestimmung der Anwesenheit und/oder Konzentration einer Vielfalt von Analyten, einschließlich Kalium, sind im US-Patent Nr. 5,200,051, hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen, offenbart.
In der Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens zur Bestimmung des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration aufgrund von Hämolyse intakter roter Blutzellen in einer Gesamtblutprobe umfasst das Verfahren die Schritte (a), (b) und (c) wie oben definiert und zusätzlich den folgenden Schritt:
(d) Schätzung des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration in der Probe, welcher auf Hämolyse zurückzuführen ist.
Vorzugsweise weist das Verfahren zur Bestimmung des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration aufgrund von Hämolyse intakter roter Blutzellen spezifisch ein ausreichendes Ausmaß an Hämolyse nach, um einen Anstieg der Kaliumkonzentration um mindestens 0,1 mM über der Kaliumkonzentration, welche sonst in der Plasmafraktion vorgelegen hätte, wenn die Gesamtblutprobe frei von Hämolyse gewesen wäre, zu verursachen. Ein Anstieg der Kaliumkonzentration um 0,1 mM entspricht der Hämolyse eines relativ kleinen Prozentsatzes roter Blutzellen pro ul Gesamtblut unter Annahme eines normalen Hämatokrit- Spiegels (etwa 40%).
Alternativ wird das Verfahren zur Bestimmung des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration aufgrund von Hämolyse intakter roter Blutzellen in einer Patrone zur Gesamtblutanalyse für den Einmalgebrauch durchgeführt, welche das trockene Trennmaterial und eine ionenselektive Elektrode zur Messung der Kaliumionenkonzentration umfasst. Vorzugsweise ist die kaliumionenselektive Elektrode auf einem Siliciumchip mikrohergestellt.
Das vorliegende Verfahren zur Bestimmung des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration aufgrund von Hämolyse intakter roter Blutzellen kann ferner den Schritt des Vergleichs des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration mit einen vorgewählten Hämolysewert und die Verwerfung einer Erhöhung oberhalb des vorgewählten Werts als für klinische Zwecke unzuverlässig beinhalten. Dies kann erreicht werden, indem die Farbe der getrennten Fraktion, welche auch mit dem oben beschriebenen chromogenen Reagenz in Kontakt gekommen sein kann, mit einem Farbton verglichen wird, welcher der Farbe einer Standardplasmaprobe entspricht, welche die Hb-Konzentration enthält, die sich aus dem vorgewählten Hämolysewert ergibt.
Beispielsweise führen 10 mg Hämoglobin pro 1 ul Serum zu einer Erhöhung der Serumkaliumionenkonzentration um 0,6% (Tietz, S. 488). Die Beziehungen zwischen hämolysierten roten Blutzellen, der Konzentration an Hb und dem Anstieg von Blut-Analyten wie die Kaliumionenkonzentration sind linear voneinander abhängig. Als Folge werden Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet in der Lage sein, einen Hämolysewert vorzuwählen, der sowohl einer bekannten Hb-Konzentration in Plasma als auch der entsprechenden Farbe entspricht, welche wiederum mit einem vorgewählten Anstieg der Kaliumionenkonzentration korreliert, der als für klinische Zwecke unzuverlässig verworfen werden soll.

IV. Vorrichtung zum Hämolysenachweis in einer Flüssigkeitsprobe, insbesondere einer Gesamtblutprobe

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst eine Vorrichtung zum Nachweis von Hämolyse in einer Flüssigkeitsprobe, umfassend die Merkmale (a) und (b) wie oben definiert.
Die vorliegende Vorrichtung eignet sich insbesondere zum Hämolysenachweis in Proben biologischer Flüssigkeit, welche Erythrozyten enthalten, wies z. B. Gesamtblut, oder welche Erythrozyten enthalten können, wie z. B. Urin. Die vorliegende Vorrichtung eignet sich am besten für Gesamtblutproben. Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung zum Nachweis von Hämolyse in einer Gesamtblutprobe, welche die obigen Merkmale (a) und (b) umfasst.
Das vorliegende trockene Trennmaterial ist ein Trockenmaterial, welches biologische Flüssigkeiten von intakten roten Blutzellen schnell durch Saugwirkung trennt und keine sichtbare Hämolyse verursacht. Der Begriff "Saugwirkung" bezieht sich auf das Vermögen des vorliegenden trockenen Trennmaterials, Flüssigkeit von der Stelle, wo sie in das trockene Trennmaterial eingeführt wird, radial zu dem Rest des trockenen Trennmaterials zu transportieren. Im Gegensatz dazu werden rote Blutzellen nicht leicht durch das Material transportiert und somit durch das trockene Trennmaterial im Vergleich zur abgetrennten Fraktion zurückgehalten. "Saugwirkung" ist auch im Stand der Technik bekannt als "Kapillarkräfte", welche in den US-Patenten Nr. 4,816,224 und 4,477,515 von Spalte 5, Zeile 64, bis Spalte 6, Zeile 5, beschrieben werden, und "Kapillarwirkung", die im US-Patent 5,096,669 (Spalten 48-51) erwähnt wird. Vorzugsweise enthält das vorliegende trockene Trennmaterial keine chemisch störenden Substanzen und bindet nicht-zelluläre Komponenten von Proben biologischer Flüssigkeit nicht signifikant.
Vorzugsweise ist das vorliegende trockene Trennmaterial eine Mischung mehrerer verschiedener Fasertypen, die unter Anwendung herkömmlicher Papierherstellungstechnologie zu einem einschichtigen Verbundfaserblatt geformt wurden, beschrieben im US- Patent Nr. 5,186,843, hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen. Alternativ schließt das vorliegende trockene Trennmaterial auch eine Zusammensetzung ein, die eine Schicht von Glasfasern umfasst, welche gegebenenfalls ferner ein organisches polymeres Bindemittel enthalten können, beschrieben in den US-Patenten Nr. 4,816,224 und 4,477,575, hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen. Ein besonders bevorzugtes trockenes Trennmaterial ist von Ahlstrom Filtration im Handel erhältlich, vertrieben unter der Marke CYTOSEPTM.
Das Verbundfaserblatt, das sich zur Verwendung in der vorliegenden Vorrichtung als trockenes Trennmaterial eignet, umfasst eine Mischung von Glasmikrofasern, Cellulosefasern und Fasern von synthetischem Material, in einer statistisch dispergierten Fasermatrix miteinander gemischt. Synthetische Bindemittelfasern können hinzugefügt werden, um eine erhöhte Zugfestigkeit zu ergeben. Dieses Verbundfaserblatt verursacht keine Hämolyse, ein essentielles Erfordernis des vorliegenden trockenen Trennmaterials.
Das vorliegende trockene Trennmaterial kann in Form eines Streifens vorliegen, bei dem die Dimensionen eine Länge von 5 bis 50 mm, eine Breite von 1 bis 10 mm und eine Dicke von 0,1 bis 3,0 mm einschließen. Vorzugsweise beinhalten die physikalischen Merkmale des trockenen Trennmaterials Dimensionen von 10 bis 40 mm Länge, 3 bis 7,5 mm Breite und 0,2 bis 1,0 mm Dicke. Eine Länge von etwa 2 cm und eine Dicke von etwa 0,3 mm des trockenen Trennmaterials ergibt eine adäquate Trennung in etwa einer Minute.
Wie in Fig. 1 gezeigt, kann die vorliegende Vorrichtung ferner ein steifes Substrat I umfassen, welches das trockene Trennmaterial 2 stützt. Vorzugsweise ist jedoch das trockene Trennmaterial ausreichend stark oder steif, daß es kein Trägersubstrat benötigt.
Dementsprechend kann die vorliegende Vorrichtung aus dem trockenen Trennmaterial und dem Nachweismittel bestehen.
Das trockene Trennmaterial kann rote Blutzellen von der zu trennenden flüssigen Fraktion entlang irgendeiner Dimension des Materials (d. h. der Länge nach, Breite nach oder Dicke nach) trennen. Wie in Fig. 1 gezeigt, wird bei Trennung der Fraktion der Länge nach (in Pfeilrichtung) die Gesamtblutprobe an einer Stelle zu einem Ende 3 des trockenen Trennmaterials hin aufgebracht. Die zu trennende Fraktion wird radial durch die Saugwirkung des trockenen Trennmaterials von der Auftragstelle wegtransportiert. Wenn die getrennte Fraktion eine Stelle in der Nähe des Endes 4 oder bei dem Ende 4 gegenüber dem Ende, welches die Auftragstelle enthält, erreicht, wird dann das Nachweismittel eingesetzt, um die Anwesenheit von Hämoglobin zu bestimmen oder das Ausmaß der Hämolyse abzuschätzen.
Die Begriffe "in der Nähe des Endes" und "zu einem Ende hin" beziehen sich auf einen Ort zwischen dem Mittelpunkt und dem Endpunkt der Achse der relevanten Trenndimension (Länge, Breite oder beide). Vorzugsweise liegt der Ort zwischen dem Endpunkt der Achse (dem äußersten Rand des trockenen Trennmaterials) und einem Punkt in einem Drittel der Entfernung entlang der Dimensionsachse, einschließlich des Endpunkts und des Punkts in einem Drittel der Entfernung entlang der Dimensionsachse.
Alternativ kann, wie in Fig. 3 gezeigt, das vorliegende trockene Trennmaterial die Fraktion entlang der Achse der Dicke des Materials von intakten roten Blutzellen trennen. In dieser Ausführungsform wird die Gesamtblutprobe auf die verfügbare Oberfläche des trockenen Trennmaterials 31 aufgebracht, wo die zu trennende Fraktion durch die Saugwirkung entlang der Achse der Dicke des trockenen Trennmaterials zu der Schicht des Materials 32, das mit der entgegensetzten Oberfläche verbunden ist, transportiert wird. Bei dieser Ausführungsform kann die Vorrichtung ferner eine oder mehrere Schicht(en) des Materials 32 umfassen, welches:
(1) rote Blutzellen nicht hämolysiert,
(2) chemische oder nicht-zelluläre Komponenten von Blutplasma oder Serum nicht bindet, und
(3) die Gesamtblutprobe effektiv daran hindert, beobachtet oder nachgewiesen zu werden.
Geeignete Materialien zur Erreichung dieser Ziele werden in den US-Patenten Nr. 5,186,843, 4,816,224 und 4,477,575 beschrieben.
Ähnlich wie bei dem Verfahren zum Nachweis von Hämolyse in einer Gesamtblutprobe kann das Nachweismittel der vorliegenden Vorrichtung eine Farbkarte umfassen, die mindestens einen Farbton einer geschätzten Konzentration an extrazellulärem Hämoglobin, die in einer gegebenen getrennten Fraktion vorliegt, zeigt.
Gegebenenfalls kann das vorliegende Nachweismittel ein chromogenes Reagenz umfassen, das mit dem extrazellulären Hämoglobin reagiert, um eine Farbänderung zu ergeben. Wie in Fig. 1 gezeigt, kann die vorliegende Vorrichtung deshalb ferner ein Reagenzkissen 5, das mit dem chromogenen Reagenz imprägniert ist, in der Nähe eines Endes oder an einem Ende des trockenen Trennmaterials befindlich, umfassen. Alternativ kann sich, wie in Fig. 3 gezeigt, ein Reagenzkissen 32 als Schicht auf einer Oberfläche des trockenen Trennmaterials befinden.
Alternativ kann das chromogene Reagenz direkt auf dem trockenen Trennmaterial aufgebracht werden. In einem solchen Fall kann das chromogene Reagenz in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und auf das trockene Trennmaterial beispielsweise durch Sprühen oder Eintauchen aufgebracht werden und dann wird das Trennmaterial getrocknet. Techniken zur Aufbringung des chromogenen Reagenzes 4 auf das trockene Trennmaterial sind üblich und Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet bekannt. Das Lösungsmittel kann organische Lösungsmittel einschließen, wie z. B. Aceton, Methylenchlorid, Methanol, Ethanol oder dgl., falls das chromogene Reagenz nicht wasserlöslich ist. Falls das chromogene Reagenz wasserlöslich ist, kann das Lösungsmittel destilliertes, entionisiertes Wasser oder ein geeigneter Puffer, z. B. ein Standard-Phosphatpuffer, sein. Natürlich sind, wo dies angemessen ist, Mischungen von Wasser und wasserlöslichen oder mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln ebenfalls annehmbar.
Wenn das trockene Trennmaterial zur Trennung der Fraktion von intakten roten Blutzellen der Länge oder der Breite nach eingesetzt wird, kann das chromogene Reagenz auf dem Ende des trockenen Trennmaterials aufgebracht werden, welches gegenüber demjenigen liegt, auf dem die Gesamtblutprobe aufgebracht wird. Alternativ kann, wenn das trockene Trennmaterial die Fraktion von intakten roten Blutzellen entlang seiner Dicke trennt, das chromogene Reagenz auf der Oberfläche des trockenen Trennmaterials aufgebracht werden, die gegenüber derjenigen liegt, auf der die Gesamtblutprobe aufgebracht wird.
Dementsprechend kann die vorliegende Vorrichtung aus dem trockenen Trennmaterial, einem chromogenen Reagenz, das sich zu einem Ende hin oder auf einer Oberfläche des trockenen Trennmaterials befindet, und dem Nachweismittel bestehen.
Gegebenenfalls kann, wie in Fig. 2 gezeigt, die vorliegende Vorrichtung mit einem Sichtbereich 6 versehen sein, neben dem sich das Nachweismittel 7 befindet. Das Sichtfenster kann so gestaltet sein, dass es im wesentlichen denjenigen Teil der getrennten Probe, welcher die intakten roten Blutzellen enthält, von der Sicht ausschließt (siehe Fig. 2). Vorzugsweise befindet sich der Sichtbereich in einem ausreichendem Abstand entlang des Trennmaterials und weg von der Stelle, wo die Probe aufgebracht wird, so dass rote Blutzellen den Sichtbereich nicht erreichen.
Alternativ kann, wie in den Fig. 4A und 4B gezeigt, ein chromogenes Reagenz in Verbindung mit einem Quenchmittel eingesetzt werden, welches die Reaktion zwischen Hb und dem chromogenen Reagenz "stoppt". Das Quenchmittel kann sich auf dem trockenen Trennmaterial befinden oder in einem damit verbundenen Kissen, beispielsweise an einem Ort 41 weiter von der Stelle 43 entfernt, an der die Gesamtblutprobe aufgebracht wird, als von der Stelle 42, die das chromogene Reagenz enthält (Fig. 4A). Alternativ kann der Ort des Quenchmittels 41 dieselbe Entfernung entlang des trockenen Trennmaterials wie zu dem Ort des chromogenen Reagenzes 42 aufweisen (Fig. 4B).

V. Hämolysenachweis-Patrone für den Einmalgebrauch

Die vorliegende Vorrichtung eignet sich besonders zur Verwendung als Patrone für den Einmalgebrauch und kann dementsprechend ferner einen Behälter, welcher das trockene Trennmaterial umgibt, und eine Öffnung 9 zur Einführung der Probe, wie in Fig. 2 gezeigt, umfassen oder ferner daraus bestehen. Die Patrone für den Einmalgebrauch kann auch ferner Mittel zum Verschluß der Öffnung umfassen oder ferner daraus bestehen. Beispielsweise kann, wie in Fig. 5 gezeigt, eine verschließbare Kappe 51 an einem flexiblen Gelenk 52 dazu verwendet werden, die Öffnung nach Einführung der Gesamtblutprobe durch diese zu verschließen. Fig. 6A zeigt die Kappe 51, das Gelenk 52 und die Patronenöffnung 53 in einer geschlossenen Position.
Die Patrone für den Einmalgebrauch ist wegwerfbar und in sich geschlossen und verwendet eine sehr kleine Menge an Blut. Beispielsweise werden 10 bis 100 Mikroliter, oder bevorzugter etwa 60 Mikroliter (ul) an Gesamtblut in der vorliegenden Patrone für den Einmalgebrauch verwendet. Deshalb stellt die vorliegende Patrone für den Einmalgebrauch ein minimales Risiko bezüglich der Exposition gegenüber kontaminierten Gesamtblutproben sowohl für Personen, welche die Patrone handhaben, als auch für die Umgebung dar.

VI. Hämolysenachweisvorrichtung, die ferner eine Farbkarte umfasst

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende, in Fig. 2 beispielhaft dargestellte Vorrichtung ferner eine Farbkarte 7, die sich innerhalb der Sicht des Fensters befindet, wobei die Farbkarte mindestens einen Farbton zeigt, der eine geschätzte Konzentration von extrazellulärem Hämoglobin, das in einer gegebenen Plasmafraktion vorhanden ist, anzeigt. Der Farbton entspricht einem vorbestimmten Anstieg der Kaliumkonzentration in der Plasmafraktion, vorzugsweise einem Anstieg von mindestens 0,5 mMol pro Liter und besonders bevorzugt mindestens 0,1 mMol pro Liter.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung von Fig. 2 umfasst die Farbkarte mindestens zwei Farbtöne, von denen jeder ein Indikativ einer geschätzten Konzentration an extrazellulärem Hämoglobin ist, das in einer gegebenen Plasmafraktion vorhanden ist, ähnlich der obigen Beschreibung für das vorliegende Verfahren zur Schätzung der Konzentration an Hb in einer Gesamtblutprobe. Beispielsweise kann ein gelber Farbton, der einer Konzentration von weniger als 20 mg/dl Hb entspricht, eine akzeptable Probe anzeigen, wohingegen ein rosa Farbton, entsprechend einer Konzentration von mehr als 20 mg/dl Hb, eine unzuverlässige Probe anzeigen kann. Für halbquantitative Schätzungen kann die Farbkarte jedoch drei bis 12 Farbtöne enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Nachweismittel der vorliegenden Vorrichtung einen Remissionsmesser umfassen, der eine Lichtquelle und einen Lichtdetektor einschließt, wobei die Lichtquelle so positioniert ist, dass sie einem einfallenden Lichtstrahl von der Lichtquelle das Auftreffen auf die getrennte Fraktion ermöglicht, um einen reflektierten Lichtstrahl zu ergeben, und der Lichtdetektor so positioniert ist, daß der Nachweis des reflektierten Lichtstrahls ermöglicht wird.

VII. Patrone für den Einmalgebrauch zum Hämolysenachweis und zur Messung von Analyten in Blut oder anderen Flüssigkeiten

Die vorliegende Hämolysenachweisvorrichtung für den Einmalgebrauch kann entweder unabhängig von einer wegwerfbaren Vorrichtung und einem Handablesegerät oder darin inkorporiert sein und imstande, eine Vielfalt elektrochemischer Messungen mit Blut oder anderen Flüssigkeiten durchzuführen. Ein äußerst nützliches analytisches System am Krankenbett zur Durchführung einer Vielfalt elektrochemischer Messungen mit Blut oder anderen Flüssigkeiten ist das i-STAT-System (hergestellt von I-Stat Corp., Princeton, N. J.), das auf einem System von mikrohergestellten Biosensoren basiert und in dem US-Patent Nr. 5,096,669 und dem US-Designpatent Nr. 337,164 beschrieben ist, wovon jedes hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist. Dementsprechend kann die vorliegende Erfindung zur Verwendung in einem System mikrohergestellter Biosensoren, wie z. B. dem i-STAT- System, adaptiert werden.
Wie in Fig. 5 gezeigt, tritt ein kleiner Teil des in die i-STAT-Vorrichtung eingeführten Bluts in die Patronenöffnung 53 ein. Die Kappe 51 ist über der Patronenöffnung 53 plaziert, so dass das trockene Trennmaterial 31 in Kontakt mit der Gesamtblutprobe in der Öffnung kommt. Die Plasma- oder Serumfraktion trennt sich von ganzen Blutzellen durch Saugwirkung, durchquert das trockene Trennmaterial 31 und kommt in Kontakt mit einer Schicht von Nachweismaterial 32, welches mit einem chromogenen Reagenz imprägniert sein kann.
Ein Blick vom Ende dieser Vorrichtung ist in Fig. 6A, oben beschrieben, dargestellt. Fig. 6B ist eine detaillierte Seitenansicht eines Teils der Kappe 51, Patronenöffnung 53 und Hämolysenachweisvorrichtung (trockenes Trennmaterial 31 und Schicht des Visualisierungsmaterials 32) in dieser Ausführungsform der Erfindung. Ein Gummi- oder Kunststoff- Runddichtring 61 umgibt das trockene Trennmaterial 31 und die Schicht des Visualisierungsmaterials 32, um einen luftdichten Abschluß zu ergeben, der für die richtige Funktion der i-STAT-Patrone, die eine Vielfalt mikrohergestellter Biosensoren umfasst, erforderlich ist.
Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ferner eine Patrone für den Einmalgebrauch, umfassend eine Vielzahl von mikrohergestellten Biosensoren, die so angeordnet sind, dass das Vorhandensein oder die Konzentration von einem oder mehreren physiologischen Analyten in einer Gesamtblutprobe bestimmt werden kann, wobei die Anordnung ferner eine Hämolysenachweiseinheit umfasst, welche die Merkmale (a) und (b) wie oben definiert umfasst.
Vorzugsweise umfassen die mikrohergestellten Biosensoren eine mikrohergestellte kaliumionenselektive Elektrode und eine Referenzelektrode, die zur Bestimmung der Kaliumionenkonzentration in der Probe verwendet werden. Ferner kann in dieser Ausführungsform die visuelle Beobachtung durch Menschen durch den Einsatz eines Remissionsmessers ersetzt werden, um die Hämoglobinkonzentration und somit den Anstieg der Plasma-Analytenkonzentration genauer quantitativ zu bestimmen. In dieser Ausführungsform ermöglicht beispielsweise eine genaue quantitative Messung von Hämoglobin die Korrektur der Kalium-Messung, die mit der kaliumionenselektiven i-STAT- Elektrode durchgeführt wird.
Die Auflösung der kaliumionenselektiven i-STAT-Elektrode ist ausreichend, um verlässlich Kaliumkonzentrationen auf + 0,1 mM nachzuweisen. Dementsprechend ist die vorliegende Patrone für den Einmalgebrauch vorzugsweise so gestaltet, dass sie eine Hämolyse nachweist, welche ausreicht, um einen Anstieg der Kaliumkonzentration in der Plasmafraktion der Gesamtblutprobe um mindestens 0,1 mM zu verursachen.
In einer weiteren Ausführungsform kann die vorliegende Vorrichtung direkt in das Patronengehäuse 72 der i-STAT-Patrone für den Einmalgebrauch wie in Fig. 7 gezeigt oder nahebei zur leichten qualitativen Ablesung durch den Anwender inkorporiert sein. In der in Fig. 7 gezeigten Vorrichtung ist die Hämolysenachweisvorrichtung von Fig. 2 für die Anwendung dort leicht modifiziert. Die Modifizierung beinhaltet im wesentlichen den Austausch des in Fig. 2 gezeigten Behälters 9 gegen das Gehäuse der Patrone für den Einmalgebrauch 72 von Fig. 7.
Bei dieser Ausführungsform wird die Gesamtblutprobe in die Patronenöffnung 73 eingeführt, die sich direkt über der Probenöffnung 71 der Hämolysenachweisvorrichtung befindet. Nach dem Schließen der Kappe 74 wird die Gesamtblutprobe durch die Probenöffnung 71 der Hämolysenachweisvorrichtung gepresst, wo sie mit einem Ende des trockenen Trennmaterials 2 in Kontakt kommt. Die Plasma- oder Serumfraktion trennt sich von ganzen Blutzellen durch Saugwirkung entlang des trockenen Trennmaterials 2, wo sie schließlich in Kontakt mit dem Visualisierungsbereich 6 kommt. Ein Fenster in dem Patronengehäuse, entweder direkt über dem Visualisierungsbereich 6 (siehe Fig. 7) oder unter dem Visualisierungsbereich 6 (siehe Fig. 8) ermöglicht den Nachweis. Eine Farbkarte 77 (Fig. 7) oder 87 (Fig. 8) kann gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die eine Farbkarte beinhalten, wie oben beschrieben, bereitgestellt sein.
Fig. 9 zeigt eine Seitenansicht der Patrone für den Einmalgebrauch der Fig. 7 und 8. In der Vorrichtung der Fig. 9 befindet sich eine Probenöffnung 91 der Hämolysenachweisvorrichtung zur Kontaktierung der Gesamtblutprobe mit trockenem Trennmaterial 92 gerade oberhalb der Dichtung der Bluteintrittsöffnung. Die Plasma- oder Serumfraktion wird entlang des trockenen Materials 92 gesaugt und wird so von ganzen Blutzellen abgetrennt. Bei dieser Ausführungsform ist ein Ventil 93 erforderlich, um Luft den Austritt aus dem trockenen Trennmaterial zu erlauben, wenn das Plasma- oder die Serumfraktion es durchquert. Aus Gründen der Bequemlichkeit befindet sich das Visualisierungsfenster 94 an der Unterseite des Patronengehäuse 95 und entspricht somit der in Fig. 8 gezeigten Ausführungsform.
Wie im US-Patent Nr. 5,096,669 beschrieben, wird die Patrone für den Einmalgebrauch, die eine Vielzahl von mikrohergestellten Biosensoren umfasst, in ein Ablesegerät eingeführt, um die Konzentration von Analyten in der Blutprobe zu messen. Dementsprechend kann die Visualisierung der getrennten Fraktion mit Hilfe der Hämolysenachweisvorrichtung entweder vor oder nach Einführung der Patrone für den Einmalgebrauch in die Ablesevorrichtung durchgeführt werden.
Andere Merkmale der Erfindung werden während der folgenden Beschreibungen beispielhafter Ausführungsformen davon ersichtlich werden, welche zur Illustration der Erfindung angegeben sind und diese nicht beschränken sollen.

BEISPIEL 1

Mit Lithium-Heparin behandeltes Blut wurde eine Stunde lang eingefroren und dann aufgetaut, um die roten Blutzellen zu hämolysieren. Aliquots von Lithium-Heparin-Blut wurden dann zu einer Reihe von Proben von nicht-hämolysiertern Gesamtblut in ausreichenden Mengen zugegeben, um ein Spektrum von Hb-Konzentrationen in den Serumfraktionen zu ergeben. Die Proben wurden dann sorgfältig gemischt. Auf diese Weise werden Proben hergestellt, die normale Kaliumwerte aufwiesen (etwa 4 mM) und Kaliumkonzentrationen aufwiesen, die aufgrund von Hämolyse um 0,1 bis 10 mM erhöht waren. Die Kaliumkonzentration in der geschleuderten Serumfraktion einer jeden Probe wurde dann mit einem Beckman Astra Autoanalyzer (Beckman Instruments) bestimmt. Die Kaliumkonzentration einer jeden Gesamtblutprobe wurde ebenfalls mit i-STAT 6+-Patronen und dem Portable Clinical Analyzer (i-STAT, Princeton, New Jersey) bestimmt. Auf diese Weise war es möglich, eine Probe zu präparieren, welche bei Untersuchung des Serums nach dem Schleudern (d. h. Zentrifugieren) sichtbare Zeichen von Hämolyse aufweist und trotzdem dieselbe gemessene Kaliumkonzentration aufweist wie eine Probe ohne sichtbare Zeichen von Hämolyse (d. h., wo der Kaliumanstieg weniger als 0,1 mM beträgt). Dies liegt daran, dass eine Änderung der Kaliumkonzentration von weniger als 0,1 mM die Auflösung sowohl des Beckman-Astra Autoanalyzers als auch des I-STAT-Systems darstellt.

BEISPIEL 2

Eine einfache Vorrichtung, die zum Nachweis von Hämolyse in Gesamtblut verwendet wurde, wurde unter Verwendung von CYTOSEP-Papier (erhältlich von Ahlstrom Filtration, Inc.) konstruiert, welches rote Blutzellen beim Einziehen von Blut durch Kapillarkräfte verlangsamt. Das CYTOSEP-Papier wurde in Streifen mit den Abmessungen 25 · 5 mm geschnitten. Ein Tropfen von Gesambblut (etwa 50 ul), nach dem in Beispiel 1 offenbarten Verfahren präpariert, wurde auf ein Ende eines jeden Streifens plaziert. Als die Proben, die rote Blutzellen enthielten, entlang eines jeden Streifens gesaugt wurden, bewegte sich die Plasmafront vor den roten Blutzeller, so dass eine Trennung erreicht wurde. Zu dem Zeitpunkt, als die Plasmafraktion das Ende erreichte, durchquerten die roten Blutzellen nur etwa 5-10 mm entlang des Streifens. Proben, welche hämolysiertes Blut enthielten, zeigten eine deutliche Röte in der Plasmafraktion, als sie sich von den roten Blutzellen trennte, wohingegen diejenigen Proben, die nicht hämolysiert waren, keine deutliche Röte zeigten und gelb blieben. Alle verfügbaren Grade von CYTOSEP wurden getestet, mit ähnlich guten Ergebnissen. Dieses Ergebnis demonstrierte, dass eine Hämolyse, die ausreicht, um zu .einem Anstieg von mindestens 0,1 mM in der Kaliumkonzentration zu führen, leicht sichtbar gemacht wird.

BEISPIEL 3

Das Experiment von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Region des CYTOSEP-Papiers gegenüber demjenigen Ende, wo die Gesamtblutprobe zugegeben wurde, mit Reagenzien für den kolorimetrischen Nachweis der Peroxidase-Aktivität von Hämoglobin imprägniert wurde. Die Reagenzien umfassten o-Toluidin und eine Mischung von Tetramethylbenzidin und Diisopropylbenzoldihydroperoxid. Die mit Reagenz imprägnierten Streifen ergaben auch eine gute Trennung der Serumfraktion von roten Blutzellen und die Visualisierung der hämolysierten Proben war aufgrund der Entwicklung einer blaugrünen Farbe sogar noch klarer als in den Streifen, die kein chromogenes Reagenz enthielten.
Offensichtlich sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Lichte der obigen Lehren möglich. Es versteht sich deshalb, dass die Erfindung im Rahmen der beigefügten Ansprüche anders als hier speziell beschrieben durchgeführt werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Hämolysenachweis in einer Gesamtblutprobe, das folgendes umfasst:

(a) In Kontakt bringen einer die intakten roten Blutzellen enthaltenden Gesamtblutprobe mit einem trockenen Trennmaterial (2), das eine Stelle (3), wo die Gesamtblutprobe eingegeben wird und einen Restbereich aufweist, wobei das Material physikalische Eigenschaften im Hinblick darauf aufweist, eine Fraktion, die extrazelluläres Hämoglobin, das in der Probe vorhanden sein kann, von den intakten roten Blutzellen durch Saugwirkung effektiv zu trennen;

(b) in Kontakt lassen der Probe mit dem Material (2) für einen Zeitraum, der ausreicht, die Trennung zu bewirken und

(c) Nachweisen der Gegenwart von extrazellulärem Hämoglobin in der Fraktion an einem Ort (4) in dem Restbereich.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fraktion Plasma umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin in dem Nachweisschritt visuell die Fraktion auf das Vorhandensein eines Farbtons untersucht wird und der Farbton weiterhin mit einer Farbkarte, die eine Vielzahl von Farbtönen wiedergibt, verglichen wird, wobei jeder der Farbtöne ein Indikativ für eine geschätzte Konzentration des extrazellulären Hämoglobins, das in einer gegebenen getrennten Fraktion vorhanden ist, ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin in der Nachweisstufe die Fraktion mit einem chromogenen Reagenz, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus o-Toluidin, Diisopropyldihydroperoxid und Tetramethylbenzidin besteht, in Kontakt gebracht wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin die Schätzung des Anstiegs eines Analyten in der Probe, der auf die Hämolyse der roten Blutzellen zurückgeht und aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Kaliumion, Lactatdehydrogenase und saurer Phosphatase besteht, umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die physikalischen Eigenschaften des trockenen Trennmaterials (2) Ausmaße im Hinblick auf die Länge von 5 bis 50 mm, die Breite von 1 bis 10 mm und die Dicke von 0,1 bis 3 mm aufweisen und welches ein Verbundmedium aus Glasfasern, Cellulosefasern und synthetischen Textilfasern umfasst.

7. Verfahren zur Bestimmung des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration aufgrund der Hämolyse von intakten roten Blutzellen in einer Gesamtblutprobe, das folgendes umfasst:

(a) In Kontakt bringen einer intakte rote Blutzellen enthaltenden Gesamtblutprobe mit einem trockenen Trennmaterial (2), das eine Stelle (3), wo die Gesamtblutprobe eingegeben wird und einen Restbereich aufweist, wobei das Material physikalische Eigenschaften im Hinblick darauf aufweist, eine Plasmafraktion, die extrazelluläres Hämoglobin, das in einer Probe vorhanden sein kann, von den intakten roten Blutzellen durch Saugwirkung effektiv zu trennen;

(b) in Kontakt lassen der Probe mit dem Material (2) für einen Zeitraum, der ausreicht, die Trennung zu bewirken;

(c) Schätzen der Menge des extrazellulären Hämoglobins in der Plasmafraktion an einem Ort (4) in dem Restbereich und

(d) Schätzen des Anstiegs der Kaliumionenkonzentration in der Probe, die auf die Hämolyse zurückzuführen ist.

8. Vorrichtung zum Hämolysenachweis in einer flüssigen Probe, die aufweist:

(a) Ein trockenes Trennmaterial (2), das eine Stelle (3), auf die die flüssige Probe aufgetragen wird und einen Restbereich aufweist, wobei das Material physikalische Eigenschaften im Hinblick darauf aufweist, eine Fraktion der Probe durch Saugwirkung effektiv zu trennen, welche Fraktion eine representative Konzentration von extrazellulärem Hämoglobin, das in der Probe vorhanden sein kann, enthalten würde und

(b) eine Nachweisvorrichtung zur Ermittlung der Konzentration des extrazellulären Hämoglobins in der Fraktion an einem Ort (4) in dem Restbereich.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, die eine Patrone für den Einmalgebrauch ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 8, worin die Probe in eine Plasmafraktion getrennt ist, die durch ein Sichtfenster (6) beobachtet werden kann, wobei das Fenster im Wesentlichen die Ansicht des Teils der getrennten Probe ausschließt, der die intakten roten Blutzellen enthält.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, worin eine Farbkarte (7) innerhalb des Sichtbereichs des Fensters (6) angeordnet ist, wobei die Farbkarte (7) mindestens einen Farbton anzeigt, der ein Indikativ für eine geschätzte Konzentration von extrazellulärem Hämoglobin, das in einer gegebenen Plasmafraktion vorhanden ist, ist.

12. Patrone für den Einmalgebrauch, die eine Vielzahl von mikrohergestellten Biosensoren, die so angeordnet sind, dass das Vorhandensein oder die Konzentration von einem oder mehreren physiologischen Analyten in einer Gesamtblutprobe bestimmt werden kann, aufweist, wobei die Anordnung weiterhin eine Hämolysenachweiseinheit aufweist, die folgendes umfasst:

(a) ein trockenes Trennmaterial (2), das eine Stelle (3), wo die Gesamtblutprobe aufgetragen wird und einen Restbereich aufweist, wobei das Material physikalische Eigenschaften im Hinblick darauf aufweist, eine Fraktion der Probe durch Saugwirkung effektiv zu trennen, welche Fraktion eine representative Konzentration von irgendwelchem extrazellulären Hämoglobin, das in der Probe vorhanden sein kann, enthalten würde und

(b) eine Nachweisvorrichtung (7) zum Ermitteln der Konzentration des extrazellulären Hämoglobins in der Fraktion an einem Ort (4) in dem Restbereich.

13. Patrone für den Einmalgebrauch von Anspruch 12, die eine mikrohergestellte, kaliumionenselektive Elektrode und eine Referenzelektrode aufweist, die dafür verwendet werden, die Konzentration des Kaliumions in der Probe zu bestimmen.

14. Verfahren zur Schätzung einer Änderung eines Analyten in einer Gesamtblutprobe, die auf die Hämolyse von roten Blutzellen zurückzuführen ist, das folgendes umfasst:

(a) In Kontakt bringen einer intakte rote Blutzellen enthaltenden Gesamtblutprobe mit einem trockenen Trennmaterial (2), das eine Stelle (3), wo die Gesamtblutprobe eingegeben wird und einen Restbereich aufweist, wobei das Material physikalische Eigenschaften im Hinblick darauf aufweist, eine Fraktion, die extrazelluläres Hämoglobin, das in der Probe vorhanden sein kann, enthält, von den intakten roten Blutzellen durch Saugwirkung effektiv abzutrennen;

(b) in Kontakt lassen der Probe mit dem Material (2) für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Trennung zu bewirken;

(c) Nachweis des Vorhandenseins von extrazellulärem Hämoglobin in der Fraktion an einem Ort (4) im Restbereich und

(d) Schätzen der Änderung des Analyten in der Probe, die auf die Hämolyse von roten Blutzellen zurückzuführen ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Änderung eine Erhöhung ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Änderung die Konzentration oder Aktivität des Analyten ist.

17. Verfahren nach Anspruch 14, das weiterhin eine Stufe aufweist, mit der die Gegenwart, Konzentration oder Aktivität von einem oder mehreren zusätzlichen physiologischen Analyten in der Gesamtblutprobe nachgewiesen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Bestimmung das Inkontaktbringen der Gesamtblutprobe mit einer Vielzahl von mikrohergestellten Biosensoren umfasst.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin der zusätzliche physiologische Analyt Kalium ist.

20. Verfahren nach Anspruch 14, worin das trockene Trennmaterial (2) eine äußerste Kante und eine Dimensionsachse, die durch die Stelle (3), wo die Gesamtblutprobe eingegeben wird, und die äußerste Kante definiert ist, aufweist und sich der Ort (4) in dem Restbereich, wo der Nachweis erfolgt, zwischen dieser äußersten Kante und einem Punkt, der ein Drittel der Entfernung entlang dieser Dimensionsachse ausmacht, befindet.

21. Verfahren nach Anspruch 14, worin das trockene Trennmaterial (2) keine sichtbare Hämolyse der intakten roten Blutzellen verursacht.