DE69414001T2

DE69414001T2 - Bestimmungsmethode

Info

Publication number: DE69414001T2
Application number: DE69414001T
Authority: DE
Inventors: Jomar N-7020 Trondheim Frengen
Original assignee: Sinvent AS
Current assignee: Sinvent AS
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-23
Publication date: 1999-05-12
Anticipated expiration: 2014-12-24
Also published as: EP0736178A1; AU1322195A; JPH09509248A; WO1995017675A1; JP3553601B2; US5739042A; DE69414001D1; GB9326238D0; EP0736178B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Test auf einen Analyten und Kits, die für ein solches Verfahren nützlich sind.
Assaytechniken zur Bestimmung der Anwesenheit und zweckdienlicherweise auch der Konzentration des Analyten unter Verwendung eines Bindungspartners mit Spezifität für den Analyten werden häufig eingesetzt, z. B. auf den Gebieten der Biochemie und der klinischen Chemie. So wurde beispielsweise ein weiter Bereich von immunologischen und verwandten Techniken vorgeschlagen, um Materialien, wie Antigene in Serum, zu bestimmen, wobei ein geeigneter Bindungspartner für den Analyten, wie ein spezifischer Antikörper (z. B. ein monoclonaler Antikörper) für ein spezielles Antigen verwendet wird.
Eine solche Technik umfaßt kompetitive Bindungsassays, bei denen eine bekannte Menge einer markierten Version eines zu bestimmenden Analyten (der z. B. einen radioaktiven Marker trägt) und eine relativ kleine bekannte Menge eines Bindungspartners dafür mit dem zu bestimmenden Analyten inkubiert werden, wodurch der markierte und der natürlicherweise vorkommende Analyt um den Bindungspartner konkurrieren. Die Menge des an den Bindungspartner gebundenen Analyten wird anschließend bestimmt, und die Konzentration des natürlich vorkommenden Analyten, die in umgekehrter Beziehung zu dieser Menge steht, wird aus einer zuvor aufgestellten Standardkurve abgeschätzt.
Eine weitere nützliche Technik umfaßt Sandwichassays. Bei diesen wird ein Überschuß eines Bindungspartners verwendet, wobei der daran bindende Analyt durch Behandlung mit einem markierten Liganden, der ebenfalls für den Analyt Affinität hat, markiert wird. Die Menge des gebundenen und markierten Analyten wird dann bestimmt und erlaubt die Bewertung der Analytkonzentration unter Bezugnahme auf eine Standardkalibrationskurve.
Der Bindungspartner und der markierte Ligand besitzen in solchen Sandwichassays bevorzugt Affinität für verschiedene Bindungsstellen (z. B. Epitope) auf dem Analyten. Der Ligand kann beispielsweise zur Ablesung auf der Basis von Radioaktivität, Lichtabsorption oder Fluoreszenz markiert sein.
Sandwichassays neigen dazu, eine größere Empfindlichkeit als kompetitive Bindungsassays zu zeigen und sind daher üblicherweise bevorzugt. Es ist klar, daß eine hohe Empfindlichkeit, beispielsweise bei Immunoassays in klinischen Laboratorien wesentlich ist, wo es erforderlich sein kann, z. B. in Serum in Konzentrationen im Bereich von nmol/l bis pmol/l oder noch niedriger vorhandene Antigene quantitativ zu bestimmen.
Der Bindungspartner in den beiden vorstehend beschriebenen Assaytypen wird üblicherweise an einen festen Träger gekoppelt, um die Isolierung des gebundenen Analyten und des konkurrierenden oder analytgebundenen Markers zu erleichtern. So kann beispielsweise der Bindungspartner an die Oberfläche eines Reaktionsgefäßes z. B. an die Oberflächen der Kavitäten einer Mikrotiterplatte aus einem geeigneten Kunststoffmaterial gekoppelt werden, um das Waschen zu erleichtern und nichtgebundenen überschüssigen markierten Liganden zu entfernen.
Alternativ kann der Bindungspartner an die Oberflächen einer Anzahl von Teilchen, beispielsweise aus geeigneten Kunststoffmaterialien, wie Polystyrol oder Polyacrylat, gekoppelt werden. Die Trennung des gebundenen Analyts/Markers von freiem Marker kann dann beispielsweise durch Filtration oder, falls superparamagnetische Teilchen verwendet werden, durch Anlegen eines Magnetfeldes durchgeführt werden. Die Teilchen besitzen vorteilhafterweise eine mikroskopische Größe, um eine große Gesamtoberfläche, die mit dem Bindungspartner beschichtet ist, zu ergeben. Die Verwendung von Mikroteilchen einer Größe ist bevorzugt, da dies gewährleistet, daß die Teilchen Standardbindungseigenschaften zeigen.
Ein Nachteil der vorstehend beschriebenen grundlegenden Assaytechniken ist, daß die Trennung des gebundenen Analyts und des Markers und die damit verbundenen Waschstufen zur Entfernung nichtgebundener Marker inhärent zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind. Es ist jedoch bekannt, daß dieses Problem im Prinzip im Falle von Assays auf Teilchenbasis vermieden werden kann, wenn die Teilchen mittels Durchflußcytometrie analysiert werden. Diese ist typischerweise mit der Passage einer Suspension von Teilchen durch die Meßregion eines Photometers so verbunden, daß aufeinanderfolgende einzelne Teilchen mit Anregungslicht bestrahlt werden, was die Emission eines Pulses von gebrochenem Licht in Beziehung zu der Größe der Teilchen und ein weiteres Signal, z. B. einen Puls von Fluoreszenzlicht in Beziehung zu der Menge und der Natur des an das Teilchen gebundenen Markers hervorruft. Geeignete elektronische Detektoren und Mikroprozessoren klassifizieren und speichern die Ergebnisse durch Messungen bezüglich 10&sup4; bis 10&sup5; einzelnen Teilchen, die leicht z. B. in einer einminütigen Datenaquisitionszeit, erhalten werden können. Hydrodynamische Fokussierung des Probenstroms in einem Durchflußzytometer führt dazu, daß die Meßregion (i. e. das Volumen des Probenstroms mit der Anregungs/Detektionsregion) sehr klein ist, typischerweise im Bereich von (10 um)³, so daß die Menge des nichtgebundenen Markers, die in der Flüssigkeit, die ein einzelnes Teilchen, das gemessen wird, umgibt, vorhanden ist, nicht signifikant ist. Folglich besteht keine Notwendigkeit, nichtgebundenen Marker vor der durchflußzytometrischen Teilchenanalyse abzutrennen, die daher als ein homogener, d. h. abtrennungsfreier Assay, gilt.
Ein allgemeines Problem im Zusammenhang mit Sandwichassays, insbesondere einschließlich derjenigen, die unter Verwendung von durchflußzytometrischen Techniken durchgeführt werden, ist, daß ihr dynamischer Bereich durch ein als Hook-Effekt bekanntes Phänomen begrenzt wird, der bei hohen Analytkonzentrationen auftritt. So wird der Bindungspartner normalerweise in einer festen Menge verwendet, wobei die theoretische maximale nachweisbare Analytkonzentration so durch die gesamte verfügbare Bindungskapazität des Bindungspartners für den Analyt bestimmt wird. Da jedoch der markierte Ligand normalerweise in einer festen Menge verwendet wird, nimmt die Menge des pro gebundenem Analytmolekül verfügbaren Markers effektiv ab, wenn die Analytkonzentration diesen theoretischen Maximalwert als Ergebnis der erhöhten Bindung des Markers an exzessiven, nichtgebundenen Analyt, der in der Lösung verbleibt, überschreitet. Mit anderen Worten, der nichtgebundene überschüssige Analyt konkurriert mit dem gebundenen Analyten um den Marker und verringert dadurch die Menge des auf dem gebundenen Analyten immobilisierten Markers. Dies führt zu einer Abnahme der beobachteten Menge des gebundenen Analyt/Markers, wenn die Analytkonzentration über den Gehalt steigt, bei dem der Bindungspartner gesättigt wird. Folglich steigen Kalibrationskurven der Signalintensität, bezogen auf einen gebundenen Marker, gegen die Analytkonzentration auf einen Maximalwert und fallen dann mit weiterem Zunehmen der Analytkonzentration ab, was zur Folge hat, daß die Signalintensitäten nicht zweifelsfrei einem einzelnen Konzentrationswert zugeschrieben werden können, außer weitere Stufen, z. B. Verdünnung der Probe und weitere Tests werden durchgeführt.
Während das Einsetzen des Hook-Effekts im Prinzip durch Erhöhen der Menge des verwendeten Bindungspartners verzögert werden kann, führt dies unvermeidbar zu einer verringerten Empfindlichkeit bei niedrigen Analytkonzentrationen, da Meßtechniken, wie Durchflußzytometrie, einen bestimmten Minimalwert von gebundenem Analyt/Marker pro Teilchen benötigen, um genau nachweisbare Ergebnisse zu ergeben.
Die US-A-4 595 661 schlägt vor, daß der Hook-Effekt in einem Immunoassay dadurch verringert werden kann, indem ein weiterer Antikörper verwendet wird, der gegebenenfalls markiert und/oder an einen festen Träger gebunden sein kann und der eine niedrigere Affinität für das Ziel-Antigen besitzt als der primäre Bindungspartner Antikörper und markierter Ligand. Obwohl dieser Antikörper mit niedriger Affinität das Einsetzen des Hook-Effekts durch Bindung an den Analyten bei hohen Analytkonzentrationen verzögern kann, verringert dessen Anwesenheit erneut die Empfindlichkeit des Assays bei niedrigen Analytkonzentrationen als Ergebnis der erhöhten Hintergrundstörung, nichtspezifischer Bindung etc.
Eine ähnliche Variante ist in der US-A-4 743 542 beschrieben, wobei das Prinzip wieder die Hinzufügung eines nichtmarkierten Antikörpers in Kompetition mit dem markierten Liganden in einem Immunoassay ist. Durch Wirkung als weiteres Reagens für das Antigen erhöht dieser nichtmarkierte Antikörper die Antigenkonzentration, bei der die Sättigung des primären Bindungspartners Antikörper eintritt und so das Einsetzen des Hook-Effekts aufgeschoben wird. Die Gesamtwirkung ist der Erhalt einer Kalibrationskurve, die einen weiteren Bereich an Antigenkonzentrationen abdeckt, aber eine verringerte Neigung besitzt, was folglich den Nachteil einer größeren Unsicherheit bei jeder bestimmten Antigenkonzentration besitzt.
Eine ähnliche Wirkung wird durch das Verfahren der FR-A- 2 652 900 erzielt, bei dem ein weiterer Antikörper mit Affinität für die Bindungsstellen auf dem Antigen verwendet wird, das ansonsten in Wechselwirkung mit dem Bindungspartner oder dem Liganden treten würde.
Die WO-A-8911101 beschreibt eine anspruchsvollere Assaytechnik, bei der hochaffine und niedrigaffine Bindungspartner verwendet werden, die jeweils auf verschiedene Typen von monodispersen Teilchen beschichtet werden, die durchzytometrisch unterscheidbar sind. Vorbestimmte Mengen dieses binären Teilchengemisches und der markierten Liganden werden mit dem Analyt inkubiert, und die so erhaltenen zwei Typen der den markierten Liganden tragenden Teilchen werden anschließend unabhängig voneinander, aber gleichzeitig mit einem Durchflußzytometer nachgewiesen, wobei die Analytkonzentration von den so erhaltenen zwei Meßwerten unter Bezugnahme auf eine doppelte Standardkalibrationskurve bestimmt wird.
Diese duale Affinitätsassaytechnik kann sowohl auf kompetitive Bindungsassays, wobei der markierte Ligand eine Affinität für den Bindungspartner haben sollte, der typischerweise eine markierte Version des Analyten ist, als auch auf Sandwichassays, wobei der markierte Ligand eine Affinität für den Analyten haben sollte, angewendet werden. Es ist möglich, gleichzeitig eine Vielzahl von Analyten unter Verwendung einer Vielzahl von binären Teilchengemischen zu bestimmen, so daß alle Teilchentypen getrennt durchflußzytometrisch unterscheidbar sind.
Die Verwendung einer doppelten Standardkalibrationskurve erhöht die Präzision des Assays und erlaubt die unmittelbare Detektion abweichender oder falscher Ergebnisse, da die zwei Meßwerte für eine Probe als Paar in die doppelte Kurve passen müssen. Weil die zwei Teilchentypen getrennt bestimmt werden, wird die Empfindlichkeit bei niedrigen Konzentrationen, die prinzipiell eine Funktion des hochaffinen Bindungspartners ist, nicht durch die Anwesenheit des niedrigaffinen Bindungspartners infrage gestellt, wodurch folglich Messungen mit hoher Präzision bei hohen Analytkonzentrationen möglich sind, und der dynamische Bereich des Assays erweitert wird, indem dem Hook-Effekt vorgebeugt wird. Dies steht im Gegensatz zu dem in der US- A-4 595 661 beschriebenen Immunoassay, bei dem, wenn ein markierter weiterer Antikörper verwendet wird, nur die Summe der Beiträge aus den zwei Bindungsreaktion gemessen wird, was zu einer verringerten Empfindlichkeit bei niedrigen Antigenkonzentrationen führt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, daß ein weiter dynamischer Arbeitsbereich, gekoppelt mit einem hohen Präzisionsgrad und einer raschen Verarbeitungszeit, mit einer Vielzahl von binären Assaysystemen erzielt werden kann, i. e. Systemen, bei denen zwei unabhängig voneinander bestimmbare Formen des Bindungspartners verwendet werden und die Analytkonzentration aus diesen beiden Formen abgeleiteten Ablesungen mittels einer doppelten Standardkurve erhalten wird, wenn die zwei Formen des Bindungspartners nacheinander statt gleichzeitig mit dem Analyten und dem markierten Liganden umgesetzt werden.
So wird gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Test auf einen Analyten in einer Probe bereitgestellt, umfassend die Umsetzung der Probe mit zwei unabhängig voneinander bestimmbaren Formen eines Bindungspartners, der auf einem festen Träger gebunden ist, mit Affinität für den Analyten und mit einem markierten Liganden mit Affinität für den Analyten oder den Bindungspartner, wobei die zwei unabhängig voneinander bestimmbaren Formen des Bindungspartners auf einem festen Träger so sind, daß die Signale bezüglich der so erhaltenen zwei Formen des markierten ligandentragenden Bindungspartners auf einem festen Träger unabhängig bestimmt werden können, wodurch die Analytkonzentration unter Bezugnahme auf eine doppelte Standardkalibrationskurve erhalten werden kann, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Probe mit der ersten Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners und nach einem geeigneten Intervall der zweiten Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners umgesetzt wird.
Eine Reihe von verschiedenen Assaysystemen und Detektionstechniken können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. So können beispielsweise die zwei Formen des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners mit einem Bindungspartner beschichtete monodisperse Teilchen der zwei Typen, die beispielsweise durch mikroskopische Untersuchung oder Photographie auf der Basis der Größe oder durchflußzytometrisch auf der Basis der Größe oder der elektrischen Impedanz, wie z. B. nachstehend ausführlicher beschrieben, unterschieden werden können, umfassen. Alternativ kann die erste Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners beispielsweise ein in geeigneter Weise beschichtetes Tauchstäbchen oder beschichtete Oberflächen der Kavitäten einer Mikrotiterplatte sein, wobei die zweite Form in geeigneter Weise beschichtete Mikroteilchen oder Kügelchen umfaßt, wobei diese bevorzugt monodispers sind, so daß die zwei Formen nach Beendigung des Assayverfahrens getrennt und analysiert werden können, beispielsweise durch spektroskopische, radiometrische oder photographische Methoden, sofern geeignet. Andere alternative Systeme umfassen die Verwendung beschichteter Mikroteilchen als erste Form und einen in geeigneter Weise beschichteten Filter als die zweite Form.
Im Gegensatz zu dem in der WO-A-8911101 beschriebenen Assayverfahren können, wenn die Bindungspartner, die an die zwei Typen von Teilchen gebunden sind, die gleiche Spezifität, aber unterschiedliche Affinitätshöhen für den Analyten haben müssen, die zwei Formen des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, den gleichen Bindungspartner verwenden. So ist die Verwendung eines einzelnen Bindungspartners bevorzugt, da sie sowohl das Verfahren als auch die Materialerfordernisse vereinfacht, die Möglichkeit von Fehlern aus Variationen in den relativen Affinitäten eines Paares von Bindungspartnern beseitigt und die Anwendung des Verfahrens auf Analyten erlaubt, für die schwierig Paare von Bindungspartnern mit der gleichen Spezifität, aber verschiedener Affinität bereitgestellt werden können. Bei Anwendung auf Teilchensysteme kann das erfindungsgemäße Verfahren auch eine größere Flexibilität als das der WO-A-8911101 im Hinblick auf die Fähigkeit, die Parameter, wie die Teilchenkonzentrationen, und die Inkubationszeiten zu optimieren, zeigen.
Es ist klar, daß es jedoch in speziellen Anwendungen für die zwei Formen des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners vorteilhaft ist, daß sie sich in ihrer Spezifität und/oder Affinität unterscheiden, und solche Verfahren fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung.
Die erste Form des auf einen festen Träger aufgebrachten Bindungspartners wird bevorzugt in einer relativ niedrigen Menge bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, z. B. in einer Menge von weniger als 10% Gew./Gew., bezogen auf die zweite Form. Wenn sie in der Form von beschichteten Teilchen vorliegt, enthalten diese bevorzugt eine relativ hohe Beladung des Bindungspartners und werden in relativ niedrigen Mengen verwendet, um die Menge der Bindung pro Teilchen zu maximieren und dadurch die Empfindlichkeit des Verfahrens bei niedrigen Analytkonzentrationen zu erhöhen.
Die zweite Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners wird bevorzugt in einer relativ großen Menge verwendet, um eine rasche Bindung des in der Probenlösung verbleibenden Analyten zu gewährleisten. So ist die Verwendung einer wesentlichen Menge der zweiten Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners, z. B. ein Überschuß, bezogen auf den markierten Liganden, besonders bevorzugt, wenn kurze Gesamtassayzeiten erwünscht sind. Die Höhe der Beladung des Bindungspartners auf dem festen Träger ist nicht kritisch und kann so gewählt werden, daß sie zu einem speziellen Assaysystem paßt. Sie kann beispielsweise niedriger sein als die Höhe für die erste Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners, da der Hauptbeitrag der zweiten Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners bei höheren Analytkonzentrationen liegt, so daß es nicht notwendig ist, die Höhe der Bindung an die zweite Form im Interesse der Empfindlichkeit, i. e. der minimalen nachweisbaren Analytkonzentration, zu maximieren.
Die Zugabe der zweiten Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners in einem wesentlichen Überschuß verhindert effektiv jede weitere Bindung des Analyten an die erste Form des auf dem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners und kann so in gewisser Hinsicht als eine Art Waschstufe betrachtet werden, bei der nichtgebundener Analyt in einer quantitativ bestimmbaren Menge weggewaschen wird.
Das Zeitintervall zwischen der Reaktion mit den ersten und zweiten Formen eines auf einem festen Träger gebundenen Bindungspartners ist nicht kritisch, vorausgesetzt, daß sie für ein gegebenes Assaysystem im wesentlichen konstant gehalten wird. Da die Geschwindigkeit des Assays einer der Vorteile, die erfindungsgemäß erhältlich sind, ist, wird das Intervall bevorzugt relativ kurz gehalten, z. B. etwa 15 Minuten oder 2 bis mehrere Stunden.
Da die Zugabe der zweiten Form eines auf einen festen Träger aufgebrachten Bindungspartners, insbesondere bei Verwendung im wesentlichem Überschuß, effektiv die Reaktion des Analyten mit der ersten Form eines auf einen festen Träger aufgebrachten Bindungspartners löscht, vermeidet das erfindungsgemäße Verfahren jede Notwendigkeit, der ersten Form des auf einen festen Träger aufgebrachten Bindungspartners zu erlauben, daß sie ein Gleichgewicht mit dem Analyten erreicht, ein Verfahren, das bis zu beispielsweise 24 Stunden in Systemen benötigen kann, bei denen niedrige Konzentrationen der ersten Form des auf einen festen Träger aufgebrachten Bindungspartners verwendet werden, um eine hohe Empfindlichkeit zu erhalten. Dies ist ein wesentlicher Nutzen des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß es erlaubt, daß der Gesamtassay in Zeiten vollendet werden kann, die beispielsweise nur 1 bis 2 Stunden betragen können.
Für die maximale Reproduzierbarkeit sollte die Detektion von Signalen bezüglich der zwei Formen von einem markierten Liganden tragenden Bindungspartnern auf einem festen Träger bevorzugt bei einem vorbestimmten Zeitintervall nach der Reaktion mit der zweiten Form des auf einen festen Träger aufgebrachten Bindungspartners durchgeführt werden, obwohl in vielen Fällen dies im Hinblick auf das rasche Gleichgewicht nicht kritisch ist, das bevorzugt durch Zugabe eines wesentlichen Überschusses der zweiten Form des auf einen festen Träger aufgebrachten Bindungspartners erreicht wird. Zeitintervalle im Bereich von 5 Minuten bis zu 2 Stunden können daher zweckdienlich sein. Die Automatisierung des Meßverfahrens kann eine präzise Analyse nach kurzen Inkubationsperioden erlauben, z. B. durch Messen bei vorbestimmten Zeitintervallen unter Nicht-Gleichgewichtsbedingungen.
In den beigefügten Figuren, die die Erfindung, ohne sie in irgendeiner Weise zu beschränken, erläutern, erläutert die Fig. 1 eine repräsentative doppelte Standardkurve, umfassend logarithmische Plots der Analytkonzentration gegen die Fluoreszenzintensität für ein System, in dem die zwei Formen von auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartnern erste und zweite Teilchentypen p1 und p2 umfassen, die z. B. verschiedene Größen haben, wobei der markierte Ligand einen fluoreszierenden Marker mit einer Affinität für den Analyten umfaßt, und die Detektion mittels Durchflußzytometrie erfolgt. Die Fig. 2A stellt eine solche doppelte Standardkurve dar, die experimentell, wie in dem Beispiel beschrieben, erhalten wurde, und die Fig. 2B stellt das doppelte Präzisionsprofil für die zwei Kurven dar.
Wie aus der Fig. 1 hervorgeht, ist es in einem solchen System leicht möglich, Assayparameter auszuwählen, wie die Beladung des Bindungspartners auf die Teilchen p1 und p2, die Menge der verwendeten Teilchen und die Zeitintervalle zwischen der Zugabe der zwei Teilchentypen, so daß die zwei Kalibrationskurven, bezogen aufeinander, asymmetrisch verteilt sind. Ähnlich asymmetrisch verteilte Kalibrationskurven können in ähnlicher Weise in anderen binären Assaysystemen erhalten werden, z. B. unter Einbeziehung mikroskopischer Analyse von binären Teilchensystemen, der Verwendung von Mikrotiterplatten/Mikropartikelsystemen, Mikropartikel/Filtersystemen etc.
Bei der erläuterten durchflußzytometrischen Ausführungsform besitzt die Asymmetrie der Kalibrationskurve die Wirkung, daß für jede Analytkonzentration zwischen den Punkten A und B es ein einzigartiges und charakteristisches Paar von Fluoreszens-Intensitätswerten für die p1- und p2- Teilchen gibt, wodurch Konzentrationsbestimmungen über einen ausnehmend weiten dynamischen Arbeitsbereich, der sich stark über den Punkt C entsprechend dem Einsetzen der Sät tigungsbindung für die p1-Teilchen und den Punkt D entsprechend der maximalen Bindung des markierten Liganden an die p2-Teilchen erstreckt. Eine objektive Abschätzung der Analytkonzentration X kann als lineare Kombination der zwei Konzentrationen x&sub1; und x&sub2;, die durch die beobachtbaren Parameter r&sub1; und r&sub2; auf jeder der Standardkurven bestimmt werden, erhalten werden, wobei berücksichtigt wird, daß r&sub1; und r&sub2; in die doppelte Standardkurve als Paar passen. Eine verbesserte Abschätzung der Konzentration kann aus der Beziehung X = ax&sub1; + (1 - a)x&sub2; bestimmt werden, worin der Wert von a mit einer statistischen Theorie so bestimmt wird, daß die so erhaltene Varianz von X minimal ist.
Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß das erfindungsgemäße Verfahren effektiv eine praktische und positive Verwendung des Hook-Effekts in dem Ausmaß macht, daß dessen dynamischer Bereich im Gegensatz zu Verfahren aus dem Stand der Technik mit denjenigen der US-A- 4 595 661 und US-A-4 743 542, die die Wirkung begünstigen, verschieben oder verhindern, nutzt. So kann es möglich sein, einen Arbeitsbereich, der 7 bis 8 Dekaden umfaßt, zu erhalten.
Es ist klar, daß Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei denen unterscheidbare Teilchentypen verwendet werden, für den gleichzeitigen Assay auf eine Vielzahl von Analyten verwendet werden können, indem zuerst geeignete Anzahlen von markierten Liganden, Sätze von ersten Teilchentypen p1, p1', p1" etc. und Sätze von zweiten Teilchentypen p2, p2', p2" etc. verwendet werden, vorausgesetzt, daß alle einzelnen Teilchentypen p1, p1', p1", p2, p2', p2" etc. getrennt voneinander unterscheidbar sind, beispielsweise durchflußzytometrisch, wobei auf eine geeignete Anzahl von doppelten Standardkalibrationskurven für die verschiedenen p1/p2-, p1'/p2'-, p1"/p2"- usw. Teilchenpaarkombinationen Bezug genommen wird.
Solche Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch gegebenenfalls angepaßt werden, um die Gehalte der nichtspezifischen Bindung in einem Assayverfahren anzugeben. So ist es möglich, ein oder mehrere weiter unterscheidbare Teilchentypen, die mit einem Bindungspartner mit Null-Affinität für den Analyten/die Analyten, die bestimmt werden sollen, z. B. einen unwichtigen Antikörper, beschichtet sind, zu verwenden, wobei Signale, die aus solchen Teilchen stammen z. B. in einer durchflußzytometrischen Analyse die Menge des nicht-spezifisch daran gebundenen Analyts/Markers anzeigen. Es kann beispielsweise zweckdienlich sein, einen ersten solchen weiteren unterscheidbaren Teilchentyp (z. B. in einer relativ kleinen Mengen) mit den ersten Teilchentypen p1 und jeden weiteren Typen p1', p1" etc. und einen zweiten solchen weiter unterscheidbaren Teilchentyp (z. B. in einer relativ großen Menge, sofern erwünscht, im Überschuß oder im wesentlichen Überschuß, bezogen auf den markierten Liganden) mit dem zweiten Teilchentyp p2 und jeden weiteren Typen p2', p2" etc. zuzusetzen.
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei denen unterscheidbare Teilchentypen verwendet werden, können zusätzlich oder alternativ angepaßt werden, um die Menge des nichtgebundenen markierten Liganden, der nach der Reaktion der Probe mit einem oder mehreren Sätzen von p1- und p2-Teilchentypen verbleibt, anzuzeigen. Typischerweise ist dies mit der Zugabe von einem oder mehreren weiteren unterscheidbaren Teilchentypen p3 mit Affinität für den markierten Liganden/die markierten Liganden verbunden, z. B. nach der Zugabe der Teilchen vom Typ p1 und p2 oder gleichzeitig mit den Teilchen vom Typ p2 und anschließende Detektion der Signale aus diesen Teilchen vom Typ p3 sowie von den Teilchen vom Typ p1 und p2.
Es ist klar, daß die Menge des verbleibenden nichtgebundener markierten Liganden, der so nachgewiesen wird, in Beziehung zu der Analytkonzentration steht, die mit der Erhöhung der Analytkonzentration in einem Sandwichassay abnimmt und mit der Erhöhung der Analytkonzentration in einem kompetitiven Assay zunimmt. Folglich ist es möglich, eine Dreifach-Standardkalibrationskurve zu konstruieren, auf die sich die Signale der Teilchen p1, p2 und p3 beziehen, um die Analytkonzentration abzuschätzen, wodurch sogar eine noch größere Präzision erhalten wird als durch eine doppelte Standardkurve gewährleistet wird.
Ein Vorteil dieser Version des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die effektive Auswaschung des nichtgebundenen markierten Liganden durch die Teilchen vom Typ p3 die nichtspezifische Bindung unter Beteiligung des markierten Liganden verringert oder sogar im wesentlichen vollständig beseitigt, wodurch eine Beschränkung auf die Empfindlichkeit des Assaysystems bei niedrigen Analytkonzentrationen minimiert oder entfernt wird.
In Sandwichassays gemäß dieser Version des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Teilchen vom Typ p3 zweckdienlicherweise mit dem Analyten beschichtet werden, um die notwendige Affinität für den markierten Liganden zu ergeben. Es ist klar, daß der Analyt so gebunden werden sollte, daß die Bindungsstelle, für die der markierte Ligand Affinität besitzt, freibleibt, um damit zu reagieren. Es kann daher zweckdienlich sein, zuerst die Teilchen vom p3-Typ mit einem Bindungspartner zu beschichten, wie er für die Teilchen vom p1-Typ und/oder p2-Typ verwendet wird, wonach erlaubt wird, daß der Analyt an die so beschichteten Teilchen vom p3-Typ bindet, gegebenenfalls unter Verwendung eines Bindemittels oder eines anderen vernetzenden Mittels, um die Bindung zu stärken. Da der Bindungspartner und der markierte Ligand normalerweise Affinitäten für verschiedene Bindungsstellen auf dem Analyten besitzen, zeigt der auf den Teilchen vom p3-Typ gebundene Analyt so normalerweise auch Affinität für den markierten Liganden.
Alternativ können die Teilchen vom p3-Typ in einem Sandwichimmunoassaysystem mit einem anti-idiotypischen Antikörper beschichtet werden, der die Bindungsstelle imitiert, für die der markierte Ligand Affinität besitzt. In kompetitiven Assays gemäß dieser Version des erfindungsgemäßen Verfahrens können, wenn der markierte Ligand Affinität für den Bindungspartner besitzt, die Teilchen vom p3- Typ beispielsweise mit einem Material mit Affinität für den Markerteil des markierten Liganden beschichtet werden, wobei ein Beispiel hier ein Anti-FITC-Antikörper ist.
Im allgemeinen unterscheiden sich bei erfindungsgemäßen Assays, bei denen durchflußzytometrische Detektion verwendet wird, die verschiedenen Teilchentypen zweckdienlicherweise durch die Größe, da die herkömmlichen Durchflußzytometer die Teilchengröße auf der Basis der Menge der Lichtbrechung durch die Teilchen bestimmen können. Ein weiter Bereich von Typen von Teilchen mit einheitlicher Größe mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Durchmessern, reaktiven Oberflächengruppen etc. sind im Handel erhältlich, beispielsweise von Dyno Particles, Lillestrom, Norwegen, und geeignete Sätze solcher Teilchen können erfindungsgemäß verwendet werden. Da solche Teilchen in hohem Maße eine einheitliche Größe besitzen, z. B. eine relative Standardabweichung von nicht mehr als 1% bei Lichtbrechungsmessungen für eine Probenpopulation zeigen, kann ein wesentlicher Anteil solcher Teilchentypen vermischt und leicht als nichtüberlappende Populationen in einem durchflußmetrischen Lichtbrechungshistogramm identifziert werden.
Alternativ oder zusätzlich können das Coulter-Prinzip verwendet werden, bei dem Teilchen durch Unterschiede in der elektrischen Impedanz als Ergebnis von Unterschieden in der Teilchengröße unterschieden werden.
Wie vorstehend ausgeführt, ist es notwendig, wenn eine Vielzahl von Analyten gleichzeitig bestimmt werden soll, daß alle einzelnen Teilchentypen getrennt unterscheidbar sind, beispielsweise durchflußzytometrisch. Wenn so der gleiche markierte Ligand für alle Analyten verwendet wird, ist es notwendig, daß jeder individuelle Teilchentyp der verschiedenen Paare p1, p2 usw., alle Teilchen vom Typ p3 und alle Teilchen, die unwichtige Antikörper tragen, von den anderen Teilchentypen durch eine nachweisbar Teilchencharakteristik unterschieden werden können. Wenn so einerseits verschiedene Marker für jeden Analyten verwendet werden, erlaubt dies die Unterscheidung der verschiedenen Paare von Teilchentypen voneinander im Hinblick auf qualitative Unterschiede in den Signalen von den Markern, z. B. die Wellenlänge der Fluoreszenzsignale so, daß Teilchen mit identischer Größe gegebenenfalls für alle p1-, p1'-, p1"- etc. Teilchentypen verwendet werden können, wobei ein unterschiedlicher Satz von Teilchen mit identischer Größe für alle p2-, p2'-, p2"-Teilchentypen verwendet wird. In einigen Fällen, wenn der Analyt ein Antikörper mit einer definierten Spezifität ist, können verschiedene Marker, z. B. mit verschiedenen Fluoreszenzfarben, verwendet werden, um verschiedene Mengen verschiedener Subklassen des Analyten, z. B. Isotypklassen des spezifischen Antikörpers, zu bestimmen.
Die Beschichtung der festen Trägersysteme zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann unter Verwendung von beispielsweise Standardverfahren auf dem Fachgebiet durchgeführt werden. So sind beispielsweise repräsentative Techniken zur Beschichtung von Teilchensystemen mit einheitlicher Größe mit Antikörpern zur Verwendung in Immunoassayverfahren von Frengen et al. in Clin. Chem. 39 (1993), Seiten 2174 bis 2181 und den darin enthaltenden Literaturstellen und von Lindmo et al. in J. Immunol. Meth. 126 (1990), Seiten 183 bis 189 beschrieben.
Bevorzugte Marker zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren umfassen fluoreszierende Substanzen, wie sie üblicherweise bei der fluorometrischen Durchflußzytometrie verwendet werden, beispielsweise Fluorescein oder Phycoerythrin, oder Fluorochrome für verzögerte, zeitaufgelöste Fluoreszenz. Solche Marker können gegebenenfalls in Form von fluoreszierend gefärbten Mikrokügelchen vorliegen, wie z. B. Durchmesser von 0,10 Mikrometer besitzen, wie beispielsweise von Saunders et al. in Clin. Chem. 31, 2020 beschrieben. Andere Marker, die ein photometrisches Signal ergeben, umfassen Systeme auf Metallbasis, wie beispielsweise Sole von kolloidalen Goldteilchen. Marker, die signifikante Unterschiede in der elektrischen Impedanz ergeben können, bei Metallteilchen (z. B. Goldteilchen), können auch verwendet werden, um Signale zu ergeben, die nach dem Coulter-Prinzip nachgewiesen werden können, wobei Unterschiede im Teilchentyp dann durch größenabhängige Eigenschaften, wie Lichtbrechung, bestimmt werden.
Wie vorstehend ausgeführt wurde, wird der markierte Ligand normalerweise in einer vorbestimmten Menge verwendet und sollte so sein, daß er Affinität für den Bindungspartner im Falle eines kompetitiven Bindungsassays oder für den Analyten im Falle eines Sandwichassays besitzt. Bei dem zuletztgenannten Verfahrenstyp, der eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist, binden der markierte Ligand und der Bindungspartner bevorzugt an verschiedene Bindungsstellen (z. B. Epitope) auf dem Analyten.
Im allgemeinen kann der markierte Ligand der Probe vor, nach oder gleichzeitig mit dem auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartner beider Formen zugesetzt werden. Ein zweckdienliches Verfahren ist die Zugabe der Probe zu einem Gemisch des markierten Liganden und der er sten Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners, wobei die zweite Form dann nach einem vorbestimmten Zeitintervall zugesetzt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Bestimmung eines weiten Bereichs von Analyten verwendet werden, wobei das einzige beschränkende Erfordernis für einen speziellen Analyten die Existenz eines spezifischen Bindungspartners dafür ist, der an die Oberflächen von geeigneten festen Trägersystemen gekoppelt werden kann. Analyt- und Bindungspartnerpaare können beispielsweise aus jeder der folgenden Kombinationen ausgewählt werden, worin jedes Mitglied des Paares Analyt sein kann und der andere der Bindungspartner sein kann:
(a) Antigen und spezifischer Antikörper;
(b) Hormon und Hormonrezeptor;
(c) Hapten und Antihapten;
(d) Polynukleotid und komplementäres Polynukleotid;
(e) Polynukleotid und Polynukleotid-bindendes Protein;
(f) Biotin und Avidin oder Streptavidin;
(g) Enzym und Enzym-Cofaktor; und
(h) Lectin und spezifisches Kohlenhydrat.
Ein Mitglied aus einem der vorstehenden Paare, z. B. Biotin oder ein Hapten, kann, sofern geeignet, an irgendein anderes Molekül gebunden werden, und der so erhaltene zweite Analyt kann dann bestimmt werden, um indirekt die Konzentration des ersten Moleküls zu bestimmen.
Antigene sind eine Kategorie von bevorzugten Analyten zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die bevorzugten Bindungspartner dafür monoclonale Antikörper sind.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Kit zur Verwendung in dem Assay auf einen Analyten in einer Probe bereitgestellt, umfassend:
(i) zwei getrennte Formen des festen Trägersystems, die jeweils identische Bindungspartner mit Affinität für den Analyten tragen; und
(ii) einen markierten Liganden mit Affinitäten für den Analyten oder Bindungspartner;
wobei die zwei Formen der festen Trägersysteme so sind, daß die Mengen der markierten Liganden, die an jede Form in einem Assayverfahren gebunden werden, unabhängig voneinander bestimmt werden können.
Die zwei Formen des festen Trägersystems umfassen vorteilhafterweise Sätze von monodispersen Teilchen, z. B. mit verschiedenen Größen, die daher mit Techniken, wie Durchflußzytometrie, unterschieden werden können. Solche Teilchen können mit einem ausgewählten Bindungspartner beschichtet werden oder können Absorptionsstellen oder reaktive Gruppen auf ihren Oberflächen besitzen, um die Absorption oder Kopplung an einen Bindungspartner der Wahl zu erlauben. In einer bevorzugten Version des Kits tragen die zwei Formen des festen Trägersystems den gleichen Bindungspartner. In anderen Versionen können die Bindungspartner unterschiedlich sein.
Die erfindungsgemäßen Kits können gegebenenfalls eine Vielzahl von Paaren von festen Trägersystemen, bevorzugt verschiedene Typen von monodispersen Teilchen, enthalten, um den gleichzeitigen Test auf eine Vielzahl von Analyten in einer Probe zu erlauben.
Erfindungsgemäße Kits können alternativ oder zusätzlich ein oder mehrere weiter unterscheidbare feste Trägersysteme enthalten, die einen Bindungspartner mit Null-Affinität für den Analyten oder Material mit Affinität für den markierten Liganden (wie z. B. vorstehend unter Bezugnahme auf die Teilchen vom Typ p3 beschrieben) tragen oder dem Tragen eines solchen Moleküls angepaßt sein.
Das folgende nichtbeschränkende Beispiel soll die Erfindung erläutern.

Beispiel

Der Testanalyt war α-Fetoprotein (AFP), wobei die Quelle ein Patientenserum war, von dem am Norwegischen Radium Hospital ein Gehalt von 3 · 10&sup6; kIE/l bestimmt wurde. Eine Reihe von Standards bekannter Konzentration wurden daraus durch Reihenverdünnung mit Assaypuffer (siehe nachstehend) hergestellt.
Zwei Formen der auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartner umfaßten makroporöse Acrylatteilchen mit Oberflächenepoxygruppen und Durchmessern von 6,5 bzw. 7,5 um, entwickelt von SINTEF, Trondheim, Norwegen, und die nachstehend jeweils als MP 6,5 und MP 7,5 bezeichnet werden. Beide Teilchentypen wurden mit einem monoclonalen Maus-Antikörper K57, der am Norwegischen Radium Hospital etabliert wurde und Affinität für ein Epitop von AFP hatte, gemäß dem Verfahren, das von Frengen et al. in Clin. Chem. 39 (1993), Seiten 2174-2181 beschrieben ist, beschichtet, wobei 150 ug K57/mg Teilchen verwendet wurden.
Der markierte Ligand wurde aus einem monoclonalen Maus-Antikörper K52, der am Norwegischen Radium Hospital etabliert wurde und Affinität für ein anderes Epitop von AFP hatte, hergestellt. Dieser wurde mit Biotin unter Verwendung eines molaren Verhältnisses von Biotin zu Antikörper von 10 : 1 umgesetzt, und der so erhaltene biotinylierte K52 (in einer Konzentration von 1,9 mg/l) wurde mit Streptavidin-R-Phycoerythrin (Becton Dickinson) in einem Verhältnis von 6 : 1 Vol./Vol. vermischt.
Der bei dem Verfahren verwendete Assaypuffer war phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die 10 g Rinderserumalbumin, 1 g Natriumazid und 1 ml Tween 20 pro Liter enthielt.
In jeder der Reihen von Assay-Reagensröhrchen wurden 40 ul markierter Antikörper und 100 ul Assaypuffer mit 20 ul Serumprobe vermischt. Nach einem Minimum von 15 Minuten Inkubation wurden 40 ul einer Suspension von MP 6,5, verdünnt mit Assaypuffer, bis zu einer Konzentration von 46 mg/l (etwa 100.000 Teilchen/ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde in einem horizontalen Rotationsschüttler bei Raumtemperatur inkubiert, wonach 40 ul einer Suspension von MP 7,5, verdünnt mit Assaypuffer bis zu einer Konzentration von 900 mg/l, zugesetzt wurden. Die Röhrchen wurden weiter auf dem horizontalen Rotationsschüttler inkubiert. Kleine Volumina der Inhalte jedes Röhrchens wurden mit dem Durchflußzytometer nach 1- und 2stündiger Inkubation ohne vorherige Waschung gemessen.
Die durchflußzytometrische Fluoreszenz- und Lichtbrechungsmessungen wurden unter Verwendung eines Skatron-Argus-Durchflußzytometers, das mit einer 75 Watt Quecksilber Xenon-Lampe ausgestattet war, durchgeführt. Der verwendete Filterblock ergab eine Anregung im Wellenlängenbereich von 510 bis 560 nm und Fluoreszenzmessungen im Bereich von 590 bis 640 nm. Teilchen-assoziierte Lichtbrechungs- und Fluoreszenzsignale wurden gleichzeitig gemessen und als korrelierte Zwei-Parameter-Histogramme aufgezeichnet. Durch Beschränken auf geeignete Fenster in dem Lichtbrechungshistogramm wurden Fluoreszenzs-Intensitäts-Histogramme der verschiedenen Teilchentypen erhalten. Der mittlere Kanal des logarithmischen Fluoreszenzhistogramms wurde als Meßwert für die Teilchen-assoziierte Fluoreszenz genommen.
Die gleichzeitig gemessenen Standardkurven für MP 6,5- (p1)-Teilchen und MP 7,5-(p2)-Teilchen nach 1- und 2stündiger abschließender Inkubation sind in der Fig. 2A gezeigt, die Ergebnisse für MP 6,5 nach 1 Stunde abschliessender Inkubation sind durch Kreise dargstellt, die Ergebnisse für MP 65 nach 2stündiger abschließender Inkubation sind durch Sternchen dargestellt. Die Ergebnisse für MP 7,5 nach 1stündiger abschließender Inkubation sind durch Quadrate dargestellt, und die Ergebnisse für MP 7,5 nach 2stündiger Endinkubation sind durch Kreuze dargestellt. Andere Daten (nicht gezeigt), die verschiedene Inkubationszeiten nach Zugabe der MP 7,5-(p2)-Teilchen zeigen, bestätigen den effektiven blockierenden Effekt, den diese Zugabe auf die weitere Bindung des Analyts an p1 besitzt, und zeigen auch, daß das Gleichgewicht rasch nach Zugabe von p2 erhalten wird.
Die Ergebnisse in Fig. 2A zeigen, daß die Bindung sowohl an MP 6,5- als auch an MP 7,5-Teilchen über diese Zeitintervalle für AFP-Konzentrationen unter 30.000 kIE/l praktisch konstant ist. Bei höheren Analytkonzentrationen erhöhten verlängerte Inkubationsausbeuten mäßig die Bindung an beide Teilchentypen.
Die Präzisionsprofile für die MP 6,5- und MP 7,5-Teilchen, wie in Fig. 2B gezeigt, sind ausgedrückt als Varianzkoeffizienten (CV):
CV = σRi*[δ(lnD)/δRi]*100 [%]
worin Ri die gemessene Antwort des Teilchens (i), ausgedrückt als Kanalnummer der logarithmischen Fluoreszenzintensität, ist, σRi die entsprechende Standardabweichung, erhalten aus zwei Parallelassays für jeden Standard unter Verwendung einer 1stündigen abschließenden Inkubation, ist und D die Dosis bezeichnet (i. e. die Konzentration an AFP).
Die Präzisionsprofile für die MP 6,5- und MP 7,5-Teilchen zeigen, daß jede oder beide Standardkurven einen CV-Wert < 10% über den Konzentrationsbereich < 0,6 - > 3 · 10&sup6; kIE/l AFP zeigen.
Die niedrige Konzentration von MP 6,5, die verwendet wurde, gewährleistet eine hohe Empfindlichkeit. Die Verwendung von MP 7,5-Teilchen in 20fach höherer Konzentration ergibt eine schlechtere Empfindlichkeit, aber die Antwort, bezogen auf dieses Teilchen, steigt über die AFP- Konzentration hinaus, bei der die MP 6,5-Standardkurve abzunehmen beginnt. So ergeben die beiden Standardkurven zusammen eine zweifelsfreie Bestimmung von AFP-Konzentrationen über den Bereich < 0,6 - > 3 · 10&sup6; kIE/l.

Claims

1. Verfahren zum Test auf einen Analyten in einer Probe, wobei man die Probe mit zwei unabhängig voneinander bestimmbaren Formen eines auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners mit Affinität für den Analyten und mit einem markierten Liganden mit Affinität für den Analyten oder den Bindungspartner umsetzt, wobei die zwei unabhängig voneinander bestimmbaren Formen des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners so sind, daß Signale bezüglich der so erhaltenen zwei Formen des markierten, einen Liganden tragenden auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners unabhängig voneinander bestimmt werden können, wodurch die Analytkonzentration unter Bezugnahme auf eine doppelte Standardkalibrationskurve erhalten werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit der ersten Form des auf dem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners und nach einer Zeitspanne mit der zweiten Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die festen Träger für die zwei Formen des auf dem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners zwei unterscheidbare Typen von monodispersen Teilchen umfassen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Typen von monodispersen Teilchen aufgrund ihrer Größe unterscheidbar sind.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Typen von monodispersen Teilchen durch Durchflußcytometrie nachgewiesen werden.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners in einer niedrigen Menge, bezogen auf die zweite Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners, verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Form des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners im Überschuß, bezogen auf den markierten Liganden, verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere weiter unterscheidbare Typ(en) von monodispersen Teilchen, die mit einem Bindungspartner beschichtet sind, mit Null-Affinität für den Analyten auch zugesetzt werden, und davon abgeleitete Signale verwendet werden, um ein Maß für die nichtspezifische Bindung des Analyten und/oder des markierten Liganden daran ergeben.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere weiter unterscheidbare Typ(en) von monodispersen Teilchen, die mit Material mit Affinität für den markierten Liganden beschichtet sind, ebenfalls zugesetzt werden, und davon abgeleitete Signale verwendet werden, um ein Maß für den verbleibenden nicht gebundenen markierten Liganden oder den nicht gebundenen markierten Ligand-Analyt-Komplex zu ergeben.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von Ana lyten gleichzeitig unter Verwendung einer geeigneten Anzahl von markierten Liganden und Sätzen von unterscheidbaren Teilchentypen bestimmt wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markerverbindung des markierten Liganden eine fluoreszierende Substanz ist.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ein Antigen ist, und der Bindungspartner dafür ein monoclonaler Antikörper ist.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der gleiche Bindungspartner in den zwei unabhängig voneinander bestimmbaren Formen des auf einem festen Träger aufgebrachten Bindungspartners verwendet wird.

13. Kit zur Verwendung in einem Test auf einen Analyten in einer Probe, umfassend:

(i) zwei getrennte Formen von festen Trägersystemen, die jeweils identische Bindungspartner mit Affinität für den Analyten tragen; und

(ii) eine markierten Liganden mit Affinität für den Analyten oder den Bindungspartner,

wobei die zwei Formen der festen Trägersysteme so sind, daß die Mengen des markierten Liganden, die an jede Form in einem Assayverfahren gebunden werden, unabhängig voneinander bestimmt werden können.

14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei getrennten Formen der festen Träger systeme Sätze von unterscheidbaren monodispersen Teilchen umfassen.

15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Sätze von monodispersen Teilchen durch die Größe unterscheidbar sind.

16. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 15, enthaltend ein oder mehrere weitere unterscheidbare feste Trägersystem(e), die einen Bindungspartner mit Null-Affinität für den Analyten tragen oder dafür angepaßt sind.

17. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehrere weitere unterscheidbare feste Trägersystem(e) umfaßt, die Material mit Affinität für den markierten Liganden tragen oder dafür angepaßt sind.

18. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 17, enthaltend eine Vielzahl von Paaren von getrennten Formen von festen Trägersystemen (i).