DE69405866T2 - Verfahren und analytische vorrichtung für gleichzeitigen immunoassay - Google Patents
Verfahren und analytische vorrichtung für gleichzeitigen immunoassayInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine analytische Vorrichtung für den gleichzeitigen Nachweis von Chlamydia trachomatis (CT), Neisseria gonorrheae (NG) und Mycoplasma (M) aus einer einzigen Probe.
- Die Diagnose der pathogenen Mittel, die für sexuell übertragene Erkrankungen (STD), wie etwa Gonorrhea, Urethritis und ähnliche Krankheiten verantwortlich sind, erfordert gegenwärtig eine vom Infektionsbereich genommene Probe sowie eine getrennte Analyse für jedes Pathogen, dessen Gegenwart festgestellt werden soll.
- Die Probenahme des Materials für die Analyse wird durch einen Abstrich des vaginalen oder urethralen Bereichs vorgenommen.
- Diese Anwendung kann, wenn sie wiederholt wird, Unannehmlichkeiten wie etwa Entzündungen oder Reizungen der Schleimhäute verursachen, mit denen der Tupfer in Kontakt kommt und sie ist für den Patienten unangenehm.
- Da die oben erwähnten Pathogene die gleichen Organe infizieren und in Verbindung stehen können (Komfektionen), ist es klar, daß die Verfügbarkeit eines Verfahrens und einer analytischen Vorrichtung, die den gleichzeitigen Nachweis von CT, NG, M in einer einzelnen endocervicalen oder urethralen Probe eine willkommene Verbesserung sein würde.
- Dies vermeidet auch den Verdruß mehrere Abstriche vom gleichen Patienten nehmen zu müssen.
- Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 264 036 (Abbott 20.4.88) beschreibt eine Vorrichtung und ein immunologisches Verfahren zum getrennten Nachweis der Gegenwart von CT und NG.
- Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 444 303 A2 (Becton Dickinson 04.09.91) beschreibt ein immunologisches Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis, welches auf einem Durchflußsystem basiert, das einen Extraktionsschritt mit Proteinase K als Extraktionsmittel umfaßt.
- WO 87/06620 (05.11.87) offenbart einen Kit für den gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Mitteln, die für sexuell übertragene Erkrankungen verantwortlich sind, umfassend eine Vorrichtung, die mindestens einen monoklonalen Antikörper aufweist, der für jedes nachzuweisende Mittel selektiv ist und auf räumlich getrennten Reaktionszonen absorbiert ist. Die das infektiöse Mittel (die infektiösen Mittel) enthaltende biologische Probe wird, gemäß diesem Dokument des Standes der Technik, direkt mit der Vorrichtung in Kontakt gebracht, auf der die verschiedenen monoklonalen Antikörper immobilisiert sind, wodurch die diagnostische Gesamtempfindlichkeit herabgesetzt wird.
- Tatsächlich sind nur Zelloberflächenantigene detektierbar und es ist bekannt, daß diese Antigene leicht beträchtliche Mutationen als Antwort auf eine Vielzahl von Bedingungen eingehen mit sich daraus ergebenden Veränderungen der Bindungsaffinität zu den für die Analyse verwendeten Antikörpern. Darüber hinaus ist es allgemein als wünschenswert anerkannt, die Antigene aus den Organismen zu extrahieren um die Assaysensitivität zu erhöhen. Siehe z.B. US 5,089,389.
- Aus diesen Gründen und im Hinblick auf die beträchtlichen Unterschiede, die in den chemischen und strukturellen Eigenschaften der Antigene der Organismen vorliegen, die für sexuell übertragene Erkrankungen verantwortlich sind, ermöglichen die Verfahren des Standes der Technik keine sensitive und verläßliche Diagnose von mehreren Antigenen mit nur einer Probenahme.
- Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden, daß Antigene von genetisch und immunologisch verschiedenen Mikroorganismen, wie etwa Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrheae und Mycoplasma gleichzeitig in einer biologischen Probe nachgewiesen werden können, die z.B. durch Abkratzen oder Abtupfen des Genitalbereichs erhalten wird, durch Unterziehen der Probe einem Inkubationsschritt in einem geeigneten Reaktionsmedium, welches Proteinase K und eine Lipase umfaßt, gefolgt von einem Festphasenimmunoassay.
- Das Proteinase K und eine Lipase enthaltende Extraktionsmedium setzt wirksam die Antigene von so unterschiedlichen Mikroorganismen wie CT-NG-M von ihren jeweiligen Membranen frei ohne ihre Strukturen zu modifizieren, und erlaubt dadurch die Erkennung und Bindung dieser chemisch unterschiedlichen Antigene durch ihre jeweiligen Antikörper.
- Der pH des Extraktionsmediums wird geeigneterweise auf Werte im Bereich von 7,5 bis 9,0 gepuffert.
- Die vorliegende Erfindung stellt deshalb ein Extraktionsreagenz zum Extrahieren von Antigenen von Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrheae und Mycoplasma aus einer biologischen Probe, umfassend Proteinase K, eine Lipase und Puffermittel bereit.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für den gleichzeitigen Nachweis von Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrheae und Mycoplasma bereit umfassend:
- a) Inkubieren der biologischen Probe in einem Reaktionsmedium, umfassend Proteinase K und eine Lipase;
- b) Inkubieren, welches auf einen spezifischen Filtrationsschritt folgen kann, des Reaktionsgemisches in a) mit einer drei Antikörperkonjugate enthaltenden Lösung, wobei jedes davon spezifisch für eines der Antigene ist, die spezifisch für eines der drei zu untersuchenden Pathogene sind;
- c) Inkontaktbringen der Probe in b) mit einem Festphasenträger, auf dem jeder der drei Antikörper, die für die zu untersuchenden Antigene spezifisch sind, immobilisiert worden war.
- In Schritt a) wird das Enzym (werden die Enzyme) typischerweise in einer 0,9 %-igen Natriumchloridsalzlösung suspendiert, welche Calcium&spplus;&spplus;-Ionen und ein Puffersystem enthält, um die pH-Werte von etwa 7,5 bis etwa 9,5 aufrechtzuerhalten, z.B. Tris pH 8. Die Mengen und Konzentrationen der Enzyme sind nicht besonders kritisch: 0,5 bis 10 mcg des Enzyms sind im allgemeinen ausreichend. Die Inkubation wird bei Temperaturen von 20 bis 50 ºC, bevorzugt bei Raumtemperatur etwa 5 bis 30 Minuten, bevorzugt etwa 10 Minuten, ausgeführt.
- In Schritt b) können monoklonale oder polyklonale Antikörper, welche mit Enzymen, Chromophoren, gefärbten Partikeln oder Schwermetallen konjugiert sind, als Reagenzien verwendet werden.
- Mit Goldpartikeln konjugierte monoklonale Antikörper, die keine Entwicklungsschritte erfordern, sind bevorzugt. Im Falle eines positiven Ergebnisses wird die Gegenwart des Immunokomplexes (Antikörper (Ab) konjugiertes-Antigen (Ag)) durch eine rote Farbe in Übereinstimmung mit dem spezifischen immobilisierten Antikörper (siehe Figur 3) offenbart.
- Die Konjugierung mit kolbidalen Goldpartikeln ist heute eine übliche Technik und viele kommerziell erhältliche Immunoassays machen Gebrauch davon.
- Die gegen die spezifische Antigene von CT, NG, M gerichteten Antikörper werden naheliegenderweise so gewählt, daß Interferenzen aufgrund von Kreuzreaktionen vermieden werden. Die Antikörper in Schritt c) können gegen das gleiche Antigen oder Epitop gerichtet sein.
- Erfindungsgemäß können kommerziell erhältliche Antikörper Anti-NG, CT, M nach Überprüfen des Fehlens von Kreuzreaktionen gegen andere Pathogene von sekundärer Bedeutung (Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureaus - Escherichia coli) und Bakterienstämme, die üblicherweise den genital-urinären Bereich besiedeln, durch immunoenzymatischen oder immunofluoreszierenden Assay, verwendet werden.
- Die von den Antikörpern erkannten Epitope wurden durch Western-Blot-Techniken identifiziert.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann geeigneterweise durch eine Vorrichtung ausgeführt werden, umfassend einen Saugbestandteil, um die in Schritt b) erhaltene Flüssigkeit aufzusaugen und eine reaktive Membran, die den Saugbestandteil überlagert, auf der primäre Einfangantikörper Anti-NG, CT, M zuvor in verschiedenen, gut abgegrenzten Bereichen immobilisiert worden sind.
- Erfindungsgemäß kann dieses Verfahren entweder ein Immunofiltrations- oder ein Immunochromatographiesystem verwenden.
- Die Erfindung wird nun unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, worin:
- Figur 1 eine Ansicht des Querschnitts der Vorrichtung ist;
- Figur 2 eine Aufsicht der Vorrichtung von Figur 1 ist;
- Figur 3 die Auswertebereiche der Vorrichtung von Figur 1 im Fall eines positiven Ergebnisses für einen oder mehrere der zu analysierenden Pathogene zeigt;
- Figur 4 ein Querschnitt eines Streifens für einen Immunochromatographieassay ist;
- Figur 5 eine Aufsicht des Streifens von Figur 4 ist;
- Figur 6 die Auswertebanden des Streifens von Figur 4 im Fall eines positiven Ergebnisses für einen oder mehrere der zu analysierenden Pathogene zeigt.
- Im Zusammenhang mit Figur 1 zeigt die Bezugsnummer 1 eine halbharte flexible Struktur (im allgemeinen in einem Kunststoffmaterial), welche innen eine dicke Filterschicht (2) enthält, auf deren oberer Oberfläche eine Membran aus Nitrocellulose (3) oder einem anderen, ähnlichen Material angebracht ist.
- Der obere Teil (4) dieses Rahmens zeigt eine runde zentrale Öffnung (5) mit konvergierenden Wänden in der Form eines Trichters (6), welche die reaktive Membran exponiert und dadurch das Auswertefenster begrenzt.
- In Figur 2 zeigen die Bezugsnummern 7, 8, 9 die Bereiche, in denen Antikörper Anti-CT, NG, M immobilisiert worden sind.
- Für die Einfachheit der Verwendung können die in dieser Beschreibung zur Bezeichnung der Pathogene verwendeten Initialen direkt auf der Vorrichtung neben dem entsprechenden Bereich angezeigt werden.
- Die Bezugsnummer 10 zeigt eine eingebaute Kontrolle auf, in der ein Anti-Fc-Antikörper immobilisiert worden ist und die in der Lage ist, das Fc-Fragment von allen in Schritt b) des Verfahrens verwendeten Tracern zu binden.
- Dieser Bereich gibt immer ein gefärbtes Ergebnis, wenn der Test korrekt durchgeführt wurde (rot, wenn mit Goldpartikeln konjugierte Antikörper verwendet werden).
- Im Zusammenhang mit Figur 4 zeigt die Bezugsnummer 1 einen adhäsiven Kunststoffträger, auf den drei verschiedene Festphasen, die an ihren Ecken überlappen, aufgeklebt wurden. Punkt 2 zeigt die Goldkonjugate und die Punkte 3-4-5 stellen die drei immobilisierten Einfang-Anti-CT-NG-M-Antikörper dar.
- Bezüglich Figur 5 zeigt die Bezugszahl 6 das Trockenreagenz, das aus dem Cocktail der drei Konjugate, welche reversibel auf die untere Membran (7) adsorbiert sind, dar. Das zentrale Auswertefenster (8) ist aus einer reaktiven Nitrocellulosemembran gemacht, auf die die primären Einfangantikörper-Anti-CT-NG-M in Form von gut abgegrenzenten Banden (10-11-12) adsorbiert wurden.
- Die chemischen Bedingungen des Einsetzens jedes Antikörpers sowie der Überschichtung der Membran sind identisch mit dem, was in Punkt 1 von Beispiel 1 berichtet wird.
- Die obere Schicht (9) ist ein gewöhnliches Filterpapier mit einer sehr hohen Absorptionskapazität, um den Fluß schneller zu machen.
- Zwei Versionen der gleichen analytischen Vorrichtung sind möglich: ein vertikaler und ein horizontaler Streifen.
- Im ersten Fall findet aufgrund von Kapillarwirkung ein vertikaler Fluß statt, sobald der Streifen in die Probe (welche zuvor wie in Punkt 2 von Beispiel 1 berichtet, extrahiert wurde) gelegt wird.
- Im zweiten Fall wird die Probe direkt auf eine spezifische Zone des Streifens aufgebracht.
- Wenn eines der Antigene in der Probe vorliegt, wird es zunächst das entsprechende Konjugat binden und der Immunokomplex wird dann, während er wandert, an der entsprechenden Bande eingefangen.
- Figur 6 zeigt, daß im Fall eines positiven Ergebnisses für ein oder mehrere Pathogene eine oder mehrere rote Linien (13-14- 15) in dem Auswertefenster auftreten, wenn goldmarkierte Antikörper verwendet werden. Dies bedeutet, daß der Sandwich Antikörper-Antigen-Antikörper* (Ab-Ag-Ab*) gebildet wurde und dieser somit einen Infektions- oder Koinfektionszustand anzeigt.
- Die Figuren 6a - 6b - 6c zeigen ein positives Ergebnis jeweils für CT-NG-M an, während die Figuren 6d - 6e zwei Fälle von Koinfektion zeigen, auch wenn viele andere Kombinationen von mehrfachen Infektionen gefunden werden können, jeweils für CT- NG und CT-M.
- Im Fall eines negativen Ergebnisses erscheinen die Linien vollständig farblos.
- Offensichtlich veranschaulichen die obigen Konfigurationen lediglich beispielhaft eine der vielen Variationen, die sich ein Fachmann vorstellen kann.
- Die erfindungsgemäße Vorrichtung stellt bevorzugt eines der Elemente eines diagnostischen Kits dar mit dem Ziel, die Ausführung des Tests einfacher zu machen.
- Ein diagnostischer Kit für den gleichzeitigen Nachweis von CT, NG, M umfaßt, zusammen mit einer Vorrichtung wie der oben erwähnten, ein Gemisch der drei konjugierten Antikörper, ein oder mehrere enzymatische Reagenzien für die Extraktion der Antikörper aus dem Tupfer und gegebenenfalls Pufferlösungen und andere Mittel oder Vorrichtungen, die geeignet sind die Ausführung des Tests zu vereinfachen. Die Reagenzien in dem Kit können entweder in flüssiger oder in der sogenannten "trockenchemischen" Form, d.h. auf geeignete Träger absorbiert oder immobilisiert vorliegen.
- Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung weiter.
- - Aufbringen der Lösungen der monoklonalen Antikörper Anti- CT, NG, M und Anti-Fc (Kontrolle).
- In Übereinstimmung mit der reaktiven Zone der Nitrocellulosenmembran werden die monoklonalen Einfangantikörper der Überschrift mit einer geeigneten Abgabevorrichtung in definierten und gesonderten runden Flecken aufgebracht. Diese Protein A affinitätsgereinigten Antikörper in einem Phosphatpuffer pH = 7,2 werden vor der Beschichtung beurteilt, um durch einen immunenzymatischen Assay das Fehlen von Kreuzreaktionen gegen inaktivierte Suspensionen von anderen sekundären Pathogenen sowie von zur normalen Flora gehörenden Stämmen zu überprüfen.
- Ein Volumen von etwa 1,5 bis 2 mcl mit der Konzentration von 0,8 bis 1,2 mg Ab/ml in 0,03 M Boratpuffer pH 4 bis 5 wird für jede Antikörperlösung aufgebracht.
- Als Abgabevorrichtung kann entweder ein Kapillare oder eine Meßpipette verwendet werden.
- Nach der radialen Diffusion der Antikörperlösung wird die Membran in einem Inkubator oder unter einem Heißluftstrom getrocknet.
- Anschließend wird das Überschichten der gesamten Oberfläche der exponierten Festphase durch Zugabe einer Lösung von 0,02 M Tris mit 1 % BSA, 5 % Succhrose, 0,3 % Tween 20, 0,05 % Natriumazid pH 8,2 und nachfolgendes Trocknen wie zuvor beschrieben ausgeführt. Das Überschichten verhindert unspezifische Kreuzreaktionen.
- - Der vom Genitalbereich (vaginal oder urethral) genommene Tupfer wird zuerst in einem Extraktionsreagenz, welches eine physiologische Salzlösung (NaCl 0,9 %), 0,005 M CaCl&sub2;, Proteinase K (1 mcg/Test) vorverdünnt in 0,05 M Tris mit 0,005 M CaCl&sub2; pH 8 und Lipase (10 U/Test) enthält, in einem geeigneten Teströhrchen für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Die Enzyme wirken durch Zerstören der Bakterienmembranen, wodurch sie die spezifischen chemisch verschiedenen Antigene freibekommen, so daß sie mit den Antikörpern reagieren können.
- Die Suspension wird dann durch Zugabe einer Lösung von schließlich 1,5 % NaCl neutralisiert, eine Bedingung, um die Ab-Ag-Reaktion zu optimieren.
- Der Tupfer wird also gegen die Wände des Teströhrchens gedrückt; dieser Vorgang wird erleichtert, da das Röhrchen flexible Kunststoffwände aufweist, welche die Freisetzung der in das Baumwollende des Tupfers eingesaugten Flüssigkeit ermöglichen. Der Tupfer wird beseitigt und die Probe ist fertig für den Testschritt.
- Oben auf dem Teströhrchen, welches die extrahierte Probe enthält, wird ein eine Tropfvorrichtung angebracht, in die ein Filter (Porosität 1 Mikrometer) eingesetzt wird, um die zellulären Aggregate, die den Test stören könnten, zurückzuhalten.
- - Die gefilterte Suspension wird mit einer Cocktaillösung der drei Antikörper Anti-CT, NG, M konjugiert mit Goldpartikeln für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Die drei Tracer werden in 0,02 M Tris mit 1 % BSA, 5 % Sucrose, 0,3 % Tween 20, 0,05 % Natriumazid pH 8,2 auf ein Endvolumen von 0,1 bis 0,2 ml verdünnt und sie weisen alle die gleiche Konzentration auf, welche durch Auswerten der optischen Dichten bei der Wellenlänge von 520 Nanometer gemessen wird.
- Am Ende der 5 Minuten wird die Lösung direkt auf die Membran getropft, was einen vertikalen Fluß durch die Membran festlegt.
- In Gegenwart des Antigens (positives Ergebnis für eines der drei nachweisbaren Pathogene) wird das Antigen, das im vorigen Schritt durch den spezifischen Tracer gebunden wurde, in Übereinstimmung mit dem Fleck, auf dem der spezifische primäre Einfangantikörper immobilisiert worden ist, festgehalten werden, was ein rotes Signal ergibt.
- Bei Abwesenheit des Antigens bildet sich kein Immunkomplex und das Konjugat gelangt durch die Membran, wobei der Fleck vollständig farblos bleibt.
- Die eingebaute Kontrolle ergibt immer eine rote Farbe, da der Anti-Fc-Antikörper in der Lage ist, das Fc-Fragment der drei Goldkonjugate zu binden, wodurch die Richtigkeit der Testdurchführung sichergestellt wird.
- Die rosa-rote Farbentwicklung in einem oder mehreren Flecken zeigt ein positives Ergebnis für das entsprechende pathogene Mittel an, wodurch ein Zustand einer Infektion oder von mehreren Infektionen (siehe Figur 3-a, b, c, d, e, f) angezeigt wird.
- Die Intensität der Farbe ist proportional zu der Bakterienbeladung.
- Das negative Ergebnis ist als farblose weiße Flecken sichtbar.
Claims (18)
1. Extraktionsreagenz zum Extrahieren von Antigenen von
Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrheae und
Mycoplasma aus einer biologischen Probe, umfassend
Proteinase K, eine Lipase und Puffermittel.
2. Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von Chlamydia
trachomatis, Neisseria gonorrheae und Mycoplasma,
dadurch gekennzeichnet,
daß die biologische Probe einem Extraktionsschritt durch
das Reagenz nach Anspruch 1 unterworfen wird, wobei
dieser Schritt von einem Festphasen-Immunoassayschritt
gefolgt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2 für den gleichzeitigen Nachweis
von zwei Pathogenen, ausgewählt aus Chlamydia
trachomatis, Neisseria gonorrheae und Mycoplasma.
4. Verfahren für den gleichzeitigen Nachweis von Chlamydia
trachomatis, Neisseria gonorrheae und Mycoplasma,
umfassend:
a) Inkubieren der biologischen Probe in einem
Reaktionsmedium, umfassend Proteinase K und eine
Lipase;
b) Inkubieren, welches auf einen spezifischen
Filtrationsschritt folgen kann, des
Reaktionsgemisches in a) mit einer drei
Antikörperkonjugate enthaltenden Lösung, wobei jedes
davon spezifisch für eines der Antigene ist, die
spezifisch fur eines der drei zu untersuchenden
Pathogene sind;
c) Inkontaktbringen der Probe in b) mit einem
Festphasenträger, auf dem jeder der drei Antikörper,
die für die zu untersuchenden Antigene spezifisch
sind, immobilisiert worden war.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Nachweis durch
Immunfiltration ausgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Nachweis durch
Immunchromatographie ausgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Nachweis durch einen
immunenzymatischen Assay ausgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche worin
die Antikörperkonjugate mit Goldpartikeln oder anderen
Schwermetallen markierte Antikörper sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, worin die
Antikörperkonjugate mit Chromophoren markierte Antikörper
sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, worin die
Antikörperkonjugate mit Enzymen konjugierte Antikörper
sind.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
umfassend eine eingebaute Kontrolle, in der ein Anti-Fc-
Antikörper immobilisiert worden ist.
12. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Nachweis in einer
Vorrichtung ausgeführt wird, umfassend einen
Saugbestandteil für die flüssige Probe, welche von dem
Extraktionsschritt kommt, und eine reaktive Membran,
benachbart zu dem Saugelement, auf welche primäre
Einfangantikörper, welche selektiv für die zu
analysierenden Mikroorganismen sind, in definierten und
gesonderten Abschnitten immobilisiert worden sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Vorrichtung die
Form eines Streifens für einen Immunchromatographieassay
hat.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Streifen entweder
einen vertikalen Fluß oder einen horizontalen Fluß der
flüssigen Probe erlaubt.
15. Diagnostischer Kit für den gleichzeitigen Nachweis von
Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrheae und
Mycoplasma aus einer einzigen biologischen Probe,
umfassend eine Vorrichtung wie in den Ansprüchen 12 bis
14 beschrieben, ein Extraktionsreagenz, das Proteinase K
und eine Lipase enthält, und die entsprechenden
konjugierten Antikörper, nämlich Anti-Chlamydia
trachomatis, Anti-Neisseria gonorrheae und Anti-
Mycoplasma.
16. Kit nach Anspruch 15 für den gleichzeitigen Nachweis von
zwei Pathogenen, ausgewählt aus Chlamydia trachomatis,
Neisseria gonorrheae und Mycoplasma.
17. Kit nach Anspruch 15 oder 16, worin die konjugierten
Antikörper mit Goldpartikeln konjugierte Antikörper sind.
18. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, worin die
Reagenzien in flüssig- oder trockenchemischer Form
vorliegen.
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