CN103018444B - ***抗原检测方法及检测试剂盒和该试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种***抗原检测方法,还公开了一种用于检测***抗原的检测试剂盒及制备该检测试剂盒的方法。所述***抗原检测方法包括以下步骤:a、将胶体金标记的***抗体载于玻璃纤维载体上;b、取裂解后的待测标本滴于胶体金标记的***抗体的载体上。所述检测试剂盒包括盒体(1)及***抗原金标检测卡(2),所述盒体(1)内存放有裂解液A(3)和裂解液B(4),所述盒体(1)上设置有与所述***抗原金标检测卡(2)相适配的加样孔(11)和观察孔(12)。制备该检测试剂盒的方法是先制成所述***抗原金标检测卡(2),然后再进行组装。本发明应用于医学领域。
Description
技术领域
本发明涉及***抗原检测方法,以及用于该方法的检测试剂盒和该试剂盒的制备方法。
背景技术
淋病是目前国内最为常见的性传播疾病之一,其病原体为***,它是一种严重的人体寄生菌,存在于急、慢性尿道炎的脓性分泌物及新生儿眼结膜分泌物中。在男性常表现为尿道炎,尿道口可出现黄色脓性分泌物,而女性感染者症状常常不明显,但可以从尿道、***扩散到输卵管,引起不育症,新生儿经产道感染引起的眼结膜炎逐渐可涉及全眼,导致失明。感染***后,若不进行治疗,可出现角膜穿孔导致失明,也可导致输卵管狭窄、增厚、粘连、阻塞,从而引***或***,甚至通过血行将***播散到全身,出现较严重的全身感染,如***性败血症、关节炎、心内膜炎、脑膜炎等。因此,对淋病的早期诊断与治疗十分重要。
诊断男女病人淋病感染的方法,目前有几种不同的方法:1、培养法;2、免疫荧光法;3、合成酶链反应LCR检测方法;4、聚合酶链反应PCR检测方法。培养法是传统的诊断方法,取女性子宫颈分泌物或男性尿道的标本接种到培养板上,然后进行48~72个小时培养;对菌落进行染色,以观察菌落的形态和着色来判断。培养法虽然灵敏度高,特异性强,但方法工作量大,培养时间长,要求专门的设施和专业人员操作,而且对环境要求高,需要特殊仪器,在实际临床应用受到一定的限制。免疫荧光法和近来建立的合成酶链反应LCR和聚合酶链反应PCR检测方法均要求专门设施和掌握技巧的技术人员进行实验操作及判读结果,检测过程需要多步骤和数小时才能得出结果,而且需有相当大的测试标本数量才能达到可接受的成本效益比。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足, 提供一种检测速度快、操作简便,而且灵敏度高、特异性强的***抗原检测方法。
本发明还提供了一种用于检测***抗原的检测试剂盒。
本发明还提供了一种用于制备所述检测试剂盒的方法。
本发明所述***抗原检测方法所采用的技术方案是:该方法包括以下步骤:
a、将胶体金标记的***抗体载于玻璃纤维载体上,并在与所述***抗体的载体相连的检测载体上包被有由所述***抗体制成的检测线和由免疫球蛋白G形成的控制线;
b、取待测标本,所述待测标本裂解后滴于胶体金标记的***抗体的载体上,如有***抗体在所述检测载体上形成所述检测线和所述控制线,则为阳性,否则为阴性。
所述***抗体为***单抗,或者为***多抗,或者为所述***单抗和所述***多抗的混合物。
本发明所述检测试剂盒所采用的技术方案是:所述检测试剂盒包括盒体及设置在所述盒体上的***抗原金标检测卡,所述盒体内存放有裂解液A和裂解液B,所述盒体上设置有与所述***抗原金标检测卡相适配的加样孔和观察孔,将样本滴于所述加样孔,然后从所述观察孔即可观察检测结果。
所述***抗原金标检测卡包括衬板,在所述衬板上从一个方向上依次设置有加样端吸水纸、检测层和吸水端吸水层,在所述检测层与所述加样端吸水纸之间搭接有***金标抗体层,所述***金标抗体层一端夹在所述加样端吸水纸内,在所述检测层上包被有检测线和控制线。
所述的检测层由硝酸纤维素膜、设在所述硝酸纤维素膜上的由所述***抗体构成的所述检测线和由免疫球蛋白G形成的所述控制线组成。
所述裂解液A为样品组织细胞分散剂溶液,所述裂解液B为***原生小体的胞液和胞质膜溶解液。
所述裂解液A为PPA或胆酸。
所述裂解液B为反应体系,其为BSA(牛血清白蛋白),或者为BSA-V(牛血清白蛋白-第五组份),或者为BSA和BSA-V的组合。
本发明用于制备所述检测试剂盒的方法所采用的技术方案是:首先制备所述金标抗体层、所述控制线的包被及所述检测线的包被,然后在所述衬板上组合***抗原金标试纸条,制成所述***抗原金标检测卡,再将所述***抗原金标检测卡装在所述盒体上,并在所述盒体内存放有裂解液A和裂解液B。
所述金标抗体层的制备方法包括下述步骤:
a、制备胶体金;
b、胶体金标记***抗体,在胶体金溶液中按0.6~1.0mg/ml加入***抗并搅拌;
c、经搅拌后再在溶液中加入胶体金稀释液和胶体金溶液的混合液;
d、将步骤c中的所述混合液经离心去掉上清液,得沉淀物;
e、将所述沉淀物按4~10mg/ml溶于缓冲液得金标抗体溶液,所述缓冲液中含有其重量的1%~10%的动物血清白蛋白和0.01%~0.06%的叠氮钠;
f、用玻璃纤维或无纺布浸取所述金标抗体溶液,所述金标抗体溶液开始渗出为止,然后将所述玻璃纤维或所述无纺布进行干燥从而形成金标抗体层。
本发明的有益效果是:由于所述***抗原检测方法包括以下步骤: a、将胶体金标记的***抗体载于玻璃纤维载体上,并在与所述***抗体的载体相连的检测载体上包被有由所述***抗体制成的检测线和由免疫球蛋白G形成的控制线; b、取待测标本,所述待测标本裂解后滴于胶体金标记的***抗体的载体上,如有***抗体在所述检测载体上形成所述检测线和所述控制线,则为阳性,否则为阴性,因此,本发明的所述***抗原检测方法灵敏度高、特异性强,而且速度快、操作简便,无需专门设施,适用于临床检测或普查等多种场合。
由于所述检测试剂盒包括盒体及设置在所述盒体上的***抗原金标检测卡,所述盒体内存放有裂解液A和裂解液B,所述盒体上设置有与所述***抗原金标检测卡相适配的加样孔和观察孔,将样本滴于所述加样孔,然后从所述观察孔即可观察检测结果,检测非常方便,因此,本发明的所述检测试剂盒是结构简单,而且一步就能实现检测的检测试剂盒。
由于制备所述检测试剂盒的方法为:首先制备所述金标抗体层、所述控制线的包被及所述检测线的包被,然后在所述衬板上组合***抗原金标试纸条,制成所述***抗原金标检测卡,再将所述***抗原金标检测卡装在所述盒体上,操作简单,并在所述盒体内存放有裂解液A和裂解液B,因此,所述制备所述检测试剂盒的方法简单、重复性好,而且用该方法制备的检测试剂盒结构稳定,使用性能好。
附图说明
图1是所述检测试剂盒的结构示意图;
图2是所述***抗原金标检测卡的结构示意图。
具体实施方式
实施例一
在本实施例中,本发明所述***抗原检测方法包括以下步骤:
a、将胶体金标记的***抗体载于玻璃纤维载体上,并在与所述***抗体的载体相连的检测载体上包被有由所述***抗体制成的检测线和由免疫球蛋白G形成的控制线;
b、取待测标本,在本实施例中,所述待测标本为女性宫颈口分泌物和男性尿道标本,所述待测标本裂解后滴于胶体金标记的***抗体的载体上,如有***抗体在所述检测载体上形成所述检测线和所述控制线,则为阳性,否则为阴性。
所述***抗体为***单抗,或者为***多抗,或者为所述***单抗和所述***多抗的混合物,在本实施例中,所述***多抗为兔或羊抗***抗体。
所述***抗原检测方法为一步法,其具有高度的种特异性、很少出现困扰临床的假阴性、假阳性问题,具有高度的灵敏性,而且操作简便,无需专门设施。
如图1和图2所示,本发明所述检测试剂盒所采用的技术方案是:所述检测试剂盒包括盒体1及设置在所述盒体1上的***抗原金标检测卡2,所述盒体1内存放有裂解液A3和裂解液B4,所述盒体1上设置有与所述***抗原金标检测卡2相适配的加样孔11和观察孔12,将样本滴于所述加样孔11,然后从所述观察孔12即可观察检测结果。
所述***抗原金标检测卡2包括衬板21,在所述衬板21上从一个方向上依次设置有加样端吸水纸22、检测层23和吸水端吸水层24,在所述检测层23与所述加样端吸水纸22之间搭接有***金标抗体层25,所述***金标抗体层25一端夹在所述加样端吸水纸22内,在所述检测层23上包被有检测线231和控制线232,所述加样端吸水纸22和所述吸水端吸水层24均由多层滤纸制成。
在本实施例中,所述的检测层23由硝酸纤维素膜及设在所述硝酸纤维素膜上的由***单抗或兔、羊抗***抗体多抗构成的所述检测线231和由免疫球蛋白G形成的所述控制线232组成。所述的检测层23的制备方法是将浓度为0.6~1.4mg/ml的***抗体中加入1%~3%的固定剂,再利用点膜机将所述***抗体点在硝酸纤维膜上,点膜后放入37~39℃的环境中烘干,再用0.01摩尔PH值为7.4含10%小牛血清的PBS缓冲液,在37℃下封闭30分钟烘干。在本实施例中,取***单抗,调蛋白浓度至1mg/ml,加入划膜稀释液,用喷膜机在硝酸纤维膜中段喷所述检测线231;再取兔或羊抗鼠IgG抗体调蛋白浓度至1mg/ml,加入划膜稀释液,用喷膜机在硝酸纤维膜的中段,距检测线一段距离处喷所述控制线232,按0.036ul/l0cm设置喷膜量,抗体包被的膜烘干,醋酸纤维素膜可以替换所述硝酸纤维素膜。
所述裂解液A3为样品组织细胞分散剂溶液,所述裂解液B4为***原生小体的胞液和胞质膜溶解液,在本实施例中,所述裂解液A3为PPA或胆酸。
所述裂解液B4为反应体系,其为BSA牛血清白蛋白,或者为BSA-V牛血清白蛋白-第五组份,或者为BSA和BSA-V的组合。
所述检测试剂盒检测灵敏度高、检测迅速、快捷、方便,很少出现假阴性和假阳性的问题,适于临床或普查。
本发明用于制备所述检测试剂盒的方法所采用的技术方案是:首先制备所述金标抗体层25、所述控制线232的包被及所述检测线231的包被,然后在所述衬板21上组合***抗原金标试纸条,制成所述***抗原金标检测卡2,再将所述***抗原金标检测卡2装在所述盒体1上,并在所述盒体1内存放有裂解液A3和裂解液B4。
在所述衬板21的两端分别粘贴加样端吸水层22和吸水端吸水层24;在其中段粘贴包被抗体的所述检测层23,在所述加样端吸水层22与所述检测层23的交接部位,夹贴所述金标抗体层25,所述金标抗体层25的4/5部分在所述加样端吸水层22中间,所述金标抗体层25的1/5部分压在硝酸纤维素膜的所述检测层23上,然后按4.1±0.1毫米的宽度规格切成条,再组装成所述检测卡2,所述加样孔11正对所述加样端吸水层22,所述观察孔12正对纤维素膜的所述检测层23.
所述金标抗体层25的制备方法包括下述步骤:
a、制备胶体金,取lg氯金酸溶于l000ml双蒸水中,加入15ml、浓度为1%的柠檬酸三钠,煮沸15分钟;
b、胶体金标记***抗体,取l00ml胶体金溶液,用0.1摩尔的Boarx调PH值,使其PH值为8.5,在l00ml胶体金溶液中加入4mg的***抗体,搅拌15分钟;
c、在步骤b中得到的溶液中按10%的比例加入牛血清白蛋白,继续搅拌5分钟;
d、将步骤c中得到的溶液加入浓度为1%的NaCl溶液,经13000转/分的转速离心15分钟,去掉上清液,得沉淀物;
e、将所述沉淀物按4~10mg/ml溶于缓冲液得金标抗体溶液,所述缓冲液中含有其重量的10%的牛血清白蛋白和0.02%叠氮钠;
f、用玻璃纤维或无纺布浸取所述金标抗体溶液,所述金标抗体溶液开始渗出为止,在37℃的环境下放置2小时进行干燥而形成金标抗体层25。
制备所述检测试剂盒的方法简便、稳定性、重复性好。
实施例二
本实施例与实施例一不同之处:在本实施例中,所述检测线231由羊抗***抗体构成的,所述控制线232由兔抗羊IgG抗体形成的组成。
实施例三
本实施例与实施例一及实施例二不同之处:在本实施例中,所述检测线231由兔抗***抗体构成的,所述控制线232由羊抗兔IgG抗体形成的组成。
本发明应用于***检测领域。
需要注意的是,上述仅以优选实施例对本发明进行了说明,并不能就此局限本发明的权利范围,因此在不脱离本发明思想的情况下,凡运用本发明说明书和附图部分的内容所进行的等效变化,均理同包含在本发明的权利要求范围内。
Claims (5)
1.一种***抗原检测试剂盒,其特征在于:它包括盒体(1)及设置在所述盒体(1)上的***抗原金标检测卡(2),所述盒体(1)内存放有裂解液A(3)和裂解液B(4),所述盒体(1)上设置有与所述***抗原金标检测卡(2)相适配的加样孔(11)和观察孔(12),所述***抗原金标检测卡(2)包括检测层(23)和***金标抗体层(25),在所述检测层(23)上包被有检测线(231)和控制线(232),所述检测层(23)由硝酸纤维素膜、设在所述硝酸纤维素膜上的由***抗体构成的所述检测线(231)和由免疫球蛋白G形成的所述控制线(232)组成,将样本滴于所述加样孔(11),然后从所述观察孔(12)即可观察检测结果;所述裂解液A(3)为胆酸,所述裂解液B(4)为反应体系,其为BSA,或者为BSA-V,或者为BSA和BSA-V的组合。
2.根据权利要求1所述的***抗原检测试剂盒,其特征在于:所述***抗原金标检测卡(2)还包括衬板(21),在所述衬板(21)上从一个方向上依次设置有加样端吸水纸(22)、所述检测层(23)和吸水端吸水层(24),所述***金标抗体层(25)搭接在所述检测层(23)与所述加样端吸水纸(22)之间,所述***金标抗体层(25)一端夹在所述加样端吸水纸(22)内。
3.根据权利要求1所述的***抗原检测试剂盒,其特征在于:所述***抗体为***单抗,或者为***多抗,或者为***单抗和所述***多抗的混合物。
4.一种如权利要求2中所述的检测试剂盒的制备方法,其特征在于:该方法为:首先制备所述金标抗体层(25)、所述控制线(232)的包被及所述检测线(231)的包被,然后在所述衬板(21)上组合***抗原金标试纸条,制成所述***抗原金标检测卡(2),再将所述***抗原金标检测卡(2)装在所述盒体(1)上,并在所述盒体(1)内存放有裂解液A(3)和裂解液B(4)。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述金标抗体层(25)的制备方法包括下述步骤:
a、制备胶体金;
b、胶体金标记***抗体,在胶体金溶液中按0.6~1.0mg/ml加入***抗体并搅拌;
c、经搅拌后再在溶液中加入胶体金稀释液和胶体金溶液的混合液;
d、将步骤c中的所述混合液经离心去掉上清液,得沉淀物;
e、将所述沉淀物按4~10mg/ml溶于缓冲液得金标抗体溶液,所述缓冲液中含有其重量的1%~10%的动物血清白蛋白和0.01%~0.06%的叠氮钠;
f、用玻璃纤维或无纺布浸取所述金标抗体溶液,所述金标抗体溶液开始渗出为止,然后将所述玻璃纤维或所述无纺布进行干燥从而形成金标抗体层(25)。
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