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TECHNISCHES GEBIET
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Gegenstand
der Erfindung ist ein einzigartiges synthetisches Nukleinsäure-Subfragment,
das für
die Aspartokinase (AK) kodiert, die gegen die Inhibition durch Lysin
unempfindlich ist. Verfahren zu ihrer Verwendung bei der Herstellung
gesteigerter Lysin- oder Threonin-Konzentrationen in transformierten
Organismen sind auch bereitgestellt.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Sich
von vielen Getreidesorten herleitende humane Nahrung und Tierfutter
haben Mangel an einigen der zehn essenziellen Aminosäuren, die
im Tierfutter erforderlich sind. In Mais (Zea mays L.) stellt Lysin
die am meisten limitierende Aminosäure für die Futterbedürfnisse
vieler Tiere dar. Das Mehl von der Sojabohne (Glycine max L.) wird
als ein Zusatzmittel zu auf Mais basierendem Tierfutter hauptsächlich als
ein Lysinsupplement verwendet. Eine derartige Steigerung des Lysingehalts
von entweder Mais oder der Sojabohne würde den Bedarf an einer Supplementierung
von gemischtem Getreidefutter mit über die Fermentierung von Mikroben
produziertem Lysin reduzieren oder eliminieren.
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Pflanzenzüchter sind
seit langem an der Verwendung natürlich vorkommender Variationen
zur Verbesserung der Proteinqualität und -quantität in Kulturpflanzen
interessiert gewesen. Maislinien, die höher als normale Lysinkonzentrationen
(70%) enthalten, wurden identifiziert (Mertz, Science 145, 279 (1964)
und Nelson, Science 150, 1469–70
(1965)). Diese Linien, die ein mutantes Gen, opaque-2, inkorporieren,
weisen jedoch schlechte agronomische Qualitäten auf (erhöhte Anfälligkeit
für Krankheiten
und Schädlinge,
8–14%
Ertragsreduktion, niedriges Körnergewicht,
langsameres Trocknen, niedrigere Trockenmahlausbeute von Kornflocken („flaking
grits"), und erhöhte Lagerungsprobleme)
und sind folglich gewerblich nicht nützlich [Deutscher, D. Adv.
Exp, Medicine and Biology, 105, 281–300 (1978)]. Der im CIMMYT
unter Verwendung der opaque-2 und sugary-2-Gene und assoziierten
Modifiziermitteln gezüchtete
Qualitätsproteinmais
(QPM) weist ein hartes Endosperm und in den Körnern angereicherte Lysin-
und Tryptophanspiegel auf [Vasal, S. K., et al. Proceedings of the
3rd Seed Protein Symposium. Gatersleben, 31. August bis 2. September
1983]. Die in den QPM-Linien dargestellten Genpools sind jedoch
tropisch und subtropisch. Qualitätsproteinmais
stellt ein genetisch komplexes Merkmal dar und die existierenden
Linien lassen sich nicht leicht an das in den USA gebräuchliche
Zahnmais-Keimplasma anpassen, wobei die Übernahme von QPM durch die
Maiszüchter
verhindert wird.
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Der
Aminosäuregehalt
von Samen wird hauptsächlich
(90–99%)
durch die Aminosäurezusammensetzung
der Proteine im Samen und in einem geringeren Ausmaß (1–10%) durch
die Pools freier Aminosäuren bestimmt.
Die Menge des Gesamtproteins in Samen variiert von ca. 10% des Trockengewichts
in Zerealien bis 20–40%
des Trockengewichts in Leguminosen. Bin großer Teil der Protein-gebundenen
Aminosäuren
ist in den Samenspeicherproteinen enthalten, die während der
Samenentwicklung synthetisiert werden und die als eine bedeutende
Nährstoffreserve
nach der Keimung dienen. In vielen Samen machen die Speicherproteine
50% oder mehr des Gesamtproteins aus.
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Zur
Verbesserung der Aminosäurezusammensetzung
von Samen wird die Genmanipulationstechnologie zum Isolieren und
Exprimieren von Genen für
Speicherproteine in transgenen Pflanzen verwendet. So wurde zum
Beispiel ein Gen aus der Paranuss für ein Samen-2S-Albumin, das sich aus 26% schwefelhaltigen Aminosäuren zusammensetzt,
isoliert [Altenbach et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 239–250] und
in den Samen von transformiertem Tabak unter der Kontrolle der Regulationssequenzen
aus einem Phaseolin-Speicherprotein-Gen der Bohne exprimiert. Die
Akkumulation des schwefelreichen Proteins in den Tabaksamen ergab
eine bis zu 30%ige Steigerung der Methioninkonzentration in den
Samen [Altenbach et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 513–522]. Es
wurden bisher jedoch keine Pflanzensamen-Speicherproteine identifiziert,
die bezogen auf den durchschnittlichen Lysingehalt von Pflanzenproteinen
in Lysin auf ähnliche
Weise angereichert werden, wobei verhindert wird, dass dieser Ansatz
zur Steigerung des Lysins verwendet wird.
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Lysin
zusammen mit Threonin, Methionin und Isoleucin stellen Aminosäuren dar,
die sich von Aspartat herleiten, und die Regulierung der Biosynthese
von jedem Mitglied dieser Familie ist miteinander verbunden. Die
Regulierung des metabolischen Flusses in der Bahn scheint hauptsächlich über die
Endprodukte zu erfolgen. Der erste Schritt in der Bahn stellt die
Phosphorylierung von Aspartat durch das Enzym Aspartokinase (AK)
dar, und es wurde festgestellt, dass dieses Enzym ein wichtiges
Target für
die Regulierung in vielen Oganismen darstellt. Eingehende physiologische
Studien zum Fluss von 4-Kohlenstoff-Molekülen durch die Aspartatbahn
wurden im Modellpflanzensystem Lemna paucicostata durchgeführt [Giovanelli
et al. (1989) Plant Physiol. 90: 1584–1599]. Die Autoren geben an: „Diese
Daten stellen mm einen definitiven Hinweis darauf bereit, dass der
durch Aspartokinase katalysierte Schritt in der Regel keinen wichtigen
Ort für
die Regulierung des Eintritts von 4-Kohlenstoff-Einheiten in die
Aspartatfamilie von Aminosäuren
[in Pflanzen] darstellt."
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Die
Bahn der Aspartat-Familie wird auch durch Reaktionen am Verzweigungspunkt
reguliert. Für
Lysin stellt dies die Kondensation von Aspartyl-β-semialdehyd mit Pyruvat, katalysiert
durch die Dihydrodipicolinsäure-Synthase
(DHDPS) dar, während
für Threonin
und Methionin die Reduktion von Aspartyl–β-semialdehyd durch Homoserindehydrogenase
(HDH), gefolgt von der Phosphorylierung von Homoserin durch Homoserinkinase
(HK) wichtige Kontrollpunkte darstellen.
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Es
wurden viele Versuche zur Isolierung von Lysin überproduzierenden Mutanten
aus Pflanzen durch Auswahl auf Resistenz des Lysin-Analogs S-(2-Aminoethyl)-cystein
(AEC), entweder allein oder zusammen mit Lysin- plus Threoninresistenz-Selektionen
unternommen. Bisher wurden jedoch keine Beispiele von Steigerungen
der Lysinspiegel in Samen mitgeteilt, die gewerblich wertvoll wären.
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Ein
alternativer Ansatz zur Steigerung der Produktion und Akkumulation
spezifischer freier Aminosäuren,
wie zum Beispiel Lysin, ist über
die Genmanipulationstechnologie vorgesehen. Eine Anzahl an Genen
für wichtige
Regulatorenzyme aus der Bahn der Aspartatfamilie wurde aus verschiedenen
Quellen isoliert. Das dapA-Gen von E. coli kodiert für ein DHDPS-Enzym,
das um das ca. 20fache weniger empfindlich gegen die Inhibition
durch Lysin als die Weizenkeim-DHDPS ist. Das dapA-Gen von E. coli
wurde mit den Pflanzengen-Expressionssequenzen verknüpft, die über die
Transformation in Tabakzellen eingeführt wurden und von denen gezeigt
wurde, dass sie eine erhebliche Steigerung der Konzentrationen von
freiem Lysin in Blättern veranlassen
(Glassman et al. (1989) PCT-Patentanmeldung
PCT/US89/01309 ). Kein Hinweis wurde
jedoch vorgelegt, dass gesteigertes Lysin in Samen anwesend war
(obwohl Samen zum Testen vorhanden waren). Das dapA-Gen von E. coli,
das mit den Expressionssequenzen des Pflanzengens verknüpft war,
wurde von Galili et al. [(1991) Abstr. 422 vom Third Int. Cong.
of Int. Soc. Plant Mol. Biol.] und von Shaul et al. ((1992) Plant
Jour. 2: 203–209]
auch in Tabakzellen eingeführt,
und hat gezeigt, dass es zu einer Steigerung der Spiegel von freiem
Lysin in Blättern
führt.
Es lag wiederum kein Hinweis auf gesteigerte Spiegel von freiem
Lysin in Samen vor. Diese Wissenschaftler haben vor kurzem über die
Einführung
eines lysC-Gens von E. coli berichtet, das für ein Lysin-unempfindliches
AK-Enzym in Tabakzellen über Transformation
kodiert [Galili et al. (1992)
Eur.
Patentanmeldung 91119328.2 ; Shaul et al. (1992) Plant Physiol.
100: 1157–1163).
Die Expression des E. coli-Enzyms führt zu Steigerungen der Spiegel
des freien Threonins in den Blättern
und Samen von transformierten Pflanzen. Kreuzungen von Pflanzen,
die E. coli-DHDPS und -AK exprimieren, führten zu einer Nachkommenschaft,
die mehr freies Lysin in Blättern
akkumulierte als die DHDPS-Elternpflanze, aber weniger freies Threonin
in Blättern
als die AK-Elternpflanze. Es lag kein Hinweis auf gesteigerte Spiegel
von freiem Lysin in Samen vor.
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Das
limitierte Verständnis
der Details hinsichtlich der Regulierung des Biosynthesewegs in
Pflanzen macht die Applikation der Genmanipulationstechnologie,
insbesondere bei Samen, ungewiss. Es stehen wenig Informationen über die
Quelle der von Aspartat hergeleiteten Aminosäuren in Samen zur Verfügung. Es
ist zum Beispiel von den meisten Pflanzen nicht bekannt, ob sie
in Samen synthetisiert oder aus den Blättern an die Samen transportiert
oder beidem werden. Freie Aminosäuren
machen außerdem
nur eine kleine Fraktion des Gesamtaminosäuregehalts von Samen aus. Deshalb
muss eine Überakkumulation
von freien Aminosäuren um
das Vielfache stattfinden, damit sie sich signifikant auf die Gesamtaminosäurezusammensetzung
der Samen auswirken. Darüber
hinausgehend ist über
den Katabolismus freier Aminosäuren
in Samen wenig bekannt. Katabolismus von freiem Lysin wurde bei
sich entwickelndem Endosperm von Mais und Gerste beobachtet. Es
wird angenommen, dass der erste Schritt beim Katabolismus von Lysin
durch die Lysin-Ketoglutarat-Reduktase [Brochetto-Braga et al. (1992)
Plant Physiol. 98: 1139–1147]
katalysiert wird. Ob solche katabolischen Wege in Pflanzen weit
verbreitet sind und ob sie sich auf die Akkumulationshöhe freier
Aminosäuren auswirken,
ist unbekannt.
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Vor
dieser Anmeldung war kein Verfahren zur Steigerung der Lysinkonzentration
oder jedweder anderen Aminosäure
in Samen über
die Genmanipulation bekannt. Folglich besteht ein Bedarf an Genen,
chimären Genen
und Verfahren, um sie in Samen dergestalt zu exprimieren, dass eine Überakkumulation
freier Aminosäuren
in Samen zu einer Verbesserung der Nährqualität führt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Gegenstand
der Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsäurefragment umfassend: (a)
ein erstes Nukleinsäure-Subfragment,
das für
AK kodiert, das gegen die Inhibition durch Lysin unempfindlich ist
und (b) ein zweites Nukleinsäure-Subfragment,
das für
die Dihydrodipicolinsäure-Synthase
kodiert, die mindestens um das 20fache weniger empfindlich gegen
die Inhibition durch Lysin als Pflanzen-DHDPS ist. Eine bevorzugte
Ausführungsform
umfasst weiter ein drittes Nukleinsäure-Subfragment, das für die Antisense-Lysin-Ketoglutarat-Reduktase
kodiert. In einer weiteren Ausführungsform
sind die ersten und zweiten Subfragmente operativ mit einer geeigneten
Pflanzenchloroplast-Transitsequenz verknüpft, und jedes Subfragment
ist auch mit einer geeigneten Regulationssequenz zur Förderung
der Expression in Pflanzen verknüpft.
Eine bevorzugte Ausführungsform
stellt eine der beiden vorstehend beschriebenen Erfindungen dar,
worin:
- (a) das erste Nukleinsäure-Subfragment
eine Nukleotidsequenz umfasst, die im Wesentlichen homolog zur in
SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz ist, kodierend für eine Lysin unempfindliche
Variante von E. coli-AKIII und die weiter dadurch gekennzeichnet
ist, dass mindestens einer der folgenden Bedingungen entsprochen wird:
- (1) die Aminosäure
an Position 318 stellt eine Aminosäure mit Ausnahme von Threonin
dar, oder
- (2) die Aminosäure
an Position 352 stellt eine Aminosäure mit Ausnahme von Methionin
dar; oder
- (b) sich das zweite Nukleinsäure-Subfragment
von Bakterien herleitet. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
stellt die dar, worin:
- (a) das erste Nukleinsäure-Subfragment
weiter dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens einer der folgenden
Bedingungen entsprochen wird:
- (1) Die Aminosäure
an Position 318 stellt Isoleucin dar, oder
- (2) die Aminosäure
an Position 352 stellt Isoleucin dar; oder
- (b) sich das zweite Nukleinsäure-Subfragment
von Bakterien, bevorzugt entweder von E. coli oder Corynebacterium
glutamicum herleitet.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
stellt das isolierte Nukleinsäurefragment
dar, das mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die zu der in
SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz, kodierend für E. coli-AKIII, im Wesentlichen
homolog ist, wobei das Nukleinsäurefragment
für eine
Lysinunempfindliche Variante von E. coli-AKIII kodiert.
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Der
erfindungsgemäße Gegenstand
schließt
auch ein isoliertes Nukleinsäurefragment
ein, das ein Nukleinsäure-Subfragment
umfasst, das für
die Lysin-Ketoglutarat-Reduktase kodiert.
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Mit
den beschriebenen Nukleinsäurefragmenten
transformierte Pflanzen, Samen und Mikroorganismen stellen auch
erfindungsgemäße Ausführungsformen
dar. Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen stellen
Verfahren zur Steigerung des Threonin- oder Lysingehalts von Samen
durch Transformation von Pflanzen mit den beschriebenen einzigartigen
Nukleinsäurefragmenten
dar.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND
DES SEQUENZPROTOKOLLS
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Die
Erfindung kann vollkommener aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung und der sie begleitenden Zeichnungen und dem Sequenzprotokoll,
die einen Teil dieser Anmeldung bilden, verstanden werden.
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1 zeigt eine schematische Darstellung
der Genexpressionskassetten.
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2 zeigt
eine Karte des binären
Plasmidvektors pZS97K.
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3 zeigt
eine Karte des binären
Plasmidvektors pZS97.
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4 zeigt
eine Karte des binären
Plasmidvektors pZS199.
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5 zeigt
eine Karte des Plasmidvektors pBT603.
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SEQ
ID NO:1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der Kodierungsregion
des Wildtyp-lysC-Gens
von E. coli, das für
das in Beispiel 1 beschriebene AKIII kodiert.
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SEQ
ID NO:2 and 3 wurden in Beispiel 2 zur Herbeiführung eines Nco I-Orts am Translations-Startcodon des lysC-Gens
von E. coli verwendet.
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SEQ
ID NO:4 und 5 wurden in Beispiel 3 als PCR-Primer zur Isolierung
des dapA-Gens von Corynebacterium verwendet.
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SEQ
ID NO:6 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der Kodierungsregion
des Wildtyp-dapA-Gens
von Corynebacterium, das für
in Beispiel 3 beschriebene Lysin-unempfindliche DHDPS kodiert.
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SEQ
ID NO:7 wurde in Beispiel 4 zur Herbeiführung eines Nco I-Orts am Translations-Startcodon
des dapA-Gens von E. coli verwendet.
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SEQ
ID NO:8, 9, 10 und 11 wurden in Beispiel 6 zur Herbeiführung einer
Chloroplast-Transitsequenz und
zum Verknüpfen
der Sequenz mit den Genen lysC von E. coli, lysC-M4 von E. coli,
dapA von E. coli und dapA von Corynebacterium verwendet.
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SEQ
ID NO:12 und 13 wurden in Beispiel 6 zur Herbeiführung eines Kpn I-Orts unmittelbar
nach dem Translation-Stoppcodon des dapA-Gens von E. coli verwendet.
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SEQ
ID NO:14 und 15 wurden in Beispiel 6 als PCR-Primer zur Herbeiführung einer
Chloroplast-Transitsequenz
und Verknüpfung
der Sequenz mit dem dapA-Gen von Corynebacterium verwendet.
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SEQ
ID NO:16 wurde in Beispiel 6 als eine konstitutive Expressionskassette
für Mais
verwendet.
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SEQ
ID NO:17–22
wurden in Beispiel 6 zur Herbeiführung
einer Maischloroplast-Transitsequenz und Verknüpfung der Sequenz mit dem lysC-M4-Gen
von E. coli verwendet.
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SEQ
ID NO:23 und 24 wurden in Beispiel 6 als PCR-Primer zur Herbeiführung einer
Maischloroplast-Transitsequenz und Verknüpfung der Sequenz mit dem dapA-Gen
von E. coli verwendet.
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Das
Sequenzprotokoll enthält
den Einbuchstabencode für
Nukleotidsequenzzeichen und die Dreibuchstabencodes für Aminosäuren wie
in Übereinstimmung
mit den in Nucleic Acids Research 13: 3021–3030 (1985) und im Biochemical
Journal 219 (Nr. 2): 345–373
(1984) beschriebenen IUPAC-IUB-Normen
definiert, die hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Zur
Steigerung der Akkumulation spezifischer freier Aminosäuren in
den Samen von Pflanzen über
die Genmanipulation, bestimmte die Anmelderin, welche Enzyme in
dieser Bahn die Bahn kontrollierten. Um dies zu erreichen wurden
Gene, die für
Enzyme in der Bahn kodieren, aus Bakterien isoliert. In einigen
Fallen wurden Mutationen in den Genen dergestalt erhalten, dass
das kodierte Enzym unempfindlich gegen die Inhibition des Endprodukts
gemacht wurde. Da die Gene nicht von pflanzlicher Herkunft waren,
mussten sie mit intrazellulären
Lokalisierungssequenzen und geeigneten Regulationssequenzen zur
Expression in Pflanzen verknüpft werden.
Die Gene, individuell oder in Kombinationen, wurden dann über die
Transformation in Pflanzen eingeführt und auf ihre Fähigkeit
zur Auslösung
der Akkumulation der gewünschten
Aminosäure(n)
in dem/den gewünschten
Pflanzenorgan(en) beurteilt.
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Die
nachstehenden Lehren beschreiben Nukleinsäurefragmente und Verfahren,
die zur Steigerung der Akkumulation von Lysin und Threonin in den
Samen von transformierten Pflanzen im Vergleich zu Spiegeln von
Aminosäuren
nicht transformierter Pflanzen nützlich
sind. Die Anmelderin hat spezifisch ein einzigartiges erstes Nukleinsäurefragment
bereitgestellt, das aus zwei Nukleinsäure-Subfragmenten besteht, wobei
eines für
AK kodiert, das gegen die Inhibition durch Lysin unempfindlich ist,
und das andere, das für
DHDPS kodiert, das mindestens um das 20fache weniger empfindlich
gegen die Feedback-Inhibition durch Lysin als eine typische Pflanzen-DHDPS,
wie z. B. Weizen-DHDPS, ist. Die Anmelderin stellte fest, dass es
sich um die Kombination von Subfragmenten handelt, welche das in
den Samen von transformierten Pflanzen akkumulierte Lysin im Vergleich
zu nicht transformierten Wirtspflanzen erfolgreich steigert. Zur
Erzielung einer größeren Akkumulation
von Lysin in Samen von transformierten Pflanzen hat die Anmelderin
auch ein Nukleinsäurefragment
bereitgestellt, das ein chimäres
Antisense-Lysin-Ketoglutarat-Reduktase-Gen
(LKR-Gen) enthält.
Dieses Fragment kann mit dem ersten Fragment verknüpft oder über die
Kreuzung von Pflanzen kombiniert werden, die mit dem ersten Fragment
mit Pflanzen transformiert werden, die mit dem Nukleinsäurefragment,
das ein chimäres
Antisense-LKR-Gen enthält,
transformiert werden. Die Anmelderin hat auch ein für AK kodierendes
Nukleinsäurefragment
bereitgestellt, das gegen die Lysin-Inhibition unempfindlich ist.
Mit diesem Fragment transformierte Pflanzen akkumulieren im Vergleich
zu nicht transformierten Pflanzen das gesteigerte Threonin in ihren
Samen.
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Im
Kontext dieser Offenbarung werden eine Anzahl von Begriffen verwendet.
Wie hierin verwendet versteht man unter dem Begriff „Nukleinsäuren" ein großes Molekül, das einsträngig oder
doppelsträngig
sein kann, das sich am Monomeren (Nukleotiden) zusammensetzt, die
einen Zucker, ein Phosphat und entweder ein Purin oder Pyrimidin
enthalten. Ein „Nukleinsäurefragment" stellt eine Fraktion
eines gegebenen Nukleinsäuremoleküls dar.
In höheren
Pflanzen stellt die Desoxyribonukleinsäure (DNA) das genetische Material
dar, während
die Ribonukleinsäure
(RNA) am Transfer der Information in der DNA in Proteine beteiligt
ist. Unter einem „Genom" versteht man den
gesamten Körper
des in jeder Zelle eines Organismus enthaltenen genetischen Materials.
Der Begriff „Nukleotidsequenz" verweist auf ein
DNA- oder RNA-Polymer,
das ein- oder doppelsträngig
sein kann, das optional synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nukleotidbasen
enthält,
die zur Inkorporation in DNA- oder RNA-Polymere fähig sind.
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Wie
hierin verwendet versteht man unter dem Begriff „homolog zu" die Komplementarität zwischen
der Nukleotidsequenz von zwei Nukleinsäuremolekülen oder zwischen den Aminosäuresequenzen
von zwei Proteinmolekülen.
Schätzungen
einer solchen Homologie werden entweder durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung
unter Bedingungen der Stringenz, wie vom Fachmann sehr wohl erkannt
werden wird [wie in Harnes und Higgins (Hrsg.) Nucleic Acid Hybridisation,
IRL Press, Oxford, U.K. beschrieben], oder durch den Vergleich der
Sequenzähnlichkeit
zwischen zwei Nukleinsäuren
oder Proteinen bereitgestellt.
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Wie
hierin beschrieben versteht man unter „im Wesentlichen homolog" Nukleinsäuremoleküle, die
weniger stringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich machen
als die für
homologe Sequenzen, und man versteht auch darunter das Kodieren
der DNA-Sequenz, das Basenänderungen
beinhalten kann, die keine Änderung
in der kodierten Aminosäure
hervorrufen, oder die Basenänderungen
beinhalten, die eine oder mehr Aminosäure(n) verändern können, sich aber nicht auf die
Funktionseigenschaften des durch die DNA-Sequenz kodierten Proteins
auswirken. Folglich schließen
die hierin beschriebenen Nukleinsäurefragmente Moleküle ein,
die mögliche
Variationen der Nukleotidbasen umfassen, die sich von der Deletion,
dem Rearrangement, der zufälligen
oder kontrollierten Mutagenese des Nukleinsäurefragments und selbst gelegentlich
Nukleotidsequenzierungsfehlern herleiten, so lange die DNA-Sequenzen
im Wesentlichen homolog sind.
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„Gen” verweist
auf ein Nukleinsäurefragment,
das ein spezifisches Protein exprimiert, das Regulationssequenzen
einschließt,
die der Kodierungsregion vorausgehen (5' nicht kodierend) und folgen (3' nicht kodierend).
Unter „nativem" Gen versteht man
das Gen wie es in der Natur vorkommt, mit seinen eigenen Regulationssequenzen.
Unter „chimärem" Gen versteht man
ein Gen, das heterogene Regulations- und Kodiersequenzen umfasst. „Endogenes" Gen verweist auf
das native Gen, das in der Regel an seiner natürlichen Stelle im Genom gefunden
wird. Ein „Fremdgen" verweist auf ein
Gen, unter dem man ein Gen versteht, das in der Regel nicht im Wirtsmechanismus
gefunden, sondern vielmehr durch Gentransfer eingeführt wird.
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Unter „Kodiersequenz" versteht man eine
DNA-Sequenz, die für
ein spezifisches Protein kodiert und nicht kodierende Sequenzen
ausschließt.
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„Initiationscodon" und „Terminationscodon" verweisen auf eine
Einheit aus drei benachbarten Nukleotiden in einer Kodiersequenz,
welche die Initiation bzw. Kettentermination der Proteinsynthese
(mRNA-Translation) spezifiziert. Unter „offenem Leserahmen" versteht man die
Aminosäuresequenz,
die zwischen den Translationsinitiations- und -terminationscodonen
einer Kodiersequenz kodiert ist.
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Unter „RNA-Transkript" versteht man das
Produkt, das sich aus der RNA-Polymerasekatalysierten Transkription
einer DNA-Sequenz ergibt. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte
komplementäre
Kopie der DNA-Sequenz darstellt, versteht man darunter das primäre Transkript,
oder es kann eine RNA-Sequenz darstellen, die sich von der posttranskriptionalen
Prozessierung des primären
Transkripts herleitet. Unter „Messenger-RNA
(mRNA)" versteht
man die RNA, die durch die Zelle in ein Protein translatiert werden
kann. „cDNA" verweist auf eine
doppelsträngige
DNA, die für
mRNA komplementär
ist und sich von ihr herleitet. Unter „Sense"-RNA versteht man ein RNA-Transkript,
das die mRNA einschließt.
Unter „Antisense-RNA" versteht man ein
RNA-Transkript, das für
das gesamte oder einen Teil eines primären Target-Transkripts oder
die gesamte mRNA oder einen Teil komplementär ist und das die Expression
eines Targetgens durch Interferenz mit der Prozessierung, dem Transport
und/oder der Translation seines primären Transkripts oder mRNA blockiert. Die
Komplementarität
einer Antisense-RNA
kann mit jedwedem Teil des spezifischen Gentranskripts, d. h. an der
5' nicht kodierenden
Sequenz, 3' nicht
kodierenden Sequenz, Intronen oder der Kodiersequenz vorhanden sein.
Die Antisense-RNA kann, wie hierin verwendet, außerdem Regionen von Ribozym-Sequenzen
enthalten, welche die Wirksamkeit der Antisense-RNA zur Blockierung
der Genexpression steigern. Unter „Ribozym" versteht man eine katalytische RNA
und schließt
sequenzspezifische Endoribonukleasen ein.
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Wie
hierin verwendet versteht man unter geeigneten „Regulationssequenzen" Nukleotidsequenzen, die
sich stromaufwärts
(5'), in, und/oder
stromabwärts
(3') an einer Kodiersequenz
befinden, welche die Transkription und/oder Expression der Kodiersequenzen,
potenziell zusammen mit dem biosynthetischen Proteinapparat der
Zelle, kontrollieren. Diese Regulationssequenzen schließen Promotoren,
Translations-Leadersequenzen,
Transkriptions-Terminationssequenzen und Polyadenylierungssequenzen
ein.
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Unter „Promotor" versteht man eine
DNA-Sequenz in einem Gen, gewöhnlich
stromaufwärts
(5') an seiner Kodiersequenz,
welcher die Expression der Kodiersequenz durch Bereitstellung der
Erkennung der RNA-Polymerase und andere für eine richtige Transkription
erforderliche Faktoren kontrolliert. Ein Promotor kann auch DNA-Sequenzen
enthalten, die an der Bindung von Proteinfaktoren beteiligt sind, welche
die Wirksamkeit der Transkriptionsinitiation als Response auf physiologische
oder Entwicklungsbedingungen kontrollieren. Er kann auch Enhancer-Elemente
enthalten.
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Ein „Enhancer" stellt eine DNA-Sequenz
dar, welcher die Promotor-Aktivität stimulieren kann. Er kann ein
innates Element des Promotors oder ein insertiertes heterologes
Element zur Förderung
des Spiegels und/oder der Gewebsspezifität eines Promotors darstellen. „Konstitutive
Promotoren" verweisen
auf die, welche die Genexpression in allen Geweben und jederzeit
lenken. Unter „organspezifischen" oder „entwicklungsspezifischen" Promotoren versteht
man hierin die, welche die Genexpression fast ausschließlich in
spezifischen Organen, wie zum Beispiel in Blättern oder Samen, oder auf
spezifischen Entwicklungsstufen in einem Organ, wie zum Beispiel
in der frühen
bzw. späten
Embryogenese, lenken.
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Unter
dem Begriff „operativ
verknüpft" versteht man Nukleinsäuresequenzen
an einem einzelnen Nukleinsäuremolekül, die dergestalt
assoziiert sind, dass die Funktion des einen durch das andere beeinflusst wird.
So ist ein Promotor zum Beispiel operativ mit einem Strukturgen
(d. h. einem Gen, das für
Aspartokinase kodiert, die wie hierin angegeben, Lysin-unempfindlich
ist) verknüpft,
wenn er zur Einwirkung auf die Expression dieses Strukturgens (d.
h. dass sich das Strukturgen unter der transkriptionalen Kontrolle
des Promoters befindet) fähig
ist.
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Der
Begriff „Expression", wie hierin verwendet,
soll die Produktion des Proteinprodukts bedeuten, das durch ein
Gen kodiert ist. „Expression" verweist insbesondere
auf die Transkription und stabile Akkumulation der Sense-(mRNA)
oder der Antisense-RNA, die sich von dem/den erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment(en)
herleitet, die zusammen mit dem Proteinapparat der Zelle in veränderten
Konzentrationen des Proteinprodukts resultiert. „Antisense-Inhibition" verweist auf die
Produktion der Antisense-RNA-Transkripte, die zur Verhinderung der
Expression des Targetproteins fähig
sind. Unter „Überexpression" versteht man die
Produktion eines Genprodukts in transgenen Organismen, die über die
Produktionsmengen in normalen oder nicht transformierten Organismen
hinausgeht. Unter „Cosuppression" versteht man die
Expression eines Fremdgens, das eine erhebliche Homologie zu einem
endogenen Gen besitzt, was zur Suppression der Expression von sowohl
dem Fremdgen als auch dem endogenen Gen führt. „Veränderte Mengen" verweist auf die
Produktion von einem Genprodukt/Genprodukten in transgenen Organismen
in Mengen oder Anteilen, die sich von den normalen oder nicht transformierten
Organismen unterscheiden.
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Die „3' nicht kodierenden
Sequenzen" verweisen
auf den DNA-Sequenzanteil eines Gens, das ein Polyadenylierungssignal
und jedwedes andere Regulationssignal enthält, die zur Einwirkung auf
die mRNA-Prozessierung oder die Genexpression fähig sind. Das Polyadenylierungssignal
ist gewöhnlich
durch die Einwirkung auf die Polyadenylsäureschwänze am 3'-Ende des mRNA-Vorläufers gekennzeichnet.
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Die „Translation-Leadersequenz" verweist auf den
DNA-Sequenzanteil eines Gens zwischen dem Promotor und der Kodiersequenz,
die in RNA transkribiert ist und in der vollkommen prozessierten
mRNA stromaufwärts
(5') vom Translations-Startcodon
anwesend ist. Die Translation-Leadersequenz kann sich auf die Prozessierung
des primären
Transkripts zu mRNA, die mRNA-Stabilität oder Translationeffizienz
auswirken.
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Unter „maturem" Protein versteht
man ein posttranslational prozessiertes Polypeptid ohne sein Targetingsignal. „Vorläufer"-Protein verweist
auf das primäre
Translationsprodukt von mRNA. Ein „Chloroplasten-Targetingsignal” stellt
eine Aminosäuresequenz
dar, die zusammen mit einem Protein translatiert wird und es an
den Chloroplasten richtet. Unter „Chloroplast-Transitsequenz" versteht man eine
Nukleotidsequenz, die für
ein Chloroplasten-Targetingsignal kodiert.
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„Transformation" verweist hierin
auf den Transfer eines Fremdgens in das Genom eines Wirtsorganismus
und sein genetisch stabiles Erbgut. Beispielhafte Verfahren der
Pflanzentransformation schließen
die von Agrobacterium vermittelte Transformation und die Partikel-beschleunigte
oder „Gen-Gun"-Transformationstechnologie
ein.
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ISOLIERUNG VON AK-GENEN
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Das
lysC-Gen von E. coli wurde zuvor kloniert, mit Restriktionsendonuklease
kartiert und sequenziert [Cassan et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:
1052–1057].
Für die
vorliegende Erfindung wurde das lysC-Gen auf einem Bakteriophagen-Lambda-Klon
aus einer geordneten Bibliothek von 3400 überlappenden Segmenten von
klonierter E. coli-DNA erhalten, die von Kohara, Akiyama und Isono
[Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508] konstruiert wurde. Das
lysC-Gen von E. coli kodiert für
das Enzym AKIII, das gegen die Lysin-Inhibition empfindlich ist.
Im lysC-Gen wurden Mutationen erhalten, die veranlassen, dass das
AKIII-Enzym gegen Lysin resistent ist.
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Zur
Ermittlung der molekularen Basis für die Lysin-Resistenz wurden
die Sequenz des Wildtyp-lysC-Gens
und drei mutante Gene bestimmt. Die Sequenz des klonierten Wildtyp-lysC-Gens,
ersichtlich in SEQ ID NO:1, unterschied sich von der veröffentlichten
lysC-Sequenz in der Kodierungsregion an den 5-Positionen.
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Von
den Sequenzen der drei mutanten lysC-Gene, die für Lysin-unempfindliche Aspartokinase
kodierten, unterschied sich jede von der Wildtyp-Sequenz durch ein
einzelnes Nukleotid, was zu einer einzelnen Aminosäuresubstitution
im Protein führte.
Bei einer Mutanten (M2) war ein A für ein G am Nukleotid 954 von
SEQ ID NO:1 substituiert, was zu einer Substitution von Isoleucin
für Methionin
in der Aminosäuresequenz
von AKIII führte
und zwei Mutanten (M3 und M4) identische Substitutionen von T für C am Nukleotid
1055 von SEQ ID NO:1 aufwiesen, was zu einer Substitution von Isoleucin
für Threonin
führte.
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Andere
Mutationen könnten
generiert werden, entweder in vivo, wie in Beispiel 1 beschrieben,
oder in vitro durch die ortsgerichtete Mutagenese anhand von dem
Fachmann bekannten Verfahren, die durch Aminosäuresubstitutionen zu dem im
Wildtyp-AKIII an diesen Positionen vorliegenden Methionin- oder Threoninrest
führen.
Es würde
erwartet, dass solche Mutationen zu einem Lysin-unempfindlichen
Enzym führen.
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren könnte überdies zur leichten Isolierung
und Charakterisierung von so vielen zusätzlichen mutanten lysC-Genen,
die für
Lysin unempfindliches AKIII kodieren, wie gewünscht führen.
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Eine
Anzahl anderer AK-Gene wurde isoliert und sequenziert. Zu diesen
gehören:
das thrA-Gen von E. coli (Katinka et al. (1980) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77: 5730–5733],
das metL-Gen von E. coli (Zakin et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:
3028–3031]
und das HOM3-Gen von S. cerevisiae [Rafalski et al. (1988) J. Biol. Chem.
263: 2146–2151].
Das thrA-Gen von E. coli kodiert für ein bifunktionelles Protein
AKI-HDHI. Die AK-Aktivität
dieses Enzyms ist unempfindlich gegen Lysin, aber empfindlich gegen
Threonin. Das metL-Gen von E. coli kodiert auch für ein bifunktionelles
Protein, AKII-HDHII, und die AK-Aktivität dieses Enzyms ist auch unempfindlich
gegen Lysin. Das HOM3-Gen von Hefe kodiert für eine AK, die unempfindlich
gegen Lysin, aber empfindlich gegen Threonin ist.
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Außer diesen
Genen sind mehrere Pflanzengene bekannt, die für Lysin-unempfindliche AK kodieren. In
Gerste wurden Lysin- plus Threonin-resistente Mutanten beschrieben,
die Mutationen in zwei nicht verknüpften Genen tragen, die zu
zwei verschiedenen Lysin-unempfindlichen AK-Isoenzymen führen [Bright
et al. (1982) Nature 299: 278–279,
Rognes et al. (1983) Planta 157: 32–38, Arruda et al. (1984) Plant
Physiol. 76: 442–446].
In Mais wies eine Lysin- plus Threonin-resistente Zelllinie AK-Aktivität auf, die
weniger empfindlich gegen die Lysin-Inhibition als ihre Elternlinie
war [Hibberd et al. (1980) Planta 148: 183–187). Eine anschließend isolierte
Lysin- plus Threonin-resistente Maismutante ist an einem anderen
genetischen Locus verändert und
produziert auch Lysin-unempfindliche AK (Diedrick et al. (1990)
Theor. Appl. Genet. 79: 209–215,
Dotson et al. (1990) Planta 182: 546–552]. In Tabak sind zwei AK-Enzyme
in Blättern
vorhanden, eines Lysin-empfindlich und eines Threonin-empfindlich.
Eine Lysin- plus Threonin-resistente Tabakmutante, die vollkommen
Lysin-unempfindliche AK exprimierte, wurde beschrieben [Frankard
et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 82: 273–282). Diese Pflanzenmutanten
könnten
gegebenenfalls als Quellen von Genen dienen, die für Lysin-unempfindliche
AK kodieren und basierend auf den Lehren hierin zur Steigerung der
Akkumulation von Lysin und Threonin in den Samen von transformierten
Pflanzen verwendet werden.
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Eine
partielle Aminosäuresequenz
von AK aus Karotten wurde mitgeteilt [Wilson et al. (1991) Plant Physiol.
97: 1323: 1328). Unter Verwendung dieser Information könnte gegebenenfalls
ein Set von degenerierten DNA-Oligonukleotiden konzipiert, synthetisiert
und als Hybridisierungssonden verwendet werden, um die Isolierung
des AK-Gens von der Karotte zu erlauben. In jüngerer Zeit wurde das AK-Gen
von der Karotte isoliert und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt
[Matthews et al. (1991)
U.S.S.N.
07/746705 ]. Dieses Gen kann als eine heterologe Hybridisierungssonde
zur Isolierung der Gene verwendet werden, die für die vorstehend beschriebene
Lysin-unempfindliche AK kodieren.
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HOCHGRADIGE EXPRESSION VON WILDTYP- UND
MUTANTEN lysC-GENEN IN E. coli
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Zum
Erlangen einer hochgradigen Expression der lysC-Gene in E. coli
wurde ein bakterieller Expressionsvektor verwendet, der das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase-/T7-Promotor-System
einsetzt [Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 125–135]. Der Expressionsvektor
und das lysC-Gen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben zur Konstruktion
eines lysC-Expressionsvektors modifiziert. Zur Expression der mutanten
lysC-Gene (M2, M3 und M4) wurde das Wildtyp-lysC-Gen durch die wie
in Beispiel 2 beschriebenen mutanten Gene ersetzt.
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Zur
hochgradigen Expression wurde jeder der Expressionsvektoren in den
E. coli-Stamm B121 (DE3) transformiert [Studier et al. (1986) J.
Mol. Biol. 189: 113–130].
Die Kulturen wurden gezüchtet,
die Expression wurde induziert, die Zellen wurden gesammelt und
Extrakte wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Die Überstands-
und Pellet-Fraktionen von Extrakten aus nicht induzierten und induzierten
Kulturen wurden mittels der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
und durch AK-Enzym-Assays
wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert. Bei dem wichtigsten Protein,
das durch Coomassieblau-Färbung in
den Überstands-
und Pellet-Fraktionen von induzierten Kulturen sichtbar gemacht
wurde, handelte es sich um AKIII. Ca. 80% des AKIII-Proteins befanden
sich im Überstand
und AKIII machte 10–20%
des Gesamtproteins von E. coli im Extrakt aus.
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Ca.
80% der AKIII-Enzymaktivität
befanden sich in der Überstandsfraktion.
Die spezifische Aktivität der
Wildtyp- und mutanten Rohextrakte betrug 5–7 μmol Produkt pro Minute pro Milligramm
Gesamtprotein. Die Wildtyp-AKIII war empfindlich gegen die Anwesenheit
von L-Lysin im Assay. Eine 50%ige Inhibition wurde bei einer Konzentration
von ca. 0,4 mM und eine 90%ige Inhibition bei ca. 0,1 mM festgestellt.
Im Gegensatz dazu wurden die Mutanten AKIII-M2, -M3 und -M4 durch
15 mM L-Lysin überhaupt
nicht inhibiert.
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Das
Wildtyp-AKIII-Protein wurde aus dem Überstand einer induzierten
Kultur wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt. Kaninchen-Antikörper wurden
gegen das gereinigte AKIII-Protein generiert.
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In
der Literatur wurden viele andere mikrobielle Expressionsvektoren
beschrieben. Ein Fachmann könnte
Gebrauch von irgendeinem von diesen zur Konstruktion von lysC-Expressionsvektoren
machen. Diese lysC-Expressionsvektoren könnten dann über Transformation zur Bereitstellung
eines Systems für
die hochgradige Expression von AKIII in geeignete Mikroorganismen
eingeführt
werden.
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ISOLIERUNG VON DHDPS-GENEN
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Das
dapA-Gen von E. coli (ecodapA) wurde zuvor kloniert, die Restriktionsendonuklease
kartiert und sequenziert (Richaud et al. (1986) J. Bacteriol. 166:
297–300].
Das dapA-Gen wurde erfindungsgemäß auf einem
Bakteriophagen-Lambda-Klon aus einer geordneten Bibliothek von 3400 überlappenden
Segmenten von klonierter E. coli-DNA, die von Kohara, Akiyama und
Isono [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508) konstruiert wurde, erhalten.
Das ecodapA-Gen kodiert für
ein DHDPS-Enzym, das empfindlich gegen die Lysin-Inhibition ist.
Es ist jedoch um das ca. 20fache weniger empfindlich gegen die Inhibition
durch Lysin als eine typische Pflanzen-DHDPS, wie z. B. Weizenkeim-DHDPS.
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Das
dapA-Gen von Corynebacterium (cordapA) wurde aus genomischer DNA
aus dem ATCC-Stamm 13032
anhand der Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert. Die Nukleotidsequenz
des dapA-Gens von Corynebacterium wurde veröffentlicht [Bonnassie et al.
(1990) Nucleic Acids Res. 18: 6421]. Mithilfe der Sequenz war es
möglich,
Oligonukleotid-Primer für
die Polymerasekettenreaktion (PCR) zu konzipieren, welche die Amplifikation
eines das Gen enthaltenden DNA-Fragments erlauben und gleichzeitig
einzigartige Restriktionsendonukleaseorte am Startcodon und eben
am Stoppcodon des Gens vorbei zur Förderung weiterer das Gen beteiligende
Konstruktionen zufügen.
Die näheren
Einzelheiten zur Isolierung des cordapA-Gens werden in Beispiel
3 dargelegt. Das cordapA-Gen kodiert für ein DHDPS-Enzym, das gegen die Lysin-Inhibition
unempfindlich ist.
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Außer der
Einführung
eines Restriktionsendonukleaseortes am Translations-Startcodon änderten
die PCR-Primer auch das zweite Codon des cordapA-Gens von der AGC-Kodierung
für Serin
zur GCT-Kodierung für Alanin.
Mehrere klonierte DNA-Fragmente, die aktive, Lysin-unempfindliche
DHDPS exprimierten, wurden isoliert, was darauf hindeutet, dass
die Aminosäuresubstitution
des zweiten Codons sich nicht auf die Enzymaktivität auswirkte.
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Das
PCR-generierte dapA-Gen von Corynebacterium wurde in den Phagemid-Vektor
pGEM-9zf(–) von
Promega subkloniert, und es wurde eine einsträngige DNA generiert und sequenziert
(SEQ ID NO:6). Außer
dem bereits erwähnten
Unterschied im zweiten Codon passte die Sequenz, außer an zwei
Positionen, den Nukleotiden 798 und 799, mit der veröffentlichten
Sequenz zusammen. Bei der veröffentlichten
Sequenz handelt es sich bei diesen um TC, während es sich bei dem in SEQ
ID NO:6 gezeigten Gen um CT handelt. Diese Änderung führt zu einer Aminosäuresubstitution
von Leucin für
Serin. Der Grund für
diesen Unterschied ist nicht bekannt. Der Unterschied hat anscheinend
keine Wirkung auf die DHDPS-Enzymaktivität.
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Die
Isolierung der anderen Gene, die für DHDPS kodieren, wurde in
der Literatur beschrieben. Zwei Beispiele stellen eine cDNA, die
für DHDPS
aus Weizen kodiert [Kaneko et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 17451–17455]
und eine cDNA, die für
DHDPS aus Mais kodiert [Frisch et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228: 287–293], dar.
Diese Gene kodieren für
Lysin-empfindliche DHDPS-Enzyme des Wildtyps. Negrutui et al. [(1984)
Theor. Appl. Genet. 68: 11–20]
erhielten jedoch zwei AEC-resistente Tabakmutanten, in denen die DHDPS-Aktivität weniger
empfindlich gegen die Lysin-Inhibition war als das Wildtyp-Enzym.
Diese Gene könnten
gegebenenfalls unter Verwendung der bereits für die Isolierung der Weizen-
oder Maisgene beschriebenen Verfahren oder als Alternative unter
Verwendung der Weizen- oder Maisgene als heterologe Hybridisierungssonden
isoliert werden.
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Noch
weitere Gene, die für
DHDPS kodieren, könnten
von einem Fachmann unter Verwendung von entweder des ecodapA-Gens,
des cordapA-Gens oder von einem oder dem anderen der DHDPS-Gene
von Pflanzen als DNA-Hybridisierungssonden isoliert werden. Als
Alternative könnten
andere für
DHDPS kodierende Gene, durch funktionelle Komplementierung eines
dapA-Mutanten von E. coli isoliert werden, wie dies zur Isolierung
des cordapA-Gens [Yeh et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 212: 105–111] und
des DHDPS-Gens in Mais durchgeführt
wurde.
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HOCHGRADIGE EXPRESSION VON ecodapA- UND
cordapA-GENEN IN E. coli
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Zum
Erzielen einer hochgradigen Expression der ecodapA- und cordapA-Gene
in E. coli, wurde ein bakterieller Expressionsvektor, welcher das
Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase-/T7-Promotorsystem einsetzt [Rosenberg
et al. (1987) Gene 56: 127–135],
verwendet. Der Vektor und die dapA-Gene wurden wie nachstehend beschrieben
zur Konstruktion von ecodapA- und cordapA-Expressionsvektoren modifiziert.
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Für die hochgradige
Expression wurde jeder der Expressionsvektoren in den E. coli-Stamm BL21(DE3)
transformiert [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130]. Die
Kulturen wurden gezüchtet,
die Expression wurde induziert, die Zellen wurden gesammelt und
die Extrakte wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Die Überstands-
und Pelletfraktionen von Extrakten von nicht induzierten und induzierten
Kulturen wurden mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und
durch DHDPS-Ezymassays wie in Beispiel 4 beschrieben analysiert.
Das wichtigste Protein, das durch die Coomassieblau-Färbung in
den Überstands-
und Pelletfraktionen von beiden induzierten Kulturen sichtbar gemacht
wurde, wies ein Molekulargewicht von 32–34 kD, die erwartete Größe für DHDPS,
auf. Selbst in den nicht induzierten Kulturen stellte dieses Protein das
prominenteste produzierte Protein dar.
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In
der mit dem ecodapA-Gen induzierten Kultur fanden sich Ca. 80% des
DHDPS-Proteins im Überstand
und die DHDPS stellte 10–20%
des Gesamtproteins im Extrakt dar. In der mit dem cordapA-Gen induzierten
Kultur befanden sich mehr als 50% des DHDPS-Proteins in der Pelletfraktion.
Die Pelletfraktionen stellten in beiden Fällen zu 90–95% reine DHDPS dar, wobei
kein anderes Einzelprotein in signifikanten Mengen vorlag. Folglich
waren diese Fraktionen zum Gebrauch bei der Generierung von Kaninchen-Antikörpern rein genug.
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Die
spezifische Aktivität
der E. coli-DHDPS in der Überstandsfraktion
von induzierten Extrakten betrug ca. 50 OD540-Einheiten
pro Milligramm Protein. Im Assay war die DHDPS von E. coli empfindlich
gegen die Anwesenheit von L-Lysin. Bei einer Konzentration von ca.
0,5 mM wurde eine 50%ige Inhibition gefunden. Für DHDPS von Corynebacterium
wurde die Enzymaktivität
in der Überstandsfraktion
von nicht induzierten Extrakten anstelle von induzierten Extrakten
gemessen. Die Enzymaktivität
betrug ca. 4 OD530-Einheiten pro Minute pro
Milligramm Protein. Im Gegensatz zur DHDPS von E. coli wurde die
DHDPS von Corynebacterium durch L-Lysin, selbst bei einer Konzentration
von 70 mM, überhaupt
nicht inhibiert.
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In
der Literatur wurden viele andere mikrobielle Expressionsvektoren
beschrieben. Ein Fachmann könnte
gegebenenfalls Gebrauch von jedweden von diesen zur Konstruktion
von ecodapA- oder cordapA-Expressionsvektoren
machen. Diese Expressionsvektoren könnten dann über die Transformation in geeignete Mikroorganismen
zur Bereitstellung eines Systems für die hochgradige Expression
von DHDPS eingeführt werden.
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EXKRETION VON AMINOSÄUREN DURCH HOHE DHPDS- UND/ODER
AKIII-SPIEGEL EXPRIMIERENDE E. coli
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Die
Expressionskassetten von E. coli wurden in Expressionsvektoren insertiert
und dann in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) [Studier et al. (1986)
J. Mol. Biol. 189: 113–130]
zur Induktion von E. coli, zur Herstellung und Exkretion von Aminosäuren transformiert.
Einzelheiten der verwendeten Verfahren und die Ergebnisse werden
in Beispiel 5 dargelegt.
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Andere
dem Fachmann bekannte mikrobielle Expressionsvektoren könnten zur
Herstellung und Kombination von Expressionskassetten für die lysC-
und dapA-Gene verwendet werden. Diese Expressionsvektoren könnten dann
zur Bereitstellung alternativer Systeme zur Herstellung und Exkretion
von Lysin, Threonin und Methionin über die Transformation in geeignete
Mikroorganismen eingeführt
werden.
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KONSTRUKTION CHIMÄRER GENE
ZUR EXPRESSION VON lysC- UND dapA-KODIERENDEN REGIONEN IN PFLANZEN
-
Die
Expression von Fremdgenen in Pflanzen ist gut etabliert [De Blaere
et al. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277–291). Richtige Expressionsspiegel
von lysC- und dapA-mRNA können
die Verwendung verschiedener chimärer Gene, die sich verschiedene
Promotoren zu Nutze machen, erforderlich machen. Solche chimären Gene
können
entweder zusammen in einem einzelnen Expressionsvektor oder sequenziell
unter Verwendung von mehr als einem Vektor in Wirtspflanzen transferiert
werden. Eine bevorzugte Klasse heterologer Wirte für die Expression
der Kodiersequenz von lysC- und dapA-Genen stellen eukaryote Wirte,
insbesondere die Zellen höherer
Pflanzen dar. Insbesondere bevorzugt unter den höheren Pflanzen und den sich
von ihnen herleitenden Samen sind die Sojabohne, Rapssamen (Brassica
napus, B. campestris), Sonnenblume (Helianthus annus), Baumwolle
(Gossypium hirsutum), Mais, Tabak (Nicotiana tobacum), Alfalfa (Medicago
sativa), Weizen (Triticum sp.), Gerste (Hordeum vulgare), Haferflocken (Avena
sativa L), Sorghum (Sorghum bicolor), Reis (Oryza sativa) und Futtergräser. Die
Expression in Pflanzen verwendet Regulationssequenzen, die in solchen Pflanzen
funktionell sind.
-
Die
Herkunft des zum Antreiben der Expression der Kodiersequenz gewählten Promotors
ist nicht kritisch, so lange er über
eine ausreichende transkriptionale Aktivität zur erfindungsgemäßen Durchführung durch
Expression einer translatierbaren mRNA für lysC- oder dapA-Gene in das
gewünschte
Wirtsgewebe verfugt. Bevorzugte Promotoren zur Expression in allen
Pflanzenorganen und besonders zur Expression in Blättern, schließen die
ein, die die 19S- und 35S-Transkripte im Blumenkohl-Mosaikvirus
[Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812; Hull et al. (1987) Virology
86: 482–493],
in kleinen Untereinheiten von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase
[Morelli et al. (1985) Nature 315: 200; Broglie et al. (1984) Science
224: 838; Hererra-Estrella et al. (1984) Nature 310: 115; Coruzzi
et al. (1984) EMBO J. 3: 1671; Faciotti et al. (1985) Bio/Technology
3: 241], im Mais-Zein-Protein [Matzke et al. (1984) EMBO J. 3: 1525]
und im Chlorophyll-a/b-Bindingsprotein [Lampa et al. (1986) Nature
316: 750–752]
lenken.
-
In
Abhängigkeit
von der Applikation könnte
die Auswahl von Promotoren wünschenswert
sein, die zur Expression in einem oder mehr Organ(en) der Pflanze
spezifisch sind. Beispiele schließen folgende ein: Licht-induzierbare
Promotoren der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase,
wenn die Expression in photosynthetischen Organen erwünscht ist,
oder Promotoren, die spezifisch in Samen aktiv sind.
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Bevorzugte
Promotoren stellen die dar, die die Expression des Proteins spezifisch
in Samen zulassen. Dies könnte
besonders nützlich
sein, da Samen die primäre
Quelle für
pflanzliche Aminosäuren
darstellen und auch, da die samenspezifische Expression jedwede
potenzielle schädliche
Wirkung in Nichtsamenorganen verhindert. Zu Beispielen samenspezifischer
Promotoren gehören
die Promotoren von Samenspeicherproteinen, sind aber nicht darauf
beschränkt.
Die Samenspeicherproteine sind strikt reguliert, indem sie fast
ausschließlich
in Samen auf eine hoch organspezifische und stufenspezifische Weise
exprimiert werden [Higgins et al. (1984) Ann. Rev. Plant Physiol.
35: 191–221;
Goldberg et al. (1989) Cell 56: 149–160; Thompson et al. (1989)
BioEssays 10: 108–113].
Darüber
hinaus können
verschiedene Samenspeicherproteine auf verschiedenen Stufen der
Samenentwicklung exprimiert werden.
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Es
gibt derzeit zahlreiche Beispiele für die samenspezifische Expression
von Samenspeicherproteingenen in transgenen dikotylen Pflanzen.
Diese schließen
Gene aus dikotylen Pflanzen für
folgende ein: Bohnen-β-Phaseolin
[Sengupta-Goplalan et al. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 3320–3324; Hoffman
et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 717–729], Bohnen-Lektin [Voelker
et al. (1987) EMBO J. 6: 3571–3577],
Sojabohnen-Lektin [Okamuro et al. (1986) Proc. Natl. Acad Sci. USA
83: 8240–8244],
Sojabohnen-Kursitz-Trypsin-Inhibitor (Perez-Grau et al. (1989) Plant
Cell 1: 1095–1109],
Sojabohnen-β-Conglycinin
[Beachy et al. (1985) EMBO J. 4: 3047–3053; Barker et al. (1988)
Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 458–462; Chen et al. (1988) EMBO J.
7: 297–302;
Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112–122; Naito et al. (1988) Plant
Mol. Biol. 11: 109–123], Erbsen-Vicilin
[Higgins et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 683–695], Erbsen-Convicilin (Newbigin
et al. (1990) Planta 180: 461], Erbsen-Legumin [Shirsat et al. (1989)
Mol. Gen. Genetics 215: 326]; Rapssamen-Napin [Radke et al. (1988)
Theor. Appl. Genet. 75: 685–694]
ebenso wie Gene aus monokotylen Pflanzen, wie zum Beispiel Mais-Zein
(15 kD) [Hoffman et al. (1987) EMBO J. 6: 3213–3221; Schernthaner et al.
(1988) EMBO J. 7: 1249–1253;
Williamson et al. (1988) Plant Physiol. 88: 1002–1007), Gersten-β-Hordein
[Marris et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10: 359–366] und Weizen-Glutenin [Colot
et al. (1987) EMBO J. 6: 3559–3564].
Darüber
hinaus erhalten Promotoren von samenspezifischen Genen, die an heterologe
Kodiersequenzen in chimären
Genkonstrukten operativ verknüpft
sind, auch ihre zeitlichen und räumlichen
Expressionsmuster in transgenen Pflanzen aufrecht. Zu solchen Beispielen
gehören
der Genpromotor des 2S-Samenspeicherproteins von Arabidopsis thaliana
zur Expression der Enkephalin-Peptide in Arabidopsis- und B. napus-Samen
[Vandekerckhove et al. (1989) Bio/Technology 7: 929–932], Promotoren
des Bohnen-Lektins und des Bohnen-β-Phaseolins zur Expression von
Luciferase (Riggs et al. (1989) Plant Sci. 63: 47–57] und
Promotoren des Weizen-Glutenins zur Expression von Chloramphenicol-Acetyltransferase
[Colot et al. (1987) EMBO J. 6: 3559–3564].
-
Von
besonderem Nutzen bei der Expression des erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragments
werden die heterologen Promotoren aus mehreren ausgiebig charakterisierten
Sojabohnen-Samenspeicherproteingenen,
wie zum Beispiel denjenigen für
den Kunitz-Trypsininhibitor [Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1:
1079–1093; Perez-Grau
et al. (1989) Plant Cell 1: 1095–1109], Glycinin (Nielson et
al. (1989) Plant Cell 1: 313–328]
und β-Conglycinin
[Harada et al. (1989) Plant Cell 1: 415–425] sein. Promotoren von
Genen für α'- und β-Unterheiten
des β-Conglycinin-Speicherproteins
der Sojabohne sind besonders nützlich
bei der Expression von lysC- und dapA-mRNAs in den Kotyledonen in
den mittleren bis späten
Stadien der Samenentwicklung von Sojabohnen [Beachy et al. (1985)
EMBO J. 4: 3047–3053;
Barker et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 458–462; Chen
et al. (1988) EMBO J. 7: 297–302;
Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112–122; Naito et al. (1988) Plant
Mol. Biol. 11: 109–123]
in transgenen Pflanzen, da a) eine sehr geringe Positionswirkung
auf ihre Expression in transgenen Samen vorliegt, und b) die beiden
Promotoren eine unterschiedliche temporale Regulation aufweisen:
der Promotor für
das Gen der α'-Untereinheit wird
einige Tage vor dem für
das Gen der β-Untereinheit
exprimiert.
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Von
besonderem Nutzen bei der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente
werden auch die heterologen Promotoren aus mehreren ausgiebig charakterisierten
Maissamenspeicherproteingenen, wie zum Beispiel endodermspezifische
Promotoren aus dem 10-kD-Zein [Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359–370], dem
27-kD-Zein [Prat et al. (1987) Gene 52: 51–49; Gallardo et al. (1988)
Plant Sci. 54: 211–281] und
dem 19-kD-Zein [Marks et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 16451–16459)
sein. Es wurde mitgeteilt, dass die relativen transkriptionalen
Aktivitäten
dieser Promotoren in Mais [Kodrzyck et al. (1989) Plant Cell 1:
105–114] eine
Basis für
die Wahl eines Promotors zur Verwendung in chimären Genkonstrukten für Mais bereitstellen. Für die Expression
in Maisembryos kann der stark embryospezifische Promotor aus dem
GLB1-Gen [Kriz (1989) Biochemical Genetics 27: 239–251, Wallace
et al. (1991) Plant Physiol. 95: 973–975] verwendet werden.
-
Es
besteht die Vorstellung, dass die Einführung von Enhancers oder Enhancer-ähnlichen
Elementen in andere Promotor-Konstrukte auch gesteigerte Grade einer
primären
Transkription für
lysC- and dapA-Gene zur
Erfüllung
der erfinderischen Aufgabe bereitstellen. Zu diesen würden virale
Enhancer gehören,
wie zum Beispiel die im 35S-Promotor gefundenen [Odell et al. (1988)
Plant Mol. Biol. 10: 263–272],
Enhancer aus den Opin-Genen [Fromm et al. (1989) Plant Cell 1: 977–984] oder
Enhancer aus jedweder anderen Quelle, die zur gesteigerten Transkription
führen,
wenn sie in einen Promotor gebracht werden, der operativ mit dem
erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment
verknüpft
ist.
-
Von
besonderer Bedeutung ist das aus dem Gen für die α'-Untereinheit von β-Conglycinin isolierte DNA-Sequenzelement,
das einem konstitutiven Promotor ein 40faches samenspezifisches
Enhancement verleihen kann [Chen et al. (1988) EMBO J. 7: 297–302; Chen
et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112–122]. Ein Fachmann kann dieses
Element ohne weiteres isolieren und es in die Promotor-Region von
jedwedem Gen insertieren, um eine samenspezifische verstärkte Expression
mit dem Promotor in transgenen Pflanzen zu erhalten. Die Insertion
eines derartigen Elements in jedwedes samenspezifische Gen, das
zu anderen Zeitpunkten als das β-Conglycinin-Gen
exprimiert wird, führt
in transgenen Pflanzen über
eine längere
Zeitdauer während
der Samenentwicklung zur Expression.
-
Jedwede
3' nicht kodierende
Region, die zur Bereitstellung eines Polyadenylierungssignals fähig ist, und
andere Regulationssequenzen, die zur ordnungsgemäßen Expression der lysC- oder
dapA-Kodierungsregionen
gegebenenfalls erforderlich sein könnten, können zum Erlangen der erfindungsgemäßen Aufgabe eingesetzt
werden. Dies würde
Folgendes einschließen:
das 3'-Ende von
jedwedem Speicherprotein, wie zum Beispiel dem 3'-Ende des Gens von Bohnen-Phaseolin,
das 3'-Ende des
Gens von Sojabohnen-β-Conglycinin, das
3'-Ende von viralen
Genen, wie zum Beispiel das 3'-Ende
der 35S- oder der 19S-Blumenkohl-Mosaik-Virus-Transkripte, das 3'-Ende von den Genen
für die
Opin-Synthese, die
3'-Enden von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase
oder das Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein
oder Sequenzen vom 3'-Ende
aus jedweder Quelle dergestalt, dass die eingesetzte Sequenz die
notwendigen Regulationsinformationen in ihrer Nukleinsäuresequenz
bereitstellt, um zu einer ordnungsgemäßen Expression der Kombination
von der Promotor-/lysC-Kodierungsregion zu führen, mit der sie operativ
verknüpft
ist. Es gibt im Stand der Technik zahlreiche Beispiele, die die
Nützlichkeit
verschiedener 3' nicht
kodierender Regionen (zum Beispiel siehe Ingelbrecht et al. (1989) Plant
Cell 1: 671–680]
lehrt.
-
DNA-Sequenzen,
die für
intrazelluläre
Lokalisierungssequenzen kodieren, können der lysC- und dapA-Kodiersequenz
zur ordnungsgemäßen Expression
der Proteine zur Erfüllung
der erfindungsgemäßen Aufgabe
gegebenenfalls zugefügt
werden. Es ist bekannt, dass biosynthetische Enzyme von Pflanzenaminosäuren in
den Chloroplasten lokalisiert sind und deshalb mit einem Chloroplasten-Targetingsignal synthetisiert werden.
Bakterienproteine, wie zum Beispiel DHDPS und AKIII, verfügen über kein
solches Signal. Eine Chloroplast-Transitsequenz könnte deshalb
mit den dapA- und lysC-Kodiersequenzen fusioniert werden. Bevorzugte
Chloroplast-Transitsequenzen stellen diejenigen der kleinen Untereinheit
von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase, z. B. von der Sojabohne
[Berry-Lowe et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 483–498], zur
Verwendung in dikotylen Pflanzen und von Mais [Lebrun et al. (1987)
Nucleic Acids Res. 15: 4360] zur Verwendung in monokotylen Pflanzen
dar.
-
EINFÜHRUNG VON CHIMÄREN lysC-
UND dapA-GENEN IN PFLANZEN
-
Es
stehen dem Fachmann verschiedene Verfahren zur Einführung einer
DNA-Sequenz (d. h. zur Transformation) in eukaryote Zellen höherer Pflanzen
zur Verfügung
(siehe
EPO-Veröffentlichungen
0295959 A2 und
0138341
A1 ). Solche Verfahren schließen die ein, die auf den Ti-
und Ri-Plasmiden von Agrobacterium spp. basierenden Transformationsvektoren
basieren. Die Verwendung des binären
Typs dieser Vektoren ist besonders bevorzugt. Sich von Ti herleitende
Vektoren transformieren viele verschiedene höhere Pflanzen, einschließlich monokotyler
und dikotyler Pflanzen, wie zum Beispiel Sojabohnen, Baumwolle und
Raps [Pacciotti et al. (1985) Bio/Technology 3: 241; Byrne et al.
(1987) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 8:3; Sukhapinda et al.
(1987) Plant Mol. Biol. 8: 209–216;
Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 178; Potrykus (1985) Mol.
Gen. Genet. 199: 183].
-
Zur
Einführung
in Pflanzen können
die erfindungsgemäßen chimären Gene
in die in Beispielen 7–12 und
14–16
beschriebenen binären
Vektoren insertiert werden. Die Vektoren stellen einen Teil eines
binären Ti-Plasmidvektorsystems
[Bevan, (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711–8720] von Agrobacterium tumefaciens dar.
-
Andere
Transformationsverfahren stehen dem Fachmann zur Verfügung, wie
zum Beispiel die direkte Aufnahme von Fremd-DNA-Konstrukten [siehe
EPO-Veröffentlichung 0295959 A2 ),
Elektroporationsverfahren [siehe Fromm et al. (1986) Nature (London)
319: 791] oder das Beschießen
mit den Nukleinsäurekonstrukten beschichteten
Metallpartikeln bei hoher Geschwindigkeit [siehe Kline et al. (1987)
Nature (London) 327: 70, und siehe
US-Patent
Nr. 4945050 ). Sobald sie transformiert sind, können die
Zellen vom Fachmann regeneriert werden.
-
Von
besonderer Relevanz sind die vor kurzem beschriebenen Verfahren
zur Transformation von Fremdgenen in gewerblich wichtige Kulturpflanzen,
wie zum Beispiel Rapssamen [siehe De Block et al. (1989) Plant Physiol.
91: 694–701],
Sonnenblumen [Everett et al. (1987) Bio/Technology 5: 1201], Sojabohnen
[McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923; Hinchee et al. (1988)
Bio/Technology 6: 915; Chee et al. (1989) Plant Physiol. 91: 1212–1218; Christou
et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7500–7504;
EPO-Veröffentlichung 0301749 A2 ]
und Mais [Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603–618; Fromm
et al. (1990) Biotechnology 8: 833–839].
-
Zur
Einführung
in Pflanzen durch Beschießen
bei hoher Geschwindigkeit können
die erfindungsgemäßen chimären Gene
in wie in Beispiel 6 beschriebene geeignete Vektoren insertiert
werden. Transformierte Pflanzen können wie in Beispielen 17–19 beschrieben
erhalten werden.
-
EXPRESSION VON CHIMÄREN lysC-
UND dapA-GENEN IN PFLANZEN
-
Zur
Bestimmung der Expression chimärer
Gene in Blättern
oder Samen der transformierten Pflanzen können die AKIII- oder DHDPS-Proteine
nachgewiesen und enzymatisch und/oder immunologisch anhand von dem
Fachmann bekannten Verfahren quantifiziert werden. Auf diese Weise
lassen sich Linien, die hohe Proteinspiegel exprimieren, leicht
identifizieren.
-
Zur
Messung der Zusammensetzung freier Aminosäuren von Blättern können die freien Aminosäuren mithilfe
verschiedener Verfahren, einschließlich der in Beispiel 7 beschriebenen
extrahiert werden. Zur Messung der Zusammensetzung freier Aminosäuren oder
Gesamtaminosäuren
von Samen können
Extrakte mithilfe verschiedener Verfahren, einschließlich der
in Beispiel 8 beschriebenen hergestellt werden.
-
Es
lag keine signifikante Wirkung der Expression von AKIII oder AKIII-M4
(mit einem Chloroplasten-Targetingsignal) auf die Spiegel von freiem
Lysin oder Threonin (oder jedweder anderen Aminosäure) in den
Blättern
vor (siehe Tabelle 2 in Beispiel 7). Da AKIII-M-1 gegen die Feedback-Inhibition durch
jedwedes der Endprodukte des Wegs unempfindlich ist, deutet dies
daraufhin, dass andere Schritte des Biosynthesewegs in Blättern kontrolliert
werden müssen.
-
Dagegen
führte
die Expression von AKIII oder AKIII-M4 (mit einem Chloroplasten-Targetingsignal)
in den Samen zu 2- bis 4fachen bzw. 4- bis 23fachen Steigerungen
des Spiegels von freiem Threonin in den Samen im Vergleich zu nicht
transformierten Pflanzen und in einigen Fällen zu 2- bis 3fachen Steigerungen
des Spiegels von freiem Lysin (Tabelle 3, Beispiel 8). Es bestand eine
gute Korrelation zwischen Transformanten, die höhere Spiegel von AKIII- oder
AKIII-M4-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel von freiem Threonin
aufweisen, dies traf jedoch nicht auf Lysin zu. Die mit dem AKIII-Protein
erreichten relativ kleinen Steigerungen von freiem Threonin oder
Lysin waren nicht ausreichend, um im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen
nachweisbare Steigerungen der Spiegel des Gesamtthreonins oder -lysins
in den Samen zu ergeben. Die größeren Steigerungen
von freiem Threonin, die über
die Expression des AKIII-M4-Proteins erreicht wurden, waren im Vergleich
zu Samen aus nicht transformierten Pflanzen, zum Erhalt nachweisbarer
Steigerungen der Spiegel des Gesamtthreonins in den Samen ausreichend.
Es wurden 16 bis 25%ige Steigerungen des Gesamthreoningehalts der
Samen beobachtet. Die erhöhtes
Gesamtthreonin zeigenden Linien waren die gleichen wie die, die
die höchste
Steigerung des freien Threonins und eine hohe Expression des AKIII-M4-Proteins aufwiesen.
-
Die
vorstehenden Lehren zeigen, dass die Aminosäure-Biosynthese in Samen stattfindet
und durch die Expression von Fremdgenen, die für biosynthetische Aminosäure-Enzyme
kodieren, moduliert werden kann. Sie zeigen überdies auch, dass sich die
Kontrolle des Biosynthesewgs einer Aminosäure von einem Pflanzenorgan
zum anderen, z. B. von Samen und Blättern, deutlich unterscheiden
kann. Die Bedeutung dieser Beobachtung wird nach der Erwägung der
verschiedenen Wirkungen der Expression einer nachstehend beschriebenen
fremden DHDPS in Blättern
und Samen hervorgehoben. Es kann daraus gefolgert werden, dass die
Threonin-Biosynthese in Semen primär über die Endprodukt-Inhibition
von AK kontrolliert wird. Deshalb kann die Threonin-Akkumulation
in den Samen von Pflanzen durch Expression eines über die
Transformation eingeführten
Gens gesteigert werden, das für
AK kodiert, die gegen die Lysininhibition unempfindlich ist und
die im Chlaroplasten lokalisiert ist.
-
Die
vorstehenden Lehren weisen auch daraufhin, dass transformierte Pflanzen,
die höhere
Spiegel des eingeführten
Enzyms in Semen exprimieren, höhere
Spiegel von freiem Threonin in Semen akkumulieren. Die Lehren weisen überdies
darauf hin, dass transformierte Pflanzen, die eine Lysinunempfindliche
AK in Semen exprimieren, höhere
Spiegel von freiem Threonin in Samen akkumulieren als transformierte
Pflanzen, die ähnliche
Spiegel einer Lysin-empfindlichen AK exprimieren. Zur Erlangung
gewerblich wertvoller Steigerungen des freien Threonins ist eine
vollkommen Lysin-unempfindliche AK bevorzugt.
-
Diese
Lehren zeigen, dass der Spiegel des freien Lysins in Samen die Akkumulation
von einer anderen sich von Aspartat herleitenden Aminosäure, Threonin,
durch die Endprodukt-Inhibition von AK kontrolliert. Zur Akkumulation
hoher Konzentrationen von freiem Lysin selbst ist es notwendig,
die Lysin-Inhibition
von AK über die
Expression einer Lysin-unempfindlichen AK zu umgehen.
-
Die
Expression von aktivem DHDPS-Enzym von E. coli wurde sowohl in jungen
als auch maturen Blättern
der transformierten Tabakpflanzen (Tabelle 4, Beispiel 9) erreicht.
Hohe Spiegel von freiem Lysin, die um des 50- bis 100fache höher als
in normalen Tabakpflanzen sind, akkumulierten sich in den jungen
Blättern
der Pflanzen, die das Enzym mit einem Chloroplasten-Targetingsignal,
aber nicht ohne ein derartiges Targetingsignal exprimieren. Eine
viel kleinere Akkumulation von freiem Lysin (2- bis 8fach) wurde
in den größeren Blättern gesehen.
Experimente, die des Lysin im Phloem messen, deuten darauf hin,
dass Lysin aus den großen Blättern exportiert
wird. Dieses exportierte Lysin kann zur Akkumulation von Lysin in
den kleinen wachsenden Blättern
beitragen, von denen bekannt ist, dass sie Nährstoffe aufnehmen anstelle
sie zu exportieren. Es wurde keine Wirkung auf die Spiegel des freien
Lysins in den Samen dieser Pflanzen beobachtet, obwohl das DHDPS-Enzym
von E. coli sowohl in den Samen als auch in den Blättern exprimiert
wurde.
-
Die
hochgradige samenspezifische Expression des DHDPS-Enzyms von E.
coli, entweder mit oder ohne ein Chloroplasten-Targetingsignal,
wies keine Wirkung auf die Zusammensetzung des Gesamt- oder freien
Lysins oder Threonins (oder jedweder anderen Aminosäure) der
Samen in jedweder transformierten Linie (Tabelle 5, Beispiel 10)
auf. Diese Ergebnisse weisen nach, dass die Expression in Samen
von einem DHDPS-Enzym, das weniger empfindlich gegen Lysin als das
Pflanzenenzym ist, nicht ausreichend ist, um zu einer gesteigerten
Produktion oder Akkumulation von freiem Lysin zu führen.
-
Diese
Lehren von Transformanten, die das DHDPS-Enzym von E. coli exprimieren,
deuten darauf hin, dass die Lysin-Biosynthese in Blättern primär über die
Endprodukt-Inhibition von DHDPS kontrolliert wird, während in
Samen mindestens ein zusätzlicher
Kontrollpunkt in der Bahn vorhanden sein muss. Die Lehren von Transformanten,
die die AKIII- und AKIII-M4-Enzyme von E. coli exprmieren, deuten
darauf hin, dass der Spiegel von freiem Lysin in Samen die Akkumulation
von allen sich von Aspartat herleitenden Aminosäuren durch die Endprodukt-Inhibition
von AK kontrollieren. AK stellt folglich einen zusätzlichen
Kontrollpunkt dar.
-
Zum
Erlangen einer simultanen, hochgradigen Expression sowohl von DHDPS
als auch AKIII-M4 von E. coli in Blättern und Samen, konnten Pflanzen,
die jedes der Gene exprmieren, gekreuzt und Hybride, die beide exprimieren,
ausgewählt
werden.
-
Ein
anderes Verfahren würde
darin bestehen, Vektoren zu konstruieren, die beide Gene auf dem
gleichen DNA-Fragment enthalten und die verknüpften Gene aber die Transformation
in Pflanzen einführen.
Dies ist bevorzugt, weil die Gene während der sich anschließenden Pflanzenzüchtungsbemühungen durchweg
verknüpft
bleiben worden. Repräsentative
Vektoren, die beide Gene auf dem gleichen DNA-Fragment tragen, sind in
den Beispielen 11, 12, 16 und 18 beschrieben.
-
Tabakpflanzen,
die mit einem Vektor transformiert sind, der sowohl DHDPS- als auch
AKIII-M4-Gene von
E. coli tragt, die mit dem 35S-Promotor verknüpft sind, sind in Beispiel
11 beschrieben. In Transformanten, die wenig oder kein AKIII-M4
exprmieren, bestimmt die Höhe
der Expression von E. coli-DHDPS den Grad der Lysin-Akkumulation
in Blättern
(Beispiel 11, Tabelle 6). In Transformanten, die sowohl AKIII-M4
und E. coli-DHDPS exprmieren, spielt jedoch bei der Kontrolle des
Grades der Lysin-Akkumulation
die Höhe
der Expression von jedem Protein eine Rolle. Transformierte Linien,
die DHDPS in vergleichbaren Spiegeln exprimieren, akkumulieren mehr
Lysin, wenn auch AKIII-M4 exprimiert wird (Tabelle 6, vergleiche
Linien 564-18A, 564-56A, 564-36E, 564-55B, and 564-47A). Folglich
steigert die Expression einer Lysin-unempfindlichen AK die Lysin-Akkumulation
in Blättern,
wenn es zusammen mit einem DHDPS-Enzym exprimiert wird, das um das 20fache
weniger empfindlich gegen Lysin ist als das endogene Pflanzenenzym.
-
Diese
Ergebnisse von den Blättern
zusammengenommen mit den Ergebnissen von den Samen, die sich von
der Expression von E. coli-AKIII-M4 und E. coli-DHDPS getrennt in
Samen herleiten, deuten darauf hin, dass die simultane Expression
von sowohl E. coli-AKIII-M4 als auch E. coli-DHDPS in Samen zu einer
gesteigerten Akkumulation sowohl von freiem Lysin als auch zu einer
gesteigerten Akkumulation von freiem Threonin führen würde. Tabakpflanzen, die mit
einem Vektor transformiert sind, der sowohl DHDPS- als auch AKIII-M4-Gene
von E. coli trägt,
die mit dem Phaseolin-Promoter verknüpft sind, sind in Beispiel
12 beschrieben. In diesen Pflanzen liegt eine gesteigerte Akkumulation
von freiem Lysin und freiem Threonin vor. Die gesteigerten Spiegel
von freiem Threonin lagen um das 4fache über denen normaler Samen, anstelle
der 20fachen Steigerung, die in Samen gesehen wird, die AKIII-M4
allein exprimieren. Die Reduktion der Akkumulation von freiem Threonin
deutet darauf hin, dass Intermediate in der Bahn den Lysinzweig
des Biosynthesewegs hinunter umgeleitet werden. Der gesteigerte
Spiegel von freiem Lysin lag um das 2fache über dem normaler Samen (oder
Samen, die E. coli-DHDPS allein exprimieren). Die Steigerung von
Lysin in Samen entspricht jedoch nicht der 100fachen Steigerung,
die in Blättern
gesehen wird.
-
Das
DHDPS-Enzym von E. coli ist weniger empfindlich gegen die Lysin-Inhibition
als Pflanzen-DHDPS, wird aber noch durch Lysin inhibiert. Die vorstehenden
Lehren über
die AK-Proteine deuten darauf bin, dass die Expression eines vollkommen
Lysin-unempfindlichen Enzyms zu einer viel größeren Akkumulation des Threonin-Endprodukts
im Aspartatweg als die Expression eines Enzyms führen kann, das obwohl es weniger
empfindlich als das Pflanzenenzym ist, noch durch Lysin inhibiert
wird. Deshalb wurden, wie in Beispielen 15 und 19 beschrieben, Vektoren,
die sowohl Corynebacterium-DHDPS- als auch -AKIII-M4-Gene tragen,
die mit den samenspezifischen Promotoren verknüpft sind, konstruiert. Tabakpflanzen,
die mit Vektoren transformiert sind, die sowohl DHDPS- als auch
AKIII-M-Gene von Corynebacterium tragen, die mit samenspezifischen
Promotoren verknüpft
sind, werden in Beispiel 15 beschrieben. Wie in Tabelle 9 ersichtlich
ist, zeigen diese Pflanzen keine größere Akkumulation von freiem
Lysin in Samen als zuvor beschriebene Pflanzen, die das DHDPS-Enzym
von E. coli zusammen mit dem Lysin-unempfindlichen AK exprimieren.
Rückblickend kann
dieses Ergebnis durch die Tatsache erklärt werden, dass die Lysin-Akkumulation
in Samen niemals eine Konzentration erreichte, die zur Inhibition
der E. coli-DHDPS hoch genug war, folglich wies der Austausch dieses
Enzyms durch ein Lysin-unempfindliches Corynebacterium-DHDPS keine
Wirkung auf.
-
In
transformierten Linien, die hohe Spiegel von E. coli-AKIII-M4- und
E. coli-DHDPS oder Corynebacterium-DHDPS exprimieren, war der Nachweis
erheblicher Mengen von α-Aminoadipinsäure möglich. Es
besteht die Annahme, dass diese Verbindung ein Intermediat im Katabolismus
von Lysin in Zerealiensamen darstellt, in der Regel aber aufgrund
seiner geringen Akkumulationsmenge nur über radioaktive Tracer-Experimente
nachgewiesen wird. Die Entdeckung von hohen Spiegeln dieses Intermediats,
die mit den Spiegeln von freien Aminosäuren vergleichbar sind, deutet
darauf hin, dass in den Samen dieser transformierten Linien eine große Lysinmenge
produziert wird und in den katabolischen Weg eintritt. Der Aufbau
der α-Aminoadipinsäure wurde
in Transformanten, die nur E. coli-DHDPS oder nur -AKIII-M4 in Samen
exprimieren, nicht beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Expression beider Enzyme gleichzeitig notwendig ist, um hohe Spiegel
von freiem Lysin in Samen zu produzieren. Zur Akkumulation hoher
Spiegel von freiem Lysin kann es auch zur Verhinderung des Lysin-Katabolismus
notwendig sein. Als Alternative könnte es gegebenenfalls zur
Umwandlung der produzierten hohen Lysin-Spiegel in eine Form, die gegen Abbau
unempfindlich ist, z. B. durch Inkorporation in ein Di-, Tri- oder Oligopeptid,
oder in ein lysinreiches Speicherprotein, erwünscht sein.
-
ISOLIERUNG EINES LYSIN-KETOGLUTARAT-REDUKTASE-GENS
IN PFLANZEN
-
Es
liegen bisher wenig Informationen über den Lysin-Katabolismus
in Pflanzen vor. Verfügbare
Hinweise geben zu erkennen, dass Lysin über den Saccharopinweg katabolisiert
wird. Der erste enzymatische Hinweis auf das Bestehen dieses Wegs
stellte der Nachweis der Aktivität
der Lysin-Ketoglutarat-Reduktase (LKR)
im immaturen Endosperm von sich entwickelnden Maissamen dar (Arruda
et al. (1982) Plant Physiol. 69: 988–989]. LKR katalysiert den
ersten Schritt im Lysin-Katabolismus, die Kondensation von L-Lysin
mit α-Ketoglutarat
zu Saccharopin unter Verwendung von NADPH als einen Cofaktor. Die
LKR-Aktivität
nimmt ab dem Einsetzen der Entwicklung des Endosperms scharf zu,
erreicht ca. 20 Tage nach der Bestäubung einen Peak und nimmt
danach ab [Arruda et al. (1983) Phytochemistry 22: 2687–2689].
Zur Verhinderung des Katabolismus von Lysin wäre die Reduktion oder Elimination
der LKR-Expression oder -Aktivität
wünschenswert. Dies
könnte
durch Klonieren des LKR-Gens, Herstellen eines chimären Gens
zur Expression einer Antisense-RNA (
Eur.
Patent-Anmeldung Nr. 84112647.7 ) für LKR und Einführen des
chimären
Gens über
die Transformation in Pflanzen geschehen.
-
Zum
Klonieren des Mais-LKR-Gens wurde RNA 19 Tage nach der Bestäubung aus
sich entwickelnden Samen isoliert. Diese RNA wurde an die Fa. Clontech
Laboratories, Inc., (Palo Alto, CA) zur kundenspezifischen Synthese
einer cDNA-Bibliothek im Vektor Lambda-Zap II gesandt. Die Umwandlung
der Lambda-Zap II-Bibliothek in eine Phagemid-Bibliothek und dann
in eine Plasmid-Bibliothek
wurde unter Befolgung des von Clontech bereitgestellten Protokolls
erreicht. Sobald sie in eine Plasmid-Bibliothek umgewandelt wurden,
tragen die erhaltenen Ampicillin-resistenten Klone das cDNA-Insert
im Vektor pBluescript SK(–).
Die Expression der cDNA untersteht der Kontrolle des lacZ-Promotors auf dem
Vektor.
-
Zur
Auswahl von das LKR-Gen tragenden Klonen wurde ein speziell konzipierter
E. coli-Wirt, DE126, wie in Beispiel 20 beschrieben, konstruiert.
DE126 weist den Gentyp F'16/malE52::Tn10,
arg, ilvA296, thrA1101, metL100, lysC+, λ–,
rpsL9, malT1, xyl-7, mtl-2, thi-1?, supE44? auf. Sein Wachstum wird
durch 20 μg/ml
L-Lysin in einem synthetischen Medium inhibiert. Es wird erwartet,
dass die Expression von LKR in DE126 die Wachstumsinhibition durch
Reduktion der Lysinkonzentration umkehrt. Die Verwendung von DE126 bei
der Auswahl von Klonen aus der Mais-cDNA-Bibliothek führt zum
in Beispiel 20 beschriebenen Lysin-resistenten Wachstum.
-
Die
auf diese Weise erhaltene Mais-LKR-cDNA kann als eine DNA-Hybridisierungssonde
zur Identifizierung und Isolierung von LKR-Genen aus anderen Pflanzenspezies
verwendet werden. Ein zur Expression von Antisense-RNA für LKR konzipiertes
chimäres
Gen kann durch Verknüpfung
des LKR-Gens in
reverser Orientierung zu jedweder der vorstehend beschriebenen Pflanzenpromotor-Sequenzen
konstruiert werden. Bevorzugte Promotoren wären samenspezifische Promotoren.
Für Mais
würde ein
starker Endosperm-spezifischer Promoter, z. B. der 10-kD- oder 27-kD-Zein-Promotor,
bevorzugt.
-
Zum
Erhalt von Pflanzen, die ein chimäres Gen für Antisense-LKR exprimieren
ebenso wie Gene, die für
Lysin-unempflindliche AK und DHDPS kodieren, könnte das Antisense-LKR-Gen
mit Genen verknüpft
werden, die für
Lysin-unempfindliche AK und DHDPS kodieren und alle drei Gene könnten über Transformation
in Pflanzen eingeführt
werden. Als Alternative könnten
die chimären
Gene für
Antisense-LKR in zuvor transformierte Pflanzen transformiert werden,
die Lysin-unempfindliche AK und DHDPS exprimieren oder das Antisense-LKR-Gen
könnte
in normale Pflanzen eingeführt
werden und die erhaltenen Transformanten könnten mit Pflanzen gekreuzt
werden, die Lysin-unempfindliche AK und DHDPS exprimieren.
-
VERWENDUNG DES CHIMÄREN cts/lysC-M4-GENS ALS EIN
SELEKTIERBARER MARKER FÜR
DIE PFLANZENTRANSFORMATION
-
Das
Wachstum von Zellkulturen und Keimpflanzen von vielen Pflanzen wird
durch hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin inhibiert. Das
Wachstum wird durch Zufügen
von Methionin (oder Homoserin, das in vivo in Methionin umgewandelt
wird) wiederhergestellt. Es wird angenommen, dass die Lysin- plus
Threonin-Inhibition aus der Feedback-Inhibition von endogener AK
resultiert, die den Fluss durch den Weg reduziert, was zur Verarmung
von Methionin führt.
Beim Tabak befanden sich in den Blättern zwei AK-Enzyme, ein Lysin-empfindliches
und ein Threonin-empfindliches [Negrutui et al. (1984) Theor. Appl.
Genet. 68: 11–20]. Hohe
Konzentrationen von Lysin plus Threonin inhibieren das Wachstum
von Sprossen aus Tabakblattscheiben und diese Inhibition wird durch
das Zufügen
niedriger Konzentrationen von Methionin umgekehrt. Folglich ist
die Wachstumsinhibition vermutlich auf die Inhibition der beiden
AK-Isozyme zurückzuführen.
-
Die
Expression von aktivem Lysin und Threonin unempfindlichem AKIII-M4
kehrt auch die Lysin- plus Threonin-Wachstumsinhibition um (Tabelle
2, Beispiel 7). Es besteht eine gute Korrelation zwischen dem Spiegel
des exprimierten AKIII-M4-Proteins und der Resistenz gegen Lysin
plus Threonin. Die Expression von Lysin-empfindlichem Wildtyp-AKIII
weist keine ähnliche
Wirkung auf. Da die Expression des AKIII-M4-Proteins unter normalen
Inhibitionsbedingungen Wachstum zulässt, kann ein chimäres Gen,
das die Expression von AKIII-M4 in Pflanzen veranlasst, als ein
selektierbarer genetischer Marker zur Transformation wie in Beispielen 13
und 17 erläutert,
verwendet werden.
-
BEISPIELE
-
Die
vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen definiert,
worin alle Teile und Prozente, sofern nicht anderweitig angegeben
wird, Gewichtsteile und Gewichtsprozente und die Grade Celsius darstellen. Es
sollte zur Kenntnis genommen werden, dass diese Beispiele, während sie
die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen
angeben, lediglich zur Erläuterung
vorgelegt werden. Aus der vorstehenden Besprechung und diesen Beispielen
kann ein Fachmann die wesentlichen erfindungsgemäßen Merkmale festlegen und
kann ohne aus dem Gedanken und Umfang davon zu kommen, verschiedene Änderungen
und Modifikationen an der Erfindung vornehmen, um sie den verschiedenen
Verwendungszwecken und Bedingungen anzupassen.
-
BEISPIEL 1
-
ISOLIERUNG DES E. coli-lysC-GENS UND ZU
LYSIN-UNEMPFINDLICHEM AKIII FÜHRENDEN
MUTATIONEN IN lysC
-
Das
lysC-Gen von E. coli wurde zuvor kloniert, die Restriktionsendonuklease
kartiert und sequenziert [Cassan et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:
1052–1057].
Das erfindungsgemäße lysC-Gen
wurde auf einem Bakteriophagen-Lambda-Klon aus einer geordneten
Bibliothek von 3400 überlappenden
Segmenten von klonierter E. coli-DNA, konstruiert von Kohara, Akiyama
und Isono (Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508], erhalten. Diese Bibliothek
stellt eine physikalische Karte des gesamten E. coli-Chromosoms dar und
verknüpft
die physikalische Karte mit der genetischen Karte. Anhand der Kenntnisse der
Position auf der Karte von lysC bei 90 min auf der genetischen Karte
von E. coli [Theze et al. (1974) J. Bacteriol. 117: 133–143], der
Restriktionsendonuklease-Karte des klonierten Gens [Cassan et al.
(1986) J. Biol. Chem. 261: 1052–1057]
und der Restriktionsendonuklease-Karte der klonierten DNA-Fragmente
in der E. coli-Bibliothek [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508] war
es möglich,
Lambda-Phagen 4E5 und 7A4 [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508] als
mögliche Kandidaten
zum Tragen des lysC-Gens zu wählen.
Die Phagen wurden in flüssiger
Kultur aus Einzelplaques wie beschrieben [siehe Current Protocols
in Molecular Biology (1987) Ausubel et al. Hrsg. John Wiley & Sons New York]
unter Verwendung von LE392 als Wirt [siehe Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press] gezüchtet.
Die Phagen-DNA wurde wie beschrieben durch Phenolextraktion hergestellt
[siehe Current Protocols in Molecular Biology (1987) Ausubel et
al. Hrsg. John Wiley & Sons
New York).
-
Aus
der Sequenz des Gens wurden mehrere Restriktionsendonuklease-Fragmente,
die für
das lysC-Gen diagnostisch
waren, vorausgesagt, einschließlich
eines 1860 bp großen
EcoR I-Nhe I-Fragments, eines 2140 bp großen EcoR I-Xmn I-Fragments
und eines 1600 bp großen
EcoR I-BamH I-Fragments. Jedes dieser Fragmente wurde in den beiden
Phagen-DNAs nachgewiesen, womit bestätigt wurde, dass diese das lysC-Gen
trugen. Das EcoR I-Nhe I-Fragment wurde isoliert und in dem mit
den gleichen Enzymen verdauten Plasmid pBR322 subkloniert, wobei
sich ein Ampicillin-resistenter, Tetracyclin-empfindlicher E. coli-Transformant
ergab. Das Plasmid wurde als pBT436 bezeichnet.
-
Zur
Etablierung, dass das klonierte lysC-Gen funktionell war, wurde
pBT436 in den E. coli-Stamm Gif106M1 (E. coli-Stamm CGSC-5074 vom
Genetic Stock Center) transformiert, der Mutationen in jedem der drei
AK-Gene von E. coli aufweist [Theze et al. (1974) J. Bacteriol.
117: 133–143].
Diesem Stamm mangelt die gesamte AK-Aktivität und benötigt deshalb Diaminopimelat
(ein Vorläufer
zu Lysin, der auch für
die Zellwand-Biosynthese wesentlich ist), Threonin und Methionin.
Im transformierten Stamm wurden alle diese nutritiven Anforderungen
gemildert, wobei nachgewiesen wurde, dass das klonierte lysC-Gen
für die
funktionelle AKIII kodierte.
-
Das
Zufügen
von Lysin (oder Diaminopimelat, das ohne weiteres in vivo in Lysin
umgewandelt wird) in einer Konzentration von ca. 0,2 mM zum Wachstumsmedium
inhibiert das Wachstum von mit pBT436 transformiertem Gif106M1.
Es wurde M9-Medium [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:
a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], supplementiert
mit dem zum Gif106M11-Wachstum erforderlichen Arginin und Isoleucin
und Ampicillin zur Aufrechterhaltung der Selektion auf das pBT436-Plasmid,
verwendet. Diese Inhibition wird durch Zufügen von Threonin plus Methionin
zum Wachstumsmedium umgekehrt. Diese Ergebnisse gaben zu erkennen,
dass AKIII durch exogen zugefügtes
Lysin inhibiert werden kannte, was zur Verarmung der anderen sich
von Aspartat herleitenden Aminosäuren
führt.
Diese Eigenschaft des pBT436-transformierten Gif106M1 wurde zum
Auswahlen auf Mutationen in lysC, das für Lysin-unempfindliche AKIII
kodiert, verwendet.
-
Mit
pBT436 transformierte Einzelkolonien von Gif106M1 wurden gewonnen
und in 200 μl
eines Gemischs von 100 μl
1%igem Lysin plus 100 μl
M9-Medium resuspendiert. Die gesamte Zellsuspension mit 107–108 Zellen wurde auf einer Petrischale ausgestrichen,
die M9-Medium enthielt, das mit Arginin, Isoleucin und Ampicillin
supplementiert war. Auf diese Weise wurden 16 Petrischalen vorbereitet.
Auf 11 der 16 Petrischalen traten von 1 bis 20 Kolonie(n) in Erscheinung.
(Wenn verfügbar)
wurden eine oder zwei Kolonie(n) gewonnen und erneut auf Lysin-Resistenz
getestet und von diesen wurden neun Lysin-resistente Klone erhalten. Die
Plasmid DNA wurde aus acht von diesen vorbereitet und erneut in
Gif106M1 transformiert, um zu bestimmen, ob die Lysin-Resistenzdeterminante
Plasmid-bürtig
ist. Sechs von den acht Plasmid-DNAs ergaben Lysin-resistente Kolonien.
Drei dieser sechs trugen lysC-Gene, die für AKIII kodierten, die durch
15 mM Lysin nicht inhibiert wurde, wohingegen die Wildtyp-AKIII
durch 0,3–0,4
mM Lysin 50%ig inhibiert und durch 1 mM Lysin >90%ig inhibiert wurde (nähere Einzelheiten
siehe Beispiel 2).
-
Zur
Bestimmung der molekularen Basis auf Lysin-Resistenz wurden die
Sequenzen des Wildtyp-lysC-Gens
und drei mutante Gene bestimmt. Ein Verfahren zu „Using
mini-prep plasmid DNA for sequencing double stranded templates with
sequenaseTM" (Verwendung
von mini-prep-Plasmid-DNA zum Sequenzieren doppelsträngiger Templates
mit SequenaseTM" [Kraft et al. (1988) BioTechniques
6: 544–545]
wurde verwendet. Oligonukleotid-Primer, die auf der veröffentlichten
lysC-Sequenz basieren und ca. alle 200 bp mit Zwischenraum angeordnet
waren, wurden zur Förderung
der Sequenzierung synthetisiert. Die Sequenz des Wildtyp-lysC-Gens,
das in pBT436 (SEQ ID NO:1) kloniert war, unterschied sich von der
veröffentlichten
lysC-Sequenz in der Kodierungsregion an 5 Positionen. Vier dieser
Nukleotidunterschiede befanden sich an der dritten Position in einem
Codon und würden
zu keiner Änderung
der Aminosäuresequenz
des AKIII-Proteins führen.
Einer der Unterschiede würde
in einem Cystein zur Glycin-Substitution an der Aminosäure 58 von
AKIII resultieren. Diese Unterschiede sind wahrscheinlich auf verschiedene
Stämme
zurückzuführen, aus
denen die lysC-Gene kloniert wurden.
-
Die
Sequenzen der drei mutanten lysC-Gene, die für Lysin-unempfindliche AK kodierten,
unterschieden sich jede von der Wildtyp-Sequenz um ein einzelnes
Nukleotid, was zu einer einzelnen Aminosäure-Substitution im Protein
führte.
Die Mutante M2 wies ein A auf, das für ein G am Nukleotid 954 von
SEQ ID NO:1 substituiert war, was zu einem Isoleucin für die Methionin-Substitution
an der Aminosäure
318 führte
und Mutanten M3 und M4 wiesen ein identisches T für C-Substitutionen
am Nukleotid 1055 von SEQ ID NO:1 auf, was zu einem Isoleucin für die Threonin-Substitution
an der Aminosäure
352 führte.
Folglich ist eine von diesen beiden dieser einzelnen Aminosäure-Substitutionen
ausreichend, um das AKIII-Enzym gegen die Lysin-Inhibition unempfindlich
zu machen.
-
BEISPIEL 2
-
HOCHGRADIGE EXPRESSION VON WILDTYP- UND
MUTANTEN lysC-GENEN IN E. coli
-
Ein
Nco I (CCATGG)-Ort wurde am Translationsinitiationscodon des lysC-Gens
unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide insertiert:
SEQ
ID NO:2:
GATCCATGGC TGAAATTGTT GTCTCCAAAT TTGGCG
SEQ ID
NO:3:
GTACCGCCAA ATTTGGAGAC AACAATTTCA GCCATG
-
Wenn
sie annealt sind, weisen diese Oligonukleotide BamH I- und Asp718-„sticky” Enden
auf. Das Plasmid pBT436 wurde mit BamH I verdaut, das stromaufwärts die
lysC-Kodiersequenz schneidet und Asp718, das 31 Nukleotide stromabwärts vom
Initiationscodon schneidet. Die annealten Oligonukleotide wurden
an den Plasmidvektor ligiert, und es wurden E. coli-Transformanten
erhalten. Es wurde Plasmid-DNA hergestellt und auf Insertion der
Oligonukleotide, basierend auf der Anwesenheit eines Nco I-Ortes
gescreent. Ein Plasmid, das den Ort enthält, wurde zur Gewährleistung
sequenziert, dass die Insertion korrekt war und wurde als pBT457
bezeichnet. Zusätzlich
zur Herbeiführung
eines Nco I-Orts am Initiationscodon von lysC verändert diese
Oligonukleotid-Insertion das zweite Codon von TCT, das für Serie
kodiert, in GCT, das für
Alanin kodiert. Diese Aminosäure-Substitution
hatte scheinbar keine Wirkung auf die AKIII-Enzymaktivität.
-
Zur
Erzielung einer hochgradigen Expression der lysC-Gene in E. coli
wurde der bakterielle Expressionsvektor pBT430 verwendet. Dieser
Vektor stellt ein Derivat von pET-3a dar [Rosenberg et al. (1987)
Gene 56: 125–135],
welches das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase/T7-Promotor-System
einsetzt. Das Plasmid pBT430 wurde wie folgt konstruiert: zuerst
durch Zerstörung
der EcoR I- und Hind III-Orte in pET-3a an ihren ursprünglichen
Positionen. Ein Oligonukleotid-Adapter, der EcoR I- und Hind III-Orte
enthält,
wurde am BamH I-Ort von pET-3a insertiert Dies führte pET-3aM mit zusätzlichen
einzigartigen Klonierungsorten zur Insertion von Genen in den Expressionsvektor
herbei. Dann wurde der Nde I-Ort an der Position der Translationsinitiation
unter Verwendung einer Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese in
einen Nco I-Ort umgewandelt. Die DNA-Sequenz von pET-3aM in dieser
Region, 5'-CATATGG,
wurde in 5'-CCCATGG
in pBT430 umgewandelt.
-
Das
lysC-Gen wurde aus dem Plasmid pBT457 als ein 1560 bp großes Nco
I-EcoR I-Fragment geschnitten und in den Expressionsvektor pBT430
insertiert, der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, wobei sich
Plasmid pBT461 ergab. Zur Expression der mutanten lysC-Gene (M2,
M3 und M4) wurde pBT461 mit Kpn I-EcoR I verdaut, wodurch das Wildtyp-lysC-Gen
aus ca. 30 Nukleotiden stromabwärts
vom Translation-Startcodon entfernt und wobei die analogen Kpn I-EcoR
I-Fragmente aus den mutanten Genen, welche die Plasmide pBT490,
pBT491 bzw. pBT492 ergeben, insertiert werden.
-
Zur
hochgradigen Expression wurde jedes der Plasmide in den E. coli-Stamm
BL21(DE3) transformiert [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:
113–130].
Die Kulturen wurden in LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 mg/l)
bei 25°C
gezüchtet.
Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von ca. 1 wurde IPTG (Isopropylthio-β-galactosid,
der Induktor) einer Endkonzentration von 0,4 mM zugefügt und die
Inkubation wurde 3 h bei 25°C
fortgesetzt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt
und in 1/20stel (oder 1/100stel) des Originalkulturvolumens in 50
mM NaCl; 50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA resuspendiert und bei –20°C eingefroren.
Die eingefrorenen Aliquote von 1 ml wurden bei 37°C und in
einem Eiswasserbad zur Lyse der Zellen beschallt. Das Lysat wurde
5 min bei 4°C
bei 15000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und
das Pellet wurde in 1 ml des vorstehenden Puffers resuspendiert.
-
Die Überstands-
und Pelletfraktionen von nicht induzierten und IPTG-induzierten
Kulturen von BL21 (DE3)/pBT461 wurden mittels der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
analysiert. Das mittels der Coomassieblau-Färbung im Überstand der induzierten Kultur
sichtbar gemachte wichtige Protein wies ein Molekulargewicht von
ca. 48 kD, die erwartete Größe für AKIII
auf. Ca. 80% des AKIII-Proteins befanden sich im Überstand
und AKIII stellte 10–20%
des Gesamtproteins von E. coli im Extrakt dar.
-
Die
AK-Aktivität
wunde wie nachstehend gezeigt bestimmt: Assay-Mix (für 12 Assay-Röhrchen):
4,5
ml H2O
1,0 ml 8 M KOH
1,0 ml 8
M NH2OH-HCl
1,0 ml 1 M Tris-HCl, pH
8,0
0,5 ml 0,2 M ATP (121 mg/ml in 0,2M NaOH)
50 μl 1 M MgSO4
-
Jedes
1,5 ml fassende Eppendorf-Assayröhrchen
enthielt:
0,64 ml Assay-Mix
0,04 ml 0,2 M L-Asparaginsäure oder
0,04 ml H2O
0,0005–0,12 ml Extrakt
H2O auf ein Gesamtvolumen von 0,8 ml
-
Die
Assay-Röhrchen
wurden bei 30°C
für die
gewünschte
Zeit (10–60
min) inkubiert. Dann wurden 0,4 ml FeCl3-Reagenz
(10% w/v FeCl3, 3,3% Trichloressigsäure, 0,7
M HCl) zugefügt
und das Material 2 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert.
Der Überstand
wurde dekantiert. Die OD wurde bei 540 nm abgelesen und mit dem
Aspartylhydroxamat-Standard verglichen.
-
Ca.
80% der AKIII-Aktivität
befanden sich in der Überstandsfraktion.
Die spezifische Aktivität
der Wildtyp- und mutanten Rohextrakte betrug 5–7 μmol Produkt pro min pro Milligram
Gesamtprotein. Die Wildtyp-AKIII war empfindlich gegen die Anwesenheit
von L-Lysin im Assay. Bei einer Konzentration von ca. 0,4 mM wurde
eine 50%ige Inhibition ermittelt und eine 90%ige bei ca. 1,0 mM.
Dagegen wurden die Mutanten AKIII-M2, -M3 und -M4 (siehe Beispiel
1) durch 15 mM L-Lysin überhaupt
nicht inhibiert.
-
Das
Wildtyp-AKIII-Protein wurde aus dem Überstand der IPTG-induzierten
Kultur wie folgt gereinigt. Zu 1 ml Extrakt wurden 0,25 ml 10%iges
Streptomycinsulfat zugefügt
und über
Nacht bei 4°C
aufbewahrt. Das Gemisch wurde bei 4°C 15 min bei 15000 U/min. zentrifugiert
Der Überstand
wurde gesammelt und unter Verwendung einer Sephadex G-25 M-Säule (Säule PD-10,
Pharmacia) entsalzt. Er wurde dann auf einer Mono-Q-HPLC-Säule laufen
lassen und mit einem NaCl-Gradienten von 0–1 M eluiert. Die beiden 1-ml-Fraktionen,
welche die meiste AKIII-Aktivität
enthielten, wurden gepoolt, konzentriert, entsalzt und auf einer HPLC-Trennsäule (TSK
G3000SW) laufen lassen. Die Fraktionen wurden in 20 mM KPO4-Puffer, pH 7,2, 2 mM MgSO4,
10 mM β-Mercaptoethanol,
0,15 M KCl, 0,5 mM L-Lysin eluiert, und es wurde mittels der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
ermittelt, dass sie >95%
rein waren. Das gereinigte AKIII-Protein wurde zum Generieren von
Kaninchen-Antikörpern
gegen das Protein an die Hazelton Research Facility (310 Swampridge Road,
Denver, PA 17517) gesandt.
-
BEISPIEL 3
-
ISOLIERUNG DER dapA-GENE VON E. coli UND
CORYNEBACTERIUM glutamicum
-
Das
dapA-Gen von E. coli (ecodapA) wurde zuvor kloniert, mit Restriktionsendonuklease
kartiert und sequenziert [Richaud et al. (1986) J. Bacteriol. 166:
297–300].
Für die
erfinderische Tätigkeit
wurde das dapA-Gen auf einem Bakteriophagen-Lambda-Klon aus einer
geordneten Bibliothek von 3400 überlappenden Segmenten
von klonierter E. coli-DNA erhalten, die von Kohara, Akiyama und
Isono konstruiert wurde [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508, siehe
Beispiel 1]. Aus der Kenntnis der Kartenposition von dapA bei 53
min auf der genetischen Karte von E. coli [Bachman (1983) Microbiol.
Rev. 47: 180–230],
der Restriktionsendonuklease-Karte des klonierten Gens [Richaud
et al. (1986) J. Bacteriol. 166: 297–300] und der Restriktionsendonuklease-Karte
der klonierten DNA-Fragmente in der E. coli-Bibliothek (Kohara et
al. (1987) Cell 50: 595–508) war
es möglich,
die Lambda-Phagen 4C11 und 5A8 [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508] als
mögliche
Kandidaten zu wählen,
die das dapA-Gen tragen. Die Phagen wurden in Flüssigkultur aus Einzelplaques
wie beschrieben (siehe Current Protocols in Molecular Biology (1987)
Ausubel et al. Hrsg., John Wiley & Sons
New York] unter Verwendung von LE392 als Wirt gezüchtet [siehe
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laborstory Manual, Cold
Spring Harbor Laborstory Press]. Die Phagen-DNA wurde durch Phenolextraktion
wie beschrieben hergestellt [siehe Current Protocols in Molecular
Biology (1987) Ausubel et al. Hrsg., John Wiley & Sons New York]. Beide Phagen enthielten
ein für
das dapA-Gen erwartetes aus ca. 2,8 kb bestehendes Pst I-DNA-Fragment [Richaud
et al. (1986) J. Bacteriol. 166: 297–300]. Das Fragment wurde aus
dem Verdau des Phagen 5A8 isoliert und in den mit Pst I verdauten
Vektor pBR322 insertiert, wobei sich das Plasmid pBT427 ergab.
-
Das
dapA-Gen von Corynebacterium (cordapA) wurde aus genomischer DNA
aus dem ATCC-Stamm 13032 mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR)
isoliert. Die Nukleotidsequenz des dapA-Gens von Corynebacterium
wurde veröffentlicht
[Bonnassie et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6421]. Es war möglich, aus der
Sequenz Oligonukleotid-Primer für
die PCR zu konzipieren, die die Amplifikation eines das Gen enthaltenden
DNA-Fragments zulassen und gleichzeitig einzigartige Restriktionsendonuklease-Orte
am Startcodon (Nco I) und eben am Stoppcodon (EcoR I) des Gens vorbei
zufügen
würden.
Bei den verwendeten Oligonukleotid-Primern handelte es sich um die
folgenden:
SEQ ID NO:4:
CCCGGGCCAT GGCTACAGGT TTAACAGCTA
AGACCGGAGT AGAGCACT
SEQ ID NO:5:
GATATCGAAT TCTCATTATA
GAACTCCAGC TTTTTTC
-
Die
PCR wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer Cetus-Kits gemäß den Anleitungen
des Herstellers an einem vom gleichen Unternehmen hergestellten
Thermocycler durchgeführt.
Das Reaktionsprodukt, wenn es auf einem Agarosegel lief und mit
Ethidiumbromid gefärbt
wurde, zeigte eine starke DNA-Bande, die für das dapA-Gen von Corynebacterium
der Größe, ca.
900 bp, erwartet wird. Das PCR-generierte Fragment wurde mit den
Restriktionsendonukleasen Nco I und EcoR I verdaut und in den Expressionsvektor pBT430
(siehe Beispiel 2), der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde,
insertiert. Außer
dem Einführen
eines Nco I-Ortes am Translation-Startcodon führten die PCR-Primer auch zu
einer Änderung
des zweiten Codons aus der AGC-Kodierung für Serin zur GCT-Kodierung für Alanin.
Mehrere Klone, die aktive, Lysin-unempfindliche DHDPS (siehe Beispiel
4) exprimierten, wurden isoliert, was darauf hindeutet, dass die
Aminosäuresubstitution
des zweiten Codons sich nicht auf die Aktivität auswirkte; ein Klon wurde
als FS766 bezeichnet.
-
Das
Nco I-EcoR I-Fragment, das das PCR-generierte dapA-Gen von Corynebacterium
trägt,
wurde in den Phagemid-Vektor pGEM-9Zf(–) von Promega subkloniert,
einsträngige
DNA wurde hergestellt und sequenziert. Diese Sequenz wird in SEQ
ID NO:6 gezeigt.
-
Außer den
bereits erwähnten
Unterschieden im zweiten Codon passte die Sequenz mit der veröffentlichten
Sequenz, ausgenommen an zwei Positionen, Nukleotiden 798 und 799,
zusammen. In der veröffentlichten
Sequenz handelt es sich bei diesen um TC, während sie im in SEQ ID NO:6
gezeigten Gen CT darstellen. Diese Änderung führt zu einer Aminosäuresubstitution
von Leucin für
Serin. Der Grund für
diesen Unterschied ist nicht bekannt. Er könnte auf einen Fehler in der
veröffentlichten
Sequenz, den Unterschied bei zum Isolieren des Gens verwendeten
Stämmen
oder einen PCR-generierten Fehler zurückzuführen sein. Letzteres scheint
unwahrscheinlich zu sein, da die gleiche Änderung in mindestens drei
unabhängig
isolierten PCR-generierten dapA-Genen beobachtet wurde. Der Unterschied
hat anscheinend keine Wirkung auf die DHDPS-Enzymaktivität (siehe
Beispiel 4).
-
BEISPIEL 4
-
HOCHGRADIGE EXPRESSION VON dapA-GENEN
VON E. coli UND CORYNEBACTERIUM glutamicum IN E. coli
-
Bin
Nco I-Ort (CCATGG) wurde am Translationsinitiationscodon des dapA-Gens
von E. coli unter Verwendung der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese
insertiert. Das 2,8 kb große
Pst I-DNA-Fragment, welches das dapA-Gen in Plasmid pBT427 (siehe
Beispiel 3) tragt, wurde in den Pst I-Ort des Phagemid-Vektors pTZ18R (Pharmacia)
insertiert, wobei sich pBT431 ergab. Die Orientierung des dapA-Gens
war dergestalt, dass der Kodierungsstrang auf der einsträngigen Phagemid-DNA
anwesend sein würde.
Die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung
eines „Muts-Gene
Kits" von Bio-Rad
nach Anleitung des Herstellers mit dem nachstehend gezeigten mutagenen
Primer durchgeführt:
SEQ
ID NO:7:
CTTCCCGTGA CCATGGGCCA TC
-
Putative
Mutanten wurden auf die Anwesenheit eines Nco I-Orts gescreent,
und es wurde gezeigt, dass ein Plasmid, bezeichnet als pBT437, die
richtige Sequenz in der Umgebung der Mutation durch DNA-Sequenzierung aufweist.
Das Zufügen
eines Nco I-Orts am Translation-Startcodon veranlasste auch eine Änderung
des zweiten Codon von der TTC-Kodierung für Phenylalanin zur GTC-Kodierung
für Valin.
-
Zur
Erlangung einer hochgradigen Expression der dapA-Gene in E. coli
wurde der bakterielle Expressionsvektor pBT430 (siehe Beispiel 2)
verwendet. Das dapA-Gen von E. coli wurde aus dem Plasmid pBT437 als
ein aus 1150 bp bestehendem Nco I-Hind III-Fragment geschnitten
und in den Expressionsvektor pBT430 insertiert, der mit den gleichen
Enzymen verdaut wurde, wobei sich das Plasmid pBT442 ergab. Zur
Expression des dapA-Gens von Corynebacterium, wurde das 910 bp große Nco I-EcoR
I-Fragment von SEQ ID NO:6, insertiert in pBT430 (pFS766, siehe
Beispiel 3), verwendet.
-
Zur
hochgradigen Expression wurde jedes der Plasmide in den E. coli-Stamm
BL21(DE3) transformiert [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:
113–130].
Die Kulturen wurden in LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 mg/l)
bei 25°C
gezüchtet.
Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von ca. 1 wurde IPTG (Isopropylthio-β-galactosid,
der Induktor) einer Endkonzentration von 0,4 mM zugefügt und die
Inkubation wurde 3 h bei 25°C
fortgesetzt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt
und in 1/20stel (oder 1/100stel) des Originalkulturvolumens in 50
mM NaCl; 50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA resuspendiert und bei –20°C eingefroren.
Die eingefrorenen Aliquote von 1 ml wurden bei 37°C aufgetaut
und in einem Eiswasserbad zur Lyse der Zellen beschallt. Das Lysat
wurde bei 4°C
5 min bei 15000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und
das Pellet wurde in 1 ml des vorstehenden Puffers resuspendiert.
-
Die Überstands-
und die Pelletfraktionen von nicht induzierten und IPTG-induzierten
Kulturen von BL21(DE3)/pBT442 oder BL21(DE3)/pFS766 wurden mittels
der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert. Das durch die
Coomassieblau-Färbung
in den Überstands-
und Pelletfraktionen von beiden induzierten Kulturen sichtbar gemachte
wichtige Protein wies ein Molekulargewicht von 32–34 kD,
der erwarteten Größe für DHDPS
auf. Selbst in den nicht induzierten Kulturen stellte dieses Protein
das prominenteste Protein dar, das hergestellt wurde.
-
In
der BL21(DE3)/pBT442 IPTG-induzierten Kultur fanden sich ca. 80%
des DHDPS-Proteins im Überstrand
und die DHDPS stellte 10–20%
des Gesamtproteins im Extrakt dar. In der BL21(DE3)/pFS766 IPTG-induzierten
Kultur fanden sich mehr als 50% des DHDPS-Proteins in der Pelletfraktion.
Die Pelletfraktionen stellten in beiden Fällen 90–95% reine DHDPS dar, wobei
kein anderes Einzelprotein in signifikanten Mengen anwesend war.
Folglich waren diese Fraktionen zur Verwendung bei der Generierung
von Antikörpern
rein genug. Die Pelletfraktionen, die 2–4 Milligramm von entweder
E. coli-DHDPS oder Corynebacterium-DHDPS enthielten, wurden in 50
mM NaCl; 50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA, 0,2 mM Dithiothreitol,
0,2% SDS löslich gemacht
und zur Generierung von Kaninchen-Antikörpern gegen die Proteine an
die Hazelton Research Facility (310 Swampridge Road, Denver, PA
17517) gesandt.
-
Die
DHDPS-Enzymaktivität
wurde wie folgt bestimmt: Assay-Mix (für 10 × 1,0 ml Assay-Röhrchen oder 40 × 0,25 ml
für die
Mikrotiterschale); kurz vor Gebrauch frisch hergestellt:
2,5
ml | H2O |
0,5
ml | 1,0
M Tris-HCl, pH 8,0 |
0,5
ml | 0,1
MNa-Pyruvat |
0,5
ml | o-Aminobenzaldehyd
(10 mg/ml in Ethanol) |
25 μl | 1,0
M DL-Asparaginsäure-β-Semialdehyd
(ASA) in 1,0 N HCl |
| Assay
(1,0 ml): | Mikroassay
(0,25 ml): |
DHDPS-Assay-Mix | 0,40
ml | 0,10
ml |
Enzym-Extrakt
+ H2O | 0,10
ml | 0,025
ml |
10
mM L-Lysin | 5 μl oder 20 μl | 1 μl oder 5 μl |
-
Inkubation
bei 30°C
für die
gewünschte
Zeit. Stoppen durch Zufügen
von:
1,0
N HCl | 0,50
ml | 0,125
ml |
-
Die
Farbe durfte sich über
30–60
min entwickeln. Das Präzipitat
wurde in der Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert. Die Ablesung
des Leerwerts erfolgte bei OD540 vs. 0 min.
Für den
Mikroassay wurde ein Aliquot von 0,2 ml in ein Mikrotiter-Well gegeben
und bei OD530 abgelesen.
-
Die
spezifische Aktivität
von E. coli-DHDPS in der Überstandsfraktion
von induzierten Extrakten betrug ca. 50 OD540-Einheiten
pro Minute pro Milligramm Protein in einem 1,0-ml-Assay. Die E.
coli-DHDPS war empfindlich gegen die Anwesenheit von L-Lysin im
Assay. Bei einer Konzentration von ca. 0,5 mM wurde eine 50%ige
Inhibition festgestellt. Für
die Corynebacterium-DHDPS wurde die Aktivität in der Überstandsfraktion von nicht
induzierten Extrakten anstelle der induzierten Extrakte gemessen.
Die Enzymaktivität
betrug ca. 4 OD530-Einheiten pro Minute
pro Milligramm Protein in einem 0,25-ml-Assay. Im Gegensatz zu E.
coli-DHDPS wurde die Corynebacterium-DHDPS, selbst bei einer Konzentration
von 70 mM, durch L-Lysin überhaupt
nicht inhibiert.
-
BEISPIEL 5
-
EXKRETION VON AMINOSÄUREN DURCH HOHE KONZENTRATIONEN
VON DHDPS UND/ODER AKIII EXPRIMIERENDE E. coli
-
Die
E. coli-Expressionskassette mit dem dapA-Gen von E. coli, das mit
dem T7-RNA-Polymerase-Promotor
verknüpft
ist, wurde durch Verdau von pBT442 (siehe Beispiel 4) mit BgIII
und BamH I, Trennen der Verdauungsprodukte über die Agarosegel-Elektrophorese
und Eluieren des ca. 1250 bp großen Fragments aus dem Gel isoliert.
Dieses Fragment wurde in den BamH I-Ort von Plasmiden pBT461 (enthaltend
den T7-Promotor/lysC-Gen) und pBT492 (enthaltend den T7-Promotor/lysC-M4-Gen)
insertiert. Inserts, bei denen die Transkription beider Gene in
der gleichen Richtung stattfinden würde, wurden durch die Restriktionsendonuklease-Analyse
identifiziert, wobei sich die Plasmide pBT517 (T7/dapA + T7/lysC-M4)
und pBT519 (T7/dapA + T7/lysC) ergaben.
-
Zur
Induktion von E. coli zur Produktion und Exkretion von Aminosäuren wurden
diese Plasmide ebenso wie die Plasmide pBT442, pBT461 und pBT492
(und pBR322 als eine Kontrolle) in den E. coli-Stamm BL21(DE3) transformiert [Studier
et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130]. Alle diese Plasmide,
besonders aber pBT517 und pBT519, sind in diesem Wirtsstamm etwas
instabil, was die sorgfältige
Aufrechterhaltung der Selektion auf Ampicillin-Resistenz während des
Wachstums erforderlich macht.
-
Alle
Stämme
wurden in M9-Medium (Minimalmedium) [siehe Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: a Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory
Press), supplementiert mit Ampicillin, zur Aufrechterhaltung der
Selektion auf die Plasmide über
Nacht bei 37°C
gezüchtet.
Wenn sie eine OD
600 von 1 erreichten, wurden
die Kulturen gesammelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt
und die Überstände (3 ml) wurden
zur Entfernung der verbleibenden Zellen und großen Moleküle durch Filter von 0,2 Mikron
gegeben. Fünf-Mikroliter-Aliquote
der Überstandsfraktionen
wurden mit einem Beckman Aminosäureanalysator,
Modell 6300, unter Verwendung einer Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion,
auf die Aminosäurezusammensetzung
analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 ersichtlich. TABELLE 1 Aminosäure-Konzentration
in Kulturüberständen (mM)
Plasmid | Lys | Thr | Met | Ala | Val | Asp | Glu |
pBR322 | 0 | 0 | 0 | 0,05 | 0,1 | 0 | 0 |
pBT442 | 0,48 | 0 | 0
0 | 0,04 | 0,06 | 0 | 0 |
pBT461 | 0,14 | 0,05 | 0,02 | 0,03 | 0 | 0 |
pBT492 | 0,16 | 0,07 | 0 | 0,02 | 0,03 | 0 | 0 |
pBT517 | 0,18 | 0 | 0,01 | 0 | 0 | 0,02 | 0,02 |
pBT519 | 0,14 | 0 | 0,01 | 0 | 0 | 0,01 | 0 |
-
Alle
die Plasmide, außer
der pBR322-Kontrolle, führten
zur Exkretion von Lysin in das Kulturmedium. Die Expression des
lysC- oder des lysC-M4-Gens führte
sowohl zur Lysin- als auch Threonin-Exkretion. Die Expression von
lysC-M4- + dapA führte
zur Exkretion von Lysin, Methionin, Asparagin- und Glutaminsäure, aber
nicht Threonin. Außerdem
wurden im Kulturüberstand
kein Alanin und Valin nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit
lysC + dapA erhalten, außer
dass keine Glutaminsäure
exkretiert wurde.
-
BEISPIEL 6
-
KONSTRUKTION CHIMÄRER dapA-, lysC- UND lysC-M4-GENE
ZUR EXPRESSION IN PFLANZEN
-
Mehrere
Gen-Expressionskassetten wurden zur Konstruktion chimärer Gene
zur Expression von ecodapA, cordapA, lysC and lysC-M4 in Pflanzen
verwendet. Eine Blatt-Expressionkassette (1a) setzt
sich aus dem 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus [Odell et al.(1985)
Nature 313: 810–812;
Hull et al. (1987) Virology 86: 482–493], dem Tanslations-Leader
aus dem Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein-Gen (Cab-Gen), [Dunsmuir
(1985) Nucleic Acids Res. 13: 2503–2518) und der 3'-Transkriptions-Terminationsrregion
aus dem Nopalinsynthase-Gen (Nos-Gen) [Depicker et al. (1982) J.
Mol. Appl. Genet. 1: 561–570]
zusammen. Zwischen den 5'-
und 3'-Regionen
befinden sich die Restriktionsendonuklease-Orte Nco I (die das ATG-Translationsinitiationscodon
einschließen),
EcoR I, Sma I und Kpn I. Die gesamte Kassette ist von Sal I-Orten
flankiert; es befindet sich auch ein BamH I-Ort stromaufwärts von
der Kassette.
-
Eine
samenspezifische Expressionskassette (1b) setzt
sich aus dem Promotor und Transkriptionsterminator am dem Gen zusammen,
das für
die β-Untereinheit
des Samenspeicherproteins Phaseolin aus der Bohne Phaseolus vulgaris
kodiert [Doyle et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228–92383].
-
Die
Phaseolin-Kassette schließt
ca. 500 Nukleotide stromaufwärts
(5') vom Translationsinitiationscodon
und ca. 1650 Nukleotide stromabwärts
(3') vom Translation-Stoppcodon
von Phaseolin ein. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen befinden sich die einzigartigen
Restriktionsendonuklease-Orte Nco I (die das ATG-Translationsinitiationscodon
einschließen),
Sma I, Kpn I und Xba I. Die gesamte Kassette ist von Hind III-Orten
flankiert.
-
Eine
zweite Samenexpressionskassette wurde für das cordapA-Gen verwendet.
Diese setzte sich aus dem Promotor und dem Transkriptionsterminator
aus dem Kunitz-Trypsin-Inhibitor-3-Gen (KTI3-Gen) der Sojabohne
zusammen [Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1: 427–435]. Die KTI3-Kassette schließt ca. 2000
Nukleotide stromaufwärts
(5') vom Translationsinitiationscodon
und ca. 240 Nukleotide stromabwärts
(3') aus dem Translations-Stoppcodon
von Phaseolin ein. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen befinden sich die einzigartigen Restriktionsendonuklease-Orte
Nco I (welche den ATG-Translationsinitiationscodon einschließen), Xba
I, Kpn I und Sma I. Die gesamte Kassette ist von BamH I-Orten flankiert.
-
Eine
konstitutive Expressionskassette für Mais wurde für die Expression
des lysC-M4-Gen und des ecodapA-Gens verwendet. Sie setzte sich
am einem chimären
Promotor zusammen, der sich aus Stücken von zwei Maispromotoren
herleitete und durch eine ortsspezifische Mutagenese in vitro modifiziert war,
um einen hochgradigen konstitutiven Promotor und eine 3'-Region aus einem
Maisgen unbekannter Funktion zu ergeben. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen befinden
sich die einzigartigen Restriktionsendonuklease-Orte Nco I (die
das ATG-Translationsinitiationscodon einschließen), Sma I und Bgl II. Die
Nukleotidsequenz der konstitutiven Maisexpressionskassette wird
in SEQ ID NO:16 gezeigt.
-
Es
ist bekannt, dass biosynthetische Enzyme von Pflanzen-Aminosäuren in
den Chloroplasten lokalisiert sind und deshalb mit einem Chloroplasten-Targetingsignal
synthetisiert werden. Bakterienproteine, wie zum Beispiel DHDPS
und AKIII weisen kein derartiges Signal auf. Eine Chloroplasten-Transitsequenz
(cts) wurde deshalb mit der ecodapA, cordapA, lysC, und lysC-M4
kodierenden Sequenz in einigen chimären Genen fusioniert. Die verwendete
cts basierte auf der cts der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase
aus der Sojabohne [Berry-Lowe et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet.
1: 483–498].
Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:8–11, wurden synthetisiert und
wie nachstehend beschrieben verwendet. Für Mais basierte die verwendete
cts auf der cts der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase
aus Mais [Lebrun et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 4360] und
wird als mcts bezeichnet, um sie von der cts der Sojabohne zu unterscheiden.
Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:17–22, wurden synthetisiert und
wie nachstehend beschrieben verwendet.
-
Es
wurden vierzehn chimäre
Gene herbeigeführt:
Nr.
1) 35S-Promotor/Cab-Leader/lysC/Nos-3'
Nr. 2) 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3'
Nr. 3) 35S
Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3'
Nr. 4) Phaseolin-5'-Region/cts/lysC/Phaseolin-3'-Region
Nr.
5) Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region
Nr.
6) 35S-Promotor/Cab-Leader/ecodapA/Nos-3'
Nr. 7) 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3
Nr.
8) Phaseolin-5'-Region/ecodapA/Phaseolin-3'-Region
Nr.
9) Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region
Nr.
10) 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/cordapA/Nos-3
Nr. 11) Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region
Nr.
12) KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region
Nr.
13) HH534-5'-Region/mcts/lysC-M4/HH2-1-3'-Region
Nr.
14) HH534-5'-Region/mcts/ecodapA/HH2-1-3'-Region
-
Ein
1440 bp großes
Nco I-Hpa I-Fragment, das die gesamte lysC-Kodierungsregion plus
ca. 90 bp der 3' nicht
kodierenden Sequenz enthielt, wurde nach der Elektrophorese aus
einem Agarosegel isoliert und in die Blatt-Expressionskassette insertiert,
die mit Nco I und Sma I (dem chimären Gen Nr. 1) verdaut wurde,
was Plasmid pBT483 ergab.
-
Oligonukleotide,
SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:9, die für den carboxyterminalen Teil
des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, wobei
sich Nco I-kompatible Enden ergaben, die über die Polyacrylamid-Gelelektrophorese
gereinigt und in Nco I-verdaute pBT461 insertiert wurden. Die Insertion
der korrekten Sequenz in der korrekten Orientierung wurde durch
DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT496 ergab. Oligonukleotide,
SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11, die für den aminoterminalen Teil
des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, was
in Nco I-kompatiblen
Enden resultiert, die über
die Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und in Nco I-verdaute pBT496 insertiert
wurden. Die Insertion der korrekten Sequenz in der korrekten Orientierung
wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT521 ergab.
Auf diese Weise wurde die cts mit dem lysC-Gen fusioniert.
-
Zum
Fusionieren der cts mit dem lysC-M4-Gen wurde pBT521 mit Sal I und
ein ca. 900 bp großes,
die cts einschließendes
DNA-Fragment verdaut, und die aminoterminale Kodierungsregion von
lysC wurde isoliert. Dieses Fragment wurde in Sal I verdautes pBT492
insertiert, wobei effektiv die aminoterminale Kodierungsregion von
lysC-M4 durch die fusionierte cts und die aminoterminale Kodierungsregion
von lysC ersetzt wurde. Da die Mutation, die zu einer Unempfindlichkeit
des Lysins führte,
sich nicht in dem ersetzten Fragment befand, trug das neue Plasmid,
pBT523, die mit lysC-M4 fusionierte cts.
-
Das
1600 bp große
Nco I-Hpa I-Fragment, das die mit lysC fusionierte cts plus die
aus ca. 90 bp bestehende 3' nicht
kodierende Sequenz enthält,
wurde isoliert und wie folgt insertiert: in die mit Nco-I und Sma I
(dem chimärem
Gen Nr. 2) verdaute Blatt-Expressionskassette, wobei sich Plasmid
pBT541 ergab, und in die mit Nco I und Sma I (dem chimären Gen
Nr. 4) verdaute samenspezifische Expressionskassette, wobei sich Plasmid
pBT543 ergab.
-
Auf ähnliche
Weise wurde das 1600 bp große
Nco I-Hpa I-Fragment, das die cts enthält, die mit lysC-M4 plus der
aus ca. 90 bp bestehenden 3' nicht
kodierenden Sequenz fusioniert war, isoliert und wie folgt insertiert:
in die mit Nco I und Sma I (dem chimären Gen Nr. 3) verdaute Blatt-Expressionskassette,
wobei sich Plasmid pBT540 ergab, und in die mit Nco I und Sma I
(dem chimärem
Gen Nr. 5) verdaute samenspezifische Expressionskassette, wobei
sich Plasmid pBT544 ergab.
-
Vor
Insertion in die Expressionskassetten wurde das ecodapA-Gen zur
Insertion eines Restriktionsendonuklease-Orts, Kpn I, eben nach
dem Translations-Stoppcodon, modifiziert. Die Oligonukleotide, SEQ
ID NO:12–13,
wurden für
diesen Zweck synthetisiert:
SEQ ID NO:12:
CCGGTTTGCT GTAATAGGTA
CCA
SEQ ID NO:13:
AGCTTGGTAC CTATTACAGC AAACCGGCAT G
-
Die
Oligonukleotide, SEQ ID NO:12 und SEQ ID NO:13, wurden annealt,
was zu einem Sph I-kompatiblen Ende an einem Ende und einem Hind
III-kompatiblen Ende am anderen führte und in Sph I- plus Hind III-verdautes
pBT437 insertiert. Die Insertion der korrekten Sequenz wurde durch
die DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT443 ergab.
-
Ein
880 bp großes
Nco I-Kpn I-Fragment aus pBT443, das die gesamte ecodapA-Kodierungsregion enthielt,
wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und
wie folgt insertiert: in die mit Nco I und Kpn I (dem chimären Gen
Nr. 6) verdaute Blatt-Expressionskassette, wobei sich Plasmid pBT450
ergab, und in die mit Nco I und Kpn I (dem chimären Gen Nr. 8) verdaute samenspezifische
Expressionskassette, wobei sich Plasmid pBT494 ergab.
-
Oligonukleotide,
SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:9, die für den carboxyterminalen Teil
des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, was
zu Nco I-kompatiblen Enden führte, über Polyacrylamid-Gelelektrophorese
gereinigt und in Nco I-verdautes pBT450 insertiert. Die Insertion
der korrekten Sequenz in der korrekten Orientierung wurde mittels
DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT451 ergab. Ein 950 bp
großes
Nco I-Kpn I-Fragment aus pBT451, das für den carboxyterminalen Teil
des Chloroplasten-Targetingsignals kodiert, fusioniert mit der gesamten
ecodapA-Kodierungsregion, wurde nach der Elektrophorese aus einem
Agarosegel isoliert und in die mit Nco I und Kpn I verdaute samenspezifische
Expressionskassette insertiert, wobei sich Plasmid pBT495 ergab.
Oligonukleotide, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11, die für den aminoterminalen
Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt,
was zu Nco I-kompatiblen Enden führte, über die
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
gereinigt, und in Nco I-verdaute pBT451 und pBT495 insertiert. Die
Insertion der korrekten Sequenz in der korrekten Orientierung wurde
durch DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT455 bzw. pBT520
ergab. Folglich wurde die cts mit dem ecodapA-Gen in der Blatt-Expressionskassette
(dem chimären
Gen Nr. 7) und der samenspezifischen Expressionskassette (dem chimären Gen
Nr. 9) fusioniert.
-
Ein
aus 870 bp bestehendes Nco I-EcoR I-Fragment aus pFS766, das die
gesamte cordapA-Kodierungsregion
enthält,
wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und
in die mit Nco I und EcoR I verdaute Blatt-Expressionskassette insertiert,
wobei sich Plasmid pFS789 ergab. Zum Anlagern der cts an das cordapA-Gen
wurde ein DNA-Fragment, das die gesamte cts enthält, unter Verwendung der PCR
hergestellt. Die Template-DNA stellte pBT540 dar und bei den verwendeten
Oligonukleotid-Primern handelte es sich um:
SEQ ID NO:14:
GCTTCCTCAA
TGATCTCCTC CCCAGCT
SEQ ID NO:15:
CATTGTACTC TTCCACCGTT
GCTAGCAA
-
Die
PCR wurde unter Verwendung eines Cetus-Kits von Perkin-Elmer gemäß den Anleitungen
des Herstellers an einem von dem gleichen Unternehmen hergestellten
Thermocycler durchgeführt.
Das anhand der PCR generierte 160 bp große Fragment, wurde mit T4-DNA-Polymerase
in Anwesenheit der 4 Desoxyribonukleotidtriphosphate zum Erhalt
eines „blunt-ended" Fragments behandelt.
Das cts-Fragment wurde in pFS789 insertiert, das mit Nco I verdaut
und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase zum Auffüllen der
5'-Überhänge behandelt
wurde. Mittels der DNA-Sequenzierung wurde bestimmt, dass das insertierte Fragment
und die Vektor-/Insert-Verbindungsstellen korrekt sind, wobei sich
pFS846 ergab, welches das chimäre
Gen Nr. 10 enthielt.
-
Ein
1030 bp großes
Nco I-Kpn I-Fragment aus pFS846, das die an die cordapA-Kodierungsregion
angelagerte cts enthielt, wurde nach der Elektrophorese aus einem
Agarosegel isoliert und in die mit Nco I und Kpn I verdaute Phaseolinsamen-Expressionskassette
insertiert, wobei sich Plasmid pFS889 ergab, welches das chimäre Gen Nr.
11 enthielt. Auf ähnliche
Weise wurde das 1030 bp große
Nco I-Kpn I-Fragment
aus pFS846 in die mit Nco I und Kpn I verdaute KTI3-Samen-Expressionskassette
insertiert, wobei sich Plasmid pFS862 ergab, welches das chimäre Gen Nr.
12 enthielt.
-
Die
Oligonukleotide, SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:18, die für den carboxyterminalen
Teil des Mais-Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt,
was zu Xba I- und Nco I-kompatiblen Enden führte, über Polyacrylamid-Gelelektrophorese
gereinigt und in Xba I- plus Nco I-verdaute pBT492 insertiert (siehe
Beispiel 2). Die Insertion der korrekten Sequenz wurde durch DNA-Sequenzierung
verifiziert, wobei sich pBT556 ergab. Die Oligonukleotide, SEQ ID
NO:19 und SEQ ID NO:20, die für
den mittleren Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren,
wurden annealt, was zu Bgl II- und Xba I-kompatiblen Enden führte, über die Polyacrylamid-Gelelektrophorese
gereinigt und in Bgl II- und Xba I-verdaute pBT556 insertiert. Die Insertion
der korrekten Sequenz wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert,
wobei sich pBT557 ergab. Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:21 und SEQ
ID NO:22, die für
den aminoterminalen Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodierten,
wurden annealt, was zu Nco I- und Afl II-kompatiblen Enden führte, über Polyacrylamid-Gelelektrophorese
gereinigt und in das Nco I- und Afl II-verdaute pBT557 insertiert.
Die Insertion der korrekten Sequenz wurde mittels DNA-Sequenzierung
verifiziert, wobei sich pBT558 ergab. Folglich wurden die mcts mit
dem lysC-M4-Gen fusioniert.
-
Ein
1,6 kb großes
Nco I-Hpa I-Fragment aus pBT558, das die an das lysC-M4-Gen angelagerte
mcts enthält,
wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und
in die mit Nco I- und Sma I-verdaute konstitutive Mais-Expressionskassette
insertiert, wobei sich Plasmid pBT573 ergab, welches das chimäre Gen Nr.
13 enthielt.
-
Zum
Anlagern der mcts an das ecodapA-Gen wurde unter Verwendung der
wie vorstehend beschriebenen PCR ein DNA-Fragment hergestellt, das
die gesamte mcts enthielt. Die Template-DNA stellte pBT558 dar und
bei den verwendeten Oligonukleotid-Primern handelte es sich um die
folgenden:
SEQ ID NO:23:
GCGCCCACCG TGATGA
SEQ ID
NO:24:
CACCGGATTC TTCCGC
-
Das
mcts-Fragment wurde in pBT450 (vorstehend) insertiert, das mit Nco
I verdaut und mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase zum Auffüllen der
5'-Überhänge behandelt
wurde. Es wurde mittels DNA-Sequenzierung bestimmt, dass das insertierte
Fragment und die Vektor-/Insert-Verbindungsstellen korrekt waren,
wobei sich pBT576 ergab. Plasmid pBT576 wurde mit Asp718 verdaut,
mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase zur Ausbeute eines „blunt-ended" Fragments behandelt
und dann mit Nco I verdaut. Das sich ergebende 1030 bp große Nco I-„blunt-ended"-Fragment, welches das an die mcts angelagerte
ecodapA-Gen enthielt, wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel
isoliert. Dieses Fragment wurde in die mit Bgl II verdaute konstitutive
Mais-Expressionskassette
insertiert, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase zur Ausbeute
eines „blunt-ended" Fragments behandelt
und dann mit Nco I verdaut, wobei sich das Plasmid pBT583 ergab,
welches das chimäre
Gen Nr. 14 enthielt.
-
BEISPIEL 7
-
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN
35S-PROMOTOR/lysC
-
Die
Transformation von Tabak mit den chimären Genen von 35S-Promotor/lysC
wurde wie folgt bewirkt:
Die chimären Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/lysC/Nos-3', 35S-Promotor/Cableader/cts/lysC/Nos
3' und 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' wurden als 3,5–3,6 kb
große
BamH I-EcoR I-Fragmente isoliert und in den mit BamH I-EcoR I verdauten
Vektor pZS97K (2) insertiert, wobei sich die
Plasmide pBT497, pBT545 bzw. pBT542 ergaben. Der Vektor stellt einen
Teil eines binären
Ti-Plasmid-Vektorsystems [Bevan, (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711–8720) von
Agrobacterium tumefaciens dar. Der Vektor enthält Folgendes: (1) das chimäre Gen Nopalinsynthase-Promoter/Neomycin-Phosphotransferase-Kodierungsregion
(nos:NPT II) als ein selektierbarer Marker für transformierte Pflanzenzellen
[Bevan et al. (1983) Nature 304: 184–186); (2) die linken und rechten
Grenzen der T-DNA des Ti-Plasmids [Bevan (1984) Nucl. Acids. Res.
12: 8711–8720];
(3) das lacZ-α-Komplementsegment
von E. coli [Vieria and Messing (1982) Gene 19: 259–267] mit
einzigartigen Restriktionsendonuklease-Orten für EcoR I, Kpn I, BamH I und
Sal I; (4) den bakteriellen Replikationsstartpunkt vom Pseudomonas-Plasmid
pVS1 [Itoh et al. (1984) Plasmid 11: 206–220); und (5) das bakterielle
Neomycin-Phosphotransferase-Gen von Tn5 [Berg et al. (1975) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 72: 3628–3632]
als einen selektierbaren Marker für transformiertes A. tumefaciens.
-
Die
chimären
Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3' und 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' wurden auch in den
binären
Vektor pBT456 insertiert, wobei sich pBT547 bzw. pBT546 ergaben. Dieser
Vektor stellt pZS97K dar, in den das chimäre Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/dapA/Nos-3' zuvor als ein BamH
I-Sal I-Fragment insertiert wurde (siehe Beispiel 9). Im Klonierungsverfahren
traten große
Deletionen des chimären
dapA-Gens auf. Infolgedessen sind diese Plasmide äquivalent
zu pBT545 und pBT542, wobei das einzige in Pflanzen exprimierte
Transgen (mit Ausnahme des selektierbaren Markergens, NPT II) 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3' oder 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' darstellte.
-
Die
binären
Vektoren, die die chimären
lysC-Gene enthalten, wurden durch „Triparental Mating" [Ruvkin et al. (1981)
Nature 289: 85–88]
an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 [Hockema et al. (1983), Nature
303: 179–180)
transferiert. Die Agrobacterium-Tansformanten wurden zum Inokulieren
von Tabakblattscheiben verwendet [Horsch et al. (1985) Science 227:
1229–1231].
Transgene Pflanzen wurden in Selektivmedium, das Kanamycin enthielt,
regeneriert.
-
Zur
Bestimmung auf Expression der chimären Gene in Blättern der
transformierten Pflanzen, wurde das Protein wie folgt extrahiert.
Ca. 2,5 g junge Pflanzenblätter,
bei denen die Mittelrippe entfernt worden war, wurden mit 0,2 g
Polyvinylpolypyrrolidon und 11 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM
NaCl, 1 mM EDTA (TNE) in einen Dounce-Homogenisator gegeben und
gründlich
gemahlen. Die Suspension wurde durch eine 20-sekündige Behandlung mit einem
Brinkman Polytron-Homogenisator, der bei Einstellung 7 betrieben
wurde, weiter homogenisiert. Die sich ergebenden Suspensionen wurden
20 min bei 4°C
bei 16000 U/min in einer Dupont-Sorvall-Superspeed-Zentrifuge unter
Verwendung eines SS34-Rotors
zur Entfernung der partikulären Stoffe
zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert, das Volumen wurde gegebenenfalls durch TNE auf
10 ml aufgefüllt
und es wurden 8 ml kaltes, gesättigtes
Ammoniumsulfat zugefügt.
Das Gemisch wurde 30 min auf Eis gestellt und wie vorstehend beschrieben
zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert und das Pellet, das das AKIII-Protein enthielt,
wurde in 1 ml TNE resuspendiert und mittels einer Passage über eine
Sephadex G-25 M-Säule
(Säule
PD-10, Pharmacia) entsalzt.
-
Zur
immunologischen Charakterisierung wurden drei Volumen Extrakt mit
1 Volumen 4 X SDS-Gel-Probenpuffer
(0,17 M Tris-HCl, pH 6,8, 6,7% SDS, 16,7% β-Mercaptoethanol, 33% Glycerol)
gemischt und 3 μl
von jedem Extrakt wurden pro Spur auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel
laufen lassen, wobei bakteriell produzierte AKIII als ein Größenstandard
und das aus nicht transformierten Tabakblättern extrahierte Protein als
eine negative Kontrolle diente. Die Proteine wurden dann elektrophoretisch
auf eine Nitrocellulosemembran geblottet (Western Blot). Die Membranen
wurden den AKIII-Antikörpern
ausgesetzt, die wie in Beispiel 2 beschrieben bei einer Verdünnung des
Kaninchenserums von 1:5000 unter Verwendung des von BioRad mit ihrem
Immun-Blot-Kit bereitgestellten Standardprotokolls hergestellt wurden.
Nach dem Spülen
zum Entfernen des ungebundenen Primärantikörpers wurden die Membranen
dem Sekundärantikörper, Esel-Antikaninchen-Ig
konjugiert an Meerrettichperoxidase (Amersham), bei einer Verdünnung von
1:3000 hergestellt. Nach dem Spülen
zum Entfernen des ungebundenen Sekundärantikörpers, wurden die Membranen
dem Amersham Chemilumineszenz-Reagens und einem Röntgenfilm
ausgesetzt.
-
Sieben
von dreizehn Transformanten, die das chimäre Gen, 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' enthalten und dreizehn
von siebzehn Transformanten, die das chimäre Gen, 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3' enthalten, produzierten
das AKIII-Protein (Tabelle 2). In allen Fallen wies Protein, das
mit dem AKIII-Antikörper
reagierte, mehrere Größen auf.
Es waren in allen Proben ca. gleiche Mengen der Proteine von gleicher
Größe zu in
E. coli produziertem AKIII und ein Protein, das ca. 6 kD größer war, evident,
was darauf hindeutete, dass das Chloroplasten-Targetingsignal aus
ca. der Hälfte
des synthetisierten Proteins entfernt worden war. Dies deutet weiter
darauf hin, dass ca. die Hälfte
des Proteins in den Chloroplast eindrang. Außerdem wurde eine erhebliche
Proteinmenge mit einem höheren
Molekulargewicht beobachtet. Die Herkunft dieses Proteins ist unklar;
die vorliegende Gesamtmenge war gleich oder geringgradig höher als die
Mengen der maturen und putativen AKIII-Vorläuferproteine in Kombination.
-
Die
Blattextrakte wurden wie in Beispiel 2 beschrieben auf AK-Aktivität untersucht.
Wenn sie vorlag, konnte die AKIII- von der endogenen AK-Aktivität durch
ihre erhöhte
Resistenz gegen Lysin plus Threonin unterschieden werden. Leider
war dieser Assay jedoch nicht empfindlich genug, um AKIII-Aktivität in diesen
Extrakten zuverlässig
nachzuweisen. Null von vier Transformanten, die das chimäre Gen,
35S-Promotor/Cab-Leader/lysA/Nos-3', enthielten, wiesen AKIII-Aktivität auf. Nur
ein Extrakt von einem Transformanten, der das Gen, 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' enthielt, produzierte
einen überzeugenden
Enzymaktivitätsspiegel.
Dieser kam vom Transformanten 546-49A und stellte auch den Extrakt
dar, der den höchsten
AKIII-M4-Proteinspiegel mithilfe des Western Blot aufwies.
-
Ein
alternatives Verfahren zum Nachweis der Expression des aktiven AKIII-Enzyms
bestand in der Bewertung der Empfindlichkeit oder Resistenz von
Blattgewebe gegen hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin.
Das Wachstum der Zellkulturen und Keimpflanzen von vielen Pflanzen
wird durch hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin inhibiert;
dies wurde durch das Zufügen
von Methionin (oder Homoserin, das in vivo in Methionin umgewandelt
wird) umgekehrt. Es wird angenommen, dass sich die Inhibition von
Lysin plus Threonin aus der Feedback-Inhibition von endogenem AK
ergibt, das den Fluss durch die Bahn reduziert, was zu einer Verarmung
an Methionin führt.
Beim Tabak gibt es zwei AK-Enzyme
in den Blättern,
ein Lysin-empfindliches und ein Threonin-empfindliches [Negrutui
et al. (1984) Theor. Appl. Genet. 68: 11–20). Hohe Konzentrationen
von Lysin plus Threonin inhibieren das Wachstum von Sprossen aus
den Tabakblattscheiben, und die Inhibition wurde durch das Zufügen geringer
Methionin-Konzentrationen
umgekehrt. Folglich ist die Wachstumsinhibition vermutlich auf die
Inhibition der beiden AK-Isozyme zurückzuführen.
-
Es
wurde vorhergesagt, dass die Expression von aktivem Lysin und Threonin
unempfindlichem AKIII-M4 die Wachstumsinhibition umkehren würde. Wie
aus Tabelle 2 hervorgeht, wurde dies beobachtet. Es besteht faktisch
eine gute Korrelation zwischen dem exprimierten AKIII-M4-Proteinspiegel
und der Resistenz gegenüber
der Lysin- plus Threonin-Inhibition. Die Expression von Lysin-empfindlichem
Wildtyp-AKIII weist keine ähnliche
Wirkung auf. Nur der Transformant mit der höchsten Expression zeigte jedwede
Resistenz gegen die Lysin- plus Threonininhibition, und diese war
viel weniger ausgeprägt
als die mit AKIII-M4 beobachtete.
-
Zum
Messen der freien Aminosäurezusammensetzung
der Blätter
wurden die freien Aminosäuren
wie folgt extrahiert. Ca. 30–40
mg junges Blattgewebe wurden mit einem Rasiermesser zerkleinert
und in 0,6 ml Methanol/Chloroform/Wasser gebracht, das in einem
Verhältnis
von of 12 v/5 v/3 v (MCW) auf Trockeneis gemischt wurde. Nach 10–30 min
wurden die Suspensionen auf Raumtemperatur gebracht und mit einem
nachladbaren Homogenisator-Handgerät, Omni 1000, homogenisiert
und dann 3 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert.
Ca. 0,6 ml des Überstands
wurden dekantiert und dem Pellet wurden zusätzlich 0,2 ml MCW zugefügt, das
dann wie vorstehend gevortext und zentrifugiert wurde. Der zweite Überstand,
ca. 0,2 ml, wurde dem ersten zugefügt. Diesem wurden 0,2 ml Chloroform
zugefügt,
gefolgt von 0,3 ml Wasser. Das Gemisch wurde gevortext und dann
ca. 3 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge
zentrifugiert, die obere wässrige Phase,
ca. 1,0 ml, wurde entfernt und wurde in einem Savant Speed Vac Concentrator
eingetrocknet. Einzehntel der Probe wurde auf einem Beckman Aminosäureanalysator,
Modell 6300, unter Verwendung einer Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion
laufen lassen. Die relativen Spiegel von freien Aminosäuren den
Blättern
wurden als die Verhältnisse
von Lysin oder Threonin zu Leucin verglichen, wobei Leucin folglich
als ein interner Standard verwendet wurde. Es bestand keine konsistente
Wirkung der Expression von AKIII oder AKIII-M4 auf die Lysin- oder
Threoninspiegel (oder die von jedweden anderen Aminosäuren) in
den Blättern
(Tabelle 2). TABELLE
2 BT542-Transformanten:
35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' BT545-Transformanten:
35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3' BT546-Transformanten:
35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' BT547-Transformanten:
35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3'
| FREIE AMINOSÄURE/BLATT | AKIIIAKTIVITÄT | WESTERN | RESISTENZ
gegen LYS 3 MM + THR |
LINIE | K/L | T/L | U/mg/h | BLOT | 3
MM |
542-5B | 0,5 | 3,5 | 0 | – | – |
542-26A | 0,5 | 3,3 | 0 | – | – |
542-27B | 0,5 | 3,4 | 0 | ++ | +++ |
542-35A | 0,5 | 4,3 | 0,01 | – | – |
542-54A | 0,5 | 2,8 | 0 | – | – |
542-57B | 0,5 | 3,4 | 0 | – | + |
545-5A | n.
d. | n.
d. | 0,02 | ++ | |
545-7B | 0,5 | 3,4 | 0 | + | |
545-17B | 0,6 | 2,5 | 0,01 | + | |
545-27A | 0,6 | 3,5 | 0 | ++ | |
545-50E | 0,6 | 3,6 | 0,03 | ++ | |
545-52A | 0,5 | 3,6 | 0,02 | – | |
546-4A | 0,4 | 4,5 | 0 | + | + |
546-24B | 0,6 | 4,9 | 0,04 | ++ | ++ |
546-44A | 0,5 | 6,0 | 0,03 | + | ++ |
546-49A | 0,7 | 7,0 | 0,10 | +++ | +++ |
546-54A | 0,5 | 6,4 | 0 | + | + |
546-56B | 0,5 | 4,4 | 0,01 | – | – |
546-58B | 0,6 | 8,0 | 0 | + | ++ |
547-3D | 0,4 | 5,4 | 0 | ++ | – |
547-8B | 0,6 | 5,0 | 0,02 | – | |
547-9A | 0,5 | 4,3 | 0,03 | +++ | |
547-12A | 0,7 | 3,9 | 0 | +++ | + |
547-15B | 0,6 | 4,5 | 0 | + | – |
547-16A | 0,5 | 3,6 | 0 | ++ | |
547-18A | 0,5 | 4,0 | | +++ | – |
547-22A | 0,8 | 4,4 | | – | |
547-25C | 0,5 | 4,3 | | + | – |
547-28C | 0,6 | 5,6 | | – | |
547-29C | 0,5 | 3,8 | | +++ | + |
-
BEISPIEL 8
-
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN
PHASEOLIN-PROMOTOR/lysC
-
Die
chimären
Genkassetten, Phaseolin-Promoter/lysC, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/phaseolin-3'-Region (Beispiel
6), wurden als ca. 3,3 kb große
Hind III-Fragmente isoliert. Diese Fragmente wurden in den einzigartigen
Hind III-Ort des binären
Vektors pZS97 (3) insertiert, wobei sich pBT548
bzw. pBT549 ergab. Dieser Vektor ist ähnlich dem in Beispiel 7 beschriebenen
pZS97K, außer
für die
Anwesenheit von zwei zusätzlichen
einzigartigen Klonierungsstellen, Sma I und Hind III, und dem bakteriellen β-Lactamase-Gen
(ruft Ampicillin-Resistenz hervor) als ein selektierbarer Marker
für das
transformierte A. tumefaciens anstelle des bakteriellen Neomycin-Phosphotransferase-Gens.
-
Die
binären
Vektoren, die die chimären
lysC-Gene enthalten, wurden durch „Triparental Matings" an den Agrobacterium-Stamm
LBA4404/pAL4404 transferiert, die Agrobacterium-Transformanten wurden zum Inokulieren
von Tabakblattscheiben verwendet und transgene Pflanzen durch die
in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
-
Zum
Bestimmen der chimären
Gene in den Samen der transformierten Pflanzen auf Expression, wurde
den Pflanzen erlaubt zu blühen,
sich selbst zu bestäuben
und in Samen zu schießen.
Die Gesamtproteine wurden aus maturen Samen wie folgt extrahiert.
Ca. 30–40
mg Samen wurden in ein 1,5 ml fassendes Kunststoff-Mikrofugenröhrchen zur
einmaligen Verwendung gegeben und in 0,25 ml 50 mM Tris-HCl, pH
6,8, 2 mM EDTA, 1% SDS, 1% β-Mercaptoethanol
zermahlen. Das Mahlen wurde unter Verwendung eines motorisierten Mahlwerks
mit Kunststoffspindeln zur einmaligen Verwendung, die so ausgelegt
waren, dass sie in das Mikrofugenröhrchen passen, durchgeführt. Die
sich ergebenden Suspensionen wurden 5 min bei Raumtemperatur in
einer Mikrofuge zum Entfernen partikulärer Stoffe zentrifugiert. Drei
Volumen des Extrakts wurden mit 1 Volumen des 4x SDS-Gel-Probenpuffers
(0,17 M Tris-HCl, pH 6,8, 6,7% SDS, 16,7% β-Mercaptoethanol, 33% Glycerol)
gemischt und 5 μl
von jedem Extakt wurden pro Spur auf einem SDS-Polyacrylamidgel
mit bakteriell hergestelltem AKIII, das als ein Größenstandard
dient und aus nicht transformierten Tabaksamen extrahiertes Protein,
das als negative Kontrolle dient, laufen lassen. Die Proteine wurden
dann elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran geblotted.
Die Membranen wurden gegenüber
den AKIII-Antikörpern
(die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurden) bei einer
Verdünnung
des Kaninchenserums von 1:5000 unter Verwendung eines Standardprotokolls
das von BioRad mit ihrem Immun-Blot-Kit bereitgestellt wurde, ausgesetzt. Nach
dem Spülen
zur Entfernung von ungebundenem Primärantikörper wurden die Membranen dem
Sekundärantikörper, Esel-Antikaninchen-Ig
konjugiert an Meerrettichperoxidase (Amersham), bei einer Verdünnung von
1:3000 ausgesetzt. Nach dem Spülen
zur Entfernung von ungebundenem sekundärem Antikörper wurden die Membranen dem
Amersham Chemilumineszenz-Reagens und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
-
Zehn
von elf Transformanten, die das chimäre Gen enthalten, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC/Phaseolin-3'-Region und zehn
von elf Transformanten, die das chimäre Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region, enthalten,
produzierten das AKIII-Protein (Tabelle 3). In allen Fällen bestand
das Protein, das mit dem AKIII-Antikörper reagierte, aus mehreren
Größen. Ungefähr gleiche
Mengen an Proteinen, von gleicher Größe zu in E. coli produziertem
AKIII und ca. 6 kD größer waren
in allen Proben evident, was darauf hindeutet, dass das Chloroplasten-Targetingsignal
von ca. der Hälfte
des synthetisierten Proteins entfernt wurde. Dies deutet weiter
darauf hin, dass ca. die Hälfte
des Proteins in den Chloroplast eindrang. Zusätzlich wurden einige Proteine
mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet, die wahrscheinlich
Abbauprodukte des AKIII-Polypeptids darstellten.
-
Zum
Messen der Zusammensetzung freier Aminosäuren der Samen wurden die freien
Aminosäuren aus
maturen Samen wie folgt extrahiert. Ca. 30–40 mg Samen und eine ca. gleiche
Menge an sterilisiertem Sand wurden in ein 1,5 ml fassendes Kunststoff-Mikrofugenröhrchen zur
einmaligen Verwendung zusammen mit 0,2 ml Methanol/Chloroform/Wasser
gegeben, das in einem Verhältnis
von 12 v/5 v/3 v (MCW) bei Raumtemperatur gemischt wurde. Die Samen
wurden unter Verwendung einer motorisierten Mühle mit Kunststoffschäften zur
einmaligen Verwendung, die so ausgelegt sind, dass sie in das Mikrofugenröhrchen passen,
zermahlen. Nach dem Mahlen wurden zusätzliche 0,5 ml MCW zugefügt, das
Gemisch wurde gevortext und dann ca. 3 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge
zentrifugiert. Ca. 0,6 ml Überstand
wurden dekantiert und zusätzliche
0,2 ml MCW wurden dem Pellet zugefügt, das dann wie vorstehend
gevortext und zentrifugiert wurde. Der zweite Überstand, ca. 0,2 ml, wurde
dem ersten zugefügt.
Diesem wurden 0,2 ml Chloroform zugefügt, gefolgt von 0,3 ml Wasser.
Das Gemisch wurde gevortext und dann ca. 3 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge
zentrifugiert, die obere wässrige
Phase, ca. 1,0 ml, wurde entfernt und wurde in einem Savant Speed
Vac Concentrator ausgetrocknet. Die Proben wurden in 6 N Salzsäure, 0,4% β-Mercaptoethanol
unter Stickstoff 24 h bei 110–120°C hydrolysiert; ¼ der Probe
wurde auf einem Beckman Aminosäureanalysator,
Modell 6300, unter Verwendung einer Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion
laufen lassen. Die Spiegel von relativ freier Aminosäure in den
Samen wurden als Verhältnisse
von Lysin, Methionin, Threonin oder Isoleucin zu Leucin verglichen,
wobei folglich Leucin als ein interner Standard verwendet wurde.
-
Zum
Messen der Zusammensetzung der Gesamtaminosäuren der Samen wurden 6 Samen
in 6 N Salzsäure,
0,4% β-Mercaptoethanol
unter Stickstoff 24 h bei 110–120°C hydrolysiert;
1/10 der Probe wurde auf einem Beckman Aminosäureanalysator, Modell 6300,
unter Verwendung einer Nachsäulenreaktion
mit Ninhydrindetektion laufen lassen. Die Spiegel der relativen
Aminosäure
in den Samen wurden als Verhältnisse von
Lysin, Methionin, Threonin oder Isoleucin zu Leucin verglichen,
wobei folglich Leucin als ein interner Standard verwendet wurde.
Da sich das Transgen in dieser selbstbestäubenden Nachkommenschaft des
primären Transformanten
segregierte und nur sechs Samen analysiert wurden, wurde erwartet,
dass einige Samplingfehler auftreten würden. Deshalb wurde die Messung
für einige
der Linien mehrmals wiederholt (Tabelle 3).
-
Die
Expression des cts/lysC-Gens in den Samen führte zu einer 2- bis 4-fachen
Steigerung des Spiegels von freiem Threonin in den Samen und eine
2- bis 3-fache Zunahme des Spiegels des freien Lysins in einigen
Fällen.
Es bestand eine gute Korrelation zwischen Transformanten, die höhere Spiegel
von AKIII-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel von freiem Threonin
aufweisen, dies war jedoch für
Lysin nicht der Fall. Diese relativ kleinen Zunahmen von freiem
Threonin oder Lysin waren nicht ausreichend, um nachweisbare Steigerungen
der Spiegel von Gesamtthreonin oder -lysin in den Samen zu ergeben.
Die Expression des cts/lysC-M4-Gens in den Samen, führte zu
einer 4- bis 23-fachen Steigerung des Spiegels von freiem Threonin
in den Samen und einer 2- bis 3-fachen Steigerung des Spiegels von
freiem Lysin in einigen Fällen. Es
bestand eine gute Korrelation zwischen Transformanten, die höhere Spiegel
des AKIII-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel von freiem Threonin
aufweisen, dies war jedoch wiederum für Lysin nicht der Fall. Die
größeren Zunahmen
von freiem Threonin waren ausreichend, um nachweisbare Steigerungen
der Spiegel von Gesamtthreonin in den Samen zu ergeben. Sechzehn
bis fünfundzwanzig
Prozent Zunahmen des Gesamtthreoningehalts der Samen wurden in drei
Linien beobachtet, bei denen mehrmals Stichproben genommen wurden.
(Zum Vergleich werden die Verhältnisse
von Isoleucin zu Leucin gezeigt.) Die Linien, die erhöhtes Gesamtthreonin
zeigten, waren die gleichen, die die höchsten Grade der Zunahme des
freien Threonins und eine hohe Expression des AKIII-M4-Proteins aufwiesen.
Aus diesen Ergebnissen kann bestimmt werden, dass freies Threonin
ca. 1% des in einem normalen Tabaksamen vorliegenden Gesamtthreonins,
aber ca. 18% des in Samen vorliegenden Gesamtthreonins darstellt,
der hohe Spiegel von AKIII-M4 exprimiert. TABELLE 3 BT548-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC/Phaseolin-3' BT549-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'
LINIE | SAMEN: FREIE
AMINOSÄURE | SAMEN: GESAMTAMINOSÄURE | Western |
K/L | T/L | I/L | K/L | T/L | I/L |
NORMAL | 0,49 | 1,34 | 0,68 | 0,35 | 0,68 | 0,63 | – |
548-2A | 1,15 | 2,3 | 0,78 | 0,43 | 0,71 | 0,67 | + |
548-4D | 0,69 | 5,3 | 0,80 | 0,35 | 0,69 | 0,65 | +++ |
548-6A | 0,39 | 3,5 | 0,85 | 0,35 | 0,69 | 0,64 | + |
548-7A | 0,82 | 4,2 | 0,83 | 0,36 | 0,68 | 0,65 | ++ |
548-14A | 0,41 | 3,1 | 0,82 | 0,32 | 0,67 | 0,65 | + |
548-18A | 0,51 | 1,5 | 0,69 | 0,37 | 0,67 | 0,63 | – |
548-22A | 1,41 | 2,9 | 0,75 | 0,47 | 0,74 | 0,65 | +++ |
548-24A | 0,73 | 3,7 | 0,81 | 0,38 | 0,68 | 0,65 | ++ |
548-41A | 0,40 | 2,8 | 0,77 | 0,37 | 0,68 | 0,65 | + |
548-50A | 0,46 | 4,0 | 0,81 | 0,33 | 0,68 | 0,65 | + |
548-57A | 0,50 | 3,8 | 0,80 | 0,33 | 0,67 | 0,65 | ++ |
549-5A | 0,63 | 5,9 | 0,69 | 0,32 | 0,65 | 0,65 | + |
549-7A | 0,51 | 8,3 | 0,78 | 0,33 | 0,67 | 0,63 | ++ |
549-20A | 0,67 | 30 | 0,88 | 0,38* | 0,82* | 0,65* | ++++ |
549-34A | 0,43 | 1,3 | 0,69 | 0,32 | 0,64 | 0,63 | – |
549-39D | 0,83 | 16 | 0,83 | 0,35 | 0,71 | 0,63 | +++ |
549-40A | 0,80 | 4,9 | 0,74 | 0,33 | 0,63 | 0,64 | + |
549-41C | 0,99 | 13 | 0,80 | 0,38* | 0,79* | 0,65* | +++ |
549-46A | 0,48 | 7,7 | 0,84 | 0,34 | 0,70 | 0,64 | + |
549-52A | 0,81 | 9,2 | 0,80 | 0,39 | 0,70 | 0,65 | ++ |
549-57A | 0,60 | 15 | 0,77 | 0,35* | 0,85* | 0,64* | +++ |
549-60D | 0,85 | 11 | 0,79 | 0,37 | 0,73 | 0,65 | ++ |
-
Normal
wurde als der Durchschnitt von 6 Proben für freie Aminosäure und
23 Proben für
Gesamtaminosäuren
berechnet.
- * Zeigt den Durchschnitt von mindestens 5 Proben
an
-
Samen,
die sich von der Selbstbestäubung
von zwei mit der Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region transformierten
Pflanzen, Pflanzen 549-5A und 549-40A, herleiten, zeigten 3 Kanamycin-resistente
Keimpflanzen zu 1 Kanamycin-empfindlichen Keimpflanze, was indikativ
für eine
einzelne Insertionsstelle des Transgens ist. Die Pflanzennachkommenschaft
wurde gezüchtet,
selbstbestäubt,
und der Samen wurde auf Segregation des Kanamycin-Markergens analysiert.
Die Pflanzennachkommenschaft, die für das Transgen-Insert homozygot
war, enthielt folglich zwei Kopien der Genkassette, akkumulierte
ca. 2-mal so viel Threonin in ihrem Samen wie ihre heterozygote
Geschwisternachkommenschaft mit einer Kopie der Genkassette und
ca. 8-mal so viel wie Samen ohne das Gen. Dies gibt zu erkennen,
dass der Expressionsspiegel des E. coli-Enzyms die Akkumulation
des freien Threonins kontrolliert.
-
BEISPIEL 9
-
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN
35S-PROMOTOR/ecodapA
-
Die
chimären
Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/ecodapA/Nos-3' und 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' wurden als 3,1 bzw.
3,3 kb große
BamH I-Sal I-Fragmente isoliert und in den mit BamH I-Sal I verdauten
binären
Vektor pZS97K insertiert (2), wobei
sich die Plasmide pBT462 bzw. pBT463 ergaben. Der binäre Vektor
ist in Beispiel 7 beschrieben.
-
Die
binären
Vektoren, die die chimären
ecodapA-Gene enthalten, wurden durch „Triparental Matings" an den Agrobacterium-Stamm
LBA4404/pAL4404, die Agrobacterium-Transformanten, die zum Inokulieren von
Tabakblattscheiben verwendet werden, transferiert und die sich ergebenden
transgenen Pflanzen durch die in Beispiel 7 dargelegten Verfahren
regeneriert.
-
Zur
Bestimmung auf Expression der chimären Gene in Blättern transformierter
Pflanzen wurde das Protein, wie in Beispiel 7 beschrieben, mit den
folgenden Modifikationen extrahiert. Der Überstand aus der ersten Ammoniumsulfat-Präzipitation,
ca. 18 ml, wurde mit zusätzlichen
12 ml von kaltem, gesättigtem
Ammoniumsulfat gemischt. Das Gemisch wurde 30 min auf Eis gestellt
und wie in Beispiel 7 beschrieben zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert und das DHDPS-Protein enthaltende Pellet wurde
in 1 ml TNE resuspendiert und mittels Passage über eine Sephadex G-25 M-Säule (Säule PD-10,
Pharmacia) entsalzt.
-
Die
Blattextrakte wurden wie in Beispiel 4 beschrieben auf DHDPS-Aktivität bestimmt
E. coli-DHDPS konnte von der DHDPS-Aktivität von Tabak durch ihre erhöhte Resistenz
gegen Lysin unterschieden werden; E. coli-DHDPS behielt 80–90% ihrer
Aktivität
bei 0,1 mM Lysin bei, während
Tabak-DHDPS bei dieser Lysinkonzentration vollkommen unhibiert wurde.
Einer von zehn Transformanten, die das chimäre Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/ecodapA/Nos-3' enthalten, zeigten
DHDPS-Expression von E. coli, während
fünf von
zehn Transformanten, die das chimäre Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' enthielten, DHDPS-Expression
von E. coli zeigten.
-
Freie
Aminosäuren
wurden, wie in Beispiel 7 beschrieben, aus Blättern extrahiert. Die Expression
des chimären
Gens 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3', aber nicht des 35S-Promotor/Cab-Leader/ecodapA/Nos-3' führte zu
erheblichen Steigerungen des Spiegels von freiem Lysin in den Blättern. Es
wurden Spiegel von freiem Lysin beobachtet, die um das 2- bis 90fache
höher als
nicht transformierter Tabak waren.
-
Den
transformierten Pflanzen wurde erlaubt zu blühen, sich selbst zu bestäuben und
in Samen zu schießen.
Die Samen von mehreren Linien, die mit dem 35S-Promoter/Cab-leader/cts/ecodapA/Nos-3'-Gen transformiert
wurden, wurden Oberflächen-sterilisiert
und keimten auf Agarplatten in der Anwesenheit von Kanamycin. Linien,
die 3 Kanamycin-resistente Keimpflanzen zu 1 Kanamycin-empfindlichen
Keimpflanze zeigten, die Indikativ für eine einzelne Insertionsstelle
der Transgene sind, wurden identifiziert. Die Nachkommenschaft,
die für
das Transgen-Insert homozygot war, wurde aus diesen Linien unter
Verwendung der genetischen Standardanalyse erhalten. Die homozygote
Nachkommenschaft wurde dann auf Expression von E. coli-DHDPS in
jungen und maturen Blättern
und für
die Blätter
charakterisiert, die Spiegel freier Aminosäuren in jungen und maturen
Blättern
und in maturen Samen akkumulierten.
-
Die
Expression von aktivem DHDPS-Enzym von E. coli war sowohl in jungen
als auch maturen Blättern
der homozygoten Nachkommenschaft der Transformanten deutlich evident
(Tabelle 4). Hohe Spiegel von freiem Lysin, die um das 50- bis 100fache
höher als
für normale
Tabakpflanzen waren, akkumulierten sich in den jungen Blättern der
Pflanzen, eine viel kleinere Akkumulation von freiem Lysin (2- bis
8fach) wurde jedoch in den größeren Blättern festgestellt.
Experimente, in denen das Lysin im Phloem gemessen wird, geben zu erkennen,
dass Lysin aus den großen
Blättern
exportiert wird. Dieses exportierte Lysin kann zur Akkumulation von
Lysin in den kleinen wachsenden Blättern beitragen, von denen
bekannt ist, das sie Nährstoffe
aufnehmen anstelle sie zu exportieren. Da die größeren Blätter den Hauptanteil der Biomasse
der Pflanze ausmachen, wird die gesteigerte Gesamtakkumulation von
Lysin in die Pflanze mehr durch den Spiegel des Lysins in den großen Blättern beeinflusst.
Es wurde keine Wirkung auf die Spiegel des freien Lysins in den
Samen dieser Pflanzen beobachtet (Tabelle 4). TABELLE 4 Nachkommen der BT463-Transformanten, die
für 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' homozygot sind
LINIE | BLATTGRÖSSE | FREIE AMINOSÄURE IM BLATT | E.
COLI-DHDPS | FREIE
AMINOSÄURE
IM SAMEN |
K/L | K/TOT | OD/60'/mg | K/L |
NORMAL | 3
in. | 0,5 | 0,006 | 0 | 0,5 |
463-18C-2 | 3
in. | 47 | 0,41 | 7,6 | 0,4 |
463-18C-2 | 12
in. | 1 | 0,02 | 5,5 | ––– |
463-25A-4 | 3
in. | 58 | 0,42 | 6,6 | 0,4 |
463-25A-4 | 12
in. | 4 | 0,02 | 12,2 | ––– |
463-38C-3 | 3
in. | 28 | 0,28 | 6,1 | 0,5 |
463-38C-3 | 12
in. | 2 | 0,04 | 8,3 | ––– |
-
BEISPIEL 10
-
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN
PHASEOLIN-PROMOTOR/ecodapA
-
Die
chimären
Genkassetten, Phaseolin-5'-Region/ecodapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region (Beispiel
6), wurden als ca. 2,6 bzw. 2,8 kb große Hind III-Fragmente isoliert.
Diese Fragmente wurden in den einzigartigen Hind III-Ort des binären Vektors
pZS97 insertiert (3), wobei sich pBT506 bzw. pBT534
ergaben. Dieser Vektor ist in Beispiel 8 beschrieben.
-
Die
binären
Vektoren, die die chimären
ecodapA-Gene enthalten, wurden durch „Triparental Matings" an den Agrobacterium-Stamm
LBA4404/pAL4404 transferiert, die Agrobacterium-Transformanten zur Inokulation von Tabakblattscheiben
verwendet und die sich ergebenden transgenen Pflanzen wurden mittels
in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
-
Zur
Bestimmung der chimären
Gene auf Expression wurde den transformierten Pflanzen erlaubt zu blühen, sich
selbst zu bestäuben
und in Samen zu schießen.
Die Gesamtproteine im Samen wurden wie in Beispiel 8 beschrieben
extrahiert und wie in Beispiel 7 beschrieben, mit der folgenden
Modifikation immunologisch analysiert. Die Western Blot-Membranen
wurden den DHDPS-Antikörpern
ausgesetzt, die in Beispiel 4 bei einer Verdünnung des Kaninchenserums von
1:5000 unter Verwendung des von BioRad mit ihrem Immun-Blot-Kit
bereitgestellten Standardprotokolls hergestellt.
-
Dreizehn
von vierzehn Transformanten, die das chimäre Gen Phaseolin-5'-Region/ecodapA/Phaseolin-3'-Region enthalten
und neun von dreizehn Transformanten, die das chimäre Gen,
Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region enthalten,
produzierten das über
das Western-Blotting
nachweisbare DHDPS-Protein (Tabelle 3). Protein, das mit dem DHDPS-Antikörper reagierte,
bestand aus mehreren Größen. Der
größte Teil
des Proteins war von gleicher Größe wie das
in E. coli produzierte DHDPS, ungeachtet ob das chimäre Gen die
Chloroplast-Transitsequenz einschloss oder nicht. Dies deutete darauf
hin, dass das Chloroplasten-Targetingsignal effizient am dem synthetisierten
Vorläuferprotein
entfernt wurde. Dies deutet weiter darauf hin, dass der größte Teil
des Proteins in den Chloroplast eindringt. Außerdem wurden einige Proteine
mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet, die wahrscheinlich
Abbauprodukte des DHDPS-Polypeptids darstellen.
-
Zum
Messen der Zusammensetzung der freien Aminosäuren und der Zusammensetzung
der Gesamtaminosäuren
der Samen wurden die freien Aminosäuren und Gesamtaminosäuren aus
maturen Samen extrahiert und wie in Beispiel 8 beschrieben extrahiert.
Die Expression von entweder dem ecodapA-Gen oder cts/ecodapA hatte
keine Wirkung auf die Zusammensetzung des Gesamtlysins oder -threonins
der Samen in jedweder der transformierten Linien (Tabelle 5). Mehrere
der Linien, die mit dem chimären
Gen Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3' transformiert wurden,
wurden auch auf jedwede Wirkung auf die Zusammensetzung der freien
Aminosäuren
getestet. Es wurde wiederum keine selbst mittelgradige Wirkung auf die
Zusammensetzung des Lysins oder Threonins der Samen in Linien beobachtet,
selbst nicht auf die, die hohe Spiegel DHDPS-Protein von E. coli
exprimieren (Tabelle 5). Hierbei handelte es sich um ein überraschendes
Ergebnis, wenn man von der ausgeprägten Wirkung (beschrieben in
Beispiel 9) ausgeht, die die Expression dieses Proteins auf die
Spiegel des freien Lysins in Blättern
ausübt.
-
Eine
mögliche
Erklärung
hierfür
bestand darin, dass das über
den Western Blot beobachtete DHDPS-Protein nicht funktionell war.
Zum Testen dieser Hypothese wurden die Gesamtproteinextrakte aus maturen
Samen hergestellt und auf DHDPS-Aktivität bestimmt. Ca. 30–40 mg Samen
wurden in ein 1,5 ml fassendes Kunststoff-Mikrofugenröhrchen zur
einmaligen Verwendung gegeben und in 0,25 ml 50 mM Tris-HCl, 50
mM NaCl, 1 mM EDTA (TNE) zermahlen. Das Mahlen wurde unter Verwendung
eines motorisierten Mahlwerks mit Kunststoffspindeln zur einmaligen
Verwendung, die so ausgelegt sind, dass sie in das Mikrofugenröhrchen passen,
durchgeführt.
Die sich ergebenden Suspensionen wurden 5 min bei Raumtemperatur
in einer Mikrofuge zum Entfernen der partikulären Stoffe zentrifugiert. Ca.
0,1 ml eines wässrigen Überstands
wurden zwischen dem pelletierten Material und der oberen Ölphase entfernt.
Die Samenextrakte wurden wie in Beispiel 4 beschrieben auf DHDPS-Aktivität untersucht.
E. coli-DHDPS konnte auf Grund ihrer erhöhten Resistenz gegen Lysin
von der DHDPS-Aktivität
des Tabaks unterschieden werden; E. coli-DHDPS behielt bei ca. 0,4
mM Lysin ca. 50% ihrer Aktivität
bei, während
Tabak-DHDPS bei dieser Lysinkonzentration vollkommen inhibiert war.
Hohe Grade der DHDPS-Aktivität
von E. coli wurden in allen vier Samenextrakten gesehen, die zur
Eliminierung dieser Erklärung
getestet wurden.
-
Die
Anwesenheit der cts-Sequenz im chimären ecodapA-Gen war zum Herbeiführen der
Akkumulation hoher Lysinspiegel in Blättern wesentlich. Folglich
bestand eine andere mögliche
Erklärung
darin, dass die cts-Sequenz irgendwie während der Insertion des chimären Gens
Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3' in den binären Vektor
verloren ging. Die PCR-Analyse mehrerer der transformierten Linien
wies jedoch auf die Anwesenheit der cts-Sequenz hin, wodurch diese
Möglichkeit
jedoch ausgeschlossen wurde.
-
Eine
dritte Erklärung
bestand darin, dass Aminosäuren
in der Regel nicht in Samen synthetisiert werden und deshalb die
anderen Enzyme in der Bahn in den Samen nicht anwesend waren. Die
Ergebnisse der in Beispiel 8 vorgelegten Experimente, worin die
Expression des Gens Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' zur Akkumulation
hoher Spiegel von freiem Threonin in Samen führte, deuteten darauf hin,
dass dies nicht der Fall ist.
-
Zusammengenommen
geben diese Ergebnisse und die in Beispiel 9 vorgelegten Ergebnisse
zu erkennen, dass die Expression einer Lysin-unempfindlichen DHDPS
in entweder Samen oder Blättern
nicht ausreicht, um eine Akkumulation von gesteigertem freiem Lysin
in Samen zu erlangen. TABELLE 5 BT506-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/ecodapA/Phaseolin-3' BT534-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'
LINIE | SAMEN: FREIE
AMINOSÄUREN | SAMEN: GESAMTAMINOSÄUREN | E.
COLI-DHDPS | Western |
K/L | K/L | T/L | OD/60'/mg |
NORMAL | 0,49 | 1,34 | 0,35 | 0,68 | | |
506-2B | | | 0,34 | 0,66 | | + |
506-4B | | | 0,33 | 0,67 | | + |
506-16A | | | 0,34 | 0,67 | | + |
506-17A | | | 0,36 | 0,55 | 7,7 | +++ |
506-19A | | | 0,37 | 0,45 | | ++ |
506-22A | | | 0,34 | 0,67 | | ++ |
506-23B | | | 0,35 | 0,67 | | ++ |
506-33B | | | 0,34 | 0,67 | | ++ |
506-38B | | | 0,36 | 0,69 | 8,7 | +++ |
506-39A | | | 0,37 | 0,70 | | ++ |
506-40A | | | 0,36 | 0,68 | | – |
506-47A | | | 0,32 | 0,68 | | +++ |
506-48A | | | 0,33 | 0,69 | | +++ |
506-49A | | | 0,33 | 0,69 | | +++ |
534-8A | | | 0,34 | 0,66 | | – |
534-9A | | | 0,36 | 0,67 | | ++ |
534-22B | 0,43 | 1,32 | 0,39 | 0,51 | 4,9 | +++ |
534-31A | | | 0,34 | 0,66 | | – |
534-38A | 0,35 | 1,49 | 0,42 | 0,33 | | +++ |
534-39A | | | 0,38 | 0,69 | | + |
534-7A | | | 0,34 | 0,67 | | +++ |
534-25B | | | 0,35 | 0,67 | | +++ |
534-34B | 0,80 | 1,13 | 0,42 | 0,70 | | – |
534-35A | 0,43 | 1,18 | 0,33 | 0,67 | | +++ |
534-37B | 0,42 | 1,58 | 0,37 | 0,68 | | – |
534-43A | | | 0,35 | 0,68 | | +++ |
534-48A | 0,46 | 1,24 | 0,35 | 0,68 | 6,2 | +++ |
-
BEISPIEL 11
-
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN
35S-PROMOTOR/cts/dapA PLUS 35S-PROMOTOR/cts/lysC-M4
-
Die
chimären
Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' und 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' wurden im binären Vektor
pZS97K kombiniert (2). Der binäre Vektor ist in Beispiel 7
beschrieben. Es wurde ein Oligonukleotid-Adapter zur Umwandlung
des BamH I-Ortes am 5'-Ende
des chimären
Gens 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' (siehe 1)
in einen EcoR I-Ort
synthetisiert. Das chimäre
Gen 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' wurde dann als ein 3,6 kb großes EcoR I-Fragment
aus dem Plasmid pBT540 (Beispiel 6) isoliert und in pBT463 (Beispiel
9), das mit EcoR I verdaut wurde, insertiert, wobei sich Plasmid
pBT564 ergab. Dieser Vektor weist sowohl die chimären Gene
35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' als auch 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' auf, die in der gleichen
Orientierung insertiert sind.
-
Der
binäre
Vektor, der die chimären
Gene ecodapA und lysC-M4 enthielt, wurde durch „Triparental Matings" an den Agrobacterium-Stamm
LBA4404/pAL4404 transferiert, die Agrobacterium-Tranisformanten zur Inokulation von
Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden transgenen
Pflanzen mittels der in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
-
Zum
Bestimmen der chimären
Gene auf Expression in Blättern
der transformierten Pflanzen, wurde das Protein wie in Beispiel
7 für AKIII
und wie in Beispiel 9 für
DHDPS beschrieben extrahiert. Die Blattextrakte wurden wie in den
Beispielen 4 und 9 beschrieben auf DHDPS-Aktivität untersucht. E. coli-DHDPS konnte mittels
ihrer erhöhten
Resistenz gegen Lysin von der DHDPS-Aktivität von Tabak unterschieden werden;
E. coli-DHDPS behielt 80–90%
ihrer Aktivität
bei 0,1 mM Lysin bei, während
die Tabak-DHDPS bei dieser Konzentration des Lysins vollkommen inhibiert
war. Die Extrakte wurden über
die in den Beispielen 7 und 10 beschriebenen Western Blots immunologisch
auf Expression von AKIII- und DHDPS-Proteinen charakterisiert.
-
Zehn
von zwölf
Transformanten exprimierten die DHDPS-Enzymaktivität von E.
coli (Tabelle 6).
-
Es
bestand eine gute Korrelation zwischen der Höhe der Enzymaktivität und der
immunologisch nachgewiesenen Menge von DHDPS-Protein. Der AK-Assay
war, wie in Beispiel 7 beschrieben, zum Nachweis der Enzymaktivität in diesen
Extrakten nicht empfindlich genug. Das AKIII-M4-Protein wurde jedoch
immunologisch in acht der zwölf
Extrakte nachgewiesen. In einigen Transformanten, 564-21A und 47A,
bestand eine große
Disparität
zwischen dem Expressionsspiegel von DHDPS und AKIII-M4, aber in
10 von 12 Linien bestand eine gute Korrelation.
-
Freie
Aminosäuren
wurden aus Blättern
extrahiert und auf die Aminosäurezusammensetzung
wie in Beispiel 7 beschrieben analysiert. In Abwesenheit von signifikanter
AKIII-M4, bestimmte der Expressionsspiegel des chimären Gens,
35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3', den Grad der Lysinakkumulation (Tabelle
6). Man sollte die Linien 564-21A, 47A und 39C vergleichen, von
denen keine signifikant AKIII-M4 exprimiert. Linie 564-21A akkumuliert
Ca. um das 10fache höhere
Lysinspiegel als die Linie 564-47A, die einen geringeren Spiegel
von E. coli-DHDPS exprimiert und um das 40fache höhere Lysinspiegel
als 564-39C, die keine E. coli-DHDPS exprimiert. In Transformanten,
die alle ähnliche
Mengen von E. coli-DHDPS (564-18A, 56A, 36E, 55B, 47A) exprimierten,
kontrollierte jedoch der Expressionsspiegel des chimären Gens,
35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3', den Grad der Lysinakkumulation. Es
ist folglich klar, dass obwohl die Expression von 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' keine Wirkung auf
die Spiegel freier Aminosäuren von
Blättern
ausübt,
wenn es allein exprimiert wird (siehe Beispiel 7), kann es die Lysinakkumulation
steigern, wenn es zusammen mit dem chimären Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' exprimiert wird. Die
Expression dieser Gene zusammen wirkte sich nicht auf die Spiegel
von jedweder anderen freien Aminosäure in den Blättern aus. TABELLE 6 BT564-Transformanten: 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3'
35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3'
LINIE | FREIE AS
IM BLATT NMOL/4MG | FREIE AS
IM BLATT | E.
COLI-DHDPS U/MG/H | WESTERN DHDPS | WESTER N
AK-III |
| TOT | K | K/L | K/TOT | | | |
564-21A | 117 | 57 | 52 | 0,49 | 2,4 | +++ | +/– |
564-18A | 99 | 56 | 69 | 0,57 | 1,1 | ++ | ++ |
564-56A | 104 | 58 | 58 | 0,56 | 1,5 | ++ | ++ |
564-36E | 85 | 17 | 17 | 0,20 | 1,5 | ++ | +++ |
564-55B | 54 | 5 | 9,1 | 0,10 | 1,0 | ++ | + |
564-47A | 18 | 1 | 4,8 | 0,06 | 0,8 | ++ | – |
564-35A | 37 | 7 | 13 | 0,18 | 0,3 | + | ++ |
564-60D | 61 | 3 | 4,5 | 0,06 | 0,2 | + | ++ |
564-45A | 46 | 4 | 8,1 | 0,09 | 0,4 | + | + |
564-44B | 50 | 1 | 1,7 | 0,02 | 0,1 | +/– | – |
564-49A | 53 | 1 | 1,0 | 0,02 | 0 | +/– | – |
564-39C | 62 | 1 | 1,4 | 0,02 | 0 | – | – |
-
Freie
Aminosäuren
wurden aus maturen Samen extrahiert, die sich aus selbstbestäubten Pflanzen herleiteten
und wie in Beispiel 8 beschrieben quantifiziert wurden. Es lag kein
signifikanter Unterschied im Gehalt freier Aminosäuren von
Samen aus nicht transformierten Pflanzen im Vergleich zu denen aus Pflanzen vor,
die die höchste
Akkumulation von freiem Lysin in Blättern, d. h. den Pflanzen 564-18A,
564-21A, 564-36E und 564-56A zeigten.
-
BEISPIEL 12
-
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN
PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/ecodapA PLUS
PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/lysC-M4
-
Die
chimären
Genkassetten, Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' (Beispiel 6), wurden
im binären
Vektor pZS97 kombiniert (3). Der binäre Vektor ist im Beispiel 8
beschrieben. Um dies zu erlangen, wurde das chimäre Gen Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3' als ein 2,7 kb großes Hind
III-Fragment isoliert und in den Hind III-Ort von Vektor pUC1318
[Kay et al (1987) Nucleic Acids Res. 6: 2778] insertiert, wobei
sich pBT568 ergab. Es war dann möglich,
pBT568 mit BamH I zu verdauen und das chimäre Gen auf einem 2,7 kb großen BamH
I-Fragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde in BamH I verdautes
pBT549 insertiert (Beispiel 8), wobei sich pBT570 ergab. Dieser
binäre
Vektor weist beide chimären
Gene, Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Gen und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' auf, die in der
gleichen Orientierung insertiert sind.
-
Der
binäre
Vektor pBT570 wurde durch „Triparental
Mating" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404
transferiert, der Agrobacterium-Transformanten zum Inokulieren von
Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden transgenen
Pflanzen mittels in Beispiel 7 dargelegte Verfahren regeneriert.
-
Zum
Bestimmen der chimären
Gene auf Expression in den Samen der transformierten Pflanzen wurde den
Pflanzen erlaubt zu blühen,
sich selbst zu bestäuben
und in Samen zu schießen.
Die Gesamtproteine wurden aus maturen Samen extrahiert und über die
in Beispiel 8 beschriebenen Western Blots analysiert.
-
Einundzwanzig
von fünfundzwanzig
Transformanten exprimierten das DHDPS-Protein und neunzehn von diesen
exprimierten auch das AKIII-Protein (Tabelle 7). Die Mengen des
exprimierten Proteins wurden auf die Zahl der in den Transformanten
vorliegenden Genkopien bezogen; die höchsten exprimierenden Linien, 570-4B,
570-12C, 570-59B und 570-23B, wiesen alle zwei oder mehr Insertionsstellen
der Genkassette auf bezogen auf die Segregation des Kanamycin-Markergens.
Enzymatisch aktive E. coli-DHDPS wurden in maturen Samen von allen
getesteten Linien, worin das Protein nachgewiesen wurde, beobachtet.
-
Zum
Messen der Zusammensetzung der freien Aminosäuren der Samen, wurden die
freien Aminosäuren
aus maturen Samen extrahiert und wie in Beispiel 8 beschrieben extrahiert.
Es ergab sich eine gute Korrelation zwischen Transformanten, die
höhere
Spiegel von sowohl DHDPS- als auch AKIII-Protein exprimieren und
denen, die höhere
Spiegel von freiem Lysin und Threonin aufweisen. Die höchsten Expressionslinien
(in Tabelle 7 mit einem Sternchen versehen) zeigten eine bis um
das 2fache Steigerung der Spiegel von freiem Lysin und eine bis
um das 4fache Steigerung des Spiegels von freiem Threonin in den
Samen.
-
In
den Linien mit der höchsten
Expression war der Nachweis eines hohen α-Aminoadipinsäure-Spiegels möglich. Von
dieser Verbindung ist bekannt, dass es sich um ein Intermediat im
Katabolismus von Lysinen in Zerealiensamen handelt, aber aufgrund
seines geringen Akkumulationsgrades in der Regel nur über radioaktive
Tracer-Experimente nachgewiesen wird. Die Ansammlung hoher Spiegel
dieses Intermediats deutet darauf hin, dass in den Samen dieser
transformierten Linien eine große
Lysinmenge produziert wird, und durch den katabolischen Weg passiert
Die Ansammlung von α-Aminoadipinsäure wurde
in Transformanten, die nur E. coli-DHDPS oder nur AKIII-M4 in Samen
exprimieren, nicht beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass es zur
Produktion hoher Spiegel von freiem Lysin notwendig ist, beide Enzyme
gleichzeitig zu exprimieren. TABELLE 7 BT570-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region
Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region
LINIE | FREIE AMINOSÄUREN/SAMEN | GESAMTAMINOSÄUREN/SAMEN | WESTE RN E. COLI-DHDPS | WESTE RN E. COLI-AKIII | E. COLI-DHDPS U/mg/hr | NACHKOMMEN KANR:KA NS |
K/L | T/L | K/L | T/L |
NORM | | | | | | | | |
AL | 0,49 | 1,3 | 0,35 | 0,68 | – | – | | |
570-4B | 0,31 | 2,6 | 0,34 | 0,64 | +++ | ++ | | 15:1 |
570-7C | 0,39 | 2,3 | 0,34 | 0,64 | ++ | + | | |
570-8B | 0,29 | 2,1 | 0,34 | 0,63 | + | – | | |
570-12C* | 0,64 | 5,1 | 0,36 | 0,68 | ++++ | ++ | > 4,3 | > 15:1 |
570-18A | 0,33 | 3,0 | 0,35 | 0,65 | ++ | ++ | | 15:1 |
570-240 | 0,33 | 2,0 | 0,34 | 0,65 | ++ | – | | |
570-37A | 0,33 | 2,1 | 0,34 | 0,64 | +/– | +/– | | |
570-44A | 0,29 | 2,1 | 0,34 | 0,64 | ++ | + | | |
570-46B | 0,41 | 2,1 | 0,35 | 0,65 | ++ | + | | |
570-51B | 0,33 | 1,5 | 0,33 | 0,64 | – | – | 0 | |
570-59B* | 0,46 | 3,0 | 0,35 | 0,65 | +++ | +++ | 2,6 | > 15:1 |
570-80A | 0,31 | 2,2 | 0,34 | 0,64 | ++ | + | | |
570-11A | 0,28 | 2,3 | 0,34 | 0,67 | ++ | ++ | | 3:1 |
570-17B | 0,27 | 1,6 | 0,34 | 0,65 | – | – | | |
570-20A | 0,41 | 2,3 | 0,35 | 0,67 | ++ | + | | |
570-21B | 0,26 | 2,4 | 0,34 | 0,68 | ++ | + | | |
570-23B* | 0,40 | 3,6 | 0,34 | 0,68 | +++ | +++ | 3,1 | 63:1 |
570-25D | 0,30 | 2,3 | 0,35 | 0,66 | ++ | +/– | | |
570-26A | 0,28 | 1,5 | 0,34 | 0,64 | – | – | | |
570-32A | 0,25 | 2,5 | 0,34 | 0,67 | ++ | + | | |
570-35A | 0,25 | 2,5 | 0,34 | 0,63 | ++ | ++ | | 3:1 |
570-38A-1 | 0,25 | 2,6 | 0,34 | 0,64 | ++ | ++ | | 3:1 |
570-38A-3 | 0,33 | 1,6 | 0,35 | 0,63 | – | – | | |
570-42A | 0,27 | 2,5 | 0,34 | 0,62 | ++ | ++ | | 3:1 |
570-45A | 0,60 | 3,4 | 0,39 | 0,64 | ++ | ++ | | 3:1 |
- * Zeigt an, dass eine Probe mit freien
Aminosäuren α-Aminoadipinsäure aufweist
-
BEISPIEL 13
-
VERWENDUNG DES CHIMÄREN GENS cts/lysC-M4 ALS EINEN
SELEKTIERBAREN MARKER FÜR
DIE TABAKTRANSFORMATION
-
Das
chimäre
Gen 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' im binären Vektor pZS97K (pBT542, siehe
Beispiel 7) wurde als ein selektierbarer genetischer Marker zur
Transformation von Tabak verwendet. Hohe Konzentrationen von Lysin
plus Threonin inhibieren das Wachstum von Sprossen aus Tabakblattscheiben.
Die Expression von aktivem Lysin und Threonin-unempfindlicher AKIII-M4
kehrt diese Wachstumsinhibition um (siehe Beispiel 7).
-
Der
binäre
Vektor pBT542 wurde durch „Triparental
Mating" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404
transferiert, die zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendeten
Agrobacterium-Transformanten
und die sich ergebenden transformierten Sprosse wurden auf dem Sprossmedium,
das 3 mM Lysin plus 3 mM Threonin enthielt, ausgewählt. Die
Sprosse wurden an das Durchwurzelungsmedium, das 3 mM Lysin plus
3 mM Threonin enthielt, transferiert. Die Pflanzen wurden aus den
durchwurzelten Sprossen gezüchtet.
Die Blattscheiben aus den Pflanzen wurden auf das Sprossmedium,
das 3 mM Lysin plus 3 mM Threonin enthielt, gegeben. Transformierte
Pflanzen wurden durch die Proliferation der Sprosse, die auf diesem
Medium um die Blattscheiben herum auftrat, identifiziert.
-
BEISPIEL 14
-
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEM CHIMÄREN GEN
35S-PROMOTOR/cts/cordapA
-
Das
chimäre
Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/cordapA/Nos-3' wurde als ein 3,0 kb großes BamH I-Sal
I-Fragment isoliert und in einen mit BamH I-Sal I verdauten binären Vektor
pZS97K insertiert (2), wobei sich das Plasmid pFS852
ergab. Der binäre
Vektor ist in Beispiel 7 beschrieben.
-
Der
binäre
Vektor, der das chimäre
cordapA-Gen enthält,
wurde durch „Triparental
Mating" an den Agrobacterium-Stamm
LBA4404/pAL4404 transferiert, der Agrobacterium-Transformant wurde
zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden
transgenen Pflanzen wurden mittels in Beispiel 7 dargelegten Verfahren
regeneriert.
-
Zum
Bestimmen des chimären
Gens auf Expression in Blättern
der transformierten Pflanzen wurde Protein wie in Beispiel 7 beschrieben
mit den folgenden Modifikationen extrahiert. Der Überstand
von der ersten Ammoniumsulfat-Präzipitation,
ca. 18 ml, wurde mit zusätzlichen
12 ml kaltem, gesättigtem
Ammoniumsulfat gemischt. Das Gemisch wurde 30 min auf Eis gestellt
und wie in Beispiel 7 beschrieben zentrifugiert Der Überstand
wurde dekantiert und das Pellet, das das DHDPS-Protein enthielt,
wurde in 1 ml TNE resuspendiert und mittels Passage über eine
Sephadex G-25 M-Säule
(Säule
PD-10, Pharmacia) entsalzt.
-
Die
Blattextrakte wurden auf DHDPSP-Protein bestimmt und die Enzymaktivität wie in
Beispiel 4 beschrieben. Die DHDPS-Enzymaktivität von Corynebacterium konnte
von der Tabak-DHDPS-Aktvität
durch ihre Unempfindlichkeit gegen die Lysininhibition unterschieden
werden. Acht von elf Transformanten zeigten die Expression von Corynebacterium-DHDPS,
sowohl über
den Western Blot als auch aktives Enzym nachgewiesenes Protein.
-
Freie
Aminosäuren
wurden wie in Beispiel 7 beschrieben aus Blättern extrahiert. Die Expression
von Corynebacterium-DHDPS, die zu großen Steigerungen des Spiegels
von freiem Lysin in den Blättern
führte (Tabelle
8). Es bestand jedoch keine gute Korrelation zwischen dem Expressionsgrad
von DHDPS und der akkumulierten Menge von freiem Lysin. Spiegel
von freiem Lysin, die von 2- bis 50fach höher als die für nicht transformierten
Tabak waren, wurden beobachtet. Es trat auch eine 2- bis 2,5fache
Steigerung des Spiegels des Gesamtlysins in Blättern in den Linien auf, die
hohe Spiegel von freiem Lysin zeigten. TABELLE 8 FS586-Transformanten: 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/cordapA/Nos-3'
LINIE | FREIE
AMINOSÄUREN/BLATT | GESAMTAMINOSÄUREN/BLATT | WESTERN
CORYNE | CORYNE.-DHDPS. |
K/L | K/L | DHDPS | U/mg/hr |
NORMAL | 0,5 | 0,8 | – | – |
FS586-2A | 1,0 | 0,8 | – | – |
FS586-4A | 0,9 | 0,8 | + | 6,1 |
FS586-11B | 3,6 | 0,8 | + | 3,4 |
FS586-11D | 26 | 2,0 | + | 3,5 |
FS586-13A | 2,4 | 0,8 | + | 3,5 |
FS586-19C | 5,1 | 0,8 | + | 3,1 |
FS586-22B | >15 | 1,5 | + | 2,3 |
FS586-30B | | 0,8 | – | – |
FS586-38B | 18 | 1,5 | ++ | 3,9 |
FS586-51A | 1,3 | 0,8 | – | – |
FS586-58C | 1,2 | 0,8 | + | 5,1 |
-
Den
Pflanzen wurde erlaubt zu blühen,
sich selbst zu bestäuben
und in Samen zu schießen.
Maturer Samen wurde geerntet und auf die Zuzammensetzung freier
Aminosäuren
wie in Beispiel 8 beschrieben untersucht. Es bestand kein Unterschied
im Gehalt des freien Lysins von den Transformanten im Vergleich
zu nicht transformierten Tabaksamen.
-
BEISPIEL 15
-
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN
KTI3-PROMOTOR/cts/cordapA ODER PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/cordapA PLUS
PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/lysC-M4
-
Die
chimären
Genkassetten KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' ebenso wie Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' (Beispiel 6) wurden
im binären
Vektor pZS97 kombiniert (3). Der binäre Vektor ist in Beispiel 8
beschrieben.
-
Um
dies zu erlangen, wurden die chimären Genkassette KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region als ein 3,3 kb großes BamH
I-Fragment isoliert und in mit BamH I verdautes pBT549 insertiert
(Beispiel 8), wobei sich pFS883 ergab. Dieser binäre Vektor
weist die chimären
Gene, KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, die
in entgegengesetzten Orientierungen insertiert sind.
-
Die
chimäre
Genkassette Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region wurde unter
Verwendung der Oligonukleotid-Adapters zur Umwandlung der Hind III-Orte
an jedem Ende an die BamH I-Orte modifiziert. Die Genkassette wurde
dann als ein 2,7 kb großes
BamH I-Fragment isoliert und in mit BamH I verdautes pBT549 insertiert
(Beispiel 8), wobei sich pFS903 ergab. Dieser binäre Vektor
weist beide chimären Gene,
Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, die
in der gleichen Orientierung insertiert sind.
-
Die
binären
Vektoren pFS883 und pFS903 wurden durch „Triparental Mating" an den Agrobacterium-Stamm
LBA4404/pAL4404 transferiert, die Agrobacterium-Transformanten wurden
zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden
transgenen Pflanzen wurden durch die in Beispiel 7 dargelegten Verfahren
regeneriert.
-
Zum
Bestimmen der chimären
Gene auf Expression in Samen der transformierten Pflanzen, wurde den
Pflanzen erlaubt zu blühen,
sich selbst zu bestäuben
und in Samen zu schießen.
Die Gesamtproteine wurden aus maturen Samen extrahiert und wie in
Beispiel 8 beschrieben über
Western Blots analysiert.
-
Einundzwanzig
von 22 getesteten Transformanten exprimierten das DHDPS-Protein
und achtzehn dieser exprimierten auch das AKIII-Protein (Tabelle
8). Enzymatisch aktive Corynebacterium-DHDPS wurde in maturen Samen
von allen den getesteten Linien beobachtet, worin das Protein außer in einer
nachgewiesen wurde.
-
Zum
Messen der Zusammensetzung der freien Aminosäuren der Samen wurden freie
Aminosäuren aus
maturen Samen extrahiert und wie in Beispiel 8 beschrieben analysiert.
Es bestand eine gute Korrelation zwischen den Transformanten, die
höhere
Konzentrationen von sowohl DHDPS- und AKIII-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel
von freiem Lysin und Threonin aufwiesen. Die höchsten Expressionslinien zeigten
eine bis zu 3fache Steigerung der Spiegel von freiem Lysin und eine
bis zu 8fache Steigerung des Spiegels von freiem Threonin in den
Samen. Wie in Beispiel 12 beschrieben wurde, wurde ein hoher Spiegel
von α-Aminoadipinsäure, die
indikativ für
den Lysinkatabolismus ist, in vielen der transformierten Linien
beobachtet (in Tabelle 9 durch ein Sternchen angezeigt). Es lag
kein bedeutender Unterschied in der Zusammensetzung der freien Aminosäuren oder
des Spiegels der Protein-Expression zwischen den Transformanten
vor, die die KTI3- oder Phaseolin-Regulationssequenzen aufweisen,
welche die Expression des DHDPS-Gens von Corynebacterium antreiben. TABELLE 9 FS883-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'
KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3' FS903-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'
Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'
LINIE | FREIE AMINOSÄUREN/SAMEN | WESTERN CORYNE.-DHDPS | WESTERN E. COLI-AKIII | CORYNE.-DHDPS U/mg/hr | NACHKOMMEN KANR:KA
NS |
K/L | T/L |
NORMAL | 0,5 | 1,3 | – | – | | |
FS883-4A | 0,9 | 4,0 | + | + | | >15:1 |
FS883-11A | 1,0 | 3,5 | ++ | ++ | 3,1 | 3:1 |
FS883-14B | 0,5 | 2,5 | ++ | ++ | | |
FS883-16A* | 0,7 | 10,5 | + | +++ | 0 | |
FS883-17A* | 1,0 | 5,0 | +++ | +++ | 7,0 | |
FS883-18C* | 1,2 | 3,5 | ++ | + | 5,8 | 3:1 |
FS883-21A | 0,5 | 1,5 | + | +/– | | |
FS883-26B* | 1,1 | 3,6 | ++ | ++ | 2,4 | |
FS883-29B | 0,5 | 1,5 | + | – | 0,4 | |
FS883-32B | 0,7 | 2,4 | ++ | + | 1,5 | 3:1 |
FS883-38B* | 1,1 | 11,3 | + | ++ | 2,0 | |
FS883-59C* | 1,4 | 6,1 | + | + | 0,5 | 15:1 |
FS903-3C | 0,5 | 1,8 | + | +++ | | |
FS903-8A* | 0,8 | 2,1 | +++ | ++++ | | |
FS903-9B | 0,6 | 1,8 | ++ | ++ | 4,3 | |
FS903-10A | 0,5 | 1,5 | – | – | | |
FS903-22F | 0,5 | 1,8 | ++ | ++ | 0,9 | |
FS903-35B* | 0,8 | 2,1 | ++ | ++ | | |
FS903-36B | 0,7 | 1,5 | + | – | | |
FS903-40A | 0,6 | 1,8 | + | + | | |
FS903-41A* | 1,2 | 2,0 | ++ | +++ | | |
FS903-42A | 0,7 | 2,2 | ++ | +++ | 5,4 | |
FS903-44C | 0,5 | 1,9 | | | | |
FS903-53B | 0,6 | 1,9 | | | | |
- * Zeigt an, dass die Probe mit der freien
Aminosäure α-Aminoadipinsäure aufweist.
-
Die
Zusammensetzung von freien Aminosäuren und die Expression von
bakteriellen DHDPS- und AKIII-Proteinen wurde auch in Entwicklungssamen
von zwei Linien analysiert, die als Einzelgenkassetteninsertionen
segregierten (siehe Tabelle 10). Die Expression des DHDPS-Proteins
unter Kontrolle des KTI3-Promotors wurde wie erwartet früher nachgewiesen
als die des AKIII-Proteins unter Kontrolle des Phaseolin-Promotors.
Am Tag 14 nach dem Blühen
wurden beide Proteine in einem hohen Spiegel exprimiert, und es
lag eine ca. 8fache Steigerung des Spiegels von freiem Lysin im
Vergleich zu normalem Samen vor. Diese Ergebnisse bestätigen, dass
die gleichzeitige Expression von Lysin-unempfindlichem DHDPS und Lysin-unempfindlichem
AK zur Produktion von hohen Spiegeln von freiem Lysin in Samen führt. Freies
Lysin setzt jedoch die Akkumulation auf noch höhere Spiegel nicht fort. In
maturen Samen liegt freies Lysin in einem Spiegel vor, der um das
2- bis 3fache höher
als in normalen maturen Samen ist und das Lysin-Abbauprodukt α-Aminoadipinsäure akkumuliert
sich. Diese Ergebnisse stellen einen weiteren Beleg dafür bereit,
dass der Lysinkatabolismus in Samen auftritt und die Akkumulation
der hohen Spiegel von freiem Lysin, das in Transformanten produziert
wird, die Lysinunempfindliche DHDPS und Lysin-unempfindliche AK
exprimieren, verhindert. TABELLE 10 Sich entwickelnde Samen von FS883-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region
LINIE | TAGE NACH DEM BLÜHEN | FREIE AMINO
SÄUREN/SAMEN | WESTERN CORYNE- DHDPS | WESTERN E. COLI- AKIII |
K/L | T/L |
FS883-18C | 9 | 1,1 | 2,1 | – | – |
FS883-18C | 10 | 1,4 | 3,3 | +/– | – |
FS883-18C | 11 | 1,4 | 2,5 | + | – |
FS883-18C | 14 | 4,3 | 1,0 | ++ | ++ |
FS883-18C* | MATUR | 1,2 | 3,5 | +++ | ++ |
FS883-32B | 9 | 1,3 | 2,9 | + | – |
FS883-32B | 10 | 1,6 | 2,7 | + | – |
FS883-32B | 11 | 1,4 | 2,3 | + | – |
FS883-32B* | 14 | 3,9 | 1,3 | ++ | ++ |
FS883-32B* | MATUR | 0,7 | 2,4 | +++ | ++ |
- * Zeigt an, dass die Probe mit der freien
Aminosäure α-Aminoadipinsäure aufweist.
-
BEISPIEL 16
-
TRANSFORMATION VON CANOLA MIT DEN CHIMÄREN GENEN
PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/cordapA UND
PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/lysC-M4
-
Die
chimären
Genkassetten, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' und Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region plus Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' (Beispiel 6) wurden
in den binären
Vektor pZS199 insertiert (4), der dem
in Beispiel 8 beschriebenen pSZ97K ähnlich ist. In pZS199 ersetzte
der 35S-Promotor vom Blumenkohl-Mosaikvirus den nos-Promotor, der
die Expression des NPT II zur Bereitstellung einer besseren Expression
des Markergen antreibt, und die Orientierung des Polylinkers, der
die multiplen Restriktionsendonuklease-Orte enthält, wurde umgekehrt.
-
Zum
Insertieren der Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region-3' wurde die Genkassette als
ein 2,7 kb großes
BamH I-Fragment (wie in Beispiel 15 beschrieben) isoliert und in
mit BamH I verdautes pZS199 insertiert, wobei sich Plasmid pFS926
ergibt. Dieser binäre
Vektor weist das chimäre
Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region auf, das
in der gleichen Orientierung wie das Markergen 35S/NPT II/nos-3' insertiert wird.
-
Zum
Insertieren der Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region wurde die
Genkassette als ein 3,3 kb großes
EcoR I-Spe I-Fragment isoliert und in EcoR I plus Xba I verdautes
pZS199 insertiert, wobei sich das Plasmid pBT593 ergab. Dieser binäre Vektor
weist das chimäre
Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, das
in der gleichen Orientierung wie das Markergen 35S/NPT II/nos-3' insertiert wurde.
-
Zur
Kombination der beiden Kassetten wurde der EcoR I-Ort von pBT593
unter Verwendung von Oligonukleotid-Adapters in einen BamH I-Ort
umgewandelt, der sich ergebende Vektor wurde mit BamH I geschnitten
und die Genkassette Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region wurde als
ein 2,7 kb großes
BamH I-Fragment isoliert und insertiert, wobei sich pBT597 ergab.
Dieser binäre
Vektor weist beide chimären
Gene, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, die
in der gleichen Orientierung wie das Markergen 35S/NPT II/nos-3' insertiert wurden.
-
Brassica
napus, Kultivar „Westar", wurde durch Cokultivierung
von Keimpflanzenstücken
mit dem „disarmed" („entwaffneten") Agrobacterium tumefaciens-Stamm
LBA4404, der den geeigneten binären
Vektor trägt,
transformiert.
-
Samen
von B. napus wurden durch Rühren
in 10% Chlorox, 0,1% SDS 30 min sterilisiert und dann gründlich mit
sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Samen wurden auf sterilem
Medium, das 30 mM CaCl2 und 1,5% Agar enthält, gekeimt
und 6 Tage im Dunkeln bei 24°C
gezüchtet.
-
Flüssigkulturen
von Agrobacterium für
die Pflanzentransformation wurden über Nacht bei 28°C in Minimal
A-Medium, das 100 mg/l Kanamycin enthielt, gezüchtet. Die Bakterienzellen
wurden durch Zentrifugieren pelletiert und bei einer Konzentration
von 108 Zellen/ml in flüssigem Murashige und Skoog
Minimalem Organischem Medium, das 100 μM Acetosyringon enthält, resuspendiert.
-
Keimpflanzen-Hypokotyle
von B. napus wurden in Segmente von 5 mm geschnitten, die sofort
in die Bakteriensuspension gegeben wurden. Nach 30 min wurden die
hypokotylen Stücke
aus der Bakteriensuspension entfernt und auf ein BC-35-Kallusmedium
gegeben, das 100 μM
Acetosyringon enthielt. Das Pflanzengewebe und Agrobacteria wurden
drei Tage bei 24°C
in gedämpftem
Licht cokultiviert.
-
Die
Cokultivierung wurde durch Transferieren der hypokotylen Stücke an das
BC-35-Kallusmedium, das
200 mg/l Carbenicillin zum Abtöten
der Agrobacteria und 25 mg/l Kanamycin zum Auswählen auf Zellwachstum von transformierten
Pflanzen enthielt, terminiert. Die Keimpflanzenstücke wurden
drei Wochen auf diesem Medium bei 24°C unter ständiger Lichteinwirkung inkubiert.
-
Nach
drei Wochen wurden die Segmente an BS-48-Regenerationsmedium, das
200 mg/l Carbenicillin und 25 mg/l Kanamycin enthielt, transferiert.
Das Pflanzengewebe wurde alle zwei Wochen auf frischem selektivem
Regenerationsmedium unter den gleichen Kulturbedingungen, die für das Kallusmedium
beschrieben wurden, subkultiviert. Putativ transformierte Kalli
wuchsen auf dem Regenerationsmedium schnell; wenn die Kalli einen
Durchmesser von ca. 2 mm erreichten, wurden sie aus den hypokotylen
Stücken
entfernt und auf das gleiche Medium gebracht, das kein Kanamycin
enthielt.
-
Innerhalb
von mehreren Wochen nach dem Transfer auf BS-48-Regenerationsmedium,
begannen Sprosse in Erscheinung zu treten. Sobald die Sprosse wahrnehmbare
Stiele bildeten, wurden sie aus den Kalli ausgeschnitten, auf MSV-1A-Elongationsmedium
transferiert und einer 16:8-stündigen
Photoperiode bei 24°C zugeführt.
-
Sobald
sich die Sprosse um mehrere Internodien elongiert hatten, wurden
sie über
der Agaroberfläche geschnitten
und die geschnittenen Enden wurden in Rootone eingetaucht. Behandelte
Sprosse wurden direkt in feuchtes Metro-Mix 350 „erdloses" (hydroponisches) Topfmedium transferiert.
Die Töpfe
wurden mit Kunststoffbeuteln abgedeckt, die entfernt wurden, wenn
die Pflanzen, nach etwa zehn Tagen eindeutig wuchsen. Die Ergebnisse
der Transformation sind in Tabelle 11 ersichtlich. Transformierte
Pflanzen wurden mit jedem der binären Vektoren erhalten.
-
Die
Pflanzen wurden unter einer 16:8-stündigen Photoperiode, bei einer
Tagestemperatur von 23°C und
einer Nachttemperatur von 17°C
gezüchtet.
Wenn sich der primäre
Blütenstengel
zu elongieren begann, wurde er mit einem maschenartigen Pollen-Containment-Beutel
zur Verhinderung von Fremdkreuzung abgedeckt. Die Selbstbestäubung wurde
durch tägliches
mehrmaliges Schütteln
der Pflanzen gefördert.
Sich von Selbstbestäubungen
herleitende mature Samen wurden ca. drei Monate nach dem Pflanzen
geerntet.
-
MINIMALMEDIUM A (BAKTERIEN-WACHSTUMSMEDIUM)
-
Auflösen in destilliertem
Wasser:
- 10,5 g Dikaliumhydrogenphosphat
- 4,5 g Monokaliumphosphat
- 1,0 g Ammoniumsulfat
- 0,5 g Natriumcitrat, Dihydrat
- Mit destilliertem Wasser auf 979 ml auffüllen
- Autoklavieren
- 20 ml filtersterilisierte 10%ige Saccharose zufügen
- 1 ml filtersterilisierte 1 M MgSO4 zufügen
-
BRASSICA-Kallus-MEDIUM BC-35
-
- pro Liter:
- Murashige und Skoog Minimales Organisches Medium
- (MS-Salze, 100 mg/l i-Inositol, 0,4 mg/L-Thiamin; GIBCO Nr.
510-3118)
- 30 g Saccharose
- 18 g Mannitol
- 0,5 mg/l 2,4-D
- 0,3 mg/l Kinetin
- 0,6% Agarose
- pH 5,8
-
BRASSICA-REGENERATIONSMEDIUM BS-48
-
- Murashige und Skoog Minimales Organisches Medium
- Gamborg B5-Vitamine (SIGMA Nr. 1019)
- 10 g Glucose
- 250 mg Xylose
- 600 mg MES
- 0,4% Agarose
- pH 5,7
- Filtersterilisieren und nach dem Autoklavieren Zufügen von:
- 2,0 mg/l Zeatin
- 0,1 mg/l IAA
-
BRASSICA-SPROSS-ELONGATIONSMEDIUM MSV-1A
-
- Murashige und Skoog Minimales Organisches Medium
- Gamborg B5-Vitamine
- 10 g Saccharose
- 0,6% Agarose
- pH 5,8
-
TABELLE 11 CANOLA-TRANSFORMANTEN
BINÄRER VEKTOR | ZAHL
DER GESCHNITTENEN ENDEN | ZAHL DER KANR KALLI | ZAHL
DER SCHIESSENDEN KALLI | PFLANZENZA HL |
pZS199 | 120 | 41 | 5 | 2 |
pFS926 | 600 | 278 | 52 | 28 |
pBT593 | 600 | 70 | 10 | 3 |
pBT597 | 600 | 223 | 40 | 23 |
-
BEISPIEL 17
-
TRANSFORMATION VON MAIS UNTER VERWENDUNG
EINES CHIMÄREN
lysC-M4-GENS ALS EIN SELEKTIERBARER MARKER
-
Embryogene
Kalluskulturen wurden aus immaturen Embryos (ca. 1,0 bis 1,5 mm)
initiiert, die aus Kernen einer Maislinie präpariert wurden, die gezüchtet wurde,
um eine Response des „Typ
II-Kallus" in der
Gewebekultur zu erhalten. Die Embryos wurden 10 bis 12 Tage nach
der Bestäubung
präpariert
und wurden mit der Achsenseite nach unten und in Kontakt mit Agarose-verfestigtem
N6-Medium [Chu et al. (1974) Sci Sin 18: 659–668] gebracht, das mit 0,5
mg/l 2,4-D (N6-0,5) supplementiert wurde. Die Embryos wurden bei
27°C im Dunkeln
gehalten. Bröckeliger
embryogener Kallus, der aus undifferenzierten Zellmassen mit somatischen Proembryos
und somatischen Embryos besteht, die auf Suspensorstrukturen getragen
werden, proliferierten aus dem Skutellum der immaturen Embryos.
Klonale embryogene Kalli, die aus individuellen Embryos isoliert wurden,
wurden identifiziert und alle 2 bis 3 Wochen auf N6-0,5-Medium subkultiviert.
-
Das
Partikel-Bombardment-Verfahren wurde zum Transfer von Genen an die
Kallus-Kulturzellen verwendet. Für
diese Experimente wurde ein Biolistic, PDS-1000/He (BioRAD Laboratories,
Hercules, CA) verwendet.
-
Das
Plasmid pBT573, das das chimäre
Gen HH534-5'-Region/mcts/lysC-M4/HH2-1-3'-Region (siehe Beispiel
6) enthielt, das für
die konstitutive Genexpression in Mais konzipiert war, wurde auf
die Oberfläche
von Goldpartikeln präzipitiert.
Um dies zu erreichen, wurden 2,5 μg
pBT573 (in Wasser bei einer Konzentration von ca. 1 mg/ml) 25 ml
Goldpartikel (durchschnittlicher Durchmesser von 1,5 um) suspendiert
in Wasser (60 mg Gold pro ml) zugefügt. Danach wurden der Gold-DNA-Suspension,
während
das Röhrchen
gevortext wurde, Calciumchlorid (25 ml einer 2,5 M Lösung) und
Spermidin (10 ml einer 1,0 M Lösung
) zugefügt.
Die Goldpartikel wurden 10 sec in einer Mikrofuge zentrifugiert
und der Überstand
entfernt. Die Goldpartikel wurden dann in 200 ml absolutem Ethanol
resuspendiert, wurden wieder zentrifugiert und der Überstand
entfernt. Schließlich
wurden die Goldpartikel in 25 ml absolutem Ethanol resuspendiert
und zweimal eine Sekunde beschallt. Fünf μl der DNA-beschichteten Goldpartikel
wurden dann auf jede Makrocarrier-Scheibe geladen und das Ethanol
wurde verdampfen lassen, wobei die mit DNA überzogenen Goldpartikel getrocknet
auf der Scheibe zurückblieben.
-
Der
embryogene Kallus (aus der als Nr. 132.2.2 bezeichneten Kalluslinie)
wurde in einem zirkulären Bereich
von ca. 6 cm im Zentrum einer 100 × 20 mm großen Petrischale mit N6-0,5-Medium,
supplementiert mit 0,25 M Sorbitol und 0,25 M Mannitol angeordnet.
Das Gewebe wurde 2 h vor dem Bombardment als Vorbehandlung auf dieses
Medium gegeben und blieb während
des Bombardment-Verfahrens
auf dem Medium. Am Ende der 2-stündigen
Vorbehandlungszeit wurde die Petrischale mit dem Gewebe in die Kammer
des PDS-1000/He gebracht. Die Luft in der Kammer wurde dann auf
ein Vakuum von 28 Inch Hg evakuiert. Der Makrocarrier wurde mit
einer Heliumschockwelle unter Verwendung einer Zerreißmembran,
die platzt, wenn der Heliumdruck in der Schockröhre 1100 psi erreicht, beschleunigt.
Das Gewebe wurde ca. 8 cm vom Stopp-Screen angeordnet. Vier Gewebeplatten
wurden mit den DNA-beschichteten
Goldpartikeln bombardiert. Sofort nach dem Bombardment wurde das
Kallusgewebe an das N6-0,5-Medium, das nicht mit Sorbitol oder Mannitol
supplementiert war, transferiert.
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Sieben
Tage nach dem Bombardment wurden kleine (2–4 mm im Durchmesser) Kallusgewebeklumpen
an das N6-0,5-Medium ohne Casein oder Prolin, das aber jeweils mit
2 mM Lysin und Threonin (LT) supplementiert war, transferiert. Das
Gewebe wuchs auf diesem Medium langsam weiter und wurde alle 2 Wochen an
frisches N6-0,5-Medium, supplementiert mit LT, transferiert. Nach
12 Wochen wurden zwei Klone von aktiv wachsendem Kallus auf zwei
getrennten Platten mit LT supplementiertem Medium identifiziert.
Diese Klone wuchsen weiter, wenn sie auf Selektivmedium subkultiviert
wurden. Die Anwesenheit des lysC-M4-Gens in den ausgewählten Klonen
wurde mittels PCR-Analyse
bestätigt.
Der Kallus wurde an Medium transferiert, das die Pflanzenregeneration
fördert.
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BEISPIEL 18
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TRANSFORMATION VON MAIS MIT DEM KONSTITUTIVEN
MAIS-PROMOTOR/cts/ecodapA UND KONSTITUTNEN MAIS-PROMOTOR/cts/lysC-M4
-
Die
chimären
Genkassetten, HH534-5'-Region/mcts/ecodapA/HH2-1-3'-Region plus HH534-5'-Region/mcts/lysC-M4/HH2-1-3'-Region (Beispiel
6), wurden in den Vektor pGem9z zur Generierung eines Mais-Transformationsvektors
insertiert. Das Plasmid pBT583 (Beispiel 6) wurde mit Sal I verdaut
und ein aus 1850 bp bestehendes Fragment mit der Genkassette HH534-5'-Region/mcts/ecodapA/HH2-1-3'-Region wurde isoliert.
Dieses DNA-Fragment wurde in pBT573 (Beispiel 6) insertiert, das
die mit Xho I verdaute HH534-5'-Region/mcts/lysC-M4/HH2-1-3'-Region tragt. Der
sich ergebende Vektor mit beiden chimären Genen in der gleichen Orientierung
wurde als pBT586 bezeichnet.
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Vektor
pBT586 wurde unter Verwendung des Partikel-Bombardment-Verfahrens
in das embryogene Maiskallusgewebe eingeführt. Das Anlegen der embryogenen
Kalluskulturen und die Parameter für das Partikel-Bombardment
waren die, wie in Beispiel 13 beschrieben.
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Entweder
der eine oder andere der beiden Plasmidvektoren, die die selektierbaren
Marker enthalten, wurden bei den Transformationen verwendet. Ein
Plasmid, pALSLUC [Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833–839], enthielt
eine cDNA des Mais-Acetolactatsynthase-Gens (ALS-Gens). Die ALS-cDNA wurde in vitro mutiert,
damit das durch das Gen kodierte Enzym resistent gegen Chlorsulfuron
würde.
Dieses Plasmid enthält auch
ein Gen, das zur Expression einer Kodierregion der Glühwürmchen-Luciferase den 35S-Promotor
aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus und die 3'-Region des Nopalinsynthase-Gens verwendet (de
Wet et al. (1987) Molec. Cell Biol. 7: 725–737]. Das andere Plasmid,
pDETRIC, enthielt das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus, das
Resistenz gegen das Herbizid Glufosinat verleiht [Thompson et al.
(1987) The EMBO Journal 6: 2519–2523].
Das Bakteriengen hatte sein Translationscodon von GTG in ATG zur
ordnungsgemäßen Translationsinitiierung
in Pflanzen geändert
[De Block et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2513–2518]. Das bar-Gen wurde vom
35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus angetrieben und verwendet
das Terminations- und Polyadenylierungssignal aus dem Octopinsynthase-Gen
aus Agrobacterium tumefaciens.
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Zum
Bombardment wurden 2,5 μg
von jedem Plasmid, pBT586 und einem von den beiden selektierbaren
Markerplasmiden auf der Oberfläche
von Goldpartikeln wie in Beispiel 13 beschrieben coprazipitiert. Das
Bombardment der embryogenen Gewebekulturen erfolgte auch wie in
Beispiel 13 beschrieben.
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Sieben
Tage nach dem Bombardment wurde das Gewebe an ein Selektivmedium
transferiert. Das mit dem selektierbaren Marker pALSLUC bombardierte
Gewebe wurde an N6-0,5-Medium transferiert, das Chlorsulfuron (30
ng/l), aber kein Casein oder Prolin enthielt Das mit dem selektierbaren
Marker, pDETRIC, bombardierte Gewebe wurde an N6-0,5-Medium transferiert,
das 2 mg/l Glufosinat, aber kein Casein oder Prolin enthielt. Das
Gewebe wuchs auf diesen Selektivmedien langsam weiter. Nach weiteren
2 Wochen wurde das Gewebe in frisches N6-0,5-Medium, das die Selektivmittel
enthielt, transferiert.
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Nach
weiteren 6–8
Wochen konnten Kallusklone mit Chlorsulfuron- und Glufosinat-Resistenz
identifiziert werden. Wenn sie an Selektivmedien transferiert wurden,
wuchsen diese Klone weiter.
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Die
Anwesenheit von pBT586 in den transformierten Klonen wurde mittels
der PCR-Analyse bestätigt. Die
Funktionalität
des eingeführten
AK-Enzyms wurde durch das Ausplattieren der transformierten Klone
auf N6-0,5-Medien, die jeweils 2 mM Lysin und Threonin enthielten
(LT-Selektion; siehe Beispiel 13) getestet. Alle diese Klone waren
fähig,
auf dem LT-Medium zu wachsen, was darauf hindeutet, dass die Aspartatkinase
von E. coli exprimiert wurde und richtig funktionierte. Zum Testen,
dass das DHDPS-Enzym von E. coli funktionsfähig war, wurde der transformierte
Kallus auf N6-0,5-Medien ausplattiert, die 2 μm 2-Aminoethylcystein (AEC), ein
Lysin-Analog und einen potenten Inhibitor von Pflanzen-DHDPS enthielten.
Das transformierte Kallusgewebe war resistent gegen AEC, was darauf
hindeutet, dass die eingeführte
DHDPS, die um das ca. 16fache weniger empfindlich gegen AEC ist
als das Pflanzenenzym, produziert wurde und funktionsfähig war.
Pflanzen wurden aus mehreren transformierten Klonen regeneriert
und wurden bis zur Maturität
gezüchtet.
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BEISPIEL 19
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TRANSFORMATION VON SOJABOHNEN MIT DEN
CHIMÄREN
GENEN PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/cordapA
UND PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/lysC-M4
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Die
chimären
Genkassetten, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region plus Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' (Beispiel 6), wurden
in den Sojabohnen-Transformationsvektor pBT603 insertiert (5).
Dieser Vektor weist ein Sojabohnen-Transformations-Markergen auf,
das aus dem 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus besteht,
das die Expression des β-Glucuronidase-Gens von E. coli (Jefferson
et al. (1986) Proc. Natl. Acad Sci USA 83: 8447–8451] mit der Nos-3'-Region in einem
modifizierten pGEM9Z-Plasmid antreibt.
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Zum
Insertieren der Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region wurde die
Genkassette als ein 3,3 kb großes
Hind III-Fragment isoliert und in mit Hind III verdautes pBT603
insertiert, wobei sich Plasmid pBT609 ergab. Dieser binäre Vektor
weist das chimäre
Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, das
in der entgegengesetzten Orientierung vom 35S/GUS/Nos-3'-Markergen insertiert
wurde.
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Zum
Insertieren der Phaseolin-5-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region-3' wurde die Genkassette als
ein 2,7 kb großes
BamH I-Fragment (wie in Beispiel 15 beschrieben) isoliert und in
mit BamH I verdautes pBT609 insertiert, wobei sich Plasmid pBT614
ergab. Dieser Vektor weist die beiden chimären Gene, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region, in der gleichen
Orientierung insertiert auf, und beide befinden sich in der entgegengesetzten
Orientierung vom 35S/GUS/Nos-3'-Markergen.
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Die
Sojabohne wurde gemäß dem in
US-Patent Nr. 5015580 beschriebenen
Verfahren mit Plasmid pBT614 transformiert. Die Sojabohnen-Transformation
wurde von der Fa. Agracetus Company (Middleton, WI) durchgeführt.
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BEISPIEL 20
-
ISOLIERUNG EINES PFLANZEN-LYSIN-KETOGLUTARAT-REDUKTASE-GENS
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Die
Enzymaktivität
der Lysin-Ketoglutarat-Reduktase (LKR) wurde in immaturem Endosperm
der sich entwickelnden Maissamen beobachtet (Arruda et al. (1982)
Plant Physiol. 69: 988–989].
Die LKR-Aktivität steigt
ab dem Einsetzen der Endosperm-Entwicklung scharf an, erreicht ca.
20 Tage nach der Bestäubung
einen Peak und nimmt danach ab [Arruda et al. (1983) Phytochemistry
22: 2687–2689].
-
Zum
Klonieren des Mais-LKR-Gens wurde 19 Tage nach der Bestäubung RNA
aus den sich entwickelnden Samen isoliert. Diese RNA wurde an die
Fa. Clontech Laboratories, Inc., (Palo Alto, CA) zur kundenspezifischen
Synthese einer cDNA-Bibliothek im Vektor Lambda-Zap II gesandt.
Die Umwandlung der Lambda-Zap II-Bibliothek in eine Phagemid-Bibliothek,
dann in eine Plasmid-Bibliothek, wurde unter Befolgung des von der
Fa. Clontech bereitgestellten Protokolls erreicht. Sofort nach der
Umwandlung in eine Plasmid-Bibliothek trugen die erhaltenen Ampicillin-resistenten
Klone das cDNA-Insert
im Vektor pBluescript SK(–).
Die Expression der cDNA erfolgt unter der Kontrolle des lacZ-Promotors auf dem
Vektor.
-
Zwei
Phagemid-Bibliotheken wurden unter Verwendung der Gemische des Lambda-Zap
II-Phagen und des filamentösen
Helferphagen von 100 μl
zu 1 μl
generiert. Zwei weitere Bibliotheken wurden unter Verwendung von
Gemischen aus 100 μl
Lambda-Zap II zu 10 μl
Helferphagen und 20 μl
Lambda-Zap II zu 10 μl Helferphagen
generiert. Die Titer der Phagemidpraparationen waren ungeachtet
des verwendeten Gemischs ähnlich
und es handelte sich um ca. 2 × 103 Ampicillin-resistente Transfektanten pro
ml mit dem E. coli-Stamm XL1-Blue als Wirt und ca. 1 × 103 mit DE126 (siehe nachstehend) als Wirt.
-
Zum
Auswählen
von Klonen, die das LKR-Gen trugen, wurde ein speziell konzipierter
E. coli-Wirt, DE126,
konstruiert. Die Konstruktion von DE126 erfolgte in mehreren Stufen.
- (1) Es wurde ein generalisierter Transduktions-Stock
des Coliphagen Plvir durch Infektion einer Kultur von TST1 [F–,
araD139, Delta-(argF-lac)205, flb5301, ptsF25, relA1, rpsL150, malE52
:: Tn10, deoC1, λ–]
(E. coli Genetic Stock Center Nr. 6137) unter Verwendung eines Standardverfahrens
(für Verfahren
siehe J. Miller, Experiments in Molecular Genetics) produziert.
- (2) Dieser Phagenstock wurde als Donor in einer transduktionalen
Kreuzung (für
Verfahren siehe J. Miller, Experiments in Molecular Genetics) mit
dem Stamm GIF106M1 (F–, arg, ilvA296, lysC1001,
thrA1101, metL1000, λ–,
rpsL9, malT1, xyl-7, mtl-2, thil(?), supE44(?)] (E. coli Genetic
Stock Center Nr. 5074) als der Empfänger verwendet. Rekombinanten
wurden auf angereichertem Medium [L supplementiert mit DM], das das
Antibiotikum Tetracyclin enthält,
ausgewählt.
Das Transposon Tn10, das Tetracyclin-Resistenz verleiht, wird in
das malE-Gen von Stamm TST1 insertiert. Sich aus dieser Kreuzung
herleitende Tetracyclin-resistente Transduktanten enthalten wahrscheinlich
bis zu 2 min des E. coli-Chromosoms
in der Umgebung von malE. Die Gene malE und lysC werden im Cotransduktionsabstand
durch weniger als 0,5 Minuten gut getrennt.
- (3) 200 Tetracyclin-resistente Transduktanten wurden gründlich phänotypisiert,
eine angemessene Fermentierung und Ernährungsmerkmale wurden anhand
von Scores bewertet. Dem Empfängerstamm GIF106M1
fehlen auf Grund von Mutationen in thrA, metL und lysC die Aspartokinase-Isozyme
vollkommen, und er benötigt
deshalb zum Wachstum die Anwesenheit von Threonin, Methionin, Lysin
und meso-Diaminopimelinsäure
(DAP). Von Transduktanten, die lysC+ mit
malE:: Tn10 von TST1 geerbt hatten, würde erwartet, dass sie auf
einem Minimalmedium, das Vitamin B1, L-Arginin, L-Isoleucin und
L-Valin zusätzlich
zu Glucose, die als Kohlenstoff- und Energiequelle dient, wachsen. Überdies
exprimieren Stämme mit
der genetischen Konstitution von lysC+,
metL– und
thrA– nur
die Lysin-empfindliche
Aspartokinase. Folglich sollte das Zufügen von Lysin zum Minimalmedium
das Wachstum der lysC+-Rekombinanten verhindern, was
zu einer Verarmung an Threonin, Methionin und DAP führt. Von
den untersuchten 200 Tetracyclin-resistenten Transduktanten wuchsen
49 auf dem Minimalmedium, dem es an Threonin, Methionin und DAP mangelte. Überdies
wurden alle 49 durch das Zufügen
von L-Lysin zum Minimalmedium inhibiert. Einer dieser Transduktanten
wurde als DE125 bezeichnet. DE125 weist den Phänotyp der Tetracyclin-Resistenz, Bedarf
an Arginin, Isoleucin und Valin zum Wachstum und Empfindlichkeit
gegen Lysin auf. Der Gentyp dieses Stamms ist F– malE52
:: Tn10, arg, ilvA296, thrA1101, metL1000, Lambda–,
rpsL9 malT1, xyl-7, mtl-2 thil(?), supE44(?).
- (4) Dieser Schritt beinhaltet die Produktion eines männlichen
Derivats von Stamm DE125. Stamm DE125 wurde mit dem männlichen
Stamm AB1528 [F'16/Delta(gpt-proA)
62, lacY1 oder lacZ4, ginV44, galK2 rac–(?),
hisG4, rfbd1, mgl-51, kdgK51(?), ilvC7, argE3, thi-1] (E. coli Genetic
Stock Center Nr. 1528) mittels des Konjugationsverfahrens gepaart.
F'16 trägt das Gencluster
ilvGMEDAYC. Die beiden Stämme
wurden auf angereichertem Medium, das das Wachstum von jedem Stamm
zulässt,
im Kreuz ausgestrichen. Nach der Inkubation wurde die Platte in
Wiederholung auf ein synthetisches Medium, das Tetracyclin, Arginin,
Vitamin B1 und Glucose enthielt, ausplattiert. DE125 kann auf diesem
Medium nicht wachsen, weil es kein Isoleucin synthetisieren kann.
Das Wachstum von AB1528 wird durch den Einschluss des Antibiotikums
Tetracyclin und das Auslassen von Prolin und Histidin am dem synthetischen
Medium verhindert. Auf diesem Selektivmedium wuchs ein Zellpatch.
Diese rekombinanten Zellen wurden der Isolierung einer Einzelkolonie
auf dem gleichen Medium unterzogen. Es wurde bestimmt, dass es sich
bei dem Phänotyp
von einem Klon um Ilv+, Arg–,
TetR, Lysin-empfindlichen, männlich-spezifischen
Phagen, (MS2)-empfindlich, handelt, der mit dem einfachen Transfer
von F'16 aus AB1528
an DE125 konsistent ist. Dieser Klon wurde als DE126 bezeichnet
und weist den Gentyp F'16/ma/E52
:: Tn10, arg–,
ilvA296, thrA1101, metL100, lysC+, λ–, rpsL9,
malT1, xyl-7, mtl-2, thi-1?, supE44? auf. Er wird durch 20 μg/ml L-Lysin
in einem synthetischen Medium inhibiert.
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Zum
Selektieren auf Klone aus der Mais-cDNA-Bibliothek, die das LKR-Gen
trugen, wurden 100 μl
der Phagemid-Bibliothek mit 100 μl
einer Kultur von DE126, die über
Nacht in L-Bouillon gezüchtet
wurde, gemischt und die Zellen wurden auf synthetische Medien ausplattiert,
die Vitamin B1, L-Arginin, Glucose als eine Kohlenstoff- und Energiequelle,
100 μg/ml
Ampicillin und L-Lysin bei 20, 30 oder 40 μg/ml enthielten. Vier Platten
mit jeder der drei verschiedenen Lysinkonzentrationen wurden hergestellt.
Es wurde erwartet, dass die Phagemidmenge und die DE126-Zellen ca.
1 × 105 Ampicillinresistente Transfektanten pro
Platte ergeben. Pro Platte wuchsen zehn bis dreißig Lysin-resistente Kolonien
(ca. 1 Lysin-resistente pro 5000 Ampicillin-resistente Kolonien).
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Plasmid-DNA
wurde aus 10 unabhängigen
Klonen isoliert und zu DE126 retransformiert. Sieben der zehn DNAs
ergaben Lysin-resistente Klone, die zu erkennen geben, dass das
Merkmal der Lysin-Resistenz auf
dem Plasmid getragen wurde. Die berichtete Größe der Mais-LKR beträgt ca. 140000
Dalton, die eine mRNA von mindestens 3,8 kb erfordert. Die Restriktionsenzym-Analyse
der DNAs zeigte, dass der Klon 11D ein Plasmid mit einem Insert
von ca. 4 kb von Mais-DNA enthielt, das groß genug ist, um eine cDNA voller Länge zu tragen.
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