DE69334163T2

DE69334163T2 - Nukleinsäurefragmente und Verfahren zur Steigerung des Lysin- und Threoningehaltes der Pflanzensamen

Info

Publication number: DE69334163T2
Application number: DE69334163T
Authority: DE
Inventors: Saverio Carl Arden Falco
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1992-03-19
Filing date: 1993-03-18
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2013-03-19
Also published as: MX9301521A; WO1993019190A1; EP0640141A1; DK0640141T3; DK1394257T3; AU675933B2; ZA931978B; CA2132414A1; EP1394257A1; DE69332974D1; DE69334163D1; EP0640141B1; CA2132414C; EP1394257B1; AU3923393A; JPH07504821A; DE69332974T2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Gegenstand der Erfindung ist ein einzigartiges synthetisches Nukleinsäure-Subfragment, das für die Aspartokinase (AK) kodiert, die gegen die Inhibition durch Lysin unempfindlich ist. Verfahren zu ihrer Verwendung bei der Herstellung gesteigerter Lysin- oder Threonin-Konzentrationen in transformierten Organismen sind auch bereitgestellt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Sich von vielen Getreidesorten herleitende humane Nahrung und Tierfutter haben Mangel an einigen der zehn essenziellen Aminosäuren, die im Tierfutter erforderlich sind. In Mais (Zea mays L.) stellt Lysin die am meisten limitierende Aminosäure für die Futterbedürfnisse vieler Tiere dar. Das Mehl von der Sojabohne (Glycine max L.) wird als ein Zusatzmittel zu auf Mais basierendem Tierfutter hauptsächlich als ein Lysinsupplement verwendet. Eine derartige Steigerung des Lysingehalts von entweder Mais oder der Sojabohne würde den Bedarf an einer Supplementierung von gemischtem Getreidefutter mit über die Fermentierung von Mikroben produziertem Lysin reduzieren oder eliminieren.
Pflanzenzüchter sind seit langem an der Verwendung natürlich vorkommender Variationen zur Verbesserung der Proteinqualität und -quantität in Kulturpflanzen interessiert gewesen. Maislinien, die höher als normale Lysinkonzentrationen (70%) enthalten, wurden identifiziert (Mertz, Science 145, 279 (1964) und Nelson, Science 150, 1469–70 (1965)). Diese Linien, die ein mutantes Gen, opaque-2, inkorporieren, weisen jedoch schlechte agronomische Qualitäten auf (erhöhte Anfälligkeit für Krankheiten und Schädlinge, 8–14% Ertragsreduktion, niedriges Körnergewicht, langsameres Trocknen, niedrigere Trockenmahlausbeute von Kornflocken („flaking grits"), und erhöhte Lagerungsprobleme) und sind folglich gewerblich nicht nützlich [Deutscher, D. Adv. Exp, Medicine and Biology, 105, 281–300 (1978)]. Der im CIMMYT unter Verwendung der opaque-2 und sugary-2-Gene und assoziierten Modifiziermitteln gezüchtete Qualitätsproteinmais (QPM) weist ein hartes Endosperm und in den Körnern angereicherte Lysin- und Tryptophanspiegel auf [Vasal, S. K., et al. Proceedings of the 3rd Seed Protein Symposium. Gatersleben, 31. August bis 2. September 1983]. Die in den QPM-Linien dargestellten Genpools sind jedoch tropisch und subtropisch. Qualitätsproteinmais stellt ein genetisch komplexes Merkmal dar und die existierenden Linien lassen sich nicht leicht an das in den USA gebräuchliche Zahnmais-Keimplasma anpassen, wobei die Übernahme von QPM durch die Maiszüchter verhindert wird.
Der Aminosäuregehalt von Samen wird hauptsächlich (90–99%) durch die Aminosäurezusammensetzung der Proteine im Samen und in einem geringeren Ausmaß (1–10%) durch die Pools freier Aminosäuren bestimmt. Die Menge des Gesamtproteins in Samen variiert von ca. 10% des Trockengewichts in Zerealien bis 20–40% des Trockengewichts in Leguminosen. Bin großer Teil der Protein-gebundenen Aminosäuren ist in den Samenspeicherproteinen enthalten, die während der Samenentwicklung synthetisiert werden und die als eine bedeutende Nährstoffreserve nach der Keimung dienen. In vielen Samen machen die Speicherproteine 50% oder mehr des Gesamtproteins aus.
Zur Verbesserung der Aminosäurezusammensetzung von Samen wird die Genmanipulationstechnologie zum Isolieren und Exprimieren von Genen für Speicherproteine in transgenen Pflanzen verwendet. So wurde zum Beispiel ein Gen aus der Paranuss für ein Samen-2S-Albumin, das sich aus 26% schwefelhaltigen Aminosäuren zusammensetzt, isoliert [Altenbach et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 239–250] und in den Samen von transformiertem Tabak unter der Kontrolle der Regulationssequenzen aus einem Phaseolin-Speicherprotein-Gen der Bohne exprimiert. Die Akkumulation des schwefelreichen Proteins in den Tabaksamen ergab eine bis zu 30%ige Steigerung der Methioninkonzentration in den Samen [Altenbach et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 513–522]. Es wurden bisher jedoch keine Pflanzensamen-Speicherproteine identifiziert, die bezogen auf den durchschnittlichen Lysingehalt von Pflanzenproteinen in Lysin auf ähnliche Weise angereichert werden, wobei verhindert wird, dass dieser Ansatz zur Steigerung des Lysins verwendet wird.
Lysin zusammen mit Threonin, Methionin und Isoleucin stellen Aminosäuren dar, die sich von Aspartat herleiten, und die Regulierung der Biosynthese von jedem Mitglied dieser Familie ist miteinander verbunden. Die Regulierung des metabolischen Flusses in der Bahn scheint hauptsächlich über die Endprodukte zu erfolgen. Der erste Schritt in der Bahn stellt die Phosphorylierung von Aspartat durch das Enzym Aspartokinase (AK) dar, und es wurde festgestellt, dass dieses Enzym ein wichtiges Target für die Regulierung in vielen Oganismen darstellt. Eingehende physiologische Studien zum Fluss von 4-Kohlenstoff-Molekülen durch die Aspartatbahn wurden im Modellpflanzensystem Lemna paucicostata durchgeführt [Giovanelli et al. (1989) Plant Physiol. 90: 1584–1599]. Die Autoren geben an: „Diese Daten stellen mm einen definitiven Hinweis darauf bereit, dass der durch Aspartokinase katalysierte Schritt in der Regel keinen wichtigen Ort für die Regulierung des Eintritts von 4-Kohlenstoff-Einheiten in die Aspartatfamilie von Aminosäuren [in Pflanzen] darstellt."
Die Bahn der Aspartat-Familie wird auch durch Reaktionen am Verzweigungspunkt reguliert. Für Lysin stellt dies die Kondensation von Aspartyl-β-semialdehyd mit Pyruvat, katalysiert durch die Dihydrodipicolinsäure-Synthase (DHDPS) dar, während für Threonin und Methionin die Reduktion von Aspartyl–β-semialdehyd durch Homoserindehydrogenase (HDH), gefolgt von der Phosphorylierung von Homoserin durch Homoserinkinase (HK) wichtige Kontrollpunkte darstellen.
Es wurden viele Versuche zur Isolierung von Lysin überproduzierenden Mutanten aus Pflanzen durch Auswahl auf Resistenz des Lysin-Analogs S-(2-Aminoethyl)-cystein (AEC), entweder allein oder zusammen mit Lysin- plus Threoninresistenz-Selektionen unternommen. Bisher wurden jedoch keine Beispiele von Steigerungen der Lysinspiegel in Samen mitgeteilt, die gewerblich wertvoll wären.
Ein alternativer Ansatz zur Steigerung der Produktion und Akkumulation spezifischer freier Aminosäuren, wie zum Beispiel Lysin, ist über die Genmanipulationstechnologie vorgesehen. Eine Anzahl an Genen für wichtige Regulatorenzyme aus der Bahn der Aspartatfamilie wurde aus verschiedenen Quellen isoliert. Das dapA-Gen von E. coli kodiert für ein DHDPS-Enzym, das um das ca. 20fache weniger empfindlich gegen die Inhibition durch Lysin als die Weizenkeim-DHDPS ist. Das dapA-Gen von E. coli wurde mit den Pflanzengen-Expressionssequenzen verknüpft, die über die Transformation in Tabakzellen eingeführt wurden und von denen gezeigt wurde, dass sie eine erhebliche Steigerung der Konzentrationen von freiem Lysin in Blättern veranlassen (Glassman et al. (1989) PCT-Patentanmeldung PCT/US89/01309 ). Kein Hinweis wurde jedoch vorgelegt, dass gesteigertes Lysin in Samen anwesend war (obwohl Samen zum Testen vorhanden waren). Das dapA-Gen von E. coli, das mit den Expressionssequenzen des Pflanzengens verknüpft war, wurde von Galili et al. [(1991) Abstr. 422 vom Third Int. Cong. of Int. Soc. Plant Mol. Biol.] und von Shaul et al. ((1992) Plant Jour. 2: 203–209] auch in Tabakzellen eingeführt, und hat gezeigt, dass es zu einer Steigerung der Spiegel von freiem Lysin in Blättern führt. Es lag wiederum kein Hinweis auf gesteigerte Spiegel von freiem Lysin in Samen vor. Diese Wissenschaftler haben vor kurzem über die Einführung eines lysC-Gens von E. coli berichtet, das für ein Lysin-unempfindliches AK-Enzym in Tabakzellen über Transformation kodiert [Galili et al. (1992) Eur. Patentanmeldung 91119328.2 ; Shaul et al. (1992) Plant Physiol. 100: 1157–1163). Die Expression des E. coli-Enzyms führt zu Steigerungen der Spiegel des freien Threonins in den Blättern und Samen von transformierten Pflanzen. Kreuzungen von Pflanzen, die E. coli-DHDPS und -AK exprimieren, führten zu einer Nachkommenschaft, die mehr freies Lysin in Blättern akkumulierte als die DHDPS-Elternpflanze, aber weniger freies Threonin in Blättern als die AK-Elternpflanze. Es lag kein Hinweis auf gesteigerte Spiegel von freiem Lysin in Samen vor.
Das limitierte Verständnis der Details hinsichtlich der Regulierung des Biosynthesewegs in Pflanzen macht die Applikation der Genmanipulationstechnologie, insbesondere bei Samen, ungewiss. Es stehen wenig Informationen über die Quelle der von Aspartat hergeleiteten Aminosäuren in Samen zur Verfügung. Es ist zum Beispiel von den meisten Pflanzen nicht bekannt, ob sie in Samen synthetisiert oder aus den Blättern an die Samen transportiert oder beidem werden. Freie Aminosäuren machen außerdem nur eine kleine Fraktion des Gesamtaminosäuregehalts von Samen aus. Deshalb muss eine Überakkumulation von freien Aminosäuren um das Vielfache stattfinden, damit sie sich signifikant auf die Gesamtaminosäurezusammensetzung der Samen auswirken. Darüber hinausgehend ist über den Katabolismus freier Aminosäuren in Samen wenig bekannt. Katabolismus von freiem Lysin wurde bei sich entwickelndem Endosperm von Mais und Gerste beobachtet. Es wird angenommen, dass der erste Schritt beim Katabolismus von Lysin durch die Lysin-Ketoglutarat-Reduktase [Brochetto-Braga et al. (1992) Plant Physiol. 98: 1139–1147] katalysiert wird. Ob solche katabolischen Wege in Pflanzen weit verbreitet sind und ob sie sich auf die Akkumulationshöhe freier Aminosäuren auswirken, ist unbekannt.
Vor dieser Anmeldung war kein Verfahren zur Steigerung der Lysinkonzentration oder jedweder anderen Aminosäure in Samen über die Genmanipulation bekannt. Folglich besteht ein Bedarf an Genen, chimären Genen und Verfahren, um sie in Samen dergestalt zu exprimieren, dass eine Überakkumulation freier Aminosäuren in Samen zu einer Verbesserung der Nährqualität führt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsäurefragment umfassend: (a) ein erstes Nukleinsäure-Subfragment, das für AK kodiert, das gegen die Inhibition durch Lysin unempfindlich ist und (b) ein zweites Nukleinsäure-Subfragment, das für die Dihydrodipicolinsäure-Synthase kodiert, die mindestens um das 20fache weniger empfindlich gegen die Inhibition durch Lysin als Pflanzen-DHDPS ist. Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst weiter ein drittes Nukleinsäure-Subfragment, das für die Antisense-Lysin-Ketoglutarat-Reduktase kodiert. In einer weiteren Ausführungsform sind die ersten und zweiten Subfragmente operativ mit einer geeigneten Pflanzenchloroplast-Transitsequenz verknüpft, und jedes Subfragment ist auch mit einer geeigneten Regulationssequenz zur Förderung der Expression in Pflanzen verknüpft. Eine bevorzugte Ausführungsform stellt eine der beiden vorstehend beschriebenen Erfindungen dar, worin:

(a) das erste Nukleinsäure-Subfragment eine Nukleotidsequenz umfasst, die im Wesentlichen homolog zur in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz ist, kodierend für eine Lysin unempfindliche Variante von E. coli-AKIII und die weiter dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens einer der folgenden Bedingungen entsprochen wird:
(1) die Aminosäure an Position 318 stellt eine Aminosäure mit Ausnahme von Threonin dar, oder
(2) die Aminosäure an Position 352 stellt eine Aminosäure mit Ausnahme von Methionin dar; oder
(b) sich das zweite Nukleinsäure-Subfragment von Bakterien herleitet. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt die dar, worin:
(a) das erste Nukleinsäure-Subfragment weiter dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens einer der folgenden Bedingungen entsprochen wird:
(1) Die Aminosäure an Position 318 stellt Isoleucin dar, oder
(2) die Aminosäure an Position 352 stellt Isoleucin dar; oder
(b) sich das zweite Nukleinsäure-Subfragment von Bakterien, bevorzugt entweder von E. coli oder Corynebacterium glutamicum herleitet.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt das isolierte Nukleinsäurefragment dar, das mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz, kodierend für E. coli-AKIII, im Wesentlichen homolog ist, wobei das Nukleinsäurefragment für eine Lysinunempfindliche Variante von E. coli-AKIII kodiert.
Der erfindungsgemäße Gegenstand schließt auch ein isoliertes Nukleinsäurefragment ein, das ein Nukleinsäure-Subfragment umfasst, das für die Lysin-Ketoglutarat-Reduktase kodiert.
Mit den beschriebenen Nukleinsäurefragmenten transformierte Pflanzen, Samen und Mikroorganismen stellen auch erfindungsgemäße Ausführungsformen dar. Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen stellen Verfahren zur Steigerung des Threonin- oder Lysingehalts von Samen durch Transformation von Pflanzen mit den beschriebenen einzigartigen Nukleinsäurefragmenten dar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND DES SEQUENZPROTOKOLLS
Die Erfindung kann vollkommener aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und der sie begleitenden Zeichnungen und dem Sequenzprotokoll, die einen Teil dieser Anmeldung bilden, verstanden werden.
1 zeigt eine schematische Darstellung der Genexpressionskassetten.
2 zeigt eine Karte des binären Plasmidvektors pZS97K.
3 zeigt eine Karte des binären Plasmidvektors pZS97.
4 zeigt eine Karte des binären Plasmidvektors pZS199.
5 zeigt eine Karte des Plasmidvektors pBT603.
SEQ ID NO:1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der Kodierungsregion des Wildtyp-lysC-Gens von E. coli, das für das in Beispiel 1 beschriebene AKIII kodiert.
SEQ ID NO:2 and 3 wurden in Beispiel 2 zur Herbeiführung eines Nco I-Orts am Translations-Startcodon des lysC-Gens von E. coli verwendet.
SEQ ID NO:4 und 5 wurden in Beispiel 3 als PCR-Primer zur Isolierung des dapA-Gens von Corynebacterium verwendet.
SEQ ID NO:6 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der Kodierungsregion des Wildtyp-dapA-Gens von Corynebacterium, das für in Beispiel 3 beschriebene Lysin-unempfindliche DHDPS kodiert.
SEQ ID NO:7 wurde in Beispiel 4 zur Herbeiführung eines Nco I-Orts am Translations-Startcodon des dapA-Gens von E. coli verwendet.
SEQ ID NO:8, 9, 10 und 11 wurden in Beispiel 6 zur Herbeiführung einer Chloroplast-Transitsequenz und zum Verknüpfen der Sequenz mit den Genen lysC von E. coli, lysC-M4 von E. coli, dapA von E. coli und dapA von Corynebacterium verwendet.
SEQ ID NO:12 und 13 wurden in Beispiel 6 zur Herbeiführung eines Kpn I-Orts unmittelbar nach dem Translation-Stoppcodon des dapA-Gens von E. coli verwendet.
SEQ ID NO:14 und 15 wurden in Beispiel 6 als PCR-Primer zur Herbeiführung einer Chloroplast-Transitsequenz und Verknüpfung der Sequenz mit dem dapA-Gen von Corynebacterium verwendet.
SEQ ID NO:16 wurde in Beispiel 6 als eine konstitutive Expressionskassette für Mais verwendet.
SEQ ID NO:17–22 wurden in Beispiel 6 zur Herbeiführung einer Maischloroplast-Transitsequenz und Verknüpfung der Sequenz mit dem lysC-M4-Gen von E. coli verwendet.
SEQ ID NO:23 und 24 wurden in Beispiel 6 als PCR-Primer zur Herbeiführung einer Maischloroplast-Transitsequenz und Verknüpfung der Sequenz mit dem dapA-Gen von E. coli verwendet.
Das Sequenzprotokoll enthält den Einbuchstabencode für Nukleotidsequenzzeichen und die Dreibuchstabencodes für Aminosäuren wie in Übereinstimmung mit den in Nucleic Acids Research 13: 3021–3030 (1985) und im Biochemical Journal 219 (Nr. 2): 345–373 (1984) beschriebenen IUPAC-IUB-Normen definiert, die hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zur Steigerung der Akkumulation spezifischer freier Aminosäuren in den Samen von Pflanzen über die Genmanipulation, bestimmte die Anmelderin, welche Enzyme in dieser Bahn die Bahn kontrollierten. Um dies zu erreichen wurden Gene, die für Enzyme in der Bahn kodieren, aus Bakterien isoliert. In einigen Fallen wurden Mutationen in den Genen dergestalt erhalten, dass das kodierte Enzym unempfindlich gegen die Inhibition des Endprodukts gemacht wurde. Da die Gene nicht von pflanzlicher Herkunft waren, mussten sie mit intrazellulären Lokalisierungssequenzen und geeigneten Regulationssequenzen zur Expression in Pflanzen verknüpft werden. Die Gene, individuell oder in Kombinationen, wurden dann über die Transformation in Pflanzen eingeführt und auf ihre Fähigkeit zur Auslösung der Akkumulation der gewünschten Aminosäure(n) in dem/den gewünschten Pflanzenorgan(en) beurteilt.
Die nachstehenden Lehren beschreiben Nukleinsäurefragmente und Verfahren, die zur Steigerung der Akkumulation von Lysin und Threonin in den Samen von transformierten Pflanzen im Vergleich zu Spiegeln von Aminosäuren nicht transformierter Pflanzen nützlich sind. Die Anmelderin hat spezifisch ein einzigartiges erstes Nukleinsäurefragment bereitgestellt, das aus zwei Nukleinsäure-Subfragmenten besteht, wobei eines für AK kodiert, das gegen die Inhibition durch Lysin unempfindlich ist, und das andere, das für DHDPS kodiert, das mindestens um das 20fache weniger empfindlich gegen die Feedback-Inhibition durch Lysin als eine typische Pflanzen-DHDPS, wie z. B. Weizen-DHDPS, ist. Die Anmelderin stellte fest, dass es sich um die Kombination von Subfragmenten handelt, welche das in den Samen von transformierten Pflanzen akkumulierte Lysin im Vergleich zu nicht transformierten Wirtspflanzen erfolgreich steigert. Zur Erzielung einer größeren Akkumulation von Lysin in Samen von transformierten Pflanzen hat die Anmelderin auch ein Nukleinsäurefragment bereitgestellt, das ein chimäres Antisense-Lysin-Ketoglutarat-Reduktase-Gen (LKR-Gen) enthält. Dieses Fragment kann mit dem ersten Fragment verknüpft oder über die Kreuzung von Pflanzen kombiniert werden, die mit dem ersten Fragment mit Pflanzen transformiert werden, die mit dem Nukleinsäurefragment, das ein chimäres Antisense-LKR-Gen enthält, transformiert werden. Die Anmelderin hat auch ein für AK kodierendes Nukleinsäurefragment bereitgestellt, das gegen die Lysin-Inhibition unempfindlich ist. Mit diesem Fragment transformierte Pflanzen akkumulieren im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen das gesteigerte Threonin in ihren Samen.
Im Kontext dieser Offenbarung werden eine Anzahl von Begriffen verwendet. Wie hierin verwendet versteht man unter dem Begriff „Nukleinsäuren" ein großes Molekül, das einsträngig oder doppelsträngig sein kann, das sich am Monomeren (Nukleotiden) zusammensetzt, die einen Zucker, ein Phosphat und entweder ein Purin oder Pyrimidin enthalten. Ein „Nukleinsäurefragment" stellt eine Fraktion eines gegebenen Nukleinsäuremoleküls dar. In höheren Pflanzen stellt die Desoxyribonukleinsäure (DNA) das genetische Material dar, während die Ribonukleinsäure (RNA) am Transfer der Information in der DNA in Proteine beteiligt ist. Unter einem „Genom" versteht man den gesamten Körper des in jeder Zelle eines Organismus enthaltenen genetischen Materials. Der Begriff „Nukleotidsequenz" verweist auf ein DNA- oder RNA-Polymer, das ein- oder doppelsträngig sein kann, das optional synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nukleotidbasen enthält, die zur Inkorporation in DNA- oder RNA-Polymere fähig sind.
Wie hierin verwendet versteht man unter dem Begriff „homolog zu" die Komplementarität zwischen der Nukleotidsequenz von zwei Nukleinsäuremolekülen oder zwischen den Aminosäuresequenzen von zwei Proteinmolekülen. Schätzungen einer solchen Homologie werden entweder durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung unter Bedingungen der Stringenz, wie vom Fachmann sehr wohl erkannt werden wird [wie in Harnes und Higgins (Hrsg.) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K. beschrieben], oder durch den Vergleich der Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäuren oder Proteinen bereitgestellt.
Wie hierin beschrieben versteht man unter „im Wesentlichen homolog" Nukleinsäuremoleküle, die weniger stringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich machen als die für homologe Sequenzen, und man versteht auch darunter das Kodieren der DNA-Sequenz, das Basenänderungen beinhalten kann, die keine Änderung in der kodierten Aminosäure hervorrufen, oder die Basenänderungen beinhalten, die eine oder mehr Aminosäure(n) verändern können, sich aber nicht auf die Funktionseigenschaften des durch die DNA-Sequenz kodierten Proteins auswirken. Folglich schließen die hierin beschriebenen Nukleinsäurefragmente Moleküle ein, die mögliche Variationen der Nukleotidbasen umfassen, die sich von der Deletion, dem Rearrangement, der zufälligen oder kontrollierten Mutagenese des Nukleinsäurefragments und selbst gelegentlich Nukleotidsequenzierungsfehlern herleiten, so lange die DNA-Sequenzen im Wesentlichen homolog sind.
„Gen” verweist auf ein Nukleinsäurefragment, das ein spezifisches Protein exprimiert, das Regulationssequenzen einschließt, die der Kodierungsregion vorausgehen (5' nicht kodierend) und folgen (3' nicht kodierend). Unter „nativem" Gen versteht man das Gen wie es in der Natur vorkommt, mit seinen eigenen Regulationssequenzen. Unter „chimärem" Gen versteht man ein Gen, das heterogene Regulations- und Kodiersequenzen umfasst. „Endogenes" Gen verweist auf das native Gen, das in der Regel an seiner natürlichen Stelle im Genom gefunden wird. Ein „Fremdgen" verweist auf ein Gen, unter dem man ein Gen versteht, das in der Regel nicht im Wirtsmechanismus gefunden, sondern vielmehr durch Gentransfer eingeführt wird.
Unter „Kodiersequenz" versteht man eine DNA-Sequenz, die für ein spezifisches Protein kodiert und nicht kodierende Sequenzen ausschließt.
„Initiationscodon" und „Terminationscodon" verweisen auf eine Einheit aus drei benachbarten Nukleotiden in einer Kodiersequenz, welche die Initiation bzw. Kettentermination der Proteinsynthese (mRNA-Translation) spezifiziert. Unter „offenem Leserahmen" versteht man die Aminosäuresequenz, die zwischen den Translationsinitiations- und -terminationscodonen einer Kodiersequenz kodiert ist.
Unter „RNA-Transkript" versteht man das Produkt, das sich aus der RNA-Polymerasekatalysierten Transkription einer DNA-Sequenz ergibt. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz darstellt, versteht man darunter das primäre Transkript, oder es kann eine RNA-Sequenz darstellen, die sich von der posttranskriptionalen Prozessierung des primären Transkripts herleitet. Unter „Messenger-RNA (mRNA)" versteht man die RNA, die durch die Zelle in ein Protein translatiert werden kann. „cDNA" verweist auf eine doppelsträngige DNA, die für mRNA komplementär ist und sich von ihr herleitet. Unter „Sense"-RNA versteht man ein RNA-Transkript, das die mRNA einschließt. Unter „Antisense-RNA" versteht man ein RNA-Transkript, das für das gesamte oder einen Teil eines primären Target-Transkripts oder die gesamte mRNA oder einen Teil komplementär ist und das die Expression eines Targetgens durch Interferenz mit der Prozessierung, dem Transport und/oder der Translation seines primären Transkripts oder mRNA blockiert. Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann mit jedwedem Teil des spezifischen Gentranskripts, d. h. an der 5' nicht kodierenden Sequenz, 3' nicht kodierenden Sequenz, Intronen oder der Kodiersequenz vorhanden sein. Die Antisense-RNA kann, wie hierin verwendet, außerdem Regionen von Ribozym-Sequenzen enthalten, welche die Wirksamkeit der Antisense-RNA zur Blockierung der Genexpression steigern. Unter „Ribozym" versteht man eine katalytische RNA und schließt sequenzspezifische Endoribonukleasen ein.
Wie hierin verwendet versteht man unter geeigneten „Regulationssequenzen" Nukleotidsequenzen, die sich stromaufwärts (5'), in, und/oder stromabwärts (3') an einer Kodiersequenz befinden, welche die Transkription und/oder Expression der Kodiersequenzen, potenziell zusammen mit dem biosynthetischen Proteinapparat der Zelle, kontrollieren. Diese Regulationssequenzen schließen Promotoren, Translations-Leadersequenzen, Transkriptions-Terminationssequenzen und Polyadenylierungssequenzen ein.
Unter „Promotor" versteht man eine DNA-Sequenz in einem Gen, gewöhnlich stromaufwärts (5') an seiner Kodiersequenz, welcher die Expression der Kodiersequenz durch Bereitstellung der Erkennung der RNA-Polymerase und andere für eine richtige Transkription erforderliche Faktoren kontrolliert. Ein Promotor kann auch DNA-Sequenzen enthalten, die an der Bindung von Proteinfaktoren beteiligt sind, welche die Wirksamkeit der Transkriptionsinitiation als Response auf physiologische oder Entwicklungsbedingungen kontrollieren. Er kann auch Enhancer-Elemente enthalten.
Ein „Enhancer" stellt eine DNA-Sequenz dar, welcher die Promotor-Aktivität stimulieren kann. Er kann ein innates Element des Promotors oder ein insertiertes heterologes Element zur Förderung des Spiegels und/oder der Gewebsspezifität eines Promotors darstellen. „Konstitutive Promotoren" verweisen auf die, welche die Genexpression in allen Geweben und jederzeit lenken. Unter „organspezifischen" oder „entwicklungsspezifischen" Promotoren versteht man hierin die, welche die Genexpression fast ausschließlich in spezifischen Organen, wie zum Beispiel in Blättern oder Samen, oder auf spezifischen Entwicklungsstufen in einem Organ, wie zum Beispiel in der frühen bzw. späten Embryogenese, lenken.
Unter dem Begriff „operativ verknüpft" versteht man Nukleinsäuresequenzen an einem einzelnen Nukleinsäuremolekül, die dergestalt assoziiert sind, dass die Funktion des einen durch das andere beeinflusst wird. So ist ein Promotor zum Beispiel operativ mit einem Strukturgen (d. h. einem Gen, das für Aspartokinase kodiert, die wie hierin angegeben, Lysin-unempfindlich ist) verknüpft, wenn er zur Einwirkung auf die Expression dieses Strukturgens (d. h. dass sich das Strukturgen unter der transkriptionalen Kontrolle des Promoters befindet) fähig ist.
Der Begriff „Expression", wie hierin verwendet, soll die Produktion des Proteinprodukts bedeuten, das durch ein Gen kodiert ist. „Expression" verweist insbesondere auf die Transkription und stabile Akkumulation der Sense-(mRNA) oder der Antisense-RNA, die sich von dem/den erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment(en) herleitet, die zusammen mit dem Proteinapparat der Zelle in veränderten Konzentrationen des Proteinprodukts resultiert. „Antisense-Inhibition" verweist auf die Produktion der Antisense-RNA-Transkripte, die zur Verhinderung der Expression des Targetproteins fähig sind. Unter „Überexpression" versteht man die Produktion eines Genprodukts in transgenen Organismen, die über die Produktionsmengen in normalen oder nicht transformierten Organismen hinausgeht. Unter „Cosuppression" versteht man die Expression eines Fremdgens, das eine erhebliche Homologie zu einem endogenen Gen besitzt, was zur Suppression der Expression von sowohl dem Fremdgen als auch dem endogenen Gen führt. „Veränderte Mengen" verweist auf die Produktion von einem Genprodukt/Genprodukten in transgenen Organismen in Mengen oder Anteilen, die sich von den normalen oder nicht transformierten Organismen unterscheiden.
Die „3' nicht kodierenden Sequenzen" verweisen auf den DNA-Sequenzanteil eines Gens, das ein Polyadenylierungssignal und jedwedes andere Regulationssignal enthält, die zur Einwirkung auf die mRNA-Prozessierung oder die Genexpression fähig sind. Das Polyadenylierungssignal ist gewöhnlich durch die Einwirkung auf die Polyadenylsäureschwänze am 3'-Ende des mRNA-Vorläufers gekennzeichnet.
Die „Translation-Leadersequenz" verweist auf den DNA-Sequenzanteil eines Gens zwischen dem Promotor und der Kodiersequenz, die in RNA transkribiert ist und in der vollkommen prozessierten mRNA stromaufwärts (5') vom Translations-Startcodon anwesend ist. Die Translation-Leadersequenz kann sich auf die Prozessierung des primären Transkripts zu mRNA, die mRNA-Stabilität oder Translationeffizienz auswirken.
Unter „maturem" Protein versteht man ein posttranslational prozessiertes Polypeptid ohne sein Targetingsignal. „Vorläufer"-Protein verweist auf das primäre Translationsprodukt von mRNA. Ein „Chloroplasten-Targetingsignal” stellt eine Aminosäuresequenz dar, die zusammen mit einem Protein translatiert wird und es an den Chloroplasten richtet. Unter „Chloroplast-Transitsequenz" versteht man eine Nukleotidsequenz, die für ein Chloroplasten-Targetingsignal kodiert.
„Transformation" verweist hierin auf den Transfer eines Fremdgens in das Genom eines Wirtsorganismus und sein genetisch stabiles Erbgut. Beispielhafte Verfahren der Pflanzentransformation schließen die von Agrobacterium vermittelte Transformation und die Partikel-beschleunigte oder „Gen-Gun"-Transformationstechnologie ein.
ISOLIERUNG VON AK-GENEN
Das lysC-Gen von E. coli wurde zuvor kloniert, mit Restriktionsendonuklease kartiert und sequenziert [Cassan et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 1052–1057]. Für die vorliegende Erfindung wurde das lysC-Gen auf einem Bakteriophagen-Lambda-Klon aus einer geordneten Bibliothek von 3400 überlappenden Segmenten von klonierter E. coli-DNA erhalten, die von Kohara, Akiyama und Isono [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508] konstruiert wurde. Das lysC-Gen von E. coli kodiert für das Enzym AKIII, das gegen die Lysin-Inhibition empfindlich ist. Im lysC-Gen wurden Mutationen erhalten, die veranlassen, dass das AKIII-Enzym gegen Lysin resistent ist.
Zur Ermittlung der molekularen Basis für die Lysin-Resistenz wurden die Sequenz des Wildtyp-lysC-Gens und drei mutante Gene bestimmt. Die Sequenz des klonierten Wildtyp-lysC-Gens, ersichtlich in SEQ ID NO:1, unterschied sich von der veröffentlichten lysC-Sequenz in der Kodierungsregion an den 5-Positionen.
Von den Sequenzen der drei mutanten lysC-Gene, die für Lysin-unempfindliche Aspartokinase kodierten, unterschied sich jede von der Wildtyp-Sequenz durch ein einzelnes Nukleotid, was zu einer einzelnen Aminosäuresubstitution im Protein führte. Bei einer Mutanten (M2) war ein A für ein G am Nukleotid 954 von SEQ ID NO:1 substituiert, was zu einer Substitution von Isoleucin für Methionin in der Aminosäuresequenz von AKIII führte und zwei Mutanten (M3 und M4) identische Substitutionen von T für C am Nukleotid 1055 von SEQ ID NO:1 aufwiesen, was zu einer Substitution von Isoleucin für Threonin führte.
Andere Mutationen könnten generiert werden, entweder in vivo, wie in Beispiel 1 beschrieben, oder in vitro durch die ortsgerichtete Mutagenese anhand von dem Fachmann bekannten Verfahren, die durch Aminosäuresubstitutionen zu dem im Wildtyp-AKIII an diesen Positionen vorliegenden Methionin- oder Threoninrest führen. Es würde erwartet, dass solche Mutationen zu einem Lysin-unempfindlichen Enzym führen. Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren könnte überdies zur leichten Isolierung und Charakterisierung von so vielen zusätzlichen mutanten lysC-Genen, die für Lysin unempfindliches AKIII kodieren, wie gewünscht führen.
Eine Anzahl anderer AK-Gene wurde isoliert und sequenziert. Zu diesen gehören: das thrA-Gen von E. coli (Katinka et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5730–5733], das metL-Gen von E. coli (Zakin et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 3028–3031] und das HOM3-Gen von S. cerevisiae [Rafalski et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 2146–2151]. Das thrA-Gen von E. coli kodiert für ein bifunktionelles Protein AKI-HDHI. Die AK-Aktivität dieses Enzyms ist unempfindlich gegen Lysin, aber empfindlich gegen Threonin. Das metL-Gen von E. coli kodiert auch für ein bifunktionelles Protein, AKII-HDHII, und die AK-Aktivität dieses Enzyms ist auch unempfindlich gegen Lysin. Das HOM3-Gen von Hefe kodiert für eine AK, die unempfindlich gegen Lysin, aber empfindlich gegen Threonin ist.
Außer diesen Genen sind mehrere Pflanzengene bekannt, die für Lysin-unempfindliche AK kodieren. In Gerste wurden Lysin- plus Threonin-resistente Mutanten beschrieben, die Mutationen in zwei nicht verknüpften Genen tragen, die zu zwei verschiedenen Lysin-unempfindlichen AK-Isoenzymen führen [Bright et al. (1982) Nature 299: 278–279, Rognes et al. (1983) Planta 157: 32–38, Arruda et al. (1984) Plant Physiol. 76: 442–446]. In Mais wies eine Lysin- plus Threonin-resistente Zelllinie AK-Aktivität auf, die weniger empfindlich gegen die Lysin-Inhibition als ihre Elternlinie war [Hibberd et al. (1980) Planta 148: 183–187). Eine anschließend isolierte Lysin- plus Threonin-resistente Maismutante ist an einem anderen genetischen Locus verändert und produziert auch Lysin-unempfindliche AK (Diedrick et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 79: 209–215, Dotson et al. (1990) Planta 182: 546–552]. In Tabak sind zwei AK-Enzyme in Blättern vorhanden, eines Lysin-empfindlich und eines Threonin-empfindlich. Eine Lysin- plus Threonin-resistente Tabakmutante, die vollkommen Lysin-unempfindliche AK exprimierte, wurde beschrieben [Frankard et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 82: 273–282). Diese Pflanzenmutanten könnten gegebenenfalls als Quellen von Genen dienen, die für Lysin-unempfindliche AK kodieren und basierend auf den Lehren hierin zur Steigerung der Akkumulation von Lysin und Threonin in den Samen von transformierten Pflanzen verwendet werden.
Eine partielle Aminosäuresequenz von AK aus Karotten wurde mitgeteilt [Wilson et al. (1991) Plant Physiol. 97: 1323: 1328). Unter Verwendung dieser Information könnte gegebenenfalls ein Set von degenerierten DNA-Oligonukleotiden konzipiert, synthetisiert und als Hybridisierungssonden verwendet werden, um die Isolierung des AK-Gens von der Karotte zu erlauben. In jüngerer Zeit wurde das AK-Gen von der Karotte isoliert und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt [Matthews et al. (1991) U.S.S.N. 07/746705 ]. Dieses Gen kann als eine heterologe Hybridisierungssonde zur Isolierung der Gene verwendet werden, die für die vorstehend beschriebene Lysin-unempfindliche AK kodieren.
HOCHGRADIGE EXPRESSION VON WILDTYP- UND MUTANTEN lysC-GENEN IN E. coli
Zum Erlangen einer hochgradigen Expression der lysC-Gene in E. coli wurde ein bakterieller Expressionsvektor verwendet, der das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase-/T7-Promotor-System einsetzt [Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 125–135]. Der Expressionsvektor und das lysC-Gen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben zur Konstruktion eines lysC-Expressionsvektors modifiziert. Zur Expression der mutanten lysC-Gene (M2, M3 und M4) wurde das Wildtyp-lysC-Gen durch die wie in Beispiel 2 beschriebenen mutanten Gene ersetzt.
Zur hochgradigen Expression wurde jeder der Expressionsvektoren in den E. coli-Stamm B121 (DE3) transformiert [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130]. Die Kulturen wurden gezüchtet, die Expression wurde induziert, die Zellen wurden gesammelt und Extrakte wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Die Überstands- und Pellet-Fraktionen von Extrakten aus nicht induzierten und induzierten Kulturen wurden mittels der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und durch AK-Enzym-Assays wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert. Bei dem wichtigsten Protein, das durch Coomassieblau-Färbung in den Überstands- und Pellet-Fraktionen von induzierten Kulturen sichtbar gemacht wurde, handelte es sich um AKIII. Ca. 80% des AKIII-Proteins befanden sich im Überstand und AKIII machte 10–20% des Gesamtproteins von E. coli im Extrakt aus.
Ca. 80% der AKIII-Enzymaktivität befanden sich in der Überstandsfraktion. Die spezifische Aktivität der Wildtyp- und mutanten Rohextrakte betrug 5–7 μmol Produkt pro Minute pro Milligramm Gesamtprotein. Die Wildtyp-AKIII war empfindlich gegen die Anwesenheit von L-Lysin im Assay. Eine 50%ige Inhibition wurde bei einer Konzentration von ca. 0,4 mM und eine 90%ige Inhibition bei ca. 0,1 mM festgestellt. Im Gegensatz dazu wurden die Mutanten AKIII-M2, -M3 und -M4 durch 15 mM L-Lysin überhaupt nicht inhibiert.
Das Wildtyp-AKIII-Protein wurde aus dem Überstand einer induzierten Kultur wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt. Kaninchen-Antikörper wurden gegen das gereinigte AKIII-Protein generiert.
In der Literatur wurden viele andere mikrobielle Expressionsvektoren beschrieben. Ein Fachmann könnte Gebrauch von irgendeinem von diesen zur Konstruktion von lysC-Expressionsvektoren machen. Diese lysC-Expressionsvektoren könnten dann über Transformation zur Bereitstellung eines Systems für die hochgradige Expression von AKIII in geeignete Mikroorganismen eingeführt werden.
ISOLIERUNG VON DHDPS-GENEN
Das dapA-Gen von E. coli (ecodapA) wurde zuvor kloniert, die Restriktionsendonuklease kartiert und sequenziert (Richaud et al. (1986) J. Bacteriol. 166: 297–300]. Das dapA-Gen wurde erfindungsgemäß auf einem Bakteriophagen-Lambda-Klon aus einer geordneten Bibliothek von 3400 überlappenden Segmenten von klonierter E. coli-DNA, die von Kohara, Akiyama und Isono [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508) konstruiert wurde, erhalten. Das ecodapA-Gen kodiert für ein DHDPS-Enzym, das empfindlich gegen die Lysin-Inhibition ist. Es ist jedoch um das ca. 20fache weniger empfindlich gegen die Inhibition durch Lysin als eine typische Pflanzen-DHDPS, wie z. B. Weizenkeim-DHDPS.
Das dapA-Gen von Corynebacterium (cordapA) wurde aus genomischer DNA aus dem ATCC-Stamm 13032 anhand der Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert. Die Nukleotidsequenz des dapA-Gens von Corynebacterium wurde veröffentlicht [Bonnassie et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6421]. Mithilfe der Sequenz war es möglich, Oligonukleotid-Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) zu konzipieren, welche die Amplifikation eines das Gen enthaltenden DNA-Fragments erlauben und gleichzeitig einzigartige Restriktionsendonukleaseorte am Startcodon und eben am Stoppcodon des Gens vorbei zur Förderung weiterer das Gen beteiligende Konstruktionen zufügen. Die näheren Einzelheiten zur Isolierung des cordapA-Gens werden in Beispiel 3 dargelegt. Das cordapA-Gen kodiert für ein DHDPS-Enzym, das gegen die Lysin-Inhibition unempfindlich ist.
Außer der Einführung eines Restriktionsendonukleaseortes am Translations-Startcodon änderten die PCR-Primer auch das zweite Codon des cordapA-Gens von der AGC-Kodierung für Serin zur GCT-Kodierung für Alanin. Mehrere klonierte DNA-Fragmente, die aktive, Lysin-unempfindliche DHDPS exprimierten, wurden isoliert, was darauf hindeutet, dass die Aminosäuresubstitution des zweiten Codons sich nicht auf die Enzymaktivität auswirkte.
Das PCR-generierte dapA-Gen von Corynebacterium wurde in den Phagemid-Vektor pGEM-9zf(–) von Promega subkloniert, und es wurde eine einsträngige DNA generiert und sequenziert (SEQ ID NO:6). Außer dem bereits erwähnten Unterschied im zweiten Codon passte die Sequenz, außer an zwei Positionen, den Nukleotiden 798 und 799, mit der veröffentlichten Sequenz zusammen. Bei der veröffentlichten Sequenz handelt es sich bei diesen um TC, während es sich bei dem in SEQ ID NO:6 gezeigten Gen um CT handelt. Diese Änderung führt zu einer Aminosäuresubstitution von Leucin für Serin. Der Grund für diesen Unterschied ist nicht bekannt. Der Unterschied hat anscheinend keine Wirkung auf die DHDPS-Enzymaktivität.
Die Isolierung der anderen Gene, die für DHDPS kodieren, wurde in der Literatur beschrieben. Zwei Beispiele stellen eine cDNA, die für DHDPS aus Weizen kodiert [Kaneko et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 17451–17455] und eine cDNA, die für DHDPS aus Mais kodiert [Frisch et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228: 287–293], dar. Diese Gene kodieren für Lysin-empfindliche DHDPS-Enzyme des Wildtyps. Negrutui et al. [(1984) Theor. Appl. Genet. 68: 11–20] erhielten jedoch zwei AEC-resistente Tabakmutanten, in denen die DHDPS-Aktivität weniger empfindlich gegen die Lysin-Inhibition war als das Wildtyp-Enzym. Diese Gene könnten gegebenenfalls unter Verwendung der bereits für die Isolierung der Weizen- oder Maisgene beschriebenen Verfahren oder als Alternative unter Verwendung der Weizen- oder Maisgene als heterologe Hybridisierungssonden isoliert werden.
Noch weitere Gene, die für DHDPS kodieren, könnten von einem Fachmann unter Verwendung von entweder des ecodapA-Gens, des cordapA-Gens oder von einem oder dem anderen der DHDPS-Gene von Pflanzen als DNA-Hybridisierungssonden isoliert werden. Als Alternative könnten andere für DHDPS kodierende Gene, durch funktionelle Komplementierung eines dapA-Mutanten von E. coli isoliert werden, wie dies zur Isolierung des cordapA-Gens [Yeh et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 212: 105–111] und des DHDPS-Gens in Mais durchgeführt wurde.
HOCHGRADIGE EXPRESSION VON ecodapA- UND cordapA-GENEN IN E. coli
Zum Erzielen einer hochgradigen Expression der ecodapA- und cordapA-Gene in E. coli, wurde ein bakterieller Expressionsvektor, welcher das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase-/T7-Promotorsystem einsetzt [Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 127–135], verwendet. Der Vektor und die dapA-Gene wurden wie nachstehend beschrieben zur Konstruktion von ecodapA- und cordapA-Expressionsvektoren modifiziert.
Für die hochgradige Expression wurde jeder der Expressionsvektoren in den E. coli-Stamm BL21(DE3) transformiert [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130]. Die Kulturen wurden gezüchtet, die Expression wurde induziert, die Zellen wurden gesammelt und die Extrakte wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Die Überstands- und Pelletfraktionen von Extrakten von nicht induzierten und induzierten Kulturen wurden mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und durch DHDPS-Ezymassays wie in Beispiel 4 beschrieben analysiert. Das wichtigste Protein, das durch die Coomassieblau-Färbung in den Überstands- und Pelletfraktionen von beiden induzierten Kulturen sichtbar gemacht wurde, wies ein Molekulargewicht von 32–34 kD, die erwartete Größe für DHDPS, auf. Selbst in den nicht induzierten Kulturen stellte dieses Protein das prominenteste produzierte Protein dar.
In der mit dem ecodapA-Gen induzierten Kultur fanden sich Ca. 80% des DHDPS-Proteins im Überstand und die DHDPS stellte 10–20% des Gesamtproteins im Extrakt dar. In der mit dem cordapA-Gen induzierten Kultur befanden sich mehr als 50% des DHDPS-Proteins in der Pelletfraktion. Die Pelletfraktionen stellten in beiden Fällen zu 90–95% reine DHDPS dar, wobei kein anderes Einzelprotein in signifikanten Mengen vorlag. Folglich waren diese Fraktionen zum Gebrauch bei der Generierung von Kaninchen-Antikörpern rein genug.
Die spezifische Aktivität der E. coli-DHDPS in der Überstandsfraktion von induzierten Extrakten betrug ca. 50 OD₅₄₀-Einheiten pro Milligramm Protein. Im Assay war die DHDPS von E. coli empfindlich gegen die Anwesenheit von L-Lysin. Bei einer Konzentration von ca. 0,5 mM wurde eine 50%ige Inhibition gefunden. Für DHDPS von Corynebacterium wurde die Enzymaktivität in der Überstandsfraktion von nicht induzierten Extrakten anstelle von induzierten Extrakten gemessen. Die Enzymaktivität betrug ca. 4 OD₅₃₀-Einheiten pro Minute pro Milligramm Protein. Im Gegensatz zur DHDPS von E. coli wurde die DHDPS von Corynebacterium durch L-Lysin, selbst bei einer Konzentration von 70 mM, überhaupt nicht inhibiert.
In der Literatur wurden viele andere mikrobielle Expressionsvektoren beschrieben. Ein Fachmann könnte gegebenenfalls Gebrauch von jedweden von diesen zur Konstruktion von ecodapA- oder cordapA-Expressionsvektoren machen. Diese Expressionsvektoren könnten dann über die Transformation in geeignete Mikroorganismen zur Bereitstellung eines Systems für die hochgradige Expression von DHDPS eingeführt werden.
EXKRETION VON AMINOSÄUREN DURCH HOHE DHPDS- UND/ODER AKIII-SPIEGEL EXPRIMIERENDE E. coli
Die Expressionskassetten von E. coli wurden in Expressionsvektoren insertiert und dann in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130] zur Induktion von E. coli, zur Herstellung und Exkretion von Aminosäuren transformiert. Einzelheiten der verwendeten Verfahren und die Ergebnisse werden in Beispiel 5 dargelegt.
Andere dem Fachmann bekannte mikrobielle Expressionsvektoren könnten zur Herstellung und Kombination von Expressionskassetten für die lysC- und dapA-Gene verwendet werden. Diese Expressionsvektoren könnten dann zur Bereitstellung alternativer Systeme zur Herstellung und Exkretion von Lysin, Threonin und Methionin über die Transformation in geeignete Mikroorganismen eingeführt werden.
KONSTRUKTION CHIMÄRER GENE ZUR EXPRESSION VON lysC- UND dapA-KODIERENDEN REGIONEN IN PFLANZEN
Die Expression von Fremdgenen in Pflanzen ist gut etabliert [De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277–291). Richtige Expressionsspiegel von lysC- und dapA-mRNA können die Verwendung verschiedener chimärer Gene, die sich verschiedene Promotoren zu Nutze machen, erforderlich machen. Solche chimären Gene können entweder zusammen in einem einzelnen Expressionsvektor oder sequenziell unter Verwendung von mehr als einem Vektor in Wirtspflanzen transferiert werden. Eine bevorzugte Klasse heterologer Wirte für die Expression der Kodiersequenz von lysC- und dapA-Genen stellen eukaryote Wirte, insbesondere die Zellen höherer Pflanzen dar. Insbesondere bevorzugt unter den höheren Pflanzen und den sich von ihnen herleitenden Samen sind die Sojabohne, Rapssamen (Brassica napus, B. campestris), Sonnenblume (Helianthus annus), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Mais, Tabak (Nicotiana tobacum), Alfalfa (Medicago sativa), Weizen (Triticum sp.), Gerste (Hordeum vulgare), Haferflocken (Avena sativa L), Sorghum (Sorghum bicolor), Reis (Oryza sativa) und Futtergräser. Die Expression in Pflanzen verwendet Regulationssequenzen, die in solchen Pflanzen funktionell sind.
Die Herkunft des zum Antreiben der Expression der Kodiersequenz gewählten Promotors ist nicht kritisch, so lange er über eine ausreichende transkriptionale Aktivität zur erfindungsgemäßen Durchführung durch Expression einer translatierbaren mRNA für lysC- oder dapA-Gene in das gewünschte Wirtsgewebe verfugt. Bevorzugte Promotoren zur Expression in allen Pflanzenorganen und besonders zur Expression in Blättern, schließen die ein, die die 19S- und 35S-Transkripte im Blumenkohl-Mosaikvirus [Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812; Hull et al. (1987) Virology 86: 482–493], in kleinen Untereinheiten von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase [Morelli et al. (1985) Nature 315: 200; Broglie et al. (1984) Science 224: 838; Hererra-Estrella et al. (1984) Nature 310: 115; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671; Faciotti et al. (1985) Bio/Technology 3: 241], im Mais-Zein-Protein [Matzke et al. (1984) EMBO J. 3: 1525] und im Chlorophyll-a/b-Bindingsprotein [Lampa et al. (1986) Nature 316: 750–752] lenken.
In Abhängigkeit von der Applikation könnte die Auswahl von Promotoren wünschenswert sein, die zur Expression in einem oder mehr Organ(en) der Pflanze spezifisch sind. Beispiele schließen folgende ein: Licht-induzierbare Promotoren der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase, wenn die Expression in photosynthetischen Organen erwünscht ist, oder Promotoren, die spezifisch in Samen aktiv sind.
Bevorzugte Promotoren stellen die dar, die die Expression des Proteins spezifisch in Samen zulassen. Dies könnte besonders nützlich sein, da Samen die primäre Quelle für pflanzliche Aminosäuren darstellen und auch, da die samenspezifische Expression jedwede potenzielle schädliche Wirkung in Nichtsamenorganen verhindert. Zu Beispielen samenspezifischer Promotoren gehören die Promotoren von Samenspeicherproteinen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Samenspeicherproteine sind strikt reguliert, indem sie fast ausschließlich in Samen auf eine hoch organspezifische und stufenspezifische Weise exprimiert werden [Higgins et al. (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35: 191–221; Goldberg et al. (1989) Cell 56: 149–160; Thompson et al. (1989) BioEssays 10: 108–113]. Darüber hinaus können verschiedene Samenspeicherproteine auf verschiedenen Stufen der Samenentwicklung exprimiert werden.
Es gibt derzeit zahlreiche Beispiele für die samenspezifische Expression von Samenspeicherproteingenen in transgenen dikotylen Pflanzen. Diese schließen Gene aus dikotylen Pflanzen für folgende ein: Bohnen-β-Phaseolin [Sengupta-Goplalan et al. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 3320–3324; Hoffman et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 717–729], Bohnen-Lektin [Voelker et al. (1987) EMBO J. 6: 3571–3577], Sojabohnen-Lektin [Okamuro et al. (1986) Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 8240–8244], Sojabohnen-Kursitz-Trypsin-Inhibitor (Perez-Grau et al. (1989) Plant Cell 1: 1095–1109], Sojabohnen-β-Conglycinin [Beachy et al. (1985) EMBO J. 4: 3047–3053; Barker et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 458–462; Chen et al. (1988) EMBO J. 7: 297–302; Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112–122; Naito et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 109–123], Erbsen-Vicilin [Higgins et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 683–695], Erbsen-Convicilin (Newbigin et al. (1990) Planta 180: 461], Erbsen-Legumin [Shirsat et al. (1989) Mol. Gen. Genetics 215: 326]; Rapssamen-Napin [Radke et al. (1988) Theor. Appl. Genet. 75: 685–694] ebenso wie Gene aus monokotylen Pflanzen, wie zum Beispiel Mais-Zein (15 kD) [Hoffman et al. (1987) EMBO J. 6: 3213–3221; Schernthaner et al. (1988) EMBO J. 7: 1249–1253; Williamson et al. (1988) Plant Physiol. 88: 1002–1007), Gersten-β-Hordein [Marris et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10: 359–366] und Weizen-Glutenin [Colot et al. (1987) EMBO J. 6: 3559–3564]. Darüber hinaus erhalten Promotoren von samenspezifischen Genen, die an heterologe Kodiersequenzen in chimären Genkonstrukten operativ verknüpft sind, auch ihre zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster in transgenen Pflanzen aufrecht. Zu solchen Beispielen gehören der Genpromotor des 2S-Samenspeicherproteins von Arabidopsis thaliana zur Expression der Enkephalin-Peptide in Arabidopsis- und B. napus-Samen [Vandekerckhove et al. (1989) Bio/Technology 7: 929–932], Promotoren des Bohnen-Lektins und des Bohnen-β-Phaseolins zur Expression von Luciferase (Riggs et al. (1989) Plant Sci. 63: 47–57] und Promotoren des Weizen-Glutenins zur Expression von Chloramphenicol-Acetyltransferase [Colot et al. (1987) EMBO J. 6: 3559–3564].
Von besonderem Nutzen bei der Expression des erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragments werden die heterologen Promotoren aus mehreren ausgiebig charakterisierten Sojabohnen-Samenspeicherproteingenen, wie zum Beispiel denjenigen für den Kunitz-Trypsininhibitor [Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1: 1079–1093; Perez-Grau et al. (1989) Plant Cell 1: 1095–1109], Glycinin (Nielson et al. (1989) Plant Cell 1: 313–328] und β-Conglycinin [Harada et al. (1989) Plant Cell 1: 415–425] sein. Promotoren von Genen für α'- und β-Unterheiten des β-Conglycinin-Speicherproteins der Sojabohne sind besonders nützlich bei der Expression von lysC- und dapA-mRNAs in den Kotyledonen in den mittleren bis späten Stadien der Samenentwicklung von Sojabohnen [Beachy et al. (1985) EMBO J. 4: 3047–3053; Barker et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 458–462; Chen et al. (1988) EMBO J. 7: 297–302; Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112–122; Naito et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 109–123] in transgenen Pflanzen, da a) eine sehr geringe Positionswirkung auf ihre Expression in transgenen Samen vorliegt, und b) die beiden Promotoren eine unterschiedliche temporale Regulation aufweisen: der Promotor für das Gen der α'-Untereinheit wird einige Tage vor dem für das Gen der β-Untereinheit exprimiert.
Von besonderem Nutzen bei der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente werden auch die heterologen Promotoren aus mehreren ausgiebig charakterisierten Maissamenspeicherproteingenen, wie zum Beispiel endodermspezifische Promotoren aus dem 10-kD-Zein [Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359–370], dem 27-kD-Zein [Prat et al. (1987) Gene 52: 51–49; Gallardo et al. (1988) Plant Sci. 54: 211–281] und dem 19-kD-Zein [Marks et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 16451–16459) sein. Es wurde mitgeteilt, dass die relativen transkriptionalen Aktivitäten dieser Promotoren in Mais [Kodrzyck et al. (1989) Plant Cell 1: 105–114] eine Basis für die Wahl eines Promotors zur Verwendung in chimären Genkonstrukten für Mais bereitstellen. Für die Expression in Maisembryos kann der stark embryospezifische Promotor aus dem GLB1-Gen [Kriz (1989) Biochemical Genetics 27: 239–251, Wallace et al. (1991) Plant Physiol. 95: 973–975] verwendet werden.
Es besteht die Vorstellung, dass die Einführung von Enhancers oder Enhancer-ähnlichen Elementen in andere Promotor-Konstrukte auch gesteigerte Grade einer primären Transkription für lysC- and dapA-Gene zur Erfüllung der erfinderischen Aufgabe bereitstellen. Zu diesen würden virale Enhancer gehören, wie zum Beispiel die im 35S-Promotor gefundenen [Odell et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10: 263–272], Enhancer aus den Opin-Genen [Fromm et al. (1989) Plant Cell 1: 977–984] oder Enhancer aus jedweder anderen Quelle, die zur gesteigerten Transkription führen, wenn sie in einen Promotor gebracht werden, der operativ mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment verknüpft ist.
Von besonderer Bedeutung ist das aus dem Gen für die α'-Untereinheit von β-Conglycinin isolierte DNA-Sequenzelement, das einem konstitutiven Promotor ein 40faches samenspezifisches Enhancement verleihen kann [Chen et al. (1988) EMBO J. 7: 297–302; Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112–122]. Ein Fachmann kann dieses Element ohne weiteres isolieren und es in die Promotor-Region von jedwedem Gen insertieren, um eine samenspezifische verstärkte Expression mit dem Promotor in transgenen Pflanzen zu erhalten. Die Insertion eines derartigen Elements in jedwedes samenspezifische Gen, das zu anderen Zeitpunkten als das β-Conglycinin-Gen exprimiert wird, führt in transgenen Pflanzen über eine längere Zeitdauer während der Samenentwicklung zur Expression.
Jedwede 3' nicht kodierende Region, die zur Bereitstellung eines Polyadenylierungssignals fähig ist, und andere Regulationssequenzen, die zur ordnungsgemäßen Expression der lysC- oder dapA-Kodierungsregionen gegebenenfalls erforderlich sein könnten, können zum Erlangen der erfindungsgemäßen Aufgabe eingesetzt werden. Dies würde Folgendes einschließen: das 3'-Ende von jedwedem Speicherprotein, wie zum Beispiel dem 3'-Ende des Gens von Bohnen-Phaseolin, das 3'-Ende des Gens von Sojabohnen-β-Conglycinin, das 3'-Ende von viralen Genen, wie zum Beispiel das 3'-Ende der 35S- oder der 19S-Blumenkohl-Mosaik-Virus-Transkripte, das 3'-Ende von den Genen für die Opin-Synthese, die 3'-Enden von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase oder das Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein oder Sequenzen vom 3'-Ende aus jedweder Quelle dergestalt, dass die eingesetzte Sequenz die notwendigen Regulationsinformationen in ihrer Nukleinsäuresequenz bereitstellt, um zu einer ordnungsgemäßen Expression der Kombination von der Promotor-/lysC-Kodierungsregion zu führen, mit der sie operativ verknüpft ist. Es gibt im Stand der Technik zahlreiche Beispiele, die die Nützlichkeit verschiedener 3' nicht kodierender Regionen (zum Beispiel siehe Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1: 671–680] lehrt.
DNA-Sequenzen, die für intrazelluläre Lokalisierungssequenzen kodieren, können der lysC- und dapA-Kodiersequenz zur ordnungsgemäßen Expression der Proteine zur Erfüllung der erfindungsgemäßen Aufgabe gegebenenfalls zugefügt werden. Es ist bekannt, dass biosynthetische Enzyme von Pflanzenaminosäuren in den Chloroplasten lokalisiert sind und deshalb mit einem Chloroplasten-Targetingsignal synthetisiert werden. Bakterienproteine, wie zum Beispiel DHDPS und AKIII, verfügen über kein solches Signal. Eine Chloroplast-Transitsequenz könnte deshalb mit den dapA- und lysC-Kodiersequenzen fusioniert werden. Bevorzugte Chloroplast-Transitsequenzen stellen diejenigen der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase, z. B. von der Sojabohne [Berry-Lowe et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 483–498], zur Verwendung in dikotylen Pflanzen und von Mais [Lebrun et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 4360] zur Verwendung in monokotylen Pflanzen dar.
EINFÜHRUNG VON CHIMÄREN lysC- UND dapA-GENEN IN PFLANZEN
Es stehen dem Fachmann verschiedene Verfahren zur Einführung einer DNA-Sequenz (d. h. zur Transformation) in eukaryote Zellen höherer Pflanzen zur Verfügung (siehe EPO-Veröffentlichungen 0295959 A2 und 0138341 A1 ). Solche Verfahren schließen die ein, die auf den Ti- und Ri-Plasmiden von Agrobacterium spp. basierenden Transformationsvektoren basieren. Die Verwendung des binären Typs dieser Vektoren ist besonders bevorzugt. Sich von Ti herleitende Vektoren transformieren viele verschiedene höhere Pflanzen, einschließlich monokotyler und dikotyler Pflanzen, wie zum Beispiel Sojabohnen, Baumwolle und Raps [Pacciotti et al. (1985) Bio/Technology 3: 241; Byrne et al. (1987) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 8:3; Sukhapinda et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 209–216; Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 178; Potrykus (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183].
Zur Einführung in Pflanzen können die erfindungsgemäßen chimären Gene in die in Beispielen 7–12 und 14–16 beschriebenen binären Vektoren insertiert werden. Die Vektoren stellen einen Teil eines binären Ti-Plasmidvektorsystems [Bevan, (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711–8720] von Agrobacterium tumefaciens dar.
Andere Transformationsverfahren stehen dem Fachmann zur Verfügung, wie zum Beispiel die direkte Aufnahme von Fremd-DNA-Konstrukten [siehe EPO-Veröffentlichung 0295959 A2 ), Elektroporationsverfahren [siehe Fromm et al. (1986) Nature (London) 319: 791] oder das Beschießen mit den Nukleinsäurekonstrukten beschichteten Metallpartikeln bei hoher Geschwindigkeit [siehe Kline et al. (1987) Nature (London) 327: 70, und siehe US-Patent Nr. 4945050 ). Sobald sie transformiert sind, können die Zellen vom Fachmann regeneriert werden.
Von besonderer Relevanz sind die vor kurzem beschriebenen Verfahren zur Transformation von Fremdgenen in gewerblich wichtige Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Rapssamen [siehe De Block et al. (1989) Plant Physiol. 91: 694–701], Sonnenblumen [Everett et al. (1987) Bio/Technology 5: 1201], Sojabohnen [McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923; Hinchee et al. (1988) Bio/Technology 6: 915; Chee et al. (1989) Plant Physiol. 91: 1212–1218; Christou et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7500–7504; EPO-Veröffentlichung 0301749 A2 ] und Mais [Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603–618; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833–839].
Zur Einführung in Pflanzen durch Beschießen bei hoher Geschwindigkeit können die erfindungsgemäßen chimären Gene in wie in Beispiel 6 beschriebene geeignete Vektoren insertiert werden. Transformierte Pflanzen können wie in Beispielen 17–19 beschrieben erhalten werden.
EXPRESSION VON CHIMÄREN lysC- UND dapA-GENEN IN PFLANZEN
Zur Bestimmung der Expression chimärer Gene in Blättern oder Samen der transformierten Pflanzen können die AKIII- oder DHDPS-Proteine nachgewiesen und enzymatisch und/oder immunologisch anhand von dem Fachmann bekannten Verfahren quantifiziert werden. Auf diese Weise lassen sich Linien, die hohe Proteinspiegel exprimieren, leicht identifizieren.
Zur Messung der Zusammensetzung freier Aminosäuren von Blättern können die freien Aminosäuren mithilfe verschiedener Verfahren, einschließlich der in Beispiel 7 beschriebenen extrahiert werden. Zur Messung der Zusammensetzung freier Aminosäuren oder Gesamtaminosäuren von Samen können Extrakte mithilfe verschiedener Verfahren, einschließlich der in Beispiel 8 beschriebenen hergestellt werden.
Es lag keine signifikante Wirkung der Expression von AKIII oder AKIII-M4 (mit einem Chloroplasten-Targetingsignal) auf die Spiegel von freiem Lysin oder Threonin (oder jedweder anderen Aminosäure) in den Blättern vor (siehe Tabelle 2 in Beispiel 7). Da AKIII-M-1 gegen die Feedback-Inhibition durch jedwedes der Endprodukte des Wegs unempfindlich ist, deutet dies daraufhin, dass andere Schritte des Biosynthesewegs in Blättern kontrolliert werden müssen.
Dagegen führte die Expression von AKIII oder AKIII-M4 (mit einem Chloroplasten-Targetingsignal) in den Samen zu 2- bis 4fachen bzw. 4- bis 23fachen Steigerungen des Spiegels von freiem Threonin in den Samen im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen und in einigen Fällen zu 2- bis 3fachen Steigerungen des Spiegels von freiem Lysin (Tabelle 3, Beispiel 8). Es bestand eine gute Korrelation zwischen Transformanten, die höhere Spiegel von AKIII- oder AKIII-M4-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel von freiem Threonin aufweisen, dies traf jedoch nicht auf Lysin zu. Die mit dem AKIII-Protein erreichten relativ kleinen Steigerungen von freiem Threonin oder Lysin waren nicht ausreichend, um im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen nachweisbare Steigerungen der Spiegel des Gesamtthreonins oder -lysins in den Samen zu ergeben. Die größeren Steigerungen von freiem Threonin, die über die Expression des AKIII-M4-Proteins erreicht wurden, waren im Vergleich zu Samen aus nicht transformierten Pflanzen, zum Erhalt nachweisbarer Steigerungen der Spiegel des Gesamtthreonins in den Samen ausreichend. Es wurden 16 bis 25%ige Steigerungen des Gesamthreoningehalts der Samen beobachtet. Die erhöhtes Gesamtthreonin zeigenden Linien waren die gleichen wie die, die die höchste Steigerung des freien Threonins und eine hohe Expression des AKIII-M4-Proteins aufwiesen.
Die vorstehenden Lehren zeigen, dass die Aminosäure-Biosynthese in Samen stattfindet und durch die Expression von Fremdgenen, die für biosynthetische Aminosäure-Enzyme kodieren, moduliert werden kann. Sie zeigen überdies auch, dass sich die Kontrolle des Biosynthesewgs einer Aminosäure von einem Pflanzenorgan zum anderen, z. B. von Samen und Blättern, deutlich unterscheiden kann. Die Bedeutung dieser Beobachtung wird nach der Erwägung der verschiedenen Wirkungen der Expression einer nachstehend beschriebenen fremden DHDPS in Blättern und Samen hervorgehoben. Es kann daraus gefolgert werden, dass die Threonin-Biosynthese in Semen primär über die Endprodukt-Inhibition von AK kontrolliert wird. Deshalb kann die Threonin-Akkumulation in den Samen von Pflanzen durch Expression eines über die Transformation eingeführten Gens gesteigert werden, das für AK kodiert, die gegen die Lysininhibition unempfindlich ist und die im Chlaroplasten lokalisiert ist.
Die vorstehenden Lehren weisen auch daraufhin, dass transformierte Pflanzen, die höhere Spiegel des eingeführten Enzyms in Semen exprimieren, höhere Spiegel von freiem Threonin in Semen akkumulieren. Die Lehren weisen überdies darauf hin, dass transformierte Pflanzen, die eine Lysinunempfindliche AK in Semen exprimieren, höhere Spiegel von freiem Threonin in Samen akkumulieren als transformierte Pflanzen, die ähnliche Spiegel einer Lysin-empfindlichen AK exprimieren. Zur Erlangung gewerblich wertvoller Steigerungen des freien Threonins ist eine vollkommen Lysin-unempfindliche AK bevorzugt.
Diese Lehren zeigen, dass der Spiegel des freien Lysins in Samen die Akkumulation von einer anderen sich von Aspartat herleitenden Aminosäure, Threonin, durch die Endprodukt-Inhibition von AK kontrolliert. Zur Akkumulation hoher Konzentrationen von freiem Lysin selbst ist es notwendig, die Lysin-Inhibition von AK über die Expression einer Lysin-unempfindlichen AK zu umgehen.
Die Expression von aktivem DHDPS-Enzym von E. coli wurde sowohl in jungen als auch maturen Blättern der transformierten Tabakpflanzen (Tabelle 4, Beispiel 9) erreicht. Hohe Spiegel von freiem Lysin, die um des 50- bis 100fache höher als in normalen Tabakpflanzen sind, akkumulierten sich in den jungen Blättern der Pflanzen, die das Enzym mit einem Chloroplasten-Targetingsignal, aber nicht ohne ein derartiges Targetingsignal exprimieren. Eine viel kleinere Akkumulation von freiem Lysin (2- bis 8fach) wurde in den größeren Blättern gesehen. Experimente, die des Lysin im Phloem messen, deuten darauf hin, dass Lysin aus den großen Blättern exportiert wird. Dieses exportierte Lysin kann zur Akkumulation von Lysin in den kleinen wachsenden Blättern beitragen, von denen bekannt ist, dass sie Nährstoffe aufnehmen anstelle sie zu exportieren. Es wurde keine Wirkung auf die Spiegel des freien Lysins in den Samen dieser Pflanzen beobachtet, obwohl das DHDPS-Enzym von E. coli sowohl in den Samen als auch in den Blättern exprimiert wurde.
Die hochgradige samenspezifische Expression des DHDPS-Enzyms von E. coli, entweder mit oder ohne ein Chloroplasten-Targetingsignal, wies keine Wirkung auf die Zusammensetzung des Gesamt- oder freien Lysins oder Threonins (oder jedweder anderen Aminosäure) der Samen in jedweder transformierten Linie (Tabelle 5, Beispiel 10) auf. Diese Ergebnisse weisen nach, dass die Expression in Samen von einem DHDPS-Enzym, das weniger empfindlich gegen Lysin als das Pflanzenenzym ist, nicht ausreichend ist, um zu einer gesteigerten Produktion oder Akkumulation von freiem Lysin zu führen.
Diese Lehren von Transformanten, die das DHDPS-Enzym von E. coli exprimieren, deuten darauf hin, dass die Lysin-Biosynthese in Blättern primär über die Endprodukt-Inhibition von DHDPS kontrolliert wird, während in Samen mindestens ein zusätzlicher Kontrollpunkt in der Bahn vorhanden sein muss. Die Lehren von Transformanten, die die AKIII- und AKIII-M4-Enzyme von E. coli exprmieren, deuten darauf hin, dass der Spiegel von freiem Lysin in Samen die Akkumulation von allen sich von Aspartat herleitenden Aminosäuren durch die Endprodukt-Inhibition von AK kontrollieren. AK stellt folglich einen zusätzlichen Kontrollpunkt dar.
Zum Erlangen einer simultanen, hochgradigen Expression sowohl von DHDPS als auch AKIII-M4 von E. coli in Blättern und Samen, konnten Pflanzen, die jedes der Gene exprmieren, gekreuzt und Hybride, die beide exprimieren, ausgewählt werden.
Ein anderes Verfahren würde darin bestehen, Vektoren zu konstruieren, die beide Gene auf dem gleichen DNA-Fragment enthalten und die verknüpften Gene aber die Transformation in Pflanzen einführen. Dies ist bevorzugt, weil die Gene während der sich anschließenden Pflanzenzüchtungsbemühungen durchweg verknüpft bleiben worden. Repräsentative Vektoren, die beide Gene auf dem gleichen DNA-Fragment tragen, sind in den Beispielen 11, 12, 16 und 18 beschrieben.
Tabakpflanzen, die mit einem Vektor transformiert sind, der sowohl DHDPS- als auch AKIII-M4-Gene von E. coli tragt, die mit dem 35S-Promotor verknüpft sind, sind in Beispiel 11 beschrieben. In Transformanten, die wenig oder kein AKIII-M4 exprmieren, bestimmt die Höhe der Expression von E. coli-DHDPS den Grad der Lysin-Akkumulation in Blättern (Beispiel 11, Tabelle 6). In Transformanten, die sowohl AKIII-M4 und E. coli-DHDPS exprmieren, spielt jedoch bei der Kontrolle des Grades der Lysin-Akkumulation die Höhe der Expression von jedem Protein eine Rolle. Transformierte Linien, die DHDPS in vergleichbaren Spiegeln exprimieren, akkumulieren mehr Lysin, wenn auch AKIII-M4 exprimiert wird (Tabelle 6, vergleiche Linien 564-18A, 564-56A, 564-36E, 564-55B, and 564-47A). Folglich steigert die Expression einer Lysin-unempfindlichen AK die Lysin-Akkumulation in Blättern, wenn es zusammen mit einem DHDPS-Enzym exprimiert wird, das um das 20fache weniger empfindlich gegen Lysin ist als das endogene Pflanzenenzym.
Diese Ergebnisse von den Blättern zusammengenommen mit den Ergebnissen von den Samen, die sich von der Expression von E. coli-AKIII-M4 und E. coli-DHDPS getrennt in Samen herleiten, deuten darauf hin, dass die simultane Expression von sowohl E. coli-AKIII-M4 als auch E. coli-DHDPS in Samen zu einer gesteigerten Akkumulation sowohl von freiem Lysin als auch zu einer gesteigerten Akkumulation von freiem Threonin führen würde. Tabakpflanzen, die mit einem Vektor transformiert sind, der sowohl DHDPS- als auch AKIII-M4-Gene von E. coli trägt, die mit dem Phaseolin-Promoter verknüpft sind, sind in Beispiel 12 beschrieben. In diesen Pflanzen liegt eine gesteigerte Akkumulation von freiem Lysin und freiem Threonin vor. Die gesteigerten Spiegel von freiem Threonin lagen um das 4fache über denen normaler Samen, anstelle der 20fachen Steigerung, die in Samen gesehen wird, die AKIII-M4 allein exprimieren. Die Reduktion der Akkumulation von freiem Threonin deutet darauf hin, dass Intermediate in der Bahn den Lysinzweig des Biosynthesewegs hinunter umgeleitet werden. Der gesteigerte Spiegel von freiem Lysin lag um das 2fache über dem normaler Samen (oder Samen, die E. coli-DHDPS allein exprimieren). Die Steigerung von Lysin in Samen entspricht jedoch nicht der 100fachen Steigerung, die in Blättern gesehen wird.
Das DHDPS-Enzym von E. coli ist weniger empfindlich gegen die Lysin-Inhibition als Pflanzen-DHDPS, wird aber noch durch Lysin inhibiert. Die vorstehenden Lehren über die AK-Proteine deuten darauf bin, dass die Expression eines vollkommen Lysin-unempfindlichen Enzyms zu einer viel größeren Akkumulation des Threonin-Endprodukts im Aspartatweg als die Expression eines Enzyms führen kann, das obwohl es weniger empfindlich als das Pflanzenenzym ist, noch durch Lysin inhibiert wird. Deshalb wurden, wie in Beispielen 15 und 19 beschrieben, Vektoren, die sowohl Corynebacterium-DHDPS- als auch -AKIII-M4-Gene tragen, die mit den samenspezifischen Promotoren verknüpft sind, konstruiert. Tabakpflanzen, die mit Vektoren transformiert sind, die sowohl DHDPS- als auch AKIII-M-Gene von Corynebacterium tragen, die mit samenspezifischen Promotoren verknüpft sind, werden in Beispiel 15 beschrieben. Wie in Tabelle 9 ersichtlich ist, zeigen diese Pflanzen keine größere Akkumulation von freiem Lysin in Samen als zuvor beschriebene Pflanzen, die das DHDPS-Enzym von E. coli zusammen mit dem Lysin-unempfindlichen AK exprimieren. Rückblickend kann dieses Ergebnis durch die Tatsache erklärt werden, dass die Lysin-Akkumulation in Samen niemals eine Konzentration erreichte, die zur Inhibition der E. coli-DHDPS hoch genug war, folglich wies der Austausch dieses Enzyms durch ein Lysin-unempfindliches Corynebacterium-DHDPS keine Wirkung auf.
In transformierten Linien, die hohe Spiegel von E. coli-AKIII-M4- und E. coli-DHDPS oder Corynebacterium-DHDPS exprimieren, war der Nachweis erheblicher Mengen von α-Aminoadipinsäure möglich. Es besteht die Annahme, dass diese Verbindung ein Intermediat im Katabolismus von Lysin in Zerealiensamen darstellt, in der Regel aber aufgrund seiner geringen Akkumulationsmenge nur über radioaktive Tracer-Experimente nachgewiesen wird. Die Entdeckung von hohen Spiegeln dieses Intermediats, die mit den Spiegeln von freien Aminosäuren vergleichbar sind, deutet darauf hin, dass in den Samen dieser transformierten Linien eine große Lysinmenge produziert wird und in den katabolischen Weg eintritt. Der Aufbau der α-Aminoadipinsäure wurde in Transformanten, die nur E. coli-DHDPS oder nur -AKIII-M4 in Samen exprimieren, nicht beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression beider Enzyme gleichzeitig notwendig ist, um hohe Spiegel von freiem Lysin in Samen zu produzieren. Zur Akkumulation hoher Spiegel von freiem Lysin kann es auch zur Verhinderung des Lysin-Katabolismus notwendig sein. Als Alternative könnte es gegebenenfalls zur Umwandlung der produzierten hohen Lysin-Spiegel in eine Form, die gegen Abbau unempfindlich ist, z. B. durch Inkorporation in ein Di-, Tri- oder Oligopeptid, oder in ein lysinreiches Speicherprotein, erwünscht sein.
ISOLIERUNG EINES LYSIN-KETOGLUTARAT-REDUKTASE-GENS IN PFLANZEN
Es liegen bisher wenig Informationen über den Lysin-Katabolismus in Pflanzen vor. Verfügbare Hinweise geben zu erkennen, dass Lysin über den Saccharopinweg katabolisiert wird. Der erste enzymatische Hinweis auf das Bestehen dieses Wegs stellte der Nachweis der Aktivität der Lysin-Ketoglutarat-Reduktase (LKR) im immaturen Endosperm von sich entwickelnden Maissamen dar (Arruda et al. (1982) Plant Physiol. 69: 988–989]. LKR katalysiert den ersten Schritt im Lysin-Katabolismus, die Kondensation von L-Lysin mit α-Ketoglutarat zu Saccharopin unter Verwendung von NADPH als einen Cofaktor. Die LKR-Aktivität nimmt ab dem Einsetzen der Entwicklung des Endosperms scharf zu, erreicht ca. 20 Tage nach der Bestäubung einen Peak und nimmt danach ab [Arruda et al. (1983) Phytochemistry 22: 2687–2689]. Zur Verhinderung des Katabolismus von Lysin wäre die Reduktion oder Elimination der LKR-Expression oder -Aktivität wünschenswert. Dies könnte durch Klonieren des LKR-Gens, Herstellen eines chimären Gens zur Expression einer Antisense-RNA ( Eur. Patent-Anmeldung Nr. 84112647.7 ) für LKR und Einführen des chimären Gens über die Transformation in Pflanzen geschehen.
Zum Klonieren des Mais-LKR-Gens wurde RNA 19 Tage nach der Bestäubung aus sich entwickelnden Samen isoliert. Diese RNA wurde an die Fa. Clontech Laboratories, Inc., (Palo Alto, CA) zur kundenspezifischen Synthese einer cDNA-Bibliothek im Vektor Lambda-Zap II gesandt. Die Umwandlung der Lambda-Zap II-Bibliothek in eine Phagemid-Bibliothek und dann in eine Plasmid-Bibliothek wurde unter Befolgung des von Clontech bereitgestellten Protokolls erreicht. Sobald sie in eine Plasmid-Bibliothek umgewandelt wurden, tragen die erhaltenen Ampicillin-resistenten Klone das cDNA-Insert im Vektor pBluescript SK(–). Die Expression der cDNA untersteht der Kontrolle des lacZ-Promotors auf dem Vektor.
Zur Auswahl von das LKR-Gen tragenden Klonen wurde ein speziell konzipierter E. coli-Wirt, DE126, wie in Beispiel 20 beschrieben, konstruiert. DE126 weist den Gentyp F'16/malE52::Tn10, arg, ilvA296, thrA1101, metL100, lysC⁺, λ^–, rpsL9, malT1, xyl-7, mtl-2, thi-1?, supE44? auf. Sein Wachstum wird durch 20 μg/ml L-Lysin in einem synthetischen Medium inhibiert. Es wird erwartet, dass die Expression von LKR in DE126 die Wachstumsinhibition durch Reduktion der Lysinkonzentration umkehrt. Die Verwendung von DE126 bei der Auswahl von Klonen aus der Mais-cDNA-Bibliothek führt zum in Beispiel 20 beschriebenen Lysin-resistenten Wachstum.
Die auf diese Weise erhaltene Mais-LKR-cDNA kann als eine DNA-Hybridisierungssonde zur Identifizierung und Isolierung von LKR-Genen aus anderen Pflanzenspezies verwendet werden. Ein zur Expression von Antisense-RNA für LKR konzipiertes chimäres Gen kann durch Verknüpfung des LKR-Gens in reverser Orientierung zu jedweder der vorstehend beschriebenen Pflanzenpromotor-Sequenzen konstruiert werden. Bevorzugte Promotoren wären samenspezifische Promotoren. Für Mais würde ein starker Endosperm-spezifischer Promoter, z. B. der 10-kD- oder 27-kD-Zein-Promotor, bevorzugt.
Zum Erhalt von Pflanzen, die ein chimäres Gen für Antisense-LKR exprimieren ebenso wie Gene, die für Lysin-unempflindliche AK und DHDPS kodieren, könnte das Antisense-LKR-Gen mit Genen verknüpft werden, die für Lysin-unempfindliche AK und DHDPS kodieren und alle drei Gene könnten über Transformation in Pflanzen eingeführt werden. Als Alternative könnten die chimären Gene für Antisense-LKR in zuvor transformierte Pflanzen transformiert werden, die Lysin-unempfindliche AK und DHDPS exprimieren oder das Antisense-LKR-Gen könnte in normale Pflanzen eingeführt werden und die erhaltenen Transformanten könnten mit Pflanzen gekreuzt werden, die Lysin-unempfindliche AK und DHDPS exprimieren.
VERWENDUNG DES CHIMÄREN cts/lysC-M4-GENS ALS EIN SELEKTIERBARER MARKER FÜR DIE PFLANZENTRANSFORMATION
Das Wachstum von Zellkulturen und Keimpflanzen von vielen Pflanzen wird durch hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin inhibiert. Das Wachstum wird durch Zufügen von Methionin (oder Homoserin, das in vivo in Methionin umgewandelt wird) wiederhergestellt. Es wird angenommen, dass die Lysin- plus Threonin-Inhibition aus der Feedback-Inhibition von endogener AK resultiert, die den Fluss durch den Weg reduziert, was zur Verarmung von Methionin führt. Beim Tabak befanden sich in den Blättern zwei AK-Enzyme, ein Lysin-empfindliches und ein Threonin-empfindliches [Negrutui et al. (1984) Theor. Appl. Genet. 68: 11–20]. Hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin inhibieren das Wachstum von Sprossen aus Tabakblattscheiben und diese Inhibition wird durch das Zufügen niedriger Konzentrationen von Methionin umgekehrt. Folglich ist die Wachstumsinhibition vermutlich auf die Inhibition der beiden AK-Isozyme zurückzuführen.
Die Expression von aktivem Lysin und Threonin unempfindlichem AKIII-M4 kehrt auch die Lysin- plus Threonin-Wachstumsinhibition um (Tabelle 2, Beispiel 7). Es besteht eine gute Korrelation zwischen dem Spiegel des exprimierten AKIII-M4-Proteins und der Resistenz gegen Lysin plus Threonin. Die Expression von Lysin-empfindlichem Wildtyp-AKIII weist keine ähnliche Wirkung auf. Da die Expression des AKIII-M4-Proteins unter normalen Inhibitionsbedingungen Wachstum zulässt, kann ein chimäres Gen, das die Expression von AKIII-M4 in Pflanzen veranlasst, als ein selektierbarer genetischer Marker zur Transformation wie in Beispielen 13 und 17 erläutert, verwendet werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen definiert, worin alle Teile und Prozente, sofern nicht anderweitig angegeben wird, Gewichtsteile und Gewichtsprozente und die Grade Celsius darstellen. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass diese Beispiele, während sie die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen angeben, lediglich zur Erläuterung vorgelegt werden. Aus der vorstehenden Besprechung und diesen Beispielen kann ein Fachmann die wesentlichen erfindungsgemäßen Merkmale festlegen und kann ohne aus dem Gedanken und Umfang davon zu kommen, verschiedene Änderungen und Modifikationen an der Erfindung vornehmen, um sie den verschiedenen Verwendungszwecken und Bedingungen anzupassen.
BEISPIEL 1
ISOLIERUNG DES E. coli-lysC-GENS UND ZU LYSIN-UNEMPFINDLICHEM AKIII FÜHRENDEN MUTATIONEN IN lysC
Das lysC-Gen von E. coli wurde zuvor kloniert, die Restriktionsendonuklease kartiert und sequenziert [Cassan et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 1052–1057]. Das erfindungsgemäße lysC-Gen wurde auf einem Bakteriophagen-Lambda-Klon aus einer geordneten Bibliothek von 3400 überlappenden Segmenten von klonierter E. coli-DNA, konstruiert von Kohara, Akiyama und Isono (Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508], erhalten. Diese Bibliothek stellt eine physikalische Karte des gesamten E. coli-Chromosoms dar und verknüpft die physikalische Karte mit der genetischen Karte. Anhand der Kenntnisse der Position auf der Karte von lysC bei 90 min auf der genetischen Karte von E. coli [Theze et al. (1974) J. Bacteriol. 117: 133–143], der Restriktionsendonuklease-Karte des klonierten Gens [Cassan et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 1052–1057] und der Restriktionsendonuklease-Karte der klonierten DNA-Fragmente in der E. coli-Bibliothek [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508] war es möglich, Lambda-Phagen 4E5 und 7A4 [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508] als mögliche Kandidaten zum Tragen des lysC-Gens zu wählen. Die Phagen wurden in flüssiger Kultur aus Einzelplaques wie beschrieben [siehe Current Protocols in Molecular Biology (1987) Ausubel et al. Hrsg. John Wiley & Sons New York] unter Verwendung von LE392 als Wirt [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press] gezüchtet. Die Phagen-DNA wurde wie beschrieben durch Phenolextraktion hergestellt [siehe Current Protocols in Molecular Biology (1987) Ausubel et al. Hrsg. John Wiley & Sons New York).
Aus der Sequenz des Gens wurden mehrere Restriktionsendonuklease-Fragmente, die für das lysC-Gen diagnostisch waren, vorausgesagt, einschließlich eines 1860 bp großen EcoR I-Nhe I-Fragments, eines 2140 bp großen EcoR I-Xmn I-Fragments und eines 1600 bp großen EcoR I-BamH I-Fragments. Jedes dieser Fragmente wurde in den beiden Phagen-DNAs nachgewiesen, womit bestätigt wurde, dass diese das lysC-Gen trugen. Das EcoR I-Nhe I-Fragment wurde isoliert und in dem mit den gleichen Enzymen verdauten Plasmid pBR322 subkloniert, wobei sich ein Ampicillin-resistenter, Tetracyclin-empfindlicher E. coli-Transformant ergab. Das Plasmid wurde als pBT436 bezeichnet.
Zur Etablierung, dass das klonierte lysC-Gen funktionell war, wurde pBT436 in den E. coli-Stamm Gif106M1 (E. coli-Stamm CGSC-5074 vom Genetic Stock Center) transformiert, der Mutationen in jedem der drei AK-Gene von E. coli aufweist [Theze et al. (1974) J. Bacteriol. 117: 133–143]. Diesem Stamm mangelt die gesamte AK-Aktivität und benötigt deshalb Diaminopimelat (ein Vorläufer zu Lysin, der auch für die Zellwand-Biosynthese wesentlich ist), Threonin und Methionin. Im transformierten Stamm wurden alle diese nutritiven Anforderungen gemildert, wobei nachgewiesen wurde, dass das klonierte lysC-Gen für die funktionelle AKIII kodierte.
Das Zufügen von Lysin (oder Diaminopimelat, das ohne weiteres in vivo in Lysin umgewandelt wird) in einer Konzentration von ca. 0,2 mM zum Wachstumsmedium inhibiert das Wachstum von mit pBT436 transformiertem Gif106M1. Es wurde M9-Medium [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], supplementiert mit dem zum Gif106M11-Wachstum erforderlichen Arginin und Isoleucin und Ampicillin zur Aufrechterhaltung der Selektion auf das pBT436-Plasmid, verwendet. Diese Inhibition wird durch Zufügen von Threonin plus Methionin zum Wachstumsmedium umgekehrt. Diese Ergebnisse gaben zu erkennen, dass AKIII durch exogen zugefügtes Lysin inhibiert werden kannte, was zur Verarmung der anderen sich von Aspartat herleitenden Aminosäuren führt. Diese Eigenschaft des pBT436-transformierten Gif106M1 wurde zum Auswahlen auf Mutationen in lysC, das für Lysin-unempfindliche AKIII kodiert, verwendet.
Mit pBT436 transformierte Einzelkolonien von Gif106M1 wurden gewonnen und in 200 μl eines Gemischs von 100 μl 1%igem Lysin plus 100 μl M9-Medium resuspendiert. Die gesamte Zellsuspension mit 10⁷–10⁸ Zellen wurde auf einer Petrischale ausgestrichen, die M9-Medium enthielt, das mit Arginin, Isoleucin und Ampicillin supplementiert war. Auf diese Weise wurden 16 Petrischalen vorbereitet. Auf 11 der 16 Petrischalen traten von 1 bis 20 Kolonie(n) in Erscheinung. (Wenn verfügbar) wurden eine oder zwei Kolonie(n) gewonnen und erneut auf Lysin-Resistenz getestet und von diesen wurden neun Lysin-resistente Klone erhalten. Die Plasmid DNA wurde aus acht von diesen vorbereitet und erneut in Gif106M1 transformiert, um zu bestimmen, ob die Lysin-Resistenzdeterminante Plasmid-bürtig ist. Sechs von den acht Plasmid-DNAs ergaben Lysin-resistente Kolonien. Drei dieser sechs trugen lysC-Gene, die für AKIII kodierten, die durch 15 mM Lysin nicht inhibiert wurde, wohingegen die Wildtyp-AKIII durch 0,3–0,4 mM Lysin 50%ig inhibiert und durch 1 mM Lysin >90%ig inhibiert wurde (nähere Einzelheiten siehe Beispiel 2).
Zur Bestimmung der molekularen Basis auf Lysin-Resistenz wurden die Sequenzen des Wildtyp-lysC-Gens und drei mutante Gene bestimmt. Ein Verfahren zu „Using mini-prep plasmid DNA for sequencing double stranded templates with sequenase^TM" (Verwendung von mini-prep-Plasmid-DNA zum Sequenzieren doppelsträngiger Templates mit Sequenase^TM" [Kraft et al. (1988) BioTechniques 6: 544–545] wurde verwendet. Oligonukleotid-Primer, die auf der veröffentlichten lysC-Sequenz basieren und ca. alle 200 bp mit Zwischenraum angeordnet waren, wurden zur Förderung der Sequenzierung synthetisiert. Die Sequenz des Wildtyp-lysC-Gens, das in pBT436 (SEQ ID NO:1) kloniert war, unterschied sich von der veröffentlichten lysC-Sequenz in der Kodierungsregion an 5 Positionen. Vier dieser Nukleotidunterschiede befanden sich an der dritten Position in einem Codon und würden zu keiner Änderung der Aminosäuresequenz des AKIII-Proteins führen. Einer der Unterschiede würde in einem Cystein zur Glycin-Substitution an der Aminosäure 58 von AKIII resultieren. Diese Unterschiede sind wahrscheinlich auf verschiedene Stämme zurückzuführen, aus denen die lysC-Gene kloniert wurden.
Die Sequenzen der drei mutanten lysC-Gene, die für Lysin-unempfindliche AK kodierten, unterschieden sich jede von der Wildtyp-Sequenz um ein einzelnes Nukleotid, was zu einer einzelnen Aminosäure-Substitution im Protein führte. Die Mutante M2 wies ein A auf, das für ein G am Nukleotid 954 von SEQ ID NO:1 substituiert war, was zu einem Isoleucin für die Methionin-Substitution an der Aminosäure 318 führte und Mutanten M3 und M4 wiesen ein identisches T für C-Substitutionen am Nukleotid 1055 von SEQ ID NO:1 auf, was zu einem Isoleucin für die Threonin-Substitution an der Aminosäure 352 führte. Folglich ist eine von diesen beiden dieser einzelnen Aminosäure-Substitutionen ausreichend, um das AKIII-Enzym gegen die Lysin-Inhibition unempfindlich zu machen.
BEISPIEL 2
HOCHGRADIGE EXPRESSION VON WILDTYP- UND MUTANTEN lysC-GENEN IN E. coli
Ein Nco I (CCATGG)-Ort wurde am Translationsinitiationscodon des lysC-Gens unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide insertiert:
SEQ ID NO:2:
GATCCATGGC TGAAATTGTT GTCTCCAAAT TTGGCG
SEQ ID NO:3:
GTACCGCCAA ATTTGGAGAC AACAATTTCA GCCATG
Wenn sie annealt sind, weisen diese Oligonukleotide BamH I- und Asp718-„sticky” Enden auf. Das Plasmid pBT436 wurde mit BamH I verdaut, das stromaufwärts die lysC-Kodiersequenz schneidet und Asp718, das 31 Nukleotide stromabwärts vom Initiationscodon schneidet. Die annealten Oligonukleotide wurden an den Plasmidvektor ligiert, und es wurden E. coli-Transformanten erhalten. Es wurde Plasmid-DNA hergestellt und auf Insertion der Oligonukleotide, basierend auf der Anwesenheit eines Nco I-Ortes gescreent. Ein Plasmid, das den Ort enthält, wurde zur Gewährleistung sequenziert, dass die Insertion korrekt war und wurde als pBT457 bezeichnet. Zusätzlich zur Herbeiführung eines Nco I-Orts am Initiationscodon von lysC verändert diese Oligonukleotid-Insertion das zweite Codon von TCT, das für Serie kodiert, in GCT, das für Alanin kodiert. Diese Aminosäure-Substitution hatte scheinbar keine Wirkung auf die AKIII-Enzymaktivität.
Zur Erzielung einer hochgradigen Expression der lysC-Gene in E. coli wurde der bakterielle Expressionsvektor pBT430 verwendet. Dieser Vektor stellt ein Derivat von pET-3a dar [Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 125–135], welches das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase/T7-Promotor-System einsetzt. Das Plasmid pBT430 wurde wie folgt konstruiert: zuerst durch Zerstörung der EcoR I- und Hind III-Orte in pET-3a an ihren ursprünglichen Positionen. Ein Oligonukleotid-Adapter, der EcoR I- und Hind III-Orte enthält, wurde am BamH I-Ort von pET-3a insertiert Dies führte pET-3aM mit zusätzlichen einzigartigen Klonierungsorten zur Insertion von Genen in den Expressionsvektor herbei. Dann wurde der Nde I-Ort an der Position der Translationsinitiation unter Verwendung einer Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese in einen Nco I-Ort umgewandelt. Die DNA-Sequenz von pET-3aM in dieser Region, 5'-CATATGG, wurde in 5'-CCCATGG in pBT430 umgewandelt.
Das lysC-Gen wurde aus dem Plasmid pBT457 als ein 1560 bp großes Nco I-EcoR I-Fragment geschnitten und in den Expressionsvektor pBT430 insertiert, der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, wobei sich Plasmid pBT461 ergab. Zur Expression der mutanten lysC-Gene (M2, M3 und M4) wurde pBT461 mit Kpn I-EcoR I verdaut, wodurch das Wildtyp-lysC-Gen aus ca. 30 Nukleotiden stromabwärts vom Translation-Startcodon entfernt und wobei die analogen Kpn I-EcoR I-Fragmente aus den mutanten Genen, welche die Plasmide pBT490, pBT491 bzw. pBT492 ergeben, insertiert werden.
Zur hochgradigen Expression wurde jedes der Plasmide in den E. coli-Stamm BL21(DE3) transformiert [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130]. Die Kulturen wurden in LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 mg/l) bei 25°C gezüchtet. Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von ca. 1 wurde IPTG (Isopropylthio-β-galactosid, der Induktor) einer Endkonzentration von 0,4 mM zugefügt und die Inkubation wurde 3 h bei 25°C fortgesetzt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt und in 1/20stel (oder 1/100stel) des Originalkulturvolumens in 50 mM NaCl; 50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA resuspendiert und bei –20°C eingefroren. Die eingefrorenen Aliquote von 1 ml wurden bei 37°C und in einem Eiswasserbad zur Lyse der Zellen beschallt. Das Lysat wurde 5 min bei 4°C bei 15000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde in 1 ml des vorstehenden Puffers resuspendiert.
Die Überstands- und Pelletfraktionen von nicht induzierten und IPTG-induzierten Kulturen von BL21 (DE3)/pBT461 wurden mittels der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert. Das mittels der Coomassieblau-Färbung im Überstand der induzierten Kultur sichtbar gemachte wichtige Protein wies ein Molekulargewicht von ca. 48 kD, die erwartete Größe für AKIII auf. Ca. 80% des AKIII-Proteins befanden sich im Überstand und AKIII stellte 10–20% des Gesamtproteins von E. coli im Extrakt dar.
Die AK-Aktivität wunde wie nachstehend gezeigt bestimmt: Assay-Mix (für 12 Assay-Röhrchen):
4,5 ml H₂O
1,0 ml 8 M KOH
1,0 ml 8 M NH₂OH-HCl
1,0 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0
0,5 ml 0,2 M ATP (121 mg/ml in 0,2M NaOH)
50 μl 1 M MgSO₄
Jedes 1,5 ml fassende Eppendorf-Assayröhrchen enthielt:
0,64 ml Assay-Mix
0,04 ml 0,2 M L-Asparaginsäure oder 0,04 ml H₂O
0,0005–0,12 ml Extrakt
H₂O auf ein Gesamtvolumen von 0,8 ml
Die Assay-Röhrchen wurden bei 30°C für die gewünschte Zeit (10–60 min) inkubiert. Dann wurden 0,4 ml FeCl₃-Reagenz (10% w/v FeCl₃, 3,3% Trichloressigsäure, 0,7 M HCl) zugefügt und das Material 2 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Die OD wurde bei 540 nm abgelesen und mit dem Aspartylhydroxamat-Standard verglichen.
Ca. 80% der AKIII-Aktivität befanden sich in der Überstandsfraktion. Die spezifische Aktivität der Wildtyp- und mutanten Rohextrakte betrug 5–7 μmol Produkt pro min pro Milligram Gesamtprotein. Die Wildtyp-AKIII war empfindlich gegen die Anwesenheit von L-Lysin im Assay. Bei einer Konzentration von ca. 0,4 mM wurde eine 50%ige Inhibition ermittelt und eine 90%ige bei ca. 1,0 mM. Dagegen wurden die Mutanten AKIII-M2, -M3 und -M4 (siehe Beispiel 1) durch 15 mM L-Lysin überhaupt nicht inhibiert.
Das Wildtyp-AKIII-Protein wurde aus dem Überstand der IPTG-induzierten Kultur wie folgt gereinigt. Zu 1 ml Extrakt wurden 0,25 ml 10%iges Streptomycinsulfat zugefügt und über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Das Gemisch wurde bei 4°C 15 min bei 15000 U/min. zentrifugiert Der Überstand wurde gesammelt und unter Verwendung einer Sephadex G-25 M-Säule (Säule PD-10, Pharmacia) entsalzt. Er wurde dann auf einer Mono-Q-HPLC-Säule laufen lassen und mit einem NaCl-Gradienten von 0–1 M eluiert. Die beiden 1-ml-Fraktionen, welche die meiste AKIII-Aktivität enthielten, wurden gepoolt, konzentriert, entsalzt und auf einer HPLC-Trennsäule (TSK G3000SW) laufen lassen. Die Fraktionen wurden in 20 mM KPO₄-Puffer, pH 7,2, 2 mM MgSO₄, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,15 M KCl, 0,5 mM L-Lysin eluiert, und es wurde mittels der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ermittelt, dass sie >95% rein waren. Das gereinigte AKIII-Protein wurde zum Generieren von Kaninchen-Antikörpern gegen das Protein an die Hazelton Research Facility (310 Swampridge Road, Denver, PA 17517) gesandt.
BEISPIEL 3
ISOLIERUNG DER dapA-GENE VON E. coli UND CORYNEBACTERIUM glutamicum
Das dapA-Gen von E. coli (ecodapA) wurde zuvor kloniert, mit Restriktionsendonuklease kartiert und sequenziert [Richaud et al. (1986) J. Bacteriol. 166: 297–300]. Für die erfinderische Tätigkeit wurde das dapA-Gen auf einem Bakteriophagen-Lambda-Klon aus einer geordneten Bibliothek von 3400 überlappenden Segmenten von klonierter E. coli-DNA erhalten, die von Kohara, Akiyama und Isono konstruiert wurde [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508, siehe Beispiel 1]. Aus der Kenntnis der Kartenposition von dapA bei 53 min auf der genetischen Karte von E. coli [Bachman (1983) Microbiol. Rev. 47: 180–230], der Restriktionsendonuklease-Karte des klonierten Gens [Richaud et al. (1986) J. Bacteriol. 166: 297–300] und der Restriktionsendonuklease-Karte der klonierten DNA-Fragmente in der E. coli-Bibliothek (Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508) war es möglich, die Lambda-Phagen 4C11 und 5A8 [Kohara et al. (1987) Cell 50: 595–508] als mögliche Kandidaten zu wählen, die das dapA-Gen tragen. Die Phagen wurden in Flüssigkultur aus Einzelplaques wie beschrieben (siehe Current Protocols in Molecular Biology (1987) Ausubel et al. Hrsg., John Wiley & Sons New York] unter Verwendung von LE392 als Wirt gezüchtet [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press]. Die Phagen-DNA wurde durch Phenolextraktion wie beschrieben hergestellt [siehe Current Protocols in Molecular Biology (1987) Ausubel et al. Hrsg., John Wiley & Sons New York]. Beide Phagen enthielten ein für das dapA-Gen erwartetes aus ca. 2,8 kb bestehendes Pst I-DNA-Fragment [Richaud et al. (1986) J. Bacteriol. 166: 297–300]. Das Fragment wurde aus dem Verdau des Phagen 5A8 isoliert und in den mit Pst I verdauten Vektor pBR322 insertiert, wobei sich das Plasmid pBT427 ergab.
Das dapA-Gen von Corynebacterium (cordapA) wurde aus genomischer DNA aus dem ATCC-Stamm 13032 mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert. Die Nukleotidsequenz des dapA-Gens von Corynebacterium wurde veröffentlicht [Bonnassie et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6421]. Es war möglich, aus der Sequenz Oligonukleotid-Primer für die PCR zu konzipieren, die die Amplifikation eines das Gen enthaltenden DNA-Fragments zulassen und gleichzeitig einzigartige Restriktionsendonuklease-Orte am Startcodon (Nco I) und eben am Stoppcodon (EcoR I) des Gens vorbei zufügen würden. Bei den verwendeten Oligonukleotid-Primern handelte es sich um die folgenden:
SEQ ID NO:4:
CCCGGGCCAT GGCTACAGGT TTAACAGCTA AGACCGGAGT AGAGCACT
SEQ ID NO:5:
GATATCGAAT TCTCATTATA GAACTCCAGC TTTTTTC
Die PCR wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer Cetus-Kits gemäß den Anleitungen des Herstellers an einem vom gleichen Unternehmen hergestellten Thermocycler durchgeführt. Das Reaktionsprodukt, wenn es auf einem Agarosegel lief und mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, zeigte eine starke DNA-Bande, die für das dapA-Gen von Corynebacterium der Größe, ca. 900 bp, erwartet wird. Das PCR-generierte Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen Nco I und EcoR I verdaut und in den Expressionsvektor pBT430 (siehe Beispiel 2), der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, insertiert. Außer dem Einführen eines Nco I-Ortes am Translation-Startcodon führten die PCR-Primer auch zu einer Änderung des zweiten Codons aus der AGC-Kodierung für Serin zur GCT-Kodierung für Alanin. Mehrere Klone, die aktive, Lysin-unempfindliche DHDPS (siehe Beispiel 4) exprimierten, wurden isoliert, was darauf hindeutet, dass die Aminosäuresubstitution des zweiten Codons sich nicht auf die Aktivität auswirkte; ein Klon wurde als FS766 bezeichnet.
Das Nco I-EcoR I-Fragment, das das PCR-generierte dapA-Gen von Corynebacterium trägt, wurde in den Phagemid-Vektor pGEM-9Zf(–) von Promega subkloniert, einsträngige DNA wurde hergestellt und sequenziert. Diese Sequenz wird in SEQ ID NO:6 gezeigt.
Außer den bereits erwähnten Unterschieden im zweiten Codon passte die Sequenz mit der veröffentlichten Sequenz, ausgenommen an zwei Positionen, Nukleotiden 798 und 799, zusammen. In der veröffentlichten Sequenz handelt es sich bei diesen um TC, während sie im in SEQ ID NO:6 gezeigten Gen CT darstellen. Diese Änderung führt zu einer Aminosäuresubstitution von Leucin für Serin. Der Grund für diesen Unterschied ist nicht bekannt. Er könnte auf einen Fehler in der veröffentlichten Sequenz, den Unterschied bei zum Isolieren des Gens verwendeten Stämmen oder einen PCR-generierten Fehler zurückzuführen sein. Letzteres scheint unwahrscheinlich zu sein, da die gleiche Änderung in mindestens drei unabhängig isolierten PCR-generierten dapA-Genen beobachtet wurde. Der Unterschied hat anscheinend keine Wirkung auf die DHDPS-Enzymaktivität (siehe Beispiel 4).
BEISPIEL 4
HOCHGRADIGE EXPRESSION VON dapA-GENEN VON E. coli UND CORYNEBACTERIUM glutamicum IN E. coli
Bin Nco I-Ort (CCATGG) wurde am Translationsinitiationscodon des dapA-Gens von E. coli unter Verwendung der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese insertiert. Das 2,8 kb große Pst I-DNA-Fragment, welches das dapA-Gen in Plasmid pBT427 (siehe Beispiel 3) tragt, wurde in den Pst I-Ort des Phagemid-Vektors pTZ18R (Pharmacia) insertiert, wobei sich pBT431 ergab. Die Orientierung des dapA-Gens war dergestalt, dass der Kodierungsstrang auf der einsträngigen Phagemid-DNA anwesend sein würde. Die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung eines „Muts-Gene Kits" von Bio-Rad nach Anleitung des Herstellers mit dem nachstehend gezeigten mutagenen Primer durchgeführt:
SEQ ID NO:7:
CTTCCCGTGA CCATGGGCCA TC
Putative Mutanten wurden auf die Anwesenheit eines Nco I-Orts gescreent, und es wurde gezeigt, dass ein Plasmid, bezeichnet als pBT437, die richtige Sequenz in der Umgebung der Mutation durch DNA-Sequenzierung aufweist. Das Zufügen eines Nco I-Orts am Translation-Startcodon veranlasste auch eine Änderung des zweiten Codon von der TTC-Kodierung für Phenylalanin zur GTC-Kodierung für Valin.
Zur Erlangung einer hochgradigen Expression der dapA-Gene in E. coli wurde der bakterielle Expressionsvektor pBT430 (siehe Beispiel 2) verwendet. Das dapA-Gen von E. coli wurde aus dem Plasmid pBT437 als ein aus 1150 bp bestehendem Nco I-Hind III-Fragment geschnitten und in den Expressionsvektor pBT430 insertiert, der mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, wobei sich das Plasmid pBT442 ergab. Zur Expression des dapA-Gens von Corynebacterium, wurde das 910 bp große Nco I-EcoR I-Fragment von SEQ ID NO:6, insertiert in pBT430 (pFS766, siehe Beispiel 3), verwendet.
Zur hochgradigen Expression wurde jedes der Plasmide in den E. coli-Stamm BL21(DE3) transformiert [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130]. Die Kulturen wurden in LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 mg/l) bei 25°C gezüchtet. Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von ca. 1 wurde IPTG (Isopropylthio-β-galactosid, der Induktor) einer Endkonzentration von 0,4 mM zugefügt und die Inkubation wurde 3 h bei 25°C fortgesetzt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt und in 1/20stel (oder 1/100stel) des Originalkulturvolumens in 50 mM NaCl; 50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA resuspendiert und bei –20°C eingefroren. Die eingefrorenen Aliquote von 1 ml wurden bei 37°C aufgetaut und in einem Eiswasserbad zur Lyse der Zellen beschallt. Das Lysat wurde bei 4°C 5 min bei 15000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde in 1 ml des vorstehenden Puffers resuspendiert.
Die Überstands- und die Pelletfraktionen von nicht induzierten und IPTG-induzierten Kulturen von BL21(DE3)/pBT442 oder BL21(DE3)/pFS766 wurden mittels der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert. Das durch die Coomassieblau-Färbung in den Überstands- und Pelletfraktionen von beiden induzierten Kulturen sichtbar gemachte wichtige Protein wies ein Molekulargewicht von 32–34 kD, der erwarteten Größe für DHDPS auf. Selbst in den nicht induzierten Kulturen stellte dieses Protein das prominenteste Protein dar, das hergestellt wurde.
In der BL21(DE3)/pBT442 IPTG-induzierten Kultur fanden sich ca. 80% des DHDPS-Proteins im Überstrand und die DHDPS stellte 10–20% des Gesamtproteins im Extrakt dar. In der BL21(DE3)/pFS766 IPTG-induzierten Kultur fanden sich mehr als 50% des DHDPS-Proteins in der Pelletfraktion. Die Pelletfraktionen stellten in beiden Fällen 90–95% reine DHDPS dar, wobei kein anderes Einzelprotein in signifikanten Mengen anwesend war. Folglich waren diese Fraktionen zur Verwendung bei der Generierung von Antikörpern rein genug. Die Pelletfraktionen, die 2–4 Milligramm von entweder E. coli-DHDPS oder Corynebacterium-DHDPS enthielten, wurden in 50 mM NaCl; 50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA, 0,2 mM Dithiothreitol, 0,2% SDS löslich gemacht und zur Generierung von Kaninchen-Antikörpern gegen die Proteine an die Hazelton Research Facility (310 Swampridge Road, Denver, PA 17517) gesandt.
Die DHDPS-Enzymaktivität wurde wie folgt bestimmt: Assay-Mix (für 10 × 1,0 ml Assay-Röhrchen oder 40 × 0,25 ml für die Mikrotiterschale); kurz vor Gebrauch frisch hergestellt:

2,5 ml H₂O

0,5 ml 1,0 M Tris-HCl, pH 8,0

0,5 ml 0,1 MNa-Pyruvat

0,5 ml o-Aminobenzaldehyd (10 mg/ml in Ethanol)

25 μl 1,0 M DL-Asparaginsäure-β-Semialdehyd (ASA) in 1,0 N HCl

Assay (1,0 ml): Mikroassay (0,25 ml):

DHDPS-Assay-Mix 0,40 ml 0,10 ml

Enzym-Extrakt + H₂O 0,10 ml 0,025 ml

10 mM L-Lysin 5 μl oder 20 μl 1 μl oder 5 μl
Inkubation bei 30°C für die gewünschte Zeit. Stoppen durch Zufügen von:

1,0 N HCl 0,50 ml 0,125 ml
Die Farbe durfte sich über 30–60 min entwickeln. Das Präzipitat wurde in der Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert. Die Ablesung des Leerwerts erfolgte bei OD₅₄₀ vs. 0 min. Für den Mikroassay wurde ein Aliquot von 0,2 ml in ein Mikrotiter-Well gegeben und bei OD₅₃₀ abgelesen.
Die spezifische Aktivität von E. coli-DHDPS in der Überstandsfraktion von induzierten Extrakten betrug ca. 50 OD₅₄₀-Einheiten pro Minute pro Milligramm Protein in einem 1,0-ml-Assay. Die E. coli-DHDPS war empfindlich gegen die Anwesenheit von L-Lysin im Assay. Bei einer Konzentration von ca. 0,5 mM wurde eine 50%ige Inhibition festgestellt. Für die Corynebacterium-DHDPS wurde die Aktivität in der Überstandsfraktion von nicht induzierten Extrakten anstelle der induzierten Extrakte gemessen. Die Enzymaktivität betrug ca. 4 OD₅₃₀-Einheiten pro Minute pro Milligramm Protein in einem 0,25-ml-Assay. Im Gegensatz zu E. coli-DHDPS wurde die Corynebacterium-DHDPS, selbst bei einer Konzentration von 70 mM, durch L-Lysin überhaupt nicht inhibiert.
BEISPIEL 5
EXKRETION VON AMINOSÄUREN DURCH HOHE KONZENTRATIONEN VON DHDPS UND/ODER AKIII EXPRIMIERENDE E. coli
Die E. coli-Expressionskassette mit dem dapA-Gen von E. coli, das mit dem T7-RNA-Polymerase-Promotor verknüpft ist, wurde durch Verdau von pBT442 (siehe Beispiel 4) mit BgIII und BamH I, Trennen der Verdauungsprodukte über die Agarosegel-Elektrophorese und Eluieren des ca. 1250 bp großen Fragments aus dem Gel isoliert. Dieses Fragment wurde in den BamH I-Ort von Plasmiden pBT461 (enthaltend den T7-Promotor/lysC-Gen) und pBT492 (enthaltend den T7-Promotor/lysC-M4-Gen) insertiert. Inserts, bei denen die Transkription beider Gene in der gleichen Richtung stattfinden würde, wurden durch die Restriktionsendonuklease-Analyse identifiziert, wobei sich die Plasmide pBT517 (T7/dapA + T7/lysC-M4) und pBT519 (T7/dapA + T7/lysC) ergaben.
Zur Induktion von E. coli zur Produktion und Exkretion von Aminosäuren wurden diese Plasmide ebenso wie die Plasmide pBT442, pBT461 und pBT492 (und pBR322 als eine Kontrolle) in den E. coli-Stamm BL21(DE3) transformiert [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130]. Alle diese Plasmide, besonders aber pBT517 und pBT519, sind in diesem Wirtsstamm etwas instabil, was die sorgfältige Aufrechterhaltung der Selektion auf Ampicillin-Resistenz während des Wachstums erforderlich macht.

Alle Stämme wurden in M9-Medium (Minimalmedium) [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press), supplementiert mit Ampicillin, zur Aufrechterhaltung der Selektion auf die Plasmide über Nacht bei 37°C gezüchtet. Wenn sie eine OD₆₀₀ von 1 erreichten, wurden die Kulturen gesammelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und die Überstände (3 ml) wurden zur Entfernung der verbleibenden Zellen und großen Moleküle durch Filter von 0,2 Mikron gegeben. Fünf-Mikroliter-Aliquote der Überstandsfraktionen wurden mit einem Beckman Aminosäureanalysator, Modell 6300, unter Verwendung einer Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion, auf die Aminosäurezusammensetzung analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 ersichtlich. TABELLE 1 Aminosäure-Konzentration in Kulturüberständen (mM)

Plasmid	Lys	Thr	Met	Ala	Val	Asp	Glu
pBR322	0	0	0	0,05	0,1	0	0
pBT442	0,48	0	0 0	0,04	0,06	0	0
pBT461	0,14	0,05	0 0	0,02	0,03	0	0
pBT492	0,16	0,07	0	0,02	0,03	0	0
pBT517	0,18	0	0,01	0	0	0,02	0,02
pBT519	0,14	0	0,01	0	0	0,01	0

Alle die Plasmide, außer der pBR322-Kontrolle, führten zur Exkretion von Lysin in das Kulturmedium. Die Expression des lysC- oder des lysC-M4-Gens führte sowohl zur Lysin- als auch Threonin-Exkretion. Die Expression von lysC-M4- + dapA führte zur Exkretion von Lysin, Methionin, Asparagin- und Glutaminsäure, aber nicht Threonin. Außerdem wurden im Kulturüberstand kein Alanin und Valin nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit lysC + dapA erhalten, außer dass keine Glutaminsäure exkretiert wurde.
BEISPIEL 6
KONSTRUKTION CHIMÄRER dapA-, lysC- UND lysC-M4-GENE ZUR EXPRESSION IN PFLANZEN
Mehrere Gen-Expressionskassetten wurden zur Konstruktion chimärer Gene zur Expression von ecodapA, cordapA, lysC and lysC-M4 in Pflanzen verwendet. Eine Blatt-Expressionkassette (1a) setzt sich aus dem 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus [Odell et al.(1985) Nature 313: 810–812; Hull et al. (1987) Virology 86: 482–493], dem Tanslations-Leader aus dem Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein-Gen (Cab-Gen), [Dunsmuir (1985) Nucleic Acids Res. 13: 2503–2518) und der 3'-Transkriptions-Terminationsrregion aus dem Nopalinsynthase-Gen (Nos-Gen) [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 561–570] zusammen. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen befinden sich die Restriktionsendonuklease-Orte Nco I (die das ATG-Translationsinitiationscodon einschließen), EcoR I, Sma I und Kpn I. Die gesamte Kassette ist von Sal I-Orten flankiert; es befindet sich auch ein BamH I-Ort stromaufwärts von der Kassette.
Eine samenspezifische Expressionskassette (1b) setzt sich aus dem Promotor und Transkriptionsterminator am dem Gen zusammen, das für die β-Untereinheit des Samenspeicherproteins Phaseolin aus der Bohne Phaseolus vulgaris kodiert [Doyle et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228–92383].
Die Phaseolin-Kassette schließt ca. 500 Nukleotide stromaufwärts (5') vom Translationsinitiationscodon und ca. 1650 Nukleotide stromabwärts (3') vom Translation-Stoppcodon von Phaseolin ein. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen befinden sich die einzigartigen Restriktionsendonuklease-Orte Nco I (die das ATG-Translationsinitiationscodon einschließen), Sma I, Kpn I und Xba I. Die gesamte Kassette ist von Hind III-Orten flankiert.
Eine zweite Samenexpressionskassette wurde für das cordapA-Gen verwendet. Diese setzte sich aus dem Promotor und dem Transkriptionsterminator aus dem Kunitz-Trypsin-Inhibitor-3-Gen (KTI3-Gen) der Sojabohne zusammen [Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1: 427–435]. Die KTI3-Kassette schließt ca. 2000 Nukleotide stromaufwärts (5') vom Translationsinitiationscodon und ca. 240 Nukleotide stromabwärts (3') aus dem Translations-Stoppcodon von Phaseolin ein. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen befinden sich die einzigartigen Restriktionsendonuklease-Orte Nco I (welche den ATG-Translationsinitiationscodon einschließen), Xba I, Kpn I und Sma I. Die gesamte Kassette ist von BamH I-Orten flankiert.
Eine konstitutive Expressionskassette für Mais wurde für die Expression des lysC-M4-Gen und des ecodapA-Gens verwendet. Sie setzte sich am einem chimären Promotor zusammen, der sich aus Stücken von zwei Maispromotoren herleitete und durch eine ortsspezifische Mutagenese in vitro modifiziert war, um einen hochgradigen konstitutiven Promotor und eine 3'-Region aus einem Maisgen unbekannter Funktion zu ergeben. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen befinden sich die einzigartigen Restriktionsendonuklease-Orte Nco I (die das ATG-Translationsinitiationscodon einschließen), Sma I und Bgl II. Die Nukleotidsequenz der konstitutiven Maisexpressionskassette wird in SEQ ID NO:16 gezeigt.
Es ist bekannt, dass biosynthetische Enzyme von Pflanzen-Aminosäuren in den Chloroplasten lokalisiert sind und deshalb mit einem Chloroplasten-Targetingsignal synthetisiert werden. Bakterienproteine, wie zum Beispiel DHDPS und AKIII weisen kein derartiges Signal auf. Eine Chloroplasten-Transitsequenz (cts) wurde deshalb mit der ecodapA, cordapA, lysC, und lysC-M4 kodierenden Sequenz in einigen chimären Genen fusioniert. Die verwendete cts basierte auf der cts der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase aus der Sojabohne [Berry-Lowe et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 483–498]. Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:8–11, wurden synthetisiert und wie nachstehend beschrieben verwendet. Für Mais basierte die verwendete cts auf der cts der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase aus Mais [Lebrun et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 4360] und wird als mcts bezeichnet, um sie von der cts der Sojabohne zu unterscheiden. Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:17–22, wurden synthetisiert und wie nachstehend beschrieben verwendet.
Es wurden vierzehn chimäre Gene herbeigeführt:
Nr. 1) 35S-Promotor/Cab-Leader/lysC/Nos-3'
Nr. 2) 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3'
Nr. 3) 35S Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3'
Nr. 4) Phaseolin-5'-Region/cts/lysC/Phaseolin-3'-Region
Nr. 5) Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region
Nr. 6) 35S-Promotor/Cab-Leader/ecodapA/Nos-3'
Nr. 7) 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3
Nr. 8) Phaseolin-5'-Region/ecodapA/Phaseolin-3'-Region
Nr. 9) Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region
Nr. 10) 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/cordapA/Nos-3
Nr. 11) Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region
Nr. 12) KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region
Nr. 13) HH534-5'-Region/mcts/lysC-M4/HH2-1-3'-Region
Nr. 14) HH534-5'-Region/mcts/ecodapA/HH2-1-3'-Region
Ein 1440 bp großes Nco I-Hpa I-Fragment, das die gesamte lysC-Kodierungsregion plus ca. 90 bp der 3' nicht kodierenden Sequenz enthielt, wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und in die Blatt-Expressionskassette insertiert, die mit Nco I und Sma I (dem chimären Gen Nr. 1) verdaut wurde, was Plasmid pBT483 ergab.
Oligonukleotide, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:9, die für den carboxyterminalen Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, wobei sich Nco I-kompatible Enden ergaben, die über die Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und in Nco I-verdaute pBT461 insertiert wurden. Die Insertion der korrekten Sequenz in der korrekten Orientierung wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT496 ergab. Oligonukleotide, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11, die für den aminoterminalen Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, was in Nco I-kompatiblen Enden resultiert, die über die Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und in Nco I-verdaute pBT496 insertiert wurden. Die Insertion der korrekten Sequenz in der korrekten Orientierung wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT521 ergab. Auf diese Weise wurde die cts mit dem lysC-Gen fusioniert.
Zum Fusionieren der cts mit dem lysC-M4-Gen wurde pBT521 mit Sal I und ein ca. 900 bp großes, die cts einschließendes DNA-Fragment verdaut, und die aminoterminale Kodierungsregion von lysC wurde isoliert. Dieses Fragment wurde in Sal I verdautes pBT492 insertiert, wobei effektiv die aminoterminale Kodierungsregion von lysC-M4 durch die fusionierte cts und die aminoterminale Kodierungsregion von lysC ersetzt wurde. Da die Mutation, die zu einer Unempfindlichkeit des Lysins führte, sich nicht in dem ersetzten Fragment befand, trug das neue Plasmid, pBT523, die mit lysC-M4 fusionierte cts.
Das 1600 bp große Nco I-Hpa I-Fragment, das die mit lysC fusionierte cts plus die aus ca. 90 bp bestehende 3' nicht kodierende Sequenz enthält, wurde isoliert und wie folgt insertiert: in die mit Nco-I und Sma I (dem chimärem Gen Nr. 2) verdaute Blatt-Expressionskassette, wobei sich Plasmid pBT541 ergab, und in die mit Nco I und Sma I (dem chimären Gen Nr. 4) verdaute samenspezifische Expressionskassette, wobei sich Plasmid pBT543 ergab.
Auf ähnliche Weise wurde das 1600 bp große Nco I-Hpa I-Fragment, das die cts enthält, die mit lysC-M4 plus der aus ca. 90 bp bestehenden 3' nicht kodierenden Sequenz fusioniert war, isoliert und wie folgt insertiert: in die mit Nco I und Sma I (dem chimären Gen Nr. 3) verdaute Blatt-Expressionskassette, wobei sich Plasmid pBT540 ergab, und in die mit Nco I und Sma I (dem chimärem Gen Nr. 5) verdaute samenspezifische Expressionskassette, wobei sich Plasmid pBT544 ergab.
Vor Insertion in die Expressionskassetten wurde das ecodapA-Gen zur Insertion eines Restriktionsendonuklease-Orts, Kpn I, eben nach dem Translations-Stoppcodon, modifiziert. Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:12–13, wurden für diesen Zweck synthetisiert:
SEQ ID NO:12:
CCGGTTTGCT GTAATAGGTA CCA
SEQ ID NO:13:
AGCTTGGTAC CTATTACAGC AAACCGGCAT G
Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:12 und SEQ ID NO:13, wurden annealt, was zu einem Sph I-kompatiblen Ende an einem Ende und einem Hind III-kompatiblen Ende am anderen führte und in Sph I- plus Hind III-verdautes pBT437 insertiert. Die Insertion der korrekten Sequenz wurde durch die DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT443 ergab.
Ein 880 bp großes Nco I-Kpn I-Fragment aus pBT443, das die gesamte ecodapA-Kodierungsregion enthielt, wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und wie folgt insertiert: in die mit Nco I und Kpn I (dem chimären Gen Nr. 6) verdaute Blatt-Expressionskassette, wobei sich Plasmid pBT450 ergab, und in die mit Nco I und Kpn I (dem chimären Gen Nr. 8) verdaute samenspezifische Expressionskassette, wobei sich Plasmid pBT494 ergab.
Oligonukleotide, SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:9, die für den carboxyterminalen Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, was zu Nco I-kompatiblen Enden führte, über Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und in Nco I-verdautes pBT450 insertiert. Die Insertion der korrekten Sequenz in der korrekten Orientierung wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT451 ergab. Ein 950 bp großes Nco I-Kpn I-Fragment aus pBT451, das für den carboxyterminalen Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodiert, fusioniert mit der gesamten ecodapA-Kodierungsregion, wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und in die mit Nco I und Kpn I verdaute samenspezifische Expressionskassette insertiert, wobei sich Plasmid pBT495 ergab. Oligonukleotide, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11, die für den aminoterminalen Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, was zu Nco I-kompatiblen Enden führte, über die Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt, und in Nco I-verdaute pBT451 und pBT495 insertiert. Die Insertion der korrekten Sequenz in der korrekten Orientierung wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT455 bzw. pBT520 ergab. Folglich wurde die cts mit dem ecodapA-Gen in der Blatt-Expressionskassette (dem chimären Gen Nr. 7) und der samenspezifischen Expressionskassette (dem chimären Gen Nr. 9) fusioniert.
Ein aus 870 bp bestehendes Nco I-EcoR I-Fragment aus pFS766, das die gesamte cordapA-Kodierungsregion enthält, wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und in die mit Nco I und EcoR I verdaute Blatt-Expressionskassette insertiert, wobei sich Plasmid pFS789 ergab. Zum Anlagern der cts an das cordapA-Gen wurde ein DNA-Fragment, das die gesamte cts enthält, unter Verwendung der PCR hergestellt. Die Template-DNA stellte pBT540 dar und bei den verwendeten Oligonukleotid-Primern handelte es sich um:
SEQ ID NO:14:
GCTTCCTCAA TGATCTCCTC CCCAGCT
SEQ ID NO:15:
CATTGTACTC TTCCACCGTT GCTAGCAA
Die PCR wurde unter Verwendung eines Cetus-Kits von Perkin-Elmer gemäß den Anleitungen des Herstellers an einem von dem gleichen Unternehmen hergestellten Thermocycler durchgeführt. Das anhand der PCR generierte 160 bp große Fragment, wurde mit T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit der 4 Desoxyribonukleotidtriphosphate zum Erhalt eines „blunt-ended" Fragments behandelt. Das cts-Fragment wurde in pFS789 insertiert, das mit Nco I verdaut und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase zum Auffüllen der 5'-Überhänge behandelt wurde. Mittels der DNA-Sequenzierung wurde bestimmt, dass das insertierte Fragment und die Vektor-/Insert-Verbindungsstellen korrekt sind, wobei sich pFS846 ergab, welches das chimäre Gen Nr. 10 enthielt.
Ein 1030 bp großes Nco I-Kpn I-Fragment aus pFS846, das die an die cordapA-Kodierungsregion angelagerte cts enthielt, wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und in die mit Nco I und Kpn I verdaute Phaseolinsamen-Expressionskassette insertiert, wobei sich Plasmid pFS889 ergab, welches das chimäre Gen Nr. 11 enthielt. Auf ähnliche Weise wurde das 1030 bp große Nco I-Kpn I-Fragment aus pFS846 in die mit Nco I und Kpn I verdaute KTI3-Samen-Expressionskassette insertiert, wobei sich Plasmid pFS862 ergab, welches das chimäre Gen Nr. 12 enthielt.
Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:18, die für den carboxyterminalen Teil des Mais-Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, was zu Xba I- und Nco I-kompatiblen Enden führte, über Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und in Xba I- plus Nco I-verdaute pBT492 insertiert (siehe Beispiel 2). Die Insertion der korrekten Sequenz wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT556 ergab. Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:19 und SEQ ID NO:20, die für den mittleren Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodieren, wurden annealt, was zu Bgl II- und Xba I-kompatiblen Enden führte, über die Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und in Bgl II- und Xba I-verdaute pBT556 insertiert. Die Insertion der korrekten Sequenz wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT557 ergab. Die Oligonukleotide, SEQ ID NO:21 und SEQ ID NO:22, die für den aminoterminalen Teil des Chloroplasten-Targetingsignals kodierten, wurden annealt, was zu Nco I- und Afl II-kompatiblen Enden führte, über Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und in das Nco I- und Afl II-verdaute pBT557 insertiert. Die Insertion der korrekten Sequenz wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei sich pBT558 ergab. Folglich wurden die mcts mit dem lysC-M4-Gen fusioniert.
Ein 1,6 kb großes Nco I-Hpa I-Fragment aus pBT558, das die an das lysC-M4-Gen angelagerte mcts enthält, wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert und in die mit Nco I- und Sma I-verdaute konstitutive Mais-Expressionskassette insertiert, wobei sich Plasmid pBT573 ergab, welches das chimäre Gen Nr. 13 enthielt.
Zum Anlagern der mcts an das ecodapA-Gen wurde unter Verwendung der wie vorstehend beschriebenen PCR ein DNA-Fragment hergestellt, das die gesamte mcts enthielt. Die Template-DNA stellte pBT558 dar und bei den verwendeten Oligonukleotid-Primern handelte es sich um die folgenden:
SEQ ID NO:23:
GCGCCCACCG TGATGA
SEQ ID NO:24:
CACCGGATTC TTCCGC
Das mcts-Fragment wurde in pBT450 (vorstehend) insertiert, das mit Nco I verdaut und mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase zum Auffüllen der 5'-Überhänge behandelt wurde. Es wurde mittels DNA-Sequenzierung bestimmt, dass das insertierte Fragment und die Vektor-/Insert-Verbindungsstellen korrekt waren, wobei sich pBT576 ergab. Plasmid pBT576 wurde mit Asp718 verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase zur Ausbeute eines „blunt-ended" Fragments behandelt und dann mit Nco I verdaut. Das sich ergebende 1030 bp große Nco I-„blunt-ended"-Fragment, welches das an die mcts angelagerte ecodapA-Gen enthielt, wurde nach der Elektrophorese aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde in die mit Bgl II verdaute konstitutive Mais-Expressionskassette insertiert, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase zur Ausbeute eines „blunt-ended" Fragments behandelt und dann mit Nco I verdaut, wobei sich das Plasmid pBT583 ergab, welches das chimäre Gen Nr. 14 enthielt.
BEISPIEL 7
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN 35S-PROMOTOR/lysC
Die Transformation von Tabak mit den chimären Genen von 35S-Promotor/lysC wurde wie folgt bewirkt:
Die chimären Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/lysC/Nos-3', 35S-Promotor/Cableader/cts/lysC/Nos 3' und 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' wurden als 3,5–3,6 kb große BamH I-EcoR I-Fragmente isoliert und in den mit BamH I-EcoR I verdauten Vektor pZS97K (2) insertiert, wobei sich die Plasmide pBT497, pBT545 bzw. pBT542 ergaben. Der Vektor stellt einen Teil eines binären Ti-Plasmid-Vektorsystems [Bevan, (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711–8720) von Agrobacterium tumefaciens dar. Der Vektor enthält Folgendes: (1) das chimäre Gen Nopalinsynthase-Promoter/Neomycin-Phosphotransferase-Kodierungsregion (nos:NPT II) als ein selektierbarer Marker für transformierte Pflanzenzellen [Bevan et al. (1983) Nature 304: 184–186); (2) die linken und rechten Grenzen der T-DNA des Ti-Plasmids [Bevan (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711–8720]; (3) das lacZ-α-Komplementsegment von E. coli [Vieria and Messing (1982) Gene 19: 259–267] mit einzigartigen Restriktionsendonuklease-Orten für EcoR I, Kpn I, BamH I und Sal I; (4) den bakteriellen Replikationsstartpunkt vom Pseudomonas-Plasmid pVS1 [Itoh et al. (1984) Plasmid 11: 206–220); und (5) das bakterielle Neomycin-Phosphotransferase-Gen von Tn5 [Berg et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3628–3632] als einen selektierbaren Marker für transformiertes A. tumefaciens.
Die chimären Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3' und 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' wurden auch in den binären Vektor pBT456 insertiert, wobei sich pBT547 bzw. pBT546 ergaben. Dieser Vektor stellt pZS97K dar, in den das chimäre Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/dapA/Nos-3' zuvor als ein BamH I-Sal I-Fragment insertiert wurde (siehe Beispiel 9). Im Klonierungsverfahren traten große Deletionen des chimären dapA-Gens auf. Infolgedessen sind diese Plasmide äquivalent zu pBT545 und pBT542, wobei das einzige in Pflanzen exprimierte Transgen (mit Ausnahme des selektierbaren Markergens, NPT II) 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3' oder 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' darstellte.
Die binären Vektoren, die die chimären lysC-Gene enthalten, wurden durch „Triparental Mating" [Ruvkin et al. (1981) Nature 289: 85–88] an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 [Hockema et al. (1983), Nature 303: 179–180) transferiert. Die Agrobacterium-Tansformanten wurden zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendet [Horsch et al. (1985) Science 227: 1229–1231]. Transgene Pflanzen wurden in Selektivmedium, das Kanamycin enthielt, regeneriert.
Zur Bestimmung auf Expression der chimären Gene in Blättern der transformierten Pflanzen, wurde das Protein wie folgt extrahiert. Ca. 2,5 g junge Pflanzenblätter, bei denen die Mittelrippe entfernt worden war, wurden mit 0,2 g Polyvinylpolypyrrolidon und 11 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (TNE) in einen Dounce-Homogenisator gegeben und gründlich gemahlen. Die Suspension wurde durch eine 20-sekündige Behandlung mit einem Brinkman Polytron-Homogenisator, der bei Einstellung 7 betrieben wurde, weiter homogenisiert. Die sich ergebenden Suspensionen wurden 20 min bei 4°C bei 16000 U/min in einer Dupont-Sorvall-Superspeed-Zentrifuge unter Verwendung eines SS34-Rotors zur Entfernung der partikulären Stoffe zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, das Volumen wurde gegebenenfalls durch TNE auf 10 ml aufgefüllt und es wurden 8 ml kaltes, gesättigtes Ammoniumsulfat zugefügt. Das Gemisch wurde 30 min auf Eis gestellt und wie vorstehend beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet, das das AKIII-Protein enthielt, wurde in 1 ml TNE resuspendiert und mittels einer Passage über eine Sephadex G-25 M-Säule (Säule PD-10, Pharmacia) entsalzt.
Zur immunologischen Charakterisierung wurden drei Volumen Extrakt mit 1 Volumen 4 X SDS-Gel-Probenpuffer (0,17 M Tris-HCl, pH 6,8, 6,7% SDS, 16,7% β-Mercaptoethanol, 33% Glycerol) gemischt und 3 μl von jedem Extrakt wurden pro Spur auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel laufen lassen, wobei bakteriell produzierte AKIII als ein Größenstandard und das aus nicht transformierten Tabakblättern extrahierte Protein als eine negative Kontrolle diente. Die Proteine wurden dann elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran geblottet (Western Blot). Die Membranen wurden den AKIII-Antikörpern ausgesetzt, die wie in Beispiel 2 beschrieben bei einer Verdünnung des Kaninchenserums von 1:5000 unter Verwendung des von BioRad mit ihrem Immun-Blot-Kit bereitgestellten Standardprotokolls hergestellt wurden. Nach dem Spülen zum Entfernen des ungebundenen Primärantikörpers wurden die Membranen dem Sekundärantikörper, Esel-Antikaninchen-Ig konjugiert an Meerrettichperoxidase (Amersham), bei einer Verdünnung von 1:3000 hergestellt. Nach dem Spülen zum Entfernen des ungebundenen Sekundärantikörpers, wurden die Membranen dem Amersham Chemilumineszenz-Reagens und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Sieben von dreizehn Transformanten, die das chimäre Gen, 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' enthalten und dreizehn von siebzehn Transformanten, die das chimäre Gen, 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3' enthalten, produzierten das AKIII-Protein (Tabelle 2). In allen Fallen wies Protein, das mit dem AKIII-Antikörper reagierte, mehrere Größen auf. Es waren in allen Proben ca. gleiche Mengen der Proteine von gleicher Größe zu in E. coli produziertem AKIII und ein Protein, das ca. 6 kD größer war, evident, was darauf hindeutete, dass das Chloroplasten-Targetingsignal aus ca. der Hälfte des synthetisierten Proteins entfernt worden war. Dies deutet weiter darauf hin, dass ca. die Hälfte des Proteins in den Chloroplast eindrang. Außerdem wurde eine erhebliche Proteinmenge mit einem höheren Molekulargewicht beobachtet. Die Herkunft dieses Proteins ist unklar; die vorliegende Gesamtmenge war gleich oder geringgradig höher als die Mengen der maturen und putativen AKIII-Vorläuferproteine in Kombination.
Die Blattextrakte wurden wie in Beispiel 2 beschrieben auf AK-Aktivität untersucht. Wenn sie vorlag, konnte die AKIII- von der endogenen AK-Aktivität durch ihre erhöhte Resistenz gegen Lysin plus Threonin unterschieden werden. Leider war dieser Assay jedoch nicht empfindlich genug, um AKIII-Aktivität in diesen Extrakten zuverlässig nachzuweisen. Null von vier Transformanten, die das chimäre Gen, 35S-Promotor/Cab-Leader/lysA/Nos-3', enthielten, wiesen AKIII-Aktivität auf. Nur ein Extrakt von einem Transformanten, der das Gen, 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' enthielt, produzierte einen überzeugenden Enzymaktivitätsspiegel. Dieser kam vom Transformanten 546-49A und stellte auch den Extrakt dar, der den höchsten AKIII-M4-Proteinspiegel mithilfe des Western Blot aufwies.
Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Expression des aktiven AKIII-Enzyms bestand in der Bewertung der Empfindlichkeit oder Resistenz von Blattgewebe gegen hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin. Das Wachstum der Zellkulturen und Keimpflanzen von vielen Pflanzen wird durch hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin inhibiert; dies wurde durch das Zufügen von Methionin (oder Homoserin, das in vivo in Methionin umgewandelt wird) umgekehrt. Es wird angenommen, dass sich die Inhibition von Lysin plus Threonin aus der Feedback-Inhibition von endogenem AK ergibt, das den Fluss durch die Bahn reduziert, was zu einer Verarmung an Methionin führt. Beim Tabak gibt es zwei AK-Enzyme in den Blättern, ein Lysin-empfindliches und ein Threonin-empfindliches [Negrutui et al. (1984) Theor. Appl. Genet. 68: 11–20). Hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin inhibieren das Wachstum von Sprossen aus den Tabakblattscheiben, und die Inhibition wurde durch das Zufügen geringer Methionin-Konzentrationen umgekehrt. Folglich ist die Wachstumsinhibition vermutlich auf die Inhibition der beiden AK-Isozyme zurückzuführen.
Es wurde vorhergesagt, dass die Expression von aktivem Lysin und Threonin unempfindlichem AKIII-M4 die Wachstumsinhibition umkehren würde. Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, wurde dies beobachtet. Es besteht faktisch eine gute Korrelation zwischen dem exprimierten AKIII-M4-Proteinspiegel und der Resistenz gegenüber der Lysin- plus Threonin-Inhibition. Die Expression von Lysin-empfindlichem Wildtyp-AKIII weist keine ähnliche Wirkung auf. Nur der Transformant mit der höchsten Expression zeigte jedwede Resistenz gegen die Lysin- plus Threonininhibition, und diese war viel weniger ausgeprägt als die mit AKIII-M4 beobachtete.

Zum Messen der freien Aminosäurezusammensetzung der Blätter wurden die freien Aminosäuren wie folgt extrahiert. Ca. 30–40 mg junges Blattgewebe wurden mit einem Rasiermesser zerkleinert und in 0,6 ml Methanol/Chloroform/Wasser gebracht, das in einem Verhältnis von of 12 v/5 v/3 v (MCW) auf Trockeneis gemischt wurde. Nach 10–30 min wurden die Suspensionen auf Raumtemperatur gebracht und mit einem nachladbaren Homogenisator-Handgerät, Omni 1000, homogenisiert und dann 3 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Ca. 0,6 ml des Überstands wurden dekantiert und dem Pellet wurden zusätzlich 0,2 ml MCW zugefügt, das dann wie vorstehend gevortext und zentrifugiert wurde. Der zweite Überstand, ca. 0,2 ml, wurde dem ersten zugefügt. Diesem wurden 0,2 ml Chloroform zugefügt, gefolgt von 0,3 ml Wasser. Das Gemisch wurde gevortext und dann ca. 3 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert, die obere wässrige Phase, ca. 1,0 ml, wurde entfernt und wurde in einem Savant Speed Vac Concentrator eingetrocknet. Einzehntel der Probe wurde auf einem Beckman Aminosäureanalysator, Modell 6300, unter Verwendung einer Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion laufen lassen. Die relativen Spiegel von freien Aminosäuren den Blättern wurden als die Verhältnisse von Lysin oder Threonin zu Leucin verglichen, wobei Leucin folglich als ein interner Standard verwendet wurde. Es bestand keine konsistente Wirkung der Expression von AKIII oder AKIII-M4 auf die Lysin- oder Threoninspiegel (oder die von jedweden anderen Aminosäuren) in den Blättern (Tabelle 2). TABELLE 2 BT542-Transformanten: 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' BT545-Transformanten: 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3' BT546-Transformanten: 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' BT547-Transformanten: 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC/Nos-3'

	FREIE AMINOSÄURE/BLATT			AKIIIAKTIVITÄT	WESTERN	RESISTENZ gegen LYS 3 MM + THR
LINIE	K/L	T/L	U/mg/h	BLOT	3 MM
542-5B	0,5	3,5	0	–	–
542-26A	0,5	3,3	0	–	–
542-27B	0,5	3,4	0	++	+++
542-35A	0,5	4,3	0,01	–	–
542-54A	0,5	2,8	0	–	–
542-57B	0,5	3,4	0	–	+
545-5A	n. d.	n. d.	0,02	++
545-7B	0,5	3,4	0	+
545-17B	0,6	2,5	0,01	+
545-27A	0,6	3,5	0	++
545-50E	0,6	3,6	0,03	++
545-52A	0,5	3,6	0,02	–
546-4A	0,4	4,5	0	+	+
546-24B	0,6	4,9	0,04	++	++
546-44A	0,5	6,0	0,03	+	++
546-49A	0,7	7,0	0,10	+++	+++
546-54A	0,5	6,4	0	+	+
546-56B	0,5	4,4	0,01	–	–
546-58B	0,6	8,0	0	+	++
547-3D	0,4	5,4	0	++	–
547-8B	0,6	5,0	0,02	–
547-9A	0,5	4,3	0,03	+++
547-12A	0,7	3,9	0	+++	+
547-15B	0,6	4,5	0	+	–
547-16A	0,5	3,6	0	++
547-18A	0,5	4,0		+++	–
547-22A	0,8	4,4		–
547-25C	0,5	4,3		+	–
547-28C	0,6	5,6		–
547-29C	0,5	3,8		+++	+

BEISPIEL 8
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN PHASEOLIN-PROMOTOR/lysC
Die chimären Genkassetten, Phaseolin-Promoter/lysC, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/phaseolin-3'-Region (Beispiel 6), wurden als ca. 3,3 kb große Hind III-Fragmente isoliert. Diese Fragmente wurden in den einzigartigen Hind III-Ort des binären Vektors pZS97 (3) insertiert, wobei sich pBT548 bzw. pBT549 ergab. Dieser Vektor ist ähnlich dem in Beispiel 7 beschriebenen pZS97K, außer für die Anwesenheit von zwei zusätzlichen einzigartigen Klonierungsstellen, Sma I und Hind III, und dem bakteriellen β-Lactamase-Gen (ruft Ampicillin-Resistenz hervor) als ein selektierbarer Marker für das transformierte A. tumefaciens anstelle des bakteriellen Neomycin-Phosphotransferase-Gens.
Die binären Vektoren, die die chimären lysC-Gene enthalten, wurden durch „Triparental Matings" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 transferiert, die Agrobacterium-Transformanten wurden zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendet und transgene Pflanzen durch die in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
Zum Bestimmen der chimären Gene in den Samen der transformierten Pflanzen auf Expression, wurde den Pflanzen erlaubt zu blühen, sich selbst zu bestäuben und in Samen zu schießen. Die Gesamtproteine wurden aus maturen Samen wie folgt extrahiert. Ca. 30–40 mg Samen wurden in ein 1,5 ml fassendes Kunststoff-Mikrofugenröhrchen zur einmaligen Verwendung gegeben und in 0,25 ml 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2 mM EDTA, 1% SDS, 1% β-Mercaptoethanol zermahlen. Das Mahlen wurde unter Verwendung eines motorisierten Mahlwerks mit Kunststoffspindeln zur einmaligen Verwendung, die so ausgelegt waren, dass sie in das Mikrofugenröhrchen passen, durchgeführt. Die sich ergebenden Suspensionen wurden 5 min bei Raumtemperatur in einer Mikrofuge zum Entfernen partikulärer Stoffe zentrifugiert. Drei Volumen des Extrakts wurden mit 1 Volumen des 4x SDS-Gel-Probenpuffers (0,17 M Tris-HCl, pH 6,8, 6,7% SDS, 16,7% β-Mercaptoethanol, 33% Glycerol) gemischt und 5 μl von jedem Extakt wurden pro Spur auf einem SDS-Polyacrylamidgel mit bakteriell hergestelltem AKIII, das als ein Größenstandard dient und aus nicht transformierten Tabaksamen extrahiertes Protein, das als negative Kontrolle dient, laufen lassen. Die Proteine wurden dann elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran geblotted. Die Membranen wurden gegenüber den AKIII-Antikörpern (die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurden) bei einer Verdünnung des Kaninchenserums von 1:5000 unter Verwendung eines Standardprotokolls das von BioRad mit ihrem Immun-Blot-Kit bereitgestellt wurde, ausgesetzt. Nach dem Spülen zur Entfernung von ungebundenem Primärantikörper wurden die Membranen dem Sekundärantikörper, Esel-Antikaninchen-Ig konjugiert an Meerrettichperoxidase (Amersham), bei einer Verdünnung von 1:3000 ausgesetzt. Nach dem Spülen zur Entfernung von ungebundenem sekundärem Antikörper wurden die Membranen dem Amersham Chemilumineszenz-Reagens und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Zehn von elf Transformanten, die das chimäre Gen enthalten, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC/Phaseolin-3'-Region und zehn von elf Transformanten, die das chimäre Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region, enthalten, produzierten das AKIII-Protein (Tabelle 3). In allen Fällen bestand das Protein, das mit dem AKIII-Antikörper reagierte, aus mehreren Größen. Ungefähr gleiche Mengen an Proteinen, von gleicher Größe zu in E. coli produziertem AKIII und ca. 6 kD größer waren in allen Proben evident, was darauf hindeutet, dass das Chloroplasten-Targetingsignal von ca. der Hälfte des synthetisierten Proteins entfernt wurde. Dies deutet weiter darauf hin, dass ca. die Hälfte des Proteins in den Chloroplast eindrang. Zusätzlich wurden einige Proteine mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet, die wahrscheinlich Abbauprodukte des AKIII-Polypeptids darstellten.
Zum Messen der Zusammensetzung freier Aminosäuren der Samen wurden die freien Aminosäuren aus maturen Samen wie folgt extrahiert. Ca. 30–40 mg Samen und eine ca. gleiche Menge an sterilisiertem Sand wurden in ein 1,5 ml fassendes Kunststoff-Mikrofugenröhrchen zur einmaligen Verwendung zusammen mit 0,2 ml Methanol/Chloroform/Wasser gegeben, das in einem Verhältnis von 12 v/5 v/3 v (MCW) bei Raumtemperatur gemischt wurde. Die Samen wurden unter Verwendung einer motorisierten Mühle mit Kunststoffschäften zur einmaligen Verwendung, die so ausgelegt sind, dass sie in das Mikrofugenröhrchen passen, zermahlen. Nach dem Mahlen wurden zusätzliche 0,5 ml MCW zugefügt, das Gemisch wurde gevortext und dann ca. 3 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Ca. 0,6 ml Überstand wurden dekantiert und zusätzliche 0,2 ml MCW wurden dem Pellet zugefügt, das dann wie vorstehend gevortext und zentrifugiert wurde. Der zweite Überstand, ca. 0,2 ml, wurde dem ersten zugefügt. Diesem wurden 0,2 ml Chloroform zugefügt, gefolgt von 0,3 ml Wasser. Das Gemisch wurde gevortext und dann ca. 3 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert, die obere wässrige Phase, ca. 1,0 ml, wurde entfernt und wurde in einem Savant Speed Vac Concentrator ausgetrocknet. Die Proben wurden in 6 N Salzsäure, 0,4% β-Mercaptoethanol unter Stickstoff 24 h bei 110–120°C hydrolysiert; ¼ der Probe wurde auf einem Beckman Aminosäureanalysator, Modell 6300, unter Verwendung einer Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion laufen lassen. Die Spiegel von relativ freier Aminosäure in den Samen wurden als Verhältnisse von Lysin, Methionin, Threonin oder Isoleucin zu Leucin verglichen, wobei folglich Leucin als ein interner Standard verwendet wurde.
Zum Messen der Zusammensetzung der Gesamtaminosäuren der Samen wurden 6 Samen in 6 N Salzsäure, 0,4% β-Mercaptoethanol unter Stickstoff 24 h bei 110–120°C hydrolysiert; 1/10 der Probe wurde auf einem Beckman Aminosäureanalysator, Modell 6300, unter Verwendung einer Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion laufen lassen. Die Spiegel der relativen Aminosäure in den Samen wurden als Verhältnisse von Lysin, Methionin, Threonin oder Isoleucin zu Leucin verglichen, wobei folglich Leucin als ein interner Standard verwendet wurde. Da sich das Transgen in dieser selbstbestäubenden Nachkommenschaft des primären Transformanten segregierte und nur sechs Samen analysiert wurden, wurde erwartet, dass einige Samplingfehler auftreten würden. Deshalb wurde die Messung für einige der Linien mehrmals wiederholt (Tabelle 3).

Die Expression des cts/lysC-Gens in den Samen führte zu einer 2- bis 4-fachen Steigerung des Spiegels von freiem Threonin in den Samen und eine 2- bis 3-fache Zunahme des Spiegels des freien Lysins in einigen Fällen. Es bestand eine gute Korrelation zwischen Transformanten, die höhere Spiegel von AKIII-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel von freiem Threonin aufweisen, dies war jedoch für Lysin nicht der Fall. Diese relativ kleinen Zunahmen von freiem Threonin oder Lysin waren nicht ausreichend, um nachweisbare Steigerungen der Spiegel von Gesamtthreonin oder -lysin in den Samen zu ergeben. Die Expression des cts/lysC-M4-Gens in den Samen, führte zu einer 4- bis 23-fachen Steigerung des Spiegels von freiem Threonin in den Samen und einer 2- bis 3-fachen Steigerung des Spiegels von freiem Lysin in einigen Fällen. Es bestand eine gute Korrelation zwischen Transformanten, die höhere Spiegel des AKIII-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel von freiem Threonin aufweisen, dies war jedoch wiederum für Lysin nicht der Fall. Die größeren Zunahmen von freiem Threonin waren ausreichend, um nachweisbare Steigerungen der Spiegel von Gesamtthreonin in den Samen zu ergeben. Sechzehn bis fünfundzwanzig Prozent Zunahmen des Gesamtthreoningehalts der Samen wurden in drei Linien beobachtet, bei denen mehrmals Stichproben genommen wurden. (Zum Vergleich werden die Verhältnisse von Isoleucin zu Leucin gezeigt.) Die Linien, die erhöhtes Gesamtthreonin zeigten, waren die gleichen, die die höchsten Grade der Zunahme des freien Threonins und eine hohe Expression des AKIII-M4-Proteins aufwiesen. Aus diesen Ergebnissen kann bestimmt werden, dass freies Threonin ca. 1% des in einem normalen Tabaksamen vorliegenden Gesamtthreonins, aber ca. 18% des in Samen vorliegenden Gesamtthreonins darstellt, der hohe Spiegel von AKIII-M4 exprimiert. TABELLE 3 BT548-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC/Phaseolin-3' BT549-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'

LINIE	SAMEN: FREIE AMINOSÄURE			SAMEN: GESAMTAMINOSÄURE			Western
LINIE	K/L	T/L	I/L	K/L	T/L	I/L	Western
NORMAL	0,49	1,34	0,68	0,35	0,68	0,63	–
548-2A	1,15	2,3	0,78	0,43	0,71	0,67	+
548-4D	0,69	5,3	0,80	0,35	0,69	0,65	+++
548-6A	0,39	3,5	0,85	0,35	0,69	0,64	+
548-7A	0,82	4,2	0,83	0,36	0,68	0,65	++
548-14A	0,41	3,1	0,82	0,32	0,67	0,65	+
548-18A	0,51	1,5	0,69	0,37	0,67	0,63	–
548-22A	1,41	2,9	0,75	0,47	0,74	0,65	+++
548-24A	0,73	3,7	0,81	0,38	0,68	0,65	++
548-41A	0,40	2,8	0,77	0,37	0,68	0,65	+
548-50A	0,46	4,0	0,81	0,33	0,68	0,65	+
548-57A	0,50	3,8	0,80	0,33	0,67	0,65	++
549-5A	0,63	5,9	0,69	0,32	0,65	0,65	+
549-7A	0,51	8,3	0,78	0,33	0,67	0,63	++
549-20A	0,67	30	0,88	0,38*	0,82*	0,65*	++++
549-34A	0,43	1,3	0,69	0,32	0,64	0,63	–
549-39D	0,83	16	0,83	0,35	0,71	0,63	+++
549-40A	0,80	4,9	0,74	0,33	0,63	0,64	+
549-41C	0,99	13	0,80	0,38*	0,79*	0,65*	+++
549-46A	0,48	7,7	0,84	0,34	0,70	0,64	+
549-52A	0,81	9,2	0,80	0,39	0,70	0,65	++
549-57A	0,60	15	0,77	0,35*	0,85*	0,64*	+++
549-60D	0,85	11	0,79	0,37	0,73	0,65	++

Normal wurde als der Durchschnitt von 6 Proben für freie Aminosäure und 23 Proben für Gesamtaminosäuren berechnet.

* Zeigt den Durchschnitt von mindestens 5 Proben an

Samen, die sich von der Selbstbestäubung von zwei mit der Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region transformierten Pflanzen, Pflanzen 549-5A und 549-40A, herleiten, zeigten 3 Kanamycin-resistente Keimpflanzen zu 1 Kanamycin-empfindlichen Keimpflanze, was indikativ für eine einzelne Insertionsstelle des Transgens ist. Die Pflanzennachkommenschaft wurde gezüchtet, selbstbestäubt, und der Samen wurde auf Segregation des Kanamycin-Markergens analysiert. Die Pflanzennachkommenschaft, die für das Transgen-Insert homozygot war, enthielt folglich zwei Kopien der Genkassette, akkumulierte ca. 2-mal so viel Threonin in ihrem Samen wie ihre heterozygote Geschwisternachkommenschaft mit einer Kopie der Genkassette und ca. 8-mal so viel wie Samen ohne das Gen. Dies gibt zu erkennen, dass der Expressionsspiegel des E. coli-Enzyms die Akkumulation des freien Threonins kontrolliert.
BEISPIEL 9
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN 35S-PROMOTOR/ecodapA
Die chimären Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/ecodapA/Nos-3' und 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' wurden als 3,1 bzw. 3,3 kb große BamH I-Sal I-Fragmente isoliert und in den mit BamH I-Sal I verdauten binären Vektor pZS97K insertiert (2), wobei sich die Plasmide pBT462 bzw. pBT463 ergaben. Der binäre Vektor ist in Beispiel 7 beschrieben.
Die binären Vektoren, die die chimären ecodapA-Gene enthalten, wurden durch „Triparental Matings" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404, die Agrobacterium-Transformanten, die zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendet werden, transferiert und die sich ergebenden transgenen Pflanzen durch die in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
Zur Bestimmung auf Expression der chimären Gene in Blättern transformierter Pflanzen wurde das Protein, wie in Beispiel 7 beschrieben, mit den folgenden Modifikationen extrahiert. Der Überstand aus der ersten Ammoniumsulfat-Präzipitation, ca. 18 ml, wurde mit zusätzlichen 12 ml von kaltem, gesättigtem Ammoniumsulfat gemischt. Das Gemisch wurde 30 min auf Eis gestellt und wie in Beispiel 7 beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das DHDPS-Protein enthaltende Pellet wurde in 1 ml TNE resuspendiert und mittels Passage über eine Sephadex G-25 M-Säule (Säule PD-10, Pharmacia) entsalzt.
Die Blattextrakte wurden wie in Beispiel 4 beschrieben auf DHDPS-Aktivität bestimmt E. coli-DHDPS konnte von der DHDPS-Aktivität von Tabak durch ihre erhöhte Resistenz gegen Lysin unterschieden werden; E. coli-DHDPS behielt 80–90% ihrer Aktivität bei 0,1 mM Lysin bei, während Tabak-DHDPS bei dieser Lysinkonzentration vollkommen unhibiert wurde. Einer von zehn Transformanten, die das chimäre Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/ecodapA/Nos-3' enthalten, zeigten DHDPS-Expression von E. coli, während fünf von zehn Transformanten, die das chimäre Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' enthielten, DHDPS-Expression von E. coli zeigten.
Freie Aminosäuren wurden, wie in Beispiel 7 beschrieben, aus Blättern extrahiert. Die Expression des chimären Gens 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3', aber nicht des 35S-Promotor/Cab-Leader/ecodapA/Nos-3' führte zu erheblichen Steigerungen des Spiegels von freiem Lysin in den Blättern. Es wurden Spiegel von freiem Lysin beobachtet, die um das 2- bis 90fache höher als nicht transformierter Tabak waren.
Den transformierten Pflanzen wurde erlaubt zu blühen, sich selbst zu bestäuben und in Samen zu schießen. Die Samen von mehreren Linien, die mit dem 35S-Promoter/Cab-leader/cts/ecodapA/Nos-3'-Gen transformiert wurden, wurden Oberflächen-sterilisiert und keimten auf Agarplatten in der Anwesenheit von Kanamycin. Linien, die 3 Kanamycin-resistente Keimpflanzen zu 1 Kanamycin-empfindlichen Keimpflanze zeigten, die Indikativ für eine einzelne Insertionsstelle der Transgene sind, wurden identifiziert. Die Nachkommenschaft, die für das Transgen-Insert homozygot war, wurde aus diesen Linien unter Verwendung der genetischen Standardanalyse erhalten. Die homozygote Nachkommenschaft wurde dann auf Expression von E. coli-DHDPS in jungen und maturen Blättern und für die Blätter charakterisiert, die Spiegel freier Aminosäuren in jungen und maturen Blättern und in maturen Samen akkumulierten.

Die Expression von aktivem DHDPS-Enzym von E. coli war sowohl in jungen als auch maturen Blättern der homozygoten Nachkommenschaft der Transformanten deutlich evident (Tabelle 4). Hohe Spiegel von freiem Lysin, die um das 50- bis 100fache höher als für normale Tabakpflanzen waren, akkumulierten sich in den jungen Blättern der Pflanzen, eine viel kleinere Akkumulation von freiem Lysin (2- bis 8fach) wurde jedoch in den größeren Blättern festgestellt. Experimente, in denen das Lysin im Phloem gemessen wird, geben zu erkennen, dass Lysin aus den großen Blättern exportiert wird. Dieses exportierte Lysin kann zur Akkumulation von Lysin in den kleinen wachsenden Blättern beitragen, von denen bekannt ist, das sie Nährstoffe aufnehmen anstelle sie zu exportieren. Da die größeren Blätter den Hauptanteil der Biomasse der Pflanze ausmachen, wird die gesteigerte Gesamtakkumulation von Lysin in die Pflanze mehr durch den Spiegel des Lysins in den großen Blättern beeinflusst. Es wurde keine Wirkung auf die Spiegel des freien Lysins in den Samen dieser Pflanzen beobachtet (Tabelle 4). TABELLE 4 Nachkommen der BT463-Transformanten, die für 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' homozygot sind

LINIE	BLATTGRÖSSE	FREIE AMINOSÄURE IM BLATT		E. COLI-DHDPS	FREIE AMINOSÄURE IM SAMEN
LINIE	BLATTGRÖSSE	K/L	K/TOT	OD/60'/mg	K/L
NORMAL	3 in.	0,5	0,006	0	0,5
463-18C-2	3 in.	47	0,41	7,6	0,4
463-18C-2	12 in.	1	0,02	5,5	–––
463-25A-4	3 in.	58	0,42	6,6	0,4
463-25A-4	12 in.	4	0,02	12,2	–––
463-38C-3	3 in.	28	0,28	6,1	0,5
463-38C-3	12 in.	2	0,04	8,3	–––

BEISPIEL 10
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN PHASEOLIN-PROMOTOR/ecodapA
Die chimären Genkassetten, Phaseolin-5'-Region/ecodapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region (Beispiel 6), wurden als ca. 2,6 bzw. 2,8 kb große Hind III-Fragmente isoliert. Diese Fragmente wurden in den einzigartigen Hind III-Ort des binären Vektors pZS97 insertiert (3), wobei sich pBT506 bzw. pBT534 ergaben. Dieser Vektor ist in Beispiel 8 beschrieben.
Die binären Vektoren, die die chimären ecodapA-Gene enthalten, wurden durch „Triparental Matings" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 transferiert, die Agrobacterium-Transformanten zur Inokulation von Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden transgenen Pflanzen wurden mittels in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
Zur Bestimmung der chimären Gene auf Expression wurde den transformierten Pflanzen erlaubt zu blühen, sich selbst zu bestäuben und in Samen zu schießen. Die Gesamtproteine im Samen wurden wie in Beispiel 8 beschrieben extrahiert und wie in Beispiel 7 beschrieben, mit der folgenden Modifikation immunologisch analysiert. Die Western Blot-Membranen wurden den DHDPS-Antikörpern ausgesetzt, die in Beispiel 4 bei einer Verdünnung des Kaninchenserums von 1:5000 unter Verwendung des von BioRad mit ihrem Immun-Blot-Kit bereitgestellten Standardprotokolls hergestellt.
Dreizehn von vierzehn Transformanten, die das chimäre Gen Phaseolin-5'-Region/ecodapA/Phaseolin-3'-Region enthalten und neun von dreizehn Transformanten, die das chimäre Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region enthalten, produzierten das über das Western-Blotting nachweisbare DHDPS-Protein (Tabelle 3). Protein, das mit dem DHDPS-Antikörper reagierte, bestand aus mehreren Größen. Der größte Teil des Proteins war von gleicher Größe wie das in E. coli produzierte DHDPS, ungeachtet ob das chimäre Gen die Chloroplast-Transitsequenz einschloss oder nicht. Dies deutete darauf hin, dass das Chloroplasten-Targetingsignal effizient am dem synthetisierten Vorläuferprotein entfernt wurde. Dies deutet weiter darauf hin, dass der größte Teil des Proteins in den Chloroplast eindringt. Außerdem wurden einige Proteine mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet, die wahrscheinlich Abbauprodukte des DHDPS-Polypeptids darstellen.
Zum Messen der Zusammensetzung der freien Aminosäuren und der Zusammensetzung der Gesamtaminosäuren der Samen wurden die freien Aminosäuren und Gesamtaminosäuren aus maturen Samen extrahiert und wie in Beispiel 8 beschrieben extrahiert. Die Expression von entweder dem ecodapA-Gen oder cts/ecodapA hatte keine Wirkung auf die Zusammensetzung des Gesamtlysins oder -threonins der Samen in jedweder der transformierten Linien (Tabelle 5). Mehrere der Linien, die mit dem chimären Gen Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3' transformiert wurden, wurden auch auf jedwede Wirkung auf die Zusammensetzung der freien Aminosäuren getestet. Es wurde wiederum keine selbst mittelgradige Wirkung auf die Zusammensetzung des Lysins oder Threonins der Samen in Linien beobachtet, selbst nicht auf die, die hohe Spiegel DHDPS-Protein von E. coli exprimieren (Tabelle 5). Hierbei handelte es sich um ein überraschendes Ergebnis, wenn man von der ausgeprägten Wirkung (beschrieben in Beispiel 9) ausgeht, die die Expression dieses Proteins auf die Spiegel des freien Lysins in Blättern ausübt.
Eine mögliche Erklärung hierfür bestand darin, dass das über den Western Blot beobachtete DHDPS-Protein nicht funktionell war. Zum Testen dieser Hypothese wurden die Gesamtproteinextrakte aus maturen Samen hergestellt und auf DHDPS-Aktivität bestimmt. Ca. 30–40 mg Samen wurden in ein 1,5 ml fassendes Kunststoff-Mikrofugenröhrchen zur einmaligen Verwendung gegeben und in 0,25 ml 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (TNE) zermahlen. Das Mahlen wurde unter Verwendung eines motorisierten Mahlwerks mit Kunststoffspindeln zur einmaligen Verwendung, die so ausgelegt sind, dass sie in das Mikrofugenröhrchen passen, durchgeführt. Die sich ergebenden Suspensionen wurden 5 min bei Raumtemperatur in einer Mikrofuge zum Entfernen der partikulären Stoffe zentrifugiert. Ca. 0,1 ml eines wässrigen Überstands wurden zwischen dem pelletierten Material und der oberen Ölphase entfernt. Die Samenextrakte wurden wie in Beispiel 4 beschrieben auf DHDPS-Aktivität untersucht. E. coli-DHDPS konnte auf Grund ihrer erhöhten Resistenz gegen Lysin von der DHDPS-Aktivität des Tabaks unterschieden werden; E. coli-DHDPS behielt bei ca. 0,4 mM Lysin ca. 50% ihrer Aktivität bei, während Tabak-DHDPS bei dieser Lysinkonzentration vollkommen inhibiert war. Hohe Grade der DHDPS-Aktivität von E. coli wurden in allen vier Samenextrakten gesehen, die zur Eliminierung dieser Erklärung getestet wurden.
Die Anwesenheit der cts-Sequenz im chimären ecodapA-Gen war zum Herbeiführen der Akkumulation hoher Lysinspiegel in Blättern wesentlich. Folglich bestand eine andere mögliche Erklärung darin, dass die cts-Sequenz irgendwie während der Insertion des chimären Gens Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3' in den binären Vektor verloren ging. Die PCR-Analyse mehrerer der transformierten Linien wies jedoch auf die Anwesenheit der cts-Sequenz hin, wodurch diese Möglichkeit jedoch ausgeschlossen wurde.
Eine dritte Erklärung bestand darin, dass Aminosäuren in der Regel nicht in Samen synthetisiert werden und deshalb die anderen Enzyme in der Bahn in den Samen nicht anwesend waren. Die Ergebnisse der in Beispiel 8 vorgelegten Experimente, worin die Expression des Gens Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' zur Akkumulation hoher Spiegel von freiem Threonin in Samen führte, deuteten darauf hin, dass dies nicht der Fall ist.

Zusammengenommen geben diese Ergebnisse und die in Beispiel 9 vorgelegten Ergebnisse zu erkennen, dass die Expression einer Lysin-unempfindlichen DHDPS in entweder Samen oder Blättern nicht ausreicht, um eine Akkumulation von gesteigertem freiem Lysin in Samen zu erlangen. TABELLE 5 BT506-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/ecodapA/Phaseolin-3' BT534-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'

LINIE	SAMEN: FREIE AMINOSÄUREN		SAMEN: GESAMTAMINOSÄUREN		E. COLI-DHDPS	Western
LINIE	K/L		K/L	T/L	OD/60'/mg	Western
NORMAL	0,49	1,34	0,35	0,68
506-2B			0,34	0,66		+
506-4B			0,33	0,67		+
506-16A			0,34	0,67		+
506-17A			0,36	0,55	7,7	+++
506-19A			0,37	0,45		++
506-22A			0,34	0,67		++
506-23B			0,35	0,67		++
506-33B			0,34	0,67		++
506-38B			0,36	0,69	8,7	+++
506-39A			0,37	0,70		++
506-40A			0,36	0,68		–
506-47A			0,32	0,68		+++
506-48A			0,33	0,69		+++
506-49A			0,33	0,69		+++
534-8A			0,34	0,66		–
534-9A			0,36	0,67		++
534-22B	0,43	1,32	0,39	0,51	4,9	+++
534-31A			0,34	0,66		–
534-38A	0,35	1,49	0,42	0,33		+++
534-39A			0,38	0,69		+
534-7A			0,34	0,67		+++
534-25B			0,35	0,67		+++
534-34B	0,80	1,13	0,42	0,70		–
534-35A	0,43	1,18	0,33	0,67		+++
534-37B	0,42	1,58	0,37	0,68		–
534-43A			0,35	0,68		+++
534-48A	0,46	1,24	0,35	0,68	6,2	+++

BEISPIEL 11
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN 35S-PROMOTOR/cts/dapA PLUS 35S-PROMOTOR/cts/lysC-M4
Die chimären Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' und 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' wurden im binären Vektor pZS97K kombiniert (2). Der binäre Vektor ist in Beispiel 7 beschrieben. Es wurde ein Oligonukleotid-Adapter zur Umwandlung des BamH I-Ortes am 5'-Ende des chimären Gens 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' (siehe 1) in einen EcoR I-Ort synthetisiert. Das chimäre Gen 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' wurde dann als ein 3,6 kb großes EcoR I-Fragment aus dem Plasmid pBT540 (Beispiel 6) isoliert und in pBT463 (Beispiel 9), das mit EcoR I verdaut wurde, insertiert, wobei sich Plasmid pBT564 ergab. Dieser Vektor weist sowohl die chimären Gene 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' als auch 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' auf, die in der gleichen Orientierung insertiert sind.
Der binäre Vektor, der die chimären Gene ecodapA und lysC-M4 enthielt, wurde durch „Triparental Matings" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 transferiert, die Agrobacterium-Tranisformanten zur Inokulation von Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden transgenen Pflanzen mittels der in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
Zum Bestimmen der chimären Gene auf Expression in Blättern der transformierten Pflanzen, wurde das Protein wie in Beispiel 7 für AKIII und wie in Beispiel 9 für DHDPS beschrieben extrahiert. Die Blattextrakte wurden wie in den Beispielen 4 und 9 beschrieben auf DHDPS-Aktivität untersucht. E. coli-DHDPS konnte mittels ihrer erhöhten Resistenz gegen Lysin von der DHDPS-Aktivität von Tabak unterschieden werden; E. coli-DHDPS behielt 80–90% ihrer Aktivität bei 0,1 mM Lysin bei, während die Tabak-DHDPS bei dieser Konzentration des Lysins vollkommen inhibiert war. Die Extrakte wurden über die in den Beispielen 7 und 10 beschriebenen Western Blots immunologisch auf Expression von AKIII- und DHDPS-Proteinen charakterisiert.
Zehn von zwölf Transformanten exprimierten die DHDPS-Enzymaktivität von E. coli (Tabelle 6).
Es bestand eine gute Korrelation zwischen der Höhe der Enzymaktivität und der immunologisch nachgewiesenen Menge von DHDPS-Protein. Der AK-Assay war, wie in Beispiel 7 beschrieben, zum Nachweis der Enzymaktivität in diesen Extrakten nicht empfindlich genug. Das AKIII-M4-Protein wurde jedoch immunologisch in acht der zwölf Extrakte nachgewiesen. In einigen Transformanten, 564-21A und 47A, bestand eine große Disparität zwischen dem Expressionsspiegel von DHDPS und AKIII-M4, aber in 10 von 12 Linien bestand eine gute Korrelation.

Freie Aminosäuren wurden aus Blättern extrahiert und auf die Aminosäurezusammensetzung wie in Beispiel 7 beschrieben analysiert. In Abwesenheit von signifikanter AKIII-M4, bestimmte der Expressionsspiegel des chimären Gens, 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3', den Grad der Lysinakkumulation (Tabelle 6). Man sollte die Linien 564-21A, 47A und 39C vergleichen, von denen keine signifikant AKIII-M4 exprimiert. Linie 564-21A akkumuliert Ca. um das 10fache höhere Lysinspiegel als die Linie 564-47A, die einen geringeren Spiegel von E. coli-DHDPS exprimiert und um das 40fache höhere Lysinspiegel als 564-39C, die keine E. coli-DHDPS exprimiert. In Transformanten, die alle ähnliche Mengen von E. coli-DHDPS (564-18A, 56A, 36E, 55B, 47A) exprimierten, kontrollierte jedoch der Expressionsspiegel des chimären Gens, 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3', den Grad der Lysinakkumulation. Es ist folglich klar, dass obwohl die Expression von 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' keine Wirkung auf die Spiegel freier Aminosäuren von Blättern ausübt, wenn es allein exprimiert wird (siehe Beispiel 7), kann es die Lysinakkumulation steigern, wenn es zusammen mit dem chimären Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' exprimiert wird. Die Expression dieser Gene zusammen wirkte sich nicht auf die Spiegel von jedweder anderen freien Aminosäure in den Blättern aus. TABELLE 6 BT564-Transformanten: 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/ecodapA/Nos-3' 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3'

LINIE	FREIE AS IM BLATT NMOL/4MG			FREIE AS IM BLATT		E. COLI-DHDPS U/MG/H	WESTERN DHDPS	WESTER N AK-III
	TOT	K	K/L	K/TOT
564-21A	117	57	52	0,49	2,4	+++	+/–
564-18A	99	56	69	0,57	1,1	++	++
564-56A	104	58	58	0,56	1,5	++	++
564-36E	85	17	17	0,20	1,5	++	+++
564-55B	54	5	9,1	0,10	1,0	++	+
564-47A	18	1	4,8	0,06	0,8	++	–
564-35A	37	7	13	0,18	0,3	+	++
564-60D	61	3	4,5	0,06	0,2	+	++
564-45A	46	4	8,1	0,09	0,4	+	+
564-44B	50	1	1,7	0,02	0,1	+/–	–
564-49A	53	1	1,0	0,02	0	+/–	–
564-39C	62	1	1,4	0,02	0	–	–

Freie Aminosäuren wurden aus maturen Samen extrahiert, die sich aus selbstbestäubten Pflanzen herleiteten und wie in Beispiel 8 beschrieben quantifiziert wurden. Es lag kein signifikanter Unterschied im Gehalt freier Aminosäuren von Samen aus nicht transformierten Pflanzen im Vergleich zu denen aus Pflanzen vor, die die höchste Akkumulation von freiem Lysin in Blättern, d. h. den Pflanzen 564-18A, 564-21A, 564-36E und 564-56A zeigten.
BEISPIEL 12
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/ecodapA PLUS PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/lysC-M4
Die chimären Genkassetten, Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' (Beispiel 6), wurden im binären Vektor pZS97 kombiniert (3). Der binäre Vektor ist im Beispiel 8 beschrieben. Um dies zu erlangen, wurde das chimäre Gen Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3' als ein 2,7 kb großes Hind III-Fragment isoliert und in den Hind III-Ort von Vektor pUC1318 [Kay et al (1987) Nucleic Acids Res. 6: 2778] insertiert, wobei sich pBT568 ergab. Es war dann möglich, pBT568 mit BamH I zu verdauen und das chimäre Gen auf einem 2,7 kb großen BamH I-Fragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde in BamH I verdautes pBT549 insertiert (Beispiel 8), wobei sich pBT570 ergab. Dieser binäre Vektor weist beide chimären Gene, Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Gen und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' auf, die in der gleichen Orientierung insertiert sind.
Der binäre Vektor pBT570 wurde durch „Triparental Mating" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 transferiert, der Agrobacterium-Transformanten zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden transgenen Pflanzen mittels in Beispiel 7 dargelegte Verfahren regeneriert.
Zum Bestimmen der chimären Gene auf Expression in den Samen der transformierten Pflanzen wurde den Pflanzen erlaubt zu blühen, sich selbst zu bestäuben und in Samen zu schießen. Die Gesamtproteine wurden aus maturen Samen extrahiert und über die in Beispiel 8 beschriebenen Western Blots analysiert.
Einundzwanzig von fünfundzwanzig Transformanten exprimierten das DHDPS-Protein und neunzehn von diesen exprimierten auch das AKIII-Protein (Tabelle 7). Die Mengen des exprimierten Proteins wurden auf die Zahl der in den Transformanten vorliegenden Genkopien bezogen; die höchsten exprimierenden Linien, 570-4B, 570-12C, 570-59B und 570-23B, wiesen alle zwei oder mehr Insertionsstellen der Genkassette auf bezogen auf die Segregation des Kanamycin-Markergens. Enzymatisch aktive E. coli-DHDPS wurden in maturen Samen von allen getesteten Linien, worin das Protein nachgewiesen wurde, beobachtet.
Zum Messen der Zusammensetzung der freien Aminosäuren der Samen, wurden die freien Aminosäuren aus maturen Samen extrahiert und wie in Beispiel 8 beschrieben extrahiert. Es ergab sich eine gute Korrelation zwischen Transformanten, die höhere Spiegel von sowohl DHDPS- als auch AKIII-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel von freiem Lysin und Threonin aufweisen. Die höchsten Expressionslinien (in Tabelle 7 mit einem Sternchen versehen) zeigten eine bis um das 2fache Steigerung der Spiegel von freiem Lysin und eine bis um das 4fache Steigerung des Spiegels von freiem Threonin in den Samen.

In den Linien mit der höchsten Expression war der Nachweis eines hohen α-Aminoadipinsäure-Spiegels möglich. Von dieser Verbindung ist bekannt, dass es sich um ein Intermediat im Katabolismus von Lysinen in Zerealiensamen handelt, aber aufgrund seines geringen Akkumulationsgrades in der Regel nur über radioaktive Tracer-Experimente nachgewiesen wird. Die Ansammlung hoher Spiegel dieses Intermediats deutet darauf hin, dass in den Samen dieser transformierten Linien eine große Lysinmenge produziert wird, und durch den katabolischen Weg passiert Die Ansammlung von α-Aminoadipinsäure wurde in Transformanten, die nur E. coli-DHDPS oder nur AKIII-M4 in Samen exprimieren, nicht beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass es zur Produktion hoher Spiegel von freiem Lysin notwendig ist, beide Enzyme gleichzeitig zu exprimieren. TABELLE 7 BT570-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region Phaseolin-5'-Region/cts/ecodapA/Phaseolin-3'-Region

LINIE	FREIE AMINOSÄUREN/SAMEN		GESAMTAMINOSÄUREN/SAMEN		WESTE RN E. COLI-DHDPS	WESTE RN E. COLI-AKIII	E. COLI-DHDPS U/mg/hr	NACHKOMMEN KAN^R:KA N^S
LINIE	K/L	T/L	K/L	T/L	WESTE RN E. COLI-DHDPS	WESTE RN E. COLI-AKIII	E. COLI-DHDPS U/mg/hr	NACHKOMMEN KAN^R:KA N^S
NORM
AL	0,49	1,3	0,35	0,68	–	–
570-4B	0,31	2,6	0,34	0,64	+++	++		15:1
570-7C	0,39	2,3	0,34	0,64	++	+
570-8B	0,29	2,1	0,34	0,63	+	–
570-12C*	0,64	5,1	0,36	0,68	++++	++	> 4,3	> 15:1
570-18A	0,33	3,0	0,35	0,65	++	++		15:1
570-240	0,33	2,0	0,34	0,65	++	–
570-37A	0,33	2,1	0,34	0,64	+/–	+/–
570-44A	0,29	2,1	0,34	0,64	++	+
570-46B	0,41	2,1	0,35	0,65	++	+
570-51B	0,33	1,5	0,33	0,64	–	–	0
570-59B*	0,46	3,0	0,35	0,65	+++	+++	2,6	> 15:1
570-80A	0,31	2,2	0,34	0,64	++	+
570-11A	0,28	2,3	0,34	0,67	++	++		3:1
570-17B	0,27	1,6	0,34	0,65	–	–
570-20A	0,41	2,3	0,35	0,67	++	+
570-21B	0,26	2,4	0,34	0,68	++	+
570-23B*	0,40	3,6	0,34	0,68	+++	+++	3,1	63:1
570-25D	0,30	2,3	0,35	0,66	++	+/–
570-26A	0,28	1,5	0,34	0,64	–	–
570-32A	0,25	2,5	0,34	0,67	++	+
570-35A	0,25	2,5	0,34	0,63	++	++		3:1
570-38A-1	0,25	2,6	0,34	0,64	++	++		3:1
570-38A-3	0,33	1,6	0,35	0,63	–	–
570-42A	0,27	2,5	0,34	0,62	++	++		3:1
570-45A	0,60	3,4	0,39	0,64	++	++		3:1

* Zeigt an, dass eine Probe mit freien Aminosäuren α-Aminoadipinsäure aufweist

BEISPIEL 13
VERWENDUNG DES CHIMÄREN GENS cts/lysC-M4 ALS EINEN SELEKTIERBAREN MARKER FÜR DIE TABAKTRANSFORMATION
Das chimäre Gen 35S-Promoter/Cab-Leader/cts/lysC-M4/Nos-3' im binären Vektor pZS97K (pBT542, siehe Beispiel 7) wurde als ein selektierbarer genetischer Marker zur Transformation von Tabak verwendet. Hohe Konzentrationen von Lysin plus Threonin inhibieren das Wachstum von Sprossen aus Tabakblattscheiben. Die Expression von aktivem Lysin und Threonin-unempfindlicher AKIII-M4 kehrt diese Wachstumsinhibition um (siehe Beispiel 7).
Der binäre Vektor pBT542 wurde durch „Triparental Mating" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 transferiert, die zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendeten Agrobacterium-Transformanten und die sich ergebenden transformierten Sprosse wurden auf dem Sprossmedium, das 3 mM Lysin plus 3 mM Threonin enthielt, ausgewählt. Die Sprosse wurden an das Durchwurzelungsmedium, das 3 mM Lysin plus 3 mM Threonin enthielt, transferiert. Die Pflanzen wurden aus den durchwurzelten Sprossen gezüchtet. Die Blattscheiben aus den Pflanzen wurden auf das Sprossmedium, das 3 mM Lysin plus 3 mM Threonin enthielt, gegeben. Transformierte Pflanzen wurden durch die Proliferation der Sprosse, die auf diesem Medium um die Blattscheiben herum auftrat, identifiziert.
BEISPIEL 14
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEM CHIMÄREN GEN 35S-PROMOTOR/cts/cordapA
Das chimäre Gen 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/cordapA/Nos-3' wurde als ein 3,0 kb großes BamH I-Sal I-Fragment isoliert und in einen mit BamH I-Sal I verdauten binären Vektor pZS97K insertiert (2), wobei sich das Plasmid pFS852 ergab. Der binäre Vektor ist in Beispiel 7 beschrieben.
Der binäre Vektor, der das chimäre cordapA-Gen enthält, wurde durch „Triparental Mating" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 transferiert, der Agrobacterium-Transformant wurde zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden transgenen Pflanzen wurden mittels in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
Zum Bestimmen des chimären Gens auf Expression in Blättern der transformierten Pflanzen wurde Protein wie in Beispiel 7 beschrieben mit den folgenden Modifikationen extrahiert. Der Überstand von der ersten Ammoniumsulfat-Präzipitation, ca. 18 ml, wurde mit zusätzlichen 12 ml kaltem, gesättigtem Ammoniumsulfat gemischt. Das Gemisch wurde 30 min auf Eis gestellt und wie in Beispiel 7 beschrieben zentrifugiert Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet, das das DHDPS-Protein enthielt, wurde in 1 ml TNE resuspendiert und mittels Passage über eine Sephadex G-25 M-Säule (Säule PD-10, Pharmacia) entsalzt.
Die Blattextrakte wurden auf DHDPSP-Protein bestimmt und die Enzymaktivität wie in Beispiel 4 beschrieben. Die DHDPS-Enzymaktivität von Corynebacterium konnte von der Tabak-DHDPS-Aktvität durch ihre Unempfindlichkeit gegen die Lysininhibition unterschieden werden. Acht von elf Transformanten zeigten die Expression von Corynebacterium-DHDPS, sowohl über den Western Blot als auch aktives Enzym nachgewiesenes Protein.

Freie Aminosäuren wurden wie in Beispiel 7 beschrieben aus Blättern extrahiert. Die Expression von Corynebacterium-DHDPS, die zu großen Steigerungen des Spiegels von freiem Lysin in den Blättern führte (Tabelle 8). Es bestand jedoch keine gute Korrelation zwischen dem Expressionsgrad von DHDPS und der akkumulierten Menge von freiem Lysin. Spiegel von freiem Lysin, die von 2- bis 50fach höher als die für nicht transformierten Tabak waren, wurden beobachtet. Es trat auch eine 2- bis 2,5fache Steigerung des Spiegels des Gesamtlysins in Blättern in den Linien auf, die hohe Spiegel von freiem Lysin zeigten. TABELLE 8 FS586-Transformanten: 35S-Promotor/Cab-Leader/cts/cordapA/Nos-3'

LINIE	FREIE AMINOSÄUREN/BLATT	GESAMTAMINOSÄUREN/BLATT	WESTERN CORYNE	CORYNE.-DHDPS.
LINIE	K/L	K/L	DHDPS	U/mg/hr
NORMAL	0,5	0,8	–	–
FS586-2A	1,0	0,8	–	–
FS586-4A	0,9	0,8	+	6,1
FS586-11B	3,6	0,8	+	3,4
FS586-11D	26	2,0	+	3,5
FS586-13A	2,4	0,8	+	3,5
FS586-19C	5,1	0,8	+	3,1
FS586-22B	>15	1,5	+	2,3
FS586-30B		0,8	–	–
FS586-38B	18	1,5	++	3,9
FS586-51A	1,3	0,8	–	–
FS586-58C	1,2	0,8	+	5,1

Den Pflanzen wurde erlaubt zu blühen, sich selbst zu bestäuben und in Samen zu schießen. Maturer Samen wurde geerntet und auf die Zuzammensetzung freier Aminosäuren wie in Beispiel 8 beschrieben untersucht. Es bestand kein Unterschied im Gehalt des freien Lysins von den Transformanten im Vergleich zu nicht transformierten Tabaksamen.
BEISPIEL 15
TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN CHIMÄREN GENEN KTI3-PROMOTOR/cts/cordapA ODER PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/cordapA PLUS PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/lysC-M4
Die chimären Genkassetten KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' ebenso wie Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' (Beispiel 6) wurden im binären Vektor pZS97 kombiniert (3). Der binäre Vektor ist in Beispiel 8 beschrieben.
Um dies zu erlangen, wurden die chimären Genkassette KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region als ein 3,3 kb großes BamH I-Fragment isoliert und in mit BamH I verdautes pBT549 insertiert (Beispiel 8), wobei sich pFS883 ergab. Dieser binäre Vektor weist die chimären Gene, KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, die in entgegengesetzten Orientierungen insertiert sind.
Die chimäre Genkassette Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Adapters zur Umwandlung der Hind III-Orte an jedem Ende an die BamH I-Orte modifiziert. Die Genkassette wurde dann als ein 2,7 kb großes BamH I-Fragment isoliert und in mit BamH I verdautes pBT549 insertiert (Beispiel 8), wobei sich pFS903 ergab. Dieser binäre Vektor weist beide chimären Gene, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, die in der gleichen Orientierung insertiert sind.
Die binären Vektoren pFS883 und pFS903 wurden durch „Triparental Mating" an den Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 transferiert, die Agrobacterium-Transformanten wurden zum Inokulieren von Tabakblattscheiben verwendet und die sich ergebenden transgenen Pflanzen wurden durch die in Beispiel 7 dargelegten Verfahren regeneriert.
Zum Bestimmen der chimären Gene auf Expression in Samen der transformierten Pflanzen, wurde den Pflanzen erlaubt zu blühen, sich selbst zu bestäuben und in Samen zu schießen. Die Gesamtproteine wurden aus maturen Samen extrahiert und wie in Beispiel 8 beschrieben über Western Blots analysiert.
Einundzwanzig von 22 getesteten Transformanten exprimierten das DHDPS-Protein und achtzehn dieser exprimierten auch das AKIII-Protein (Tabelle 8). Enzymatisch aktive Corynebacterium-DHDPS wurde in maturen Samen von allen den getesteten Linien beobachtet, worin das Protein außer in einer nachgewiesen wurde.

Zum Messen der Zusammensetzung der freien Aminosäuren der Samen wurden freie Aminosäuren aus maturen Samen extrahiert und wie in Beispiel 8 beschrieben analysiert. Es bestand eine gute Korrelation zwischen den Transformanten, die höhere Konzentrationen von sowohl DHDPS- und AKIII-Protein exprimieren und denen, die höhere Spiegel von freiem Lysin und Threonin aufwiesen. Die höchsten Expressionslinien zeigten eine bis zu 3fache Steigerung der Spiegel von freiem Lysin und eine bis zu 8fache Steigerung des Spiegels von freiem Threonin in den Samen. Wie in Beispiel 12 beschrieben wurde, wurde ein hoher Spiegel von α-Aminoadipinsäure, die indikativ für den Lysinkatabolismus ist, in vielen der transformierten Linien beobachtet (in Tabelle 9 durch ein Sternchen angezeigt). Es lag kein bedeutender Unterschied in der Zusammensetzung der freien Aminosäuren oder des Spiegels der Protein-Expression zwischen den Transformanten vor, die die KTI3- oder Phaseolin-Regulationssequenzen aufweisen, welche die Expression des DHDPS-Gens von Corynebacterium antreiben. TABELLE 9 FS883-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3' FS903-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'

LINIE	FREIE AMINOSÄUREN/SAMEN		WESTERN CORYNE.-DHDPS	WESTERN E. COLI-AKIII	CORYNE.-DHDPS U/mg/hr	NACHKOMMEN KAN^R:KA N^S
LINIE	K/L	T/L	WESTERN CORYNE.-DHDPS	WESTERN E. COLI-AKIII	CORYNE.-DHDPS U/mg/hr	NACHKOMMEN KAN^R:KA N^S
NORMAL	0,5	1,3	–	–
FS883-4A	0,9	4,0	+	+		>15:1
FS883-11A	1,0	3,5	++	++	3,1	3:1
FS883-14B	0,5	2,5	++	++
FS883-16A*	0,7	10,5	+	+++	0
FS883-17A*	1,0	5,0	+++	+++	7,0
FS883-18C*	1,2	3,5	++	+	5,8	3:1
FS883-21A	0,5	1,5	+	+/–
FS883-26B*	1,1	3,6	++	++	2,4
FS883-29B	0,5	1,5	+	–	0,4
FS883-32B	0,7	2,4	++	+	1,5	3:1
FS883-38B*	1,1	11,3	+	++	2,0
FS883-59C*	1,4	6,1	+	+	0,5	15:1
FS903-3C	0,5	1,8	+	+++
FS903-8A*	0,8	2,1	+++	++++
FS903-9B	0,6	1,8	++	++	4,3
FS903-10A	0,5	1,5	–	–
FS903-22F	0,5	1,8	++	++	0,9
FS903-35B*	0,8	2,1	++	++
FS903-36B	0,7	1,5	+	–
FS903-40A	0,6	1,8	+	+
FS903-41A*	1,2	2,0	++	+++
FS903-42A	0,7	2,2	++	+++	5,4
FS903-44C	0,5	1,9
FS903-53B	0,6	1,9

* Zeigt an, dass die Probe mit der freien Aminosäure α-Aminoadipinsäure aufweist.

Die Zusammensetzung von freien Aminosäuren und die Expression von bakteriellen DHDPS- und AKIII-Proteinen wurde auch in Entwicklungssamen von zwei Linien analysiert, die als Einzelgenkassetteninsertionen segregierten (siehe Tabelle 10). Die Expression des DHDPS-Proteins unter Kontrolle des KTI3-Promotors wurde wie erwartet früher nachgewiesen als die des AKIII-Proteins unter Kontrolle des Phaseolin-Promotors. Am Tag 14 nach dem Blühen wurden beide Proteine in einem hohen Spiegel exprimiert, und es lag eine ca. 8fache Steigerung des Spiegels von freiem Lysin im Vergleich zu normalem Samen vor. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die gleichzeitige Expression von Lysin-unempfindlichem DHDPS und Lysin-unempfindlichem AK zur Produktion von hohen Spiegeln von freiem Lysin in Samen führt. Freies Lysin setzt jedoch die Akkumulation auf noch höhere Spiegel nicht fort. In maturen Samen liegt freies Lysin in einem Spiegel vor, der um das 2- bis 3fache höher als in normalen maturen Samen ist und das Lysin-Abbauprodukt α-Aminoadipinsäure akkumuliert sich. Diese Ergebnisse stellen einen weiteren Beleg dafür bereit, dass der Lysinkatabolismus in Samen auftritt und die Akkumulation der hohen Spiegel von freiem Lysin, das in Transformanten produziert wird, die Lysinunempfindliche DHDPS und Lysin-unempfindliche AK exprimieren, verhindert. TABELLE 10 Sich entwickelnde Samen von FS883-Transformanten: Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region KTI3-5'-Region/cts/cordapA/KTI3-3'-Region

LINIE	TAGE NACH DEM BLÜHEN	FREIE AMINO SÄUREN/SAMEN		WESTERN CORYNE- DHDPS	WESTERN E. COLI- AKIII
LINIE	TAGE NACH DEM BLÜHEN	K/L	T/L	WESTERN CORYNE- DHDPS	WESTERN E. COLI- AKIII
FS883-18C	9	1,1	2,1	–	–
FS883-18C	10	1,4	3,3	+/–	–
FS883-18C	11	1,4	2,5	+	–
FS883-18C	14	4,3	1,0	++	++
FS883-18C*	MATUR	1,2	3,5	+++	++
FS883-32B	9	1,3	2,9	+	–
FS883-32B	10	1,6	2,7	+	–
FS883-32B	11	1,4	2,3	+	–
FS883-32B*	14	3,9	1,3	++	++
FS883-32B*	MATUR	0,7	2,4	+++	++

BEISPIEL 16
TRANSFORMATION VON CANOLA MIT DEN CHIMÄREN GENEN PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/cordapA UND PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/lysC-M4
Die chimären Genkassetten, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' und Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region plus Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' (Beispiel 6) wurden in den binären Vektor pZS199 insertiert (4), der dem in Beispiel 8 beschriebenen pSZ97K ähnlich ist. In pZS199 ersetzte der 35S-Promotor vom Blumenkohl-Mosaikvirus den nos-Promotor, der die Expression des NPT II zur Bereitstellung einer besseren Expression des Markergen antreibt, und die Orientierung des Polylinkers, der die multiplen Restriktionsendonuklease-Orte enthält, wurde umgekehrt.
Zum Insertieren der Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region-3' wurde die Genkassette als ein 2,7 kb großes BamH I-Fragment (wie in Beispiel 15 beschrieben) isoliert und in mit BamH I verdautes pZS199 insertiert, wobei sich Plasmid pFS926 ergibt. Dieser binäre Vektor weist das chimäre Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region auf, das in der gleichen Orientierung wie das Markergen 35S/NPT II/nos-3' insertiert wird.
Zum Insertieren der Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region wurde die Genkassette als ein 3,3 kb großes EcoR I-Spe I-Fragment isoliert und in EcoR I plus Xba I verdautes pZS199 insertiert, wobei sich das Plasmid pBT593 ergab. Dieser binäre Vektor weist das chimäre Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, das in der gleichen Orientierung wie das Markergen 35S/NPT II/nos-3' insertiert wurde.
Zur Kombination der beiden Kassetten wurde der EcoR I-Ort von pBT593 unter Verwendung von Oligonukleotid-Adapters in einen BamH I-Ort umgewandelt, der sich ergebende Vektor wurde mit BamH I geschnitten und die Genkassette Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region wurde als ein 2,7 kb großes BamH I-Fragment isoliert und insertiert, wobei sich pBT597 ergab. Dieser binäre Vektor weist beide chimären Gene, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region und Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, die in der gleichen Orientierung wie das Markergen 35S/NPT II/nos-3' insertiert wurden.
Brassica napus, Kultivar „Westar", wurde durch Cokultivierung von Keimpflanzenstücken mit dem „disarmed" („entwaffneten") Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404, der den geeigneten binären Vektor trägt, transformiert.
Samen von B. napus wurden durch Rühren in 10% Chlorox, 0,1% SDS 30 min sterilisiert und dann gründlich mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Samen wurden auf sterilem Medium, das 30 mM CaCl₂ und 1,5% Agar enthält, gekeimt und 6 Tage im Dunkeln bei 24°C gezüchtet.
Flüssigkulturen von Agrobacterium für die Pflanzentransformation wurden über Nacht bei 28°C in Minimal A-Medium, das 100 mg/l Kanamycin enthielt, gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugieren pelletiert und bei einer Konzentration von 10⁸ Zellen/ml in flüssigem Murashige und Skoog Minimalem Organischem Medium, das 100 μM Acetosyringon enthält, resuspendiert.
Keimpflanzen-Hypokotyle von B. napus wurden in Segmente von 5 mm geschnitten, die sofort in die Bakteriensuspension gegeben wurden. Nach 30 min wurden die hypokotylen Stücke aus der Bakteriensuspension entfernt und auf ein BC-35-Kallusmedium gegeben, das 100 μM Acetosyringon enthielt. Das Pflanzengewebe und Agrobacteria wurden drei Tage bei 24°C in gedämpftem Licht cokultiviert.
Die Cokultivierung wurde durch Transferieren der hypokotylen Stücke an das BC-35-Kallusmedium, das 200 mg/l Carbenicillin zum Abtöten der Agrobacteria und 25 mg/l Kanamycin zum Auswählen auf Zellwachstum von transformierten Pflanzen enthielt, terminiert. Die Keimpflanzenstücke wurden drei Wochen auf diesem Medium bei 24°C unter ständiger Lichteinwirkung inkubiert.
Nach drei Wochen wurden die Segmente an BS-48-Regenerationsmedium, das 200 mg/l Carbenicillin und 25 mg/l Kanamycin enthielt, transferiert. Das Pflanzengewebe wurde alle zwei Wochen auf frischem selektivem Regenerationsmedium unter den gleichen Kulturbedingungen, die für das Kallusmedium beschrieben wurden, subkultiviert. Putativ transformierte Kalli wuchsen auf dem Regenerationsmedium schnell; wenn die Kalli einen Durchmesser von ca. 2 mm erreichten, wurden sie aus den hypokotylen Stücken entfernt und auf das gleiche Medium gebracht, das kein Kanamycin enthielt.
Innerhalb von mehreren Wochen nach dem Transfer auf BS-48-Regenerationsmedium, begannen Sprosse in Erscheinung zu treten. Sobald die Sprosse wahrnehmbare Stiele bildeten, wurden sie aus den Kalli ausgeschnitten, auf MSV-1A-Elongationsmedium transferiert und einer 16:8-stündigen Photoperiode bei 24°C zugeführt.
Sobald sich die Sprosse um mehrere Internodien elongiert hatten, wurden sie über der Agaroberfläche geschnitten und die geschnittenen Enden wurden in Rootone eingetaucht. Behandelte Sprosse wurden direkt in feuchtes Metro-Mix 350 „erdloses" (hydroponisches) Topfmedium transferiert. Die Töpfe wurden mit Kunststoffbeuteln abgedeckt, die entfernt wurden, wenn die Pflanzen, nach etwa zehn Tagen eindeutig wuchsen. Die Ergebnisse der Transformation sind in Tabelle 11 ersichtlich. Transformierte Pflanzen wurden mit jedem der binären Vektoren erhalten.
Die Pflanzen wurden unter einer 16:8-stündigen Photoperiode, bei einer Tagestemperatur von 23°C und einer Nachttemperatur von 17°C gezüchtet. Wenn sich der primäre Blütenstengel zu elongieren begann, wurde er mit einem maschenartigen Pollen-Containment-Beutel zur Verhinderung von Fremdkreuzung abgedeckt. Die Selbstbestäubung wurde durch tägliches mehrmaliges Schütteln der Pflanzen gefördert. Sich von Selbstbestäubungen herleitende mature Samen wurden ca. drei Monate nach dem Pflanzen geerntet.
MINIMALMEDIUM A (BAKTERIEN-WACHSTUMSMEDIUM)
Auflösen in destilliertem Wasser:

10,5 g Dikaliumhydrogenphosphat
4,5 g Monokaliumphosphat
1,0 g Ammoniumsulfat
0,5 g Natriumcitrat, Dihydrat
Mit destilliertem Wasser auf 979 ml auffüllen
Autoklavieren
20 ml filtersterilisierte 10%ige Saccharose zufügen
1 ml filtersterilisierte 1 M MgSO₄ zufügen

BRASSICA-Kallus-MEDIUM BC-35

pro Liter:
Murashige und Skoog Minimales Organisches Medium
(MS-Salze, 100 mg/l i-Inositol, 0,4 mg/L-Thiamin; GIBCO Nr. 510-3118)
30 g Saccharose
18 g Mannitol
0,5 mg/l 2,4-D
0,3 mg/l Kinetin
0,6% Agarose
pH 5,8

BRASSICA-REGENERATIONSMEDIUM BS-48

Murashige und Skoog Minimales Organisches Medium
Gamborg B5-Vitamine (SIGMA Nr. 1019)
10 g Glucose
250 mg Xylose
600 mg MES
0,4% Agarose
pH 5,7
Filtersterilisieren und nach dem Autoklavieren Zufügen von:
2,0 mg/l Zeatin
0,1 mg/l IAA

BRASSICA-SPROSS-ELONGATIONSMEDIUM MSV-1A

Murashige und Skoog Minimales Organisches Medium
Gamborg B5-Vitamine
10 g Saccharose
0,6% Agarose
pH 5,8

TABELLE 11 CANOLA-TRANSFORMANTEN

BINÄRER VEKTOR ZAHL DER GESCHNITTENEN ENDEN ZAHL DER KAN^R KALLI ZAHL DER SCHIESSENDEN KALLI PFLANZENZA HL

pZS199 120 41 5 2

pFS926 600 278 52 28

pBT593 600 70 10 3

pBT597 600 223 40 23
BEISPIEL 17
TRANSFORMATION VON MAIS UNTER VERWENDUNG EINES CHIMÄREN lysC-M4-GENS ALS EIN SELEKTIERBARER MARKER
Embryogene Kalluskulturen wurden aus immaturen Embryos (ca. 1,0 bis 1,5 mm) initiiert, die aus Kernen einer Maislinie präpariert wurden, die gezüchtet wurde, um eine Response des „Typ II-Kallus" in der Gewebekultur zu erhalten. Die Embryos wurden 10 bis 12 Tage nach der Bestäubung präpariert und wurden mit der Achsenseite nach unten und in Kontakt mit Agarose-verfestigtem N6-Medium [Chu et al. (1974) Sci Sin 18: 659–668] gebracht, das mit 0,5 mg/l 2,4-D (N6-0,5) supplementiert wurde. Die Embryos wurden bei 27°C im Dunkeln gehalten. Bröckeliger embryogener Kallus, der aus undifferenzierten Zellmassen mit somatischen Proembryos und somatischen Embryos besteht, die auf Suspensorstrukturen getragen werden, proliferierten aus dem Skutellum der immaturen Embryos. Klonale embryogene Kalli, die aus individuellen Embryos isoliert wurden, wurden identifiziert und alle 2 bis 3 Wochen auf N6-0,5-Medium subkultiviert.
Das Partikel-Bombardment-Verfahren wurde zum Transfer von Genen an die Kallus-Kulturzellen verwendet. Für diese Experimente wurde ein Biolistic, PDS-1000/He (BioRAD Laboratories, Hercules, CA) verwendet.
Das Plasmid pBT573, das das chimäre Gen HH534-5'-Region/mcts/lysC-M4/HH2-1-3'-Region (siehe Beispiel 6) enthielt, das für die konstitutive Genexpression in Mais konzipiert war, wurde auf die Oberfläche von Goldpartikeln präzipitiert. Um dies zu erreichen, wurden 2,5 μg pBT573 (in Wasser bei einer Konzentration von ca. 1 mg/ml) 25 ml Goldpartikel (durchschnittlicher Durchmesser von 1,5 um) suspendiert in Wasser (60 mg Gold pro ml) zugefügt. Danach wurden der Gold-DNA-Suspension, während das Röhrchen gevortext wurde, Calciumchlorid (25 ml einer 2,5 M Lösung) und Spermidin (10 ml einer 1,0 M Lösung ) zugefügt. Die Goldpartikel wurden 10 sec in einer Mikrofuge zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Goldpartikel wurden dann in 200 ml absolutem Ethanol resuspendiert, wurden wieder zentrifugiert und der Überstand entfernt. Schließlich wurden die Goldpartikel in 25 ml absolutem Ethanol resuspendiert und zweimal eine Sekunde beschallt. Fünf μl der DNA-beschichteten Goldpartikel wurden dann auf jede Makrocarrier-Scheibe geladen und das Ethanol wurde verdampfen lassen, wobei die mit DNA überzogenen Goldpartikel getrocknet auf der Scheibe zurückblieben.
Der embryogene Kallus (aus der als Nr. 132.2.2 bezeichneten Kalluslinie) wurde in einem zirkulären Bereich von ca. 6 cm im Zentrum einer 100 × 20 mm großen Petrischale mit N6-0,5-Medium, supplementiert mit 0,25 M Sorbitol und 0,25 M Mannitol angeordnet. Das Gewebe wurde 2 h vor dem Bombardment als Vorbehandlung auf dieses Medium gegeben und blieb während des Bombardment-Verfahrens auf dem Medium. Am Ende der 2-stündigen Vorbehandlungszeit wurde die Petrischale mit dem Gewebe in die Kammer des PDS-1000/He gebracht. Die Luft in der Kammer wurde dann auf ein Vakuum von 28 Inch Hg evakuiert. Der Makrocarrier wurde mit einer Heliumschockwelle unter Verwendung einer Zerreißmembran, die platzt, wenn der Heliumdruck in der Schockröhre 1100 psi erreicht, beschleunigt. Das Gewebe wurde ca. 8 cm vom Stopp-Screen angeordnet. Vier Gewebeplatten wurden mit den DNA-beschichteten Goldpartikeln bombardiert. Sofort nach dem Bombardment wurde das Kallusgewebe an das N6-0,5-Medium, das nicht mit Sorbitol oder Mannitol supplementiert war, transferiert.
Sieben Tage nach dem Bombardment wurden kleine (2–4 mm im Durchmesser) Kallusgewebeklumpen an das N6-0,5-Medium ohne Casein oder Prolin, das aber jeweils mit 2 mM Lysin und Threonin (LT) supplementiert war, transferiert. Das Gewebe wuchs auf diesem Medium langsam weiter und wurde alle 2 Wochen an frisches N6-0,5-Medium, supplementiert mit LT, transferiert. Nach 12 Wochen wurden zwei Klone von aktiv wachsendem Kallus auf zwei getrennten Platten mit LT supplementiertem Medium identifiziert. Diese Klone wuchsen weiter, wenn sie auf Selektivmedium subkultiviert wurden. Die Anwesenheit des lysC-M4-Gens in den ausgewählten Klonen wurde mittels PCR-Analyse bestätigt. Der Kallus wurde an Medium transferiert, das die Pflanzenregeneration fördert.
BEISPIEL 18
TRANSFORMATION VON MAIS MIT DEM KONSTITUTIVEN MAIS-PROMOTOR/cts/ecodapA UND KONSTITUTNEN MAIS-PROMOTOR/cts/lysC-M4
Die chimären Genkassetten, HH534-5'-Region/mcts/ecodapA/HH2-1-3'-Region plus HH534-5'-Region/mcts/lysC-M4/HH2-1-3'-Region (Beispiel 6), wurden in den Vektor pGem9z zur Generierung eines Mais-Transformationsvektors insertiert. Das Plasmid pBT583 (Beispiel 6) wurde mit Sal I verdaut und ein aus 1850 bp bestehendes Fragment mit der Genkassette HH534-5'-Region/mcts/ecodapA/HH2-1-3'-Region wurde isoliert. Dieses DNA-Fragment wurde in pBT573 (Beispiel 6) insertiert, das die mit Xho I verdaute HH534-5'-Region/mcts/lysC-M4/HH2-1-3'-Region tragt. Der sich ergebende Vektor mit beiden chimären Genen in der gleichen Orientierung wurde als pBT586 bezeichnet.
Vektor pBT586 wurde unter Verwendung des Partikel-Bombardment-Verfahrens in das embryogene Maiskallusgewebe eingeführt. Das Anlegen der embryogenen Kalluskulturen und die Parameter für das Partikel-Bombardment waren die, wie in Beispiel 13 beschrieben.
Entweder der eine oder andere der beiden Plasmidvektoren, die die selektierbaren Marker enthalten, wurden bei den Transformationen verwendet. Ein Plasmid, pALSLUC [Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833–839], enthielt eine cDNA des Mais-Acetolactatsynthase-Gens (ALS-Gens). Die ALS-cDNA wurde in vitro mutiert, damit das durch das Gen kodierte Enzym resistent gegen Chlorsulfuron würde. Dieses Plasmid enthält auch ein Gen, das zur Expression einer Kodierregion der Glühwürmchen-Luciferase den 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus und die 3'-Region des Nopalinsynthase-Gens verwendet (de Wet et al. (1987) Molec. Cell Biol. 7: 725–737]. Das andere Plasmid, pDETRIC, enthielt das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus, das Resistenz gegen das Herbizid Glufosinat verleiht [Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519–2523]. Das Bakteriengen hatte sein Translationscodon von GTG in ATG zur ordnungsgemäßen Translationsinitiierung in Pflanzen geändert [De Block et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2513–2518]. Das bar-Gen wurde vom 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus angetrieben und verwendet das Terminations- und Polyadenylierungssignal aus dem Octopinsynthase-Gen aus Agrobacterium tumefaciens.
Zum Bombardment wurden 2,5 μg von jedem Plasmid, pBT586 und einem von den beiden selektierbaren Markerplasmiden auf der Oberfläche von Goldpartikeln wie in Beispiel 13 beschrieben coprazipitiert. Das Bombardment der embryogenen Gewebekulturen erfolgte auch wie in Beispiel 13 beschrieben.
Sieben Tage nach dem Bombardment wurde das Gewebe an ein Selektivmedium transferiert. Das mit dem selektierbaren Marker pALSLUC bombardierte Gewebe wurde an N6-0,5-Medium transferiert, das Chlorsulfuron (30 ng/l), aber kein Casein oder Prolin enthielt Das mit dem selektierbaren Marker, pDETRIC, bombardierte Gewebe wurde an N6-0,5-Medium transferiert, das 2 mg/l Glufosinat, aber kein Casein oder Prolin enthielt. Das Gewebe wuchs auf diesen Selektivmedien langsam weiter. Nach weiteren 2 Wochen wurde das Gewebe in frisches N6-0,5-Medium, das die Selektivmittel enthielt, transferiert.
Nach weiteren 6–8 Wochen konnten Kallusklone mit Chlorsulfuron- und Glufosinat-Resistenz identifiziert werden. Wenn sie an Selektivmedien transferiert wurden, wuchsen diese Klone weiter.
Die Anwesenheit von pBT586 in den transformierten Klonen wurde mittels der PCR-Analyse bestätigt. Die Funktionalität des eingeführten AK-Enzyms wurde durch das Ausplattieren der transformierten Klone auf N6-0,5-Medien, die jeweils 2 mM Lysin und Threonin enthielten (LT-Selektion; siehe Beispiel 13) getestet. Alle diese Klone waren fähig, auf dem LT-Medium zu wachsen, was darauf hindeutet, dass die Aspartatkinase von E. coli exprimiert wurde und richtig funktionierte. Zum Testen, dass das DHDPS-Enzym von E. coli funktionsfähig war, wurde der transformierte Kallus auf N6-0,5-Medien ausplattiert, die 2 μm 2-Aminoethylcystein (AEC), ein Lysin-Analog und einen potenten Inhibitor von Pflanzen-DHDPS enthielten. Das transformierte Kallusgewebe war resistent gegen AEC, was darauf hindeutet, dass die eingeführte DHDPS, die um das ca. 16fache weniger empfindlich gegen AEC ist als das Pflanzenenzym, produziert wurde und funktionsfähig war. Pflanzen wurden aus mehreren transformierten Klonen regeneriert und wurden bis zur Maturität gezüchtet.
BEISPIEL 19
TRANSFORMATION VON SOJABOHNEN MIT DEN CHIMÄREN GENEN PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/cordapA UND PHASEOLIN-PROMOTOR/cts/lysC-M4
Die chimären Genkassetten, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region plus Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3' (Beispiel 6), wurden in den Sojabohnen-Transformationsvektor pBT603 insertiert (5). Dieser Vektor weist ein Sojabohnen-Transformations-Markergen auf, das aus dem 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus besteht, das die Expression des β-Glucuronidase-Gens von E. coli (Jefferson et al. (1986) Proc. Natl. Acad Sci USA 83: 8447–8451] mit der Nos-3'-Region in einem modifizierten pGEM9Z-Plasmid antreibt.
Zum Insertieren der Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region wurde die Genkassette als ein 3,3 kb großes Hind III-Fragment isoliert und in mit Hind III verdautes pBT603 insertiert, wobei sich Plasmid pBT609 ergab. Dieser binäre Vektor weist das chimäre Gen, Phaseolin-5'-Region/cts/lysC-M4/Phaseolin-3'-Region auf, das in der entgegengesetzten Orientierung vom 35S/GUS/Nos-3'-Markergen insertiert wurde.
Zum Insertieren der Phaseolin-5-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region-3' wurde die Genkassette als ein 2,7 kb großes BamH I-Fragment (wie in Beispiel 15 beschrieben) isoliert und in mit BamH I verdautes pBT609 insertiert, wobei sich Plasmid pBT614 ergab. Dieser Vektor weist die beiden chimären Gene, Phaseolin-5'-Region/cts/cordapA/Phaseolin-3'-Region, in der gleichen Orientierung insertiert auf, und beide befinden sich in der entgegengesetzten Orientierung vom 35S/GUS/Nos-3'-Markergen.
Die Sojabohne wurde gemäß dem in US-Patent Nr. 5015580 beschriebenen Verfahren mit Plasmid pBT614 transformiert. Die Sojabohnen-Transformation wurde von der Fa. Agracetus Company (Middleton, WI) durchgeführt.
BEISPIEL 20
ISOLIERUNG EINES PFLANZEN-LYSIN-KETOGLUTARAT-REDUKTASE-GENS
Die Enzymaktivität der Lysin-Ketoglutarat-Reduktase (LKR) wurde in immaturem Endosperm der sich entwickelnden Maissamen beobachtet (Arruda et al. (1982) Plant Physiol. 69: 988–989]. Die LKR-Aktivität steigt ab dem Einsetzen der Endosperm-Entwicklung scharf an, erreicht ca. 20 Tage nach der Bestäubung einen Peak und nimmt danach ab [Arruda et al. (1983) Phytochemistry 22: 2687–2689].
Zum Klonieren des Mais-LKR-Gens wurde 19 Tage nach der Bestäubung RNA aus den sich entwickelnden Samen isoliert. Diese RNA wurde an die Fa. Clontech Laboratories, Inc., (Palo Alto, CA) zur kundenspezifischen Synthese einer cDNA-Bibliothek im Vektor Lambda-Zap II gesandt. Die Umwandlung der Lambda-Zap II-Bibliothek in eine Phagemid-Bibliothek, dann in eine Plasmid-Bibliothek, wurde unter Befolgung des von der Fa. Clontech bereitgestellten Protokolls erreicht. Sofort nach der Umwandlung in eine Plasmid-Bibliothek trugen die erhaltenen Ampicillin-resistenten Klone das cDNA-Insert im Vektor pBluescript SK(–). Die Expression der cDNA erfolgt unter der Kontrolle des lacZ-Promotors auf dem Vektor.
Zwei Phagemid-Bibliotheken wurden unter Verwendung der Gemische des Lambda-Zap II-Phagen und des filamentösen Helferphagen von 100 μl zu 1 μl generiert. Zwei weitere Bibliotheken wurden unter Verwendung von Gemischen aus 100 μl Lambda-Zap II zu 10 μl Helferphagen und 20 μl Lambda-Zap II zu 10 μl Helferphagen generiert. Die Titer der Phagemidpraparationen waren ungeachtet des verwendeten Gemischs ähnlich und es handelte sich um ca. 2 × 10³ Ampicillin-resistente Transfektanten pro ml mit dem E. coli-Stamm XL1-Blue als Wirt und ca. 1 × 10³ mit DE126 (siehe nachstehend) als Wirt.
Zum Auswählen von Klonen, die das LKR-Gen trugen, wurde ein speziell konzipierter E. coli-Wirt, DE126, konstruiert. Die Konstruktion von DE126 erfolgte in mehreren Stufen.

(1) Es wurde ein generalisierter Transduktions-Stock des Coliphagen Plvir durch Infektion einer Kultur von TST1 [F^–, araD139, Delta-(argF-lac)205, flb5301, ptsF25, relA1, rpsL150, malE52 :: Tn10, deoC1, λ^–] (E. coli Genetic Stock Center Nr. 6137) unter Verwendung eines Standardverfahrens (für Verfahren siehe J. Miller, Experiments in Molecular Genetics) produziert.
(2) Dieser Phagenstock wurde als Donor in einer transduktionalen Kreuzung (für Verfahren siehe J. Miller, Experiments in Molecular Genetics) mit dem Stamm GIF106M1 (F^–, arg, ilvA296, lysC1001, thrA1101, metL1000, λ^–, rpsL9, malT1, xyl-7, mtl-2, thil(?), supE44(?)] (E. coli Genetic Stock Center Nr. 5074) als der Empfänger verwendet. Rekombinanten wurden auf angereichertem Medium [L supplementiert mit DM], das das Antibiotikum Tetracyclin enthält, ausgewählt. Das Transposon Tn10, das Tetracyclin-Resistenz verleiht, wird in das malE-Gen von Stamm TST1 insertiert. Sich aus dieser Kreuzung herleitende Tetracyclin-resistente Transduktanten enthalten wahrscheinlich bis zu 2 min des E. coli-Chromosoms in der Umgebung von malE. Die Gene malE und lysC werden im Cotransduktionsabstand durch weniger als 0,5 Minuten gut getrennt.
(3) 200 Tetracyclin-resistente Transduktanten wurden gründlich phänotypisiert, eine angemessene Fermentierung und Ernährungsmerkmale wurden anhand von Scores bewertet. Dem Empfängerstamm GIF106M1 fehlen auf Grund von Mutationen in thrA, metL und lysC die Aspartokinase-Isozyme vollkommen, und er benötigt deshalb zum Wachstum die Anwesenheit von Threonin, Methionin, Lysin und meso-Diaminopimelinsäure (DAP). Von Transduktanten, die lysC⁺ mit malE:: Tn10 von TST1 geerbt hatten, würde erwartet, dass sie auf einem Minimalmedium, das Vitamin B1, L-Arginin, L-Isoleucin und L-Valin zusätzlich zu Glucose, die als Kohlenstoff- und Energiequelle dient, wachsen. Überdies exprimieren Stämme mit der genetischen Konstitution von lysC⁺, metL^– und thrA^– nur die Lysin-empfindliche Aspartokinase. Folglich sollte das Zufügen von Lysin zum Minimalmedium das Wachstum der lysC⁺-Rekombinanten verhindern, was zu einer Verarmung an Threonin, Methionin und DAP führt. Von den untersuchten 200 Tetracyclin-resistenten Transduktanten wuchsen 49 auf dem Minimalmedium, dem es an Threonin, Methionin und DAP mangelte. Überdies wurden alle 49 durch das Zufügen von L-Lysin zum Minimalmedium inhibiert. Einer dieser Transduktanten wurde als DE125 bezeichnet. DE125 weist den Phänotyp der Tetracyclin-Resistenz, Bedarf an Arginin, Isoleucin und Valin zum Wachstum und Empfindlichkeit gegen Lysin auf. Der Gentyp dieses Stamms ist F^– malE52 :: Tn10, arg, ilvA296, thrA1101, metL1000, Lambda^–, rpsL9 malT1, xyl-7, mtl-2 thil(?), supE44(?).
(4) Dieser Schritt beinhaltet die Produktion eines männlichen Derivats von Stamm DE125. Stamm DE125 wurde mit dem männlichen Stamm AB1528 [F'16/Delta(gpt-proA) 62, lacY1 oder lacZ4, ginV44, galK2 rac^–(?), hisG4, rfbd1, mgl-51, kdgK51(?), ilvC7, argE3, thi-1] (E. coli Genetic Stock Center Nr. 1528) mittels des Konjugationsverfahrens gepaart. F'16 trägt das Gencluster ilvGMEDAYC. Die beiden Stämme wurden auf angereichertem Medium, das das Wachstum von jedem Stamm zulässt, im Kreuz ausgestrichen. Nach der Inkubation wurde die Platte in Wiederholung auf ein synthetisches Medium, das Tetracyclin, Arginin, Vitamin B1 und Glucose enthielt, ausplattiert. DE125 kann auf diesem Medium nicht wachsen, weil es kein Isoleucin synthetisieren kann. Das Wachstum von AB1528 wird durch den Einschluss des Antibiotikums Tetracyclin und das Auslassen von Prolin und Histidin am dem synthetischen Medium verhindert. Auf diesem Selektivmedium wuchs ein Zellpatch. Diese rekombinanten Zellen wurden der Isolierung einer Einzelkolonie auf dem gleichen Medium unterzogen. Es wurde bestimmt, dass es sich bei dem Phänotyp von einem Klon um Ilv⁺, Arg^–, TetR, Lysin-empfindlichen, männlich-spezifischen Phagen, (MS2)-empfindlich, handelt, der mit dem einfachen Transfer von F'16 aus AB1528 an DE125 konsistent ist. Dieser Klon wurde als DE126 bezeichnet und weist den Gentyp F'16/ma/E52 :: Tn10, arg^–, ilvA296, thrA1101, metL100, lysC⁺, λ^–, rpsL9, malT1, xyl-7, mtl-2, thi-1?, supE44? auf. Er wird durch 20 μg/ml L-Lysin in einem synthetischen Medium inhibiert.

Zum Selektieren auf Klone aus der Mais-cDNA-Bibliothek, die das LKR-Gen trugen, wurden 100 μl der Phagemid-Bibliothek mit 100 μl einer Kultur von DE126, die über Nacht in L-Bouillon gezüchtet wurde, gemischt und die Zellen wurden auf synthetische Medien ausplattiert, die Vitamin B1, L-Arginin, Glucose als eine Kohlenstoff- und Energiequelle, 100 μg/ml Ampicillin und L-Lysin bei 20, 30 oder 40 μg/ml enthielten. Vier Platten mit jeder der drei verschiedenen Lysinkonzentrationen wurden hergestellt. Es wurde erwartet, dass die Phagemidmenge und die DE126-Zellen ca. 1 × 10⁵ Ampicillinresistente Transfektanten pro Platte ergeben. Pro Platte wuchsen zehn bis dreißig Lysin-resistente Kolonien (ca. 1 Lysin-resistente pro 5000 Ampicillin-resistente Kolonien).
Plasmid-DNA wurde aus 10 unabhängigen Klonen isoliert und zu DE126 retransformiert. Sieben der zehn DNAs ergaben Lysin-resistente Klone, die zu erkennen geben, dass das Merkmal der Lysin-Resistenz auf dem Plasmid getragen wurde. Die berichtete Größe der Mais-LKR beträgt ca. 140000 Dalton, die eine mRNA von mindestens 3,8 kb erfordert. Die Restriktionsenzym-Analyse der DNAs zeigte, dass der Klon 11D ein Plasmid mit einem Insert von ca. 4 kb von Mais-DNA enthielt, das groß genug ist, um eine cDNA voller Länge zu tragen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäurefragment, umfassend eine Nukleotidsequenz, die im Wesentlichen homolog zur in SEQ ID NO:1 gezeigten Sequenz ist, kodierend für Wildtyp-E. coli AKIII, wobei das Nukleinsäurefragment mindestens eine Mutation dergestalt enthält, dass es für eine Lysin-unempfindliche Variante von E. coll AKIII kodiert und weiter dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist: (a) die Aminosäure an Position 318 stellt eine Aminosäure mit Ausnahme von Methionin dar, oder (b) die Aminosäure an Position 352 stellt eine Aminosäure mit Ausnahme von Threonin dar.
Isoliertes Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, worin das Fragment funktionsfähig mit einer Pflanzenchloroplast-Transitsequenz verknüpft ist und funktionsfähig mit einer geeigneten Regulationssequenz zur Förderung der Expression in Samen von transformierten Pflanzen verknüpft ist.
Isoliertes Nukleinsäurefragment, umfassend: (a) ein erstes Nukleinsäure-Subfragment, umfassend das Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2, und (b) ein zweites Nukleinsäure-Subfragment, kodierend für die Dihydrodipicolinsäure-Synthase, das mindestens um das 20fache weniger empfindlich für die Inhibition durch Lysin als Pflanzen-DHDPS ist; und das funktionsfähig mit einer geeigneten Pflanzenchloroplast-Transitsequenz und mit einer geeigneten Regulationssequenz zur Förderung der Expression in Samen von transformierten Pflanzen verknüpft ist.
Nukleinsäurefragment nach Anspruch 3, worin: (a) das erste Nukleinsäure-Subfragment das Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2 umfasst; und (b) sich das zweite Nukleinsäure-Subfragment von Bakterien herleitet.
Pflanze, umfassend in ihrem Genom das Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Samen, die aus der Pflanze nach Anspruch 5 erhalten werden, umfassend das Nukleinsäurefragment nach Ansprüchen 1 bis 4.
Verfahren zur Steigerung des Lysingehalts der Samen von Pflanzen, umfassend: (a) Transformieren von Pflanzenzellen mit dem Nukleinsäurefragment nach Anspruch 3 oder 4; (b) Züchten fertiler maturer Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen, die aus Schritt (a) unter Bedingungen erhalten werden, die zum Erhalt von Samen geeignet sind; und (c) Auswählen aus dem Nachkommensamen von Schritt (b) die Samen, die gesteigerte Lysinkonzentrationen enthalten.
Verfahren zur Steigerung des Threoningehalts der Samen von Pflanzen, umfassend: (a) Transformieren von Pflanzenzellen mit dem Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2; (b) Züchten fertiler maturer Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen, die aus Schritt (a) unter Bedingungen erhalten werden, die zum Erhalt von Samen geeignet sind; und (c) Auswählen aus dem Nachkommensamen von Schritt (b) die Samen, die gesteigerte Threoninkonzentrationen enthalten.
Pflanze, die durch das Verfahren nach Anspruch 7 produziert wird und die Nukleinsäure nach Ansprüchen 3 und 4 umfasst, zur Steigerung des Lysingehalts der Samen von Pflanzen, worin die Pflanze zur Übertragung des Nukleinsäurefragments an eine Nachkommenpflanze fähig ist und worin die Nachkommenpflanze die Fähigkeit aufweist, Konzentrationen von freiem Lysin zu produzieren, die mindestens zweimal höher sind als die Konzentrationen von freiem Lysin von Pflanzen, die das Nukleinsäurefragment nicht enthalten.
Pflanze, die durch das Verfahren nach Anspruch 8 produziert wird und die Nukleinsäure nach Ansprüchen 1 und 2 umfasst, zur Steigerung des Threoningehalts der Samen von Pflanzen, worin die Pflanze zur Übertragung des Nukleinsäurefragments an eine Nachkommenpflanze fähig ist und worin die Nachkommenpflanze die Fähigkeit aufweist, Konzentrationen von freiem Threonin zu produzieren, die mindestens zweimal höher sind als die Konzentrationen von freiem Threonin von Pflanzen, die das Nukleinsäurefragment nicht enthalten.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem gesteigerten Lysingehalt in den Samen, umfassend die Transformation einer Pflanze mit dem Nukleinsäurefragment nach Anspruch 3 oder 4.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem gesteigerten Threoningehalt in den Samen, umfassend die Transformation einer Pflanze mit dem Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2.