DE69334035T2 - Verfahren zur vorbeugung von nmda-rezeptor vermittelten neuronalen schäden - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Verbindungen, die zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems, besonders Erkrankungen, die durch den N-Methyl-D-aspartat- (NMDA-) Subtyp des excitatorischen Aminosäurerezeptor-Komplexes vermittelt werden.
  • Glutamat oder verwandte Verbindungen sind als ein wesentlicher Faktor bei der Neurotoxizität in Zusammenhang gebracht worden, die mit hypoxischer ischämischer Enzephalopathie, Anoxie, Hypoglykämie, Krämpfen, Trauma und mehreren degenerativen neurologischen Erkrankungen verbunden sind (Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6556, 1988; Choi, Neuron 1:623, 1988; Rothman et al., Trends Neurosci. 10:299, 1987; Meldrum et al., Trends Pharm. Sci. 11:379, 1990). In vielen zentralen Neuronen scheint die vorherrschende Form dieser Neurotoxizität durch Aktivierung des NMDA-Subtyps des Glutamatrezeptors und der nachfolgende Einstrom von überschüssigem Ca2+ vermittelt zu werden (Choi, ebendort; Weiss et al., Science 247:1474, 1990). Lei et al. Neuron 8:1087–1099 (1992) offenbart die Verwendung von Nitroso-Verbindungen (Verbindungen, die die NO-Gruppe enthalten) zum Behandeln von neurologischen Krankheiten. Stamler et al. Science 258:1898–1902 (1992) offenbart durch Bezugnehmen von Lei et al. (1992) auch die Verwendung von Nitroso-Verbindungen zum Behandeln von neurologischen Krankheiten.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ich habe entdeckt, dass bestimmte Verbindungen Neuronen gegen NMDA-Rezeptor-vermittelte neuronale Schäden schützen. Genauer stellen Nitroglyzerin, Nitroprussid und ihre Nitroso-Verbindungsderivate derartigen Schutz bereit. Folglich wird ein Verfahren zum Verringern von NMDA-Rezeptorkomplex-vermittelten neuronalen Schäden bei einem Säugetier durch Verabreichen einer der vorstehend beschriebenen Verbindungen an das Säugetier in einer Konzentration, die wirksam ist, um derartige Schäden zu verringern, offenbart.
  • Mit Hinblick auf die vorstehend diskutierten Verbindungen möchte ich mich nicht an eine bestimmte Theorie oder Wirkungsmechanismus binden. Jedoch scheint es, dass die Oxidation des/r Thiolreste/s der Redox-Modulationsstelle des NMDA-Rezeptors gegen NMDA-Rezeptorvermittelte neuronale Schäden schützt. Es wird auch bekannt, dass die aktive Spezies von Nitroglyzerin und Nitroprussid Stickoxid oder eine verwandte NO-Redox-Spezies ist.Siehe z.B. Garthwaite et al. (Trends in Neurosciences 14:60, (1991).
  • Ein möglicher Mechanismus für die Schutzwirkung, die ich entdeckt habe, ist die NO-induzierte Oxidation des NMDA-Rezeptor-Kanal-Komplexes, die vermutlich durch eine Nitrosierungsreaktion vermittelt wird, die die Übertragung der NO-Gruppe auf den/die Thiolrest/e der Redox-Modulationsstelle des NMDA-Rezeptors einschließt, was ein RS-NO (NO+-Äquivalent) zur Folge hat. In ähnlicher Weise kann die Redox-Spezies Nitroxylanion (NO) auch mit Thiolresten reagieren. Im Gegensatz dazu reagiert unter physiologischen Bedingungen NO•(Stickoxid) direkt mit Thiolresten schlecht, wenn überhaupt.
  • Ein erster Gesichtspunkt der Erfindung kennzeichnet die Verwendung einer Nitroso-Verbindung, die Stickoxid oder eine verwandte Redox-Spezies von Stickoxid erzeugt, oder eines physiologisch verträglichen Salzes einer solchen Verbindung in einer Konzentration, die wirksam Neuroschutz bewirken kann, z.B. eine Abnahme derartiger Schäden, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von NMDA-Rezeptorkomplex-vermittelten neuronalen Schäden in einem Säugetier, vorausgesetzt, dass die Verbindung kein Nitroglyzerin, Nitroprussid oder Nitroglyzerinderivate, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isosorbidmononitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglyzerin sublingual, NT-1, Niotrocor, Nitroderm, Nitrodisc, Nitro-dur, Nitro-Dur II, Nitrofilm, Nitrogard, Nitroglin, Nitropen, Tridil und 6-Chlor-2-pyridylmethylnitrat, ist. Ohne dass ich mich an einen spezifischen Wirkungsmechanismus binden möchte, scheint es, dass NO oder eine verwandte Redox-Spezies an der/den Thiolgruppe/n der Redox-Modulationsstelle des NMDA-Rezeptor-Kanal-Komplexes wirkt, um gegen NMDA-Rezeptor-vermittelte Schäden zu schützen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Säugetier ein menschlicher Patient, der mit einem Virus infiziert ist, das das Nervensystem beeinflusst, z.B. das Masern- oder das menschliche Immunschwäche Virus (human immunodeficiency virus) (HIV). Insbesondere kann der Patient, an den die Verbindung der Erfindung verabreicht wird, mit HIV infiziert sein und kann Symptome des AIDS-verwandten Komplexes oder des erworbenen Immunschwäche Syndroms (Acquired Immunodeficiency Syndrome) manifestieren (zum Beispiel neurologische Manifestationen von HIV (siehe z.B. USSN 571,949), wie solchen, die mit der Verbindung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, behandelt werden können, die den AIDS-Demenzkomplex oder die kognitiv-motorisch-sensorischen Defizite von inzipienter oder progressiver Demenz einschließen). Andere neurodegenerative Zustände, die mit den Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, behandelt werden können, schließen die Alzheimersche Krankheit, Huntingtonsche Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose (ALS oder Motor-Neuron-Krankheit), Parkinsonsche Krankheit, Neurolathyrismus, Guam-Krankheit und solche, die nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt sind, ein. In einer anderen Ausführungsform kann der Patient eine akute Störung, wie Hypoxie, Anoxie, Kohlenmonoxidvergiftung, Ischämie, ZNS-Trauma, Hypoglykämie, Krämpfe, Schlaganfall (von welchem ich meine, dass er einen Schlaganfall einschließt, der mit Ischämie oder Subarachnoidalblutung verbunden ist), Domosäurevergiftung, Bleivergiftung, oder andere akute Störungen, die nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt sind, aufweisen (oder wahrscheinlich diesen unterworfen ist). Wenn es wahrscheinlich ist, dass der Patient einer der vorstehenden Zustände unterworfen ist, könnten die Verbindungen, die in der Erfindung verwendet werden, verwendet werden, um eine prophylaktische Behandlung bereitzustellen. Andere Krankheiten, die (mindestens teilweise) durch excitatorische Aminosäuretoxizität vermittelte werden, können durch NMDA-Rezeptorkomplex-Modulation unter Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Derartige Krankheiten schließen ein: 1) ALS (amyotrophe Lateralsklerose- oder Motor-Neuron-Krankheit); 2) schmerzhafte Typen von "peripherer Neuropathie", welche durch übermäßige Glutamat- (NMDA-) Rezeptorstimulierung vermittelt werden können, z.B. Kausalgie und andere Typen von neuropathischen Schmerzsyndromen, die schmerzhafte Typen von peripherer Neuropathie einschließt, welche eine Zentralnervensystemkomponente einschließen kann (aber nicht notwendigerweise muss).
  • "NMDA-Rezeptor-vermittelte neuronale Schäden" bedeutet jede neuronale Verletzung, welche mit der Stimulation oder Co-Stimulation des NMDA-Rezeptor-Kanal-Komplexes verbunden ist, einem Rezeptor-Kanal-Komplex, welcher an einer Teilmenge von Säugetierneuronen gefunden wurde und welcher eine Bindungsstelle für ein Molekül, wie Glutamat, NMDA oder ähnliche Agonisten einschließen (siehe nachstehend). Die Aktivierung dieses Rezeptor-Kanal-Komplexes durch das Binden von Agonisten induziert neuronale Erregung durch Öffnen spezifischer Ionenkanäle in der Membran.
  • Eine "Nitroso-Verbindung" bedeutet jede Verbindung, welche eine ausreichende Menge NO (sehr wahrscheinlich eine verwandte Redox-Spezies, wie ein NO+- oder NO–-Äquivalent) bei Verabreichung an ein Säugetier erzeugt, um neuronale Schäden oder Verletzung zu verringern. Zur Vereinfachung habe ich auch den weniger exakten Begriff "NO-erzeugende Verbindung" verwendet, um Verbindungen einzuschließen, die die vorstehend beschriebene NO-verwandte Redox-Spezies (z.B. RS-NO, ein NO+-Äquivalent oder NO–) oder ein physiologisch verträgliches Salz davon erzeugen.
  • Nützliche Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung schließen jede Nitroso-Verbindung ein, außer Nitroglyzerin, Nitroprussid oder Nitroglyzerinderivate, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Isosorbidmononitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglyzerin sublingual, NT-1, Niotrocor, Nitroderm, Nitrodisc, Nitro-dur, Nitro-Dur II, Nitrofilm, Nitrogard, Nitroglin, Nitropen, Tridil und 6-Chlor-2-pyridylmethylnitrat. Überprüfung, dass eine bestimmte Verbindung schützende Oxidation des NMDA-Rezeptors selbst bereitstellt, ist ein Schritt, der vom Fachmann gut verstanden wird (siehe z.B. Lipton, PCT WO 91/02810).
  • Die beiden bevorzugten Verbindungen, welche bei einem Verfahren zum Verringern von NMDA-Rezeptorkomplex-vermittelten neuronalen Schäden verwendet werden können, wie vorstehend diskutiert, (d.h. Nitroglyzerin und Natriumnitroprussid, welche nicht im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen) stellen den Vorteil einer nachgewiesenen Aufzeichnung der sicheren menschlichen Verabreichung bereit (d.h. zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen). Nitroso-Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung, die auf diese Art und Weise verwendet werden können, schließen ein: Isosorbiddinitrat (Isordil); S-Nitroso-Captopril (Snocap); Serumalbumin in Verbindung mit Stickoxid ("SA-NO"); Kathepsin in Verbindung mit Stickoxid (Kathepsin-NO); Gewebeplasminogenaktivator in Verbindung mit NO (TPA-NO); SIN-1 (oder Molsidomin) Kation-Nitrosylkomplexe, die Fe2+-Nitrosylkomplexe einschließen; Nicorandil; S-Nitrosoglutathion; NO in Verbindung mit einem Adamantinderivat, das Memantin einschließt (siehe US-Patent-Anmeldung SN 07/934,824); S-Nitrosothiole, die S-Nitrosocystein einschließen; Sydnonimine oder Nonoate mit der Formel
    Figure 00040001
    wobei X ein Nucleophil ist, das ein Amin einschließt; und Mittel, welche eine Oxidationskaskade erzeugen, die der ähnlich ist, die durch NO erzeugt wird, wie α-Lipoinsäure (Thioctinsäure und ihre Enantiomere); Dihydrolipoat; Glutathion; Ascorbat; und Vitamin E.
  • Jede der vorstehend beschriebenen Nitroso-Verbindungen kann mit anderen Redox-Verbindungen kombiniert werden, die die Erzeugung und Aufrechterhaltung von NO erleichtern. Zum Beispiel können direkte NO-Erzeuger mit Pyrolochinolinchinon (PQQ), einem bekannten NMDA-Redox-Modulator (siehe US-Patent 5,091,391), oder Esterderivaten von PQQ oder anderen Chinonen, wie Ubichinon, kombiniert werden.
  • Bezüglich der Verbindungen, die in der Erfindung verwendet werden, macht die Fähigkeit von NO, zu Kreuzzellmembranen transportiert zu werden, solche Verbindungen bei der Behandlung der vorher diskutierten Zustände nützlich.
  • Es ist auch erkannt worden, dass die Redox-Spezies NO• (Stickoxid, das ein freies Elektron enthält) über die Erzeugung von Peroxynitrit (ONOO–) (oder seinen Zersetzungsprodukten) durch Umsetzung mit O2•– zu Neurotoxizität führt (siehe 7, nachstehend zur Veranschaulichung). Der Anmelder stellt fest, dass die Literatur das Enzym, NO-Synthase, beschreibt, welches in bestimmten Zelltypen Stickoxid produziert; dieses Enzym und seine Rolle in der neuronalen Funktion ist z.B. in Garthwaite et al. (Tends in Neurosciences 14:60, 1991), Hope et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2811, 1991) und Dawson et al. (Ann. Neurol. 32:297–311, 1992) diskutiert. Folglich kann die Stickoxidsynthase gehemmt werden, um Neuroschutz zu bewirken, Inhibitoren der Stickoxidsynthase können verabreicht werden, um die Verfügbarkeit von NO• zu verringern und folglich die Verfügbarkeit von neurotoxischem Peroxynitrit (ONOO–) zu verringern. Diese Erkenntnis kann mit der Erfindung kombiniert werden, wie vorstehend beschrieben, oder der Stickoxidsynthase-Inhibitor kann unabhängig verabreicht werden, um neurologische Manifestationen einer Infektion mit einem HIV zu behandeln, neuropathischen Schmerz, der durch NMDA-Rezeptoraktivität vermittelt wird, zu behandeln, oder ALS zu behandeln.
  • Es ist auch erkannt worden, dass Neuroschutzdosen von Nitrosoverbindungen, die in der Erfindung verwendet werden, als unerwünschte Nebenwirkung den Blutdruck bei naiven Patienten senken kann, aber dass es möglich ist, Toleranz zu dieser Nebenwirkung zu erzielen, ohne die gewünschte Neuroschutzwirkung zu verlieren. Demgemäß kann eine Nitrosoverbindung, die in der Erfindung verwendet wird, die in der Lage ist, gegen NMDA-Rezeptorkomplex-vermittelte neuronale Verletzung zu schützen, kontinuierlich über einen ausgedehnten Zeitraum mit stufenweise steigender Dosis verabreicht werden, wobei bei einer Dosismenge begonnen wird, welche den Blutdruck des Patienten nicht wesentlich senkt, und sie zu einer späteren Dosismenge zur systemischen Toleranz der Verbindung erhöht wird. Die spätere Dosismenge ist hoch genug, um den Blutdruck eines naiven Patienten wesentlich zu senken, aber die kontinuierliche Verabreichung der Verbindung erzielt Toleranz gegenüber der Blutdruck-senkenden Wirkung der Verbindung, so dass die spätere Dosismenge den Blutdruck des Patienten tatsächlich nicht wesentlich senkt. Demgemäß umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Verbindung durch kontinuierliche Verabreichung über einen ausgedehnten Zeitraum, der vorzugsweise 12 Stunden übersteigt, mit stufenweise steigender Dosis, um eine systemische Toleranz der Verbindung zu schaffen, wobei bei einer ersten Dosismenge begonnen wird, welche den Blutdruck des Patienten im wesentlichen nicht senkt, und sie zu einer späteren Dosismenge erhöht wird, wobei die spätere Dosismenge hoch genug ist, den Blutdruck des Patienten im wesentlichen zu senken, wenn sie einem naiven Patienten gegeben wird, aber ungenügend ist, um den Blutdruck des Patienten nach der Einnahme der kontinuierlichen Verabreichung über einen ausgedehnten Zeitraum im wesentlichen zu senken. Vorzugsweise wird die Verbindung in vielen zunehmend höheren Dosen verabreicht, bis die spätere Dosis erreicht ist, und dann wird die Verbindung in vielen Dosen in der späteren Dosismenge verabreicht.
  • Die Verbindung kann durch ein transdermales Pflaster verabreicht werden, wie nachstehend ausführlich beschrieben (z.B. ein Pflaster mit einer Fläche von über 50 cm2). Vorzugsweise erfolgt eine derartige Verabreichung kontinuierlich über einen Zeitraum, der 24 Stunden übersteigt.
  • Es ist auch nützlich, wenn eine Nitrosoverbindung gemäß der Erfindung akut verabreicht wird, eine blutdrucksteigernde Verbindung, wie Dopamin, zusammen zu verabreichen.
  • Es ist auch die Verabreichung der Superoxiddismutase (SOD), der Katalase oder der beiden offenbart, um die Neurotoxizität durch Verringern der Erzeugung von Peroxynitrit aus der Umsetzung von NO• mit dem Superoxidanion (O2•) zu beschränken. Die Behandlung kann zusammen mit der Verabreichung einer Verbindung gemäß der Erfindung erfolgen, oder sie kann unabhängig verwendet werden, besonders um neurologische Manifestationen einer Infektion mit HIV oder von ALS zu behandeln.
  • Polyethylenglykol (PEG) wird verwendet, um die Absorption in das Zentralnervensystem (ZNS) und die Wirksamkeit der SOD und/oder der Katalase zu erhöhen. Ein SOD-Nachahmer, das proteingebundene Polysaccharid von Coriolus-versicolor QUEL, "PS-K" benannt, kann auch durch parenterale oder orale Wege der Verabreichung wirksam sein, besonders mit PEG, um die ZNS-Absorption zu erhöhen, und SOD kann in diesem Gesichtspunkt der Erfindung durch derartige Nachahmer ersetzt werden. Siehe Kariya et al., Mol. Biother. 4:40–46 (1992); und Liu et al., (1989) Am. J. Physiol. 256:589–593.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und aus den Patentansprüchen ersichtlich.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Die Zeichnungen werden zu erst kurz beschrieben.
  • Zeichnungen
  • Die 1–3 sind Diagramme, die NMDA-hervorgerufene intrazelluläre [Ca2+]-Mengen zeigen, die durch Fura-2-Bildaufzeichnung im Laufe der Zeit beobachtet werden, wenn verschiedene Redoxmittel, die NTG einschließen, zu gezüchteten Neuronen verabreicht werden (siehe Beispiele 1 und 2).
  • 4 ist ein Diagramm, das NMDA-hervorgerufene Ströme (einschließlich [Ca2+]) in kortikale Neuronen und die Wirkung verschiedener Redoxmittel, die NTG einschließen, zeigt (siehe Beispiel 3).
  • 5A–5B sind Diagramme, die NMDA-hervorgerufenes intrazelluläres [Ca2+], die in kortikalen Neuronen induziert wird, und die Wirkung verschiedener Redoxmittel, die S-Nitrosocystein (SNOC) einschließen, zeigen (siehe Beispiel 5).
  • 6A–6D sind Balkendiagramme, die zeigen, dass Natriumnitroprussid (SNP) oder Nitroglyzerin (NTG) NMDA-vermittelte Neurotoxizität verhindert.
  • Die 7A und 7B sind Balkendiagramme, die das Superoxiderfordernis der Neurotoxizität, die durch S-Nitrosocystein (SNOC) oder Peroxynitrit (ONOO–) induziert wird, zeigen.
  • Es ist festgestellt worden, dass die Verbindungen Nitroprussid und Nitroglyzerin NMDA Rezeptorkomplex-vermittelte neuronale Schäden verringern (siehe nachstehend). Dieser Neuroschutz kann auf die Nitrosierung oder Oxidation des NMDA-Rezeptors an der Redox-Modulationsstelle zurückgeführt werden, was eine NO-Gruppenübertragung auf die Thiolgruppe(n) der Redox-Modulationsstelle des NMDA-Rezeptors zur Folge hat, um ein RS-NO (NO+-Äquivalent) zu erzeugen. Diese chemische Reaktion führt zu einer Abnahme der NMDA-Rezeptor-betriebenen Kanalaktivierung durch excitatorische Aminosäuren (wie NMDA oder Glutamat) und eine gleichzeitige Abnahme des intrazellulären Calcium-Einstroms und Verbesserung der Neurotoxizität.
  • Eine erhöhte Menge oder Wirkung von einer oder mehreren Glutamat-verwandten Verbindungen ist mit vielen neurodegenerativen Störungen (z.B. solchen, die vorstehend aufgeführt sind) verbunden. Zusätzlich zu Glutamat selbst kann sich neuronale Verletzung aus der Stimulierung des NMDA-Rezeptor-Kanal-Komplexes durch andere excitatorische Aminosäuren, wie Aspartat, Chinolinat, Homocysteinsäure, Cysteinsulfonsäure, Cystein, oder aus der Stimulierung durch excitatorische Peptide, wie N-Acetylaspartylglutamat, ergeben.
  • Verbindungen, die in der Erfindung nützlich sind (d.h. Nitroso-Verbindungen oder NO-erzeugende Verbindungen und ihre Derivate), können auf Wirksamkeit bei der Verringerung neuronaler Schäden unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Assays getestet werden – d.h. in Assays von NMDA-hervorgerufener Ionenstrom (siehe z.B. PCT WO 91/02810), in Assays von NMDA-hervorgerufenen Zunahmen von intrazellulärem [Ca2+] (siehe nachstehend) oder in Assays des neuronalen Zelltodes (siehe nachstehend). Eine wirksame Verbindung verursacht jeweils eine Abnahme der Ionenstrom, der intrazellulären Ca2+-Konzentration oder des neuronalen Zelltods. Die in der Erfindung am meisten bevorzugten Verbindungen sind solche, die den größten Schutz von Neuronen vor NMDA-Rezeptorkomplexvermittelter Verletzung bewirken, z.B. der Verletzung, die sich aus der Stimulierung des NMDA-Rezeptors durch NMDA (wie nachstehend gezeigt) oder andere excitatorische Aminosäuren oder aus der Stimulierung durch excitatorische Peptide, wie N-Acetylaspartylglutamat, ergibt.
  • Assay für neuronale Zellenfunktion und -tod
  • Um Verbindungen auf ihre Fähigkeit, Neurotoxizität zu verhindern, zu testen, kann der neuronale Zelltod wie folgt geprüft werden. Neonatale kortikale Neuronen wurden gemäß dem allgemeinen Verfahren von Snodgrass et al. (1980) Brain Res. 190:123–138; und Rosenberg et al. (1988) J. Neurosci. 8:2887–2899 präpariert. Kulturen werden im Anschluss an eine kurze Einwirkung (5–30 Minuten) von 30–100 μM NMDA oder von 5 mM DTT (5 Minuten lang), gefolgt von 30–100 μM NMDA (5–30 zusätzliche Minuten lang) und Inkubation über Nacht (d.h. 16 bis 24 Stunden) überwacht. Experimente in vivo legen nahe, dass ein transienter chemischer Reduktionszustand im Anschluss an einen Schlaganfall im Gehirn besteht; die Einbringung des chemischen Reduktionsmittels DTT kann diese reduzierende Umgebung nachahmen, wobei die Ähnlichkeit des in vitro-Assays auf die in vivo-Situation erhöht wird. Die Kandidatenverbindung wird durch Zugabe (z.B. in einer Reihe von Konzentrationen, die im Bereich von 0,1 nM–10 mM liegen) nach DTT-Behandlung, aber vor NMDA-Behandlung getestet. Die Kandidatenverbindung kann Minuten, Stunden oder sogar Tage vor ihrem Auswaschungszeitraum zugefügt werden. Im Anschluss an die Einwirkung von NMDA werden die Kulturen zusätzliche 16–24 h lang bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2/95% Luft inkubiert. Neuronale Kulturen werden nach dieser Inkubation über Nacht auf Zellüberleben gezählt, weil die NMDA-Toxizität häufig bis zu mehreren Stunden im Anschluss an die Einwirkung von NMDA verzögert ist. Die Fähigkeit von kortikalen Neuronen, phasenhelles Aussehen beizubehalten und Trypanblau auszuschließen, wird als Index des Überlebens verwendet (Rosenberg et al., Neurosci. Lett. 103: 162–168, 1989).
  • Messung von intrazellulärem Ca2+
  • Die Konzentration von intrazellulärem freiem Ca2+ ([Ca2+]i) wird in neonatalen kortikalen Neuronen durch digitale bilderzeugende Mikroskopie mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura 2 wie folgt gemessen. Dieselben kortikalen neuronalen Kulturen, wie vorstehend beschrieben, werden verwendet. Während der Ca2+-Messungen besteht, wenn nicht etwas anderes angegeben ist, das Fluid, das die Neuronen badet, aus Hanks' ausgeglichenen Salzen (Hanks' balanced salts): 137,6 mM NaCl, 1 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 5,36 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 0,5 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5 mM Hepes NaOH, 22,2 mM Glukose und gelegentlich mit Phenolrotindikator (0,001% v/v); pH 7,2. NMDA (in Abwesenheit Mg++), Glutamat und andere Stoffe werden normalerweise durch Druckeinspritzung auf die Neuronen nach Verdünnung in dieser Badlösung aufgebracht. Neuronale [Ca2+]i wird mit Fura 2-acetoxy-methylester (AM), wie beschrieben, analysiert [Grynkiewicz, et al., J. Biol. Chem. 260:3440 (1985); Williams et al., Nature 318:558 (1985); Connor et al., J. Neurosci. 7:1384 (1987); Connor et al., Science 240:649 (1988); Cohan et al., J. Neurosci. 7:3588 (1987); Mattson, et al., ebenda, 9:3728 (1989)]. Nach dem Zufügen von Eagle's minimales essentielles Medium (Eagle's minimum essential medium), das 10 μM Fura 2-AM enthält, zu den Neuronen werden die Kulturen bei 37°C in einer Feuchtkammer mit 5% CO2/95% Luft inkubiert und dann gespült. Der Farbstoff wird innerhalb 1 Stunde geladen, eingeschlossen und verseift, wie durch stabile Fluoreszenzverhältnisse bestimmt, und die Wirkung des Ca2+-Ionophors Ionomycin auf die [Ca2+]i wird gemessen. Während der Ca2+-Bilderzeugung werden die Zellen in einer Lösung von Hepes-gepufferter Kochsalzlösung mit Hanks' ausgeglichenen Salzen inkubiert. Die [Ca2+]i wird aus Verhältnisbildern berechnet, die durch Messen der Fluoreszenz bei 500 nm erhalten werden, die durch Licht von 350 und 380 nm mit einer DAGE MTI 66 SIT- oder einer QUANTEX QX-100 Intensified CCD-Kamera angeregt wird, die an einem Zeiss Axiovert 35-Mikroskop angebracht ist. Die Belichtungszeit für jede Abbildung beträgt 500 ms. Die Analyse wird mit einem Quantex QX7-210 Bildverarbeitungssystem (Sunnyvale, CA) durchgeführt. Weil die Zellen Ultraviolettlicht nur während der Datensammlung (allgemein weniger als insgesamt 20 s pro Zelle) ausgesetzt sind, ist das Bleichen von Fura 2 minimal. Es ist gezeigt worden, dass verzögerte NMDA-Rezeptorvermittelte Neurotoxizität mit einer frühen Zunahme der intrazellulären Ca2+-Konzentration verbunden ist.
  • Patch-Clamp-Aufnahme
  • Patch-Clamp-Aufnahmen wurden in der Ganzzellkonfiguration allgemein unter Verwendung des Verfahrens durchgeführt, das von Hamill et al. (1981) beschrieben ist, wie durch Lipton und Tauck (1987); und Aizenman et al. (1988) modifiziert wurde. Die Patch-Clamp-Pipetten enthielten typischerweise 140 mM KCl (oder 120 mM CsCl und 20 mM TEA-Cl), 2 mM MgCl2, 2,25 mM EGTA, 10 mM HEPES-NaOH (pH 7,2). Redox-Reagenzien wurden durch Superfusion (3,5 ml/min) verabreicht, während NMDA und Glycin durch die Pufferpipette immer zusammen verabreicht wurden.
  • Eine Verbindung kann auf Nützlichkeit im erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung eines neuronalen Zelltyps aus dem Zentralnervensystem getestet werden, solange die Zelle durch herkömmliche Verfahren intakt isoliert werden kann. Obwohl Kulturen kortikaler Neuronen vorstehend verwendet werden, können auch Netzhautganglienzellneuronen, Rückenmarkneuronen, zerebellare granuläre Neuronen oder jedes Neuron, das NMDA-Rezeptoren (z.B. Neuronen von anderen Regionen der Rinde) enthält, verwendet werden. Derartige Neuronen können prenatal oder postnatal sein.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verbindungen, die im erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, und ihre Wirksamkeit beim Verringern neuronaler Schäden. Diese Beispiele werden zur Veranschaulichung der Erfindung bereitgestellt.
  • Obwohl die Beispiele 1 bis 4, 6 und 7 keine Verbindungen verwenden, die im Schutzbereich der Erfindung liegen, werden sie bereitgestellt, um Verfahren zu veranschaulichen, welche verwendet werden können, um die klinischen Wirkungen der Nitroso-Verbindungen zu bewerten, welche im Schutzbereich der Erfindung liegen.
  • Beispiele 1–4: NTG- oder SNP inhibiert NMDA-induzierte Zunahmen der [Ca++] in kortikalen Neuronen der Ratte in Kultur.
  • In diesem Experiment wurde die Wirkung von NTG auf die intrazellulären [Ca++]-Zunahmen, die durch NMDA induziert wurden, unter Verwendung von digitalen [Ca++]-Bilderzeugungsverfahren, die auf dem Farbstoff Fura-2 beruhen, verfolgt.
  • Genauer schließt das Modell für NMDA-vermittelte Neurotoxizität die Einwirkung von NMDA auf gezüchtete kortikale Neuronen der Ratte in Gegenwart von Glycin (einem Coagonisten) ein. NMDA (50 μM) induziert eine Zunahme der [Ca++]i (intrazelluläre Calciumionenkonzentration), die ferner nach Einwirkung des starken Reduktionsmittels, Dithiothreitol (DTT), erhöht wird. Die chemische Reduktion der Thiolgruppe(n) der NMDA-Redox-Modulationsstelle mit DTT erhöht die neurotoxische Wirkung von NMDA. Der Antagonismus der NMDA-Rezeptor-vermittelten Neurotoxizität durch NTG wird wie folgt dargelegt.
  • Kortikale Kulturen wurden aus embryonalen (fötaler Tag 15 oder 16) Sprague-Dawley-Ratten, wie vorher beschrieben (Dichter, 1978; Rosenberg und Aizenman, 1989), gewonnen. Kurz zusammengefasst, wurden im Anschluss an die Dissoziation in 0,027% Trypsin die zerebralen kortikalen Zellen mit einer Dichte von 4,5 × von 105 pro 35 mm-Schale ausplattiert, die Poly-Llysin-beschichtete Deckgläser in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) mit Ham's F12 und hitze-inaktiviertes eisen-ergänztes Kälberserum (Hy-Clone) in einem Verhältnis von 8:1:1 enthält. Nach 15 Tagen in Kultur (wenn die Astrozyten-Schicht konfluent geworden war) wurden die Kulturen 72 Stunden lang mit Cytosinarabinosid behandelt. Das Kulturmedium wurde 3mal wöchentlich erneuert. Die Kulturen wurden bei 36°C in einer Feuchtatmosphäre mit 5% CO2, 95% Luft inkubiert. Die Kulturen wurden für Experimente bei Raumtemperatur (21°C–24°C) ungefähr 1 Monat nach dem Ausplattieren verwendet. Neuronen konnten durch morphologische Kriterien unter Phasenkontrastoptik zuverlässig identifiziert werden, wie später durch Patch-Clamp-Aufnahme bestätigt wurde.
  • Um Physiologieexperimente (Ca2+-Bilderzeugung oder Patch-Clamp) unter normalen Raumluftbedingungen zu ermöglichen, wurde direkt vor einer Aufnahmesitzung das Kulturmedium gegen eine Lösung ausgetauscht, die auf Hanks' ausgeglichenen Salzen beruht (wie vorstehend mit 1,25–2,5 mM CaCl2 definiert). Um physiologische Reaktionen auf NMDA zu erhöhen, war die Kochsalzlösung nominal Mg2+-frei und enthielt 1 μM Glycin, einen Coagonisten, der für die NMDA-Rezeptoraktivierung erforderlich ist (Johnson und Ascher, 1987; Kleckner und Dingledine, 1988). Tetrodotoxin (1 μM) wurde zugefügt, um Aktionspotentiale und nachfolgende Neurotransmitterfreisetzung aus anderen Neuronen auf die Zelle von Interesse zu blockieren. Die Gegenwart von intakter Neurotransmission konnte die Ergebnisse verschleiern, wenn zum Beispiel viel K+, Kainat oder NMDA die Freisetzung eines Stoffs aus einem Neuron verursachte, das wiederum auf die zu überwachende Zelle wirkte.
  • 1 zeigt Quantifizierungen von [Ca2+]i von digitalen Darstellungen von Fura-2-Bildern im Laufe der Zeit für fünf kortikale Neuronen auf dem Gebiet, für das Bilderzeugung durchgeführt wurde. DTT, NTG, DTNB (5,5-Dithio-bis-2-nitrobenzoesäure) wurden (in dieser Reihenfolge) ungefähr 2 Minuten lang aufgebracht und vor dem Datensammeln von NMDA-hervorgerufenen [Ca2+]i-Reaktionen ausgewaschen. Diese Daten wurden direkt nach der Einwirkung von 50 μM NMDA gesammelt. In den 1 und 2 wurde die NMDA-induzierte [Ca2+]i-Reaktion nach DTT-Vorbehandlung auf 100% eingestellt. Vor der DTT-Vorbehandlung betrug die NMDAinduzierte [Ca2+]i-Reaktion etwa 68%. Im Anschluss an DTT verringerte die nachfolgende NTG- oder SNP-Behandlung die NMDA-hervorgerufene [Ca2+]i-Reaktion auf 60% oder weniger. Das starke Oxidationsmittel DTNB verringerte auch die NMDA-hervorgerufenen [Ca2+]i-Reaktionen. Nachfolgende Behandlung mit DTT stellte die NMDA-hervorgerufene [Ca2+]i-Reaktion wieder auf 100% her.
  • Beispiel 2:
  • Kortikale Kulturen wurden hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und wurden mit DTT vorbehandelt, gewaschen und mit 100 μM NTG, gefolgt von 50 μM NMDA behandelt. In 3 NTG verringerte NTG anhaltend die NMDA-hervorgerufene [Ca2+]i-Reaktion, und diese Abnahme blieb durch wiederholte erneute Verabreichung von NMDA bestehen. Erneute Verabreichung von DTT kehrte die Wirkung von NTG um.
  • Beispiel 3:
  • Die vorstehend beschriebenen kortikalen Kulturen wurden hergestellt, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, und Patch-Clamp-Aufnahmen wurden an Steile von digitaler Ca2+-Bilderzeugung durchgeführt. Spezifisch wurde NMDA (50 μM) zusammen mit Glycin (1 μM) aus einer pneumatischen Pipette aufgebracht. Eine derartige Anwendung hatte einen nach innen gerichteten Strom von –60 mV zur Folge, wobei die Zellspannung an ein Haltepotential angeschlossen wurde. Eine 2 Minuten lange Inkubation mit DTT (gefolgt von Auswaschung) erhöhte den NMDA-hervorgerufenen Strom. Dieser Strom wurde anschließend nach 2 Minuten langer Einwirkung von NTG (und Auswaschung) vermindert. Erneute Anwendung von DTT (gefolgt von Auswaschung) erhöhte die gegenwärtige Reaktion auf ihren vorhergehenden Wert.
  • 4 veranschaulicht aufeinanderfolgende Kompilation der NMDA-hervorgerufenen Peakströme für 18 Zellen im Anschluss an die Behandlung (und nachfolgender Auswaschung) jedes Redoxreagenzes, das auf der Abszisse aufgeführt ist. Die zeitliche Reihenfolge der Zugabe der Redoxreagenzien ist auf der Abszisse angezeigt. Die Werte sind Mittelwerte ±SEM, die auf die Reaktion bei 50 μM NMDA normalisiert sind, die nach Einwirkung von DTT beobachtet wird, um einen Vergleich unter mehreren Zellen zu erlauben. Reaktionen auf NMDA, die statistisch kleiner als solche sind, die vorher direkt nach der DTT-Einwirkung erhalten wurden, sind mit einem Sternchen gekennzeichnet (P < 0,001, ANOVA, gefolgt von Mehrfachvergleich von Mittelwerten nach Scheffé).
  • Eine 2 Minuten lange Einwirkung von DTT (2 mM, gefolgt von Auswaschung) erhöhte die NMDA-aktivierten Ströme, wohingegen die Zugabe von NTG (500 μM, gefolgt von Auswaschung) die Reaktionen hemmte. Nachfolgende Inkubation in DTNB (500 μM, 2 Minuten lang, gefolgt von Auswaschung) verringerte die Reaktionen etwas.
  • Beispiel 4:
  • Das Experiment von Beispiel 3 wurde mit 1–5 mM NEM, N-Ethylmalemid, ein Mittel, das bekannt ist, Sulfhydryl (Thiol-) Gruppen von Proteinen zu alkylieren, wiederholt. Im Anschluss an die Alkylierung beeinflussten weder NTG noch DTNB die Amplitude des NMDA hervorgerufenen Stromes erheblich, was anzeigt, dass die Redox-Modulationsstelle des NMDA-Rezeptors, die Stelle, die mit der NO-Gruppe reagiert, (eine) Thiolgruppe(n) umfasst.
  • Beispiel 5: SNOC verringert NMDA-hervorgerufene [Ca2+]i-Reaktionen
  • S-Nitrosocystein (SNOC) setzt sowohl NO• frei als auch nimmt es an der Nitrosierung (NO+-Äquivalente, die mit Proteinthiolgruppen reagieren) teil. 5A ist eine digitale Darstellung von Fura-2-Calcium-Bildern, wie vorstehend beschrieben, für 10 kortikale Neuronen auf einem einzelnen Gebiet. Im Anschluss an jede Reaktion auf NMDA kehrte die [Ca2+]i innerhalb 1 Minute zum Grundlinienwert zurück (Daten für Klarheit nicht gezeigt). Die Datenpunkte werden durch gestrichelte Linien bloß verbunden, um die zeitliche Reihenfolge der Zugabe hervorzuheben. In jedem Fall wurde 2 mM DTT -2 Minuten lang aufgebracht und dann vor der Anwendung von NMDA und der Datensammlung ausgewaschen. Die Werte sind Mittelwerte ±SEM, die auf die NMDA- (50 μM) Reaktion normalisiert wurden, die nach Einwirkung von DTT (maximale Reaktion ~750 nM [Ca2+]i) erhalten wurde.
  • Im Anschluss an die maximale chemische Reduktion mit DTT wurde die NMDA-hervorgerufene Reaktion erhöht, wurde aber anschließend durch eine 3 Minuten lange Einwirkung von 100 μM S-Nitrosocystein (SNOC) inhibiert. Im Anschluss an die Auswaschung von S-Nitrosocystein erholte sich die NMDA-ausgelöste Reaktion nur etwas. Eine zweite Einwirkung von DTT kehrte die Inhibitionswirkung von S-Nitrosocystein völlig um. Reaktionen auf NMDA, die statistisch kleiner als solche sind, die direkt nach der DTT-Einwirkung erhalten wurden, sind mit einem Sternchen gekennzeichnet (P < 0,01, ANOVA, gefolgt von Mehrfachvergleich von Mittelwerten nach Scheffé). 5B zeigt, dass Vorbehandlung mit NEM die Wirkung von SNOC durch Alkylierung von Thiolgruppe(n) blockiert, wobei folglich Transnitrosierung der NO-Gruppe auf die NMDA-Rezeptorthiolgruppe(n) verhindert wird.
  • Beispiel 6: Nitroglyzerin (NTG) oder Natriumnitroprussid (SNP) verhindert NMDA-Rezeptor-vermittelte Neurotoxizität
  • Unter Verwendung eines vorstehend beschriebenen Neurotoxizitätsassays wurden die Verbindungen Natriumnitroprussid und Nitroglyzerin einzeln auf ihre Fähigkeit getestet, das Überleben von neonatalen kortikalen Neuronen zu erhöhen. Die neuronalen Zellen wurden 16–24 Stunden lang bei 37°C in einer Feuchtatmosphäre von 5% CO2 und 95% Luft inkubiert.
  • Wie in den 6A–6D gezeigt, werden überlebende Neuronen als der Prozentsatz von lebensfähigen Neuronen in den Kontrollkulturschalen in demselben Experiment ausgedrückt. Die Konzentrationen von Arzneistoffen waren wie folgt: APV (2 mM), NTG (100 μM), SNP (400 μM), DTT (0,5–2 mM) und reduziertes Hb (500 μM). In den Experimenten mit NTG wurden die Kulturen 30 Minuten lang 30 μM NMDA ausgesetzt; für die SNP-Experimente betrug die Einwirkung 5 Minuten lang 75 μM NMDA. Für die Experimente mit Hb wurde NTG oder SNP mit einer chemisch reduzierten, gereinigten Zubereitung von Hb vor der Zugabe zu den Kulturen vorinkubiert. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM für Experimente, die in dreifacher Ausführung auf Geschwisterkulturen an unterschiedlichen Tagen (Gesamtmenge von 32 Experimenten) laufen. Sternchen zeigen den wesentlichen Unterschied im Vergleich mit dem Wert für DTT-NMDA-Einwirkung an, P < 0,05 (ANOVA, gefolgt von Mehrfachvergleich von Mittelwerten nach Scheffé).
  • Wir stellten fest, dass entweder NTG oder SNP die neuronale Verletzung verbesserte, die durch die Zugabe von NMDA nach Einwirkung von DTT erzeugt wurde (6A und 6B). Die letztere Verbindung wurde zugefügt, um chemische Reduktion der Redox-Modulationsstelle hervorzurufen, um den NMDA-aktivierten Strom, [Ca2+]i-Reaktionen und Neurotoxizität zu maximieren (wie in der Literatur berichtet). Die Tatsache, dass eine supramaximal wirksame Konzentration des NMDA-Rezeptor-spezifischen Antagonisten APV (2 mM) in Verbindung mit NTG, das den neuronalen Zelltod zu einem größeren Grad als APV alleine nicht verhindern konnte, legt nahe, dass die letalen Wirkungen über den NMDA-Rezeptor vermittelt wurden (6B). Außerdem beeinflusste die Einwirkung von 500 μM von reduziertem Hämoglobin (Hb), welches NO komplexiert, das neuronale Überleben unter diesen Bedingungen von sich aus nicht; jedoch inhibierte Hb die Wirkung von 100 μM NTG vollständig, was bedeutete, dass die Schutzwirkung durch NO vermittelt wurde (6C). Reduziertes Hb (500 μM) inhibierte auch die Schutzwirkung von 400 μM SNP vollständig, was erneut das Beteiligtsein von NO nahelegte (6D). Es ist wahrscheinlich, dass sich mindestens ein Teil der Neuroschutzwirkung von NO von der Oxidation der Redox-Modulationsstelle ableitet, weil vorher gezeigt worden ist, dass diese Wirkung die NMDA-Rezeptor-vermittelte Neurotoxizität vermindert.
  • Beispiel 7: Superoxiddismutase (SOD) plus Katalase kann Neurotoxizität verhindern, die durch Peroxynitrit (ONOO–) vermittelt wurde, das aus der Umsetzung von Stickoxid (NO•) mit dem Superoxidanion (O•2 –) erzeugt wurde
  • S-Nitrosocystein wurde als Quelle von NO• zu zerebrokortikalen Kulturen (Lei et al., (1992) Neuron 8:1087–1099; Stamler et al., (1992) Science 258:1898–1902) zugefügt. Inkubation in dieser S-Nitrosothiol- (RS-NO-) Verbindung erzeugte dosisabhängige Tötung von kortikalen Neuronen. Die neurotoxische Wirkung der maximal-letalen Konzentrationen von S-Nitrosocystein (200 μM) konnte durch gleichzeitige Zugabe von SOD und Katalase (jeweils 50 U/ml) verhindert werden (7A). Diese Feststellungen stimmen mit der sehr schnellen Freisetzung von NO• (t1/2(pH 7,4) von S-Nitrosocystein ~30 s) bei der Umsetzung mit endogenem 02•– zum Erzeugen von Peroxynitrit (ONOO–) mit nachfolgenden neuronalen Schäden überein.
  • Um zu testen, ob es tatsächlich Peroxynitrit ist (und/oder seine Zersetzungsprodukte), das neurotoxisch ist, zeigten wir als nächstes, dass gereinigtes OONO– Neuronen auf eine dosisabhängige Art und Weise tötet. Peroxynitrit führt zu Lipidperoxidation und massiver Oxidation von Sulfhydrylgruppen (Radi et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:4244–4250; Radi et al., (1991) Arch. Biochem. Biophvs. 288:481–487). Außerdem verhinderte, als vorausgesagt wurde, ob OONO– und/oder seine Zersetzungsprodukte neurotoxisch waren, die Umsetzung mit SOD (Ischiropoulos et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 298(2):431–436) und Katalase die letale Wirkung von Peroxynitrit auf Neuronen nicht (7B). Diese Experimente zeigen an, dass SOD und Katalase nützliche adjunktive Neuroschutzmittel sein könnten, die mit den Nitroso-Verbindungen, wie NTG und SNP, verabreicht werden könnten, um die NMDA-Rezeptorvermittelte Neurotoxizität zu verhindern, weil SOD plus Katalase die Erzeugung von neurotoxischem ONOO– aus jedem NO• verhindern würde, das durch die Zugabe der exogenen Nitrosoverbindungen erzeugt werden könnte.
  • Die Ergebnisse der vorstehenden Experimente, wie in 7 gezeigt, stellen das Superoxidanionenerfordernis der Neurotoxizität, die durch S-Nitrosocystein (SNOC) aber nicht Peroxynitrit (ONOO–) induziert wurde, bildlich dar. A, B, Superoxiddismutase (SOD, 50 U/ml) plus Katalase (Katze, 50 U/ml) verhinderte die Neurotoxizität, die durch SNOC induziert wird (200 μM, B). Neuronales Überleben wurde in Gegenwart von SOD/Katalase alleine im Vergleich mit dem, das in Geschwisterkontrollkulturen beobachtet wurde, nicht wesentlich beeinflusst. Als zusätzliche Kontrolle hatten 200 μM SNOC, die mehrere Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert worden waren, um alle NO•-Spezies freizusetzen; keine Neurotoxizität zur Folge (A, die ganz linken Säulen, beschriftet mit "altes SNOC"). Die Werte sind als Mittelwert + SEM ausgedrückt (n = 9). Statistische Vergleiche wurden durch eine Varianzanalyse, gefolgt von einem Mehrfachvergleich von Mittelwerten nach Scheffé durchgeführt (*, P < 0,01, verglichen mit Kontrolle; **, P < 0,05, verglichen mit Kontrolle; ✝, P < 0,01, verglichen mit Nitrosoverbindung + SOD/Katalase).
  • Genauer wurden die Daten in 7 unter Verwendung von gemischten neuronalen und kortikalen Gliakulturen aus neonatalen Ratten erzeugt, wie vorher beschrieben (Lei, et al., (1992) Neuron 8:1087–1099). In mindestens drei verschiedenen Experimenten wurden dreifache Kulturen über Nacht in Earle's gepufferter Kochsalzlösung-Lösung (EBSS), die verschiedene Konzentrationen von SNOC, Peroxynitrit, SOD, Katalase oder Glutamat enthält, inkubiert. Ähnliche Ergebnisse wurden jedoch bei 20 Minuten langen Inkubationen in Peroxynitrit erhalten, was mit den bekannten schnellen Wirkungen dieses starken Oxidationsmittels übereinstimmt. Die Kulturflüssigkeit wurde auf Laktasedehydrogenase (LDH) als Indikator von neuronalem Überleben durch Messen der die Absorption bei 450 nm getestet (Koh et al., (1987) J. Neurosci. Meth. 20:83–90). Die Kulturen wurden nach Fixierung in Glutaraldehyd 2,5% auch auf neuronale Lebensfähigkeit durch Zählen der Zellen allgemein mit 0,2% Trypanblau gezählt, wie vorstehend beschrieben. Neuronen aus Kulturen, die auf Deckgläschen mit einem Durchmesser von 15 mm gewachsen sind, wurden auf eine maskierte Art und Weise bei 200x in ~30 mikroskopischen Feldern gezählt. Kontrollkulturen, die auf diese Art und Weise gezählt wurden, enthielten typischerweise ungefähr 1000 lebensfähige Neuronen. Über den Bereich von hier veranschaulichten Werten gab es ein lineares Verhältnis zwischen den neuronalen Zellzahlen und den Ergebnissen der LDH-Lebensfähigkeit, wenn durch eine Standardkurve bestimmt, die auf Experimenten mit variierenden Konzentrationen von Glutamat (0–1 mM) beruht. Für LDH-Assays wurde das neuronale Überleben auf das normalisiert, was in Geschwisterkontrollkulturen (Wert von 100% Lebensfähigkeit) und in Gegenwart von 1 mM Glutamat (Wert von 0% Lebensfähigkeit) beobachtet wurde; Werte von etwas unterhalb von 0% wurden durch Extrapolation erhalten, unterschieden sich aber nicht wesentlich von 0%. Ähnliche Experimente an Kulturen von gereinigten Astrozyten (denen Neuronen fehlen) erzeugten keine Änderungen der LDH.
  • Therapie
  • Um neuronale Schäden zu verhindern, können Verbindungen, die in der Erfindung verwendet werden, durch einen von mehreren Wegen in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, um einen NMDA-hervorgerufenen Ionenstrom oder ein Ansteigen der [Ca2+]i oder Neurotoxizität zu vermindern. Die Verbindung kann in einer pharmazeutischen Zubereitung unter Verwendung eines pharmazeutischen Trägers (z.B. physiologische Kochsalzlösung) eingeschlossen sein; die genaue Formulierung des therapeutischen Gemisches hängt von dem Weg der Verabreichung ab. Vorzugsweise wird die Verbindung oral oder intravenös verabreicht, sie kann aber auch sublingual, durch ein Nasenspray, durch ein transdermales Pflaster, subkutan, intraventrikulär, intravitreal oder durch eine Salbe verabreicht werden.
  • Die in der Erfindung verwendeten Nitroso-Verbindungen, bei denen durch die hier beschriebenen Assays bestimmt wurde, dass sie wirksame Neuroschutzmittel sind, sind wie vorstehend bei einer Dosis zu verabreichen, die geeignet ist, neuronale Schäden oder NMDA-hervorgerufenen Ionenstrom oder erhöhte [Ca2+]i zu verringern. Allgemein werden derartige Verbindungen in Dosen verabreicht, die im Bereich von 0,01 mg–60 g/Tag, stärker bevorzugt in einer Dosis von 0,1–5 mg/Tag liegen.
  • Für den Fachmann ist es selbstverständlich, dass es andere Faktoren gibt, welche bei der Bestimmung der optimalen Dosis helfen. Zum Beispiel lässt sich für NO-konjugierte Arzneistoffe aus der Dosis, die für den nichtkonjugierten Arzneistoff verwendet wird (z.B. TPA eine Dosis von 0,35–1,08 mg/kg und allgemein < 0,85 mg/kg), auf die nützliche NO-konjugierte Dosis schließen. Die Dosen können geteilt werden. Die Behandlung kann, wenn erforderlich, wiederholt werden, um neurologische Verletzung zu verhindern oder zu vermindern. Es ist wünschenswert, die Mengen von NO oder verwandter Redox-Spezies im Gehirn von 1 nM bis 500 μM beizubehalten.
  • Für die hier beschriebenen ZNS-Schutzzwecke können Nitroso-Verbindungen zusammen mit blutdruckerhöhenden Mitteln (z.B. Dopamin) akut verabreicht werden, um ein Abfallen des systemischen Blutdrucks zu verhindern.
  • Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen können nützlich sein, um gegen mehrere neurotoxische Erkrankungen zu schützen, die mit erhöhten Mengen oder Wirkungen von Glutamat oder verwandten Verbindungen verbunden sind. Derartige Erkrankungen werden durch Stimulierung von NMDA-Rezeptoren oder durch stromabwärtsgerichtete Wirkungen von NMDA-Rezeptor-Überstimulierung vermittelt. Diese Erkrankungen schließen Ischämie, Hypoxie, Hypoglykämie, Trauma des Nervensystems, Epilepsie, Huntingtonsche Krankheit, Alzheimersche Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Parkinsonsche Krankheit und andere neurodegenerative Erkrankungen ein. Ererbte oder erworbene chemische Erkrankungen, die mindestens teilweise durch die NMDA-Rezeptor-Aktivierung vermittelt wird, können auch behandelt werden. Diese schließen Hyperammonämie, hepatoportale Enzephalopathie, Hyperglycinämie und andere ein (siehe Tabellen 1 und 2). Neuropathische Schmerzsyndrome, wie Kausalgie, können auch auf diese Art und Weise vermittelt werden und können mit den Verbindungen der Erfindung behandelt werden. Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen sind für die Behandlung des AIDS-Demenzkomplexes (HIV-verbundener kognitiver/motorischer Komplex plus inzipiente Formen von kognitiven, motorischen und sensorischen Defiziten, die noch nicht die stringenten Kriterien für diese Komplexe erfüllen) und anderer neurologischer Manifestationen des AIDS-Virus (HIV-1 oder HIV-2) besonders bevorzugt. Die Verbindungen können auch zur Verringerung von neuronalen Schäden verwendet werden, die sich aus einer Infektion mit anderen Viren, wie Masern, ergeben, welche Schäden des Nervensystems verursachen. Andere Krankheiten, die vorstehend aufgeführt sind, können behandelt werden.
  • Ein Gesichtspunkt der Erfindung kennzeichnet die Verwendung der vorher beschriebenen Verbindungen bei der Herstellung eines Medikaments zur verlängerten Verabreichung von zunehmenden Dosen von NO-erzeugenden Verbindungen, um die Toleranz der Gefäßwirkungen (Koronararterienerweiterung, Blutdrucksenkung usw.) zu erzielen, wodurch höhere Dosen der Verbindungen zum Neuroschutz ermöglicht werden. Ein bestimmter Weg, dieses Ziel zu erreichen, ist, die NO-erzeugende Verbindung unter Verwendung gut etablierter Pflasterverfahren transdermal zu verabreichen. Gegenwärtige transdermale Nitroglyzerinpflaster stellen etwa 0,2–0,8 mg/h bereit. Sie weisen eine typische Oberfläche von 10–30 cm2 auf. Das Standardprotokoll zur Verwendung derartiger Pflaster beschränkt ihre Verwendung auf etwa 12 ununterbrochene Stunden, um systemische Toleranz zu vermeiden.
  • Um systemische Toleranz zu erzielen und dadurch die NO-erzeugengenden Mengen zu erhöhen, die für den Neuroschutz verfügbar sind, beginnt ein Patient mit einem Regime der Therapie ähnlich dem, das gegenwärtig für Herzzustände verwendet wird (z.B. Pflaster, das mit etwa 2–4 mg Nitroglyzerin beladen ist, um etwa 10 Stunden lang verwendet zu werden, oder etwa 0,2–0,4 mg/h). Dieses Regime wird kontinuierlich ohne eine wesentliche Lücke (nicht mehr als 4–6 Stunden) verfolgt. Stufenweise (z.B. nach einem Tag) wird die Dosis erhöht, und der Blutdruck wird überwacht, um sicherzustellen, dass die systemische Toleranz erreicht worden ist. Die Geschwindigkeit der Zunahme hängt vom Patienten ab, schließt aber allgemein eine Verdoppelung der Dosis alle 24 Stunden über einen Zeitraum von 2-3 Tagen ein. Typischerweise werden Mengen von etwa 3–4mg/h erzielt, aber die Dosis könnte auf bis zu 2,5 g/h gehen. Die Dosis kann durch die Erhöhung der Beladung des vorhandenen Pflasters, durch Erhöhung der Oberfläche von ähnlich beladenen Pflastern oder durch die Erhöhung der Leistungsfähigkeit der Permeabilität und der Frequenz der erneuten Verabreichung der Pflaster erhöht werden. Der Fachmann erkennt, dass es viele Wege gibt, das Ziel der systemischen Toleranz zu erreichen. In einem spezifischen Verfahren können farbkodierte Pflaster verwendet werden, um die Möglichkeit für Fehlanwendung (z.B. rot, dann weiß, dann blau) zu verringern. Die Farben würden die Reihenfolge der Verwendung der jeweiligen Pflaster bedeuten.
  • Andere Ausführungsformen
  • Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen sind nützlich zum Verringern neuronaler Verletzung in einem Säugetier mit NMDA-Rezeptoren. Behandlung von neuronalen Schäden in Menschen ist die bevorzugte Verwendung; aber die Verbindungen können auch erfolgreich für Veterinärzwecke verwendet werden. Die NO-erzeugende Verbindung kann zusammen mit anderen Redoxverbindungen verabreicht werden, um Superoxid- (O2•–)-verbundene Schäden zu regulieren. Stickoxid (NO•) ist bekannt, mit O2•– zu reagieren, um Peroxynitrit (ONOO–) zu erzeugen, von welchem wir gezeigt haben, dass es toxisch zu Neuronen ist (siehe 7, vorstehend). Superoxiddismutase (SOD) plus Katalase verringert das O2•–, das für diese Umsetzung verfügbar ist, und könnte deshalb den Neuroschutz erhöhen, indem sie die NO-Umsetzung der Nitrosierung (Übertragung von NO+-Äquivalenten auf Thiolgruppen) vorherrschen ließen, um Schutz durch Herunterregulieren der Redox-Modulationsstelle des NMDA-Rezeptors bereitzustellen. SOD plus Katalase oder ähnlich wirkende Verbindungen können mit Polyethylenglykol verabreicht werden, um ihre Absorption in das ZNS und die Wirksamkeit zu erhöhen (Liu et al., (1989) Am. J. Physiol. 256:589–593). Ein SOD-Nachahmer, das proteingebundene Polysaccharid von Coriolus versicolor QUEL, bezeichnet als "PS-K", kann auch durch parenterale oder orale Wege der Verabreichung wirksam sein, besonders mit PEG, um die ZNS-Absorption zu erhöhen. PQQ (Pyrrolochinolinchinon – siehe US-Patent Nr. 5,091,391, Esterderivate von PQQ oder andere Chinone, wie Ubichinon) könnte auch nützlich sein, um ein Elektron von NO• oder von O2•– aufzunehmen, um die Umsetzung in Richtung Nitrosierung mit NO+-Äquivalentspezies und folglich in Richtung Neuroschutz zu treiben.
  • Ähnlich würden andere nützliche Mittel entweder alleine oder als adjunktive Mittel (mit Nitroso-Verbindungen zu verabreichen) die NO•-Produktion beschränken (z.B. Stickoxidsynthase- (NOS-) Inhibitoren). Eine derartige Behandlung würde die Erzeugung von Peroxynitrit (ONOO–) und folglich neuronale Verletzung vermeiden; z.B. Beitrag zum AIDS-Demenzkomplex und anderen neurologischen Manifestationen von AIDS. Diese Mittel sind in Tabelle 3 aufgeführt (eingeschlossen).
  • TABELLE 1
  • Akute neurologische Störungen mit neuronalen Schäden, von denen angenommen wird, dass sie mindestens teilweise durch excitatorische Aminosäuren vermittelt werden
    • i. Domosäurevergiftung von kontaminierten Miesmuscheln
    • ii. zerebrale Ischämie, Schlaganfall
    • iii. Hypoxie, Anoxie, Kohlenmonoxidvergiftung
    • iv. Hypoglykämie
    • v. verlängerte epileptische Anfälle
    • vi. mechanisches Trauma des Nervensystems
    • vii. Pb- (Blei-) Vergiftung
  • TABELLE 2
  • Chronische neurodegenerative Krankheiten mit neuronalen Schäden, von denen angenommen oder vorgeschlagen wird, dass sie mindestens teilweise durch excitatorische Aminosäuren vermittelt werden.
    • i. Neurolathyrismus-BOAA (β-N-Oxalylamino-L-alanin) in Kichererbsen
    • ii. Guam-Krankheit-BMAA (β-N-Methylamino-L-alanin) im Mehl von Zykassamen
    • iii. Hungtingtonsche Krankheit
    • iv. ALS (amyotrophe Lateralsklerose)
    • v. Parkinsonismus
    • vi. Alzheimersche Krankheit
    • vii. AIDS-Demenzkomplex (HIV-verbundener kognitiver/motorischer Komplex)
    • viii. olivopontozerebellare Atrophie (einige rezessive Formen, die mit einem Glutamatdehydrogenasemangel verbunden sind)
    • ix. hepatoportale Enzephalopathie
    • x. Tourette-Syndrom
    • xi. Mitochondriale Abnormitäten und andere ererbte biochemische Störungen a. MELAS-Syndrom (mitochondriale Myopathie, Enzephalopathie, Laktatazidose und schlaganfall-ähnliche Episoden) b. Rett-Syndrom c. Homocysteinurie d. Hyperprolinämie e. Hyperglycinämie f. Hydroxybutyraminoazidurie g. Sulfitoxidasemangel
  • TABELLE 3
  • Stickoxidsynthase-Inhibitoren:
    • 1. Argininanaloga, die N-Mono-methyl-L-arginin (NMA) einschließen
    • 2. N-Amino-L-arginin (NAA)
    • 3. N-Nitro-L-arginin (NNA)
    • 4. N-Nitro-L-arginin-methylester
    • 5. N-Iminoethyl-L-ornithin
    • 6. Diphenyleniodonium und Analoga siehe Steuhr, FASEB J 5:98–103 (1991)
    • 7. Diphenyliodonium, Calmodulin-Inhibitoren, Trifluoparizin, Calmidazoliumchlorid
    • 8. Phospholipase A2-Inhibitoren, wie Aristolochinsäure
    • 9. Calcineurin-Inhibitoren, z.B. FK-506, Cyclosporin A und Analoga, die Rapamycin einschließen (inhibieren Calcineurin und folglich Stickoxidsynthase durch Inhibieren ihrer Dephosphorylierung)

Claims (19)

  1. Verwendung einer Nitroso-Verbindung, die Stickoxid oder verwandte Redox-Spezies von Stickoxid erzeugt, oder eines physiologisch akzeptablen Salzes einer solchen Verbindung, in einer Konzentration, die wirksam Neuroschutz bewirken kann, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von NMDA-Rezeptor-vermittelten neuronalen Schäden in einem Säugetier, vorausgesetzt, die genannte Verbindung ist kein Nitroglycerin, Nitroprussid oder Nitroglycerindrivat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isosorbidmononitrat, Isosorbiddinitrat; Nitroglycerin sublingual, NT-1, Niotrocor, Nitroderm, Nitrodisc, Nitrodur, Nitro-Dur II, Nitrofilm, Nitrogard, Nitroglin, Nitropen, Tridil und 6-Chloro-2-pyridylmethylnitrat.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Medikament zur Behandlung eines mit einem Virus infizierten Menschen dient, vorzugsweise Masern oder der HIV-(Human Immunodeficiency Virus)-Virus, der das Nervensystem befällt.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der genannte Mensch Symptome von AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) oder einem AIDS-verwandten Komplex manifestiert.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Medikament zur Behandlung eines Säugetiers dient, das an einer akuten Störung leidet, bestehend aus Hypoxie, Anoxie, Kohlenmonoxidvergiftung, Ischämie, CNS-Trauma, Hypoglyzämie, Anfälle, Schlaganfall, Domosäurevergiftung oder Bleivergiftung.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Medikament zur Behandlung eines Säugetiers verwendet wird, das an einer neurodegenerativen Störung leidet.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die genannte neurodegenerative Störung aus Folgenden besteht: Alzheimersche Krankheit, Huntingdonsche Krankheit, amyotrophe laterale Sklerose (ALS oder Motor-Neuron-Erkrankung), Parkinsonsche Krankheit, Neurolathyrismus, Guam-Krankheit, olivopontozerebellare Atrophie, hepatische Enzephalopathie, Tourette-Syndrom, MELAS-Syndrom (mitochondriale Myopathie, Enzephalopathie, Milchazidose und schlaganfallähnliche Anfälle), Rett-Syndrom, Homocysteinurie, Hyperprolinämie, Hyperglycinämie, Hydroxybutyraminoazidurie und Sulfitoxidasemangel.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Medikament zur Behandlung eines Säugetiers dient, das an einem neuralen Schmerzsyndrom, vorzugsweise neuropathischen Schmerzsyndromen, Kausalgie oder schmerzhaften Typen von peripherer Neuropathie leidet.
  8. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die genannte Verbindung ausgewählt ist aus: a. S-nitroso-Captopril (Snocap); b.Serumalbumin in Verbindung mit Stickoxid („SA-NO"); c. Kathepsin in Verbindung mit Stickoxid (Kathepsin-NO); d. Gewebeplasminogenaktivator in Verbindung mit NO (TPA-NO); e. SIN-1 (oder Molsidomin); f. Kation-Nitrosylkomplexe, vorzugsweise Fe2+-Nitrosylkomplexe; g. Nicorandil; und h. S-Nitrosoglutathion.
  9. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die genannte Verbindung NO in Verbindung mit einem Adamantimderivat, vorzugsweise Memantin; einem S-Nitrosothiol, vorzugsweise S-Nitrosocystein; oder einem Sydnonimin oder einem Nonoat mit der Formel X-N-O–,
    Figure 00230001
    gekoppelt ist, wobei X ein Nucleophil, vorzugsweise ein Amin ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die genannte Nitrosoverbindung aus solchen Verbindungen ausgewählt ist, die nach einer anfänglichen Verabreichung an ein Säugetier eine Blutdrucksenkung bewirken, und wobei die genannte Behandlung die Verabreichung im Laufe der Zeit mit zunehmenden Dosen beinhaltet, so dass die Wirkung der genannten Verbindung auf den Blutdruck abnimmt.
  11. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das genannte Medikament die genannte Nitrosoverbindung in Kombination mit einem Mittel, vorzugsweise Dopamin, umfasst, das den systemischen Blutdruck erhöht.
  12. Verwendung nach Anspruch 1 durch kontinuierliche Verabreichung der genannten Nitrosoverbindung für einen längeren Zeitraum, vorzugsweise mehr als 12 Stunden und vorzugsweise mehr als 24 Stunden, mit allmählich eskalierender Dosis zum Erzielen einer systemischen Toleranz der genannten Verbindung, beginnend mit einer ersten Dosis, die den Blutdruck des Patienten nicht erheblich senkt, und ansteigend zu einer späteren Dosis, wobei die genannte spätere Dosis hoch genug ist, um bei Verabreichung an einen naiven Patienten den Blutdruck des genannten Patienten erheblich zu senken, die aber nicht ausreicht, um den Blutdruck des genannten Patienten nach Erhalt der genannten kontinuierlichen Verabreichung über einen längeren Zeitraum erheblich zu senken.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die genannte Verbindung in mehreren progressiv zunehmenden Dosen verabreicht wird, bis die genannte spätere Dosis erzielt ist, und die genannte Verbindung dann in mehreren Dosen auf dem genannten späteren Dosisniveau verabreicht wird.
  14. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die genannte Verbindung oral oder durch einen transdermalen Patch verabreicht wird.
  15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das genannte Medikament ferner eine Komponente umfasst, die ausgewählt ist aus Superoxiddismutase (SOD); SOD mimic einschließlich PS-K; Catalase und Kombinationen von wenigstens zwei Inhaltsstoffen, wobei der genannte erste Inhaltsstoff SOD oder die genannte Mimic und der genannte zweite Inhaltsstoff Catalase ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die genannte Komponente in Polyethylenglykol oder Liposomen formuliert ist, um die Absorption und Wirksamkeit im zentralen Nervensystem (CNS) zu erhöhen.
  17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das genannte Medikament ferner einen Inhibitor von Stickoxidsynthase umfasst.
  18. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, 15, 16 oder 17, wobei das genannte Medikament für eine intravitreale Verabreichung formuliert ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das genannte Medikament zur Behandlung von Glaukom oder retinaler Ischämie dient.
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