ES2235157T3 - Celulas recombinantes, constructos de adn, vectores y procedimientos para la expresion de enzimas degradantes de fitatos en proporciones deseadas. - Google Patents
Celulas recombinantes, constructos de adn, vectores y procedimientos para la expresion de enzimas degradantes de fitatos en proporciones deseadas.Info
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Abstract
UNA CEPA DE COMBINACION RECOMBINANTE E QUE ES CAPAZ DE SOBREEXPRESAR AL MENOS DOS DIFERENTES GENES BAJO DIOS PROMOTORES SEPARADOS EN HONGOS FILAMENTOSOS. LOS GENES CODIFICAN LA FITASA Y LA FOSFATASA ACIDO A PH 2.5. SE USAN PREFERENTEMENTE LOS PROMOTORES GA CIONES DESEADAS DE LAS DOS ENZIMAS POR TECNICAS DE ADN RECOMBINANTE. LA MEZCLA DE ENZIMAS MUESTRA UN EFECTO COOPERANTE EN LA DEGRADACION DEL ACIDO FITICO Y SUS SALES. LAS PROPORCIONES PREFERIDAS DE LAS DOS ENZIMAS SON APROXIMADAMENTE 3:1 A APROXIMADAMENTE 16:1. LAS SECUENCIAS DE ADN SE AISLARON A PARTIR DE UN ASPERGILLUS NIGER ALQU0234 (ATCCDISNTITO DE 38854) DE TIPO LIBRE.
Description
Células recombinantes, constructos de ADN,
vectores y procedimientos para la expresión de enzimas degradantes
de fitatos en proporciones deseadas.
La presente solicitud es una continuación en
parte de la solicitud de EE.UU. nº de serie. 07/925.401 presentada
el 31 de julio de 1992.
La presente invención se refiere a cepas de
hongos filamentosos capaces de sobreexpresar al menos dos enzimas
degradantes de fitatos en proporciones deseadas. Se desvelan
asimismo secuencias de ADN, promotores, constructos de ADN y
vectores útiles para la preparación de dichas cepas.
Los minerales son elementos esenciales para el
crecimiento de todos los organismos. Para la producción ganadera de
animales monogástricos (por ejemplo, cerdos, aves) y peces, el
pienso está suplementado comúnmente con minerales. Las semillas
vegetales son una rica fuente de minerales ya que contienen iones
que forman complejo con los grupos fosfato de ácido fítico. Los
rumiantes no requieren fosfato inorgánico y minerales porque los
microorganismos del rumen producen enzimas que catalizan la
conversión de fitato (hexafosfato de mio-inosita) a
inosita y fosfato inorgánico. En el procedimiento se liberan
minerales que han formado complejo con fitato.
El fitato existe como una fuente de fósforo
almacenado en prácticamente todos los alimentos vegetales (para una
revisión, ver: Phytic Acid, Chemistry and Applications, E. Graf
(ed)., Pilatus Press: Minneapolis, Minnesota, EE.UU., 1986). El
ácido fítico forma parte normal de la semilla en cereales y
legumbres. Funciona de modo que se une a minerales de la dieta que
son esenciales para que de la semilla surja una nueva planta. Cuando
los grupos fosfato de ácido fítico se eliminan por la acción de la
enzima fitasa de la semilla, la capacidad para unirse a iones
metálicos se pierde y los minerales quedan disponibles para la
planta. En el pienso de cereales para el ganado, los minerales traza
unidos por ácido fítico están disponibles sólo parcialmente para su
absorción por animales monogástricos, que carecen de actividad de
fitasa. Aunque en el colon tiene lugar algo de hidrólisis de fitato,
la mayoría del fitato pasa a través del tracto gastrointestinal de
los animales monogástricos y se excreta en los excrementos,
contribuyendo a los problemas de contaminación por fosfatos fecales
de zonas de intensa producción ganadera. El fósforo inorgánico
liberado en el colon no tiene valor nutritivo para el ganado porque
el fósforo inorgánico se absorbe sólo en el intestino delgado. Así,
una cantidad significativa de los minerales de la dieta
nutricionalmente importantes están potencialmente no disponibles
para los animales monogástricos.
La conversión de fitato a inosita y fósforo
inorgánico puede estar catalizada por enzimas microbianas referidas
ampliamente como fitasas. Las fitasas, como la fitasa #EC 3.1.3.8,
son capaces de catalizar la hidrólisis de hexafosfato de
mio-inosita a 1,2,4,5,6-pentafosfato
y ortofosfato de D-mio-inosita.
Ciertas fitasas fúngicas hidrolizan según se ha informado
pentafosfato de inosita a fosfatos tetra-, tri- e inferiores; por
ejemplo, las fitasas de A. ficuum producen según se ha
informado mezclas de di- y mono-fosfato de
mio-inosita (Ullah, 1988). Los microorganismos
productores de fitasas comprenden bacterias como Bacillus
subtilis (V.K. Powar y V.J. Jagannathan, J. Bacteriol.
151:1102-1108, 1982) y Pseudomonas (D.J. Cosgrove,
Austral. J. Biol. Sci. 23:1207-1220, 1970);
levaduras como Saccharomyces cerevisiae (N.R. Nayini y P.
Markakis, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie
17:24-26, 1984); y hongos como Aspergillus
terreus (K. Yamada, Y. Minoda y S. Yamamoto, Agric. Biol. Chem.
32:1275-1282, 1968). Se ha informado previamente del
posible uso de microbios capaces de producir fitasa como aditivo en
el pienso para animales monogástricos (Shieh y Ware, patente de
EE.UU. nº 3.297,548; Nelson, T. S. y col., J. Nutrition
101:1289-1294. 1971). Hasta la fecha, sin embargo,
la aplicación comercial de este concepto no se ha demostrado viable,
por el alto coste de producción de fitasas microbianas.
Según se ha informado, las fitasas microbianas
pueden asimismo ser útiles para producir pienso para animales a
partir de ciertos procedimientos industriales, por ejemplo, como
productos de desecho del trigo y el maíz. El procedimiento de molido
en húmedo del maíz produce glútenes que se venden como piensos para
animales. Según se ha informado, la adición de fitasa puede mejorar
el valor nutricional del producto de pienso. Las enzimas fitasa
fúngicas y las condiciones de los procedimientos (t \sim 50ºC y pH
\sim 5,5) se han comunicado previamente en la Solicitud de Patente
Europea 0.321.004. En el procesamiento de harina de soja, la
presencia de fitato según se ha informado convierte a la harina y a
los residuos en no adecuados para los piensos usados en la cría de
peces, aves y otros animales no rumiantes, así como terneros
alimentados con leche. Según se ha informado, la fitasa es útil para
mejorar el valor nutritivo y comercial de este material de soja rico
en proteínas (véase Enzimas Finasa por Alko, un prospecto de
información de producto publicado por Alko Ltd., Rajamaki,
Finlandia). Alko, Ltd. ha estado usando asimismo una combinación de
fitasa y una fosfatasa ácida de pH 2,5 óptimo obtenida de A.
niger como un suplemento en el pienso para animales en sus
productos degradantes de ácido fítico Finasa F y Finasa S. Un fuente
de fitasa rentable económicamente mejoraría enormemente el valor de
la harina de soja como pienso para animales (Shieh y col.,
1969).
La fitasa y las fosfatasas ácidas menos
específicas son producidas por el hongo Aspergillus ficuum
como enzimas extracelulares (Shieh y col., 1969). Ullah purificó,
según se ha informado, una fitasa a partir de A. ficuum de
tipo silvestre que tenía un peso molecular aparente de 61,7 kDa (en
SDS-PAGE; corregido para glicosilación); pH óptimos
a pH 2,5 y pH 5,5; una Km de 40 \muM aproximadamente; y una
actividad específica de 50 U/mg aproximadamente (Ullah, A.,
Preparative Biochem. 18:443-458, 1988); según se ha
informado, la solicitud de patente PCT WO 9l/05053 desvela asimismo
el aislamiento y la clonación molecular de una fitasa a partir de
Aspergillus ficuum con pH óptimo a pH 2,5 y pH 5,5, una Km de
250 \muM aproximadamente y una actividad específica de 100 U/mg de
proteína aproxima-
damente.
damente.
Las fosfatasas ácidas son enzimas que hidrolizan
catalíticamente una amplia variedad de ésteres de fosfato y
habitualmente muestran pH óptimos inferiores a 6,0 (Hollander,
1971); por ejemplo, #EC 3.1.3.2 cataliza la hidrólisis de
monoésteres ortofosfóricos a productos de ortofosfato. Según se ha
informado, se ha purificado una fosfatasa ácida a partir de A.
ficuum. La forma desglicosilada de la fosfatasa ácida tiene un
peso molecular aparente de 32,6 kDa (Ullah y col., 1987).
Los objetos de la invención proporcionan
fosfatasas recombinantes aisladas a partir de hongos filamentosos
que mejoran la eficacia de la liberación de fósforo a partir de
fitato y de las sales de ácido fítico. Otros objetos de la invención
proporcionan fuentes eficaces y económicas de dos o más enzimas
recombinantes que son adecuadas para su uso comercial en piensos y
en procedimientos industriales con un mínimo procesamiento.
Se purificaron sustancialmente dos enzimas a
partir de Aspergillus niger var. awamori cepa ALKO243: en
concreto, una fitasa y una fosfatasa ácida de pH 2,5. Para cada
enzima se determinó la secuencia de aminoácidos para péptidos
internos aislados y que se usaron secuencias de nucleótidos
deducidas para construir sondas se usaron para clonar molecularmente
los dos genes. Para cada gen se determinó la secuencia genómica de
nucleótidos y se determinó asimismo la secuencia de región de
codificación (en caso necesario) por clonación del ADNc. La
comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de la fitasa
y la fosfatasa ácida de pH 2,5 con otras fosfatasas conocidas
identificó una secuencia de sitios activos potenciales de la enzima.
Se construyeron vectores de transformación usando promotores nativos
a hongos filamentosos y se compararon varias secuencias de
promotores heterólogos diferentes en cuanto a su capacidad para
conducir la expresión de los genes respectivos. Se seleccionaron
células huésped recombinantes que sobreprodujeron fitasa y fosfatasa
ácida de pH 2,5 a niveles situados entre aproximadamente 2 veces y
aproximadamente 4.000 veces superiores, y entre 10 veces y 126 veces
superiores (respectivamente), que los niveles de estas enzimas
secretadas por la cepa ALKO243 (ATCC#38854) de Aspergillus.
Se seleccionaron asimismo células huésped transformadas de gen dual
que expresaron niveles elevados de las dos enzimas recombinantes, es
decir, tanto la fitasa como la fosfatasa ácida de pH 2,5. Se
identificaron cepas seleccionadas de células transformadas de gen
dual que sintetizaron y secretaron fitasa junto con fosfatasa ácida
de pH 2,5 dentro de los intervalos hechos a medida deseados de las
actividades enzimáticas respectivas, por ejemplo, dentro de un
intervalo de 3:1 a 16:1 entre actividad de fosfatasa ácida de pH 2,5
y actividad de fitasa. Las células huésped recombinantes
transformadas desveladas en la presente memoria descriptiva
resuelven los problemas de la técnica anterior y proporcionan
fuentes económicamente rentables de enzimas fosfatasa comerciales
adecuadas para su uso en procedimientos comerciales que liberan
minerales a partir de fitatos en sustancias vegetales ya sea in
vitro, es decir, en procedimientos del tratamiento del pienso, o
in vivo, es decir, administrando una o más de las enzimas a
los animales.
La fitasa purificada a partir de A. niger
var. awamori cepa ALKO243 (ATCC#38854; también conocida como
IFO4033) mostró un peso molecular aparente de 80 a 86.000 daltons
(SDS-PAGE), y de 45.000 a 48.000 daltons
(SDS-PAGE), después de tratamiento con
endoglicosidasa F/N-glicosidasa F. La fitasa
purificada parece ser monomérica bajo condiciones no
desnaturalizantes con un punto isoeléctrico de 5,3 aproximadamente.
Esta enzima fitasa muestra actividad en la ausencia de iones
metálicos, es decir, es independiente de iones metálicos; la enzima
tiene un pH óptimo de 5,0 aproximadamente; y una temperatura óptima
comprendida en el intervalo de 55 a 60ºC.
La fosfatasa ácida purificada de pH 2,5 obtenida
de A. niger var. awamori cepa ALKO243 tenía un peso molecular
aparente de 66.000 daltons aproximadamente
(SDS-PAGE) y de 46.000 a 49.000 daltons
(SDS-PAGE) después de eliminación de hidratos de
carbono con endoglicosidasa F/N-glicosidasa F. Esta
fosfatasa ácida purificada de pH 2,5 parece ser tetramérica bajo
condiciones no desnaturalizantes, con un punto isoeléctrico de 4 a
4,25 aproximadamente; una Km aparente de 0,7 mM para fitato de sodio
a pH 2,5 y 4 mM de paranitrofenilfosfato; un pH óptimo de 2,5
aproximadamente; y una temperatura óptima de 55ºC
aproximadamente.
Las secuencias de nucleótidos traducidas para
fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 produjeron polipéptidos de 470
aminoácidos y 479 aminoácidos, respectivamente. Los pesos
moleculares calculados para los polipéptidos predichos de fitasa y
fosfatasa ácida de pH 2,5 fueron de 51.400 daltons aproximadamente y
52.700 daltons aproximadamente, respectivamente.
La proporción deseada de fitasa y fosfatasa ácida
de pH 2,5 recombinantes producidas por unas células huésped
recombinantes transformadas de gen dual alcanza una mezcla
enzimática equilibrada en la que la actividad enzimática cooperativa
cataliza de manera rápida y eficaz la hidrólisis casi completa de
fitato a inosita y fosfato libre con liberación de minerales a
partir de complejo de ácido fítico.
La presente invención se refiere por tanto a una
célula huésped transformada recombinante caracterizada porque ha
sido transformada por un primer ácido nucleico capaz de hibridación
bajo condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de SEC.
ID. nº 18 y un segundo ácido nucleico capaz de hibridación bajo
condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de SEC. ID. nº
20 y que es capaz de secretar la actividad enzimática de fosfatasa
ácida de pH 2,5 y la actividad enzimática de fitasa en una
proporción de 3:1 a 16:1.
Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas
relacionadas de la presente invención se apreciarán con más
facilidad a la vez que se entenderán mejor haciendo referencia a la
siguiente descripción detallada, tomada en conjunto con los dibujos
adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra el pH óptimo de una enzima
fitasa independiente de iones metálicos purificada a partir de
Aspergillus niger var. awamori cepa ALKO243 (ATCC#38854) con
un pH óptimo de pH 5 aproximadamente; y actividad enzimática máxima
> 20% en el intervalo de pH 2 a pH 7 (según se describe en el
Ejemplo 1, más adelante).
La Figura 2 muestra la temperatura óptima a entre
55 y 60ºC, con actividad enzimática máxima > 20% en el intervalo
de 25ºC a 65ºC, para la enzima fitasa purificada de la Figura 1,
anterior.
La Figura 3 muestra el pH óptimo a 37ºC de
fosfatasa ácida de pH 2,5 purificada a partir de Aspergillus
niger var. awamori cepa ALKO243 que tiene una Km aparente de 0,7
mM para fitato de sodio a pH 2,5, un pH óptimo de pH
2,0-2,5, y > 20% de actividad en el intervalo de
pH 1,5 a pH 3,5 (según se describe más adelante en el Ejemplo
1).
La Figura 4 muestra la temperatura óptima a 55ºC
aproximadamente, y actividad enzimática máxima > 20% en el
intervalo de 25ºC a 60ºC, para la fosfatasa ácida de pH 2,5 de la
Figura 3, anterior.
La Figura 5 muestra la actividad relativa de
fitasa {es decir, liberación de fosfato desde fitato de sodio) de
Finasa, un preparado comercial que contiene fitasa y fosfatasas, en
función del pH a 37ºC (cuadrados) y 55ºC (+).
La Figura 6 muestra la actividad de fitasa
relativa (es decir, actividad de liberación de fosfato) de Finasa
(Figura 5) en función de la temperatura, es decir, entre 10ºC y
70ºC, a pH 5.
La Figura 7 muestra una autorradiografía de sonda
de fitasa de oligonucleótido degenerado radiomarcada
PHY-1 que hibrida bajo condiciones rigurosas con
fragmentos de endonucleasa de ADN genómico generado con BamHI;
EcoRI; XbaI; BamHI + EcoRI; BamHI + XbaI; y EcoRI + XbaI (según se
describe en el Ejemplo 2, más adelante).
La Figura 8 muestra una autorradiografía de sonda
de fosfatasa ácida de pH 2,5 de oligonucleótido específico
radiomarcada PHY-31 que hibrida bajo condiciones
rigurosas con fragmentos de endonucleasa de ADN genómico generado
con BamHI, HindIII, KpnI, PstI, SalI, SphI o SstI (según se describe
en el Ejemplo 2, más adelante).
La Figura 9A y la Figura 9B (SEC. ID. nº 18)
muestran la secuencia genómica de nucleótidos para el gen de fitasa
en Aspergillus niger var. awamori cepa ALKO243 (ATCC#38854);
la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. ID. nº 19) para el
polipéptido de fitasa, según se describe en el Ejemplo 2, más
adelante-, y la región de promotor regulador 5' del gen.
Las Figuras 10A, 10B, 10C y 10D muestran la
organización de los constructos de vectores de expresión de fitasa
pFF1, pFF2, pFF3 y pFF4 (según se describe en el Ejemplo 2, más
adelante).
Las Figuras 11A y 11B (SEC. ID. nº 20) muestran
la secuencia de nucleótidos para el gen de fosfatasa ácida de pH 2,5
y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. ID. nº 21) de la
enzima.
Las Figuras 12A, 12B, 12C y 12D muestran la
organización de los constructos de vectores de expresión de fitasa
pFF-6A, pFF8, pFF9 y pFF11 que se diseñaron para
eliminar cualquier secuencia de nucleótidos de E. coli (según
se describe en el Ejemplo 4, más adelante).
Las Figuras 13A, 13B, 13C y 13D muestran la
organización de los constructos de vectores de fosfatasa ácida de
pH 2,5 pPHO-1-4A a partir de los
cuales pueden aislarse fragmentos lineales según se describe en el
Ejemplo 4, más adelante.
Las Figuras 14A y 14B muestran la organización de
dos vectores de transformación que tienen ambos el gen de fosfatasa
ácida de pH 2,5 y el gen de fitasa, en concreto,
pFIN-1 A y pFIN-1B (según se
describe en el Ejemplo 4, más adelante).
La Figura 15 muestra actividad de fitasa en un
ensayo en placa de subclones transformados de A. niger var.
awamori que sobreproducen fitasa en hasta 1.260 veces con respecto a
los niveles producidos por la cepa parental ALKO243. (El tamaño de
los círculos formados por el complejo indicador de molibdato
alrededor de los clones es proporcional a la actividad enzimática;
según se describe en el Ejemplo 4, más adelante).
La Figura 16 muestra el número de copias de genes
de fitasa cromosómicos y los niveles de ARNm en gen de fitasa
transformado A. niger var. awamori cepa ALKO2268 determinado
por análisis de transferencia Southern y análisis por análisis de
transferencia Northern, respectivamente (según se describe en el
Ejemplo 4, más adelante). El aumento significativo en la actividad
de fitasa observado en la Figura 15 en células transformadas es
atribuible a la integración de una o más copias del constructo de
gen de fitasa recombinante clonado en ADN cromosómico (véase Ejemplo
4, más adelante).
La Figura 16A muestra análisis de transferencia
Southern de control no transformado ALKO2268 (vías 1, 4 y 7) y
sobreproducción de transformantes de fitasa (vías 2, 5, 8, 9 y
10).
La Figura 16B muestra análisis de transferencia
Northern de niveles de ARNm en cepas de control sin transformar
ALKO2268 (vía 1) y transformadas (vías 2-6).
La Figura 17 y la Figura 18 muestran números de
copias génicas cromosómicas de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 y
niveles de ARNm en A. niger var. awamori cepa ALKO243
transformada de gen dual determinadas por análisis de transferencia
Southern y por análisis de Northern, respectivamente (según se
describe en el Ejemplo 5).
La Figura 17A muestra análisis de transferencia
Southern de cepas de control sin transformar ALKO243 (vía 2) y
transformadas duales (vías 3, 4 y 5) sondeadas para genes de
fitasa.
La Figura 17B muestra análisis de transferencia
Northern de cepas control sin transformar (vía 1) y transformadas
duales (vías 2, 3 y 4) sondeadas para ARNm de fitasa.
La Figura 18A muestra análisis de transferencia
Southern de cepas de control sin transformar ALKO243 (vía 3) y
transformadas duales (vías 4, 5 y 6) sondeadas para genes de
fosfatasa ácida de pH 2,5.
La Figura 18B muestra análisis de transferencia
Northern de cepas de control sin transformar ALKO243 (vía 1) y
transformadas duales (vías 2, 3 y 4) sondeadas para ARNm de
fosfatasa ácida de pH 2,5.
La Figura 19 describe gráficamente los niveles de
actividad de fitasa en 24 transformantes diferentes usando
constructos de vectores de plásmidos lineales o circulares (según se
describe en el Ejemplo 6, más adelante); y
La Figura 20 muestra los efectos de diferentes
promotores en los niveles de actividad recombinante de fitasa y
actividad de fosfatasa ácida de pH 2,5 en A. niger var.
awamori cepas ALKO243 y ALKU2268 transformadas de gen dual, según se
describe en el Ejemplo 6, más adelante.
Según se usan en la presente memoria descriptiva
los términos siguientes pretenden tener el significado que se indica
a continuación:
El término "fosfatasa" pretende referirse a
una enzima capaz de liberar fosfato a partir de un sustrato que
contiene fosfato como, por ejemplo, fitato. Entre los ejemplos
representativos de fosfatasas se incluyen fitasas fúngicas y
fosfatasas ácidas y neutras como, por ejemplo, fosfatasa ácida de pH
2,5 y fosfatasa neutra de pH 6.
El término "ácido nucleico" se usa en la
presente memoria descriptiva para referirse a polinucleótidos (es
decir, de más de tres nucleótidos) y oligonucleótidos (es decir, de
más de nueve nucleótidos) de ADN y ARN naturales o sintéticos.
El término "capaz de hibridar bajo condiciones
rigurosas" se usa en la presente memoria descriptiva para
referirse al apareamiento a una secuencia de nucleótidos objeto, o a
su cepa complementaria, bajo condiciones estándar, por ejemplo, alta
temperatura y/o bajo contenido en sales que tiende a desfavorecer el
apareamiento de secuencias no relacionadas. Un protocolo adecuado
(que afecta a 0,1X SSC y apareamiento a 68ºC durante 2 horas) se
describe en Maniatis, T. y col., Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N.Y.,
págs. 387-389, 1982.
El término "secuencia de nucleótidos" se usa
en la presente memoria descriptiva para referirse a una secuencia de
nucleótidos o nucleósidos y puede incluir secuencias no contiguas;
por ejemplo, en secuencias genómicas, las secuencias de regiones de
codificación de exones pueden estar interrumpidas por secuencias de
intrones y similares.
El término "secuencia de nucleótidos
contigua" se usa en la presente memoria descriptiva para
referirse a una secuencia de nucleótidos unida en una disposición en
serie, una detrás de otra.
El término "región de codificación" se
refiere a la secuencia de nucleótidos en un ácido nucleico que
cuando se transcribe y se traduce dará origen a una secuencia objeto
de aminoácidos, por ejemplo, regiones de exones en ADN genómico que
cuando se transcriben a ARNm dirigirán la traducción de la secuencia
objeto de aminoácidos. El término "codificado" se usa para
referirse a una secuencia de aminoácidos codificada para el código
de triplete de nucleótidos por secuencia de nucleótidos de la región
de codificación.
El término "vector de transformación" se usa
en la presente memoria descriptiva indistintamente con el de
"constructo de vector" para referirse a un constructo
recombinante (por ejemplo, un ADN de plásmido) que contiene una
fitasa objeto, y/o una secuencia de nucleótidos de fosfatasa ácida
de pH 2,5 incorporada en la presente memoria descriptiva, e incluye
"vectores de expresión" como una subclase. Entre los ejemplos
representativos de vectores de transformación se incluyen vectores
de plásmido de E. coli (por ejemplo, pBR322, pUC18, pUC19 y
similares, así como vectores útiles para transformar cepas
filamentosas de hongos (por ejemplo, pL0-3,
pFF-6, pPHO-1 y similares). La
fitasa objeto o secuencia de nucleótidos de fosfatasa ácida de pH
2,5 puede contener los elementos reguladores de secuencia de la
región 5' del gen respectivo (en la presente memoria descriptiva
denominados "elementos reguladores nativos"); o puede añadirse
un promotor heterólogo (es decir, de una cepa, variedad, especie o
género distinto de A. niger var. awamori cepa ALKO243 o de un
gen diferente como, por ejemplo, secuencias de nucleótidos de
promotores de GA o GAPDH) para conducir la expresión de la secuencia
objeto de nucleótidos. El vector de transformación objeto puede
contener también sitios de restricción adecuados para recibir
secuencias de nucleótidos adicionales útiles para promover la
integración cromosómica del ADN del vector. Los vectores de
transformación objeto son capaces de introducir secuencias de
nucleótidos de fosfatasa en una célula huésped de manera que puedan
integrarse eficazmente en el ADN de la célula huésped, y que el
producto de la región de codificación de la secuencia de nucleótidos
se exprese por medio de la célula huésped transformada.
"Promotor" se usa para referirse a una
secuencia de nucleótidos capaz de promover la expresión de secuencia
de nucleótidos descendente como secuencias de transcripción y de
señales reguladoras de traslación y similares. Más adelante se
proporcionan ejemplos representativos de promotores en los Ejemplos
3-5, por ejemplo, promotor de GA, GAPHD, y fitasa o
fosfatasa ácida de pH 2,5 nativa.
"Marcador seleccionable" se usa para
referirse a una secuencia de nucleótidos capaz de codificar un
polipéptido que cuando se expresa por célula transformada confiere a
la célula la capacidad de ser identificada o seleccionada entre las
demás células en una población celular. Entre los ejemplos
ilustrativos se incluyen marcadores antigénicos, marcadores
fenotípicos (por ejemplo, tamaño celular, forma, patrones de
gemación y similares), y marcadores de resistencia a fármacos como
resistencia a fleomicina.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "célula huésped recombinante transformada" se
refiere a una célula que tiene un ADN cromosómico con una secuencia
de nucleótidos de vector de transformación integrada en la misma.
Entre los ejemplos representativos de células huésped recombinantes
transformadas de la invención se incluyen células bacterianas y
fúngicas capaces de sintetizar y/o secretar una fitasa recombinante
y/o una o varias fosfatasas recombinantes, es decir, una fitasa
codificada por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo
condiciones rigurosas con SEC. ID. nº 18; y, la fosfatasa ácida de
pH 2,5 recombinante, es decir, una fosfatasa codificada por una
secuencia de nucleótidos capaz de hibridar con SEC. ID. nº 20.
El término "secuencia de nucleótidos de
fitasa" según se usa en la presente memoria descriptiva se
refiere a la secuencia de nucleótidos situada en SEC. ID. nº 18.
El término "secuencia de nucleótidos de
fosfatasa ácida de pH 2,5" según se usa en la presente memoria
descriptiva se refiere a una secuencia de nucleótidos capaz de
hibridar bajo condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos
en SEC. ID. nº 20.
El término "fosfatasa" según se usa en la
presente memoria descriptiva comprende todas las enzimas capaces de
escindir un enlace estérico de fosfato en un sustrato, e incluye
fitasas, y fosfatasas ácidas y neutras.
El término "fitasa" pretende referirse a una
enzima capaz de hidrolizar un enlace estérico de fosfato en un
sustrato de fitato, por ejemplo, hexafosfato de inosita,
pentafosfato de inosita, tetrafosfato de inosita y trifosfato de
inosita y sales de los mismos.
El término "fitasa purificada" pretende
referirse a una enzima purificada de la invención aislada y
purificada sustancialmente a partir de A. niger var. awamori
cepa ALKO243. Las enzimas objeto son monoméricas bajo condiciones no
desnaturalizantes con puntos isoeléctricos de 5,3 aproximadamente;
pesos moleculares aparentes en SDS-PAGE de
aproximadamente 80.000 daltons a 86.400 daltons; pesos moleculares
aparentes después de extracción de hidrato de carbono (por ejemplo,
con endoglicosidasa F/N-glicosidasa F) de 45.000 a
48.000 daltons aproximadamente (SDS-PAGE). La
enzimas de fitasa purificada objeto tienen las siguientes
propiedades catalíticas: en concreto, las enzimas son enzimas
independientes de iones metálicos capaces de hidrolizar un enlace
estérico de fosfato en un sustrato de fitato de sodio. Las enzimas
objeto tienen un pH óptimo de pH 5 aproximadamente a 37ºC; muestran
más de un 20% de actividad enzimática máxima en el intervalo de pH 2
a pH 7; y tienen una temperatura óptima comprendida entre 55ºC y
60ºC con > actividad enzimática máxima 20% en el intervalo de
25ºC a 65ºC. Una unidad de actividad de fitasa (PU) es la cantidad
de proteína enzimática requerida para liberar 1 nmol de fosfato
inorgánico a partir de fitato de sodio en un minuto a 37ºC bajo las
condiciones de ensayo descritas en el Ejemplo 1, más adelante.
El término "fitasa recombinante" pretende
referirse a una enzima fitasa codificada por la secuencia de
codificación de nucleótidos de las Figuras 9A y 9B; SEC. ID. nº 18 y
producida por una célula huésped transformada recombinante con el
vector de transformación objeto conteniendo la secuencia de
nucleótidos de fitasa objeto. El peso molecular predicho a partir de
la transcripción de la región de codificación de la secuencia de
nucleótidos de fitasa objeto es un producto de traducción de
polipéptido (es decir, antes de glicosilación) de aproximadamente
51.000 daltons a aproximadamente 52.000 daltons.
El término "independiente de iones
metálicos" pretende indicar que la actividad de la enzima puede
medirse en ausencia de Mn2+, Mg2+ y Ca2+. Sin embargo, esto no
quiere decir que la actividad de la enzima no pueda aumentar en
presencia de Mn2+, Mg2+ y Ca2+.
El término "fosfatasa ácida" se usa para
referirse a una enzima que tiene un pH óptimo para mediar en la
hidrólisis de un enlace estérico de fosfato en un sustrato a un pH
inferior a pH 5,0, preferentemente inferior a pH 3,0.
El término "fosfatasa ácida de pH 2,5" se
usa para referirse a una fosfatasa que tiene un pH óptimo para
mediar la hidrólisis de un fosfato éster en un sustrato a un pH de
2,0 a 2,5, por ejemplo, un sustrato de fitato de sodio.
El término "fosfatasa ácida de pH 2,5
purificada" pretende referirse a una enzima purificada de la
invención aislada y purificada sustancialmente a partir de A.
niger var. awamori cepa ALKO243. Cuando se purifica a partir de
la cepa objeto de hongos filamentosos, la enzima tiene las
siguientes propiedades: en concreto, la enzima aislada bajo
condiciones no desnaturalizantes es un complejo tetramérico de
glicoproteínas de cuatro monómeros idénticos con un punto
isoeléctrico aparente de 4,0 aproximadamente a 4,25 aproximadamente.
Cada uno de los monómeros tiene un peso molecular aparente de 66.000
daltons aproximadamente bajo conditions desnaturalizantes en
SDS-PAGE, y los monómeros tienen un peso molecular
aparente de 46.000 a 49.000 daltons (SDS-PAGE)
después de la eliminación sustancial de hidratos de carbono. Las
enzimas objeto de fosfatasa ácida de pH 2,5 purificada tienen las
siguientes propiedades catalíticas: en concreto, las enzimas pueden
catalizar la hidrólisis de un enlace estérico de fosfato en un
sustrato de fitato de sodio con una Km aparente de 0,7 mM
aproximadamente (es decir, a 37ºC y pH 2,5, según se describe en el
Ejemplo 1, más adelante). Las enzimas objeto tienen un pH óptimo de
aproximadamente pH 2 a aproximadamente pH 2,5 (es decir, a 37ºC);
tienen una actividad enzimática máxima mayor del 20% en el intervalo
de pH 1,5 a pH 3,5; y tienen una temperatura óptima a 55ºC con
actividad enzimática máxima > 20% en el intervalo de 25ºC a 60ºC.
Una unidad de actividad de fosfatasa ácida de pH 2,5 (HFU) es la
cantidad de proteína enzimática requerida para liberar 1 nmol de
fosfato inorgánico a partir de fosfato de
p-nitrofenilo en un minuto a 37ºC bajo las
condiciones descritas en el Ejemplo 1, más adelante.
El término "fosfatasa ácida de pH 2,5
recombinante" pretende referirse a una enzima de fosfatasa ácida
de pH 2,5 codificada por la región de codificación de una secuencia
de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas con una
secuencia de nucleótidos en las Figuras 11A y 11B; la SEC. ID. nº 20
y producida por una célula huésped transformada recombinante con el
vector de transformación objeto que contiene la secuencia objeto de
nucleótidos de fosfatasa ácida de pH 2,5. En un ejemplo
representativo, la secuencia de nucleótidos objeto de fosfatasa
ácida de pH 2,5 es la región de codificación de SEC. ID. nº 20 que
codifica un polipéptido con un peso molecular aparente (es decir,
antes de glicosilación) de 52.000 daltons aproximadamente a 53.000
daltons aproximadamente.
El término "secretado" se usa en la presente
memoria descriptiva para referirse a la forma extracelular de una
proteína, por ejemplo, una proteína "secretada" que se
sintetiza en una célula y se transporta en el medio de cultivo
extracelular en el que puede someterse a ensayo su presencia o la
actividad enzimática.
El término "actividad enzimática de fitasa"
se usa en la presente memoria descriptiva para referirse a la
actividad catalítica de una fitasa, por ejemplo, en la mediación de
la hidrólisis de un sustrato de fitato de sodio para liberar
fosfato, según puede medirse convenientemente en un ensayo de
fosfato como el descrito en los Ejemplos, más adelante.
El término "actividad enzimática de fosfatasa
ácida de pH 2,5" se usa en la presente memoria descriptiva para
referirse a la actividad fosfatasa de una fosfatasa ácida de pH 2,5,
por ejemplo, en la mediación de la hidrólisis de un enlace estérico
de fosfato en un sustrato de paranitrofenilfosfato (en un ensayo
como el descrito en los Ejemplos, más adelante).
El término "sobreproducción" se usa
indistintamente con el término "sobreexpresión" para indicar
que la célula huésped recombinante transformada objeto es capaz de
sintetizar y secretar niveles de la enzima objeto que son al menos 2
veces aproximadamente superiores que la cantidad de una enzima
sintetizada bajo condiciones idénticas por células de A.
niger var. awamori cepa ALKO243 (ATCC#38854). Según se ilustra
en el Ejemplo 4, (Tablas 8 y 9, más adelante), la sobreproducción en
la cepa ALKO2268 tiene como resultado la secreción de cultivos en
matraz de agitación realizados según el Ejemplo 1 de aproximadamente
45 veces más actividad enzimática de fitasa por ml del medio de
cultivo que la secretada bajo condiciones equivalentes por ALKO243.
Los transformantes ilustrativos con ácidos nucleicos objeto de la
invención (mostrados también en el Ejemplo 4) producen una actividad
aproximadamente 6 veces mayor que ALKO2268 (ver Tabla 7; una
actividad hasta 300 veces mayor aproximadamente que ALKO243). Otros
transformantes del Ejemplo 4 (Tablas 8 y 9) produjeron actividades
de fitasa actividades por ml de hasta 2.100 veces mayores que
ALKO243. La sobreproducción con respecto a fosfatasa ácida de pH 2,5
se ilustra análogamente mediante transformantes en el Ejemplo 4, más
adelante, que produjo hasta 130 veces aproximadamente (Tabla 11) más
de actividad por ml que ALKO243. En comparación, la cepa ALKO2268
produce aproximadamente del 41 al 46% de la actividad enzimática de
fosfatasa ácida de pH 2,5 producida por ALKO243.
El término "proporción entre fosfatasa ácida de
pH 2,5 y fitasa" se refiere a la proporción entre la actividad
enzimática una fosfatasa ácida de pH 2,5 y la actividad de una
fitasa, en este case, una proporción que puede calcularse dividiendo
la actividad enzimática de fosfatasa ácida de pH 2,5 por ml de
muestra (por ejemplo, el número de HFU/ml) por la actividad
enzimática de fitasa por ml de muestra (por ejemplo, el número de
PU/ml). En los Ejemplos, más adelante, se proporcionan ensayos
representativos para determinar la actividad de fitasa y de
fosfatasa ácida de pH 2,5. Con fines comparativos, los resultados
presentados en los Ejemplos posteriores muestran la cantidad de la
actividad de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5, respectivamente,
producidas y secretadas en el caldo de cultivo por A. niger
var. awamori cepa ALKO243 (ATCC#38854) durante 5 días de cultivo de
fermentación bajo las condiciones descritas en las Tablas 7 y 8, más
adelante (Ejemplo 3). Las células de ALKO243 cultivadas bajo estas
condiciones producen aproximadamente de 80 a 450 PU de fitasa y
aproximadamente de 5.000 a 6.000 HFU de fosfatasa ácida de pH 2,5;
y, con fines de referencia, la cepa de fitasa sobreproductora de
A. niger var. awamori cepa ALKO2268 produce aproximadamente
de 3.000 a 9.000 PU y de 2.000 a 3.000 HFU. Con estas cepas de
ejemplo, la proporción entre fosfatasa ácida de pH 2,5 y fitasa (es
decir, HFU/PU) es de 0,6 aproximadamente en medios de cultivo de
fermentación en matraz de agitación obtenidos a partir de ALKO2268
después de 5 días, y es de 64,7 con ALKO243 (por ejemplo, ver Tablas
1 y 14 a 16, más adelante). Según se ilustra en el Ejemplo 5, más
adelante, las proporciones entre actividad de fosfatasa ácida de pH
2,5 (HFU) y actividad de fitasa (PU) estuvieron comprendidas entre
aproximadamente 4 y aproximadamente 16 con los transformantes
mostrados en la Tabla 14, y entre aproximadamente 3 a 6 con los
transformantes cuyas actividades enzimáticas se muestran en la Tabla
15 (PU) y la Tabla 16 (HFU). La "proporción entre fosfatasa ácida
de pH 2,5 y fitasa" objeto logra una mezcla enzimática
equilibrada en la que la actividad enzimática cooperativa cataliza
de forma rápida y eficaz la hidrólisis casi completa de fitato a
inosita y fosfato libre con liberación de minerales del complejo de
ácido fítico a un pH (por ejemplo, el del estómago de un animal
monogástrico) y una temperatura deseados en un producto comercial.
El término "actividad enzimática cooperativa" se usa para
referirse a las proporciones objeto que confieren a la mezcla de
enzimas las propiedades de: a) catálisis más rápida fitato a inosita
y fosfato libre; b) conversión más eficaz de fitato a inosita y
fosfato libre; y c) conversión más completa de fitato (es decir,
IP6, ver los Ejemplos más adelante) a inosita y fosfato (es decir,
conversión mayor del 80% según se ilustra en el Ejemplo 1, Tabla 1,
más adelante).
Una "unidad normalizada de fitasa" o
"PNU" se define como la cantidad de actividad de fitasa
producida por el A. niger ALKO243, que en este caso es
equivalente a 85 PU/ml. Una "unidad normalizada de fosfatasa
ácida" o "APNU" se define como la cantidad de actividad de
fosfatasa ácida producida por la cepa de A. niger ALKO243,
que en este caso es equivalente a 5.500 HFU/ml.
Las formas de realización de la invención
proporcionan secuencias de nucleótidos de fitasa y también
secuencias de nucleótidos de fosfatasa ácida de pH 2,5 capaces de
hibridar bajo condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos
de SEC. ID. nº 18 o SEC. ID. nº 20, respectivamente. Las secuencias
objeto de nucleótidos son útiles para construir sondas de
oligonucleótidos, vectores de transformación, células huésped
recombinantes transformadas, fitasa recombinante de codificación y
proteínas de fosfatasa ácida de pH 2,5, y similares, según se
describe más adelante.
En otras formas de realización, la invención
proporciona células huésped recombinantes transformadas, por
ejemplo, E. coli, Bacillus, Aspergillus, Trichoderma,
Penicillium, Cephalosporium, Rhizopus y similares, que tienen
copias de la fitasa objeto y/o las secuencias de nucleótidos de
fosfatasa ácida de pH 2,5 de la invención. En una forma de
realización preferida, las células huésped recombinantes
transformadas se seleccionan entre especies de hongos filamentosos
como, por ejemplo, Aspergillus, Trichoderma, y
Rhizopus; y, en otra forma de realización preferida, las
células huésped objeto se seleccionan entre variedades y cepas de
Aspergillus niger. En una forma de realización más preferida,
las células huésped objeto se seleccionan entre células huésped
recombinantes que tienen secuencias de nucleótidos de fitasa, por
ejemplo, células transformadas de las cepas de sobreproducción de
fitasa GAI-6, GAL-142,
GAN-1, GAG-12,
GAO-248, GAI-12,
GAK4-46, GAI-2,
GAK4-52, GAM-111,
GAK4-47, GAM-225,
GAD-103, GAD-23,
GAD-103, GAD-23,
GAD-130, GAM-199,
GAE-3, GAE-32,
GAM-111 y GAL-65 (según se describe
en el Ejemplo 4, más adelante). En otra forma de realización
preferida, las células huésped objeto se seleccionan entre células
huésped recombinantes transformadas con vectores que tienen
secuencias de nucleótidos de fosfatasa ácida de pH 2,5, por ejemplo,
células transformadas de cepas GAO-69,
GAW-131, GBL-128,
GBL-97, GAO-61,
GAW-89, GAW-130,
GAW-121, GBL-87,
GBL-119, GAO-84,
GAW-54, GBL-129,
GAW-141, GBL-103,
GAW-112, GBL-92,
GAW-114 y GAT-143 (según se describe
en el Ejemplo 2, 4, 5 ó 6, más adelante). Otras células huésped
preferidas incluyen células seleccionadas entre las cepas
transformadas GAX-11, GAX-12,
GBE-14, GBH-134,
GBH-15, GBJ-9,
GBJ-10, GBJ-13,
GBJ-16, GBJ-26,
GBJ-27, GBJ-28,
GBJ-31, GBJ-35,
GBJ-38, GBJ-40,
GBJ-76 y GBJ-82 (según se describe
más adelante en el Ejemplo 2, 4, 5 ó 6). Los expertos en la materia
reconocerán que las secuencias de nucleótidos, los vectores de
transformación y las células huésped recombinantes transformadas
proporcionadas en la presente memoria descriptiva son útiles para
identificar cepas adicionales que tienen sustancialmente las mismas
propiedades que las cepas identificadas anteriormente.
Los expertos en la materia reconocerán que las
secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos deducidas
de la invención pueden ser útiles para construir sondas de
nucleótidos y anticuerpos para identificar y aislar variantes
naturales, y mutantes de transformantes, como, por ejemplo, mutantes
resultantes del tratamiento con productos químicos, UV, irradiación
gamma y similares). Los mutantes pueden tener expresión aumentada de
la fitasa objeto, la fosfatasa ácida de pH 2,5, o tanto una fitasa
como una fosfatasa ácida de pH 2,5. Entre los ensayos de muestreo
representativos para identificar los últimos mutantes se incluyen
transferencias Northern y Southern, y transferencia Western con
anticuerpos dirigidos a péptidos (naturales y sintéticos) dentro de
las secuencias de aminoácidos deducidas de las fitasas y las
fosfatasas ácidas de pH 2,5 objeto.
Los expertos en la materia reconocerán
naturalmente que pueden usarse mezclas de células huésped
recombinantes transformadas para conseguir la producción de una
fitasa y una o más fosfatasas; por ejemplo, pueden mezclarse células
huésped recombinantes transformadas de una cepa que produce fitasa
con células huésped recombinantes transformadas de una cepa que
produce fosfatasa ácida de pH 2,5. De esta manera, los cultivos de
células mixtas pueden construirse de manera que las células liberen
una proporción deseada entre actividad enzimática fitasa y actividad
enzimática de fosfatasa ácida de pH 2,5.
Las células huésped recombinantes transformadas
objeto de la invención pueden usarse también para preparar
preparaciones de fitasa recombinante sustancialmente puras. En una
forma de realización preferida, las secuencias de nucleótidos de
fitasa en la célula huésped recombinante transformada codifican un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de fitasa
RHGXRXP, en la que R es arginina, H es histidina, G es glicina, X es
cualquier aminoácido y P es prolina.
Las formas de realización de la invención
proporcionan también "mezclas" de fitasa y fosfatasa ácida de
pH 2,5 recombinantes en estados variables de pureza y se formulan en
una proporción deseada entre actividad enzimática de fosfatasa ácida
de pH 2,5 sustancialmente pura y actividad de enzima fitasa. La
formulación de esta mezcla equilibrada de enzimas en las
proporciones deseadas confiere a la mezcla la propiedad de actividad
enzimática cooperativa (descrita anteriormente) que puede prepararse
a medida para comprender el intervalo de propiedades deseadas en una
aplicación comercial seleccionada (por ejemplo, usos como los que se
describen más adelante). Los materiales de partida para la fitasa y
la fosfatasa ácida de pH 2,5 recombinantes incluyen caldos de
fermentación, medios de cultivo de producción y similares a partir
de células huésped recombinantes transformadas o de cepas
seleccionadas que sobreproducen la fitasa y/o la fosfatasa ácida de
pH 2,5 objeto. El procesamiento descendente de las enzimas objeto en
un producto puede implicar la eliminación de células y residuo
celular (por ejemplo, por centrifugado, filtración y similares),
seguido de concentración (por ejemplo, por ultrafiltración,
intercambio iónico o cromatografía de afinidad y similares), o el
material de partida puede ser adecuado para su uso en procedimientos
comerciales después de una simple purificación (por ejemplo,
liofilización}. Las mezclas objeto pueden prepararse por combinación
de cantidades iguales (o diferentes) de las preparaciones de las
enzimas objeto (por ejemplo, de diferentes cultivos celulares), con
el fin de lograr la proporción deseada de las actividades
enzimáticas respectivas, o las mezclas objeto pueden existir en el
mismo cultivo (por ejemplo, el producto de una célula huésped
recombinante transformada de gen dual, según se describe más
adelante). En una forma de realización preferida, la mezcla objeto
contiene una proporción entre actividad enzimática de fosfatasa (por
ejemplo, fosfatasa ácida de pH 2,5) y actividad enzimática de fitasa
comprendida entre 3:1 aproximadamente y 16:1 aproximadamente.
Las formas de realización de la invención
proporcionan células huésped recombinantes transformadas que se
construyen con uno o más vectores de transformación que tienen una
secuencia de nucleótidos de fitasa y una o más fosfatasas, es decir,
una secuencia de nucleótidos de fosfatasa ácida de pH 2,5, en la que
la expresión de cada enzima está bajo el control de una secuencia de
promotores independiente. Las células huésped transformadas objeto
se seleccionan para la expresión de los dos (o más) productos de
proteínas dentro de un intervalo deseado de actividades
enzimáticas.
Las fosfatasas producidas por las células huésped
recombinantes transformadas y los procedimientos que son formas de
realización de la invención proporcionan las siguientes ventajas con
respecto a otras preparaciones enzimáticas usadas anteriormente en
la técnica: en concreto, las fosfatasas objeto de la invención
tienen mayor actividad enzimática por volumen unitario de muestra,
mayor rendimiento de proteína enzimática por volumen unitario de
muestra, mayor rentabilidad económica, menor concentración y/o
purificación requerida para su uso en un producto o procedimiento
comercial, mayor eficacia para convertir fitato en inosita libre y
fosfato inorgánico, y menores efectos secundarios digestivos cuando
se usa en piensos para animales.
Las fosfatasas objeto producidas por las células
huésped recombinantes transformadas de la invención son útiles en
procedimientos comerciales para liberar minerales de complejos con
fitato en materiales vegetales como semillas o material de desecho
de la molienda, por ejemplo, harina de soja, de manera que los
materiales de bajo valor se convierten con eficacia y efectividad en
un pienso de alta calidad para animales no rumiantes. Entre los
ejemplos de procedimientos comerciales en los que las enzimas objeto
pueden ser útiles se incluyen molienda húmeda de maíz, aislamiento
de proteínas vegetales (en especial, aislamiento de proteína de
soja), tratamiento de cereales para su uso en horneado, y
similares.
En una forma de realización preferida las
fosfatasas objeto de la invención se añaden directamente a los
piensos para animales de manera que los fosfatos son ingeridos por
el animal y liberados in vivo en el tracto digestivo, por
ejemplo, de un animal no rumiante. En este caso, las fosfatasas
objeto se seleccionan para que tengan pH óptimos para sus
actividades enzimáticas respectivas que coincidan con el pH
digestivo encontrado en un animal no rumiante (es decir, el
intervalo de pH 1 a pH 6).
Entre los procedimientos adecuados para preparar
las enzimas objeto para su uso en productos se incluyen secado por
pulverización, estabilización en formulaciones líquidas, granulación
y encapsulación, que son conocidas para los expertos en la
técnica.
Las enzimas de fosfatasa objeto de la invención,
y las mezclas objeto de enzimas, son capaces de degradar fitato a
fosfato libre con más eficiencia y rapidez que cualquier otra de las
enzimas constituyentes en solitario. Las formas de realización de la
invención proporcionan una mezcla de una fitasa y una fosfatasa
ácida de pH 2,5 que son capaces de degradar fosfatos de inosita de
fitatos y ácidos fíticos, hexafosfato de inosita, IP6; pentafosfato
de inosita, IP5; tetrafosfato de inosita, IP4; trifosfato de
inosita, IP3; difosfato de inosita, IP2; monofosfato de inosita,
IP1; a inosita y fosfato inorgánico libres. La mezcla objeto
proporciona actividades enzimáticas cooperativas mediante
construcción de una cascada enzimática para una conversión más
rápida, completa y eficiente de un sustrato de fitato a fosfato
inorgánico e inosita. Por ejemplo, una fitasa que tiene fitato (IP6)
como un sustrato preferido puede catalizar la hidrólisis de IP6 a
IP5, IP4, IP3 e IP2 pero no a inosita y fosfato inorgánico
libres.
A su vez, una fosfatasa ácida de pH 2,5 puede
preferir sustratos de fosfato simples (por ejemplo, IP5, IP4, IP3,
IP2 e IPl) y puede catalizar la hidrólisis eficiente de estos
sustratos a inosita y fosfatos inorgánicos libres. Se cree que
mediante la formulación de la fosfatasa objeto de la invención en
intervalos óptimos deseados de actividad de fitasa a fosfatasa ácida
de pH 2,5 las mezclas objeto de la invención proporcionan mezclas
enzimáticas equilibradas que tienen una actividad enzimática
cooperativa. Las mezclas objeto de la invención formuladas de esta
manera pueden proporcionar una liberación más rápida, eficiente y
completa de mayores cantidades de inosita y fosfato inorgánico
libres desde fitato y ácido fítico que las producidas en el mismo
tiempo (y bajo las mismas condiciones de pH y temperatura) por
cualquiera de las enzimas de fosfatasa constituyentes.
[Los Materiales y procedimientos generales se
describen en la sección titulada "Materiales y procedimientos",
que sigue al final de este Ejemplo y de cada uno de los
posteriores].
Se purificaron las enzimas fitasa y fosfatasa
ácida de pH 2,5 a entre 4ºC y 8ºC (salvo que se indique lo
contrario) a partir de filtrado/concentrado de medio de cultivo
libre de células de A. niger var. awamori cepa ALKO243
(ATCC#38854). Se ajustó el filtrado/concentrado de cultivo (990 ml)
(en hielo) a saturación del 70% en sulfato de amonio, y se extrajo
el precipitado por centrifugado a 10.000 x g durante 15 min. A
continuación se separó el sobrenadante (1.070 ml) por cromatografía
hidrófoba sobre octil-sefarosa CL-4B
(Pharmacia). Se equilibró la columna (5 cm x 17 cm) en un tampón
bis-Tris/HCl 20 mM, pH 6,2, que contenía 0,436 g de
(NH4)2SO4 por ml; se aplicó sobrenadante; y se extrajeron las
proteínas no adsorbidas lavando con 500 ml de la solución tampón de
equilibrado. Se eluyeron las proteínas adsorbidas a partir de la
columna usando un gradiente lineal de 500 ml del 70% al 0,0% de
sulfato de amonio en tampón bis-Tris/HCl 20 mM, pH
6,2. Se recogieron fracciones de 10 ml para fitasa y se analizó la
actividad enzimática de fosfatasa ácida de pH 2,5. La mayoría de la
actividad de fitasa se eluyó pronto en el gradiente. Se agruparon
por separado fracciones que contenían las diferentes actividades
enzimáticas respectivas; se concentró por ultrafiltración en filtros
de membrana PM10 de Amicon. Se desaló la fitasa que contenía las
fracciones mediante paso sobre columnas de filtración de gel PD10
(Pharmacia) equilibradas en tampón bis-Tris/HCl 50
mM, pH 6,2. Primero se describe la purificación de fitasa, seguido
de la purificación de fosfatasa ácida.
Primero se purificó la fitasa por cromatografía
de intercambio aniónico sobre DEAE-Sefarosa
(Pharmacia). Brevemente, se aplicó una parte alícuota de 24,5 ml a
una columna de 5 cm x 7 cm equilibrada en
bis-Tris/HCl 50 mM, pH 6,2. Se extrajeron las
proteínas no adsorbidas lavando con el tampón de equilibrado (100
ml), y se eluyeron las proteínas adsorbidas usando un gradiente de
200 ml lineal desde NaCl 0,0 M a 0,5 M, en tampón de equilibrado. Se
sometió a ensayo la actividad de fitasa en las fracciones y se
agruparon y concentraron las fracciones con actividad a 600 \mul
usando un miniconcentrador Centricon-30. Se
aplicaron porciones de 100 \mul a 23ºC aproximadamente a una
columna HPLC 10/30 12 HR de Superosa (Pharmacia) y se eluyeron las
proteínas con bis-Tris/HCl 50 mM, pH 6,2 a una
velocidad de flujo de 0,3 ml/min. Se identificaron, agruparon y
concentraron las fracciones activas y se transfirieron a un tampón
de formiato de sodio 50 mM, pH 3,8, usando un microconcentrador
Centricon-30. Se purificó la solución enzimática en
tampón de formiato usando además cromatografía de intercambio
catiónico. Se aplicaron muestras de enzima en partes alícuotas de 2
ml a una columna FPLC 5/5 Mono S RH (Pharmacia) equilibrada en
formiato de sodio 50 mM (pH 3,8) a 23ºC aproximadamente. Se lavó la
columna con el tampón de equilibrado (10 ml) y se eluyó la proteína
enlazada a 60 ml/h usando un gradiente lineal de 20 ml desde Na Cl O
mM a 430 mM en el tampón de equilibrado de formiato. Se purificó la
fitasa por este procedimiento con un rendimiento del 18,4% que tenía
una actividad específica de 275.900 (PU/mg) aproximadamente con una
purificación calculada de 130 veces (Tabla A).
Primero se concentró la fosfatasa ácida que
contenía fracciones de la fracción de Octil-Sefarosa
agrupada, anterior, por ultrafiltración sobre filtro PM10 de Amicon,
y luego se sometió a cromatografía de tamiz molecular sobre una
columna Sephacryl S-200 (Pharmacia) 2,6 cm x 94 cm
equilibrada en bis-Tris/HCl 50 mM (pH 6,2). Se
eluyeron las proteínas a 20 ml/h y se agruparon y separaron las
fracciones con actividad por cromatografía de intercambio aniónico
en una columna de DEAE-Sefarosa (Pharmacia) de 5 cm
x 7 cm equilibrada en bis-Tris/HCl 50 mM, pH 6,2. Se
lavó la columna con 100 ml de tampón de equilibrado y se eluyeron
las proteínas adsorbidas usando un gradiente lineal de 200 ml desde
NaCl 0,0 M a 0,5 M en tampón de equilibrado. A continuación se
concentraron las fracciones activas; se transfirieron a
bis-Tris/HCl 20 mM, pH 6,0 por ultrafiltración en
una membrana PM10 de Amicon; y se sometieron a una segunda etapa de
cromatografía de intercambio aniónico, usando esta vez una columna
HPLC Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) equilibrada
bis-Tris/HCl 20 mM, pH 6,0, a 23ºC aproximadamente.
Se aplicó la muestra en partes alícuotas de 3,5 ml; se lavó la
columna con 10 ml del tampón de equilibrado; y se eluyeron las
proteínas a 60 ml/h usando un gradiente lineal de 20 ml de NaCl
desde 0,0 mM a 350 mM en el tampón de equilibrado. Se agruparon y
concentraron las fracciones que contenían actividad enzimática a un
volumen total de 400 \mul, y se transfirieron en
bis-Tris/HCl 20 mM, pH 6,2, que contenía NaCl 150 mM
usando un microconcentrador Centricon-30. Se realizó
purificación adicional, primero por cromatografía de tamiz molecular
en una columna HPLC de Superosa 12 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrada
en el tampón de muestra de bis-Tris/HCl. Se
aplicaron partes alícuotas de 100 \mul a esta columna y se
eluyeron las proteínas a 23ºC a una velocidad de 18 ml/h. Se
agruparon las fracciones que contenían enzimática y se transfirieron
a tampón de histidina/HCl 20 mM, pH 5,8, usando una columna de
filtración de gel PD10, y se sometieron a una segunda etapa de
purificación por cromatografía de intercambio aniónico en una
columna HPLC Mono Q HR 5/5. Se aplicaron a la columna partes
alícuotas de 1 ml, se lavó la columna con 5 ml del tampón de muestra
de histidina/HCl a 23ºC aproximadamente. Se eluyeron las proteínas a
una velocidad de 60 ml/h usando un gradiente de 20 ml lineal de NaCl
desde 0 mM a 350 mM en tampón de equilibrado. Se purificó la
fosfatasa ácida de pH 2,5 por este procedimiento a un rendimiento
del 13% con una purificación de 126 veces, Tabla B.
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Fitasa: La fitasa según se purificó por los
procedimientos enumerados (más arriba) mostró un peso molecular
aparente en SDS-PAGE de aproximadamente 80.000 a
86.000 daltons. La proteína según se purificó sustancialmente (es
decir, en SDS-PAGE) dio una reacción positiva con
tinción de Schiff de ácido periódico para hidrato de carbono (es
decir, la enzima fitasa purificada es una glicoproteína). Después de
tratar la fitasa purificada con una mezcla de endoglicosidasa
F/N-glicosidasa F, el peso molecular aparente de la
enzima (en SDS-PAGE) cambió a entre 45.000 y 48.400
daltons aproximadamente, sugiriendo que un 44% aproximadamente de la
masa molecular puede ser atribuible al hidrato de carbono. (No se
determinaron el tipo de enlace de hidrato de carbono y la naturaleza
del radical). El peso molecular de la enzima fitasa purificada
desnaturalizada demostró ser aproximadamente de 90.000 daltons por
filtración de gel de tamiz molecular (es decir, basada en su radio
de Stokes), y se observó un peso molecular aparente de 100.000
daltons por electroforesis PAA de gel de gradiente nativo. El último
resultado sugiere que la enzima fitasa purificada desnaturalizada
existe como un monómero. El punto isoeléctrico de la fitasa objeto
es 5,3 por enfoque isoeléctrico.
Fosfatasa ácida de pH 2,5: La fosfatasa ácida de
pH 2,5, purificada por los procedimientos enumerados más arriba,
mostró un peso molecular de subunidad aparente en
SDS-PAGE de 66.000 daltons. La enzima
sustancialmente purificada (es decir, en SDS-PAGE)
dio una reacción positiva con tinción de Schiff de ácido periódico,
indicando que la fosfatasa ácida de pH 2,5 es también una
glicoproteína. Después de extraer hidrato de carbono con
endoglicosidasa F/N-glicosidasa F, la proteína
mostró un peso molecular aparente de 46.000 a 49.000 daltons por
SDS-PAGE. (No se caracterizaron el enlace
glicosídico y la naturaleza del radical de hidrato de carbono). La
fosfatasa ácida de pH 2,5 muestra un peso molecular aparente de
280.000 daltons por electroforesis de gel PAA de gradiente nativo,
sugiriendo que la enzima desnaturalizada purificada existe como un
tetrámero de cuatro unidades de 66.000 daltons. El punto
isoeléctrico de la fosfatasa ácida por enfoque isoeléctrico es de
aproximadamente 4 a 4,25.
Fitasa: La fitasa purificada mostró actividad
enzimática óptima (medida a 37ºC, en condiciones de exceso de
sustrato), a un pH de aproximadamente pH 5,0 con un codo en pH 2,5 y
actividad enzimática máxima > 20% en el intervalo de pH 2 a pH 7
(Figura 1). La temperatura óptima para la enzima fitasa purificada
(un sustrato Na-fitato óptimo y pH 5,0) se encontró
que estaba en el intervalo de 55 a 60ºC con actividad enzimática
máxima > 20% en el intervalo de 25ºC a 65ºC (Figura 2). La enzima
fitasa purificada catalizó la hidrólisis de fitato de sodio en
ausencia de ion metálico añadido (es decir, la enzima mostró no
necesidad absoluta de iones metálicos y, así, demostró ser
"independiente de iones metálicos"); sin embargo, la actividad
de la enzima fitasa purificada aumentó en presencia de Mn2+, Mg2+ y
Ca2+.
Fosfatasa ácida de pH 2,5: La Km aparente de la
fosfatasa ácida de pH 2,5 para sustrato Na-fitato a
37ºC y pH 2,5 se determinó que era de 0,7 mM aproximadamente; y,
para paranitrofenilfosfato (PNP) a 37ºC y pH 2,5, la Km aparente fue
de 4 mM. La enzima fosfatasa ácida de pH 2,5 purificada mostró un pH
óptimo en el intervalo de pH 2,0 a pH 2,5 (es decir, a 37ºC, en
presencia de concentraciones óptimas de sustrato
Na-fitato) con actividad máxima > 20% en el
intervalo de pH 1,5 a pH 3,5 (Figura 3). La temperatura óptima para
hidrólisis mediada por fosfatasa ácida de pH 2,5 de
Na-fitato se encontró que era de 55ºC
aproximadamente con actividad enzimática máxima > 20% en el
intervalo de 25ºC a 60ºC (Figura 4). En comparación, en la Figura 5
se muestra el perfil pH/actividad de una preparación de Finasa
comercial no purificada, y en la Figura 6 se muestra el perfil
temperatura/actividad.
Degradación de fitato por fitasa y fosfatasa
ácida de pH 2,5 y mezclas de las mismas: La Finasa es un preparado
comercial de enzimas de Aspergillus que incluye una mezcla de
fitasa y fosfatasa. La proporción de actividad fosfatasa ácida de pH
2,5 (HFU) con respecto a actividad de fitasa (PU) de Finasa se
determinó que era de 7:1 aproximadamente. Se realizó una comparación
de la velocidad de degradación de fitato por un preparado de enzimas
de Finasa comercial con la velocidad de degradación por preparados
de fitasa purificada, fosfatasa ácida de pH 2,5 purificada y mezclas
de los mismos que contenían diferentes proporciones entre fosfatasa
ácida y fitasa. La proporción de actividad de fosfatasa ácida (HFU)
frente a actividad de fitasa (PU) de la fitasa purificada es
aproximadamente 0,4:1, mientras que la fosfatasa ácida no muestra
actividad de fitasa a pH 5,0. Las proporciones de las mezclas de
enzimas se indican en las Tablas 1.a y 1.b. La comparación se
realizó a pH 2,5 37ºC y a pH 5,0 37ºC usando
Na-fitato 10 mM como sustrato. Las actividades
enzimáticas de todos los diferentes preparados usados en los
experimentos a pH 2,5 fueron de 10.000 HPU por mmol de sustrato
Na-fitato (HPU es la unidad de actividad de fitasa
medida a pH 2,5 usando tampón de glicina (HCl) 0,2 M de pH 2,5 en
vez de tampón de Na-citrato, ver Materiales y
procedimientos al final del Ejemplo 1). En los experimentos
realizados a pH 5,0 la dosificación de enzimas por mmol de sustrato
de Na-fitato fue de 10.000 PU, con la excepción del
experimento realizado usando fosfatasa ácida purificada en
solitario. Las muestras se tomaron de la mezcla de reacción después
de los tiempos indicados (horas, h; 0, 1, 2, 8, 24 y 48 h); se
liofilizaron las muestras y más tarde se analizó su contenido en
hexa-, penta-, tetra- y tri-fosfatos de inosita (es
decir, IP6, IP5, IP4 e IP3, respectivamente), así como de inosita
libre (Ins) y fósforo inorgánico (Pi). Los hexa-, penta-, tetra- y
trifosfatos de inosita se analizaron por el procedimiento de
Sandberg y col. (1987). La inosita se analizó por HPLC usando
columna Sugar Pak 1 (300 mm x 6,5 mm, Waters), con
Ca-EDTA 0,01 mM como eluyente
(Calcium-Titriplex Merck 8439), flujo de 0,6 ml/min
a 90ºC. La detección se realizó por RI (Waters), usando
mio-inosita (Fluka) 0,1-0,5 mg/ml
como patrón. Se analizó el fósforo inorgánico según se describe en
Materiales y procedimientos al final del Ejemplo 1. Los resultados
de estos experimentos se presentan en la Tabla 1a y la Tabla 16, a
continuación.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
a. Rendimiento, % del teórico: la
concentración de partida de sustrato Na-fitato 10 mM
(IP6) en los ensayos se consideró igual al rendimiento teórico del
100% (es decir, de IP6); para IP6, la concentración de
Na-fitato residual al final del ensayo se dividió
por la concentración de partida para obtener el % indicado en las
Tablas 1a y 1b: para IP5, IP4, IP3, Ins y Pi, se calculó la
concentración teórica máxima de cada producto de degradación que
podría liberarse a partir de IP6 (es decir, por hidrólisis ácida) y
se consideró igual al rendimiento teórico del 100% del producto de
degradación respectivo; la concentración de producto de degradación
residual al final del ensayo se dividió por la concentración teórica
para obtener el % indicado en las Tablas 1a y 1b; (+)
trazas.
- a. Como en la Tabla 1a, anterior.
Los resultados presentados en las Tablas 1a y 1b
muestran que las enzimas fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5
purificadas y la mezcla de enzimas comerciales Finasa catalizaron la
hidrólisis de Na-fitato a inosita y fosfato
inorgánico, pero a velocidades diferentes y con pH óptimos
diferentes. Bajo condiciones óptimas de pH para cada una de las
enzimas purificadas (es decir, pH 5,0 para fitasa purificada; y pH
2,5 para fosfatasa ácida de pH 2,5 purificada) se liberaron
cantidades aproximadamente equivalentes de fosfato inorgánico en 48
horas para los tres preparados enzimáticos (es decir, 90% de Pi para
fitasa; 88% de Pi para fosfatasa ácida; y 88% ó 103% para la mezcla
Finasa). Sin embargo, los resultados muestran también que la
producción de inosita (Ins, Tablas 1a y 1b) es marcadamente más
lenta a pH 5,0 que a pH 2,5. La inosita, como producto final de la
hidrólisis Na-fitato, no podría detectarse a pH 2,5
ni a pH 5,0 cuando se usara la enzima fitasa purificada en
solitario, aunque se extrajeran completamente IP6, IP5, IP4 e IP3
durante el tiempo de hidrólisis. Puede concluirse que los productos
finales hidrolíticos probables de las enzimas fitasa purificadas son
di- y/o monofosfatos de inosita. En contraste, la fosfatasa ácida
purificada catalizó la degradación de fitato (con IP6 = hexafosfatos
de inosita) a pH 2,5, produciendo inosita como producto final. Estos
resultados combinados sugieren que en una mezcla comercial de
fosfatasas, como Finasa, la fitasa en solitario no es suficiente
para permitir una conversión completa de fitato a inosita y fosfato
inorgánico. Más bien, los resultados sugirieron que los productos
finales de inosita pueden derivarse de la acción de enzimas con
especificidad de sustrato similar a la de la fosfatasa ácida de pH
2,5 purificada. En consecuencia, se consideró la posibilidad de que
los productos de hidrólisis de fitatos por fitasa (es decir, IP5,
IP4, IP3, IP2, IP1) pudieran servir como sustratos útiles para
fosfatasa ácida que convertirían los fosfatos de inosita en inosita
y fosfato inorgánico libres. Los resultados sugirieron así una
actividad enzimática cooperativa previamente no sospechada para
degradación de fitatos entre fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5.
Para explorar aún más esta posibilidad, se evaluaron las
especificidades de sustrato de la fitasa purificada y la fosfatasa
ácida de pH 2,5.
Las especificidades de sustrato de la fitasa
purificada y la fosfatasa ácida de pH 2,5 se compararon a 37ºC
usando concentraciones equivalentes (es decir, 20 mM) y temperatura
(es decir, 37ºC) de sustrato de fitato. Se midió la actividad de
fitasa a pH 5,0 y se midió la actividad de fosfatasa actividad a pH
2,5 usando el sistema de detección de molibdato descrito en la
sección de Materiales y procedimientos que aparece al final del
Ejemplo 1. En la Tabla 2, más adelante, se presenta una comparación
de las actividades relativas de las dos diferentes enzimas en
diferentes sustratos.
a) Actividad relativa porcentual =
``la actividad medida calculada como un % de la obtenida con un
sustrato patrón de fitasa (es decir, Na-fitatoa
definido como el
100%)''.
b) Actividad relativa porcentual =
"la actividad medida calculada como un % de la obtenida con un
sustrato patrón de fosfatasa ácida (es decir, fosfato de
p-nitrofenilo, definido como el
100%)".
Los resultados presentados en las Tablas 1a, 1b y
2 muestran que la fitasa purificada, aunque eficaz para mediar en la
hidrólisis de ácido fítico, fue menos eficaz para catalizar la
hidrólisis de otros sustratos más sencillos que contienen sustrato.
En contraste, la fosfatasa ácida de pH 2,5 purificada, aunque
relativamente eficaz en la hidrólisis de fosfatos más simples, fue
relativamente ineficaz para catalizar la hidrólisis de ácido fítico.
Los resultados apoyan la noción de una mezcla enzimática cooperativa
en la que los productos de una fitasa purificada (por ejemplo, di-
y mono-fosfatos de inosita) podrían servir como
sustratos para una fosfatasa ácida de pH 2,5 purificada de manera
que los productos últimos de la reacción fueran inosita y fosfato
inorgánico.
A continuación se consideró la posibilidad de que
pudiera construirse una mezcla enzimática cooperativa eficaz
optimizando las cantidades de fitasa purificada y fosfatasas ácidas
de pH 2,5 purificadas que se mezclaron conjuntamente en un preparado
de manera que la actividad de las dos diferentes enzimas estuviera
"equilibrada", es decir, se consiguiera actividad enzimática
cooperativa a un pH y una temperatura determinados para dar
velocidad, eficacia y completitud óptimas de degradación de fitato a
inosita y fosfato inorgánico libres. Se realizaron estudios en los
que se formularon mezclas de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5
purificadas en proporciones definidas de las dos actividades
enzimáticas, pero mientras dichas mezclas "equilibradas" de
fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 purificadas ofrecían ventajas de
velocidad aumentada de hidrólisis de fitato y conversión más
completa a inosita y fosfato inorgánico libres en preparados
comerciales, no se consideró rentable económicamente purificar,
normalizar y someter a control de calidad (QC) y seguridad de
calidad (QA) dicha mezcla "equilibrada" de enzimas para su uso
en la mayoría de los procedimientos comerciales (por ejemplo, para
piensos para animales) dentro de los intervalos deseados de
proporciones de actividades enzimáticas, por ejemplo, de fosfatasa
ácida de pH 2,5 a fitasa.
Para resolver estos problemas, se consideró a
continuación la posibilidad de que pudieran usarse técnicas
moleculares para producir enzimas recombinantes que fueran de
calidad suficientemente alta para proporcionar preparados
normalizados uniformes, y con las propiedades de rentabilidad
económica y QC/QA requeridas para productos comerciales de mezclas
"equilibradas".
Para obtener secuencias de aminoácidos internas
de las proteínas purificadas, se prepararon fragmentos de péptidos
usando TPCK-tripsina (según se ha descrito, ver
Materiales y procedimientos, más adelante). Además, se alquiló
fosfatasa ácida de pH 2,5 purificada (es decir, usando
4-vinil piridina) y después se digirió con
lisilendopeptidasa C, según se ha descrito (Materiales y
procedimientos). Los péptidos resultantes se purificaron por
cromatografía líquida de alta presión de fase inversa
(RP-HPLC) en una columna C18 RP (según se describe
en la sección de Materiales y procedimientos, más adelante). La
secuenciación amino terminal de péptidos purificados se realizó
usando un secuenciador de fase líquida de impulsos gaseosos, y los
aminoácidos PTH liberados se analizaron por RP-HPLC
(según se ha descrito, Materiales y procedimientos). Se realizó
secuenciación carboxi terminal usando digestión de carboxipeptidasa
Y cinética, derivación PITC y análisis por RP-HPLC
de los aminoácidos PITC.
En las Tablas 3 y 4, más adelante, se presentan
las secuencias de aminoácidos de los péptidos trípticos de fitasa y
fosfatasa de pH 2,5, así como de los péptidos de lisilendopeptidasa
de fosfatasa de pH 2,5 fosfatasa. Según indican los resultados
presentados en las Tablas 3 y 4, algunos preparados peptídicos no
eran puros. Las Tablas 3 y 4 presentan también una comparación de
las secuencias de aminoácidos peptídicos con la secuencia de
aminoácidos deducida de la secuenciación de nucleótidos de los genes
y el ADNc (Ejemplo 2, más adelante), es decir, los corchetes [] de
las Tablas 3-4.
La secuencia amino terminal de fitasa purificada
de Aspergillus niger var. awamori cepa ALKO243 mostró una
secuencia N-terminal (es decir, péptido
#1081/N-phy Tabla 3; LAVPAS(R)NQSTXDT)
similar, pero no idéntica, a la secuencia amino terminal comunicada
en una fitasa de A. ficuum (es decir, Ullah, 1988;
LAVPASRNQSSGDT). Un péptido (es decir, #420/10phy;
LYVEMMQ(N)QA(E)Q(T)PLV)
era similar, pero no idéntico en secuencia, a un péptido interno
comunicado en una fitasa de A. ficuum (es decir, Ullah, 1988,
MMQCQAEQEPLVRVLVNDRX). La secuenciación carboxi terminal de fitasa
dio la secuencia XSA-OH. Un péptido (es decir, #675;
Tabla 3) contenía una secuencia KDPR homóloga a la secuencia
presentada según se ha informado en otras fosfatasas (en concreto,
KDPRA; Ullah, 1991).
a) secuencia de péptidos, X =
aminoácido no detectado; / = puede estar presente uno u otro de los
dos aminoácidos indicados, el ensayo no fue definitivo, () = la
presencia de los aminoácidos entre paréntesis está sujeta a
cuestionamiento debido a la débil señal del
PTH-aminoácido; se obtuvieron péptidos de fitasa
designados como (phy) por digestión tríptica; b) [] = [secuencia de
péptidos deducida de secuencia de ADN, Ejemplo 2, más adelante]; y #
: número de
péptidos.
En la secuenciación de fosfatasa de pH 2,5, no se
obtuvieron resultados de la secuenciación amino terminal de
proteínas nativas o alquiladas purificadas a partir de
Aspergillus niger var. awamori cepa ALKO243. Un péptido (es
decir, #1107T/7Lpho, Tabla 4, más adelante) produjo una secuencia
que era idéntica a una secuencia amino terminal comunicada en una
fosfatasa purificada a partir de A. ficuum (es decir, Ullah
& Cummins, 1987; FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDG). El péptido
#94lC/10Lpho de fosfatasa de pH 2,5 purificada (ALKO243) puede ser
una continuación de la secuencia #1107/7Lpho, ya que parece estar
incluido en el término N de A. ficuum. El péptido
#1112T/3Tpho parece ser una continuación del péptido #943C/11Lpho,
ya que parece tener una secuencia parcialmente solapada (es decir,
FSSG en #1112T/3Tpho). El péptido de fosfatasa de pH 2,5 #8l6C/1Lpho
contiene una posible secuencia consenso del sitio activo (es decir,
RHGXRXP).
a) T: = digestión de tripsina; C: =
digestión de lisilendopeptidasa C de fosfatasa de pH 2,5 tratada con
4-vinilpiridina; b) secuencia peptídica, X =
aminoácido no detectado; / = puede estar presente uno u otro de los
dos aminoácidos indicados, el ensayo no fue definitivo, () = la
presencia de los aminoácidos entre paréntesis está sujeta a
cuestionamiento debido a la débil señal del
PTH-aminoácido; se identifican péptidos de fosfatasa
(pho) obtenidos por digestión de lisilendopeptidasa (L), se
identifican péptidos de fosfatasa alquilada obtenidos por digestión
de tripsina (T); y c) [] = [secuencia de péptidos deducida de
secuencia de ADN, Ejemplo 2, más adelante]; y # : número de
péptidos.
A partir de estas secuencias de aminoácidos se
seleccionaron una secuencia de péptidos de fitasa (es decir, #420,
Leu Tyr Val Glu Met Met Gln (Asn) Gln Ala (Glu) Gln (Thr) Pro Leu
Val con el (Asn) cuestionable corregido como Cys; Ullah, 1988; Tabla
3) y dos de fosfatasa de pH 2,5 (es decir, #816C; Arg His Gly Glu
Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Ala Gly Lys y #1110T; Gln Leu Pro Gln Phe
Lys, Tabla 4) como útiles para la preparación de sondas de
oligonucleótido degeneradas para clonación molecular, según se
describe más adelante en el Ejemplo 2.
Los dos ensayos miden la cantidad de fosfato
inorgánico que se libera por la acción enzimática como
cuantificación colorimétrica usando reducción de un complejo de
fosfomolibdato. Una unidad de fitasa (PU) es la cantidad de enzima
que libera, bajo las condiciones descritas más adelante, 1 nmol de
fosfato inorgánico a partir de Na-fitato en un
minuto a 37ºC. Una unidad de fosfatasa ácida de pH 2,5 (HFU) es la
cantidad de enzima que libera, bajo las condiciones indicadas más
adelante, 1 nmol de fosfato inorgánico a partir de fosfato de
P-nitrofenilo en un minuto.
La actividad de fitasa se determinó añadiendo 1
ml de sustrato (fitato de sodio al 1% preparado nuevo diariamente
[Sigma #P3168], en tampón de citrato 0,2 M, pH 5,0) hasta 1 ml de
enzima diluida sobrenadante para iniciar la hidrólisis de
ortofosfato. Después de exactamente quince minutos a 37ºC, se
terminó la reacción de hidrólisis por la adición de 2 ml de TCA
(ácido tricloroacético, Merck #807) al l5% seguido de mezclado,
enfriado y centrifugado para eliminar cualquier precipitado que se
forme. El ortofosfato liberado se midió por la adición de un volumen
igual de Reactivo C de nueva preparación (es decir, 3 volúmenes de
ácido sulfúrico 1 M mezclado con 1 volumen de molibdato de amonio al
2,5% (p/v) (Merck #1182) y 1 volumen de ácido ascórbico al 10% (p/v)
(Merck #127) hasta una dilución de 1:10 de la mezcla de reacción de
hidrólisis (anterior). La mezcla de Reactivo C se incubó a 50ºC
durante veinte minutos. Se midieron las absorbancias a 820 nm frente
a un blanco de reactivo y patrones conocidos (diluciones de 1:100 a
1:400 de KH2PO4 9,0 mM: Merck #4873) que se usaron para construir
una curva estándar. La cantidad de fosfato liberada por fitasa se
usó para calcular la fitasa de la siguiente manera: se comparó el
valor A820nm de la fitasa con los valores A820nm de la curva
estándar de fosfato y después de corregir todos los factores de
dilución se obtuvo la actividad de fitasa dividiendo la
concentración de fósforo (nmol/ml) por el tiempo de hidrólisis (es
decir, 15 min).
La actividad de fosfatasa ácida de pH 2,5 se
determinó de una forma similar: en concreto, se añadieron 0,1 ml de
enzima diluida (diluida en tampón de Glicina-HCl 0,2
M, pH 2,5) a 1,9 ml de sustrato (fosfato de
p-nitrofenilo 30 mM [Boehringer Mannheim] disuelto
en tampón de Glicina-HCl 0,2 M) pH 2,5. Después de
una incubación de quince minutos a 37ºC, se terminó la reacción por
adición de un volumen igual de TCA al 15% (como antes). Se midió el
ortofosfato liberado usando Reactivo C (según se ha descrito
anteriormente), y se determinó la actividad por comparación con
patrones de fosfato diluido conocidos (como antes) y usando los
cálculos descritos anteriormente.
Se digirió fitasa purificada (70 \mug) en
Tris-HCl 50 mM de pH 7,9 con tripsina al 2% (p/p)
(tratada con TPCK, Sigma) durante 2 h a 37ºC y después con tripsina
adicional al 2% (p/p) durante 21 h. La fosfatasa ácida de pH 2,5
purificada en Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, se trató con
tripsina al 2% (p/p) durante 20 h a 37ºC y luego con más tripsina al
2% (p/p) durante 6 h. Se purificaron los péptidos según se describe
más adelante.
Se alquiló la fosfatasa ácida de pH 2,5
purificada usando 4-vinilpiridina del modo
siguiente: a una fosfatasa ácida de pH 2,5 liofilizada (75 \mug)
se añadieron 40 \mul de Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5,
que contenían clorhidrato de guanidinio 6 M, EDTA 2 mM y DTT 34 mM.
Después de adición de 1 \mul de 4-vinilpiridina
(Sigma), se mantuvo la mezcla de reacción a temperatura ambiente
(22ºC) durante 1 h. Se detuvo la reacción por adición de 10 ml de
DTT 1,4 M. A continuación se purificó la fosfatasa alquilada sobre
HPLC con una columna de fase inversa C-1 (TSK TMS
250; 0,46 x 4 cm) usando un gradiente de ACN del 20% al 70%/TFA al
0,06% (80% a 30% TFA al 0,1%) en 30 min. Se agruparon y evaporaron
las fracciones que se absorben a 218 nm en una centrífuga de vacío
Speed-Vac. A continuación se volvió a suspender la
muestra seca añadiendo 60 \mul de Tris-HCl 70 mM,
pH 9,l, y se digirió con lisilendopeptidasa C al 2% (p/p) (Wako
Chemicals) durante 2 h a 37ºC. Después de adición de más
lisilendopeptidasa C al 2% (p/p), se prolongó la incubación a 37ºC
durante 26 h. Se purificaron los péptidos según se describe más
adelante.
Los péptidos obtenidos de digestión enzimática
(más arriba) se separaron por HPLC en una columna de fase inversa
C-18 (Vydac 218 TP B5; 0,46 x 25 cm) con un
gradiente de 90 min del 0 al 60% de ACN/TFA al 0,06% (100 a 40% TFA
al 0,1%). Se usó la absorbancia a 218 nm para detección de péptidos.
La secuenciación amino terminal de los péptidos purificados, así
como las proteínas nativas, se realizó degradándolos en un
secuenciador de fase líquida de impulso gaseoso (Kalkkinen &
Tilgmann, 1988). Se analizaron los PTH-aminoácidos
liberados en línea usando HPLC de fase inversa de calibre
estrecho.
Se digirió un lote de fitasa purificada (53
\mug) con carboxipeptidasa Y (Sigma, 0,6 U) en acetato de sodio 50
mM, pH 5,6, que contenía urea al 10% y SDS al 0,05% a temperatura
ambiente (22ºC). Se extrajeron muestras de la digestión en varios
puntos de tiempo. Estas mezclas se secaron en una centrífuga de
vacío Speed-Vac y se derivaron con isotiocianato de
fenilo (PTTC) según el kit de análisis de aminoácidos
Pico-Tag (asociación Waters). El análisis de los
aminoácidos derivados se realizó por HPLC de fase inversa con la
columna C-18 Pico-Tag, y se
cuantificó mediante patrones de aminoácido derivados de manera
idéntica.
[Los Materiales y procedimientos generales se
describen en la sección titulada "Materiales y procedimientos",
a continuación del ejemplo].
Para clonación molecular de genes de fitasa y
fosfatasa ácida de pH 2,5 se prepararon péptidos interiores a partir
de las enzimas (según se describe anteriormente) de A. niger
var. awamori cepa ALKO243. Se clonaron ADN genómicos que codifican
fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 y también se clonó ADNc de manera
que pudiera determinarse la secuencia de codificación completa.
Finalmente, se construyeron vectores de expresión (según se describe
en el Ejemplo 3, más adelante) que secretaban cada una de las
enzimas en una forma funcional, y se seleccionó también una cepa
transformada de gen dual que sintetizaba y secretaba la mezcla de
enzimas "equilibrada" y rentable económicamente en una
proporción de fosfatasa ácida de pH 2,5 y fitasa que confería a la
mezcla la propiedad de una actividad enzimática cooperativa que es
deseable en un uso comercial determinado como, por ejemplo, en
piensos para animales.
Se secuenciaron varios fragmentos de péptidos
internos a partir de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 purificadas,
Ejemplo 1, anterior. Se sintetizó un oligonucleótido degenerado
complementario a las ocho posibles combinaciones de codones de una
región escogida (corchetes, Tabla 3) de un péptido de fitasa interno
usando el Ensamblador Génico Plus de Pharmacia: en concreto, el
péptido a partir de fitasa con la secuencia Leu Tyr Val Glu Met Met
Gln Cys Gln Ala Glu Gln (es decir, péptido #420, Tabla 3 con el
(Asn) cuestionable corregido con Cys; Ullah, 1988).
PHY-1, mostrada en la Tabla 5, es una mezcla de
oligonucleótidos de 17 bases que contiene una correspondencia
perfecta de las ocho combinaciones.
Se diseñó un oligonucleótido degenerado de 17
mer, PHY-31, a partir de un péptido de fosfatasa
ácida: en concreto, el péptido #816C a partir de fosfatasa de pH 2,5
(es decir, Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Ala Gly Lys). A
través de la incorporación de una inosina neutra, en
PHY-31 existe una correspondencia perfecta de 64
combinaciones posibles. En la Tabla 5 se muestran la secuencia de
oligonucleótidos PHY-31 y la secuencia de péptidos
correspondiente. PHY-34 es una mezcla de 17 mer con
degeneración de 128 veces construida para codificar la secuencia del
péptido #1110T de fosfatasa ácida de pH 2,5; PHY-35
es una mezcla de l7 mer con degeneración de 64 veces construida
también para codificar la secuencia del péptido #1110T. Tanto
PHY-34 como PHY-35 son necesarias
para una representación completa del péptido #1110T. El péptido
#1110T se obtiene de una digestión de tripsina de fosfatasa ácida de
pH 2,5 nativa purificada (Tabla 4, más arriba).
Para evaluar la especificidad de los
oligonucleótidos degenerados, se sondeó ADN genómico a partir de
ALKO243 con PHY-1 terminal marcada con
[\gamma-32P]-ATP a una alta
actividad específica usando polinucleótido T4 cinasa [BRL] de E.
coli. La Figura 7 muestra que con un lavado muy riguroso, una
única banda hibridaba a un oligonucleótido PHY-1 de
fitasa. Con este rigor, se reconoció una banda única mediante el
oligonucleótido degenerado que hizo de él un buen candidato para
muestreo de biblioteca.
Figura 7. Se sondeó ADN genómico de A.
niger var. awamori cepa ALKO243 con oligonucleótido de fitasa
PHY-1. El ADN genómico se aisló mediante un
procedimiento de lisis neutra. Brevemente, se lisaron micelios secos
finamente triturados con un tampón de SDS-TE al 4%.
Se eliminaron los residuos celulares y se eliminó el sobrenadante y
se extrajo dos veces con un volumen igual de
Tris-fenol saturado:cloroformo (1:1). El ADN
genómico se hizo precipitar con NH4OAC y EtOH. El ADN sedimentado se
purificó por ultracentrifugado a través de CsCl con recuperación
según han descrito Maniatis y col. La hibridación a ADN genómico con
(\gamma32P) oligonucleótidos degenerados marcados con ATP
(Maniatis y col., 1982) se realizó a 42ºC durante toda la noche en
filtros de solución de hibridación de oligonucleótidos (6X SSPE, SDS
al 0,5%, 3X Denhardts, 100 \mug/ml de ARNt). Se eliminó la unión
no específica mediante lavado de los filtros dos veces durante 30
minutos a temperatura ambiente con 2XSSC, SDS al 0,1%, y una vez
durante 5 minutos a 42ºC en solución nueva. La exposición durante
toda la noche en película Kodak X-Omat AR con
pantallas de intensificación reveló positivamente bandas de
hibridación.
Análogamente, se sondeó ADN genómico de ALKO243
con oligonucleótido de fosfatasa ácida de pH 2,5 específica
radiomarcada PHY-31 (bajo las condiciones descritas
en la Figura 7, más arriba). La autorradiografía se muestra en la
Figura 8. Aunque la especificidad de PHY-31 no fue
tan alta como con PHY-1, parece como si, como
máximo, mediante esta sonda de oligonucleótidos se reconocieran dos
bandas.
El ADN genómico se digirió parcialmente con Sau3A
para producir fragmentos de 10 a 23 kb de longitud. El ADN digerido
se ligó a brazos de vector Lambda Dash II desfosforilados de corte
con BamHI [Stratagene]. La ligadura se empaquetó in vitro
usando extractos de empaquetamiento Gigapack Gold de Stratagene. El
fago empaquetado se usó para infectar la cepa de E. coli
P2392 y obtener placas. Se muestrearon 5 x 104 unidades de formación
de placas con oligonucleótido de fitasa PHY-1 usando
las siguientes condiciones : 42ºC durante toda la noche sobre
filtros en solución de hibridación de oligonucleótidos (6X SSPE, SDS
al 0,5%, 3X Denhardts, 100 \mug/ml de ARNt). Se eliminaron las
uniones no específicas lavando los filtros dos veces durante 30
minutos a temperatura ambiente con 2 X SSC, SDS a 0,1%, y una vez
durante 5 minutos a 42ºC en solución nueva. La exposición durante
toda la noche en película Kodak X-Omat AR con
pantallas de intensificación reveló positivamente placas de
hibridación.
Se tomaron doce placas de intensa hibridación
para una mayor caracterización. Se eligió un fago Lambda con
insertos que hibridaron a las sondas PHY-1, y que
tenían un tamaño idéntico a los fragmentos de ADN genómico en
electroforesis de gel de agarosa al 0,8%, para subclonación y, en su
caso, secuenciación de nucleótidos (según se describe más adelante,
Materiales y procedimientos).
Se digirió el ADN de bacteriófago aislado
esencialmente por el procedimiento de Yamamoto (1970) a partir de
cada uno de los 12 candidatos con endonucleasas de restricción y se
sondeó con el oligonucleótido PHY-1. Se aisló un
fragmento de hibridación BamHI/XbaI de 1,8 kb identificado
previamente en transferencias Southern genómicas a partir del número
de clon CH7 y se subclonó en M13mp18 y M13mp19 [BRL]. Se secuenció
el subclón CH7 que reaccionó positivamente con sondas de
oligonucleótido para fitasa (es decir, PHY-1).
La secuencia de nucleótidos de este subclón
reveló regiones correspondientes a la secuencia comunicada de
nucleótidos de otras secuencias de péptidos de fitasa, confirmando
así la probable identidad del clon como un ADN genómico de fitasa.
La secuenciación continuada de un fragmento de SphI de 2,6 kb
solapado reveló un marco de lectura abierta de 1.409 pb que incluía
15 secuencias de péptidos internos y secuencia de péptido
N-terminal. El análisis de la secuencia ascendente
con el programa PC/GENE de IntelliGenetics "SIGNAL" (basado en
el procedimiento de Standen, 1984), reveló una fuerte secuencia
consenso de Kozak eucariota seguido de un codón de iniciación de
metionina. Sin embargo, este ATG estaba fuera del marco con respecto
al resto de la secuencia. Se identificó un intrón de 102 pb
potencial delineado por secuencias consenso de donador fúngico, lazo
y aceptor (Rambosek y Leach, 1987) entre el codón de iniciación
potencial y el péptido N-terminal. El empalme de
este posible intrón restauró el marco de lectura entre el ATG
propuesto y la secuencia de aminoácidos de péptidos
N-terminales. Mediante incorporación de este único
posible intrón en el extremo 5' del gen de fitasa, todo el
polipéptido se codificó por 470 aminoácidos. En la Figura 9 se
muestran la secuencia y la traducción del gen de fitasa.
Figura 9. Secuencia de nucleótidos desde el
fragmento SphI de 2,6 kb que incluye el gen de fitasa con traducción
deducida. Las secuencias consenso propuestas del donador de intrón
(GTRNGT), el lazo (RCTRAC) y el aceptor (YAG) están marcadas con una
línea superior. La secuencia de nucleótidos correspondiente al
péptido #420 (Tabla 3) está marcada con una línea de subrayado. La
secuencia de nucleótidos se determinó por el procedimiento
M13-didesoxi (Sanger y col., 1977) de subclones
superpuestos con el uso del kit United States Biochemical Sequenase
II.
La masa molecular relativa del polipéptido de
fitasa traducido se calculó en un valor de 51.400 daltons
aproximadamente. Un análisis de uso de codón de fitasa reveló una
frecuencia de G+C en la tercera posición silente de codones
codificantes (es decir, excluyendo los codones Trp y Met) de 68,3%.
El gen estructural completo y la secuencia ascendente se subclonaron
como un fragmento de SphI de 2,6 kb en pUC-18 y se
designó como pFF-1 (Figura 10).
Figura 10. Vectores circulares de transformación
de fitasa. (A) pFF-1: se subclonó un fragmento de
SphI de 2,6 kb que contenía el gen de fitasa y su promotor nativo a
partir de un clon lambda positivo en pUC-18. Se
introdujo un sitio XbaI en la posición -26 de la región de
codificación de fitasa en pFF-1 por mutagénesis
directa del sitio para dar pSELFX. (B) pFF-2: fitasa
bajo control del promotor de \beta-tubulina de
A. niger. Se ligó un fragmento de XbaI de 2,0 kb obtenido de
pSELFX a un sitio XbaI único en el vector de expresión fúngica
pTL-113 para dar pFF-2. (C)
pFF-3: fitasa bajo control del promotor de GADPH de
A. niger. El fragmento XbaI de 2,4 kb obtenido de pSELFX se
ligó a un sitio XbaI único en pPRE-81 para dar
pFF-3. (D) pFF-4: fitasa bajo
control del promotor de GA de A. niger. El fragmento de XbaI
de 2,0 kb obtenido de pSELFX se ligó a un sitio XbaI único en pGA
para dar
pFF-4.
pFF-4.
Se volvió a someter a ensayo de placa la misma
biblioteca lambda y se muestreó con oligonucleótido de fosfatasa
ácida de pH 2,5 PHY-31 usando condiciones
establecidas en las hibridaciones genómicas anteriores. Se tomaron
doce placas de hibridación para posterior caracterización. El ADN
bacteriófago aislado de cada uno de los candidatos se digirió con
endonucleasas de restricción y se sondeó con oligonucleótido
PHY-31 oligo, o con una segunda mezcla de
oligonucleótidos, PHY-34/35 que se obtuvo de un
péptido independiente de fosfatasa ácida de pH 2,5 (Tabla 5). Uno de
los clones, AP99, contenía un fragmento de SphI de 2,1 kb
previamente identificado en análisis de Southern genómico, que
hibridó fuertemente a los dos oligonucleótidos. La fuerte
hibridación a los dos oligonucleótidos obtenidos de la secuencia de
péptidos independiente sugiere acusadamente que los clones contenían
secuencia de fosfatasa ácida de pH 2,5. Se subclonó este fragmento
en M13mp18 y M13mp19 para secuenciación. La secuencia de nucleótidos
de este subclón reveló un marco de lectura abierta de 785 pb con ATG
de inicio 5' potencial (metionina), una secuencia de señal fúngica y
una secuencia traducida compatible con el péptido
N-terminal y otras secuencias de péptidos internos
determinadas en el Ejemplo 1, anteriormente (Tabla 4). A
continuación del marco de lectura abierta, se identificaron codones
de terminación en los tres marcos de lectura hasta el nucleótido
1151, después de lo cual se identificó una secuencia adicional de
péptido de fosfatasa ácida péptido de pH 2,5. Estos resultados
necesitaban la inclusión de uno o varios intrones en la porción 3'
del gen.
Se purificó ARNm PoliA (según se describe, más
adelante; Materiales y procedimientos) y se usó para clonación de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una porción de ADNc de
fosfatasa ácida de pH 2,5. Brevemente, se realizó una primera
síntesis de cadena con el cebador de oligonucleótidos AP273 que se
apareó con ARNm de subespecie que codifica fosfatasa ácida de pH
2,5: en concreto, AP273
5-CTACCCCTCTGCATCTAG-3'. Se
sintetizaron los cebadores PCR de oligonucleótidos UPPHOS y DOWNPHOS
con sitios de restricción EcoRI de flanqueo: en concreto,
UPPHOS
5'-GAATTCCGAGTCCGAGGTCATGGGCGCG-3';
y,
DOWNPHOS
5'-GAATTCCCGGGACCTACCCCTCTGCAT-3'.
UPPHOS y DOWNPH4S se orientaron y separaron
inversamente mediante 978 bases en clones genómicos. La
amplificación PCR del complejo ADNc-ARNm con
cebadores de oligonucleótidos UPPHOS y DOWNPHOS produjo un producto
específico de 850 pbs aproximadamente. El producto amplificado se
aisló a partir de geles de agarosa y se digirió con EcoRI. A
continuación se subclonó este fragmento en pUC-18
digerido con EcoRI para secuenciación bicatenaria.
Se secuenció el ADNc amplificado por PCR a partir
de la porción 3' del gen y reveló la presencia de tres intrones
cortos, cada uno de los cuales mostraba secuencias consenso de
donador fúngico, lazo y aceptor. La secuencia de exón se obtiene por
empalme de los nucleótidos 136-916,
971-1088, 1141-1245 y
1305-1740 (según se muestra en la Figura 11). La
secuencia traducida resultante codifica una proteína de 479 aa. La
secuencia completa con traducción se muestra en la Figura 11.
El polipéptido de fosfatasa ácida de pH 2,5
deducido tiene un peso molecular calculado de 52.700 daltons
aproximadamente. Un análisis de uso de codones de fosfatasa ácida de
pH 2,5 reveló una frecuencia muy alta de G+C en la tercera posición
silente de codones codificantes del 79,3%.
El fragmento de SphI de 2,1 kb contenía sólo 135
pb de secuencia ascendente de fosfatasa ácida de pH 2,5. Como esta
longitud de secuencia de promotor puede no haber sido suficiente
para una expresión eficaz, se subclonó un fragmento mayor del clon
lambda. pAP-3 contiene un fragmento de SalI/PstI de
clon lambda AP99 y la secuencia de nucleótidos se muestra en la
Figura 11.
Figura 11. Secuencia de nucleótidos del fragmento
de SphI de 2,1 kb que contiene el gen de fosfatasa ácida de pH 2,5
con traducción de aminoácido deducido. Las secuencias de donadores,
lazo y aceptores de intrones determinadas por secuenciación de ADNc
están marcadas con línea superior. La secuencia de nucleótidos
correspondiente a péptidos #816 y #1110 (Tabla 4) está marcada con
línea de subrayado. La secuencia genómica de nucleótidos se
determinó por el procedimiento M13-didesoxi (Sanger
y col., 1977) con el uso del kit United States Biochemical Sequenase
II.
Se adquirieron enzimas de restricción de Bethesda
Research Laboratories y New England Biolabs (Beverly, Massachusetts,
Estados Unidos). Se adquirieron ADN ligasa T4, ADN polimerasa T4,
cinasa T4 y el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I de E.
coli de BRL (Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos). Se
adquirió fosfatasa de intestino de ternera (CIP) de Boehringer
Mannheim (Indianápolis, Indiana, Estados Unidos). Se adquirió enzima
de formación de esferoplastos, Novozyme, de Novo Biolabs (Bagsvaerd,
Dinamarca). Todas las enzimas se usaron de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. Se adquirieron los sustratos de
ensayo enzimático ácido fítico y paranitrofenilfosfato (PNPP) de
Sigma (St. Louis, Missouri, Estados Unidos) y BNB,
respectivamente.
Se usó A. niger var. awamori cepa ALKO243
(ATCC#38854) para aislamiento de los genes para fitasa y fosfatasa
ácida de pH 2,5.
Las cepas de E. coli LE392 y P2392 y el
fago Dash II, usados en la construcción del banco de genes de A.
niger, se obtuvieron de Stratagene (La Jolla, California,
EE.UU.). Se usó la cepa de E. coli JM109 como huésped en
transformaciones con construcciones derivadas de los plásmidos pUCl8
y pUC19. Los fagos M13mp18 y M13mp29 usados en la secuenciación de
didesoxinucleótido se obtuvo de Bethesda Research Laboratories
(Gaithersburg, Maryland, EE.UU.).
El vector resistente a fleomicina
pL0-3, que contiene el gen de resistencia a la
fleomicina (una proteína de unión a fleomicina obtenida de
Streptoalloteichus hindustanus) acoplado a un terminador C1
de citocromo de levadura, se obtuvo del plásmido pUT713 (CAYLA,
Toulouse Cedex, Francia). Se expresa en hongo por el promotor de
\beta-tubulina de A. niger.
Se cultivó E. coli JMI09 en caldo L. Se
seleccionaron transformantes en placas L complementadas con agar al
1,5% y que contenían 125 \mug/ml de ampicilina. El medio completo
(CM) de crecimiento de hongo en líquido está compuesto por: 50 ml de
sales 20X Clutterbuck (120 g de NaNO3, 10,4 g de KCl, 10,4 g de
MgSO4\cdot7H2O, 30,4 g de KH2PO4), 2,0 ml de Oligoelementos de
Vogel (ácido cítrico 0,3 M, ZnSO4 0,2 M,
(NH4)2(SO4)2\cdot6H2O 25 mM, CuSO4 10 mM,
MnSO4\cdotH2O 3 mM, ácido bórico 8 mM, Na2MoO4\cdot2H2O 2 mM),
5,0 g de triptona, 5,0 g de extracto de levadura, 10 g de glucosa,
en un litro de agua destilada. Las cepas de A. niger ALKO243
y ALKO2268 se cultivaron en sólidos en tubo de agar PD (caldo de
dextrosa de patata al 2,4% [Difco #0549]; agar al 1,5% [Difco
#0140]) durante siete a doce días a 28ºC.
Un sólido en tubo de ALKO243 cultivado en PDA
durante 5 días a 35ºC se impregnó con 5 ml de NP-40
H2O (0,005% (v/v) detergente Nonidet P40). Se rasparon las esporas
de los sólidos en tubo y se maceraron en tubos de vidrio con perlas
de vidrio de 3 mm. Se usaron 1 x 108 esporas para inocular 500 ml CM
en un matraz de 2 litros. Se trataron los cultivos a 35ºC con
agitación a 200 RPM durante 48 horas. Se recogieron las micelias en
Miracloth, se congelaron en nitrógeno líquido y se liofilizaron
durante toda la noche. Se trituraron todas las micelias secas
congeladas (aproximadamente 2,0 gramos) con arena de mar en un
mortero enfriado con nitrógeno líquido. Las micelias trituradas se
transfirieron a un frasco de centrífuga de 250 ml y se volvieron a
suspender en 30 ml de tampón SDS-TE al 4% (Base Tris
10 mM, EDTA 1 mM, SDS al 4%) y se dejó que se lisaran a temperatura
ambiente durante 1 hora. Se eliminaron los residuos celulares por
centrifugado a 4.000 x g durante 5 minutos y se eliminó el
sobrenadante a un tubo de centrífuga de 30 ml. Se extrajeron las
muestras dos veces con un volumen igual de fenol
Tris-saturado:cloroformo (1:1) cada vez, eliminando
la fase acuosa a un tubo limpio. Se hizo precipitar el ADN añadiendo
NH4OAc 5 M al 10% (v/v) y 2,5 volúmenes de EtOH, e incubando durante
toda la noche a -80ºC. La preparación se descongeló a temperatura
ambiente hasta "punto de jarabe" y se centrifugó a 12.000 x g
durante 30 minutos a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y se disolvió
el sedimento en 19 ml de TE (Base Tris 10 mM, EDTA 1 mM) con suave
pipeteo, a lo que se añadieron 19,0 g de CsCl. Se llenaron dos tubos
de ultracentrífuga de 11,5 ml con ADN en TE + CsCl, se añadieron 0,9
ml de 10 mg/ml de bromuro de etidio y se centrifugó la mezcla a
45.000 RPM (20ºC) durante 22 horas en un rotor Sorvall T865.1. El
ADN genómico en bandas fue visible bajo luz UV y se recogió a través
de una aguja hipodérmica de calibre 18m. El etidio se eliminó por
extracción con NaCl saturado isopropanol. El CsCl se eliminó por
diálisis frente a TE. El ADN se hizo precipitar con etanol en NaOAc
0,3 M.
El ADN genómico obtenido de A. niger var.
awamori cepa ALKO243 se cortó con Sau3A para producir fragmentos de
10 a 23 kb de longitud. El ADN cortado se ligó a brazos de vectores
Lambda Dash II desfosforilados de corte BamHI comprados. La ligadura
se empaquetó in vitro usando extractos de empaquetado
Gigapack Gold de Stratagene. Los fagos empaquetados se usaron para
infectar cepa de E. coli P2392 para obtener placas.
Se levantaron las placas en membranas de
nitrocelulosa Schleicher & Schuell NC (BA85) según recomendó el
fabricante. Usando las secuencias de aminoácidos de fitasa y
fosfatasa ácida de pH 2,5 (Ejemplo 1, anterior), se prepararon
oligonucleótidos degenerados para cada proteína. La mezcla de
oligonucleótidos para cada proteína fue complementaria a todas las
posibles combinaciones de codones de la región escogida del péptido.
Los oligonucleótidos se sintetizaron usando el Ensamblador de Genes
Plus de Pharmacia y las secuencias se muestran en la Tabla 5,
anterior.
Se tomaron placas de hibridación aisladas simples
en 500 ml SM (por litro: 5,8 g de NaCl, 2,0 g de MgSO4, 50 ml de
Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 5 ml de solución de gelatina
al 2% (p/v)). Se añadieron 20 ml de cloroformo y se eluyeron las
partículas de fagos durante toda la noche a 4ºC. Se mezclaron 220 ml
de lisato de células con 200 ml de células LE392 cultivadas en
presencia de Mg y maltosa; se añadieron 8 ml de medio NZCYM (10,0 g
de NZ-amina, 5,0 g de NaCl, 5,0 g extracto de
levadura, 2,0 g de MgSO4\cdot7H2O, y 1,0 g de ácidos Casamino por
litro; pH adjustado a pH 7,5); y se promovió el cultivo con
agitación a 37ºC hasta células lisadas (6 horas aproximadamente). A
continuación se añadieron 100 ml de cloroformo y se continuó con la
incubación durante 15 minutos para garantizar lisis completa. A
continuación se centrifugó la muestra 5 min a 8.000 g y se eliminó
el sobrenadante a un tubo nuevo. Se añadieron ARNasa A y ADNasa I a
1 mg/ml cada uno; se incubaron las muestras durante 30 minutos a
37ºC; y se añadió un volumen igual de PEG 8000 al 20% (p/v), NaCl 2
M en SM para precipitar los fagos. Se incubaron muestras durante al
menos 1 hora en hielo. Se sedimentaron los fagos resultantes por
centrifugado 10.000 x g durante 20 minutos a 4ºC; se decantó el
sobrenadante; y se volvió a suspender el sedimento de fago en 0,5 ml
de SM. Se purificó más el ADN por adición de SDS, EDTA y Proteinasa
K, seguido de extracción con fenol:cloroformo y precipitación de
isopropanol. A continuación se examinaron los tamaños de los
insertos de ADN lambda en geles de agarosa al 0,8%, se transfirió el
ADN a nitrocelulosa y se hibridó con las sondas
PHY-1 o PHY-31 de oligonucleótidos
radiomarcados. Se eligieron para subclonación fragmentos de ADN que
hibridan a las sondas y que tienen un tamaño idéntico a los
fragmentos de ADN genómicos.
Se cultivaron 200 ml de cultivos de A.
niger var. awamori ALKO243 en medio de cultivo de ARN (almidón
de maíz al 2% [Sigma], proteasa peptona al 1% [Difco], 30 g/l de
glucosa, 5 g/l de NH4NO3, 0,5 g/l de MgSO4\cdot7H2O, 0,5 g/l de
KCl, 0,183 g/l de FeSO4\cdot7H2O) durante 48 horas a 30ºC, 220
RPM. Se filtraron los micelios a través de papel de filtro Whatman
#1 y se enjuagó con 10 ml de H2O tratada con DEPC (pirocarbonato de
dietilo al 0,1% en agua destilada estéril), después de liofilizó
durante toda la noche a -80ºC. Se trituraron 1,5 gramos (3 g total)
de micelios secos bajo nitrógeno líquido en un polvo fino, y luego
se transfirió a un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de Tampón
de Ruptura (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA
5 mM, pH 8, SDS al 5%) y 10 ml de fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico (P/CIA: 50:48:2). Se dejó que se descongelara la mezcla
durante treinta minutos a temperatura ambiente y después se
centrifugó durante 10 minutos a 10.000 RMP a 4ºC. Se eliminó la fase
acuosa usando una pipeta de calibre ancho en un tubo de centrífuga
limpio y se reextrajo con P/CIA hasta que la interfaz estaba
transparente. Se añadió un volumen igual de LiCl 6 M a la capa
acuosa final para hacer precipitar el ARN y se enfrió durante toda
la noche a -80ºC. A continuación se centrifugó la mezcla durante
veinte minutos a 10.000 x g y 4ºC, y se volvió a suspender el
sedimento en 2,4 ml de solución GTC (tiocianato de guanidina 4 M,
citrato de sodio 25 mM pH 7, N-lauril sarcosina al
5%, b-mercaptoetanol 100 mM). Se añadió un volumen
igual de isopropanol, se enfrió el precipitado sobre hielo seco
durante 40 minutos, y después se centrifugó a 4ºC durante 30
minutos. Se enjuagó el sedimento en EtOH al 80%, se volvió a girar,
se secó al vacío y finalmente se resuspendió en 1 ml de
DEPC-H2O. La concentración de ARN se determinó
espectrofotométricamente a 260 nm.
Se purificó por afinidad ARN mensajero
poliadenilado (ARNm poliA) a partir de ARN total usando columnas de
oligo(dT)-celulosa según las instrucciones
del fabricante (Pharmacia Fine Chemicals, Piscatawy, Nueva Jersey).
Brevemente, se aplicaron 1,25 mg de ARN total a dos columnas
separadas que se sometieron anteriormente a centrifugado y
equilibrado en tampón de alto contenido sal (Pharmacia). Después de
tres lavados en tampón de bajo contenido sal (Pharmacia), se eluyó
el ARNm a partir de la columna a 65ºC en Tampón de Elución
precalentado (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, que contenía
EDTA 1 mM); y se hizo precipitar añadiendo 0,1 volúmenes de 10 mg/ml
de glicógeno y 2,5 volúmenes de etanol. Se enfrió la mezcla a -80ºC
durante 2 horas, y luego se centrifugó a 4ºC durante 30 minutos. El
ARNm recuperado se disolvió en Tampón de Elución hasta una
concentración final de 1,3 mg/ml.
Primero se realizó síntesis de cadena con el kit
de ADNc BMB según las recomendaciones del fabricante con 1,0 mg de
ARNm y cebador de oligonucleótido AP273, sintetizado como
complemento asecuencia de nucleótido de fosfatasa de pH 2,5 3': en
concreto, AP273
5'-CTACCCCTCTGCATCTAG-3'. Se
sintetizaron los cebadores PCR de oligonucleótidos UPPHOS y DOWNPHOS
con sitios de restricción de EcoRI de flanqueo: en concreto,
UPPHOS
5'-GAATTCCGAGTCCGAGGTCATGGGCGCG-3',
y,
DOWNPHOS
5'-GAATTCCGGGGACCTACCCCTCTGCAT-3',
según se ha descrito anteriormente.
Los fragmentos de restricción de hibridación de
clones genómicos lambda se purificaron con gel usando el "Kit de
Purificación Glassmilk" disponible comercialmente a partir de
GeneClean (Bio 101, La Jolla, California). Los fragmentos de
restricción se subclonaron en corte M13mp-18 y
M13mp-19 con las enzimas apropiadas. Se determinó la
secuencia de nucleótidos de clones que reaccionan positivamente con
sondas de oligonucleótido para fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5
por el procedimiento de secuenciación de didesoxinucleótidos M13
(Sanger y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA
74:5463-5467, 1977) usando el kit United States
Biochemical Sequenase II. Se secuenció el ADNc en regiones de
intrones sospechosos por secuencia bicatenaria de desnaturalización
alcalina. El gen de fitasa estaba contenido completamente en el
fragmento SphI de 2,6 kb que se subclonó en pUC-18
para dar pFF-1. El gen de fosfatasa ácida de pH 2,5
completo se aisló como un fragmento SphI de 2,1 pb que se
subclonaron en pUC-18 para dar
pAP-1.
pSELFX es un plásmido que contiene una secuencia
de nucleótidos de fitasa en la que se introdujo un sitio XbaI en la
secuencia de genes modificando los nucleótidos en posición -26 y -24
con respecto al codón de iniciación ATG. Se introdujeron cambios de
nucleótidos por mutagénesis específica del sitio del fragmento SphI
de 2,6 kb que contenía el gen de fitasa, usando el Kit de
Mutagénesis de Sitios Alterados de Promega. A continuación se
muestra el oligonucleótido usado para dirigir la mutagénesis:
Oligo PHY-40:
5'-AGAAGAAATTTCTAGAACAGCAGCGATTGG-3'
(XbaI)
pAP-1Xba es un plásmido que
contiene una secuencia de nucleótidos de fosfatasa ácida de pH 2,5
en la que se introdujo un sitio XbaI en la secuencia génica mediante
modificación de los nucleótidos en posiciones -24 y -27 con respecto
al codón de iniciación ATG. Los cambios en los nucleótidos se
introdujeron por PCR-mutagénesis. A continuación se
muestran los cebadores para la mutagénesis por PCR:
Oligo #271
5'-CGAGAGCACCTTCTCTAGATTTTGTCAAATGTACC-3'
(XbaI)
y,
Oligo #272
5'-ACCCTCACCGAACTTGCGGGCCG-3'.
Se usó ADN pAP-1 como plantilla
para amplificación por PCR. El fragmento amplificado resultante se
escindió con XbaI y NruI y a continuación se ligó el fragmento a
XbaI/NruI corte pAP-1 para dar el plásmido
pAP-1Xba. Se secuenció el plásmido para asegurar que
no se introdujeran mutaciones en la región que había sido
amplificada por PCR. Se generó pAP-2 por ligadura
del fragmento BamHI/HindIII tratado con reactivo de Klenow a partir
de pAP-1XBA en SmaI corte pUC-18.
Los transformantes que contenían el pAP-2 orientado
correctamente se identificaron mediante el análisis del tamaño de
los fragmentos de endonucleasas de restricción.
Se eliminó el gen estructural completo de
fosfatasa ácida de pH 2,5 a partir de pAP-2 como un
fragmento de 2,0 kb de XbaI para construcción de vectores de
transformación de fosfatasa ácida de pH 2,5 que sobreexpresaron la
enzima objeto (Ejemplo 4, más adelante). También se aisló el gen
completo de fosfatasa ácida de pH 2,5 como fragmento de PstI/SalI de
5,0 kb que se subclonó en pUC-18 para dar
pAP-3. pAP-3 se usó en la
construcción de vectores de transformación de fosfatasa ácida de pH
2,5 para sobreexpresión de la enzima objeto (Ejemplo 4, más
adelante).
Se aplicaron 21 mg de ARN total (aislado como
antes) a pocillos de agarosa-gel de formaldehído al
1,5% y se separó por electroforesis. Se aplicaron también marcadores
de peso molecular de ARN ("ARN escalera" 0,24 kb a 9,5 kb,
Bethesda Research Labs) al gel para comparaciones de tamaño. El gel
se transfirió en nitrocelulosa (Schleicher y Schuell; Keene, NH),
horneado durante un hora a 80ºC en un horno de vacío, prehibridado
en formamida al 50%, 5X SSC, SDS al 0,1%, 5X Denhardt y 100 mg/ml de
ADN de timo de ternera a 37ºC durante 24 horas, luego se hibridó en
la misma solución con sonda radiomarcada a 42ºC durante 24 horas. Se
lavó el filtro dos veces en 2X SSC/SDS al 0,1% a temperatura
ambiente durante quince minutos, y luego una vez en 0,1X SSC/SDS al
0,1% y se autorradiografió usando película Kodak
S-Omat AR con pantallas de intensificación.
Se realizó una comparación entre la secuencia de
aminoácidos de la fosfatasa ácida de pH 2,5 y la fitasa y otras
secuencias publicadas de fosfatasa ácida. Se determinó la homología
(valor de alineación de 17,705) usando el programa de matrices
PC/GENE PCOMPARE (basado en el procedimiento de Neddleman y Wunsch,
1970). Se encontró homología significativa entre la fosfatasa ácida
de pH 2,5 y otras enzimas de fosfatasa ácida
"PHO-3" (Bajwa y col., 1984) y
"PHO-5" (Arima y col., 1983), ambas aisladas
previamente por otros a partir de Saccharomyces cerevisiae.
La zona de mayor homología, R H G X R X P (posiciones aa
81-87), se usó para buscar la proteína EMBL
CDPROT17 de edición de base de datos 1991. La secuencia RHGXRXP se
encontró en otras varias fosfatasas ácidas (como se muestra en la
Tabla 6, más adelante).
a) Homología con otras fosfatasas
ácidas encontrada usando la secuencia objeto R H G X R X P con el
programa PC/GENE de IntelliGenetics QGSEARCH en la base de datos de
proteínas EMBL CDPROT17 usando parámetros de búsqueda por omisión;
los residuos en NEGRITA son idénticos; b} APPA = fosfatasa ácida de
pH 2,5 de E. coli ([Touati y Danchin, 1987];
PHO-1 = fosfatasa ácida de Scizosaccharomyces
pombe ([Elliot y col., 1986]); PHO-5 =
fosfatasa ácida represible de Saccharomyces cerevisiae
([Arima y col., 1983]); PHO-3 = fosfatasa ácida no
represible de S. cerevisiae ([Bajwa y col., 1984]); LAP =
fosfatasa ácida lisosómica de rata ([Himeno y col., 1989]); PAP =
fosfatasa ácida prostática de rata ([Roiko y col., 1990]); ACP2 =
fosfatasa ácida lisosómica humana ([Pohlmann y col., 1988)); ACPP =
fosfatasa ácida prostática humana ([Tailor y col.,
1990]).
La región RHGXRXP se conserva entre organismos
con la misma diversidad que E. coli y el hombre. Esta
conservación sugiere importancia funcional y puede reflejar así una
región de sitio activo de estas fosfatasas.
[Los Materiales y procedimientos generales se
describen en la sección titulada "Materiales y procedimientos"
a continuación de este ejemplo].
Se diseñó una serie de vectores para la
reintroducción de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 usando
promotores fúngicos nativos y alternativos. Un conjunto de vectores
que transportaban el gen de fitasa, pFF1-pFF4
(Figura 10, anterior) no contenía marcador fúngico seleccionable y
se introdujo por cotransformación con el plásmido pL03 (ver
Materiales y procedimientos, más adelante).
Las cepas recombinantes resultantes de vectores
pFF1-2 contenían secuencias extrañas de ADN
derivadas del marcador seleccionable de E. coli. Por tanto,
se diseñó un segundo conjunto de vectores denominados
pFF6-pFF11 para eliminar estas secuencias. Los
últimos vectores contenían un marcador fúngico seleccionable y
sitios de restricción que permitían aislar fragmentos lineales
libres de secuencias de E. coli (Figura 12).
Figura 12. Vectores lineales de transformación de
fitasa. (A) pFF-6A: fitasa bajo control de su
promotor nativo. Se clonó el fragmento SphI de 2,6 kb a partir de
pFF-1 en el sitio SphI de pL03 para dar
pFF-6, se aisló como fragmento HindIII de 4,9 kb
lineal. (B) pFF-8: fitasa bajo control del promotor
de GAPDH. Se aisló el casete de resistencia a fleomicina a partir de
pL03 como un fragmento HindIII (relleno)/PstI y se subclonó en BglII
(relleno)/Pst corte pPRE-81 para dar
pPRE-82. Se añadió el fragmento pSELFX de XbaI que
contenía fitasa al pPRE-82 cortado parcialmente con
XbaI para dar pFF-8, que se aisló como un fragmento
PstI de 6,7 kb. (C) pFF-9: fitasa bajo control del
promotor de GA. Se aisló el casete de resistencia a fleomicina a
partir de pL03 como un fragmento KpnI (relleno)/HindIII y se ligó a
pFF-4 cortado parcialmente con KpnI, romo, y luego
se cortó con HindIII. Se aisló pFF-9 como un
fragmento lineal HindIII/KpnI de 7,3. (D) pFF-11:
fitasa bajo control del promotor de GA y secuencia de señal. Se
aparearon oligonucleótidos #260 y #261 (ver Materiales y
procedimientos, más adelante) y se ligaron a XbaI/XhoI digerido
pFF-1, se añadió el promotor de GA como un fragmento
KpnI/XbaI, y se añadió casete de marcador de resistencia a
fleomicina (Fleor) como un fragmento HindIII para dar
pFF-11. Se aisló ADN lineal como un fragmento de
KpnI 7,35.
Los vectores de transformación para fosfatasa
ácida de pH 2,5 consistieron en vectores lineales, denominados
pPHO1-pPHO4A, que se construyeron para la
introducción en el gen de fosfatasa ácida de pH 2,5 (Figura 13). Se
diseñaron también dos vectores, pFIN-1A y
pFIN-1B, que contenían tanto los genes de fitasa
como de fosfatasa ácida de pH 2,5 expresados a partir del promotor
de glucoamilasa en un único plásmido (Figura 14).
Figura 13. Vectores a partir de los cuales pueden
aislarse fragmentos lineales para la reintroducción de fosfatasa
ácida de pH 2,5. (A) pPHO-1: fosfatasa ácida de pH
2,5 bajo control de su promotor nativo. Se aisló el casete de fleor
como un fragmento HindIII, de extremo romo, y ligado a
pAP-3 (el gen de fosfatasa ácida de pH 2,5 en un
fragmento PstI/SalI en 5,0 kb en pUC-18 (5)),
cortado con EcoRI y también de extremo romo. Se aisló el ADN lineal
como un fragmento PstI de 6,3 kb. (B) pPHO-2:
fosfatasa ácida de pH 2,5 bajo control del promotor de
\beta-tubulina. Se subclonó el gen de fosfatasa
ácida de pH 2,5 contenido en un fragmento XbaI de 2,0 kb a partir de
pAP-1Xba (Materiales y procedimientos, más adelante)
en pTL-113, que después se cortó parcialmente con
SphI, se rellenó y se ligó a un fragmento que contenía el casete
marcador de resistencia a fleomicina, produciendo
pPHO-2. (C) pPHO-3: fosfatasa ácida
de pH 2,5 bajo control del promotor de GAPDH. Se digirió
pPHO-2 parcialmente con XbaI para dar un fragmento
de 4,3 kb de XbaI que contenía fosfatasa ácida de pH 2,5 y el casete
de Fleor, que se ligaron en el sitio XbaI de
pPRE-81. (D) pPHO-4A: fosfatasa
ácida de pH 2,5 bajo control del promotor de GA. Se subclonó el
fragmento Xba de 2,0 kb a partir de pAP-1Xba en pGA,
y se aisló un fragmento de KpnI de 5,5 kb que contenía el promotor
de GA y fosfatasa ácida de pH 2,5, se rellenó y se ligó a pL03.
Figura 14. Se construyó un vector de
transformación de enzima dual para sobreexpresión tanto de fitasa
como de fosfatasa ácida de pH 2,5 por un único plásmido. (A)
pFIN-1A y (B) pFIN-1B: plásmidos de
combinación con fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 bajo control de
copias separadas del promotor de GA. Se aisló un fragmento HindIII
de 8,1 kb a partir de pPHO-4A y se ligó a
pFF-4 digerido con HindIII.
Como resulta evidente a partir de la información
de la exposición anterior de las Figuras 12 a 15, se evaluaron
varias construcciones de promotores fúngicos diferentes: en
concreto, el promotor de \beta-tubulina, el
promotor de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH) y el promotor de glucoamilasa (GA). Los dos últimos
promotores fúngicos se aislaron a partir de A. niger ATCC1015
(Tailor, P. y col. 1990). Estos respectivos promotores se sometieron
a ensayo para determinar su capacidad de conducir la expresión de
fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5.
Para facilitar la fusión de promotores
alternativos en los constructos, se introdujo un sitio de
restricción XbaI por mutagénesis dirigida al sitio en la posición
-26 del gen de fitasa. Análogamente, se diseñó un sitio XbaI en la
posición -28 del gen de fosfatasa ácida de pH 2,5 por mutagénesis
por PCR (ver Materiales y procedimientos, más adelante). Los sitios
XbaI diseñados por ingeniería se usaron posteriormente para
promotores fúngicos alternativos diseñados previamente por
ingeniería para que contuvieran dichos sitios XbaI en las regiones
reguladoras 5' del gen.
Primero se presentan los resultados obtenidos en
células transformadas con constructos de vectores de fitasa, a
continuación, seguido de los resultados obtenidos con fosfatasa
ácida de pH 2,5.
A. niger var. awamori cepa ALKO243 y A.
niger cepa ALKO2268, una cepa mutante que muestra una producción
superior de fitasa obtenida de ALKO243 por mutagénesis UV, se usaron
como huéspedes para fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 diseñadas por
ingeniería. Se transformaron cepas de A. niger ALKO243 y
ALKO2268 por una modificación del procedimiento de Tilburn y col.
(1983) usando resistencia a fleomicina como un marcador genético
seleccionable de fármaco. Dado que los genes clonados de fitasa y
fosfatasa ácida de pH 2,5 se mantuvieron en plásmidos sin un
marcador seleccionable, se cotransformaron esferoplastos con un
vector resistente a fleomicina pL0-3 que contiene el
gen de proteína de unión a fleomicina a partir de
Streptoalloteichus hindustanus acoplado a un terminador C1 de
citocromo de levadura. Se obtuvo pL0-3 a partir del
plásmido pUT713 [CAYLA, Toulouse Cedex, Francia] y se expresó en
hongo por el promotor de \beta-tubulina de A.
niger. Se seleccionaron transformantes con un recubrimiento de
volumen igual que contiene 50 \mug/ml de fleomicina para la cepa
ALKO243 y de 195 a 200 \mug/ml para la cepa ALKO2268. (Las cepas
ALKO243 y ALKO2268 fueron sensibles a lisis por esferoplasto, y
necesitaron diferentes condiciones de tamponamiento osmótico; ver
Materiales y procedimientos, más adelante). Se obtuvieron de 30 a 45
colonias de esporulación por \mug de ADN en las placas de
selección. Todas las colonias resistentes a fleomicina habían
integrado el marcador de resistencia a fleomicina (análisis de
Southern, datos no mostrados).
Se identificaron transformantes que producían
mayor actividad de fitasa que A. niger cepa ALKO243 parental
en un ensayo de muestreo de placa de fitasa que mide
colorimétricamente la acumulación de fosfato inorgánico por la
reducción de un complejo de fosfomolibdato (Materiales y
procedimientos, más adelante). Posteriormente se probaron
transformantes con alta actividad en el ensayo de placa en cuanto a
producción de fitasa mediante ensayo de la actividad enzimática
liberada en el caldo de un cultivo de fermentación (según se ha
descrito, más adelante).
La Figura 15 muestra un ensayo de placa para
detectar actividad de fitasa aumentada. Se estudiaron conidios de
transformantes de fitasa de A. niger GAD-10 a
GAD-120 en los medios de ensayo de placa, incubados
durante dos días a 30ºC, y se recubrieron con Reactivo C para
detección de color (Materiales y procedimientos, más adelante). Los
GAD 130 (a4), GAD 112 (e3) y GAD 118 positivos cuando se cultivaron
en cultivos en matraz agitador mostraron valores de 108.000 PU/ml,
35.600 PU/ml y 36.700 PU/ml, respectivamente (es decir, aumentos de
aproximadamente 1.260 veces superiores que ALKO243). La actividad de
fitasa para ALKO2268 (b5) no transformado fue de 4.000 PU/ml.
Se analizó la cantidad de fitasa producida por
transformantes mediante crecimiento de las células en cultivos en
matraz agitador y valoración de la cantidad de enzima en el caldo,
del modo siguiente: brevemente, se establecieron cultivos en
matraces agitadores bajo condiciones óptimas (Materiales y
procedimientos, más adelante) y se incubó durante 5 días, momento en
el cual se eliminaron las células por centrifugado y se valoró el
medio de sobrenadante del cultivo para determinar la cantidad de
actividad de fitasa. (Tanto el ensayo de placa (anterior) como el
ensayo de valoración del medio midieron la cantidad de fosfato
inorgánico liberado por hidrólisis enzimática del sustrato de fitato
de sodio cuantificando colorimétricamente la reducción de un
complejo de fosfomolibdato).
Usando el promotor de fitasa nativo (a partir de
plásmido; pFF-1 ver Ejemplo 2, Materiales y
procedimientos, anterior), de los 58 transformantes generados,
cuatro mostraron producción aumentada de fitasa que fue de 6,5 a 7,0
veces mayor que la producida por la cepa sobreproductora no
transformante ALKO2268 ("No transformado", Tabla 7, más
adelante) o por células de control ALKO2268 que se transformaron con
un plásmido de control pL0-3 que no contenía
secuencias de fitasa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a) Sobreproductores ALKO2268
recombinantes de fitasa en cultivos de matraz de agitación, es
decir, fermentación en medios de cultivo de harina de soja, después
de 5 días de agitación a 28ºC. Los componentes celulares y de los
medios se eliminaron por centrifugado. Se determinó la actividad
enzimática añadiendo diluciones del caldo de cultivo sobrenadante a
fitato de sodio al 1% [Sigma], en tampón de citrato 0,2 M, pH 5,0.
Después de quince minutos a 37ºC, cada reacción se terminó añadiendo
TCA (ácido tricloroacético, [Merck]) al 15%. Se midió el ortofosfato
liberado añadiendo un volumen igual de Reactivo C (proporción 3:1:1
de ácido sulfúrico 1 M [Mallinckrodt], molibdato de amonio al 2,5%
[Sigma], ácido ascórbico al 10% (Sigma]) a una dilución 1:10 de la
reacción de hidrólisis e incubando a 50ºC durante veinte minutos. Se
midió la absorbancia de la mezcla de reacción frente a un blanco de
reactivo y patrones de fosfato conocidos (diluciones 1:100 a 1:400
de KH2PO4 9,0 mM) a 820 nm; b) la actividad se expresa por unidades
de fitasa por ml (es decir, PU/ml); c) el aumento se expresa como
aumento en número de veces en actividad (es decir, en PU/ml) con
respecto a la actividad (es decir, en PU/ml) con ALKO2268 (es decir,
actividad de transformante/actividad de
ALKO2268).
Estudios posteriores implican el uso de
promotores heterólogos que conducen la expresión de fitasa. Se
examinaron 1.467 transformantes de fitasa usando el ensayo de placa
(157 se obtuvieron de la cepa ALKO243, y 1.310 se obtuvieron de la
cepa ALKO2268). De ellos, 302 se identificaron en el ensayo de placa
como potenciales sobreproductores de fitasa. De los transformantes
de sobreproducción de fitasa, 25 (es decir, el 1,7% de los 1.467
evaluados) tuvieron actividad enzimática en exceso de 700 veces
mayor en PU/ml que la producida por ALKO243. (Los resultados
obtenidos con 18 de los 25 transformantes se muestran en la Tabla
8). El transformante que mostraba la más alta producción de fitasa
(es decir, GAI-6; 181.000 PU; aproximadamente 2.100
veces mayor en PU/ml que ALKO243) fue el resultado de la
transformación con el constructo pFF-9 que contenía
un promotor fúngico de glucoamilasa (GA). El último transformante
mostró un aumento significativo en los niveles de producción de
fitasa en comparación con ALKO2268 (un sobreproductor) o con ALKO243
(una cepa de tipo salvaje) (ver Tabla 8, más adelante).
\vskip1.000000\baselineskip
a) Se usaron plásmidos
pFF-9, pFF-8 y
pFF-6A en forma lineal con todas las secuencias de
E. coli escindidas. Designación de transformante; GA =
promotor de glucoamilasa, GAPDH = promotor de gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa; NATIVO = promotor de
fitasa nativo; b) = actividad de cultivo de fermentación en matraz
de agitación; las actividades enzimáticas (es decir, en PU/ml) son
promedios de dos fermentaciones independientes; c) el aumento se
expresa como el número de veces de aumento en la actividad en
cultivo de matraz de agitación con respecto a la actividad con
ALKO243 en cultivo de matraz de agitación (es decir, actividad en
PU/ml de transformante por actividad en PU/ml de
ALKO243).
Se realizaron análisis de Southern y Northern con
ADN y ARNm (respectivamente), aislados a partir de transformantes de
fitasa GAE 32, GAK 4-47, GAL 65, GAM 225 y GAO 248
(Tabla 8) que sobreprodujeron fitasa en cultivos de fermentación de
matraz de agitación. Se aisló el ADN genómico a partir de las cepas
transformantes respectivas, se digirió con enzimas de restricción y
se ensayó con un fragmento de restricción de ADN de fitasa clonado
radiomarcado (es decir, aislado a partir de pFF1, anterior), para
determinar el número de copias génicas y el procedimiento de
integración en los transformantes. Se determinó un aumento en el
número de copias génicas comparando la densidad de la transferencia
en 1,3 kb (es decir, el ADN de constructo de vector de
transformación) frente a la densidad de la copia cromosómica
endógena del gen de fitasa (es decir, a 2,4 kb) y frente al ADN
genómico ALKO2268 de control. La cuantificación se consiguió
mediante densitometría de barrido (Figura 16A). Se detectaron de
tres a cinco copias génicas de vector de fitasa adicionales,
dispuestas en múltiples patrones diferentes de integración (datos no
mostrados), en transformantes GAE 32, GAK 4-47,
GAL-65, GAM-225 y
GAO-248.
La expresión de niveles de ARNm de fitasa por
transferencia Northern demostró que los niveles de mensaje de los
transformantes aumentaron consistentemente entre siete y trece veces
con respecto a los controles no transformados (Figura 16B). Sin
embargo, los niveles reales pueden ser superiores porque se demostró
difícil aislar ARNm de las células cultivadas en los medios de
producción, y fue por tanto necesario hacer estas comparaciones bajo
condiciones subóptimas de crecimiento celular y expresión de
fitasa.
Figura 16A. Análisis por transferencia Southern
de número de copias genómicas de fitasa en sobreproducción de
transformantes de fitasa: el ADN genómico se digirió con BamHI, se
transfirió, se sometió a electroforesis y se sondeó el filtro con
fragmentos de BamHI de la región 5' de pFF-1. Se
determinó el número de copias génicas comparando la densidad de
transferencia de copias génicas (a 1,3 kb) en transformantes con la
densidad de transferencia del gen de fitasa endógeno (a 2,4 kb) por
densitometría de barrido. Vías 1, 4, 7: control no transformado
ALKO2268. Vías 2, 5, 8, 9, 10: sobreproducción de transformantes de
fitasa GAE-32, GAK-47,
GAL-65, GAM-225,
GAO-248, respectivamente.
Figura 16B. Niveles de ARN mensajero por análisis
por transferencia Northern en transformantes de sobreproducción de
fitasa: se sometieron a electroforesis 20 \mug de cada muestra
total de ARN en un gel de formaldehído y se transfirió a
nitrocelulosa. Se sondeó cada transformante con los fragmentos de
restricción del gen de fitasa (es decir, fragmentos BamHI a partir
de pFF-1). Se midió un nivel de mensaje de fitasa
aumentado por densitometría del ARNm. Se usó el ARN de ALKO2268 (Vía
1) como línea de base. Las vías 2 a 6: GAE-32,
GAK-47, GAL-65,
GAM-225, GAO-248,
respectivamente.
Los resultados presentados en la Tabla 9, a
continuación, resumen los resultados cuantitativos obtenidos por
barrido de la densidad de las transferencias Southern y Northern en
la Figura 16A y la Figura 16B.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
a) nat = promotor nativo; cir =
vector circular; lin = fragmento de ADN lineal; GA = promotor de
glicoamilasa; b) ARNm = niveles de amplificación de ARN mensajero
(como aumento en número de veces con respecto a los niveles en
ALKO243); c) Actividad = producción de fitasa en cultivo de
fermentación representada en unidades de fitasa por ml (es decir,
PU/ml), condiciones descritas en la Tabla 7, anterior; d) el aumento
se expresa en aumento en número de veces en la actividad en el
cultivo de matraz de agitación con respecto a la actividad con
ALKO243 en el cultivo de matraz de agitación (es decir, actividad en
PU/ml de transformante por actividad en PU/ml de
ALKO243).
b)
No fue posible desarrollar un ensayo de muestreo
en placa específico para fosfatasa ácida de pH 2,5; por tanto, se
analizaron los transformantes evaluando la producción de enzimas en
el caldo de cultivo después de 5 días de fermentación en matraces de
agitación (según se ha descrito anteriormente, Tabla 7, y en
Materiales y procedimientos, más adelante). Las condiciones para
medir la producción de fosfatasa ácida de pH 2,5 en el ensayo de
matraz de agitación de fermentación se describe más adelante (Tabla
10) usando paranitrofenilfosfato como sustrato (también se describe
más adelante en Materiales y procedimientos). Como en la Tabla 7,
anterior, se valoraron los niveles de enzimas en el medio de cultivo
sobrenadante y se compararon los niveles de enzimas con los niveles
producidos en el mismo período de incubación de 5 días por un
cultivo de control de la cepa ALKO1243 de A. niger.
De los 55 transformantes generados con el
plásmido pAP-3 que contiene el promotor nativo que
conduce la expresión de fosfatasa ácida de pH 2,5 (Ejemplo 2,
Materiales y procedimientos, anterior), cuatro transformantes
mostraron aumentos en la producción de fosfatasa ácida de pH 2,5 que
fue de 25 a 57 veces mayor (Tabla 10) que los niveles producidos por
una cepa ALKO243 parental. El más alto transformante de producción
(GAQ56) mostró un aumento de casi 58 veces con respecto al ALKO2268
no transformado (Tabla 10), y en la Tabla 11, más adelante, se
ilustra un aumento de hasta 126 veces.
a) Condiciones, según se describe
en la Tabla 7, anterior; b) actividad en unidades de fosfatasa ácida
por ml (es decir, HFU/ml); c) el aumento se expresa como el número
de veces de aumento en actividad en matraz de agitación con respecto
a la actividad con ALKO2268 en cultivo de matraz de agitación (es
decir, actividad en HFU/ml de transformante por actividad en HFU/ml
de
ALKO2268).
Estudios posteriores evaluaron los promotores
heterólogos que condujeron expresión de fosfatasa ácida de pH 2,5.
1.181 transformantes sobreprodujeron fosfatasa ácida de pH 2,5 (410
resultantes de la cepa ALKO243 y 771 de la cepa ALKO2268). Se
identificaron 32 transformantes (2,7%) que produjeron fosfatasa
ácida de pH 2,5 en exceso de 30 HFU/ml. El transformante de máxima
producción (es decir, GAO-69) tuvo en promedio 126
HU/ml. Esta expresión se obtuvo como resultado de la transformación
con constructo de plásmido que tenía un promotor de glucoamilasa
(GA) fúngica (Tabla 11).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
a) Sobreproductores ALKO2268 y
ALKO243 de fosfatasa ácida de pH 2,5 en cultivos de fermentación de
matraz de agitación (realizado según se describe en la Tabla 7,
anterior). La actividad enzimática se determinó añadiendo diluciones
del caldo de cultivo sobrenadante a
p-nitrofenilfosfato 30 mM (Boehringer Mannheim) en
tampón de glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5. Se terminó la
reacción y se sometió a ensayo ortofosfato según se describe en la
nota al pie de la Tabla 7. Las actividades enzimáticas son medias de
actividades de dos fermentaciones independientes excepto (*), que se
obtuvo de fermentaciones simples. Se usaron los plásmidos
pPHO-3 y pPHO-4A en forma lineal con
secuencias de E. coli escindidas. Designación de
transformante: GA = promotor de glucoamilasa, GAPDH = promotor de
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; b)
actividad en unidades de fosfatasa ácida por ml (es decir, HFU/ml);
c) el aumento se expresa como el número de veces el aumento en la
actividad en cultivo de matraz de agitación con respecto a la
actividad con ALKO243 en cultivo de matraz de agitación (es decir,
actividad en HFU/ml de transformante por actividad en HFU/ml de
ALKO243).
El número de copias y los niveles de mensajes se
determinaron usando análisis de transferencia Southern y Northern y
densitometría de barrido (según se describe anteriormente) para
cinco de los más altos sobreproductores de fosfatasa ácida de pH 2,5
identificados en los cultivos de fermentación en matraz de agitación
(Tabla 11, anterior). El ADN de los transformantes de fosfatasa
ácida de pH 2,5 GAT-143, GAW-54,
GAW-89, GAW-121 y
GAW-130 se digirieron con enzimas de restricción e
hibridaron a sonda radiomarcada específica de fosfatasa ácida de pH
2,5. En total, los transformantes de fosfatasa ácida de pH 2,5
tuvieron números de copia génica (Tabla 12, más adelante) superiores
a los observados con los transformantes de fitasa (Tabla 9,
anterior). En contraste, los niveles de mensaje de los
transformantes de fosfatasa ácida de pH 2,5 (Tabla 12) no fueron tan
altos como los observados en transformantes de fitasa (Tabla 9). Sin
embargo, al igual que con los transformantes de fitasa anteriores,
los niveles de mensaje de fosfatasa ácida de pH 2,5 no se midieron
bajo condiciones de fermentación óptimas debido a la dificultad
encontrada al aislar ARN de las células bajo condiciones de cultivo
de producción. Por tanto, la expresión bajo condiciones de
producción puede ser superior a la medida aquí.
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a) GA = promotor de glucoamilasa;
GAP = promotor de gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa; lin = fragmento de ADN lineal; ARNm = niveles de
amplificación de ARN mensajero (aumento en número de veces con
respecto a los niveles en ALKO243); b) = actividad de fosfatasa
ácida de pH 2,5 representada en unidades de fosfatasa ácida por ml
(HFU/ml); comparaciones realizadas con crecimientos celulares en
cultivos de matraces de agitación; actividad = actividad enzimática
medida según se describe en la Tabla 10, anterior; c) el aumento se
expresa como aumento en número de veces de la actividad en cultivo
de matraz de agitación con respecto a la actividad con ALKO243 en
cultivo de matraz de agitación (es decir, actividad en HFU/ml de
transformante por actividad en HFU/ml de
ALKO243).
Las construcciones de plásmidos se diseñaron de
manera que podrían eliminarse fácilmente secuencias de esqueleto del
vector antes de la transformación de los genes respectivos en
hongos. Se aisló ADN lineal a partir de agarosa y se purificó
mediante GeneClean para eliminar cualquier especificidad
contaminante posible. Los constructos A-D y los
constructos E-H que expresan los genes de fitasa y
fosfatasa de pH 2,5, respectivamente, bajo control regulador
diferente se prepararon según se describe a continuación.
Constructo A: pFF-6 Fitasa bajo
control de su promotor nativo.
Se clonó el fragmento SphI de 2,6 kb que contenía
el gen de fitasa en el sitio SphI de pL0-3. Se
generaron dos orientaciones, denominadas pFF-6A y
pFF-6B. Se aisló ADN lineal a partir de cualquier
vector como fragmento HindIII de 4,9 kb.
Constructo B: pFF-8 Fitasa bajo
control del promotor de GAPDH de A. niger.
Se cortó el vector de expresión fúngica
pPRE8-1 con BglII y se cortó en extremo romo con
fragmento de Klenow de ADN polimerasa I; a continuación se cortó el
plásmido con PstI para terminar. Se eliminó el casete de expresión
de marcador de resistencia a fleomicina (Fleor) de
pL0-3 (como un fragmento HindIII (relleno)/PstI), y
se ligó al corte pPRE8-1 para dar
pPRE8-2. Se identificaron los transformantes por
análisis de restricción. Se ligó el fragmento de XbaI de 2,0 kb que
contenía el gen de fitasa (Ejemplo 2, Materiales y procedimientos)
en un sitio XbaI único descendente con respecto al promotor de GAPDH
en el plásmido pPRE8-2. Se identificaron los
transformantes correctamente orientados que contenían
pFF-8 por análisis de restricción. Se aisló ADN
lineal a partir de pFF-8 como un fragmento PstI de
6,7 kb.
Constructo C: pFF-9 Fitasa bajo
control del promotor de GA de A. niger.
El fragmento de XbaI de 2,0 kb que contenía el
gen de fitasa (Ejemplo 2, Materiales y procedimientos, anterior) se
ligó al sitio XbaI único de vector de expresión fúngica pGA para dar
pFF-4. Los transformantes que contenían plásmido
correctamente orientado se identificaron por análisis de
restricción. pFF-4 se cortó parcialmente con KpnI
para producir plásmido lineal cortado de manera singular. Se
cortaron los extremos en romo con ADN polimerasa T4. A continuación
se cortó el plásmido hasta terminar con HindIII.
pL0-3 se cortó primero con KpnI y se cortó en
extremo romo con ADN polimerasa T4, y luego se cortó con HindIII. Se
purificó el fragmento de 2,1 kb que contenía casete de expresión
fleor a partir de agarosa con GeneClean y se ligó a corte
pFF-4. Los transformantes que contenían
pFF-9 se identificaron por análisis de restricción.
Se aisló ADN lineal a partir de pFF-9 como un
fragmento HindIII/KpnI de 7,3 kb.
Constructo D: pFF-11 Fitasa bajo
control del promotor de GA de A. niger GA con secreción a
través de la secuencia de señal GA.
Se sintetizaron oligonucleótidos 260 y 261 que
codifican para un sitio XbaI ascendente con respecto a la región de
inicio de traducción y secuencia de señal para glucoamilasa, que
estaba situada, a su vez, en sentido ascendente desde la secuencia
de nucleótidos que codifica el N-terminal de fitasa
(SEC. ID. nº 1). (El constructo contenía también un sitio XhoI
nativo inmediatamente descendente con respecto a esta región). Los
dos oligonucleótidos sintéticos en este constructo tenían la
siguiente secuencia de nucleótidos: en concreto,
Se aparearon los oligonucleótidos 260 y 261 y a
continuación se ligaron a XbaI/XhoI corte pFF-1 para
dar pFF-1GA. El promotor de glucoamilasa de pGA se
ligó en pFF-1GA (como un fragmento KpnI/XbaI) para
dar pPREFF-11. Finalmente, se añadió un casete de
fleor como un fragmento HindIII en un sitio HindIII único de la
construcción. Los transformantes que contenían plásmido
correctamente orientado se identificaron por análisis de
restricción. El ADN lineal se aisló a partir de
pFF-11 como un fragmento KpnI de 7,35.
Constructo E: pPHO-1 Fosfatasa
ácida (AP) de pH 2,5 bajo control de su promotor nativo.
pAP-3 se cortó con EcoRI y se
cortó el extremo en romo con Klenow. Se eliminó el casete fleor a
partir de pL0-3 como un fragmento HindIII, se cortó
el extremo en romo con Klenow, y ligó en el corte de plásmido
pAP-3. Los transformantes que contenían
pPHO-1 correctamente orientado se identificaron por
análisis de restricción. Se aisló el ADN lineal a partir de
pPHO-1 como un fragmento PstI de 6,3 kb.
Constructo F: pPHO-3, gen de
fosfatasa ácida de pH 2,5 bajo control del promotor de
\beta-tubulina de A. niger.
Se cortó el vector de expresión fúngica pTL113
con XbaI y se desfosforiló con fosfatasa intestinal de ternera. Se
ligó un fragmento de XbaI de 2,0 kb que contenía el gen de fosfatasa
de pH 2,5 (Ejemplo 2, Materiales y procedimientos, anterior) en
corte pTL113 para dar pPREPHO-2. Los transformantes
que contenían plásmidos correctamente orientados se identificaron
por análisis de restricción. Se cortó pPREPHO-2
parcialmente con SphI para dar plásmido lineal de corte singular.
Los extremos del pPREPHO-2 se cortaron en romo con
ADN polimerasa T4. Se ligó un fragmento HindIII de 2,7 kb de extremo
romo que contenía el casete de expresión fleor a partir de
pL0-3 en el vector pPREPHO-2 de
corte. Los transformantes que contenían plásmido
pPHO-2 correctamente orientado se identificaron por
análisis de restricción. Se aisló ADN lineal como un fragmento PstI
de 6,0 kb.
Constructo G: pPHO-3, gen de
fosfatasa ácida de pH 2,5 bajo control del promotor de GAPDH de
A. niger.
Se eliminaron un fragmento de 4,3 kb de XbaI que
contenía el gen de fosfatasa de pH 2,5 (Ejemplo 2, anterior) y el
casete de expresión de fleor de pPho-2 por digestión
parcial. Se purificó el fragmento a partir de agarosa con GeneClean
y se ligó en sitio XbaI único en el vector de expresión fúngica
pPRE8-1. Los transformantes que contenían plásmido
pPHO-3 correctamente orientado se identificaron por
análisis de restricción. Se aisló el ADN lineal como un fragmento
PstI de 7,0 kb.
Constructo H: pPHO-4, gen de
fosfatasa ácida de pH 2,5 bajo control del promotor de GA de A.
niger.
El fragmento de 2,0 kb de XbaI que contenía el
gen de fosfatasa ácida de pH 2,5 (Ejemplo 2, anterior) se ligó en el
vector de expresión fúngica pGA de corte XbaI para dar
pPREPHO-4. Los transformantes que contenían plásmido
correctamente orientado se identificaron por análisis de
restricción. Se eliminó un fragmento KpnI de 5,5 kb que contenía el
promotor de GA y el gen de fosfatasa ácida de pH 2,5 a partir de
pPREPHO-4 por digestión parcial. Se purificó el
fragmento resultante a partir de agarosa con GeneClean y se cortó en
extremo romo con ADN polimerasa T4. El fragmento de extremo romo se
ligó en pL0-3 cortado con PstI, y a continuación se
cortó el ADN en extremo romo para dar plásmidos en dos orientaciones
diferentes, denominadas pPHO-4A y
pPHO-4B. Los transformantes que contenían cada
orientación se identificaron por análisis de restricción. Se aisló
ADN lineal como un fragmento HindIII de 8,1 kb.
Se obtuvieron esferoplastos primero añadiendo de
0,5 ml a 1 ml de una suspensión de esporas fúngicas a partir de
conidiación de cultivos desarrollados en sólidos en tubo PD a 50 ml
de medio CM media en matraces de 250 ml. Para ALKO243, se
desarrollaron cultivos durante toda la noche a 35ºC, 200 RPM, antes
de filtración. Los cultivos ALKO2268 se desarrollaron durante 48
horas a 30ºC, 200 RPM. Los micelios resultantes se recogieron en una
doble capa de gasa, se añadió a 50 ml de tampón KCM (KCl 0,7 M, MOPS
10 mM, pH 5,8) con 5 mg/ml de Novozym 234 (Novo BioLabs) y se incubó
a 30ºC, 85 RPM durante toda la noche para generación de
esferoplastos.
Los esferoplastos se recogieron por filtración a
través de un embudo empaquetado con Miracloth y se cubrieron con
gasa en cuatro tubos de centrífuga cónicos de 15 ml, y se agitó
durante diez minutos, 1.500 RPM en una centrífuga superior de banco.
Se volvieron a suspender suavemente los sedimentos en un total de
Tampón de Sorbital de 15 ml (Sorbital 1 M; CaCl2 50 ml) y se volvió
a centrifugar. Se lavó nuevamente el sedimento en Tampón de Sorbitol
(SB) y se volvió a suspender en SB hasta una densidad de 5 x
l07/ml.
Se añadieron 5 \mug de ADN lineal o de plásmido
en 20 \mul de TE a 200 \mul de esferoplastos. Para
cotransformaciones, se añadió también 1 \mug de ADN de gen
marcador de resistencia a fleomicina seleccionable, pL03. Se
pipetearon suavemente 50 \mul de PCM (PEG 8000 al 40%, MOPS 10 mM,
pH 5,8, CaCl2 50 mM [CaCl2 añadido justo antes de usar]) en la
mezcla de ADN-esferoplastos y se incubó en hielo
durante 30 minutos.
Se añadió 1 ml de PCM a la mezcla de
transformación, se pipeteó la mezcla en 50 ml de Agar de
Regeneración (MA:CM más manitol 1,3 M, agar al 3%) y se dividió en
cinco placas de Petri. Se dejó que los esferoplastos se regeneraran
de 3 a 5 horas a 35ºC antes de solapamiento con una cantidad igual
de OL + fleomicina (OL: peptona al 1%, agar al 1%; fleomicina
[CAYLA]: 50 \mug/ml para ALKO243, 195 \mug/ml para ALKO2268).
Los posibles transformantes se transfirieron a sólidos en tubo PD +
fleomicina y se cultivaron a 28ºC.
Se identificaron transformantes que producen
rendimientos superiores de fitasa por medio de un ensayo de placa
que mide colorimétricamente la acumulación de fosfato inorgánico por
la reducción de un complejo de fosfomolibdato. Se determinaron
conidios de los transformantes posibles en placas de ensayo y se
incubaron dos días a 30ºC. Se aplicaron 20 ml de Reactivo C
(proporción 3:1:1 de ácido sulfúrico 1 M [Mallinckrodt], molibdato
de amonio al 2,5% [Sigma], ácido ascórbico al 10% [Sigma] a la parte
superior del medio, y se incubaron las placas a 50ºC durante quince
minutos antes de medir la intensidad de color. (Ensayo de placa
agar: almidón de maíz al 2% [Sigma #S-4126),
proteasa peptona al 1% [Difco #0122-1], 30 g
glucosa/l, 5 g de NH4NO3/l, 0,5 mg de MgS04\cdot7H20/l, 0,5 g de
KCl, 0,183 g FeSO4\cdot7H2O/l, agar al 3%, fitato de sodio al 3%
[Sigma #P-3168]).
Se realizaron ensayos enzimáticos según se
describe en el Ejemplo 1, anterior.
Se cultivaron hongos filamentosos recombinantes
transformados que expresaban fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 bajo
idénticas condiciones en un medio de producción con base de soja
[(50 g/l de harina de soja, 30 g/l de glucosa, 5 g/l de NH4NO3, 0,5
g/l de MgSO4\cdot7H2O, 0,5 g/l de KCl, 0,183 g/l de
FeSO4\cdot7H20, pH 5,0)] durante cinco días en un agitador
rotatorio a 200 RPM y 28ºC. Se cultivaron adicionalmente
transformantes que utilizan el promotor de glucoamilasa en medio de
glucoamilasa de soja (medio de soja más almidón de maíz al 4% y
glucosa al 6%). Se recogieron muestras enzimáticas por centrifugado
de partes alícuotas del medio de fermentación a 13.000 RPM en una
microcentrífuga durante diez minutos, y a continuación transfiriendo
el sobrenadante que contiene la enzima a un tubo nuevo para ensayo
enzimático (más adelante).
Como para la degradación óptima de ácido fítico
se necesitan tanto fosfatasa ácida de pH 2,5 como fitasa, se
consideró altamente ventajoso construir cepas que pueden
sobreproducir ambas enzimas. Como el ácido fítico se desfosforiló
más eficazmente cuando las proporciones entre unidades de fitasa y
unidades de fosfatasa ácida estaban adaptadas a medida para el uso
específico (Ejemplo 1, anterior), se consideró todavía más deseable
si las cepas transformantes pudieran seleccionarse de forma que
sobreprodujeran ambas enzimas en este intervalo de proporción
deseado.
Se seleccionaron transformantes de A.
niger ALKO243 usando las combinaciones de plásmidos de vectores
de transformación mostrados en la Tabla 13 y cotransfección con un
marcador seleccionable de fleomicina (según se describe
anteriormente, Ejemplo 4, Materiales y procedimientos). Después de
cotransformación con las combinaciones indicadas de fitasa y
fosfatasa ácida de pH 2,5 que contienen plásmidos (Tabla 13), se
cultivaron los transformantes en cultivos de matraces de agitación
(según se describe en la Tabla 7 y la Tabla 10, Ejemplo 4, anterior)
para evaluar la producción de enzimas.
Primero se sometieron a ensayo todos los
transformantes de enzima dual para determinar la cantidad de
fosfatasa ácida de pH 2,5; si los niveles estaban significativamente
elevados, entonces se sometió a ensayo la actividad de fitasa. (Como
la fitasa tiene dos pH óptimos a pH 2,5 y pH 5,0 [anterior, Ejemplo
1], su actividad puede detectarse bajo parámetros de fosfatasa ácida
de pH 2,5). (Los valores de fosfatasa ácida se ajustaron para tener
en cuenta el porcentaje de actividad de fitasa que aparece en el
ensayo de fosfatasa ácida de pH 2,5). Se encontró que 9 de los 425
transformantes sobreproducían fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5; y,
a valores superiores a 4:1 de HFU/PU (es decir, HFU de fosfatasa
ácida de pH 2,5 divido por PU de fitasa).
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| Combinación Plásmido ADN | Número analizado | |
| pPHO1/pFF4 | 3 | |
| pPHO3/pFF1 | 108 | |
| pPHO3/pFF2 | 50 | |
| pPHO3/pFF4 | 11 | |
| pPHO3(lin)/pFF6(lin) | 74 | |
| pPHO3(lin)/pFF8(lin) | 7 | |
| pPHO4A/pFF1 | 21 | |
| pPHO4A/pFF2 | 22 | |
| pPHO4A/pFF3 | 25 | |
| pPHO4A/pFF4 | 22 | |
| pFF6/prepho2 | 2 | |
| pFIN-1A | 84 | |
| pFIN-1B | 46 | |
| Total | 475 |
Dieciocho de los 475 transformantes de
combinación (Tabla 13) mostraron actividades en exceso de 20 veces
más de HFU/ml que ALKO243 para fosfatasa ácida de pH 2,5 y 250 veces
de PU/ml mayor que ALKO243 para actividad de fitasa (Tabla 14).
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a) Las actividades enzimáticas se
determinaron en cultivos de matraz de agitación (según se describe
en la Tabla 10, Ejemplo 4, anterior). Los resultados se expresan
como promedio de al menos dos cultivos de fermentación
independientes excepto (*), que se toman desde un cultivo de
fermentación único. Los niveles de fosfatasa ácida de pH 2,5 (AP pH
2,5) se ajustaron para restar la actividad de fondo de fitasa (es
decir, el porcentaje de fitasa que podría detectarse a pH 2,5 en las
condiciones de ensayo de fosfatasa ácida de pH 2,5; Materiales y
procedimientos); b) todos los plásmidos utilizados en estos estudios
fueron circulares, y en la forma circular completa. Los plásmidos
pFIN-1A y pFIN-1B son plásmidos
simples que contienen la secuencia génica de la fosfatasa ácida (AP)
de pH 2,5 y de la fitasa (Phy). Transformante = Designación de
transformante; (Promotor para fosfatasa ácida (AP)/promotor para
fitasa (Phy)); GA = promotor de glucoamilasa, GAPDH = promotor de
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa;
\beta-T = promotor de
\beta-tubulina, c) HFU/ml, unidades de fosfatasa
ácida; PU/ml, unidades de fitasa (ver Tablas 7-10,
anteriores), d) proporción HFU/PU = actividad de fosfatasa ácida
(HFU/ml)/actividad de fitasa (PU/ml); e) el aumento se expresa como
el número de veces en actividad de fosfatasa ácida (HFU/ml) o fitasa
(PU/ml) en cultivo de matraz de agitación con respecto a la
actividad con ALKO243 en cultivo de matraz de agitación (es decir,
actividad en HFU/ml o PU/ml, respectivamente, de transformante por
actividad en HFU/ml o PU/ml, respectivamente, de
ALKO243).
Las cepas GAX7, GAX-11 y
GAX-12 se caracterizaron para determinar sus
cantidades relativas de dosificación génica, niveles de mensajes y
producción de enzimas. Los tres transformantes muestran evidencia de
integración en tándem que tiene lugar desde la introducción del
vector de transformación de fitasa pFF4. Dos de las cepas,
GAX-7 y GAX-11, muestran también
evidencia de sucesos múltiples de integración (Figura 17A). El
aumento de nivel de mensajes de fitasa con respecto a los niveles de
ARNm de ALKO243 ARNm variaron entre 17,5 veces de aumento (para
GAX-11) y 34,4 veces de aumento (para
GAX-12) (Figura 17B; Tabla 15).
La Figura 17A muestra análisis de Southern de
número de copias de ADN de genes de fitasa en las cepas GAX
transformadas de gen dual. El ADN de transformantes de enzimas
duales GAX-7, 11 y 12 se digirieron con BamHI y
XbaI; se sometieron a electroforesis; se transfirieron; y se sondeó
el filtro con un fragmento BamHI/XbaI a partir de
pFF-4. Vía 1. ADN de control de plásmido
pFF-4 digerido con BamHI/XbaI. Vía 2. ADN de control
sin transformar ALKO243. Vía 3. ADN de GAX-7
transformante. Vía 4. ADN GAX-11 transformante. Vía
5. ADN GAX-12 transformante. p = número de copias de
plásmido de vector de transformación; c = número de copias génicas
cromosómicas.
La Figura 17B muestra análisis de Northern de
niveles de transcripto de ARNm de fitasa en las cepas GAX de la
Figura 17A: 20 mg de ARN total, espigados con 10 ng de ADN RF mp18
(mp), se sometieron a electroforesis, se transfirieron a
nitrocelulosa y se sondearon con pFF-1. El
transcripto de fitasa en 1,4 kb está señalado con flechas. Vía 1.
ARN de control sin transformar ALKO243. Vía 2. ARN
GAX-7 Vía 3. ARN GAX-11. Vía 4. ARN
GAX-12.
a) GA = promotor de glucoamilasa;
cir = vector circular; b) Copia de vector nº = número de copias del
ácido nucleico vector en el genoma de la célula transformada; + =
copias adicionales no cuantificadas de fitasa presentes; c) ARNm =
niveles de amplificación de ARN mensajero (como número de veces de
aumento con respecto a los niveles en ALKO243); d) actividad =
actividad de fitasa representada en PU/ml a partir de cultivos de
matraz de agitación según se describe en la Tabla 10, anterior; e)
el aumento se expresa como el número de veces de aumento en
actividad de fitasa (PU/ml) en cultivo de matraz de agitación con
respecto a la actividad con ALKO243 en cultivo de matraz de
agitación (es decir, actividad en PU/ml, respectivamente, de
transformante por actividad en PU/ml, respectivamente, de
ALKO243).
En la Tabla 16, a continuación, se presentan
datos de un análisis similar por transferencia Southern y Northern
de las tres cepas, para secuencias génicas de vector de
transformación de fosfatasa ácida de pH 2,5. Los resultados muestran
que GAX-7, un integrante de pPHO-3,
contenía una copia adicional de fosfatasa ácida de pH 2,5 (como un
suceso de integración simple); mientras que GAX-11 y
12, integrantes de pPHO-4A, contenían copias
adicionales (adquiridas por integración en tándem; Figura 18A). Los
niveles de mensajes de fosfatasa ácida de pH 2,5 aumentaron 2,7
veces (es decir, con respecto a los niveles en ALKO243) en
GAX-7, y l0 veces y 15 veces en
GAX-11 y GAX-12, respectivamente
(Figura 18B; Tabla 16). Como se observa en los transformantes de
genes de fosfatasa ácida de pH 2,5 simples (es decir, Ejemplo 4
anterior), se obtuvieron números de copia más altos para integración
de plásmidos de vectores de transformación que con los vectores de
fitasa, pero los niveles de mensaje para fosfatasa ácida de pH 2,5
no fueron en correspondencia tan altos como los niveles observados
con los vectores de fitasa (Tabla 16, más adelante).
La Figura 18A muestra análisis de Southern de
número de copias de ADN de fosfatasa ácida de pH 2,5 secuencias en
cepas transformadas de gen dual GAX. Todas las muestras se
digirieron con SalI, se sometieron a electroforesis, se
transfirieron a nitrocelulosa y se sondearon con el gen de fosfatasa
ácida de pH 2,5 aislado en fragmentos a partir de
pAP-3 (Ejemplo 3, anterior). Vía 1. Control de ADN
de plásmido pPHO-3, digerido SalI. Vía 2. Control de
ADN de plásmido pPHO-4A, digerido SalI. Vía 3.
Control de ADN ALKO243 no transformado. Vía 4. ADN
GAX-7. Vía 5. ADN GAX-11. Vía 6. ADN
GAX-12.
La Figura 18B muestra análisis de Northern de
niveles de ARNm de expresión de mensajes de fosfatasa ácida de pH
2,5 en enzimas duales transformadas en cepas. El transcripto de ADN
de fosfatasa ácida de pH 2,5 está señalado con flechas. Vía l. ARN
de control sin transformar ALKO243. Vía 2. ARN
GAX-7. Vía 3. ARN GAX-11. Vía 4. ARN
GAX-12.
a) GAP = promotor de gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa; GA = promotor de
glucoamilasa; cir = vector circular; b) copia de vector nº, ver
Tabla 15, anterior; c) ARNm = niveles de amplificación de ARN
mensajero (como aumento en número de veces con respecto a niveles en
ALKO243); d) actividad = actividad de fosfatasa ácida de pH 2,5
representada en HFU/ml medido en cultivos de matraz de agitación
según se describe en Tabla 10, anterior; e) el aumento se expresa
como aumento en número de veces la actividad de fosfatasa ácida
(HFU/ml) en cultivo de matraz de agitación con respecto a la
actividad con ALKO243 en cultivo de matraz de agitación (es decir,
actividad en HFU/ml de transformante por actividad en HFU/ml de
ALKO243).
Los materiales y procedimientos usados en la
presente memoria descriptiva fueron los mismos que los usados
anteriormente (ver Ejemplo 4).
Según se ha descrito anteriormente en los
Ejemplos 2 a 5, se lograron aumentos industrialmente significativos
en los rendimientos de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5
transformando una cepa de Aspergillus niger (es decir,
ALKO2268) con constructos de vectores de transformación y
seleccionando transformantes que sobreexpresaban la proteína
enzimáticamente activa deseada. En fermentaciones en matraces de
agitación, se aumentaron los rendimientos de fitasa 2.000 veces con
respecto a los niveles de producción de enzimas conseguidos con
ALKO243 (Ejemplo 4; Tabla 8, anterior), y los rendimientos de
fosfatasa ácida de pH 2,5 se aumentaron más de 100 veces (Ejemplo 4;
Tabla 11, anterior). Estos aumentos de rendimiento se consideraron
resultantes de varios factores: los más importantes fueron la
dosificación génica aumentada y la utilización de promotores
alternativos eficaces (es decir, promotores heterólogos de GA, GAP,
GAPDH y el promotor de \beta-tubulina; ver
Ejemplos 4 y 5, anteriores). Posteriormente se evaluaron los
factores que controlan los niveles de expresión.
Los datos presentados en los Ejemplos 4 y 5
anteriores sugieren que se produjeron aumentos relativamente grandes
en la proteína de fitasa a partir de aumentos relativamente modestos
en el número de copias génicas y los niveles de transcriptos de
ARNm. El número observado de copias génicas aumenta entre tres y
cinco copias adicionales en las cepas de sobreproducción de fitasa.
Estas cepas, en concreto GAE-32,
GAK-47, GAL-65,
GAM-225 y GAO-248, adquirieron
aparentemente las copias génicas adicionales por sucesos de
integración múltiple del vector recombinante de ADN de plásmido de
transformación, es decir, más que por integración en tándem. Tres de
las cinco cepas, GAL-65, GAM-225 y
GAO-268, se transformaron con fragmentos de ADN
lineal, a partir de los cuales puede ser menos probable que
aparezcan alineamientos en tándem. GAE-32 y
GAK-47, sin embargo, se transformaron con
construcciones de vectores circulares, que a menudo dan lugar a
copias génicas alineadas en tándem. Como los transformantes se
seleccionaron sobre la base de la actividad de fitasa en el ensayo
enzimático de placa (antes que en el análisis por transferencia de
Southern, como suele ser el caso), la frecuencia relativa de
transformantes que tuvieron secuencias de ADN de fitasa integradas
en posiciones óptimas probablemente se incrementó. El o los sitios
de integración cromosómica desempeñan aparentemente un rol
importante en la expresión de gen de fitasa y este procedimiento de
muestreo seleccionó transformantes optimizados.
En transformantes de fitasa de alta producción,
los niveles de ARN mensajero se elevaron de siete a trece veces con
respecto a ALKO2268, mientras que los niveles de fermentación
producidos por las células se incrementaron cincuenta veces.
El número de copias observado en transformantes
de fosfatasa ácida de pH 2,5 {Tabla 12, Ejemplo 4; Tabla 16, Ejemplo
5, anterior) fue mayor que en los transformantes de fitasa (Tabla 9,
Ejemplo 4; Tabla 15, Ejemplo 5, anterior), pero las cantidades de
mensaje de fosfatasa ácida de pH 2,5 fueron sustancialmente menores
que en transformantes de fitasa. Las cepas sobreproductoras de
fosfatasa ácida de pH 2,5 altas GAT-143,
GAW-54, GAW-89,
GAW-121 y GAW-130 se transformaron
con vectores que tenían ADN lineal a partir de
pPHO-3 o pPHO-4A. En estos
transformantes se observaron de siete a doce copias génicas
adicionales (es decir, copias de genes vectores), pero los niveles
de mensaje aumentaron sólo entre aproximadamente tres y
aproximadamente siete veces.
Se evaluaron los efectos los constructos de
vectores de transformación de ADN lineales y los constructos
circulares de vectores en producción enzimática de fitasa. En
general, las construcciones circulares dieron una frecuencia
superior de transformantes con producción de la enzima fitasa
aumentada (Figura 19), pero los niveles máximos de enzima producidos
por los transformantes fueron comparables con los constructos
lineales y circulares. Por ejemplo, el vector circular pFF3 dio 8/24
(33%) transformantes de fitasa con niveles de producción de enzimas
superiores a 750 PU. La contrapartida lineal de pFF3, es decir,
pFF8, tuvo dos veces menos transformantes (es decir, consiguió el
mismo nivel umbral de producción de fitasa), pero los transformantes
que se seleccionaron tenían niveles de producción máximos
comparables a los transformantes pFF8. Cuando se purificaron y
volvieron a ligar los fragmentos lineales, la frecuencia de
productores superiores no aumentó.
Figura 19. Comparación de los efectos de ADN
lineal y circular en las valoraciones de 24 transformantes de fitasa
seleccionados aleatoriamente. Con el vector circular pFF3, el 33% de
los transformantes de fitasa tuvieron niveles de producción de
enzimas superiores a 750 PNU. Su contrapartida lineal, pFF8, tuvo
dos veces menos transformantes que los conseguidos por ese mismo
umbral de producción de enzimas. PNU = unidades normalizadas de
fitasa.
El nivel de expresión de genes en
Aspergillus puede depender de la elección particular de
promotor fúngico filamentoso de A. niger. Los resultados
presentados en los Ejemplos 4 y 5, anteriores, sostienen la noción
de que la fitasa y la fosfatasa ácida de pH 2,5 pueden expresarse a
partir de una variedad de promotores de A. niger (incluyendo,
por ejemplo, los promotores GA, GAPDH y
\beta-tubulina), así como los elementos de
promotores nativos en las regiones reguladoras 5' de los genes de
fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5. Sin embargo, los resultados
muestran también que los niveles máximos de enzima producidos en
transformantes, a partir de la expresión dirigida por los diferentes
promotores, es diferente; es decir, la elección de promotor
determinó el nivel de expresión. Mientras los promotores nativos de
fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 fueron efectivos, los promotores
de glucoamilasa (GA) y GAPDH fueron significativamente mejores. Los
niveles de producción de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 en
cultivo de fermentación bajo el control de los promotores de GA y
GAPDH se muestran en la Figura 20.
Figura 20. Los diferentes promotores fúngicos
usados en transformación de plásmidos influyeron en el nivel de
fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 producidos por transformantes de
A. niger. Los niveles de enzima producidos por diez
transformantes (es decir, con los niveles más altos para esos
promotores dados) se promediaron conjuntamente.
(En estos cálculos no se usaron los
transformantes de enzima dual).
GAPDH = gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa. GA = glucoamilasa.
El promotor de glucoamilasa de la especie
Aspergillus se ha usado según se ha informado para aumentar
la expresión de varias proteínas (Ullah y col., 1987). Además del
promotor de GA, la secuencia GA contiene péptido y propéptido de
señal de glucoamilasa que se han usado según se ha informado en
intentos de aumentar la expresión (Yamamoto y col., 1970).
Para probar los efectos de la secuencia de señal
de fitasa en los niveles de fitasa producidos, se sustituyó la
secuencia de señal en el gen de fitasa (en el constructo
pFF-11) por un oligonucleótido sintético que
contenía la secuencia de señal posible de glucoamilasa fúngica.
Sorprendentemente, en vez de aumentar los niveles de enzima
producidos, la inserción de la secuencia de señal GA redujo en
realidad los niveles de fitasa producidos, en comparación con los
niveles de producción conseguidos en transformantes que tienen la
secuencia de señal de fitasa nativa (es decir, en el gen nativo de
la secuencia de fitasa). Estos resultados indican la posible
importancia de la secuencia de señal de fitasa a la hora de elevar
al máximo los niveles de producción de fitasa.
Los genes bajo el control de un promotor de
glucoamilasa pueden regularse al alta (inducirse) en presencia de
almidón. Para evaluar los efectos de dicha regulación al alta en los
niveles de producción de fitasa, algunos transformantes de fitasa
promotores de glucoamilasa pFF-4 y
pFF-9 se cultivaron en medios que habían sido
complementados con almidón de maíz al 4%. Los niveles de producción
de enzimas se aumentaron en promedio 1,4 veces en los últimos
cultivos, aunque estos niveles de producción no se observaron de
forma consistente. Estos máximos rendimientos de fitasa observados
bajo condiciones de inducción fueron de 3.240 a 3.770 PNU. Los
resultados indican que la optimización de los medios usados en el
caldo de fermentación de producción de fitasa podrían dar como
resultado rendimientos significativamente mayores de enzima.
El promotor de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) es, según se ha informado, un promotor
constitutivo que puede conducir expresión de alto nivel de un
producto génico heterólogo. Los autores de la invención clonaron
independientemente el gen de gliceraldehído fosfato deshidrogenasa A
(gpdA) a partir de A. niger ATCC1015 con el fin de evaluar su
efecto sobre la expresión de genes de fitasa y fosfatasa ácida de pH
2,5 en un constructo de vector de transformación introducido en
A. niger cepa ALKO243 o ALKO2268. Los niveles de producción
de enzimas en transformantes que tienen el promotor de GAPDH que
conduce la expresión de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 fueron
casi idénticos a los niveles alcanzados, anteriormente, usando el
promotor de glucoamilasa (Figura 20). Así, el promotor de GAPDH no
pareció ofrecer oportunidades especiales para la producción de
enzimas aumentada. Los motivos de este comportamiento particular no
están claros por ahora; sin embargo, dicha variabilidad en la
expresión entre ALKO243 y ALKO2268 puede relacionarse con la
derivación de ALKO2268 como un mutante de ALKO243, y a este respecto
ALKO2268 produce sólo la mitad aproximadamente de la cantidad de
fosfatasa ácida de pH 2,5 producida por la cepa ALKO243 parental.
Así, es posible que ALKO2268 sea deficiente en algunos factores
limitadores relacionados con la expresión de fosfatasa ácida de pH
2,5. (Dichas diferencias dependientes de la cepa en la expresión
conducida por promotores no se observó con otros promotores
cualesquiera).
El promotor de \beta-tubulina
es también, según se ha informado, un promotor capaz de conducir la
expresión constitutiva de genes. Para probar sus posibles efectos en
la expresión de genes de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5, se
aisló el promotor de \beta-tubulina a partir de
A. niger cepa 1015. El promotor se introdujo en vectores de
transformación para evaluar sus efectos en los niveles de producción
de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5. Estudios previos de los
autores de la invención sugirieron que la expresión de genes
fúngicos homólogos podría aumentar cuando se condujeran por el
promotor de \beta-tubulina, y que este aumento fue
sustancialmente mayor que el que podría alcanzarse a través del uso
de un promotor de GAPDH o GA (Panlabs, inédito). Lamentablemente, la
inclusión de un promotor de \beta-tubulina en
constructo del vector de transformación de fitasa redujo en realidad
los niveles de enzima producidos; y, con fosfatasa ácida de pH 2,5
sólo se observó un modesto aumento en los niveles de producción con
respecto a los niveles de producción mediados por el promotor nativo
(Figura 20).
También se consideró posible que la producción de
fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 recombinantes fuera sensible a la
represión mediada por fosfato de la transcripción. En este caso, los
niveles de enzima producidos podría aumentarse eliminando dichas
condiciones en el cultivo de fermentación. En apoyo de la noción de
represión mediada por fosfato, las células de cepas ALKO243 y
ALKO2268 no produjeron fitasa detectable cuando se añadió fosfato en
exceso al caldo de cultivo de fermentación. Para estudiar más a
fondo esta posibilidad, se compararon los niveles de enzima
producidos por transformantes de fitasa que tienen promotores
alternativos (es decir, GA, GAPDH o
\beta-tubulina) con los niveles alcanzados con los
promotores nativos de fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 en los
constructos de vectores de transformación para ver si el uso de
dicho promotor alternativo eliminaba la posible represión mediada
por fosfato. Es interesante que no se detectara producción de fitasa
en el promotor de fitasa o de fosfatasa ácida de pH 2,5 cuando se
cultivaron los transformantes en presencia de fosfato, apoyando la
noción de que no es posible superar la represión mediada por fosfato
a través del uso del promotor nativo integrado en un sitio
cromosómico diferente. En la evaluación de los promotores
alternativos, un transformante con un promotor de
\beta-tubulina fue capaz de producir fitasa en
presencia de fosfato, pero mostró un descenso en la producción de
fitasa en aproximadamente la mitad. En contraste, los transformantes
de promotor de GAPDH y promotor de GA no fueron sensibles a la
inhibición mediada por fosfato en cualquier grado, y produjeron
niveles similares de producción de fitasa en presencia o ausencia de
fosfato adicional. Así, los resultados sugieren que los elementos
reguladores en la región reguladora 5' de los genes de fitasa y
fosfatasa ácida de pH 2,5 pueden ser útiles para dirigir la
represión mediada por fosfato de expresión génica, y que la
inserción de promotores alternativos en las regiones 5' de estos
genes pueden superar estas restricciones reguladoras nativas y
aumentar los rendimientos de producción.
La identificación de los factores limitadores de
velocidad, relacionados con la energía o con las secreciones, puede
aumentar aún más los rendimientos de fitasa y fosfatasa ácida de pH
2,5. Otros factores como la optimización de medios, los niveles de
transcripción génica aumentados o estabilizados de fosfatasa ácida
de pH 2,5 o la selección de mutagénesis clásica de altos productores
podría tener impactos adicionales en el rendimiento del producto.
Una dosificación génica elevada y el uso de promotores alternativos
han aumentado drásticamente los rendimientos de producción con
respecto a los promotores nativos y han escapado a las restricciones
reguladoras negativas. La clonación y la reintroducción de los genes
para fitasa y fosfatasa ácida de pH 2,5 han tenido como resultado
niveles comercialmente significativos de estas enzimas para su uso
como suplementos de los piensos para animales. El diseño racional de
sobreexpresión homóloga puede aplicarse para aumentar los
rendimientos de otros productos industriales fúngicos, y dar
potencialmente una mejor comprensión de los mecanismos requeridos
para la expresión heteróloga.
Los materiales y procedimientos usados en este
ejemplo son los mismos que los usados en el Ejemplo 4, anterior.
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Sandberg, A.S. y col., Journal of
Nutrition 117:2061-2065, 1987.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Alko Group Ltd.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Salmisaarenranta 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Helsinki
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Finlandia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): FIN-00180
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: "Células recombinantes, constructos de ADN, vectores y procedimientos para la expresión de enzimas degradantes de fitatos en proporciones deseadas"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 47
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE SOLICITUD EN CURSO:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US93/07058
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido #420
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu
Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido #816C
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Ala
Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido #1110T
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Pro Gln Phe Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-1; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTGGCATT GTACTAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-1; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTGACACT GTACTAC
\hfill17
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: N es dIMP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-31; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTANCGCT CGCCGTG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: N es dIMP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-31; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATANCTTT CACCATG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: N es dIMP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-31; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTANCGCT CGCCGTG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc-feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: N es dIMP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-31; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTANCGCT CCCCGTG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-34; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTGCCGC AATTTAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-31; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCTACCAC AGTTCAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-34; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTTCCTC AATTTAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-34; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTCCCCC AATTTAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-35; lectura 5' a 3'
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATACCGC AATTTAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-35; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTTGCCAC AGTTCAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-35; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATTACCTC AATTTAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-35; lectura 5' a 3'
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATTACCCC AATTTAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.379 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Secuencia de Figura 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 467 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Proteína codificada por SEC. ID. nº:18
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.071 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Secuencia de Figura 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 479 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Proteína codificada por SEC. ID. nº:20
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido #1081/N-phy
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Thr
Xaa Asp Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de fitasa de A. ficuum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser
Gly Asp Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(25) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido #420/10 phy
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Tyr Val Glu Met Met Gln Asn Gln Ala Glu
Gln Thr Pro Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(26) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de fitasa de A. ficuum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Gln Glu Pro Leu
Val Arg Val Leu Val}
\sac{Asn Asp Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(27) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido #657
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(28) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de fosfatasa (Ullah, 1991)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Pro Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(29) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ser Tyr Gly Ala Ala Ile Pro Gln Ser Thr
Gln Glu Lys Gln Phe}
\sac{Ser Gln Glu Phe Arg Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(30) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Gly Xaa Arg Xaa Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(31) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Cebador UPPHOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCCGAG TCCGAGGTCA TGGGCGCG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(32) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Cebador DOWNPHOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCCCGG GACCTACCCC TCTGCAT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(33) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Cebador AP273
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACCCCTCT GCATCTAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(34) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo PHY-40
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAAGAAATT TCTAGAACAG CAGCGATTGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(35) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo #271
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGAGCACC TTCTCTAGAT TTTGTCAAAT GTACC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(36) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo #272
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCCTCACCG AACTTGCGGG CCG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(37) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de fitasa de A. niger
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr
Pro Thr Glu Ser Lys}
\sac{Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(38) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de AP pH 2,5 de A. niger
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ile Met Val Lys Arg His Gly Glu Arg Tyr
Pro Ser Pro Ser Ala}
\sac{Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(39) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de APPA de E. coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala
Pro Thr Lys Ala Thr}
\sac{Gln Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(40) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de levadura PHO-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val His Thr Leu Gln Arg His Gly Ser Arg Asn
Pro Thr Gly Gly Asn}
\sac{Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(41) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de levadura PHO-5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gln Met Val Gly Arg His Gly Glu Arg Tyr
Pro Thr Val Ser Leu}
\sac{Ala Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(42) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de levadura PHO-3
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gln Met Leu Ala Arg His Gly Glu Arg Tyr
Pro Thr Tyr Ser Lys}
\sac{Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(43) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de rata LAP
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Thr Leu Leu Tyr Arg His Gly Asp Arg Ser
Pro Val Lys Ala Tyr}
\sac{Pro Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(44) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de rata PAP
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Thr Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Gly
Pro Ile Glu Thr Phe}
\sac{Pro Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(45) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de ACP2 humana
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Thr Leu Leu Tyr Arg His Gly Asp Arg Ser
Pro Val Lys Thr Tyr}
\sac{Pro Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(46) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Péptido de ACPP humana
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Thr Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Ser
Pro Ile Asp Thr Phe}
\sac{Pro Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(47) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo 260
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGACACCT CAGCAATGTC GTTCCGATCT CTACTCGCCC TGAGCGGCCT
\hfill50
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCTGCACA GGGTTGGCAC TGGCAGTCCC CGCC
\hfill84
\vskip1.000000\baselineskip
(48) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.800000\baselineskip
- OTRA INFORMACIÓN: Oligo 261
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. nº 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGGCGGG GACTGCCAGT GCCAACCCTG TGCAGACGAG GCCGCTCAGG
\hfill50
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGAGTAGAG ATCGGAACGA CATTGCTGAG GTGT
\hfill84
Claims (17)
1. Una célula huésped transformada recombinante
caracterizada porque ha sido transformada por un primer ácido
nucleico capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas con la
secuencia de nucleótidos de SEC. ID. nº 18 y un segundo ácido
nucleico capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas con la
secuencia de nucleótidos SEC. ID. nº 20 y que es capaz de secretar
la actividad enzimática de fosfatasa ácida de pH 2,5 y la actividad
enzimática de fitasa en una proporción de 3:1 a 16:1.
2. La célula huésped de la reivindicación 1,
caracterizada porque es capaz de sintetizar y secretar una
fitasa recombinante y una o más fosfatasas recombinantes.
3. La célula huésped de la reivindicación 2,
caracterizada porque dicha fitasa sobreexpresada secretada
tiene una actividad enzimática por mililitro que es al menos
aproximadamente 2 veces mayor que una actividad enzimática de fitasa
secretada por ALKO243 (ATCC#38854) o dicha fosfatasa sobreexpresada
secretada tiene una actividad enzimática que es al menos
aproximadamente 10 veces mayor que una actividad enzimática de
fosfatasa secretada por ALKO243 (ATCC#38854).
4. La célula huésped de la reivindicación 1,
caracterizada porque es una célula de un hongo
filamentoso.
5. La célula huésped de la reivindicación 4,
caracterizada porque es una célula de Aspergillus.
6. La célula huésped de la reivindicación 1,
caracterizada porque la segunda secuencia de nucleótidos
codifica un polipéptido conservado que tiene una secuencia de
aminoácidos RHGXRXP, en la que R es arginina, H es histidina, G es
glicina, X es cualquier aminoácido y P es prolina.
7. La célula huésped de la reivindicación 1
caracterizada porque secreta un polipéptido de fosfatasa
ácida de pH 2,5 que tiene un peso molecular entre 52.000 daltons
aproximadamente y 53.000 daltons aproximadamente según el cálculo a
partir de la secuencia de aminoácidos predicha.
8. La célula huésped de la reivindicación 7,
caracterizada porque la fosfatasa ácida de pH 2,5 es una
enzima tetramérica bajo condiciones no desnaturalizantes con un
punto isoeléctrico de 4,0 aproximadamente a 4,25 aproximadamente, y
tiene un peso molecular de monómero bajo condiciones
desnaturalizantes de 66.000 daltons aproximadamente según se
determina por SDS-PAGE y de 46.000 daltons
aproximadamente a 49.000 daltons aproximadamente después de
eliminación sustancial de hidratos de carbono.
9. La célula huésped de la reivindicación 8,
caracterizada porque la fosfatasa ácida de pH 2,5 tiene una
Km aparente de 0,7 mM aproximadamente para Na-fitato
y 4 mM para paranitrofenilfosfato y un pH óptimo de pH 2,0
aproximadamente a pH 2,5 a 37ºC aproximadamente.
10. La célula huésped de la reivindicación 1,
caracterizada porque ha sido transformada por un constructo
de vector para expresar un ácido nucleico de fitasa en una célula,
que comprende un promotor, el ácido nucleico capaz de hibridar bajo
condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de SEC. ID. nº
18, y opcionalmente un marcador seleccionable.
11. La célula huésped de la reivindicación 1,
caracterizada porque ha sido transformada con un constructo
de vector para expresar ácido nucleico de fosfatasa ácida de pH 2,5
en una célula que comprende un promotor, el ácido nucleico capaz de
hibridar bajo condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos
de SEC. ID. nº 20 y opcionalmente un marcador seleccionable.
12. La célula huésped de la reivindicación 10 u
11, caracterizada porque los constructos de vectores tienen
un promotor seleccionado entre un promotor de
\beta-tubulina, de GA, de GAPHD, de fitasa nativa
y de fosfatasa ácida de pH 2,5 nativa.
13. La célula huésped de la reivindicación 1,
caracterizada porque ha sido transformada con un constructo
de vector para expresar ácidos nucleicos de fitasa y fosfatasa en
una célula, que comprende al menos un promotor, las secuencias de
nucleótidos SEC. ID. nº 18 y SEC. ID. nº 20 y opcionalmente uno o
más marcadores seleccionables.
14. La célula huésped de la reivindicación 10,
caracterizada porque el constructo del vector se selecciona a
partir del grupo de vectores según se muestra en las Figs. 10A, 10B,
10C, 10D, 12A, 12B, 12C y 12D, respectivamente.
15. La célula huésped de la reivindicación 11,
caracterizada porque el constructo de vector se selecciona
del grupo de vectores según se muestra en las Figs. 13A, 13B, 13C y
13D, respectivamente.
16. La célula huésped de la reivindicación 13,
caracterizada porque el constructo de vector se selecciona de
un grupo de vectores según se muestra en las Figs. 14A y 14B,
respectivamente.
\newpage
17. Uso de las células huéspedes de una de las
reivindicaciones 1 a 16 para producir una mezcla activa
enzimáticamente que comprende una o más enzimas de degradación de
fitato sobreexpresado en una proporción entre actividad enzimática
de fosfatasa ácida de pH 2,5 y fitasa comprendida entre 3:1 y
16:1.
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