DE69330218T2

DE69330218T2 - Alkohol-Acetyltransferase und deren Anwendung

Info

Publication number: DE69330218T2
Application number: DE69330218T
Authority: DE
Inventors: Takayuki Bogaki; Toshio Fujii; Akihiro Iwamatsu; Toshitaka Minetoki; Naoshi Nagasawa; Hiroyuki Yoshimoto
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1992-06-18
Filing date: 1993-06-18
Publication date: 2001-10-11
Anticipated expiration: 2013-06-19
Also published as: US5728412A; CA2098696A1; ES2157909T3; CA2098696C; EP0574941A3; US5658777A; JPH0662849A; JP3363197B2; ATE201231T1; US5686284A; EP0574941A2; EP0574941B1; US5521088A; DK0574941T3; AU672974B2; DE69330218D1; AU4131893A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG:

Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Alkoholacetyltransferase ("AATase"), die z. B. durch Saccharomyces cerevisiae erzeugt wird, eine DNA-Sequenz, die AATase codiert, d. h. die Fähigkeit zu deren biotechnologischer Herstellung besitzt, und eine Hefe mit einer verbesserten esterproduzierenden Fähigkeit aufgrund von Transformation mit der DNA-Sequenz. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines alkoholischen Getränks mit einem verstärkten Estergeschmack.

Stand der Technik:

Es ist wohlbekannt, dass Acetatester die Geschmacksqualität von alkoholischen Getränken wie Sake, Bier, Wein und Whisky beeinflussen. Diese Ester liegen allgemein im fermentierten Überstand vor, weil Hefe verschiedene Arten von Alkohol erzeugt, die weiter zu Estern während des Fermentationsverfahrens konvertiert werden.
Insbesondere ist Isoamylacetat ein Ester, der einen guten fruchtigen Geschmack für alkoholische Getränke liefert. Es wurde vorgeschlagen, dass das Verhältnis von Isoamylacetat zu Isoamylalkohol, der eine Vorstufe von Isoamylacetat ist, in enger Beziehung zum Auswertungswert der sensorischen Prüfung steht. Zum Beispiel wird Sake mit einem hohen Verhältnis von Isoamylacetat zu Isoamylalkohol im sensorischen Test als "Ginjo-shu" bewertet (Johshi Hokoku, Nr. 145, Seite 26 (1973)).
Wie zuvor von Yoshioka et al. berichtet, Agric. Biol. Chem., 45, 2188 (1981), ist AATase ein Enzym, das eine primäre Rolle in der Erzeugung von Isoamylacetat spielt. Die AATase synthetisiert Isoamylacetat durch Kondensation von Isoamylalkohol und Acetyl-CoA. Ausserdem ist von AATase bekannt, dass sie eine weite Substratspezifität besitzt und viele Acetatester wie Ethylacetat mit dem gleichen Mechanismus wie oben beschrieben erzeugt.
Um daher die Ester wie Isoamylacetat in alkoholischen Getränken anzureichern, ist es wirksam, die AATase- Aktivität einer Hefe zu steigern. Einige der herkömmlichen Erwägungen in der Herstellung alkoholischer Getränke, z. B. die Auswahl von Rohstoffen oder die Regulierung der Fermentationsbedingungen, haben als Ergebnis die Aktivität der AATase gesteigert.
Obwohl es wohlbekannt ist, dass AATase ein wichtiges Enzym für die Herstellung von Estern ist, gibt es jedoch wenige Berichte, die auf AATase Bezug nehmen. Partielle Reinigungen des Enzyms wurden in manchen Berichten beschrieben (z. B. Nippon Nogei Kagakukaishi, 63, 435 (1989); Agric. Biol. Chem., 54, 1485 (1990); Nippon Jozo Kyokaishi, 87, 334 (1992)), aber weil AATase eine sehr labile Aktivität besitzt, wurde von der vollständigen Reinigung von AATase und der Klonierung des Gens, das AATase codiert, soweit noch nicht berichtet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Struktur von AATase aufzuklären und das AATase-Gen zu isolieren, um dadurch eine transformierte Hefe mit einer gesteigerten Fähigkeit zur AATase-Produktion zu erhalten und ein alkoholisches Getränk mit einem gesteigerten Estergeschmack zu erzeugen.
Gemäss der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung eine AATase bereit, die aus Hefe mit der Fähigkeit zur Übertragung der Acetylgruppe von Acetyl-CoA auf einen Alkohol stammt, um einen Acetatester zu erzeugen, und die ein Molekulargewicht von etwa 60.000 gemäss SDS-PAGE besitzt.
Gemäss der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung eine homogen gereinigte AATase bereit, die ein Polypeptid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden Vertretern besteht:
(1a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz;
(1b) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B in der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz; und
(1c) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis C oder B bis C der in Fig. 17 gezeigten Aminosäuresequenz.
Gemäss der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung das AATasecodierende Gen mit einer DNA-Sequenz bereit, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden Vertretern besteht:
(2a) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;
(2b) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz codiert; und
(2c) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis C oder B bis C der in Fig. 17 gezeigten Aminosäuresequenz codiert.
Gemäss der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung eine DNA- Sequenz bereit, die ein AATase-Gen umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden Vertretern besteht:
(3a) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenz umfasst;
(3b) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis B der in Fig. 2 gezeigten DNA-Sequenz umfasst;
(3c) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis C oder B bis C der in Fig. 17 gezeigten DNA-Sequenz umfasst;
(3d) einer DNA-Sequenz, die auf der Basis der Degeneration des genetischen Codes ein in Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 17 gezeigtes Polypeptid codiert, oder einer DNA- Sequenz, die ein in Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 17 gezeigtes Polypeptid codiert, modifiziert durch Addition, Insertion, Elimination, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren und mit AATase-Aktivität; und
(3e) einer DNA-Sequenz, die zur Hybridisierung mit jeder der DNA-Sequenzen aus (3a) bis (3d) in einer Lösung, die 0,2 · SSC (0,03 M Natriumchlorid, 3 mM Natriumcitrat) umfasst, bei 50ºC fähig ist.
Gemäss der fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung eine transformierte Hefe mit einer gesteigerten Fähigkeit zur AATase-Produktion aufgrund der Transformation bereit, die das aus (2a) bis (2c) ausgewählte AATase-Gen oder die aus (3a) bis (3d) ausgewählte DNA-Sequenz verwendet.
Gemäss der sechsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines alkoholischen Getränks mit einem angereicherten Estergeschmack unter Verwendung einer wie oben beschriebenen transformierten Hefe bereit.
Gemäss der siebten AUSFÜHRUNGSFORM der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung einer DNA-Sequenz bereit, die AATase codiert, umfassend die Schritte aus:
(a) Herstellen eines DNA-Fragments mit einer Länge von wenigstens 20 Basen einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;
(b) Herstellen einer Genbibliothek, die aus DNA- Strängen mit einer Länge im Bereich von 5 · 10³ bis 30 · 10³ Basen hergestellt wurde, die durch Schneiden des Chromosoms einer Hefe erhalten wurden;
(c) Klonieren eines DNA-Fragments durch Hybridisierung aus der Genbibliothek aus (b) unter Verwendung des DNA-Fragments aus (a) als Sonde, worin die Hybridisierung in einer Lösung bei 30ºC über Nacht stattfindet, die 6 · SSPE und 0,5% SDS umfasst.
Die Begriffe "DNA-Fragment", "DNA-Sequenz" und "Gen" sollen hier im wesentlichen synonym sein.
Da das AATase-Gen erhalten wurde, kann eine Hefe unter Verwendung dieses Gens als Fremdgen durch ein gentechnisches Verfahren transformiert werden. Das heisst, das Gen kann in eine Hefezelle als extranukleäres und/oder intranukleäres Gen transfiziert werden, um die Hefe mit einer höheren Fähigkeit zur AATase-Produktion äls die der Wirtszelle zu versehen, und unter Verwendung dieser Transformanten kann ein alkoholisches Getränkt mit dem angereicherten Estergeschmack hergestellt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:

Fig. 1(a) und (b) zeigen eine Aminosäuresequenz der AATase und DNA-Sequenz des erfindungsgemässen AATasecodierenden Gens;
Fig. 2(a) und (b) zeigen eine Aminosäuresequenz der AATase und DNA-Sequenz eines anderen erfindungsgemässen AATase-codierenden Gens;
Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte des aus einer Sakehefe stammenden AATase-codierenden Gens gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 4 zeigt zwei Restriktionskarten der aus einer Brauerei-Lagerbierhefe stammenden AATase gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 5 zeigt eine Restriktionskarte der aus einer Weinhefe stammenden AATase gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 6 zeigt das Verfahren zur Herstellung der Sonde, die zum Erhalt des AATase-Gens aus der Weinhefe verwendet wird;
Fig. 7 zeigt das Elutionsprofil einer aktiven AATase- Fraktion durch das Affinitätschromatografieverfahren aus den Reinigungsverfahren gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 8 zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese der durch Affinitätschromatografie eluierten aktiven AATase-Fraktion gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 9 zeigt die Substratspezifität der erfindungsgemässen AATase für eine Anzahl von Alkoholen;
Fig. 10 zeigt eine Restriktionskarte des Expressionsvektors YEp13K für Hefe;
Fig. 11 zeigt eine Restriktionskarte des Expressionsvektors YATK11 mit dem aus einer Sakehefe stammenden AATase-Gen gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 12 zeigt eine Restriktionskarte des Expressionsvektors YATL1 mit dem aus einer Brauerei-Lagerbierhefe stammenden AATase-1-Gen gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 13 zeigt eine Restriktionskarte des Expressionsvektors YATL2 mit dem aus einer Brauerei-Lagerbierhefe stammenden AATase-2-Gen gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 14 zeigt eine Restriktionskarte des Sakehefe- Expressionsvektors YATK11G mit dem aus einer Sakehefe stammenden AATase-Gen gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 15 zeigt eine Restriktionskarte des Brauerei- Lagerbierhefe-Vektors YATLIG mit dem aus einer Brauerei-Lagerbierhefe stammenden AATase-1-Gens gemäss der vorliegenden Erfindung;
Fig. 16 zeigt einen Teil der Brauerei-Lagerbierhefe- Expressionsvektorkonstruktion; und
Fig. 17(a) und (b) zeigen die Aminosäure- und DNA-Sequenz des Brauerei-Lagerbierhefe-AATase-2-Gens gemäss der vorliegenden Erfindung.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

AATase:

AATase, Alkoholacetyltransferase, ist ein Enzym mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines Acetatesters durch Übertragung der Acetylgruppe aus Acetyl-CoA auf Alkohole.
Die Alkohole meinen hier primär Alkohole mit linearen oder verzweigten Ketten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Gemäss unseren Untersuchungen wurde jedoch gefunden, dass die AATase Alkohole mit einer höheren Anzahl von Kohlenstoffatomen verwenden kann, wie 2-Phenylethylalkohol.
Daher sollten "die Alkohole" so aufgefasst werden, dass sie einen weiten Bereich von Alkoholen einschliessen, falls es in der vorliegenden Erfindung erforderlich ist, den Substratalkohol der AATase zu erörtern.
Die erfindungsgemässe AATase stammt aus Hefe. Die AATase wird spezifisch aus Saccharomyces cerevisiae erhalten und ist ein Polypeptid mit einem der oben definierten Polypeptide (1a) bis (1c). Spezifisch schliesst das Polypeptid ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ein; ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz; ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis C der in Fig. 17 gezeigten Aminosäuresequenz; und ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von B bis C der in Fig. 17 gezeigten Aminosäuresequenz. Ausserdem wurde durch Gentechnik oder Proteintechnik geklärt, dass die physiologische Aktivität eines Polypeptids bei Addition, Insertion, Elimination, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren des Polypeptids aufrechterhalten werden kann. Das Polypeptid schliesst daher ein modifiziertes Polypeptid aus einem der obigen Polypeptide aufgrund von Addition, Insertion, Elimination, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren des Polypeptids ein, solange das modifizierte Polypeptid eine AATase-Aktivität besitzt.
Die hier verwendete Saccharomyces cerevisiae ist ein in "The yeast, a taxonomic study", 3. Auflage (herausgegeben von N. J. W. Kreger-von Rij, Elsevier Publishers B. V., Amsterdam (1984), Seite 379) beschriebener Mikroorganismus oder ein Synonym oder Mutant davon.
AATase und ihr Reinigungsverfahren wurden in einigen Veröffentlichungen mitgeteilt, z. B. Nippon Nogeikagaku Kaishi, 63, 435 (1989); Agric. Biol. Chem., 54, 1485 (1990); Nippon Joso Kyokaishi, 87, 334 (1992). Soweit es den Autoren der vorliegenden Erfindung bekannt ist, wurde die AATase jedoch nicht bis zur Homogenität gereinigt, so dass ihre Aminosäuresequenz nicht bestimmt wurde.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben nun gefunden, dass eine Affinitätssäule mit 1-Hexanol als Ligand erfolgreich zur Reinigung der AATase verwendet werden kann. Wir haben daher die AATase aus Saccharomyces cerevisiae durch Verwendung dieser Affinitätssäule vollständig gereinigt und einige Eigenschaften des Enzyms definiert. Die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz wird durch Analyse der aus Saccharomyces cerevisiae stammenden AATase erhalten, die somit bis zur Homogenität gereinigt wurde.
Die typische Eigenschaft der AATase, die erfindungsgemäss definiert wurde, schliesst das Molekulargewicht der AATase ein. Obwohl das zuvor angegebene Molekulargewicht der AATase im Bereich von 45.000 bis 56.000 ist, beträgt das Molekulargewicht der erfindungsgemäss gereinigten AATase etwa 60.000 gemäss SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE), was vermuten lässt, dass sie verschieden vom zuvor angegebenen Protein ist. Das aus der DNA-Sequenz abgeleitete Molekulargewicht der AATase betrug ca. 61.000.
Die erfindungsgemässe AATase hat enzymologische und physikochemische Eigenschaften wie nachfolgend aufgeführt.
(a) Wirkung:
Dieses Enzym wirkt auf eine Anzahl von Alkoholen wie Ethylalkohol und Acetyl-CoA, so dass ein Acetatester erzeugt wird.
(b) Substratspezifität:
Dieses Enzym wirkt auf verschiedene Arten von Alkoholen mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, besonders effizient auf Alkohole mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Zusätzlich wirkt das Enzym effizienter auf geradkettige Alkohole als auf verzweigtkettige Alkohole.
(c) Molekulargewicht: etwa 60.000
(d) Optimaler und stabiler pH:
Optimaler pH: 8,0
Stabiler pH: 7,5 bis 8,5
(e) Optimale und stabile Temperatur:
Optimale Temperatur: 45ºC
Stabile Temperatur: 4ºC
(f) Inhibitoren:
Dieses Enzym wird intensiv durch Parachlorquecksilberbenzoat (PCMB) und Dithiobisbenzoesäure (DTNB) gehemmt.
(g) Wirkungen von verschiedenen Fettsäuren auf die Aktivität:
Dieses Enzym wird nicht merklich durch eine gesättigte Fettsäure gehemmt, aber intensiv durch eine ungesättigte Fettsäure gehemmt.
(h) Km-Wert gegenüber Isoamylalkohol und Acetyl-CoA: Isoamylalkohol: 29,8 mM
Acetyl-CoA: 190 uM.
Die AATase kann durch ein Verfahren erhalten werden, das die Kultivierung von Hefezellen von Saccharomyces cerevisiae KYOKAI Nr. 7 und die Gewinnung und Reinigung des Rohenzyms aus dem Gehalt des Organismus wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben umfasst.

DNA-Sequenz oder DNA-Fragment/Gen, die/das AATase erzeugt:

In der vorliegenden Erfindung bedeutet die DNA-Sequenz oder das DNA-Fragment mit einer Fähigkeit zur Erzeugung von AATase die DNA-Sequenz oder das DNA-Fragment, die/das für ein Polypeptid mit AATase-Aktivitäten codiert. Die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch die Sequenz oder das Fragment codiert wird, d. h. die AATase, wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus den folgenden Vertretern (2a) bis (2c) besteht, und wird spezifisch aus der Gruppe ausgewählt, die aus den folgenden Vertretern (3a) bis (3e) besteht:
(2a) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;
(2b) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;
(2c) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis C oder B bis C der in Fig. 17 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;
(3a) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenz umfasst;
(3b) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis B der in Fig. 2 gezeigten DNA-Sequenz umfasst;
(3c) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis C oder B bis C der in Fig. 17 gezeigten DNA-Sequenz umfasst;
(3d) einer DNA-Sequenz, die auf der Basis der Degeneration des genetischen Codes ein in Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 17 gezeigtes Polypeptid codiert, oder einer DNA- Sequenz, die ein in Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 17 gezeigtes Polypeptid codiert, modifiziert durch Addition, Insertion, Elimination, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren und mit AATase-Aktivität; und
(3e) einer DNA-Sequenz, die zur Hybridisierung mit einer der DNA-Sequenzen aus (3a) bis (3d) in einer Lösung, die 0,2 · SSC (0,03 M NaCl, 3 mM Natriumcitrat) umfasst, bei 50ºC fähig ist.
Die DNA-Sequenz variiert in Abhängigkeit von der Variation des Polypeptids. Zusätzlich ist es den Fachleuten wohlbekannt, dass eine DNA-Sequenz leicht gemäss dem Wissen, das sich auf die sogenannte "Degeneration" bezieht, definiert wird, sobald eine Aminosäuresequenz angegeben ist.
Daher kann der Fachmann verstehen, das bestimmte, in der in den Fig. 1, 2 und 17 gezeigten Sequenz vorliegende Codonen durch andere Codonen substituiert werden können und das gleiche Polypeptid erzeugen. Dies bedeutet, dass die erfindungsgemässe DNA-Sequenz (oder das DNA-Fragment) DNA-Sequenzen einschliesst, die das gleiche Peptid codieren, aber unterschiedliche DNA-Sequenzen sind, in denen Codonen in der Degenerationsbeziehung verwendet werden. Ausserdem kann der Fachmann verstehen, dass die erfindungsgemässe DNA-Sequenz die DNA-Sequenz einschliesst, die ein modifiziertes Polypeptid aus einem der Polypeptide (1a) bis (1c) aufgrund von Addition, Insertion, Elimination, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren dieser Polypeptide codiert. In diesem Zusammenhang ist der Begriff "Codieren" synonym mit dem Begriff "fähig zum Codieren".
Die erfindungsgemässe DNA-Sequenz kann aus einer natürlichen Genquelle oder durch Gesamtsynthese oder Halbsynthese erhalten werden (d. h. synthetisiert unter Verwendung eines Teils einer aus einer natürlichen Genquelle stammenden DNA-Sequenz).
Aus der natürlichen Genquelle kann die erfindungsgemässe DNA-Sequenz durch Durchführung von DNA-Manipulationen wie Plaque-Hybridisierung, Kolonie-Hybridisierung und das PCR- Verfahren unter Verwendung eine Sonde, die ein Teil einer DNA-Sequenz ist, die die AATase der vorliegenden Erfindung erzeugt, erhalten werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt und können einfach durchgeführt werden.
Geeignete Genquellen zum Erhalt einer DNA-Sequenz mit Fähigkeit zur AATase-Erzeugung durch diese Verfahren schliessen z. B. Bakterien, Hefe und Pflanzen ein. Unter diesen Genquellen ist Hefe, die derzeit zur Herstellung von Fermentationsnahrungsmitteln wie Sake und Sojasauce verwendet wird, der beste Kandidat mit einer DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung.
Die typische Form der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, das eine Länge besitzt, die gerade der Länge der AATase entspricht. Zusätzlich kann die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung zusätzliche DNA-Sequenzen aufweisen, die stromaufwärts und/oder stromabwärts der Sequenz gebunden sind. Ein spezifisches Beispiel für letzteres ist ein Vektor wie ein Plasmid, der die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung trägt.
Ein geeignetes Beispiel der erfindungsgemässen DNA-Sequenz ist von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Diese Sequenz wird durch Analyse eines AATase-codierenden Gens erhalten, das aus einem Hefestamm, SAKE YEAST KYOKAI Nr. 7, erhalten wird.

Transformation:

Das Verfahren oder die Methode zum Erhalt einer Transformanten wird üblicherweise auf dem Gebiet der Gentechnik verwendet. Zusätzlich zum nachfolgend beschriebenen Verfahren ist jedes herkömmliche Transformationsverfahren (z. B. Analytical Biochemistry, 163, 391 (1987)) nützlich zum Erhalt der Transformanten.
Vektoren, die verwendet werden können, schliessen alle bekannten Vektoren für Hefe ein, wie YRp-Vektoren (Mehrfachkopie-Vektoren für Hefe, die die ARS-Sequenz des Hefechromosoms als Replikationsursprung enthalten), YEp- Vektoren (Mehrfachkopie-Vektoren für Hefe, die den Replikationsursprung der 2 um-DNA von Hefe enthalten), YCp-Vektoren (Einzelkopie-Vektoren für Hefe, die die DNA- Sequenz der ARS-Sequenz des Genchromosoms und die DNA- Sequenz des Centromers des Hefechromosoms enthalten), YIp- Vektoren (integrierende Vektoren für Hefe ohne Replikationsursprung der Hefe). Diese Vektoren sind wohlbekannt und werden in "Genetic Engineering for the Production of Materials", Nippon Nogei Kagakukai ABC Series, Asakura Shoten, Seite 68, beschrieben, aber können ebenfalls leicht hergestellt werden.
Um das Gen der DNA-Sequenz gemäss der vorliegenden Erfindung zu exprimieren oder die Expression zu erhöhen oder zu verringern, ist es zusätzlich bevorzugt, dass der Expressionsvektor einen Promotor, der eine Einheit zur Regulierung von Transkription und Translation ist, in der Region 5'-stromaufwärts und einen Termintor in der Region 3'-stromabwärts der DNA-Sequenz enthält. Geeignete Promotoren und Terminatoren sind z. B. jene, die aus dem AATase-Gen selbst stammen, jene, die aus beliebigen bekannten Genen stammen, wie dem Alkoholdehydrogenasegen (J. Biol. Chem., 257, 3018 (1982)), dem Phosphoglyceratkinasegen (Nucleic Acids Res., 10, 7791 (1982)) oder dem Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase- Gen (J. Biol. Chem., 254, 9839 (1979)), oder jene, die künstliche Modifikationen des ersteren sind.
Die in der vorliegenden Erfindung zu transformierende Hefe, d. h. die Wirtshefe, kann jeder Hefestamm sein, der taxonomisch zur Kategorie der Hefe gehört, aber für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Hefestamm zur Erzeugung alkoholischer Getränke, der zu Saccharomyces cerevisiae gehört, wie Brauereihefe, Sakehefe und Weinhefe, bevorzugt. Geeignete Beispiele für Hefen schliessen Brauereihefe ein wie ATCC 26292, ATCC 2704, ATCC 32634 und AJL 2155; Sakehefe wie ATCC 4134, ATCC 26421 und IFO 2347; und Weinhefe wie ATCC 38637, ATCC 38638 und IFO 2260.
Eine andere, als Wirtshefe bevorzugte Gruppe ist Bäckerhefe, wie ATCC 32120.

Herstellung alkoholischer Getränke:

Die transformierter Hefe mit einer gesteigerten Fähigkeit zur AATase-Produktion wird mit einem Merkmal versehen, das der Wirtshefe sowie dem eingeführten Merkmal intrinsisch ist. Die Transformante kann somit für verschiedene Anwendungen verwendet werden, die auf das intrinsische Merkmal gerichtet sind.
Falls die Wirtshefe eine Hefe zur Herstellung alkoholischer Getränke ist, besitzt die transformierte Hefe ebenfalls eine Fähigkeit zur Fermentierung von Sacchariden zu Alkoholen. Daher liefert die transformierte erfindungsgemässe Hefe alkoholische Getränke mit einem gesteigerten oder angereicherten Estergeschmack.
Typische alkoholische Getränke schliessen Sake, Wein, Whisky und Bier ein. Zusätzlich sind die Verfahren zur Herstellung dieser alkoholischen Getränke wohlbekannt.

Herstellung anderer AATasen:

Wie oben beschrieben, liefert die vorliegende Erfindung das AATase-Gen, das die Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz codiert. Gemäss einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die vorliegende Erfindung andere AATase-Gene bereit. Es wurde jetzt gefunden, dass eine andere Art von AATaseproduzierendem Gen aus einer Hefe-Genbibliothek durch Verwendung einer Sonde erhalten wird, die ein relativ kurzes DNA-Fragment einer DNA-Sequenz ist, die die Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz codiert. Es ist in diesem Fall interessant, dass die aus der DNA-Sequenz, die aus einer "Sake"-Hefe erhalten wurde, stammende Sonde zwei unterschiedliche DNA-Sequenzen mit einer Fähigkeit zur AATase-Produktion aus der Genbibliothek einer Brauerei- Lagerbierhefe lieferte Während diese beiden DNA-Sequenzen fähig zur Produktion von AATase sind, unterscheiden sich zusätzlich die Restriktionskarten, DNA-Sequenzen und die Aminosäuresequenzen der DNA-Sequenzen von jenen der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz, die aus einer Sakehefe stammt.
Im Verfahren zur Isolierung dieser DNA-Sequenzen wird zuerst ein DNA-Fragment als Sonde bereitgestellt. Die Sonde besitzt bevorzugt eine Länge von wenigstens 20 Basen der DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäure von A bis B der im wesentlichen in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz codiert.
Die Länge des DNA-Strangs als Sonde ist bevorzugt wenigstens 20 Basen, da eine ausreichende Hybridisierung mit einer übermässig kurzen Sonde nicht stattfinden wird.
Der DNA-Strang hat bevorzugt eine Länge von 100 Basen oder mehr.
Die Genbibliothek, auf die die Sonde angewendet wird, umfasst bevorzugt Vektoren, die DNA-Fragmente mit im wesentlichen gleicher Länge im Bereich von 5 · 10³ Basen bis 30 · 10³ Basen enthalten, erhalten durch Schneiden eines Hefechromosoms durch chemische oder physikalische Mittel, wie ein Restriktionsenzym oder mit Ultraschall.
Das Restriktionsenzym, das in diesem Verfahren verwendet werden soll, dessen Arten und/oder die Reaktionsbedingungen sollten so eingestellt werden, dass für ein bestimmtes Hefechromosom die DNA-Stränge mit einer Länge innerhalb des obigen Bereichs erhalten werden. Für den Fall der Herstellung einer Genbibliothek aus chromosomaler Brauereihefe-DNA schliessen geeignete Restriktionsenzyme z. B. Sau3AI oder MboI ein.
Es ist wünschenswert, dass das durch Schneiden erhaltene DNA-Fragment im wesentlichen die gleiche Länge im Bereich von 5 · 10³ bis 30 · 10³ Basen hat, mit anderen Worten hat das DNA-Fragment im mit Restriktionsenzym verdauten Produkt eine einheitliche Länge innerhalb des Bereichs von 5 · 10³ bis 30 · 10³ Basen.
Die Klonierung der komplementären DNA-Stränge aus der Genbibliothek unter Verwendung von Sonden und die Subklonierung dieser klonierten DNA-Fragmente, z. B. in die Hefe, wird leicht gemäss der wohlbekannten Gentechnikmethode durchgeführt (z. B. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
Die in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz ist ein Polypeptid, das durch eine der zwei DNA-Sequenzen codiert wird, die aus der Brauerei-Lagerbierhefe-Genbibliothek unter Verwendung einer Sonde erhalten werden, die eine der in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenz von 234 bis 1451 entsprechende Sequenz hat. Es ist aus dem Vergleich der Abbildungen ersichtlich, dass sich die aus Brauerei- Lagerbierhefe und Sakehefe stammenden AATasen voneinander allein in 12 Basenpaaren und 3 Aminosäuren unterscheiden. Das Polypeptid mit einer in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz von A bis B, das mit dem oben beschriebenen Hybridisierungs/Klonierungs-Verfahren erhalten wurde, kann ebenfalls als ein äquivalentes Polypeptid der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz von A bis B angesehen werden, d. h. als ein modifiziertes Polypeptid, in dem einige der Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert wurden.
In ähnlicher Weise sind die in Fig. 17 gezeigten Aminosäuresequenzen (von A bis C oder von B bis C) Polypeptide, die durch die andere DNA-Sequenz codiert werden, die aus der Genbibliothek der Brauerei- Lagerbierhefe durch Verwendung der gleichen Sonde erhalten wird. Es ist aus dem Vergleich der Abbildungen ersichtlich, dass sich diese aus Brauerei-Lagerbierhefe stammende AATase von der aus Sakehefe stammenden AATase in 332 Basenpaaren und 102 Aminosäuren unterscheidet.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung angeboten und sind nicht zur Beschränkung der Erfindung in irgendeiner Weise beabsichtigt. In den Beispielen sind alle Prozentabgaben gewichtsbezogen, sofern nicht anders angegeben.

(1) Herstellung von AATase:

Das erfindungsgemässe Enzym kann aus der Kultur eines Mikroorganismus erhalten werden, der ein Mitglied von Saccharomyces ist und ein Enzym mit den zuvor genannten Eigenschaften produziert. Das bevorzugte Herstellungsverfahren ist wie folgt:

(1) - (i) Assay der AATase-Aktivität:

1 ml einer Lösung, die einen Puffer für die AATase- Reaktion (25 mM Imidazol-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 1 mM Acetyl-CoA, 0,1% Triton X-100, 0,5% Isoamylalkohol, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 M Natriumchlorid, 20% Glycerin; oder 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,5), 1 mM Acetyl-CoA, 0,1% Triton X-100, 0,5% Isoamylalkohol, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 M Natriumchlorid, 20% Glycerin) und das Enzym der vorliegenden Erfindung enthielt, wurde in einer 20 ml- Ampulle versiegelt und für 1 Stunde bei 25ºC umgesetzt. Nach Inkubation wurde die Ampulle geöffnet, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,6 g Natriumchlorid beendet. n-Butan wurde als innerer Standard zur Reaktionsmischung auf 50 ppm hinzugegeben. Die Ampulle wurde mit einem Teflonstopfen verschlossen. Dann wurde das erzeugte Isoamylacetat durch Headspace-Analyse (Shimadzu GC-9A, HSS-2A) unter den folgenden Bedingungen bestimmt:
Säule: Glassäule 2,1 m · 3 mm
Stationäre Phase: 10% Polyethylenglykol 1540 Diasolid L (60/80 mesh)
Säulentemperatur: 75ºC
Injektionstemperatur: 150ºC
Trägergas: Stickstoff
Fliessgeschwindigkeit: 50 ml/min
Probenvolumen: 0,8 ml

(1) - (ii) Herstellung des Rohenzyzus:

Hefezellen von KYOKAI Nr. 7 wurden in 500 ml einer YPD- Kultur (1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 2% Glucose) übergeimpft und bei 15ºC für 3 Tage kultiviert. 25 ml der Kulturlösung wurden in 100 ml eines YPD-Kulturmediums in 20 Stück Erlenmeyer-Kolben mit einem Volumen von 200 ml übergeimpft und bei 30ºC für 12 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation (3.000 U/min. 10 min) gesammelt und in Puffer (50 mM Tris-Hydrochlorid- Puffer (pH 7,5), 0,1 M Natriumsulfit, 0,8 M Kaliumchlorid) mit dem 10-fachen Volumen desjenigen der Zellen suspendiert. Danach wurde "ZYMOLYASE 100T" (handelsübliches Hefezell-Spaltenzym von Seikagaku Kogyo K. K., JP-PS 702095, US-PS 3 917 510) in einer Menge von 1 : 1.000 zum Gewicht der Zellen hinzugegeben. Die Mischung wurde unter Schütteln bei 30ºC für 1 Stunde inkubiert. Dann wurde der resultierende Protoplast durch Zentrifugation bei 3.000 U/min für 5 Minuten aufgefangen, in 400 ml eines Puffers zum Aufreissen der Zellen suspendiert (25 mM Imidazol-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 0,6 M Kaliumchlorid, 1 mM Natriumethylendiamintetraacetat (EDTA)) und mit einem Mikroben-Zellzerstörungsapparat "POLYTRON PT10" (Kinematica Co.) auseinandergerissen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 45.000 U/min unter Erhalt einer Rohenzymlösung entfernt.

(1) - (iii) Herstellung der Mikrosomfraktion:

Danach wurde die in (1)-(ii) erhaltene Rohenzymlösung mit 100.000 · g für 2 Stunden zentrifugiert, und der resultierende Niederschlag ("mikrosomale Fraktion") wurde in 40 ml eines Puffers (25 mM Imidazol-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 1 mM Dithiothreitol) suspendiert. Wenn die Suspension nicht unverzüglich verwendet wurde, wurde sie bei -20ºC gelagert.

(1) - (iv) Herstellung des solubilisierten Enzyms:

Nachdem die in (1)-(iii) erhaltene mikrosomale Fraktion in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben worden war, wurde Triton X-100 in einer Menge von 1 : 100 des Volumens hinzugegeben. Die Mischung wurde vorsichtig mit einem Magnetrührer bei 4ºC für 60 Minuten gerührt, so dass die Mischung nicht schäumte. Die Mischung wurde dann mit 100.000 · g für 2 Stunden zentrifugiert. Der Überstand wurde dann über Nacht gegen den Puffer A (25 mM Imidazol- Hydrochlorid-Puffer (pH 7,2), 0,1% Triton X-100, 0,5% Isoamylalkohol, 1 mM Dithiothreitol, 20% Glycerin) dialysiert.

(1) - (v) Reinigung des Enzyms:

Durch 20-fache Wiederholung der Vorgänge (1)-(ii) und (1)-(iii) wurde eine mikrosomale Fraktion erhalten und bei -20ºC erhalten. Dann wurde die solubilisierte Enzymfraktion zur weiteren Reinigung erhalten, indem die mikrosomale Fraktion dem Vorgang (1)-(iv) unterworfen wurde. Die solubilisierte Enzymfraktion wurde zuerst auf eine POLYBUFFER EXCHANGER 94-Säule (Pharmacia) aufgetragen (Adsorption: Puffer A; Elution: Puffer A + ein Gradient von 0,0 auf 0,6 M Natriumchlorid).
Die aktive Fraktion wurde aufgefangen und wiederholt auf die POLYBUFFER EXCHANGER 94-Säule aufgetragen.
Die aktive Fraktion wurde weiter in der in Tabelle 1 gezeigten Weise gereinigt. Das heisst, die aktive Fraktion wurde gereinigt durch
(1) Ionenaustauscher-Säulenchromatografie mit DEAE Toyopearl 55 (Tosoh, Adsorption: Puffer A; Elution: Puffer A + ein Gradient von 0,0 auf 0,2 M Natriumchlorid);
(2) Gelfiltrationschromatografie mit Toyopearl HW60 (Tosoh) unter Verwendung von Puffer B (10 mM Phosphatpuffer (pH 7,5), 0,1% Triton X-100, 0,5% Isoamylalkohol, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 M Natriumchlorid, 20% Glycerin);
(3) Hydroxyapatit-Säulenchromatografie (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Adsorption: Puffer B; Elution: Puffer B + ein Gradient von 10 auf 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)); oder
(4) Octylsepharose-Säulenchromatografie (Pharmacia; Adsorption: 50 mM Imidazol-Hydrochlorid (pH 7,5), 0,5% Isoamylalkohol, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 M Natriumchlorid, 20% Glycerin; Elution: 50 mM Imidazol-Hydrochlorid (pH 7,5), 0,1% Triton X-100, 100,5% Isoamylalkohol, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 M Natriumchlorid, 20% Glycerin).
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde die AATase etwa 2.000-fach gereinigt, bezogen auf die spezifische Aktivität. Jedoch wurde noch immer eine geringe Menge anderer Proteine im SDS-PAGE mit Silberanfärbung beobachtet, was somit eine unzureichende Reinigung anzeigte.
Daher haben die Autoren der vorliegenden Erfindung eine Affinitätschromatografie auf Basis der spezifischen Aktivität zwischen 1-Hexanol und AATase durchgeführt. Die Hexanol-Sepharose 4B-Säule wurde mit 6-Amino-1-hexanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) als Träger gemäss der Vorschrift von Pharmacia vorbereitet. Die Affinitätschromatografie wurde mit der Säule durchgeführt (Adsorption: 5 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 0,1% Triton X-100, 20% Glycerin, 1 mM Dithiothreitol; Elution: Natriumchlorid mit einem Gradienten von 0,0 auf 0,2 M). Die so erhaltene, wie in Fig. 9 gezeigte aktive Fraktion wurde einem SDS-PAGE unterworfen und mit Silber angefärbt. Die AATase wurde erfolgreich bis zur Homogenität gereinigt, da die aktive Fraktion ein Enzym war, das eine einzelne Bande wie in Fig. 8 gezeigt lieferte. TABELLE 1 Reinigung der AATase

(2) Eigenschaften der AATase:

(2) - (i) Substratspezifität:

Gemäss Untersuchungen zur Substratspezifität Von AATase gegenüber unterschiedlichen Arten von Alkoholen durch Verwendung der zuvor genannten Analysegeräte und -verfahren wirkt AATase auf eine Vielzahl von Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. AATase wirkt besonders effizient auf Alkohole mit einer höheren Anzahl von Kohlenstoffatomen. Zusätzlich wirkt AATase effizienter auf geradkettige Alkohole als auf verzweigtkettige Alkohole (Fig. 9).

(2) - (i) Optimaler pH und pH-Stabilität:

Um die Wirkung des pH auf die Stabilität des Enzyms zu untersuchen wurde das Enzym bei einem jeweiligen pH von 5 bis 9 (pH 5 bis 6 : 50 mM Citrat-Phosphat-Puffer; pH 6 bis 8 : 50 mM Phosphatpuffer; pH 8 bis 9 : 50 mM Tris-Phosphat- Puffer) unter der Bedingung von 4ºC für 22 Stunden gehalten. Die Enzymaktivität wurde bei pH 7,5 mit 0,2 M Dinatriumphosphat gemäss dem Verfahren (1) - (i) untersucht.
Um die Wirkung des pH auf die Aktivität des Enzyms auszuwerten wurden die Enzymaktivitäten bei dem jeweiligen pH von 5 bis 9 (pH 5 bis 6 : 50 mM Citrat-Phosphat-Puffer; pH 6 bis 8 : 50 mM Phosphatpuffer; pH 8 bis 9 : 50 mM Tris- Phosphat-Puffer) gemäss dem Verfahren (1) - (i) untersucht.
Das erfindungsgemässe Enzym war im pH-Bereich von 7,5 bis 8,5 stabil. Der optimale pH betrug 8,0.

(2) - (iii) Optimale Temperatur und thermische Stabilität:

Um die Wirkung der Temperatur auf die Aktivität des Enzyms zu untersuchen wurden die Enzymaktivitäten bei unterschiedlichen Temperaturen gemäss dem Verfahren (1) - (i) untersucht.
Zusätzlich wurden die Enzymaktivitäten gemäss dem Verfahren (1) - (i) untersucht, nachdem das Enzym bei der jeweiligen Temperatur für 30 Minuten inkubiert worden war. Die optimale Temperatur betrug 25ºC. Das Enzym war bei 4ºC stabil, aber es war sehr instabil bei einer Temperatur von mehr als 4ºC.

(2) - (iv) Hemmung:

Zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener Inhibitoren auf die Enzymaktivität wurde ein Enzymassay in einem in (1) - (i) beschriebenen Reaktionspuffer, der die in Tabelle 2 gezeigten Inhibitoren (1 mM) enthielt, gemäss dem Verfahren (1) - (i) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Vom erfindungsgemässen Enzym wird angenommen, dass es ein SH-Enzym ist, weil es stark durch p-Chlorquecksilber(II)-benzoesäure (PCMB) und Dithiobis- (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) gehemmt wurde. TABELLE 2
*1 mMTNBS: Trinitrobenzolsulfonsäure
0,1 mMPCMB: p-Chlorquecksilber(II)-benzoesäure
0,1 mMDTNB: Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)
1 mMPMSF: Phenylmethansulfonylfluorid

(2) - (v) Wirkungen von Fettsäuren auf die Enzymaktivität:

Verschiedene Fettsäuren wurden in einer Menge von 2 mM zum Reaktionspuffer aus (1) - (i) hinzugegeben, um die Wirkung der Fettsäuren auf die Enzymaktivität zu untersuchen. Die Aktivität wurde gemäss dem Verfahren (1) - (i) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

TABELLE 3

Einfluss von Fettsäuren auf die Enzymaktivität

Fettsäure (2 mM) Relative Aktivität (%)
Ohne 100
Myristinsäure C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub8;O&sub2; 60,5
Palmitinsäure C&sub1;&sub6;H&sub3;&sub2;O&sub2; 88,1
Palmitoleinsäure C&sub1;&sub6;H&sub3;&sub0;O&sub2; 16,7
Stearinsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub6;O&sub2; 80,5
Oleinsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;O&sub2; 59,6
Linolsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub2;O&sub2; 4,3
Linolensäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub2; 32,0

(3) Sequenzierung der partiellen Aminosäuresequenz:

Die partielle Aminosäuresequenz wurde gemäss dem von Iwamatsu (Seikagaku, 63, 139 (1991)) beschriebenen Verfahren unter Verwendung einer Polyvinylidendifluorid- (PVDF)-Membran bestimmt. Die in (1) - (v) hergestellte AATase wurde gegen 3 l 10 mM Ameisensäure für 1 Stunde dialysiert und dann gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Enzym wurde in einem Elektrophoresepuffer (10% Glycerin, 2,5% SDS, 2% 2-Mercaptoethanol, 62 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 6,8)) suspendiert und einem SDS-PAGE unterworfen. Dann wurde das Enzym auf eine PVDF-Membran mit 10 cm · 7 cm ("Proßlot", Applied Biosystems) unter Verwendung eines Modells ZARTBLOT IIs (Zartrius Co.) elektrogeblottet. Das Elektroblotting wurde bei 160 mA für 1 Stunde gemäss "Pretreatment method of a sample in PROTEIN SEQUENCER (1)", herausgegeben von Shimadzu Seisakusho, durchgeführt.
Das PVDF-immobilisierte Enzym wurde dann abgeschnitten und in etwa 300 ul eines Reduktionspuffers (6 M Guanidin- Hydrochlorid - 0,5 M Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 3,5), 0,3% EDTA, 2% Acetonitril) mit 1 mg Dithiothreitol (DTT) getaucht und unter Argon bei 60ºC für ca. 1 Stunde reduziert. Eine Lösung aus 2,4 mg Monoiodessigsäure in 10 ul 0,5 N Natriumhydroxid wurde hinzugegeben. Die Mischung wurde dann in der Dunkelheit für 20 Minuten gerührt. Nachdem die PVDF-Membran herausgenommen und ausreichend mit 2% Acetonitril gewaschen worden war, wurde die Membran weiter in 0,1% SDS für 5 Minuten gerührt. Die PVDF-Membran wurde als nächstes leicht mit Wasser gespült, in 0,5% Polyvinylpyrrolidon -40-100 mM Essigsäure getaucht und für 30 Minuten stehengelassen. Die PVDF-Membran wurde sorgfältig mit Wasser gewaschen und in quadratische Schnipsel mit einer Seitenlänge von ca. 1 mm geschnitten. Die Schnipsel wurden in einen Verdauungspuffer (8% Acetonitril, 90 mM Tris- Hydrochlorid-Puffer (pH 9,0)) getaucht und bei Raumtemperatur für 15 Stunden verdaut, nachdem 1 umol ACROMOBACTER PROTEASE I (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) hinzugegeben worden war. Die verdauten Produkte wurden durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatografie (Modell L6200, Hitachi) mit einer C8-Säule (Nippon Millipore, Ltd.; u-Bondesphere 5C8, 300A, 2,1 · 150 mm) getrennt, um etwa ein Dutzend Fragmente zu ergeben. Die Elution des Peptids wurde unter Verwendung des Lösungsmittels A (0,05% Trifluoressigsäure) mit einem linearen Gradienten von 2 auf 50% des Lösungsmittels B (2-Propanol/Acetonitril (7 : 3), das 0,02% Trifluoressigsäure enthielt) bei einer Fliessgeschwindigkeit von 0,25 ml/min durchgeführt. Die Aminosäuresequenzierung der so erhaltenen Peptidfragmente wurde durch das automatische Edman-Abbauverfahren mit einem Dampfphasen-Proteinsequenzer Modell 470 (Applied Biosystems) gemäss Herstelleranweisungen durchgeführt.
Als Ergebnis wurden die folgenden Aminosäuresequenzen bestimmt:
Peak 1 Lys Trp Lys
Peak 2 Lys Tyr Val Asn Ile Asp
Peak 3 Lys Asn Gln Ala Pro Val Gln Gln Glu Cys Leu
Peak 4 Lys Gly Met Asn Ile Val Val Ala Ser
Peak 5 Lys Tyr Glu Glu Asp Tyr Gln Leu Leu Arg Lys
Peak 6 Lys Gln Ile Leu Glu Glu Phe Lys
Peak 7 Lys Leu Asp Tyr Ile Phe Lys
Peak 8 Lys Val Met Cys Asp Arg Ala Ile Gly Lys
Peak 9 Lys Leu Ser Gly Val Val Leu Asn Glu Gln Pro Glu Tyr
Peak 10 Lys Asn Val Val Gly Ser Gln Glu Ser Leu Glu Glu Leu Cys Ser Ile Tyr Lys

(4) Klonierung der AATase-codierenden DNA aus Sakehefe:

(i) Herstellung der Sakehefe-Bibliothek:

Hefezellen aus KYOKAI Nr. 7 wurden in 1 t eines YPD- Mediums auf O. D. 600 = 10 herangezogen, gesammelt und mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Die Zellen wurden in SCE- Lösung (1 M Sorbitol, 0,125 M EDTA, 0,1 M Trinatriumcitrat (pH 7), 0,75% 2-Mercaptoethanol, 0,01% "ZYMOLYACE 100T" (Seikagaku Kogyo K. K.)) in einem Verhältnis von 2 ml SCE- Lösung auf 1 g der Zellen suspendiert, bei 37ºC für ca. 2 Stunden inkubiert und vollständig zu Protoplasten überführt. Die resultierenden Protoplasten wurden in Lyse- Puffer (0,5 M Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 9), 0,2 M EDTA, 3% Natriumdodecylsulfat (SDS)) in einem Verhältnis von 3,5 ml des Puffers auf 1 g der Zellen suspendiert. Die Mischung wurde dann vorsichtig bei 65ºC für 15 Minuten zur vollständigen Lyse der Zellen gerührt. Nach der Lyse wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt, und 10 ml der Mischung wurden vorsichtig auf jeweils 23,5 ml einer Saccharoselösung mit einem Dichtegradienten von 10 auf 40% (0,8 M Natriumchlorid, 0,02 M Tris-Hydrochlorid- Puffer (pH 8), 0,01 M EDTA, 10 bis 40% Saccharose) gegeben, die zuvor in Hitachi-Ultrazentrifugationsröhrchen 40PA hergestellt worden war. Sie wurde mit einer Hitachi- Ultrazentrifuge SCP85H bei 4ºC und 26.000 U/min für 3 Stunden zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die resultierende Lösung mit einer Messpipette (Komagome) in einer Menge von ca. 5 ml vom Boden des Röhrchens gewonnen. Die so gewonnene DNA-Probe wurde über Nacht gegen 1 einer TE-Lösung dialysiert.
Die so erhaltene chromosomale DNA wurde partiell mit Sau3AI gemäss dem Verfahren von Frischauf et al. verdaut (Methods in Enzymology, 152, 183, Academic Press, 1987), erneut auf eine Saccharoselösung mit einem Dichtegradienten von 10 auf 40% gegeben und bei 20ºC und 25.000 U/min für 22 Stunden zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das Ultrazentrifugationsröhrchen am Boden mit einer Nadel angestochen, und 0,5 ml der Dichtegradientenlösung wurden in jedem Probenröhrchen fraktioniert. Ein Teil einer jeden Fraktion wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um das Molekulargewicht der chromosomalen DNA zu bestätigen. Dann wurde die 15-20 kb DNA aufgefangen und durch Ethanolausfällung gewonnen.
Die verdaute chromosomale DNA (1 ug) und der λ-EMBL3- Vektor (1 ug) aus einem λEMBL3/BamHI-Vektor-Kit (hergestellt von Stratagene, erworben von Funakoshi) wurden bei 16ºC über Nacht ligiert. Das Ligationsprodukt wurde unter Verwendung von GIGAPCK GOLD (hergestellt von Stratagene, erworben von Funakoshi) verpackt. Die Ligation und die Verpackung wurden gemäss Herstelleranweisungen durchgeführt.
Der Wirtsstamm P2392 des λ-EMBL3-Vektor-Kits wurde mit 50 ml der verpackten Lösung infiziert. Eine Impfschlaufenmenge von P2392 wurde in 5 ml eines TB- Kulturmediums (1% Bactotripton (DIFCO), 0,5% Natriumchlorid, 0,2% Maltose, pH 7,4) bei 37ºC über Nacht kultiviert. Dann wurde 1 ml der Kultur in 50 ml eines TB- Kulturmediums übergeimpft, und die Zellen wurden auf O. D. 600 = 0,5 herangezogen. Nach Abkühlen der Kulturflüssigkeit auf einem Eisbad wurden die Zellen durch Zentrifugation aufgefangen und in 15 ml einer eisgekühlten 10 mM Magnesiumsulfatlösung suspendiert. Zu 1 ml der Zellen wurden 0,95 ml einer SM-Lösung (0,1 M Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumsulfat, 50 mM Tris- Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 0,01% Gelatine)und 50 ul der Verpackungslösung gegeben. Die Mischung wurde für 15 Minuten leicht gerührt und bei einer Temperatur von 37ºC gehalten. Eine 200 ul-Portion der Mischung wurde in 7 ml eines BBL-Weichagar-Kulturmediums (1% Tripticasepepton (BBL), 0,5% Natriumchlorid, 0,5% Agarose (Sigma)) gegeben, das bei einer Temperatur von 47ºC gehalten worden war. Die Mischung wurde leicht vermischt und zum Verteilen auf einer BBL-Agarplatte (1% Tripticasepepton, 0,5% Natriumchlorid, 1,5% Bactoagar (DIFCO)) mit einem Durchmesser von 15 cm überschichtet.
Die überschichtete Platte wurde bei einer Temperatur von 37ºC für 8 Stunden inkubiert. Eine Phagenbibliothek, die ca. 30.000 Klone mit chromosomalen Hefe-DNA-Fragmenten enthielt, wurde so auf 10 überschichteten Agarplatten erhalten.
Die Bibliothek wurde zur Klonierung auf eine Nylonmembran übertragen. Eine Hybridisierungs-Transfermembran (NEN) mit einem Durchmesser von 15 cm wurde mit der überschichteten Agarplatte für ca. 2 Minuten in Kontakt gebracht, um zwei Sätze der Membranen, auf die die Phagen übertragen wurden, und 20 Bögen insgesamt herzustellen. Die Membranen wurden mit der Oberfläche, die mit der Agarplatte in Kontakt gebracht worden war, nach oben auf ein mit einer a.
Alkalidenaturierungslösung (1,5 M Natriumchlorid, 0,5 N Natriumhydroxid) getränktes Filterpapier gegeben und für ca. 5 Minuten stehengelassen. Die Membranen wurden dann auf ein mit einer Neutralisierungslösung (3 M Natriumacetat (pH 5,8)) getränktes Filterpapier verschoben, für ca. 5 Minuten stehengelassen, dann bei Raumtemperatur getrocknet und weiter im Vakuum bei 80ºC für 1 Stunde getrocknet. Die Agarplatte, aus der die Bibliothek übertragen worden war, wurde bei 4ºC gelagert.

(ii) Synthese und Markierung der Sonden:

Die folgenden synthetischen Sonden wurden unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten "Modell 380B" (hergestellt von Applied Biosystems) auf der Basis der in (3) erhaltenen partiellen Aminosäuresequenz von Peak 5 und Peak 2 hergestellt:
Alle Synthesereagenzien wie Phosphoamidit wurden von Applied Biosystems erworben und wurden gemäss Herstelleranweisungen verwendet.
Die so erhaltene synthetische DNA wurde mit 3 ml einer 28%-igen wässrigen Ammoniaklösung bei 60ºC für 4 Stunden behandelt und dann mit einer von Applied Biosystems hergestellten Oligonukleotid-Reinigungskartusche gereinigt.
Die zwei synthetischen Sonden wurden individuell mit [γ-³²P]ATP markiert (ca. 6.000 Cl/mM). Jede Sonden-DNA (c. 250 ng) wurde einer Reaktion in 200 ul einer Reaktionslösung, die 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase, 500 uCl [γ-³²P]ATP und einen Phosphatpuffer enthielt (0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA, 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM DTT, 50 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,6)), bei 37ºC für 1 Stunde unterworfen und bei einer Temperatur von 70ºC für 10 Minuten gehalten. Nicht eingebautes [γ-³²P]ATP wurde durch Reinigung mit einem von Whatman hergestellten DE52 entfernt.

(iii) Klonierung durch Plaque-Hybridisierung:

Die Klonierung durch Plaque-Hybridisierung wurde durch erste, zweite und dritte Durchmusterungen wie folgt durchgeführt.
In der ersten Durchmusterung wurden 20 Bögen der Membran, auf die die in (4)-(i) hergestellte Hefebibliothek übertragen worden war, in 200 ml einer Hybridisierungslösung (6 · SSPE (1,08 M Natriumchlorid, 0,06 M Natriumphosphat, 6 mM EDTA (pH 7,4), 5 · Denhardt- Lösung (0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Ficoll, 0,1% Rinderserumalbumin), 0,5% SDS, 10 gg/ml Einzelstrang-DNA aus Lachssperma) getaucht und zur Vorhybridisierung bei 60ºC für 3 Stunden inkubiert.
Die in (4) - (ii) hergestellte [γ-³²P]ATP-markierte Sonde 5 wurde bei 95ºC für 5 Minuten gehalten und mit Eiswasser gekühlt. Die 20 Bögen der vorhybridisierten Membran wurden in eine gemischte Lösung aus der denaturierten Sonde 5 und 400 ml der Hybridisierungslösung getaucht und vorsichtig bei 30ºC über Nacht inkubiert, um die Membran mit der markierten Sonde 5 zu hybridisieren.
Die Hybridisierungslösung wurde verworfen. Um die überschüssige Sonde 5 aus der Membran zu entfernen, wurde die Membran vorsichtig in 400 ml 2 · SSC (0,3 M Natriumchlorid, 0,03 M Natriumcitrat) bei 30ºC für 20 Minuten geschüttelt. Die Membran wurde dann mit einem Röntgenfilm in Kontakt gebracht und dieser bei -80ºC über Nacht belichtet. Als positive Klone wurden 94 Plaques, von denen beide der zwei Bögen sensibilisiert worden waren, der zweiten Durchmusterung unterworfen.
In der zweiten Durchmusterung wurden diese Plaques auf den ursprünglichen Agarplatten mit einer aseptischen Pasteur- Pipette gepickt und in 1 ml SM suspendiert. Nachdem eine 1 : 1.000-Verdünnung der Suspension hergestellt worden war, wurden 100 ul der mikrobiellen P2392-Lösung mit einer 100 ul-Portion der Verdünnung in der gleichen Weise wie in der Herstellung der Bibliothek infiziert, mit 3 ml eines BBL-Weichagarmediums vermischt und auf BBL-Agarplatten mit einem Durchmesser von 9 cm überschichtet. Nachdem Plaques erschienen waren, wurden 49 Sätze von zwei Membranbögen für einen Klon in der gleichen Weise wie in (3) - (iii) beschrieben hergestellt. Das gleiche Verfahren wie in der ersten Durchmusterung wurde mit der [γ-³²P]ATP-markierten Sonde 2 wiederholt, die in (4) - (ii) hergestellt worden war. 15 Plaques als positive Klone wurden der dritten Durchmusterung unterworfen.
In der dritten Durchmusterung wurde unter Verwendung der [γ-³²P]ATp-markierten Sonde 5 das gleiche Verfahren wie in der zweiten Durchmusterung wiederholt. Schliesslich wurden 14 positive Klone erhalten.
Eine Kultur von E. coli P2392 in TB-Medium über Nacht wurde 4-fach in TB-Medium, das 10 mM MgSO&sub4; enthielt, aufkonzentriert. Dann wurden 20 ul jedes positiven Klons, der in einer Konzentration von 109 bis 1010 Plaques/ml hergestellt worden war, in 5 ml dieser Zellsuspension infiziert. Diese infizierte Zellsuspension wurde für 15 Minuten bei 37ºC gehalten, dann in 50 ml TB-Medium, das 10 mM MgSO&sub4; enthielt, übergeimpft und für 6 Stunden unter Schütteln kultiviert. Dann wurde CCl&sub4; zur Zellkultur hinzugegeben, und die Kultur wurde unter Schütteln bei 37ºC für 30 Minuten zur Lyse von P2392 inkubiert und bei 10.000 U/min für 10 Minuten zur Gewinnung des Überstandes zentrifugiert. DNase (Takara Shuzo) bzw. RNase (Boehringer Mannheim) wurden zum Überstand auf 10 ug/ml hinzugegeben. Die Mischung wurde dann bei 37ºC für 30 Minuten gehalten. Nach Zugabe einer Polyethylenglykollösung (20% Polyethylenglykol 6000, 2,5 M Natriumchlorid) in einer Menge von 30 ml wurde die Mischung bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Die Zentrifugation wurde bei 10.000 U/min für 10 Minuten durchgeführt. Nach Verwerfen des Überstandes wurde die Ausfällung in 3 ml SM suspendiert. EDTA (pH 7,5) und SDS wurden zur Suspension auf 20 mM bzw. 0,1% hinzugegeben. Die Mischung wurde dann bei 55ºC für 4 Minuten gehalten, gefolgt von Zugabe einer Phenollösung (Phenol (25). Chloroform (24). Isoamylalkohol (1)). Die Mischung wurde langsam für 10 Minuten gerührt und für 10 Minuten bei 10.000 U/min zur Gewinnung der DNA-Schicht (wässrige Schicht) zentrifugiert. Nach erneutem Wiederholen dieses Verfahrens wurden 0,33 ml 3 M Natriumacetat und 7,5 ml Ethanol zur wässrigen Schicht gegeben, und die Mischung wurde gerührt und für 30 Minuten bei -80ºC stehengelassen. Nachdem die Mischung bei 10.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert worden war, wurde die Ausfällung mit 70%-igem Ethanol gespült, dann der 70%-ige Ethanol entfernt, und die Ausfällung wurde getrocknet und in 500 gl TE aufgelöst. Jede der so erhaltenen Phagen-DNAs wurde mit einer Anzahl von Restriktionsenzymen geschnitten und miteinander durch Elektrophorese verglichen. Obwohl die 14 positiven Klone scheinbar nicht nur aus jenen bestanden, die die gesamte DNA-Sequenz enthielten, die zur Produktion von AATase fähig ist, sondern auch jenen mit partiellen Deletionen, waren alle Klone diejenigen, die den identischen Ort des Hefechromosoms klonierten. Die Restriktionskarte des 6,6 kb XbaI-Fragments, das die gesamte Länge der DNA- Sequenz unter diesen Klonen enthielt, ist in Fig. 3 gezeigt. Die DNA-Sequenzierung wurde gemäss dem Didesoxyverfahren mit einem XbaI-Fragment durchgeführt, das in pUC119 (Takara Shuzo) subkloniert worden war. Die DNA-Sequenz des AATase-codierenden Gens ist in Fig. 1 gezeigt.

(5) Herstellung von AATase-codierender DNA aus Brauerei-Lagerbierhefe:

Unter Verwendung des Sakehefe-AATase-Gens als Sonde wurde ein mit dem Sakehefe- (KYOKAI Nr. 7)-AATase-Gen hybridisierter DNA-Strang aus Brauerei-Lagerbierhefe kloniert. Das in Fig. 3 gezeigte 1,6 kb HindIII-Fragment (der Bereichinnerhalb des Pfeils) (50 ng) wurde mit 100 uCl [α-³²P]dCTP (ca. 3.000 Ci/mM) unter Verwendung eines Multiprime-Markierungskits (Amersham Japan K. K.) umgesetzt. Die Klonierung durch Plaque-Hybridisierung wurde mit diesem Reaktionsprodukt als Sonde durchgeführt und die Brauerei-Lagerbierhefe-Bibliothek, die 30.000 Phagenklone enthielt, in der gleichen Weise wie in (4) - (i) beschrieben hergestellt. Die Hybridisierungstemperatur wurde auf 50ºC eingestellt. Die Membranen wurden vorsichtig bei 50ºC in 2 · SSC für 30 Minuten und in 0,2 · SSC (0,03 M Natriumchlorid, 3 mM Natriumcitrat) für 30 Minuten inkubiert, um überschüssige Sonden zu entfernen. In der ersten Durchmusterung wurden 60 positive Klone erhalten. Diese positiven Plaques wurden der zweiten Durchmusterung in der gleichen Weise wie in (4) - (iii) beschrieben unterworfen. Die Hybridisierung wurde mit der gleichen Sonde unter der gleichen Bedingung wie oben beschrieben unter Erhalt von 30 positiven Klonen wiederholt. Die DNA wurde aus diesen positiven Klonen extrahiert und einer Restriktionsanalyse unterworfen. Die Ergebnisse zeigen, dass die positiven Klone zwei Gruppen sind. Die Restriktionskarten der Insertions-DNA dieser zwei Gruppen sind ziemlich unterschiedlich, und es wird daher vermutet, dass diese Insertions-DNAs an unterschiedlichen Orten auf dem Hefechromosom vorliegen. Fig. 6 zeigt die Restriktionskarten des DNA-Fragments, enthaltend AATase 1 und 2. Diese Klone werden nachfolgend als "Brauereihefe-AATase 1-Gen" bzw. "Brauereihefe- AATase 2-Gen" bezeichnet.
Die DNA-Sequenzen des Brauereihefe-AATase 1-Gens und des Brauereihefe-AATase 2-Gens wurden in der gleichen Weise wie in (4) - (iii) beschrieben bestimmt. Die DNA-Sequenzen des Brauereihefe-AATase 1-Gens und des Brauereihefe- AATase 2-Gens sind in den Fig. 2 bzw. 17 gezeigt. Das AATase 2-Gen war ein DNA-Fragment, das ein Polypeptid mit AATase-Aktivität in jedem Fall der DNA-Sequenz von A bis C oder der DNA-Sequenz von B bis C produzierte.

(6) Herstellung eines Vektors, der ein AATase-Gen enthält, und Kultivierung einer durch den Vektor transformierten Hefe:

(i) Konstruktion eines Expressionsvektors für Saccharomyces cerevisiae:

Ein 6,6 kb XbaI-Fragment (AAT-K7) des in (4)-(iii) erhaltenen und in Fig. 3 gezeigten Sakehefe-AATase-Gens wurde hergestellt. Das Fragment wurde in den NheI-Ort des Hefevektors YEp13K kloniert, der den Replikationsursprung der 2 uM Hefe-DNA und des LEU2-Hefegens als Marker enthält, um den Expressionsvektor YATK11 (Fig. 11) zu konstruieren.
In der gleichen Weise wurde ein 6,6 kb XbaI-Fragment (AAT-1) des in (5) erhaltenen und in Fig. 4 gezeigten Brauereihefe-AATase-Gens 1 in den NheI-Ort von YEp13K kloniert, um den Expressionsvektor YATL1 zu konstruieren (Fig. 12).
Zusätzlich wurde ein 5,6 kb BglII-Fragment (AAT-2) des in Fig. 4 gezeigten Brauereihefe-AATase-Gens 2 in den BamHI- Ort von YEp13K kloniert, um den Expressionsvektor YATL2 zu konstruieren (Fig. 13).

(ii) Konstruktion eines Expressionsvektors für Sakehefe KYOKAI Nr. 9:

Das Plasmid pUC4k (Pharmacia), das ein G418-resistentes Gen enthält, wurde mit SalI geschnitten. Dann wurde das resultierende Fragment, das das G418-resistente Gen enthält, in den SalI-Ort des YATK11 kloniert, um einen Vektor YATK11 G zur Transfektion des AATase-Gens in Sakehefe zu konstruieren (Fig. 14).

(iii) Konstruktion eines Expressionsvektors für Brauerei-Lagerbierhefe:

(iii-a) Herstellung des G418-Resistenzmarkers:

Das 2,9 kb HindIII-Fragment, das ein PGK-Gen enthält (JP-OS 26548/1990), wurde in pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Das Plasmid pUCPGK21, das einen PGK-Promotor und einen Terminator enthält, ist in Fig. 16 gezeigt.
Das G418-Resistenzgen wurde aus dem Plasmid pNEO (Pharmacia) in das pUCPGK21 durch das in Fig. 16 beschriebene Verfahren zur Konstruktion von pPGKNEO2 kloniert.

(iii-b) Konstruktion der Expressionsvektoren:

pPGKNEO2 wurde mit SalI verdaut, um das ca. 2,8 kb- Fragment zu erzeugen, das den PGK-Promotor, das G418- Resistenzgen und den PGK-Terminator enthält. Dieses Fragment wurde dann in den XhoI-Ort von YATL1 kloniert, um YATLIG zu konstruieren (Fig. 15).

(7) Transformation von Hefen mit dem AATase-Gen:

Um zu bestätigen, dass die klonierten AATase-Gene in (4) - (iii) und in (5) AATase produzieren, wurden Hefezellen mit diesen in in (6) hergestellten Vektoren transformiert, und die AATase-Aktivität der Transformanten wurde gemessen.
Die Transfektion des Plasmids in Saccharomyces cerevisiae TD4 (a, his, leu, ura, trp) wurde gemäss dem Lithiumacetatverfahren (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)) durchgeführt, um YATK11/TD4, YATL1/TD4 und YATL2/TD4 (SKB105-Stamm) zu ergeben.
Die Transformante von Sakehefe KYOKAI Nr. 9 (SKB106-Stamm) wurde gemäss dem folgenden Verfahren erhalten. Der Stamm, in den das Plasmid durch die Lithiumacetatmethode transfiziert worden war, wurde auf YPD-Agarplatten, die G418 enthielten (300 u1/ml), verteilt. Die Platten wurden für 3 Tage bei 30ºC inkubiert. Herangezogene Kolonien wurden erneut in einem G418-haltigen (500 ug/ml) YPD- Agarmedium bei 30ºC für 2 Tage kultiviert, um die Transformanten zu ergeben.
YATLIG wurde in den Stamm 2155 der Brauerei-Lagerbierhefe, Alfred Jorgensen Laboratory (Dänemark) (AJL2155-Stamm), im folgenden Verfahren transfiziert. Die Hefe wurde unter Schütteln in 100 ml eines YPD-Mediums bei 30ºC bis zu einem O. D. 600 = 16 kultiviert. Die Zellen wurden gesammelt, einmal mit sterilisiertem Wasser gespült, dann erneut mit 135 mM Tris-Puffer (pH 8,0) gespült und im gleichen Puffer suspendiert, so dass die Suspension eine mikrobielle Konzentration von 2 · 10&sup9; Zellen/ml hatte. Zu 300 ul der Suspension wurden 10 ug YATLIG, 20 ug Kälberthymus-DNA (Sigma) als Träger-DNA und schliesslich 1.200 ul 35% PEG4000 (das einer sterilen Filtration unterworfen worden war) hinzugegeben. Die Mischung wurde dann ausreichend gerührt. Eine 750 ul-Portion der gerührten Flüssigkeit wurde in eine Küvette für den Gene Pulser (Biorad) gegossen und einmal einer Behandlung mit einem elektrischen Puls unter den Bedingungen von 1 gE und 1.000 V unterworfen. Die Zellsuspension wurde aus der Küvette in ein 15 ml-Röhrchen überführt und bei 30ºC für 1 Stunde stehengelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3.000 U/min für 5 Minuten aufgefangen, in 1 ml YPD-Medium suspendiert und bei 30ºC für 4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden aufgefangen und in 600 ul sterilisiertem Wasser suspendiert. 150 ul der Suspension wurden auf YPD-Agarplatten, die G418 enthielten (100 ug/ml), ausgebreitet. Die Platten wurden bei 30ºC für 3 Tage inkubiert, um die Transformante SKB108 zu erhalten.
Die AATase-Aktivitäten der Transformante, in die das AATase-Gen transfiziert worden war, und der Kontrollstämme wurden gemessen. Ein flüssiges SD-Medium, das eine leucinfreie Mischaminosäurelösung enthielt (0,6% Hefe- Stickstoff-Basis (aminosäurefrei, DIFCO), 2% Glucose) wurde zur Kultivierung der Traneformanten von Saccharomyces cerevisiae TD4 verwendet; ein flüssiges YPD- Medium, das G418 enthielt (400 ug/ml), wurde zur Kultivierung der Transformanten von Sakehefe KYOKAI Nr. 9 verwendet; ein YPD-Medium, das G418 enthielt (10 ug/ml), wurde zur Kultivierung der Transformanten des Brauerei- Lagerbierhefe-AJL2155-Stamms verwendet. Eine 25 ml-Portion des Schüttelkulturprodukts bei 30ºC für ca. 16 Stunden wurde zu 1.000 ml des Kulturmediums hinzugegeben, und das Kulturmedium wurde bei 30ºC für 12 bis 18 Stunden unter statischen Bedingungen inkubiert.
Die Herstellung eines Rohenzyms und der Test seiner Aktivität wurden gemäss dem in (1) - (ii) und (1) - (i) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BIORAD PROTEIN ASSAY KIT (Biorad) gemäss den Anweisungen des Handbuchs bestimmt.
Die Ergebnisse für Saccharomyces cerevisiae TD4, die Sakehefe KYOKAI Nr. 9 und die Bierhefe AJL2155 sind in Tabellen 4, 5 bzw. 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemässen Transformanten AATase-Aktivitäten von 2- bis 15-mal höher als jene des nicht-transformierten Stamms besitzen. Dies zeigt, dass das erfindungsgemässe AATase-Gen leicht einen Stamm bereitstellt, der eine grosse Menge eines Acetatesters, wie Isoamylacetat, produziert.

TABELLE 4

Transformanten Rohenzymaktivität
(ppm/mg Protein)
YEp13K/TD4 7,8
YATK11/TD4 84,0
YATL1/TD4 116,2
YATL2/TD4 (SKB105) 50,6

TABELLE 5

Transformanten Rohenzymaktivität (ppm/mg Protein)
K9 3,4
YATK11 G/K9 (SKB106) 11,6

TABELLE 6

Transformanten Rohenzymaktivität (ppm/mg Protein)
AJL2155 4,1
YATK11 G/AJL2155 (SKB108) 11,6

(8) Fermentationstest der Transformanten:

Sake und Bier wurden unter Verwendung der mit dem AATase- Gen oben in (7) transformierten Hefe hergestellt.

(8) - (i) Herstellung von Sake mit der Transformantenhefe:

Ein Sake-Brauversuch im kleinen Massstab wurde mit 300 g Reis gemäss dem in Tabelle 7 gezeigten Zufuhrprogramm durchgeführt. 30 g gemälzter Reis (Koji-Reis) und 110 ml Wasser, einschliesslich Hefe (2 · 10&sup7; Zellen/ml (Koji- Reis) und Milchsäure (0,35% (V/V)), wurden bei 15ºC vermischt und inkubiert. Am zweiten Tag wurden 35 g gedämpfter Reis als erste Zufuhr hinzugegeben. Am vierten Tag wurde die zweite Zufuhr ausgeführt. Nach Fermentation für 15 Tage wurde das Fermentationsprodukt bei 8.000 U/min für 30 Minuten zentrifugiert. Die Esterkonzentration der "Sake"-Flüssigkeit wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Die durch die erfindungsgemässe Transformante produzierte Flüssigkeit hatte einen aromatischen Geschmack aufgrund einer gesteigerten Menge von Acetatestern wie Ethylacetat und Isoamylacetat im Vergleich mit der durch Hefezellen von KYOKAI-K9 hergestellten Flüssigkeit. TABELLE 7 Zufuhrprogramm für Sake-Brauen im kleinen Massstab TABELLE 8
Einheit: ppm;
NS: Nippon Shudo (Sakegrad)

(8) - (ii) Herstellung von Bier mit Transformantenhefe:

Nachdem Hefe zur Bierwürze hinzugegeben worden war, in der der ursprüngliche Extraktgehalt auf 11% eingestellt war, wurde die Mischung bei 8ºC für 8 Tage inkubiert, bei 3.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert und durch Filtration sterilisiert. Die in der filtrierten Lösung enthaltenen Ester wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Die erfindungsgemässe Transformante produzierte eine Flüssigkeit mit einer gesteigerten Menge von Acetatestern wie Ethylacetat und Isoamylacetat im Vergleich mit der durch die nicht-transformierte Hefe AJL2155 produzierten Flüssigkeit. TABELLE 9

(9) Herstellung von AATase-codierender DNA aus Weinhefe:

Die Primer A und B, die Homologie gegenüber zwei unterschiedlichen Orten in dem in Fig. 6 gezeigten Sakehefe-AATase-Gen besitzen, wurden synthetisiert. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit Gene Amp Reagent Kit (Takara Shuzo) und einem DNA Thermal Cycler (Perkin- Elmer-Theters Instruments Co.) unter Verwendung chromosomaler DNA von Weinhefe als Schablone mit den zwei Primern durchgeführt, um ein 1,17 kb DNA-Fragment von der Position des Primers A zur Position des Primers B zu ergeben. Das Verfahren bestand aus 30 Zyklen mit Verschmelzen bei 50ºC für 2 Minuten. Die Reaktionsmischung wurde in der Agarose-Elektrophorese eingesetzt. Das 1,17 kb DNA-Fragment wurde aus dem Gel gereinigt, mit 100 uCi [³²P]dCTP unter Verwendung eines Nick-Translation- Kit (Takara Shuzo) markiert und mit 20.000 Genombibliotheken aus eine Weinhefe W-3 (Yamanashi Kogyo Gijutsu Center), hergestellt in der gleichen Weise wie die Sakehefe-Bibliothek, hybridisiert. Nach Durchführung der Hybridisierung bei 65ºC wurden die Membranen mit 2 · SSC (1 · SSC ist 15 mM NaCl plus 115 mM Natriumcitrat) unter leichtem Schütteln bei 65ºC für 20 Minuten gespült, mit 2 · SSC für 10 Minuten und schliesslich mit 0,1 · SSC. Als Positive wurden zuerst 14 Plaques erhalten. Bei Hybridisierung dieser Plaques mit dem 1,7 kb Fragment in der gleichen Weise wie oben wurden 7 positive Plaques mit einem starken Hybridisierungssignal erhalten. Die Phagen- DNAs dieser positiven Plaques wurden gereinigt und einer Restriktionsenzymanalyse unterworfen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass alle 7 Klone die gleiche DNA mit der in Fig. 5 gezeigten Restriktionskarte besassen.

HINTERLEGUNG DER MIKROORGANISMEN:

Die unten gezeigten Mikroorganismen in bezug auf die vorliegende Erfindung wurden beim Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter den folgenden Hinterlegungsnummern gemäss Budapest-Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck des Patentverfahrens hinterlegt.
(1) SKB105 FERM BP-3828
(2) SKB106 FERM BP-3829
(3) SKB108 FERM BP-3830
YATL2, YATK11G und YATL1G können durch Kultivierung von SKB105, SKB106 bzw. SKB108 unter einer bestimmten Bedingung, Extrahieren der gesamten DNA der Hefe daraus (Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), Transformieren von Escherichia coli mit dieser Gesamt-DNA und schliesslich Extrahieren der Plasmide durch das Alkaliverfahren (Literatur: Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) erhalten werden.
Ein DNA-Fragment, das einen Teil der DNA-Sequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenz enthält, kann durch Verdauen von YATK11G mit einem geeigneten Restriktionsenzym erhalten werden. Ein Beispiel für eine geeignete DNA-Sequenz ist das 1,6 kb HindIII-Fragment, das durch einen Doppelpfeil in Fig. 3 angegeben ist.

Claims

1. Homogen gereinigte AATase, umfassend ein Polypeptid, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus folgenden Vertretern besteht:

(1a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz;

(1b) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B in der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz; und

(1c) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis C oder B bis C der in Fig. 17 gezeigten Aminosäuresequenz.

2. AATase gemäss Anspruch 1, worin die AATase das Polypeptid (1a) ist.

3. AATase gemäss Anspruch 1, worin die AATase das Polypeptid (1b) ist.

4. AATase gemäss Anspruch 1, worin die AATase das Polypeptid (1c) ist.

5. AATase-Gen, umfassend eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus folgenden Vertretern besteht:

(2a) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;

(2b) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz codiert; und

(2c) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis C oder B bis C der in Fig. 17 gezeigten Aminosäuresequenz codiert.

6. AATase-Gen gemäss Anspruch 5, worin die DNA-Sequenz die DNA-Sequenz (2a) ist.

7. AATase-Gen gemäss Anspruch 5, worin die DNA-Sequenz die DNA-Sequenz (2b) ist.

8. AATase-Gen gemäss Anspruch 5, worin die DNA-Sequenz die DNA-Sequenz (2c) ist.

9. DNA-Sequenz, umfassend ein AATase-Gen, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus folgenden Vertretern besteht:

(3a) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten DNA-Sequenz umfasst;

(3b) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis B der in Fig. 2 gezeigten DNA-Sequenz umfasst;

(3c) einem AATase-Gen, das eine DNA-Sequenz von A bis C oder B bis C der in Fig. 17 gezeigten DNA- Sequenz umfasst;

(3d) einer DNA-Sequenz, die auf der Basis der Degeneration des genetischen Codes ein in Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 17 gezeigtes Polypeptid codiert, oder einer DNA-Sequenz, die ein in Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 17 gezeigtes Polypeptid codiert, das durch Addition, Insertion, Elimination, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert ist und AATase-Aktivität besitzt; und

(3e) einer DNA-Sequenz, die zur Hybridisierung mit einer der DNA-Sequenzen aus (3a) bis (3d) in einer Lösung, die 0,2 · SSC (0,03 M NaCl, 3 mM Natriumcitrat) umfasst, bei 50ºC fähig ist.

10. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 9, worin die DNA-Sequenz das AATase-Gen (3a) ist.

11. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 9, worin die DNA-Sequenz das AATase-Gen (3b) ist.

12. DNA-Sequenz gemäss Anspruch 9, worin die DNA-Sequenz das AATase-Gen (3c) ist.

13. Expressionsvektor, umfassend ein AATase-Gen oder eine DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 5 bis 12.

14. Mit einem AATase-Gen oder einer DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 5 bis 12 transformierte Hefe.

15. Transformierte Hefe gemäss Anspruch 14, worin die zu transformierende Hefe zur Herstellung alkoholischer Getränke ist.

16. Transformierte Hefe gemäss Anspruch 14, transformiert mit einem Expressionsvektor gemäss Anspruch 13.

17. Verfahren zur Herstellung eines alkoholischen Getränks mit einem angereicherten Estergeschmack, umfassend den Schritt der Fermentierung von Saccharid durch eine Hefe gemäss einem der Ansprüche 14 bis 16.

18. Verfahren zur Isolierung einer AATase-codierenden DNA-Sequenz, umfassend die Schritte aus:

(a) Herstellen eines DNA-Fragments mit einer Länge von wenigstens 20 Basen einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von A bis B der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;

(b) Herstellen einer Genbibliothek, die aus DNA-Strängen mit einer Länge im Bereich von 5 · 10³ bis 30 · 10³ Basen, erhalten durch Schneiden des Chromosoms einer Hefe, hergestellt wurde;

(c) Klonieren eines DNA-Fragments durch Hybridisierung aus der Genbibliothek aus (b) unter Verwendung des DNA-Fragments aus (a) als Sonde, worin die Hybridisierung in einer Lösung, die 6 · SSPE und 0,5% SDS umfasst, bei 30ºC über Nacht stattfindet.