DE69332607T2 - Herstellung von -i(aspergillus niger katalase-r) - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft die Anwendung von gentechnologischen Techniken, um neue Stämme von A. niger zu schaffen, die hohe Konzentrationen eines endogenen Katalase-Enzyms (catR Genprodukt, Katalase-R) erzeugen, während sie minimales Natriumgluconat-Abfallmaterial erzeugen: Spezielle werden hohe Konzentrationen an Katalase-R durch den Ersatz des endogenen catR Gen-Promotors durch den A. niger Glucoamylase- (glaA-) Genpromotor erzeugt, was nicht nur höhere Konzentrationen an Katalase-R zur Folge hat, sondern auch die Notwendigkeit für Wasserstoffperoxid ausschaltet, um als ein Induktor für die Katalase-Synthese zu wirken, und die Deletion des endogenen Glucoseoxidase- (goxA-) Gens verringert in großem Maß die Konzentration an Natriumgluconat-Abfallprodukt, wodurch die Notwendigkeit für eine umfangreiche Abfall-Handhabung minimiert wird.
- Katalasen [Wasserstoffperoxid: Wasserstoffperoxid-Oxidoreduktasen (EC 1.11.1.6)] sind Enzyme, welche die Umwandlung von Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;) in Sauerstoff (O&sub2;) und Wasser (H&sub2;O) gemäß der folgenden Formel katalysieren:
- 2H&sub2;O&sub2; 2H&sub2;O + O&sub2;
- Diese allgegenwärtigen Enzyme sind aus einer Vielfalt von Tiergeweben, Pflanzen und Mikroorganismen gereinigt worden (Chance und Maehly, 1955, Methods Enzymol. 2: 764-791; Jones und Wilson, 1978; in H. Sigel (Hsg.), Metal Ions in Biological Systems, Bd. 7, Marcel Dekker Inc., New York). Nahezu alle Formen des Enzyms, die charakterisiert worden sind, bestehen aus vier Polypeptid- Untereinheiten, die jeweils ein Molekulargewicht von 50 000 bis 60 000 aufweisen und eine prosthetische Protohämin-Gruppe pro Untereinheit enthalten (Wasserman und Hultin, 1981, Arch. Biochem. Biophys. 212: 385-392; Hartig und Ruis, 1986, Eur. J. Biochem. 100: 487-490). Rinderleber-Katalase ist die am umfangreichsten untersuchte Varietät dieses Enzyms [Schonbaum und Chance, 1976, in The Enzymes (P. D. Boyer, Hsg.) 3. Aufl., Bd. 13, S. 363-408, Academic Press, New York]. Die vollständige Aminosäuresequenz und dreidimensionale Struktur von Rinderleber-Katalase sind bekannt (Schroeder, et al., 1982, Arch. Biochem. Biophys. 214: 397-412; Murthy, et al., 1981, J. Mol. Biol. 152: 465-499).
- Obwohl sie in biochemischer und biophysikalischer Hinsicht weniger gut untersucht sind, weisen Katalasen aus Fadenpilzen mehrere Eigenschaften auf, die sie von ihren Säuger-Gegenstücken unterscheiden. Während sie bezüglich der Untereinheiten-Zahl und des Häm-Gehalts ähnlich sind, sind Pilzkatalasen wesentlich größere Moleküle als diejenigen aus anderen Organismen, mit Untereinheit- Molekulargewichten im Bereich von 80 000 bis 97 000 (Vainshtein et al., 1986, J. Mol. Biol. 188: 63-72; Jacob und Orme-Johnson, 1979, Biochem. 18: 2967-2975; Jones et al., 1987, Biochim. Biophys. Acta 913: 395-398). Was wichtiger ist, sind Katalasen aus Pilzen wie Aspergillus niger gegen Proteolyse und Inaktivierung durch Glutaraldehyd, SDS stabiler als Rinderleber-Katalase und weisen eine geringere Affinität zu Katalaseinhibitoren wie Cyanid, Azid und Fluorid auf (Wasserman und Hultin, 1981, Arch. Biochem. Biophys. 212: 385-392). Zusätzlich ist A. niger Katalase signifikant stabiler als Rinderleber- Katalase, wenn sie Extremen von pH, Wasserstoffperoxid und Temperaturen unterzogen wird (Scott und Hammer, 1960, Enzymologia 22: 229-237). Obwohl Pilz-Katalasen Stabilitätsvorteile bieten, scheinen entsprechende Säuger-Enzyme, wie Rinderleber-Katalase, eine höhere katalytische Aktivität zu besitzen. (Gruft et al., 1978; Kikuchi-Torii et al., 1982). Da jedoch die Enzymstabilität ein wichtiger Faktor bei der biotechnologischen Verwendung von Enzymen ist, gab es beträchtliches Interesse an der Verwendung von Pilzkatalasen, insbesondere für Anwendungen, welche die Neutralisation von hohen Konzentrationen an Wasserstoffperoxid beinhalten. Vasudevan und Weiland (1990, Biotechnol. Bioeng. 36: 783-789) beobachteten, dass die Geschwindigkeit der Desaktivierung in H&sub2;O&sub2; bei A. niger-Katalase mindestens eine Größenordnung niedriger als bei Rinderleber-Katalase war. Die Stabilitäts-Unterschiede dieser zwei Enzyme können wahrscheinlich den Unterschieden der strukturellen Eigenschaften und Zusammensetzung der Proteine zugeschrieben werden [Vasudevan und Weiland, 1990, Biotechnol. Bioeng. 36: 783-789].
- Katalase-Präparate aus A. niger werden kommerziell für - diagnostische Enzymkits für die enzymatische Erzeugung von Natriumgluconat aus Glucose, für die Neutralisation von H&sub2;O&sub2;-Abfall und für die Entfernung von H&sub2;O&sub2; und/oder Erzeugung von O&sub2; in Nahrungsmitteln und Getränken verkauft. Traditionell war Rinderleber-Katalase das bevorzugte Enzym für diagnostische Zwecke und für mit Pharmazeutika in Beziehung stehende Anwendungen (z. B. Kontaktlinsen-Reinigung/Desinfektion/H&sub2;O&sub2;- Neutralisierung). Jedoch hat der kürzliche Ausbruch einer Slow-Virus-Krankheit, die als BSE (bovine spongiform encephalopathy) bekannt ist, in europäischen Viehherden und die Angst, dass diese Krankheit auf den Menschen übertragen werden könnte [Dealler und Lacey, 1991, Nutr. Health (Bicester) 7: 117- 134; Dealler und Lacey, 1990, Food Microbiol. 7: 253-280], Interesse am Auffinden von Alternativen zu Rinderleber-Katalase für die meisten industriellen Anwendungen geweckt.
- Es wurde wenig Information veröffentlicht, was die Regulierung der Katalase-Synthese in A. niger betrifft. Jedoch wurde beobachtet, dass Katalase als Antwort auf die Erzeugung von H&sub2;O&sub2; während des Wachstums des Organismus auf Glucose oder Fettsäuren erzeugt wird. Beispielsweise wird beim Metabolismus von Glucose durch Oxidation des Zuckers, um Gluconat zu ergeben, H&sub2;O&sub2; gebildet. Diese Reaktion wird durch das Enzym Glucoseoxidase katalysiert:
- Glucose + O&sub2; Gluconat + H&sub2;O&sub2;
- Der zelluläre Metabolismus von Fettsäuren, der in spezialisierten Organellen stattfindet, die als Peroxisomen bekannt sind, liefert ebenfalls H&sub2;O&sub2;, welches die Bildung von Katalase induziert. Jedoch wird in einem entfernt verwandten Pilz (Hefe), Saccharomyces cerevisiae, eine spezielle Katalase beim Wachstum auf Fettsäuren induziert. Diese Katalase, als Katalase A (atypisch) bezeichnet, ist hauptsächlich in Peroxisomen angeordnet, wo die Fettsäureoxidation stattfindet. Ein zweites S. cerevisiae-Enzym, Katalase-T (typisch) ist ein lösliches zytoplasmatisches Enzym, das als Antwort auf eine Vielfalt von anderen metabolischen und Umwelteinwirkungen synthetisiert wird. Diese zwei Hefe-Katalasen sind die Produkte von zwei verschiedenen Zellkern-Genen, die als CTA1 und C771 bezeichnet werden. Ähnlich wurden zwei Katalase-Gene aus A, niger (Genencor International, Inc., unveröffentlicht) isoliert. Das A. niger catA-Gen, das durch Kreuzhybridisierung mit dem Hefe-CTA1-Gen kloniert wird, kodiert ein Katalaseenzym, das hauptsächlich beim Wachstum auf Fettsäuren induziert wird und vermutlich peroxisomal ist. Dieses Enyzm (Katalase-A) ist derzeit nicht von kommerzieller Bedeutung, jedoch kodiert ein zweites kloniertes A. niger-Katalasegen, das als catR bezeichnet wird, ein lösliches zytoplasmatisches Enzym (Katalase-R), welches die Hauptaktivität in kommerziellen Katalase-Präparaten darstellt.
- Wegen des offensichtlichen kommerziellen Interesses an A. niger Katalasen wäre es wünschenswert, A. niger-Stämme zu erhalten, die erhöhte Konzentrationen des catR Genprodukts erzeugen. Weiter wäre es von signifikantem Vorteil, hohe Konzentrationen der Katalase-Synthese ohne die Notwendigkeit zu bewirken, Wasserstoffperoxid als Induktor zu erzeugen. Gleichzeitig mit der Erzeugung von Wasserstoffperoxid findet die Bildung von Natriumgluconat statt, das ein Abfallbeseitigungs-Problem darstellt. Deshalb ist es auch hoch wünschenswert, die Produktion von Gluconat bei der Fermentation in großem Maßstab mit Katalase erzeugenden Stämmen von A. niger zu minimieren. Diese Erfindung offenbart eine Lösung für die gleichzeitige Bewerkstelligung aller dieser Ziele.
- Es wurde entdeckt, dass es möglich ist, die Expression von Katalase-R (catR Genprodukt) ohne die Notwendigkeit zu erhöhen, Wasserstoffperoxid als Induktor der Katalase-Synthese zuzuführen. Gleichzeitig wurde entdeckt, dass die Eliminierung der Glucoseoxidase-Genexpression (durch goxA-Gendeletion) die Erzeugung von Gluconat-Abfallmaterial minimiert, wodurch das Erfordernis für teure Abfall- Behandlungsverfahren umgangen wird.
- Die Erfindung schließt ein Gen ein, das Aspergillus niger-Katalase-R kodiert (catR Gen), an das Promotor- und Terminator-Elemente des A. niger Glucoamylase- (glaA-) Gens funktionell geknüpft sind. Gleichzeitig wurde die kodierende Region des A. niger-Glucoseoxidase- (goxA-) Gens unter Verwendung einer zielgerichteten Genersatz-Strategie zerstört. Die Erfindung schließt auch einen transformierten A. niger-Organismus ein, der hohe Konzentrationen an Katalase-R ohne Wasserstoffperoxid-Induktion exprimieren kann. Dieser Organismus enthält eine funktionelle Expressionseinheit, die das catR Gen umfasst, an das die A. niger glaA-Genpromotor- und -Terminatorsequenzen funktionell geknüpft sind.
- Die Erfinder offenbaren auch ein Verfahren zur Herstellung hoher Konzentrationen an Katalase-R, umfassend das Züchten von transformierten A. niger-Zellen, die chromosomal integrierte Kopien des catR- Gens unter der operationellen Kontrolle des A. niger glaA-Promotors enthalten.
- Fig. 1 ist eine diagrammatische Darstellung der Konstruktion des catR Expressionsplasmids, welches den A. niger glaA-Promotor, die catR kodierende Region, den glaA-Terminator und das A. niger pyrG-Gen enthält. Ein lineares Fragment (EC2L), das diese Komponenten enthält, wurde durch Verdauung mit NotI und PmeI ausgeschnitten und verwendet, um den Wirtsstamm A. niger ΔgoxA pyrG metC zu transformieren.
- Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des A, niger catR Gens und flankierende Regionen. Restriktionsstellen für Enzyme, die Hexanucleotid- und Octanucleotid-Sequenzen erkennen, sind gezeigt. Introns sind durch gestrichelte Linien gekennzeichnet. Abgeleitete Aminosäure- Sequenzen, die den Peptiden entsprechen, welche direkt aus dem Katalase-R-Protein sequenziert wurden, sind mit einem durchgezogenen Balken unterstrichen.
- Fig. 3 ist die vollständige Nucleotidsequenz des linearen Fragments (EC2L), das verwendet wurde, um A. niger ΔgoxA pyrG metC zu transformieren.
- Fig. 4, Schaubild A, ist eine diagrammatische Darstellung der Konstruktion des A. niger-Vektors für die Deletion des Glucoseoxidase- (goxA-) Gens. Ein lineares Fragment, welches das SmaI-ClaI-Segment umfasst, wurde ausgeschnitten und verwendet, um den Wirtsstamm A. niger pyrG zu transformieren. Schaubild B ist eine schematische Ansicht, welche das erwartete Integrationsereignis am goxA-Locus zeigt, das den Ersatz der goxA-kodierenden Region durch das A. niger pyrG-Gen zur Folge hat.
- Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Katalaseproduktion unter Stämmen von A. niger ΔgoxA pyrG metC zeigt, die mit der catR Expressionskassette (EC2L) transformiert sind. Der ursprüngliche Elternstamm, A. niger FS-1, und der Wirtsstamm, A. niger ΔgoxA pyrG metC, sind als Kontrollen eingeschlossen. Jeder Stamm wurde zweifach gezüchtet, und die Assay-Ergebnisse von jedem sind gezeigt:
- Die Einzelheiten der catR Expressionsvektor-Konstruktion und die genetischen Modifikationen, die verwendet wurden, um Stämme mit verbesserter Katalaseproduktion abzuleiten, sind beschrieben. Der Fachmann wird verstehen, dass vielfältige Änderungen in den folgenden Beispielen vorgenommen werden könnten. Demgemäß sollen die Beispiele nicht beschränkend sein.
- Die Techniken, die beim Klonieren des A. niger catR Gens und bei der Konstruktion der catR Expressionskassette verwendet wurden, sind herkömmliche Techniken, die in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind.
- Gereinigte Katalase-R wurde aus einem kommerziellen Präparat von A. niger-Katalase (Fermcolase 1000, Genencor International, Inc.) erhalten, und eine Reihe von proteolytischen Fragmenten wurde erzeugt. Diese Peptidfragmente wurden einer Aminosäuresequenz-Analyse unterzogen. Die Aminosäuresequenz-Information wurde verwendet, um synthetische DNA-Sonden für die Identifikation von catR spezifischen cDNA-Sequenzen zu konstruieren, die in einer λgt11-Bibliothek enthalten waren. Kurz gesagt, würde das Peptidfragment Met-Phe-Trp-Asn-Ser-Leu-Ile-Pro-Ala-Glu-Gln-Gln-Met verwendet, um einen Genpool von drei synthetischen Oligonucleotiden mit den folgenden Sequenzen:
- zu konstruieren. Dieses Peptid wurde gewählt, da die Aminosäuren minimale degenerierte Codon-Auswahlen ergeben, d. h. die Unterschiede unter den drei synthetischen Oligonucleotiden stellen alternative Codon-Auswahlen dar, wo es keine starke Neigung in dem bekannten Codon-Verwendungsmuster bei 4 niger gibt. Diese Position dieses proteolytischen Fragments entspricht dem Peptid 3, das in Fig. 2 gezeigt ist. Ein Klon, der ein partielles cDNA-Fragment enthielt, wurde positiv durch Hybridisierung mit der synthetischen DNA-Sonde identifiziert, und die Nucleotidsequenz-Analyse dieses Klons bestätigte, dass er Katalase-R kodierte. Dieses klonierte cDNA-Segment wurde verwendet, um eine Bibliothek von genomischer A. niger DNA zu sondieren. Anschließend wurde das gesamte catR Gen plus stromaufwärtige und stromabwärtige Transkriptions-Kontrollelemente als ein 9,0 kb HindII-XhoI-Restriktionsfragment zusammengestellt. Die Nucleotidsequenz der catR kodierenden Region wurde bestimmt und ist in Fig. 3 angegeben.
- Der catR Expressionsvektor, der für diese Untersuchungen verwendet wurde, verwendet Transkriptions- und Translations-Kontrollsignale des gut charakterisierten A. niger-Glucoamylase- (glaA-) Gens. Anders als der catR Promotor erfordert der starke glaA-Promotor kein H&sub2;O&sub2; zur Induktion. Stattdessen spricht der glaA-Promotor auf die Anwesenheit von Stärke, Maltose oder anderen Maltooligosacchariden an (Nunberg et al., 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 2306-2316; Barton et al., 1972, J. Bacteriol. 111: 771-777; Fowler et al., 1990, Curr. Genet. 18: 537-545). So gestattet die Verwendung des glaA-Promotors die Konstruktion von Katalase erzeugenden Stämmen, die nicht von der Erzeugung von Wasserstoffperoxid für die Induktion der Katalase-Synthese abhängen. Die Konstruktion der Vektorkassette für die Expression von Katalase unter der Transkriptionskontrolle des glaA-Promotors ist in Fig. 1 umrissen. Das wesentliche Merkmal dieses Konstrukts ist, dass die Glucoamylase-Katalase- Expressionseinheit (d. h. glaA-Promotor + catR kodierende Region + glaA-Terminator) und der angrenzende selektierbare Marker (das A. niger pyrG-Gen) auf einem einzigen NotI PmeI Restriktionsfragment ausgeschnitten werden können (Fig. 1).
- Die catR kodierende Region wurde unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotid-Linkers (13 Basenpaare) mit dem glaA-Promotor verknüpft, wobei der Linker so konstruiert war, dass er diese zwei DNA-Segmente über eine BgIII Stelle in dem glaA-Promotor zu einer einzigen SspI Stelle vier Basenpaare nach dem catR Startcodon (eingeführt durch Orts-gerichtete Mutagenese) kuppelte. Die Insertion dieses Linkers stellt die Nucleotidsequenz von catP zu derjenigen wieder her, die vor der Ortsgerichteten Mutagenese vorlag, und verschmilzt präzise die catR kodierende Region mit dem glaA- Promotor. In einer Beschreibung der glaA-Promotorregion, die von Fowler et al., (1990, Curr. Genet. 18: 537-545) gegeben wurde, wurde angemerkt, dass es DNA-Sequenzen weit stromaufwärts vom Startcodon gibt, die für eine Expression mit hohem Niveau erforderlich sind. Diese Sequenzen, welche wahrscheinlich die Transkriptions-Verstärkungselemente darstellen, sind in dem 1,9 kb-glaA-Promotorsegment eingeschlossen, das in die Konstruktion der catP-Expressionskassette eingeschlossen ist. Ähnlich wurde die glaA-Terminatorregion mit dem 3'-Ende von catR über eine natürlich vorkommende ClaI-Stelle stromabwärts vom Katalase R-Gen-Stoppcodon verknüpft. Eine XbaI-Stelle angrenzend an C/al wurde unter Verwendung eines synthetischen DNA-Linkers eingebaut und wurde dann verwendet, um die Terminatorfusion zu vervollständigen. Dieses Terminatorsegment, das die Information kodiert, die für eine richtige Polyadenylierung und Termination der Transkription erforderlich ist, ist das gleiche Segment wie dasjenige, das für Genencor's Chymosin-Expressionsvektor verwendet wurde (Cullen et al., 1987 Bio/Technol. 5: 369-376). Ein Restriktionsfragment, welches das A. niger pyrG-Gen enthält (Wilson et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 2339) wurde angrenzend an den glaA-Terminator subkloniert, so dass die gesamte Glucoamylase/Katalase/selektierbarer Marker-Kassette auf einem einzigen Restriktionsfragment kodiert war (die Nucleotidsequenz dieses Fragments (EC2L) ist in Fig. 3 angegeben).
- Merkmale des A. niger-Stammes, der als Wirt für die Expression der Glucoseamylase/Katalase- Kassette verwendet wird, umfassen a) Uridin erfordernde Auxotrophie, spezielle eine pyrG-auxotrophe Mutation, b) Deletion des Gens, das Glucoseoxidase kodiert, goxA, und c) eine Methionin erfordernde Auxotrophie, speziell eine Mutation, welche die Zelle defizient bezüglich der Cystathionase- (metC-) Aktivität macht. Obwohl der metC-Marker für eine Expression bei hohem Niveau von Katalase-R nicht erforderlich ist, wurde er als Merkmal des Wirtsstammes eingeschlossen, um der Vorschrift der begrenzten Überlebensfähigkeit von regulatorischen Regierungsämtern zu genügen. Die oben beschriebene Katalase- Expressionskassette wurde verwendet, um den A. niger ΔgoxA pyrG metC-Stamm zu transformieren, und die resultierenden Transformanten wurden in Schüttelkolben-Kulturen bezüglich ihrer Fähigkeit, hohe Konzentrationen an Katalase zu erzeugen, durchmustert. Aus diesen Transformanten wurden die stärksten Erzeuger von Katalase für eine weitere Untersuchung selektiert. Schüttelkolben-Kulturen wurden zwei Tage bei 33ºC in 50 ml eines flüssigen Mediums gezüchtet, das gemäß dem folgenden Rezept hergestellt war: Man gebe für jeden Liter Medium Maltodextrin [Staley 200, A. E. Staley Co., (100 g)], Ammoniumsulfat (4 g), Calciumchlorid (0,4 g), Magnesiumsulfat (0,6 g), Mais-Einweichungsflüssigkeit [Archer Daniels Midland Col, (10 g)] und Kaliumphosphat (3 g) zu. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf 500 ml gebracht, der pH wird auf 7,0 eingestellt und die Lösung wird autoklaviert. Getrennt wird eine 500 ml-Lösung von 12% Calciumcarbonat in destilliertem Wasser hergestellt, der pH wird auf 7,0 eingestellt und die Lösung wird autoklaviert. Die zwei sterilen Mischungen werden aseptisch vereinigt, um einen Liter Katalase-Produktionsmedium zu ergeben. Nach zwei Tagen Wachstum wurden die Myzelen durch Filtration (Miracloth, Calbiochem, Inc.) geerntet, und die Zellen wurden rasch in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Zellen wurden durch Mahlen des gefrorenen Pellets in einer elektrischen Kaffeemühle über etwa 60 s oder bis ein feines Pulver erhalten wurde, zerstört. Die zerstörten Zellen wurden in einem Extraktionspuffer resuspendiert, der 100 mM Natriumformiat, pH 7, 0,01% Natriumdodecylsulfat und 1 mM jeweils von Phenylmethylsulfonylfluorid und Pepstatin enthielt. Unlösliche Trümmer wurden durch Zentrifugation bei etwa 1500 · g entfernt, und die Aktivität der löslichen Katalase in dem Extrakt wurde durch früher beschriebene Verfahren gemessen (Patti und Bonet-Maury, 1953, Bull. Soc. Biol. 35: 1177; Teranishi et al., 1974, Agric. Biol. Chem. 38: 1213). Spezielle Methoden zur Erzeugung der Katalaseproduzierenden Organismen sind nachstehend angegeben. Der Elternstamm für alle hierin beschriebenen Untersuchungen war A. niger FS-1 (NRRL3).
- 5-Fluororotsäure (FOA), ein toxisches Analogon von Orotsäure, wurde verwendet, um Uridin erfordernde auxotrophe Organismen in Faserpilzen und Hefen zu selektieren (VanHartingveldt et al., 1987, Mol: Gen. Genet. 206: 71-75). Pilzstämme, die defizient in Orotidin-5'-monophosphatdecarboxylase (pyrG Genprodukt) sind, sind resistent gegen FOA und erfordern exogenes Uridin für das Wachstum. Das A. niger pyrG-Gen wurde kloniert (Wilson et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 2339) und als selektierbarer Marker für die Transformation von pyrG-Mutantenstämmen verwendet. Ein Vorteil der Verwendung von FOA als positive Selektion für pyrG-auxotrophe Organismen besteht darin, dass spontane Mutanten ohne Erfordernis einer übermäßigen Mutagenese und Durchmusterung selektiert werden können. Das Verfahren der Selektion von A. niger FS-1 pyrG-Mutanten ist wie folgt: Sporen von A. niger FS-1 wurden auf der Oberfläche von Platten mit minimalem Medium ausgebreitet, welches zwei mg/ml Uridin und 1,2 mg/ml FOA enthielt. Resistente Kolonien (FOAr) waren nach 2-3 Tagen Wachstum bei 37ºC zu sehen. Sporen von sechs FOAr-Kolonien wurden auf frischem Medium ausgestrichen, das FOA enthielt, und isolierte Kolonien wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Es wurde gezeigt, dass drei der sechs FOAr-Stämme Uridin für das Wachstum erfordern. Um zu bestimmen, welcher der Uridin erfordernden Stämme ein nicht- funktionelles pyrG-Gen hatte, wurde jeder der Stämme bezüglich seiner Fähigkeit getestet, mit einem Plasmid, welches das A. nidulans pyrG-Gen enthielt, transformiert (d. h. komplementiert) zu werden. Nur ein Stamm, FS-1 pyrG1, ergab Transformanten (eine ungefähre Häufigkeit von 10 Transformanten pro ug DNA), was anzeigte, dass er eine pyrG-Mutation trug. Dieser Stamm wurde für alle anschließenden Experimente verwendet.
- Um eine chromosomale Deletion im goxA-Gen zu erzeugen, wurde ein Vektor konstruiert, der 5'- und 3'-flankierende DNA-Sequenzen des goxA-Gens und ein selektierbares pyrG-Gen enthielt, das anstelle eines Teils der goxA-kodierenden Region insertiert war (siehe Fig. 4). Für eine vollständige Information bezüglich der Nucleotidsequenz des goxA-Gens ziehe man Frederick et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 3793-3802 989, und Kriechbaum et al., 1989, FEBS Lett. 255: 63-66 heran. Kurz gesagt, wurde ein 4,1 kb ClaI SmaI Fragment, welches das A. niger FS-1 goxA-Gen umfasste, in ein pUC218-Derivat (aus dem zuvor die EcoRI-Stelle entfernt worden war) subkloniert, um pUC21Bgoxl zu ergeben. Das A. niger pyrG- Gen wurde als EcoRI-Fragment mit 27 bp und 16 bp pUC4XL-Polylinker-DNA an beiden Enden aus pUC4XL isoliert. Die goxA-kodierende Region wurde anschließend durch Verdauung mit EcoRI entfernt, und das verbleibende Plasmidfragment wurde mit dem EcoRI-Fragment ligiert, welches das A. niger pyrG-Gen enthielt, um pUC21B Δgox.A zu schaffen. Aus diesem Plasmid wurde ein 4,75 kb SmaI XbaI Restriktionsfragment isoliert, das 5'- und 3'-flankierende Regionen des goxA-Gens enthält, bei dem ein Teil der goxA-kodierenden Sequenz entfernt und durch ein funktionelles pyrG-Gen ersetzt war. Die Verwendung dieses Fragments, um A. niger FS-1 pyrG1 mit Selektion für eine Uridin-Prototrophie zu transformieren, hatte die Isolierung mehrerer Stämme zum Ergebnis, die auf Glucoseoxidase- Indikatorplatten keine blaue Farbe ergaben (Witteveen et al., 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 683- 686). Eine Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA, die aus diesen goxA-defizienten Transformanten extrahiert wurde, zeigt an, dass die Δgox.A::pyrG-Kassette über ein homologes Rekombinationsereignis an dem goxA-Locus integriert worden war (wie in Fig. 4B diagrammatisch gezeigt). Mit anderen Worten, das selektierbare pyrG-Gen hatte die goxA-kodierende Region ersetzt.
- Wie in Fig. 5 gezeigt, war die Katalase-Produktion in ΔgoxA-Mutanten etwa drei- bis sechsfach niedriger als beim Elternstamm FS-1. Wir interpretieren diese Daten, dass sie anzeigen, dass in Abwesenheit von Glucoseoxidase wenig Wasserstoffperoxid erzeugt wird und dies wiederum eine nachteilige Auswirkung auf die Katalase-Induktion ausübt.
- Spontane Uridin erfordernde Mutanten von A. niger FS-1 Δgox.4 wurden unter Verwendung von FOA, wie oben beschrieben, selektiert. Dieser Schritt ist für die anschließende Transformation des Stammes mit der EC&sub2;-Kassette auf pyrG-Basis erforderlich.
- Um die Überlebensfähigkeit eines rekombinanten Katalase erzeugenden Organismus in der Umgebung zu begrenzen, wurde auf die folgende Weise ein Methionin erfordernde Auxotrophie eingeführt. Sporen von A. niger FS-1 Δgox A pyrG wurden mit UV-Licht mutagenisiert (95%-ige Abtötung), und die überlebenden wurden einer Filtrationsanreicherung in minimalem Aspergillus-Medium unterzogen. Bei dieser Technik keimen unerwünschte Prototrophe und wachsen unter der Bildung von Myzelen, die durch Filtration entfernt werden können. Auxotrophe Zellen können nicht keimen oder in minimalem Medium wachsen und treten deshalb durch poröse Filter (z. B. Miracloth, Calbiochem, Inc.). Nach mehreren Runden von Filtration und Wachstum wurden die verbleibenden Sporen auf vollständigem Medium plattiert. Kolonien wurden von diesen Platten auf Agar mit minimalem Medium und auf Platten mit frischem komplettem Medium in Flecken aufgebracht. Diejenigen, die auf vollständigem Medium, aber nicht auf minimalem Agar wuchsen, waren auxotroph. Aus der Population von auxotrophen Organismen wurde eine Kolonie identifiziert, die auf minimalem Medium wuchs, das mit Methionin ergänzt war. Nach weiteren Tests wurde entdeckt, dass der Stamm in einem spezifischen Schritt des biosynthetischen Methionin-Wegs defizient war. Das Wachstum wurde durch die Zugabe von entweder Homocystein oder Methionin, aber nicht durch Homoserin oder Cystathionin unterstützt. Auf der Grundlage des bekannten biosynthetischen Wegs für Methionin erscheint es, dass dieser Methionin erfordernde Auxotroph in der Cystathionase-Aktivität defizient war, und so wurde ihm die Bezeichnung metC im Einklang mit anderen Organismen gegeben.
- Die Katalase-Expressionskassette (in linearer Form) wurde nach Verdauung des pUC-EC&sub2;-Plasmids mit PmeI und NotI und Reinigung des EC&sub2;-Fragments durch präparative Gelelektrophorese isoliert. Das gereinigte DNA-Fragment wurde dann verwendet, um den A. niger ΔgoxA pyrG metC Stamm zu transformieren, und prototrophe Transformanten wurden in Schüttelkolben-Kultur bezüglich ihrer Fähigkeit, Katalase zu erzeugen, durchmustert. Aus etwa 50 Transformanten, die in Schüttelkolben durchmustert wurden, wurden zehn identifiziert, die signifikant höhere Katalase-Konzentrationen als Kontrollstämme erzeugten. Diese zehn Stämme wurden in zweifachen Schüttelkolben-Kulturen wiederbewertet, und die Ergebnisse der Katalaseaktivitäts-Assays sind in Fig. 5 gezeigt. Neun der zehn Stämme erzeugten signifikant höhere Konzentrationen an Katalase-R als der Elternstamm FS-1. Zwei der Transformanten (EC2L-19, EC2L-23) erzeugten Katalase-Ausbeuten in Schüttelkolben-Kulturen, die grob das 10- bis 15-fache der Konzentration waren, die von A. niger FS-1 erzeugt wird, und diese Stämme würden für Tests unter Produktionsbedingungen in großem Maßstab ausgewählt. Fermentationsexperimente im 10 I- und 50000 I-Maßstab haben gezeigt, dass die Katalase-R-Produktion des Transformanten EC2L-23 dem Niveau der Katalase-R-Expression entspricht, das in den Schüttelkolben- Untersuchungen gesehen wurde.
- Weiter ergaben die HPLC-Analysen von organischen Säuren, die bei den Fermentationen von A. niger EC2L-23 und dem Elternstamm FS-1 erzeugt wurden, die folgenden Ausbeuten an Natriumgluconat:
- Stamm Natriumgluconat (mg/l)
- FS-1 > 200 000
- EC2L-23 (Ansatz 27) 48
- EC2L-23 (Ansatz 28) 123
- Diese Daten zeigen eine dramatische Abnahme der Produktion von Natriumgluconat-Abfallmaterial durch die Transformante EC2L-23.
Claims (7)
1. Gensequenz, welche die kodierende Region eines Gens, das für ein
Catalase R-Enzym von Aspergillus kodiert, welches die Aminosäuresequenz
von Fig. 2A-C umfasst, und ein Aspergillus-Glucoamylase-Promotorgen
umfasst, das funktionell an dem Gen angebracht ist.
2. Gensequenz nach Anspruch 1, in der der Aspergillus-Glucoamylase-
Promotor von A. niger abstammt.
3. Gensequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in der das Gen die in Fig.
2A-C oder in Fig. 3A-F gezeigte catR-Sequenz umfasst.
4. Replizierbares Plasmid oder replizierbarer Vektor, das bzw. der zu einer
Integration in ein Aspergillus niger-Genom in der Lage ist und in das bzw.
den die Gensequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1-3 inseriert worden
ist.
5. Aspergillus niger, der mit einer Gensequenz nach irgendeinem der
Ansprüche 1-4 transformiert worden ist.
6. Aspergillus niger nach Anspruch 5, in dem das native Glucoseoxidase-Gen
deletiert ist.
7. Verfahren zur Erzeugung eines Catalase R-Enzyms von Aspergillus, das die
Aminosäuresequenz von Fig. 2A-C umfasst, umfassend das Kultivieren von
Aspergillus niger nach Anspruch 5 oder Anspruch 6 unter Verwendung von
assimilierbaren Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff.
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