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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tetanus-Toxin
zur Verwendung in Tetanus-Impfstoffen.
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Der
existierende Tetanus-Impfstoff wird aus einer 7-Tage-Flaschenkultur
von Clostridium tetani hergestellt, welche durch die Zugabe von
Formaldehyd inaktiviert (”toxoidiert”) wird.
Der Formaldehyd wird als Formalin zugesetzt. Toxoid wird zur Verwendung
in einem Impfstoff durch Salzfraktionierung auf eine spezifische
Aktivität
von etwa 1200-Flockulationseinheiten (Limes flocculationis, Lf)/mg
Protein-Stickstoff (PN) gereinigt, was 30% bis 40% Reinheit entspricht.
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Es
wurden Versuche unternommen, die spezifische Aktivität des Impfstoffs
durch Reinigen des Toxoids unter Verwendung von Immunoadsorbentien zu
erhöhen
(Hughes et al., J. Appl. Bact. 37, 603–621, 1974). Dies führte jedoch
lediglich zu einer begrenzten Erhöhung auf 1600 Lf/mg PN. Dawson & Mauritzen (Aust
J. Biol. Sci, 1969, Band 22, Seite 1217) beschreiben Untersuchungen
zur Wechselwirkung von Formaldehyd mit Tetanus-Toxin, welche die Bindung
von Formaldehyd in Gegenwart der Aminosäuren Leucin und Lysin während der
Detoxifikation von Tetanus-Toxin einschließt. Bacterial Vaccines („Bakerielle
Impfstoffe”)
(Ausg. R. Germanier, Academic Press, 1984, Seiten 48–50) beschreibt
Verfahren, die bei der Detoxifikation von Tetanus-Toxin zur Verwendung
in Impfstoffen, und insbesondere menschlichen Impfstoffen angewandt
werden. Die
WO-A-91/12020 beschreibt
ein neues detoxifiziertes toxisches Antigen, insbesondere B. Pertussis-Toxin, erhalten
durch teilweise Detoxifikation unter Verwendung von Glutaraldehyd,
gefolgt von einer Umsetzung des teilweise detoxifizierten Antigens
mit Formalin in Gegenwart ausgewählter
Aminosäuren.
Das detoxifizierte B. Pertussis-Toxin gilt als stabil gegenüber einer
Reversion zur Toxizität.
Die
GB-A-969772 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung eines Toxoids aus einem gereinigten
bakteriellen Toxin, insbesondere gereinigtem Diphtherie-Toxin, durch
Behandeln des Toxins in einem wäßrigen Medium
mit Formaldehyd in Gegenwart eines aliphatischen Diamins mit einem
Molekulargewicht von unterhalb 200, welches eine primäre oder
sekundäre
Aminogruppe enthält.
Bevorzugte Diamine sind Lysin und Ethylendiamin.
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Wir
entwickelten jetzt ein neues Verfahren zur Herstellung von Tetanus-Toxoid.
Statt das Toxin zu toxoidieren und anschließend das Toxoid zu reinigen,
reinigten wir das Toxin und toxoidierten danach das gereinigte Toxin. Überraschenderweise
erwiesen sich aber viele dieser Präparate als instabil und zeigten
unterschiedliche Grade der Reversion zu Toxizität bei einer Lagerung bei 37°C in Abwesenheit
von Formalin.
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Wir
befaßten
uns dann mit der Hinzufügung von
Aminosäuren
zu der Toxoidierungsreaktion in verschiedenen Konzentrationen, wobei
auch die Formalin-Konzentration, der pH-Wert und die Inkubationszeiten
variiert wurden. Die Reversion zu Toxizität war schwierig zu vermeiden,
außer
auf Kosten der niedrigen (TCP)/Lf-Verhältnisse der Gesamtbindekraft,
die zu Präparaten
mit schlechter Immunogenizität
führten.
Nur unter spezifischen Bedingungen konnten stabile und hochimmunogene
Präparate
erhalten werden.
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Demzufolge
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von
Tetanus-Toxoid bereit, wobei das Verfahren das Inkubieren von gereinigtem
Tetanus-Toxin mit einer spezifischen Aktivität von 2000 Lf/mg PN oder mehr
und einem Lf-Gehalt von 250 Lf/ml oder mehr mit 0,2 bis 1% (v/v)
Formaldehyd in Gegenwart von 0,005 bis 0,25 M Lysin während 24
bis 32 Tagen bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 und einer Temperatur
von 30 bis 45°C
umfasst, wobei das gereinigte Toxin mit dem Formaldehyd in Abwesenheit
von dem Lysin 20 bis 40 Minuten lang bei 35 bis 40°C vorinkubiert
wird.
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Das
Tetanus-Toxin wird typischerweise aus einer Kultur von Clostridium
tetani erhalten. Es kann jeder geeignete Stamm von Cl. tetani verwendet
werden. Das Toxin kann aus einer Fermentationsbrühe zunächst durch Zentrifugieren der
Brühe und
anschließendes
Klären
des Kulturüberstandes,
zum Beispiel durch eine zweistufige Filtration, gereinigt werden.
Der geklärte Überstand
kann konzentriert werden. Der Überstand
kann anschließend
einer Diafiltration, um kleine geladene Molekularspezies zu entfernen,
und danach einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen werden.
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Das
gereinigte Toxin hat einen Lf-Gehalt von 250 Lf/ml oder mehr, zum
Beispiel von 250 bis 500 Lf/ml. Wenn der Lf-Gehalt geringer als
250 Lf/ml ist, kann das Toxin durch einen zusätzlichen Konzentrationsschritt
erneut behandelt werden, um die Toxinausbeute zu erhöhen.
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Die
spezifische Aktivität
des Toxins kann durch Schätzen
des Protein-Stickstoff-(PN-)Gehalts des gereinigten Materials und
durch Berechnen des Verhältnisses
von Lf zu PN bestimmt werden. Das gereinigte Toxin besitzt ein Verhältnis von
Lf zu PN von 2000 Lf/mg PN oder mehr, zum Beispiel von 2000 bis
3000 Lf/mg PN oder von 2000 bis 2800 Lf/mg PN. Wenn die spezifische
Aktivität
von Toxin niedriger als 2000 Lf/mg PN ist, kann das gereinigte Material
durch eine Ionenaustauschsäule
erneut behandelt werden. Eine spezifische Aktivität von 2000 Lf/mg
PN entspricht einer Reinheit von etwa 70%. 100% reines Toxin soll
eine spezifische Aktivität
von 3000 bis 3200 Lf/mg PN besitzen.
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Die
Reinheit des Toxins kann alternativ oder weiterhin durch eine Hochdruck-Flüssigchromatographie-(HPLC-)Analyse
und/oder durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) bestimmt werden. Die Reinheit wird vorzugsweise durch
HPLC bewertet, wodurch Elutionspeaks integriert werden und der Bereich
der toxinbedingten Peaks als Prozentsatz des gesamten integrierten Peakbereichs
ausgedrückt
wird. Die Analyse durch SDS-PAGE
unter reduzierenden Bedingungen trennt das Toxinmolekül in seine
schweren (100 kD) und leichten (50 kD) Kettenbestandteile. Die zwei
Banden können
nach einem Färben
identifiziert werden, und ihre kombinierten Intensitäten, wie
durch Densitometrie bestimmt, werden als ein Prozentsatz der gesamten
Banden ausgedrückt.
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Wenn
die HPLC-Analyse und/oder SDS-PAGE-Analyse zeigt, daß das Toxin
zu weniger als 70% rein ist, kann das Material durch eine Ionenaustauschsäule erneut
behandelt werden, um die Reinheit zu erhöhen. Vorzugsweise ist das Toxin
daher zu 70% oder mehr rein, beispielsweise zu 70% bis 100% rein,
wie durch HPLC und/oder SDS-PAGE ermittelt. Das Toxin kann zu 80%
oder mehr oder 90% oder mehr rein sein.
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Das
gereinigte Tetanus-Toxin wird durch 0,2 bis 1% (v/v) Formaldehyd
in Gegenwart von 0,005 bis 0,25 M Lysin toxoidiert. Ein Puffer,
wie Natriumborbernsteinsäurepuffer,
wird üblicherweise
zugesetzt, um den pH-Wert der Lösung
von gereinigtem Toxin auf 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,5 bis 7,5,
einzustellen. Die Konzentration des gereinigten Toxins in Lösung wird
typischerweise auf 150 bis 300 Lf/ml, vorzugsweise etwa 200 Lf/ml,
eingestellt.
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Das
gereinigte Toxin wird zuerst mit dem Formaldehyd in Abwesenheit
von Lysin gereinigt. Die Vorinkubation erfolgt während 20 bis 40 Minuten, zum
Beispiel während
etwa 30 Minuten. Die Vorinkubationstemperatur beträgt 35 bis
40°C, zum
Beispiel etwa 37°C.
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Lysin
wird anschließend
hinzugegeben. Das Lysin ist typischerweise L-Lysin, wie L-Lysinmonohydrochlorid.
Ein Puffer wie Natriumbicarbonatpuffer kann zur Einstellung des
pH-Wertes hinzugegeben werden. Die Inkubation des gereinigten Toxins
mit dem Formaldehyd und dem Lysin erfolgt vorzugsweise für etwa 28
Tage. Die Inkubationstemperatur beträgt vorzugsweise 35 bis 40°C, zum Beispiel
etwa 37°C.
Die Formaldehyd-Konzentration ist vorzugsweise 0,25 bis 0,5% (v/v).
Die Lysin-Konzentration ist vorzugsweise 0,05 bis 0,2 M. Geeignete
Bedingungen sind: –0,25%
(v/v) Formaldehyd mit 0,05 bis 0,1 M L-Lysin, und –0,5% (v/v)
Formaldehyd mit 0,1 bis 0,2 M L-Lysin.
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Das
resultierende Toxoid kann anschließend gereinigt werden. Restliches
Formaldehyd und Lysin werden entfernt. Das Toxoid kann daher durch
Ultrafiltration konzentriert werden, diafiltriert werden, um das
restliche Formaldehyd und Lysin zu entfernen, und durch Membranfiltration
sterilisiert werden. Vorzugsweise ist das Lf/PN-Verhältnis des
Toxoids 2000 Lf/mg PN oder mehr, beispielsweise 2000 bis 3000 Lf/mg
PN oder 2000 bis 2800 Lf/mg PN. Weiter bevorzugt besitzt das Toxoid
eine Reinheit von 70% oder mehr, zum Beispiel von 70% bis 100%,
wie durch HPLC und/oder SDS-PAGE bestimmt. Das Toxoid kann daher
zu 80% oder mehr rein oder 90% oder mehr rein sein, wie durch HPLC
und/oder SDS-PAGE bestimmt. Wenn das Lf/PN-Verhältnis weniger als 2000 LF/mg
PN beträgt
und/oder wenn das Toxoid weniger als 70% rein ist, wie durch HPLC und/oder
SDS-PAGE bestimmt, kann das Toxoid durch eine Ionenaustauschsäule wiederbehandelt werden.
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Ein
auf diese Weise hergestelltes Tetanus-Toxoid kann daher keiner Reversion
zu Toxin unterliegen, wenn es bei 37°C 3 Monate oder länger, vorzugsweise
bis zu 6 Monate gelagert wird; besitzt eine spezifische Aktivität von 2000
bis 2800 Lf/mg PN, beispielsweise 2400 bis 2700 LF/mg PN; und besitzt
eine Potenz von 130 bis 270 Internationale Einheiten (Iu)/3,5 Lf,
beispielsweise 200 bis 250 Iu/3,5 Lf.
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Das
resultierende Toxoid unterliegt keiner Reversion zur Toxizität und ist
immunogener als der bereits existierende Impfstoff. Das Toxoid kann
daher mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel
zur Bildung einer Impfstoffzusammensetzung formuliert werden. Das
Toxoid kann mit einem physiologisch annehmbaren Lösungsmittel wie
physiologischer Salzlösung
gemischt werden. Das Toxoid kann alternativ in einer physiologischen Salzlösung oder
einer anderen geeigneten, mit Blut isotonischen Lösung auf
einem geeigneten mineralischen Träger präzipitiert werden oder durch
diesen adsorbiert werden. Solche Formulierungen werden allgemein
bei 2 bis 8°C
vor dem Gebrauch gelagert. Thiomersal kann in der Impfstoffformulierung
vorhanden sein. Das Toxoid kann Teil eines Mehrkomponentenimpfstoffs,
wie eines kombinierten Diphterie-Tetanus-Impfstoffs oder eines kombinierten
Diphtherie-Tetanus-pertussis-Impfstoffs,
sein.
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Ein
Mensch kann daher gegen Tetanus durch Verabreichung einer wirksamen
Menge des vorliegenden Tetanus-Toxoids immunisiert werden. Typischerweise
erfolgt die Verabreichung intramuskulär oder subkutan. In jedem Fall
kann die verabreichte anfängliche
Dosis von Toxoid 3 Lf bis 10 Lf betragen. Diese Dosis kann bis zu
zweimal in Abständen
von 2 Monaten wiederholt werden. Eine Booster-Dosis von 3 Lf bis
10 Lf kann 5 oder 10 Jahre später
verabreicht werden.
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Das
folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung. Ein Referenzbeispiel
und Vergleichsbeispiele sind ebenfalls angegeben.
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Referenzbeispiel: Herstellung von gereinigtem
Tetanus-Toxin
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Cl.
tetani-Stamm CN 3911, bei dem es sich um eine Subkultur von dem
Harvard-Stamm von Cl. tetani handelt (Mueller und Miller, J. Immunol.
50, 377–384,
1945), wurde in einem modifizierten Mueller-Medium (Latham et al.,
Appl. Microbiol. 10, 146, 1962) kultiviert. Insbesondere wurden
10% (v/v) einer 48-Stunden-Impfkultur verwendet, um sie entweder
in einer statischen Flasche oder in einem regulierten Fermentator
bzw. Gärbottich,
enthaltend ein modifiziertes Mueller-Medium, zu inokulieren. Im
Falle der statischen Kultur wurde dem Medium vor der Animpfung Aluminiumpulver
zugegeben. Der Fermentator, ein 15-l-Fermentator, wurde mit 50 U/min umgerührt und
0,2 μM filtrierte
Luft wurden über
die Oberfläche
der Kultur in einer Rate von 500 ml/min gezogen. Die Fermentierung
in der statischen Flasche oder in dem Fermentator wurde 4 bis 7
Tage bei 33 ± 2°C fortgeführt.
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Die
Fermentationsbrühe
wurde durch satzweises Zentrifugieren (6 × 1-Liter-Rotor) mit 3000 g 40
Minuten lang abgetrennt. Der Überstand
wurde weiter durch eine zweistufige Filtration durch einen 1,2/0,8-μm-Kombinationsflter
und danach einen 0,2-μm-Sterilfilter
geklärt.
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Der
Kulturüberstand
wurde anschließend zehnfach
unter Verwendung einer 30K-Cut-off-Ultrafiltrationsmembran konzentriert
und anschließend unter
Verwendung derselben Membran unter Verwendung von 10 Volumina Puffer
[20 mM Tris, 25 mM NaCl, 0,2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH-Wert:
7,5] extensiv diafiltriert. Dies führte zu einer achtzehnfachen
Erhöhung
der Reinheit, wie durch HPLC ermittelt. Die mittlere Rückgewinnung
aus diesem Schritt wurde mit 80% ermittelt.
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Das
filtrierte Material wurde anschließend auf eine Anionen-Ionenaustauschsäule (DEAE-Sepharose Fast Flow)
geladen. Die Säule
wurde mit 20 mM Tris-Puffer, pH-Wert = 7,5, gewaschen. Tetanus-Toxin
wurde mit 80 mM NaCl, Tris-Puffer, pH-Wert = 7,5, eluiert. Das eluierte
Material wurde durch einen 0,2-μm-Sterilfilter
steril-filtriert. Das auf diese Weise gereinigte Material wurde
den folgenden Tests unterzogen.
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(i) Schätzung des Lf-Gehalts
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Dieser
Test überwachte
die Toxin-Ausbeute des gereinigten Toxinmaterials. Ungefähr 5 ml
an gereinigtem Toxinmaterial wurden für die Tests hergenommen. Die
Probe wurde vor dem Testen nicht gelagert. Die Lf-Bestimmung wurde
durch die bei Ramon, G. (1922), Sur une technique de titrage in
vitro due serum anti-diphtherique C. P. SOC. BIOL. (Paris) 86, 711–712, beschriebene
Verfahrensweise durchgeführt.
Der Lf-Gehalt des gereinigten Materials war 250–500 Lf/ml.
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(ii) Schätzung des Lf: Protein-Stickstoff-Verhältnisses
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Dieser
Test ermittelte die Reinheit des gereinigten Materials. Nicht weniger
als 1 ml des gereinigten Materials wurden für die Tests herangezogen. Die Probe
wurde bei 5°C ± 3°C gelagert,
wenn sie nicht unmittelbar untersucht wurde. Der Protein-Stickstoff-(PN-)Gehalt
wurde unter Verwendung der Kjeldahl-Digeriertechnik (Kjeldahl J.
(1888) C. R. CARLSBERG LABOR. (Kopenhagen) 2, 1–12) nach der Präzipitierung
mit Trichloressigsäure
geschätzt. Das
Verhältnis
von Lf:PN war 2000–3000
Lf/mg PN.
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(iii) Bestimmung des HPLC-Profils durch
Größenausschluß
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Dieser
Test stellte sicher, daß das HPLC-Profil
des gereinigten Toxins sich innerhalb der annehmbaren Grenzen befand.
Nicht weniger als 1 ml gereinigtes Material wurde für die Tests
herangezogen. Die Probe wurde bei +4°C vor dem Test aufbewahrt. Eine
Probe des gereinigten Toxinmaterials wird auf eine HPLC-Gel-Filtrationssäule (TSK
G 3000 SW × 1)
aufgebracht. Die Abtrennung der Probenkomponenten wird bei 280 nm überwacht,
und die Peakbereiche werden integriert. HPLC-Resultate:
- – Peak
1 (Verweilzeit 10,6–10,7
Minuten) – Toxinmonomer;
- – Peak
2 (Verweilzeit 12,4–12,5
Minuten) – Toxinfragment
C; und
- – Peak
3 (Verweilzeit > 14
Minuten) – Verunreinigungen.
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Die
kombinierten integrierten Bereiche der Peaks 1 und 2 betrugen 70
bis 100% der gesamten integrierten Bereiche der Peaks 1 bis 3.
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(iv) Bestimmung des SDS-PAGE-Profils
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Dieser
Test stellte sicher, daß das
SDS-PAGE-Profil des gereinigten Toxins innerhalb annehmbarer Grenzen
lag. Nicht weniger als 0,5 ml des gereinigten Toxinmaterials wurden
für die
Tests herangezogen. Die Probe wurde bei 4°C vor dem Testen aufbewahrt.
Die Probe wurde nach der Reduktion unter Verwendung von Mercaptoethanol
durch SDS-PAGE durch das von Laemili beschriebene Verfahren untersucht
(Nature, 227, 680–685,
1970). Das Gel wurde durch ein Densitometer abgetastet, und es wurden
die Peakbereiche integriert. Die schweren (100 kD) und leichten
(50 kD) Toxin-Banden repräsentierten
70 bis 100% der gesamten mit Coomassieblau gefärbten Banden, berechnet aus
den durch Densitometrie nachgewiesenen integrierten Banden.
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BEISPIEL: Toxoidierung von gereinigtem
Tetanus-Toxin
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Das
gereinigte Tetanus-Toxin aus dem Referenzbeispiel wurde mit ausreichend
Natriumborbernsteinsäure-(SBSA-)Puffer,
pH-Wert = 7,5, verdünnt, wodurch
eine letztendliche Toxinkonzentration von 200 Lf/ml erhalten wurde.
Die Aliquoten wurden wie folgt toxoidiert:
- 1.
0,25% (v/v) Formaldehyd in der Form von Formalin wurden einer Aliquote
zugesetzt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert.
L-Lysin-monohydrochlorid wurde anschließend auf eine Endkonzentration
von 0,1–0,2 M
in Gegenwart von 0,1 M Natriumbicarbonat zugesetzt. Der pH-Wert
der Reaktionsmischung war 6,5 bis 7,5, und die Toxoidierung wurde
28 Tage lang bei 37°C ± 2°C weiterlaufen
gelassen.
- 2. 0,5% (v/v) Formaldehyd in der Form von Formalin wurden einer
weiteren Aliquote zugesetzt und die Mischung wurde 30 Minuten lang
bei 37°C vorinkubiert.
L-Lysin-monohydrochlorid wurde anschließend einer Endkonzentration
von 0,05 bis 0,1 M in Gegenwart von 0,1 M Natriumbicarbonat zugegeben.
Der pH-Wert der Reaktionsmischung war 6,5 bis 7,5, und die Toxoidierung
wurde 28 Tage lang bei 37°C ± 2°C weiterlaufen
gelassen.
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Der
Lf-Gehalt des inkubierten Materials wurde wie in dem Referenzbeispiel
beschrieben untersucht. Das inkubierte Material wurde durch eine
Ultrafiltration-30K-Cutoff-Ultrafiltrationsmembran konzentriert.
Das Konzentrat wurde unter Verwendung derselben 30K-Membran gegenüber einem SBSA-Puffer,
pH-Wert = 7,5, diafiltriert, um restliches Formaldehyd und Lysin
zu entfernen. Thiomersal (Ethylmercurithiosalicylsäure, Natriumsalz)
wurde hinzugegeben, wodurch eine Endkonzentration von 0,1 g/Liter
(2,5 × 10–4 Mol/Liter)
Thiomersal erhalten wurde. Die resultierende Lösung wurde durch Membranfiltration
(0,2-μm-Membran)
sterilisiert. Es wurden Proben entnommen und wie folgt getestet:
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(i) Schätzung des Protein-Stickstoff-Gehalts
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Dieser
Test wurde wie in dem Referenzbeispiel beschrieben durchgeführt. Das
Resultat war 2000–2800
Lf/mg PN.
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(ii) Schätzung des Gesamtbindevermögens (TCP)
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Dieser
Test bestimmte den Antigengehalt des Tetanus-Toxoids. TCP ist ein
weithin verwendeter Begriff im Tetanus-Fachbereich und wird in dem WHO-Leitfaden
(11, Anhang T. 10) erwähnt.
Dieser ist als reziproker Wert des Toxoidvolumens definiert, welches
bei Verdünnung,
wie sich erweist, 1 internationalen Einheit (WHO BLG/UNDP/77,1 Rev.
1) entspricht. Die Qualität
von Toxoiden kann durch Bestimmung des Verhältnisses von TCP (Bindeeinheiten)
zu Lf-Einheiten gemessen werden, welche größer als 1 sein sollte.
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Nicht
weniger als 5,0 ml des Toxoids wurden für die Untersuchung herangezogen.
Die Probe wurde bei 5°C ± 3°C aufbewahrt,
wenn sie nicht unmittelbar untersucht wurde. Ein geeigneter Bereich
der Volumina von 0,01–0,03 μl des Testmaterials
und ein Referenz-Tetanus-Toxoid von 87 internationalen Einheiten
(Iu)/ml, die eine korrigierte geometrische Progression erzeugen,
wurden in eine Reihe von Röhrchen
verteilt. Ein feste Dosis von 2 Iu/0,5 ml an Tetanus-Antitoxin-Referenzlösung wurde
jedem Röhrchen
hinzugegeben und 60 Minuten lang auf Raumtemperatur gehalten.
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Ein
der halben Antitoxin-Dosis entsprechendes Volumen des Tetanus-Testtoxins
wurde jedem Röhrchen
hinzugegeben und 30 Minuten stehen gelassen. Der Inhalt jedes Röhrchens
wurde subkutan in Mäuse
injiziert, die jeweils ein Gewicht von 18–22 g hatten. Die Mäuse wurden
4 Tage auf Anzeichen einer typischen Tetanus-Paralyse hin beobachtet.
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Wenn
eine spezifische Tetanus-Paralyse innerhalb von 3 Tage auftrat,
enthielt das Testmaterial Tetanus-Toxoid, das mehr als der Hälfte der
zugegebenen Antitoxin-Dosis entsprach. Wenn die Maus mehr als 3
Tage ohne eine spezifische Tetanus-Paralyse überlebte, enthielt das Testmaterial
Tetanus-Toxoid, das weniger als der Hälfte der zugesetzten Antitoxin-Dosis
entsprach. Die Herbeiführung
einer spezifischen Tetanus-Paralyse am dritten Tag war ein Hinweis
darauf, daß das
Volumen von Tetanus-Toxoid exakt als der halben zugesetzten Antitoxin-Dosis entsprechend
angenommen wurde.
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Die
Resultate wurden als Durchschnitt von zwei Tests angenommen, unter
der Maßgabe,
daß diese
vom Durchschnittswert nicht um mehr als 20% abwichen. Die Resultate
waren 200–350
u/ml.
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(iii) Schätzung des Lf-Gehalts
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Der
Lf-Gehalt wurde wie in dem Referenzbeispiel beschrieben bestimmt.
Die Resultate waren 150–250
Lf/ml.
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(iv) Bestimmung des HPLC-Profils
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Das
HPLC-Profil wurde wie in dem Referenzbeispiel beschrieben bestimmt.
Das Resultat war 70–100%
Reinheit.
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(v) Reversionstest
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Dieser
Test wies das Ausbleiben einer Reversion des Toxoids zu Toxin während der
Lagerung oder des Gebrauchs nach und erfüllt die Anforderungen der Technischen
Berichtsreihe der WHO Nr. 725, Seite 67. 10 ml an diafiltriertem
Toxoid-Material wurden genommen und bei 5 ± 3°C gelagert, bis der Lf-Gehalt
wie obenstehend beschrieben geschätzt wurde. Die Probe wurde
auf 16 Lf/ml verdünnt.
Die verdünnte
Probe wurde auf 37°C
gehalten. Die Probe wurde nach einer Lagerung von 6 Wochen, 2 Monaten
und 3 Monaten auf Nicht-Toxizität
untersucht. 5 ml der Probe wurden subkutan in jedes von 2 gesunden
Meerschweinchen eingeimpft. Die Tiere wurden 14 Tage lang hinsichtlich
einer Todesfolge oder von Anzeichen einer spezifischen Paralyse
beobachtet. Es gab keinen Hinweis auf eine Reversion zu Toxin.
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(vi) Charakterisierung von Toxoid durch
elektrophoretische Mobilität
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In
diesem Test wurde die Potenz des toxoidierten Materials vorausgesagt.
0,5 ml diafiltriertes Toxoid-Material wurden für den Test hergenommen. Die
Probe wurde bei 5 ± 3°C gelagert,
wenn sie nicht unmittelbar untersucht wurde. Glasplatten wurden mit
1% (v/v) Agarose in 60 mM Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 überzogen
(0,18 ml/cm2). Die Proben (5 ul) wurden
in der ersten Dimension mit 20 Volt/cm 60 Minuten lang einer Elektrophorese
unterzogen. Die Elektrophorese in der zweiten Dimension in Agarose,
die Pferde-Antitetanusserum enthielt (0,06% v/v), wurde bei 6 Volt/cm
16 Stunden lang durchgeführt.
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Das
Gel wurde mit Coomassieblau gefärbt, und
es wurde die Mobilität
des Toxoidpeaks ab dem Ausgangspunkt gemessen. Die Resultate, einschließlich des
Resultats für
ein Referenz-Toxoid (14 mm), waren 5–30 mm.
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(vii) Untersuchung der Potenz
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Dieser
Test erfüllt
die Anforderungen der ”British
Pharmacopoiea” (amtliches
britisches Arzneibuch) (1980), Band II, Seite 880, Ph. Eur., Anhang
zu Band III (1977), Seite 175, und der Technischen Berichtsreihe
der WHO Nr. 638, Seite 90, Abschnitt A.3.5.6. Die Potenz wurde anhand
der Reaktion auf die Immunisierung mit einem Impfstoff, welcher
durch Adsorption des toxoidierten Materials an einem Hilfsmittel
(Aluminiumhydroxid, Alhydrogel) hergestellt wurde, bestimmt.
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Eine
Probe aus einem Transportbehälter
einer am Ende erhaltenen Masse von adsorbiertem Impfstoff wurde
für den
Test herangezogen. Die Probe wurde bei 5°C ± 3°C gelagert, wenn sie nicht unmittelbar
untersucht wurde. Die Probe wurde durch das in Ph. Eur., Anlage
zu Band III (1977), Seite 175, beschriebene Verfahren untersucht.
Die Potenz wurde mit 130 bis 270 Iu/3,5 Lf ermittelt, was wesentlich höher ist
als die Potenz von 70–110
Iu/7 Lf des gebräuchlichen
Impfstoffs, welcher durch Toxoidierung mit Formaldehyd und anschließendes Reinigen
des Toxoids hergestellt wird.
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(viii) Untersuchung der spezifischen Toxizität
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Dieser
Test basiert auf den Anforderungen der ”British Pharmacopoiea” (amtliches
britisches Arzneibuch) (1988), Band II, Seite 1062; Ph. Eur., 1985,
Seite 452, und der Technischen Berichtsreihe der WHO Nr. 638, Seite
90, Abschnitt A.3.5.5. Der Test wies das Fehlen einer nachweisbaren
Toxizität nach,
die auf das Tetanus-Toxoid zurückzuführen ist. Nicht
weniger als 12,5 ml toxoidiertes Material wurden für den Test
hergenommen. Die Probe wurde bei 5°C ± 3°C gelagert, wenn sie nicht unmittelbar
untersucht wurde. Das Verfahren basierte auf dem in Ph. Eur., 1985,
Seite 452, beschriebenen. 1 ml einer Verdünnung, die mindestens 500 Lf-Einheiten
Tetanus-Toxoid enthielt, wurde subkutan in jedes von fünf normalen
Meerschweinchen injiziert, die jeweils ein Gewicht von 250 g–350 g hatten.
Die Tiere wurden 21 Tage lang auf Anzeichen einer spezifischen Toxizität oder Paralyse
hin beobachtet. Es gab keine Hinweise auf Toxizität, die auf
Tetanus-Toxoid zurückzuführen ist.
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Vergleichsbeispiel 1: Toxoidierung in
Abwesenheit von Lysin
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Das
gereinigte Tetanus-Toxin des Referenzbeispiels wurde unter Zugabe
lediglich von Formalin toxoidiert. 0,25–1,0% Formaldehyd in der Form
von Formalin wurden mit Toxin mit 200 Lf/ml 14 Tage lang bei 37°C ± 2°C inkubiert.
Es wurde daher kein Lysin hinzugegeben.
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Die
resultierenden Toxoide wurden auf eine Reversion wie in dem Beispiel
beschrieben untersucht. Die Toxoide unterlagen der Reversion zur
Toxizität.
Die der Reversion unterliegenden Toxoide führten in der Tat selten zu
einem klassischen Tetanus, erzeugten aber ein anderes neurologisches Syndrom.
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Vergleichsbeispiel 2: Toxoidierung in
Gegenwart von Lysin unter verschiedenen Bedingungen
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Das
gereinigte Tetanus-Toxin des Referenzbeispiels wurde wie folgt toxoidiert:
- (i) Gereinigtes Tetanus-Toxin aus dem Referenzbeispiel
wurde mit ausreichend SBSA-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 unter
Erhalt einer letztendlichen Toxinkonzentration von 200 Lf/ml verdünnt. 0,1
bis 1,0% Formaldehyd, in der Form von Formalin, wurden einer Aliquote
hinzugegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert.
L-Lysin-monohydrochlorid wurde anschließend einer Endkonzentration
von 0,005 bis 0,1 M in Gegenwart von 0,1 M Natriumbicarbonat hinzugegeben.
Der pH-Wert der Reaktionsmischung war 6,5 bis 7,5, und die Toxoidierung
wurde 14 Tage lang bei 37°C
weiterlaufen gelassen.
- (ii) Wie (i), jedoch wurde der pH-Wert der Toxoidierungsreaktion
von 6,0 zu 8,5 verändert.
- (iii) Wie (i), jedoch wurde Arginin (0,05 bis 0,1 M) an Stelle
von Lysin verwendet.
- (iv) Wie (i), jedoch wurde der Inkubationszeitraum von 14 Tagen
auf 21 Tage erhöht.
- (v) Wie (i), jedoch ohne Vorinkubationszeit.
-
Alle
resultierenden Toxoide wurden auf eine Reversion wie in dem Beispiel
beschrieben untersucht. Die Toxoide unterlagen einer Reversion zur Toxizität.