DE69328459T2

DE69328459T2 - Vorbereitung von Nukleinsäure aus mononuklearen Zellen

Info

Publication number: DE69328459T2
Application number: DE69328459T
Authority: DE
Inventors: Daniel Louis Kacian; Thomas B. Ryder
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1992-06-08
Filing date: 1993-06-08
Publication date: 2000-09-07
Anticipated expiration: 2013-06-09
Also published as: EP0574227B1; ATE192196T1; AU4530893A; AU5207698A; EP0574227A2; JP3494646B2; EP0574227A3; CA2137563C; KR950701979A; WO1993025710A1; DE69328459D1; DK0574227T3; AU5207498A; AU706083B2; CA2137563A1; ES2145030T3; US5639599A; JPH07507458A; AU713753B2; AU687352B2

Description

Vorbereitung von Nukleinsäure aus mononukleären Zellen

Hintergrund der Erfindung

Das Gebiet der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Nukleinsäure für Studien, die Forschung und Untersuchungen.
Häufig ist es erforderlich, daß Nukleinsäure isoliert und aus verschiedenartigen Geweben aufgereinigt (d. h. präpariert) wird, um das Vorhandensein einer bestimmten Nukleinsäure - zum Beispiel das Vorhandensein von HIV-1-DNA oder -RNA in einer Blutzelle eines Menschen - nachzuweisen. Zu diesem Zweck wird die Nukleinsäure im allgemeinen nach einer extensiven Reinigung geeigneter Blutzellen, der Lyse dieser Zellen und der Reinigung der freigesetzten Nukleinsäuren, um Substanzen zu entfernen, welche später die analytischen Verfahren hemmen könnten, extrahiert. Insbesondere ist es wichtig, Nukleinsäure mit einer Qualität und Reinheit herzustellen, welche ihre Amplifikation gestattet.
"PCR Protocols" (Academic Press 1990), Kapitel 18, Seiten 146-152 diskutiert die Trennung mononukleärer Zellen aus Gesamtblut unter Verwendung einer Dichtegradientenzentrifugation und die Freisetzung von DNA oder RNA aus den so getrennten Zellen für eine Amplifikation. Biotechniques (1991) Band 10, Nr. 4, 506-513 diskutiert die Extraktion von DNA für die Amplifikation aus Proben vom forensischen Typ, z. B. aus Blutflecken und anderen Blutproben, bei einer hohen Temperatur und in Gegenwart eines mit Metallionen chelatbildenden Harzes, um einen Abbau der DNA zu verhindern.
Zwei verbreitete Verfahren, welche die Amplifikation einer spezifischen Sequenz einer Nukleinsäure gestatten (z. B. Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA)), wobei eines als die "Polymerase-Ketten-Reaktion" bezeichnet wird (worin zwei Primer verwendet werden, um Nukleinsäure, welche zwischen den Bereichen liegt, an welche die Primer hybridisieren, zu synthetisieren) und eines, welches RNAse H, reverse Transkriptase und RNA-Poymerase verwendet. Diese Verfahren werden in dem US-Patent 4 683 202 (Mullis et al.) bzw. in PCT/US90/03 907 (Veröffentlichungs-Nr. WO 91/01 384; Kacian et al.) beschrieben.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Amplifizieren einer Zielsequenz in einer Nukleinsäure, welche von Zellen wie mononukleären Zellen (z. B. T-Lymphozyten und/oder Monozyten) stammt, worin ein Eisen(III)- Ionen komplexierendes Mittel, spezifischer Deferoxamin, Sideramin, Sideramycin oder Ferrimycin in der Amplifikations-Mischung verwendet wird, um die Amplifikation einer beliebigen vorhandenen Zielsequenz zu verbessern. Auf eine solche Weise amplifizierte Nukleinsäure kann für verschiedenartige Zwecke verwendet werden, einschließlich des Screenens der Nukleinsäure auf das Vorhandensein viraler Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung einer Sonde, welche komplementär zu einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz des Virus ist. Es ist ebenfalls nützlich für den Nachweis genetischer Anomalien oder Defekte in der Nukleinsäure. Entsprechendermaßen sind die Verfahren und Kits der Erfindung entworfen, um eine schnelle und einfache Herstellung von Nukleinsäure ohne die Notwendigkeit extensiver Reinigungsverfahren zu gestatten.
Daher verkörpert die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure aus Zellen und ihr Inkorporieren in einer Amplifikations- Mischung, wie vorausstehend diskutiert.
Eine verschiedenartige Zellen enthaltende Probe (z. B. Gesamtblut) und ein geeignetes Zentrifugationsmedium werden zentrifugiert, um zu bewirken, daß sich eine Population von mononukleären Zellen in einer diskreten Schicht ansammelt. Diese Schicht ist getrennt und verschieden vom Rest der Zellen und dem Dedritus in der Probe, außer einer kleinen Menge von Plättchen und/oder Lipiden oder anderen Komponenten niedriger Dichte oder anderen löslichen und suspendierten Bestandteilen. Überraschenderweise verhindert das Vorhandensein von Plättchen und anderen Komponenten nicht die Amplifizierung von in diesem Verfahren gereinigter Nukleinsäure.
Bevorzugtermaßen schließt die Population von Zellen mononukleäre Zellen aus Gesamtblut ein. Die Zellen können jedoch aus anderen Quellen stammen, wie der Pleuralflüssigkeit, der Synovialflüssigkeit oder einer In-Vitro-Quelle von Zellen. Die Zellen oder die Probe von Zellen muß nur einer Zentrifugation zur Trennung zugänglich sein oder in einem Zustand, um lysiert werden zu können (wie nachstehend diskutiert) und dann effektiv in späteren Reaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden. Das Zentrifugationsmedium kann isotonisch und/oder isopyknisch zu den Zellen sein und ist bevorzugtermaßen von einer intermediären Dichte zwischen derjenigen der erwünschten Zellen und derjenigen der anderen Zellen in der Probe.
Die Zellen werden aus der Zentrifugationszusammensetzung entfernt, zum Beispiel durch Absaugen unter Verwendung einer Pipette und lysiert. Eine solche Lyse macht die Nukleinsäure, welche mit den Zellen assoziiert ist, für die Amplifikation zugänglich. Zu diesem Zweck kann ein Lysiermittel verwendet werden. Die Verwendung eines starken Alkali wie KOH, NaOH oder LiOH wird bevorzugt. Eine solche Lyse denaturiert ebenfalls jedwede doppelsträngige Nukleinsäure aus den Zellen, wodurch sie eine Amplifikation erleichtert. Alternativerweise kann eine Beschallungsdisruption verwendet werden, um die Zellen zu lysieren.
Das Verfahren schließt das Zugeben eines Komplexierungsmittels ein, welches mit Eisen(III)-Ionen (Fe+&spplus;&spplus;) komplexiert und sie aus der Lösung in einer wirksamen Weise entfernt, bevor die Nukleinsäure amplifiziert wird. Die Gegenwart von Eisen(III)-Ionen interferiert mit bestimmten enzymatischen Verfahrensweisen, wie denjenigen, welche für die Amplifikation von Nukleinsäure verwendet werden. Das Komplexierungsmittel wird bevorzugtermaßen so ausgewählt, daß es nicht mit Zinkionen (Zn&spplus;&spplus;), Manganionen (Mn&spplus;&spplus;) oder Magnesiumionen (Mg&spplus;&spplus;) komplexiert, da diese Ionen nützlich sind und dazu tendieren, diese enzymatischen Reaktionen zu erleichtern. Ein solches Mittel wird ausgewählt aus den Komplexierungsmitteln Deferoxamin (ebenfalls bekannt als Desferrioxamin und Desferrioxamin B), Sideramin, Sideramycin und Ferrimycin. Bevorzugtermaßen wird Deferoxamin verwendet.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann ein zweites oder ein anderes Komplexierungsmittel zugegeben werden, welches mit Calciumionen (Ca&spplus;&spplus;) oder anderen Ionen komplexiert, welche mit einer Amplifizierungsreaktion oder anderen Reaktionen, welche mit dem Lysat der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, interferieren. Calciumionen können ebenfalls mit enzymatischen Reaktionen, welche in Amplifizierungsverfahren verwendet werden, interferieren. Das zweite Komplexierungsmittel wird am meisten zu bevorzugen so ausgewählt, daß es nicht mit Zinkionen oder Magnesiumionen komplexieren kann, oder eine höhere Affinität für unerwünschte Ionenspezies (wie Fe&spplus;&spplus;&spplus; und Ca++) hat als für erwünschte Ionenspezies (wie Zn&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus; und Mg&spplus;&spplus;).
In noch mehr zu bevorzugenden Ausführungsformen können Zinkionen, Manganionen oder Magnesiumionen zu der Lösung hinzugegeben werden, um die enzymatischen Reaktionen zu erleichtern.
Daher stellt die Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäure dar, in welchem die zu amplifizierende Nukleinsäure in einer Lösung mit Eisen(III)-Ionen hergestellt wird, und diese Eisen(III)-Ionen werden auf eine wirksame Weise aus dem Gemisch durch die Verwendung eines Komplexierungsmittels entfernt, ausgewählt aus Deferoxamin, Sideramin, Sideramycin und Ferrimycin, so daß eine Amplifikation auftreten kann. Die Lösung kann ebenfalls Calciumionen enthalten, welche bevorzugtermaßen ebenfalls aus der Lösung durch ein Komplexierungsmittel entfernt werden, so daß eine Amplifizierung auftreten kann.
Wenn die Nukleinsäure einmal amplifiziert worden ist, sind Verfahren im Fachbereich bekannt, um die amplifizierte Nukleinsäure unter Verwendung bekannter Techniken zur Nukleinsäure-Hybridisierung und zum -Nachweis zu screenen. Zum Beispiel unter Verwendung einer Nukleinsäuresonde, welche komplementär zu einer Zielsequenz ist (welche bevorzugtermaßen die Sequenz einschließt, auf welche zur Amplifikation abgezielt wurde) das Hybridisieren der Sonde an die Zielsequenz der Nukleinsäure und dem Nachweis des Komplexes von Sonde und Ziel durch wohlbekannte Verfahren wie Southern- oder Northernblots oder durch das Verfahren in homogener Lösungsphase (homogeneous solution phase procedure; "HPA") beschrieben in Arnold et al., Clin. Chem.; 35: 1 588 (1989) und PCT/U588/02746.
Durch die Verwendung eines solchen Sondennachweisverfahrens kann bestimmt werden, ob eine virale Nukleinsäure wie diejenige von HIV oder von Hepatitis B Virus (HBV) mit der in der Probe vorhandenen Nukleinsäure assoziiert ist. Ein solches Screenen kann ebenfalls auf jedwede andere Art von Nukleinsäuresequenz abzielen, wie eine genetische Anomalie oder einen Defekt. Die Verwendung von solchen Amplifikationsverfahren gestattet es, daß selbst eine einzelne Kopie der Nukleinsäure, auf welche abgezielt wird, in dem Anteil der nach dem Zentrifugieren gewonnenen Probe unter Verwendung der vorliegenen Erfindung nachgewiesen werden kann.
Es ist ein weiteres Merkmal der Erfindung Kits für das Ausführen von Verfahren in Übereinstimmung mit der Erfindung bereitzustellen. Ein solcher Kit wird ein Komplexierungsmittel für Eisen(III)-Ionen einschließen, welches Deferoxamin, Sideramin, Sideramycin oder Ferrimycin ist, und eine oder mehrere Komponenten ausgewählt aus:
(a) einem Zentrifugationsmedium (und einem osmotischen Mittel falls nötig),
(b) einem lysierenden Mittel, welches ausreicht, um aus der Probe getrennte Zellen zu lysieren; und
(c) Amplifikationsmaterialien, welche ausreichen, um die Zielnukleinsäuresequenz zu amplifizieren. Ein solcher Kit kann ebenfalls ein Komplexierungsmittel für Calciumionen einschließen und einen Vorrat einer Sonde für eine gewünschte Zielnukleinsäure oder eine bekannte genetische Anomalie.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen ersichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Die Fig. 1 ist ein Graph, welcher die Zahlen der roten Blutzellen, die Hämatokritwerte und die Plasmadichte von 66 unterschiedlichen Individuen zeigt.
Die Fig. 2 ist ein Diagramm, welches die Wirkungen einer Zinktitration gemeinsam mit Deferoxamin auf die Amplifikation zeigt.
Die Fig. 3 ist ein Diagramm, welches die Wirkungen von Polyethylenimin (PEI) und Deferoxamin auf die Amplifikation zeigt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz in einer Amplifikations-Mischung bereit, wobei diese Mischung ein erstes Komplexierungsmittel einschließt, welches in der Lage ist, Eisen(III)-Ionen zu komplexieren, wobei das erste Komplexierungsmittel gewählt wird aus Deferoxamin, Sideramin, Sideramycin und Ferrimycin, so daß die Amplifikation der Zielsequenz in dem Gemisch mehr amplifizierte Nukleinsäure ergibt, als wenn das erste Komplexierungsmittel von dem Gemisch abwesend ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Amplifikations-Mischung zur Nukleinsäureamplifikation vor, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Zentrifugieren einer Zusammensetzung, umfassend ein Zentrifugationsmedium und eine Probe von Blutzellen, umfassend mononukleäre Zellen, unter Zentrifugationsbedingungen, so daß sich ein wesentlicher Anteil der mononukleären Zellen in der Zusammensetzung in einer diskreten Bande sammelt;
(b) Trennen der diskreten Bande von der Zusammensetzung;
(c) Lysieren der mononukleären Zellen in der diskreten Bande durch
(i) Zufügen eines lysierenden Mittels zu der Bande, oder
(ii) Aussetzen der Bande einer Beschallungs-Disruption, so daß die mononukleären Zellen in der Bande lysieren, wodurch die Nukleinsäure für eine Amplifikation verfügbar gemacht wird;
(d) Zufügen eines ersten Komplexierungsmittels zu der Bande, das in der Lage ist, Eisen(III)-Ionen zu komplexieren, wobei das erste Komplexierungsmittel aus Deferoxamin, Sideramin, Sideramycin und Ferrimycin gewählt wird; und
(e) Unterziehen der Nukleinsäure ausreichenden Bedingungen, um die Zielnukleinsäuresequenz zu amplifizieren.

Erhalten einer Probe von Zellen

Eine Probe von Zellen kann bereitgestellt werden durch jedwede geeignete Quelle wie aus Gesamtblut oder aus Synovialflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit oder anderen Flüssigkeiten, welche Zellen von Interesse enthalten. Bevorzugtermaßen umfaßt die Probe mononukleäre Zellen in gerinnungshemmend behandeltem Gesamtblut, welches von jedwedem Tier, einschließlich einem menschlichen Wesen, erhalten werden kann. Das Blut kann vorbehandelt werden falls gewünscht, z. B. um rote Blutzellen und/oder Fibrin zu entfernen, vorausgesetzt, daß die mononukleären Zellen (oder die anderen Zellen von Interesse) in der Flüssigkeit verbleiben. Andere Blutfraktionen oder jedwede anderen Flüssigkeiten, welche Zellen von Interesse enthalten können verwendet werden.
Das Blut oder die andere Quelle einer Probe von Zellen kann unter Verwendung eines jedweden verfügbaren Verfahrens erhalten werden, einschließlich der im Fachbereich bekannten. Die Probe kann erhalten und gelagert werden und selbst einer Zentrifugation in derselben Vorrichtung unterzogen werden. Falls die Probe Blut ist, kann es wünschenswert sein, die Probe mit einem gerinnungshemmenden Mittel wie EDTA, Citrat, Oxalat oder Heparin zu behandeln, so daß das Blut nicht gerinnt, bevor der Rest des Verfahrens durchgeführt wird, oder während der Verwendung des Rests der Materialien und des Apparates in dem Kit.

Herstellung der Zusammensetzung

Es ist nützlich, eine Zusammensetzung der Probe und einem Zentrifugationsmedium so zu machen, daß nach dem Zentrifugieren die mononukleären Zellen sich in einer diskreten Bande sammeln. Mit "Sammeln in einer diskreten Bande" meint man, daß die gewünschten Zellen in einer effektiven Weise durch die Zusammensetzung bis zu einem bestimmten Dichteniveau wandern und von dem Rest der Zellen und anderem Dedritus in der Zusammensetzung hinreichend getrennt sind, so daß die späteren Enzymreaktionen, wie die Amplifikation, voranschreiten können. Solche Zentrifugationsmedien sind im Fachbereich bekannt. Siehe z. B. Percoll Methodology and Applications Desity Marker Beads for Calibration of Gradients of PERCOLL®, veröffentlicht von Pharmacia Laboratory Separation Division, Uppsala, Schweden; Sepracell-MN® Trennungshandbuch, veröffentlicht von Sepratech Corp., Oklahoma City, Oklahoma; NYCOMED® Density Gradient Media, veröffentlicht von Nycomed, Oslo, Norwegen. Das Zentrifugationsmedium kann isotonisch zu den Zellen der Probe sein und kann ebenfalls im allgemeinen isopyknisch zu den Zellen von der Probe sein oder bevorzugtermaßen von einer Dichte, welche intermediär zu der von der Zellpopulation von Interesse und den anderen Zellpopulationen in der Probe ist. Das Zentrifugationsmedium und die Probe von Zellen können vor der Zentrifugation gemischt werden, so daß es keinen Dichtegradienten vor der Zentrifugation gibt. Mit "isopyknisch" meint man, daß das Zentrifugationsmedium etwa von derselben Dichte wie die Zellen in der Probe ist, so daß bei dem Zentrifugieren die gewünschten Zellen von der Probe sich von dem Rest des Gemisches trennen werden, wobei dieser Rest im Fall einer Probe aus Gesamtblut rote Blutzellen und andere weiße Blutzellen enthalten wird. Alternativerweise kann die Zusammensetzung als ein Dichtegradient vor oder während der Zentrifugation gebildet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung differentieller Ausschlußdichtezentrifugation wird die Probe von Zellen mit einem Zentrifugationsmedium so gemischt, daß die resultierende Dichte intermediär zwischen der Auftriebsdichte der Zellpopulation von Interesse und der der anderen Zellpopulationen in der Probe liegt. Zum Beispiel ist die Dichte der Mischung größer als die Auftriebsdichte mononukleären Zellen und geringer als die Auftriebsdichte der roten Blutzellen und Granulozyten in einer Probe von Gesamtblut. In dieser Ausführungsform wird das Zentrifugationsgemisch einer Zentrifugation so unterzogen, daß die mononukleären Zellen zu dem Meniskus in einer relativ engen Bande "flottieren". Die Zentrifugation einer solchen Mischung während einer längeren Zeit als zum Beispiel derjenigen, in welcher das isopyknische Gleichgewicht erreicht wird, wird zu einer breiteren Bande oder zu Banden von gewünschten Zellen führen.
Eine differentielle Ausschlußzentrifugation oder andere Zentrifugationsverfahren innerhalb des Umfangs der Erfindung können ohne übermäßiges Experimentieren im Licht der vorliegenden Beschreibung für andere Zellen als mononukleäre Zellen aus Gesamtblut angepaßt werden.
Ein Zentrifugationsmedium mit einer Dichte zwischen 1,105 und 1,115 Gramm pro Milliliter kann zum Beispiel verwendet werden.
Im allgemeinen ist die gewünschte Enddichte des Zentrifugationsgemisches etwa 1,077 Gramm pro Milliliter Flüssigkeit, um mononukleäre Zellen zu trennen. Jedoch wird die Dichte des Zentrifugationsmediums variieren gemäß der Osmolarität, dem Typ und dem Volumen der Zellen in der Probe.
Mit "isotonisch" meint man, daß die Zusammensetzung, wenn sie einmal gemacht ist, etwa isotonisch zu den mononukleären Zellen der Probe ist, so daß weniger als 20% der mononukleären Zellen zufolge der Effekte eines osmotischen Unterschiedes aufbrechen. Im allgemeinen wird dieser isotonische Zustand durch die Verwendung eines osmotischen Mittels erreicht, wie zum Beispiel Sucrose, Sorbitol oder Mannitol oder eines geeigneten Salzes, z. B. Natriumchlorid oder Natriumglutamat. Ein geeignetes Salz ist ein Salz, das nicht auf eine andere Weise mit der Durchführung des Verfahrens interferiert, entsprechendermaßen ist ein Salz, welches in einer effektiven Weise die Amplifikation der Nukleinsäure verhindert, nicht wünschenswert. Es ist manchmal vorteilhaft, wenn das osmotische Mittel die Ionenkonzentration in dem Gemisch nicht erhöht, z. B. so, wie wenn das osmotische Mittel Sucrose ist.
Das Zentrifugationsmedium kann bevorzugtermaßen direkt in der Probe wie Blut verwendet werden und lysiert die Zellen in der Probe nicht. Das Zentrifugationsmedium kann kolloidales Silica oder kolloidales mit Polyvinylpyrrolidon beschichtetes Silica umfassen. Ein Zentrifugationsmedium, hergestellt mit einer Verbindung mit iodierten Benzoesäurederivaten, kann verwendet werden. Einige Beispiele nützlicher Zentrifugationsmedien schließen PERCOLL, SEPRACELL-MN und NYCO-DENZ ein. Andere nützliche Medien, einschließlich von Ficoll-hypaque oder Ficoll-isopaque werden typischerweise durch das Schichten anstelle des Mischens verwendet. Falls zum Beispiel das Zentrifugationsmedium weiße Blutzellen lysiert, dann kann Nukleinsäure vorzeitig freigesetzt werden. Falls rote Blutzellen lysiert werden, setzen sie Hämoglobin und daher eine Quelle von Eisen(III)-Ionen frei, welche mit den späteren Amplifikationsreaktionen interferieren. Es wird bevorzugt, daß das Zentrifugationsmedium gestattet, daß mehr als oder gleich etwa 50%, wünschenswerterweise wenigstens 80% der mononukleären Zellen, die in der Probe von Gesamtblut enthalten sind, nach der Zentrifugation gewonnen werden können.

Zentrifugation

Das Gemisch wird dann einer Zentrifugation unterzogen, so daß die gewünschten Zellen sich in einer effektiven Weise bewegen, um eine diskrete Bande isolierter Zellen zu bilden. Im Fall einer isopyknischen Zentrifugation oder einer Zentrifugation, welche Zentrifugationsmedien verwendet, die intermediär zwischen der der gewünschten Zellpopulation und der von anderen Zellen in der Probe liegen, bewegen sich die gewünschten Zellen in einer effektiven Weise in Richtung auf das Ende des Zentrifugenröhrchens, welches auf das Zentrum der Rotation gerichtet ist, während sie zur Oberfläche des Zentrifugationsmediums aufsteigen, um einen oberen, isolierte Zellen enthaltenden Anteil gemeinsam mit einigen Plättchen und/oder Lipiden und anderen Bestandteilen zu bilden.
In einem Beispiel wird das Gemisch bei etwa 2 900 U/min während etwa 20 min (etwa 1 500 x g) zentrifugiert. Die Zentrifugation ist sanft genug, daß die Zentrifugation keinen wesentlichen Anteil oder signifikanten Prozentsatz der Zellen veranlaßt, zu lysieren, was bedeutet, daß hinreichend wenige Zellen lysieren, daß die Amplifikation von Nukleinsäure, welche von intakten Zellen gewonnen wird, voranschreiten kann.
Die Zentrifugation kann in einem Zentrifugenröhrchen durchgeführt werden, worin der Anteil des Röhrchens in der Nähe der diskreten Bande (z. B. der Teil des Röhrchens in der Nähe des Zentrums der Rotation einer isopyknischen Zentrifugation) so geformt ist, daß er den Anteil der Zusammensetzung betont, welche die gewünschten Zellen, wie mononukleäre Zellen, enthält. Dies kann zum Beispiel durch das Verengen des Innendurchmessers des Röhrchens gemacht werden. Des weiteren kann die Zentrifugation unter Verwendung einer Vorrichtung durchgeführt werden, welche eine Turbulenz und daher ein Mischen, während die Zusammensetzung hergestellt wird, während des Durchführens der Zentrifugation und/oder während des Entfernens der isolierten gewünschten Zellen, hemmen wird. Ein Beispiel für eine solche Vorrichtung ist ein poröser Nylonfilter, welcher es erwünschten Zellen gestattet, durch ihn hindurchzutreten. Bevorzugtermaßen wird die aus den erwünschten Zellen gebildete Bande 20% oder weniger, mehr zu bevorzugen 10% oder weniger des Gesamtvolumens der Zusammensetzung umfassen. Bevorzugtermaßen wird sie wenigstens 20%, mehr zu wünschen, wenigstens 30% in der Zusammensetzung vorhandenen mononukleären Zellen umfassen.

Entfernen des Anteils, welcher die erwünschten Zellen enthält

Nach der Zentrifugation kann der Anteil an Flüssigkeit, welcher die erwünschten Zellen (die diskrete Bande) enthält von dem Rest des Gemisches unter Verwendung eines jeden, im Fachbereich bekannten Mittels entfernt werden, wie durch das Absaugen des Anteils unter Verwendung einer Pipette. Im allgemeinen wird weniger als etwa 20% des ursprünglichen Gesamtvolumens entfernt, z. B. etwa 500 ul von 6 ml und bevorzugtermaßen nur etwa die 100 ul an der Oberfläche am oder in der Nähe des Meniskus.

Lysieren der erwünschten Zellen

Nach dem Entfernen der isolierten, erwünschten Zellen werden die Zellen lysiert, um die Nukleinsäure aus den Zellen oder welche mit den Zellen assoziiert ist, freizusetzen. Das bedeutet jedwede Nukleinsäure, entweder anhaftend an oder gefunden wird innerhalb der oder auf den erwünschten Zellen.
Die Zellen können durch jedwedes gewünschte Verfahren lysiert werden, einschließlich zum Beispiel von der Verwendung eines starken Alkali, der Verwendung eines enzymatischen Mittels, der Verwendung eines Detergens, der Verwendung eines osmotischen Schocks, der Verwendung chaotroper Konzentrationen von gelösten Stoffen oder der Verwendung einer Beschallungsdisruption. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Zellen unter Verwendung von Kaliumhydroxid lysiert werden. Dieses Alkali oder ein äquivalentes Alkali, z. B. NaOH, (CH&sub3;)&sub4;NOH oder LiOH ist besonders nützlich, da es ebenfalls zelluläre Nukleasen inaktiviert und so eine Hemmung von späteren enzymatischen Reaktionen unter Verwendung der durch Alkali induzierten Lysate verhindert und ebenfalls doppelsträngige Nukleinsäure denaturieren kann.

Zugabe eines chelatbildenden Mittels

Ein Mittel, welches mit einem Eisen(III)-Ion und/oder einem Calciumion und/oder anderen unerwünschten Ionen komplexiert, kann zu dem Dichtezentrifugationsmedium oder zu der Lösung während oder nach der Lyse zugegeben werden. "Komplexiert" bedeutet, daß das Mittel sich selbst in einer wirksamen Weise an das Ion anheftet, sei es durch Chelatbildung, Koordination, kovalente Bindung oder eine andere Form der Bindung oder der Anheftung, so daß das Ion nicht länger die spätere Amplifikationsreaktion der Erfindung verhindern kann. Diese Ionen werden aus der von der Lyse resultierenden Lösung entfernt, weil sie Enzyme inhibieren können, welche in anderen Schritten des Verfahrens verwendet werden können, wie der Amplifkation der Nukleinsäure aus mononukleären Zellen.
Bevorzugtermaßen ist das Komplexierungsmittel ein chelatbildendes Mittel, das solche Ionen aus der Lösung entfernt, das aber nicht in einer signifikanten Weise an Zinkionen oder an Magnesiumionen bindet, da diese Ionen nützlich für einige Reagenzien sind, welche in der späteren Amplifikationsreaktion verwendet werden können, siehe im allgemeinen Zinc in DNA Replication and Transcription, Wu, F. Y. H. und Wu, C. W., Ann. Rev. Nutr. 7: 251 (1987).
Beispiele für chelatbildende Mittel, welche verwendet werden können, sind Deferoxamin und Transferrin. Deferoxamin hat eine Bindungskonstante von 10³¹ für das Eisen(III)-Ion, siehe Antioxidant Capacity of Desferrioxamin and Ferrioxamin in the Chemically-Initiated Lipid Peroxidation of Rat Erythrocyte Ghost Membranes, Videla, C. A., et al., Biochem Int'l., 16, 799 (Mai 1988), bindet jedoch weder in einer spezifischen Weise an Zink- noch an Magnesiumionen. Beispiele für Komplexierungsmittel für Calciumionen sind Oxalat und Citrat. Oxalat und Citrat binden ebenfalls Fe&spplus;&spplus;&spplus; mit einer größeren Stabilität verglichen mit Mg&spplus;&spplus;, insbesondere bei einem neutralen - alkalischen pH. Andere Mittel wie EDTA sind keine bevorzugten chelatbildenden Mittel, da sie Zinkionen und Magnesiumionen zusammen mit anderen divalenten Kationen binden.
Einige nützliche chelatbildende Mittel haben das Potential wünschenswerte Ionen zu binden (z. B. Mg&spplus;&spplus;, Zn&spplus;&spplus;), können aber nützlich sein, falls sie nicht wünschenswerte Ionen bevorzugt binden. Zum Beispiel bindet EGTA Ca&spplus;&spplus; bevorzugt gegenüber Mg&spplus;&spplus;. Daher wird, falls die Konzentration von EGTA geringer ist als die Konzentration von Mg&spplus;&spplus;, es immer noch eine wünschenswerte und vorausbestimmbare Aktivität von freiem Mg&spplus;&spplus; geben, aber Spurenmengen von Ca&spplus;&spplus; werden in einer wirksamen Weise maskiert. Darüber hinaus wird, falls ein solcher Chelatbildner mit einer erwünschten Spezies wie Mg&spplus;&spplus; gemischt wird, bevor er zu der Reaktion von Interesse hinzugegeben wird, die freie Aktivität von Mg&spplus;&spplus;, welche zu der Reaktion aus anderen Quellen beigetragen wird, nicht durch die Zugabe des komplexierten Chelatbildners reduziert, sondern der Chelatbildner kann in einer wirksamen Weise bevorzugt gebundene Spezies wie Ca&spplus;&spplus; maskieren, insbesondere falls die Assoziations- /Dissoziationsraten relativ schnell sind.
Die Verwendung eines chelatbildenden Mittels ist insbesondere hilfreich, wenn ein gerinnungshemmendes Mittel zuvor in dem Verfahren verwendet worden ist, da die Verwendung eines solchen gerinnungshemmenden Mittels die Freisetzung von Eisen(III)- Ionen verursachen oder gestatten kann.
Spätere Reaktionen wie die Amplifikation unter Verwendung des Lysates kann ebenfalls durch eine Vielzahl von Polyanionen gehemmt werden. Die Bereitstellung einer wirksamen Menge eines Polykations wie Polyethylenimin (PEI) kann solche Polyanionen neutralisieren. Eine wirksame Menge eines solchen Polykations ist diejenige Menge, die nötig ist, um die Hemmung durch ein Polyanion zu reduzieren. Es ist überraschend, daß ein Polykation wie PEI eine solche nützliche Wirkung haben würde, da Nukleinsäuren selbst dicht geladene Anionen sind.

Amplifikation von Nukleinsäure aus erwünschten Zellen

Die Nukleinsäure kann nun unter Verwendung jedweden, im Fachbereich bekannten Verfahrens amplifiziert werden, wie einem Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren oder einem Verfahren, beschrieben von Kacian, supra unter Verwendung von RNAse H, reverser Transkriptase und RNA-Polymerase. Bevorzugtermaßen wird die Amplifikation auf dieselbe Sequenz einer Nukleinsäure abzielen, die das Ziel der nachstehend diskutierten Sonde ist. Die Amplifikation der Nukleinsäure kann durchgeführt werden an der Nukleinsäure aus den gewünschten Zellen, ohne entweder zuerst den Debris aus der Zentrifugation und der Lyse zu entfernen, oder in einer anderen Weise ein "Aufreinigen" des die isolierten erwünschten Zellen enthaltenden Anteils als einem Herstellen der chemischen Balance der Lösung, die einer Amplifikation unterzogen werden soll, in einer geeigneten Weise, zum Beispiel durch Neutralisieren des lysierenden Mittels wie Kaliumhydroxid.

Screenen nach einer erwünschten Nukleinsäure

Die amplifizierte Nukleinsäure ist nun bereit, auf eine gewünschte Sequenz einer Nukleinsäure hin gescreent zu werden, unter Verwendung jedweden im Fachbereich bekannten Verfahrens oder anderen verwandten Verfahren, wie einer Hybridisierung unter Verwendung eines Stranges von DNA oder RNA, der zu der gewünschten Nukleinsäuresequenz komplementär ist, wobei dieser komplementäre Strang bekannt ist als eine "Sonde". Die Sonde kann an die Nukleinsäure hybridisiert werden und nachgewiesen werden unter Verwendung jedweden bekannten Nachweisverfahrens, wie den traditionellen Southern- oder Northern-Blot-Verfahren oder dem Homogenen Protektionsassay ("HPA"), beschrieben bei Arnold et al., supra. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sonde, die mit einem HIV-Virus assoziierte Nukleinsäure nachweisen.

Kit zur Ausführung des vorausstehenden Verfahrens

Ein einfacher Kit zur Durchführung des vorausstehenden Verfahrens kann hergestellt werden aus leicht verfügbaren Materialien und Reagenzien. Der Kit kann so entworfen sein, daß die Reagenzien einander komplementieren, zum Beispiel kann das osmotische Mittel Sucrose und das Zentrifugationsmedium PERCOLL® sein.

Beispiele:

Herstellung eines Dichtezentrifugationsmediums

PERCOLL® wird vom Hersteller in einer Dichte in dem Bereich von 1,130 ±0,005 g/ml bereitgestellt. Die exakte Dichte wird mit jeder Charge geliefert. Um einen Liter (1000 ml) einer Suspension von PERCOLL® in 0,25 M Sucrose mit einer bestimmten Dichte, ρgewünscht, herzustellen, kann das Volumen (in ml) von PERCOLL® Stammlösung nach den folgenden Gleichungen abgeschätzt werden:
ρgewünscht = VPercollρPercoll + VOsmotρOsmot + (1000 - VPercoll - VOsmot)/ 1000 ml
oder,
VPercoll = 1000(ρgewünscht - 1) - VOsmot(ρOsmot -1) / (ρPercoll -1)
In diesem Beispiel ist Sucrose das osmotische Mittel und wird in die Mischung als eine SX (1,25M) Stammlösung eingeführt, daher ist für eine Endkonzentration von 0,25 M, das Volumen (VOsmot) das zugegeben werden muß = 200,0 ml. Die Dichte von 1,25 M Sucrose beträgt 1,1607 g/ml. Der letzte Ausdruck in dem Nenner der ersten Gleichung (1000 - VOsmot - VPERCOLL® repräsentiert das Volumen von Wasser, das zugegeben wird, um das Endvolumen auf einen Liter zu bringen und setzt eine nominelle Dichte von 1,000 g/ml für Wasser voraus. Daher,
1. Mische, um eine Suspension mit einer Dichte von 1,110 g/ml unter Verwendung einer Stammlösung von PERCOLL®, geliefert mit einer Dichte von 1,131 g/ml, herzustellen:
594,4 ml PERCOLL®
200,0 ml 1,25M Sucrose
205,6 ml H&sub2;O
2. Messe den Brechungsindex (RI, refractive index) der resultierenden Suspension genau. Berechne die Dichte unter Verwendung der für das Dichtezentrifugationsmedium (DCM) passenden Beziehung (beschrieben von Pharmacia), welches PERCOLL® in 0,25 M Sucrose (DCM&sub1;) umfaßt.
ρDCM&sub1; (6,6145 · RIDCM&sub1;) - 7,8620
Der erwartete RI für die gewünschte 1,110 g/ml Suspension wäre daher 1,3564.
3) Falls die gewünschte Dichte schwer zu erhalten ist, oder eine hinreichend genaue volumetrische Glasware nicht verfügbar ist, verwende die vorausstehende Formel als eine Richtschnur, um die Volumina abzuschätzen, welche erforderlich sind, um zwei Suspensionen mit Dichten herzustellen, welche die gewünschte Enddichte einrahmen (z. B. 1,105 g/ml und 1,115 g/ml). Messe den RI einer jeden und berechne dann die tatsächliche Dichte einer jeden. Berechne die Volumina einer jeden, die gemischt werden sollen (z. B. Vniedrig und Vhoch (Vgesamt - Vniedrig)), um die gewünschte Dichte zu erhalten und das Gesamtvolumen:
ρgewünscht = ρniedrigVniedrig + ρhoch(Vgesamt - Vniedrig)/Vgesamt
4. Eine ähnliche Strategie kann zur Herstellung von PERCOLL®-Suspensionen in anderen osmotischen Mitteln, wie 0,15 M NaCl, verwendet werden. Die Dichte von NaCl- Lösungen ist ebenfalls in der Literatur verfügbar und kann als eine Funktion der Konzentration berechnet werden. Zum Beispiel hat 1,50 M NaCl, welches als eine 10X Stammlösung anstelle der 5X Sucrose in der vorausstehenden Formulierung verwendet werden kann, eine Dichte von 1,058 g/ml. Die Dichte kann aus dem RI einer solchen PERCOLL®/Salzlösung DCM&sub2; durch die folgenden Gleichung berechnet werden:
ρDCM&sub2; = (6,8166 · RIDCM&sub2;) - 8,0923
Ein Brechungsindex von 1,350 würde der gewünschten Dichte von 1,110 g/ml für DCM&sub2; entsprechen.
5. Andere Mittel als PERCOLL® können verwendet werden, um die gewünschte Dichte zu erzeugen. (Wie in der Produktliteratur von Pharmacia und Nycomed herausgestellt, schließen die erwünschten Eigenschaften eines Dichtereagenzes ein: eine hinreichende Löslichkeit und Dichtezahl, um Lösungen von wenigstens der gewünschten Dichte zu ergeben, geringe eigene osmotische Aktivität und eine niedrige Viskosität in Lösung). Zum Beispiel können NYCODENZ®-Stammlösungen durch dessen Lösen in Wasser bei einer Dichte gemacht werden, die größer ist, als die gewünschte Enddichte des DCM (z. B. 0,35 M). Die Dichte einer wäßrigen NYCODENZ®-Lösung kann aus ihrer Molarität vorausgesagt werden:
ρNycodenz = (0,43914 [Nycodenz]) + 0,99828
und durch ihren RI bestätigt werden:
ρNycodenz = (3,242 · RINycodenz) - 3,323
Eine solche NYCODENZ®-Stammlösung bekannter Dichte kann in Verbindung mit einem geeigneten osmotischen Mittel verwendet werden, um ein isoosmotisches DCM der gewünschten Dichte unter Verwendung desselben Verfahrens wie vorausstehend für PERCOLL® beschrieben, zu ergeben. Die Dichten der resultierenden Mischungen können aus den Brechungsindices unter Verwendung der folgenden Konstanten (von Nycomed) berechnet werden:
ρDCM&sub3; = (3,553 · RIDCM&sub3;) - 3,751
für NYCODENZ® in Sucrose (DCM&sub3;) und:
ρDCM&sub4; = (3,287 · RIDCM&sub4;) - 3,383
für NYCODENZ® in Salzlösung (DCM&sub4;).
Die Auftriebsdichte der in der Probe, wie Blut, vorhandenen Zellen kann sich verändern, falls die osmotische Stärke verändert wird. Typischerweise vermindert sich die Auftriebsdichte der Zellen, wenn sich die Osmolarität vermindert, und steigt an, wenn die Osmolarität ansteigt. Während verschiedene Kombinationen der Osmolarität und der Mediumdichte verwendet werden können, um ähnliche Ergebnisse zu erreichen, sind die annähernd physiologischen Osmolaritäten, welche hierin beschrieben werden, geeignet für den Zweck dieses Verfahrens (Präparieren von Zellen für nachfolgende Amplifikationsreaktionen). Darüber hinaus sind rote Blutzellen (RBCs; red blood cells) typischerweise einem osmotischen Schock gegenüber sensitiver als weiße Blutzellen (WBCs, white blood cells). Und die geeignetsten Bedingungen für eine Verarbeitung der Probe sind diejenigen, welche die Möglichkeit einer RBC-Lyse minimieren.
Wie hierin beschrieben, wird eine Dichte von 1,110 g/ml für das DMC bevorzugt, um es mit Gesamtblut zu mischen, um eine Dichte der Endmischung von 1,077 g/ml zu erhalten, um die mononukleären Zellen von Gesamtblut zu separieren. Diese Dichte für das DCM wurde empirisch gewählt, basierend auf den Ergebnissen von verschiedenen Experimenten, einschließlich von Untersuchungen der Anzahl gewonnener Zellen, der Reinheit der gewünschten Fraktion, d. h. niedrige Kontamination durch Granulozyten, wie durch Wright- Färbung bestimmt, und durch Beobachten eines typischen Verhältnisses von Lymphozyten zu Monozyten, wie unter den gewonnenen Zellen durch Wright-Färbung bestimmt. Diese DCM- Dichte ist ebenfalls eine bevorzugte Dichte, beruhend auf der typischen Auftriebsdichte von mononukleären Zellen (gewöhnlich meint man, daß sie < 1,077 g/ml ist) und dem normalen Bereich der Blutzusammensetzung. Das gepackte Volumen von RBCs ist für die meisten erwachsenen Individuen gewöhnlich mindestens 35% des Gesamtvolumens des Blutes, obwohl dieses bei Individuen mit einer signifikanten Anämie geringer sein kann. Wenn das DCM und das Gesamtblut gemischt werden, sollte die Dichte der resultierenden Flüssigphase eine Kombination der Teilvolumina, welche von einer jeden Quelle beigetragen werden, sein, d. h. dem DCM und dem Plasma und ihrer jeweiligen Dichten:
ρPlasma/DCM = VDCMρDCM + VPlasmaρPlasma / VDCM + VPlasma
Falls gleiche Volumina von DCM mit einer Dichte = 1,110 g/ml und Blut gemischt werden, und falls 65% des Blutvolumens Plasma ist, mit einer Dichte von 1,026 g/ml, dann wird die Dichte der resultierenden Flüssigphase 1,077 g/ml sein, welches eine ideale Dichte für das Separieren von mononukleären Zellen von anderen Blutzellen ist. In einem solchen Gemisch werden die meisten der mononukleären Zellen auf der Oberfläche des Gemisches flottieren, gemeinsam mit vielen Plättchen; die RBCs und die Granulozyten werden sedimentieren. Unter Verwendung dieser Vorgehensweise ist es offenbar, daß die bevorzugte Dichte gemäß den Bedingungen innerhalb der Blutzellprobe (wie Blut) und dem DCM variieren wird. Das Bestimmen einer geeigneten Dichte unter Verwendung der vorausstehend erwähnten Faktoren erfordert kein übermäßiges Experimentieren.
Blut von der Mehrzahl der Individuen wird ein gepacktes Volumen der RBCs (wie durch Hämatokritverfahren gemessen) von mehr als 35% des Gesamtvolumens des Blutes haben. Daher wird das Mischen von gleichen Volumina von Blut und 1,110 g/ml DCM eine flüssige Phase mit einer Dichte > 1,077 g/ml für die meisten Blutproben ergeben. Die Zielfraktion der mononukleären Zellen wird sogar leichter auf der Oberfläche solch eines Gemisches flottieren. Die Fig. 1 zeigt die RBC-Zahlen und die Hämatokritwerte, bestimmt für Blut, das von 66 unterschiedlichen Individuen genommen wurde. Die 2. y-Achse zeigt die entsprechende Dichte der DCM-Plasma-Mischung, welche aus dem Mischen eines bestimmten Volumens von DCM mit einem gleichen Volumen von Blut mit dem Hämatokritwert, welcher direkt gegenüber auf der primären y-Achse ist, resultieren würde. Das Beispiel zeigt, daß die hier beschriebene Strategie zu einem DCM/Plasma-Gemisch mit einer Dichte zwischen 1,076 g/ml-1,082 g/ml für die Mehrzahl der Individuen führt. Wenn die Dichte des Gemisches ansteigt, könnte eine gewisse Kontamination mit Granulozyten in der Fraktion der mononukleären Zellen (MNC) erwartet werden. Es sollten jedoch Gemische über diesen Dichtebereich hinweg sehr wirksam beim Separieren von MNC und Granulozyten sein, da die Auftriebsdichte der Granulozyten typischerweise im Durchschnitt 1,086 g/ml beträgt und nur eine kleine Fraktion eine Auftriebsdichte < 1,082 g/ml hat. Darüber hinaus ist für einige Aspekte der Erfindung wie die Amplifikation einer Zielnukleinsäure und/oder einer Hybridisierungsanalyse selbst eine wesentliche Kontamination mit Granulozyten kein signifikantes Problem, da diese Verfahren entworfen worden sind, um spezifisch für gewünschte Zielsequenzen selbst in Gegenwart beträchtlicher Mengen im Überschuß von Nicht-Zielsequenzen zu sein. Es ist zum Beispiel, während es vorteilhaft ist, eine Zellpopulation, die hinsichtlich der MNCs in hohem Maße angereichert ist, zu gewinnen, welche die Zielzellen einer HIV-Infektion einschließt, gegenüber Granulozyten, welche keine Zielzellen für eine HIV-Infektion sind, dies nicht absolut erforderlich. Es ist in einem solchen Fall wichtiger, Bedingungen zu verwenden, welche zu einem Gewinnen der meisten von den MNCs führen, als hochgereinigte MNCs zu gewinnen.
Unter Verwendung der vorausstehend beschriebenen Verfahren war es möglich, DCMs der gewünschten Dichte ±0,002 g/ml auf eine reproduzierbare und verläßliche Weise zu machen.
Man muß bemerken, daß die Erfindung es nicht erfordert, daß das Blut und das DCM in gleichen Volumina kombiniert werden, oder daß die DCM-Dichte darauf eingeschränkt ist 1,110 g/ml zu betragen. Es liegt innerhalb der Fertigkeiten des Fachgebietes, ohne übermäßiges Experimentieren die für eine Kombination passenden Volumina für einen weiten Bereich von Dichten des DCM zu berechnen, basierend auf den Teilvolumina der Komponenten und ihrer jeweiligen Dichten, wie vorausstehend beschrieben. Im Gegenteil kann die passende Dichte des DCM, welche verwendet werden soll, berechnet werden, um auf das gewünschte Volumen und die letztendliche Dichtespezifikationen abgestimmt zu werden.

Beispiel für die Fraktionierung von Blut, um mononukleäre Zellen zu gewinnen

1.) Mische 3,0 ml gerinnungshemmend mit EDTA behandeltes Gesamtblut mit 3,0 ml isoosmotischem PERCOLL®/Sucrose-DCM (Dichte = 1,110 g/ml) in einem Reaktionsröhrchen mit Schraubdeckel. Verschließe es sicher und invertiere es mehrere Male, um gründlich zu mischen.
2. Zentrifugiere es in einem Schwinggefäßrotor bei 1600 · g 20 min. lang. Die RBCs werden pelletieren. Die Granulozyten werden mitpelletieren und eine Bande auf der Oberfläche der RBCs bilden. MNCs werden auf der Oberfläche des Gemisches flottieren. Andere Zentrifugationsbedingungen können verwendet werden. Zum Beispiel kann eine größere g-Kraft während einer kürzeren Zeit verwendet werden, aber es wird bevorzugt, daß die g-Kraft nicht ein Niveau übersteigt, bei dem ein vollständiges isopyknisches Gleichgewicht erreicht wird, da die MNCs sich dann unterhalb des Meniskus zu einer Bande anordnen können. Die Geometrie des Röhrchens kann ebenfalls einen Einfluß die Zentrifugationszeit und -Kraft haben. Zum Beispiel sollte eine kürzere Flüssigsäule das isopyknische Gleichgewicht schneller erreichen. Des weiteren können Vorrichtungen, um den Meniskus und/oder die MNC-Bande zu stabilisieren, verwendet werden. Das Anpassen der Bedingungen des Zentrifugierens in einer geeigneten Weise an solche unterschiedlichen Bedingungen oder an unterschiedliche Zellarten oder Probenquellen erfordert kein übermäßiges Experimentieren für den Fachmann. Ebenfalls kann die Erfindung ein Zentrifugationsverfahren einschließen, welches wenigstens einen Waschschritt umfaßt. Solche Verfahren sind im Fachbereich bekannt. Das Auftreten der MNC-Bande wird leicht variieren, abhängig von den Einzelheiten der Zentrifugation und des Zentrifugationsapparates, wie dem Durchmesser des Röhrchens, dem Volumen des verwendeten Blutes etc., wird sich aber typischerweise am höchsten Punkt des Meniskus konzentrieren.
3. Die vollständige MNC-Bande kann durch das Aufsaugen in eine Pipette geerntet werden, wobei die Pipette so gehandhabt wird, daß die Spitze in einem Bereich einer dichten Ansammlung von Zellen bleibt. Fahre fort, bis die meisten von den MNCs gewonnen sind. Typischerweise wird dies zum Sammeln von 300-700 ul der MNC/DCM/Plasma- Suspension führen.

Beispiel für ein Verfahren zur Zell-Lyse von mononukleären Zellen

1.) Mixe 250 ul der MNC-Suspension mit 250 ul 0,14 N KOH. Vortexe, um gut zu mischen. Erwärme auf 95ºC 30 min. lang.
2.) Stelle den pH-Wert des resultierenden Lysates auf den pH-Wert 8,0 ± 0,5 (typischerweise) durch das Zugeben von 50 ul einer Lösung ein, welche umfaßt:
0,65 N Essigsäure (HOAc)
0,066 M Tris(Hydroxymethyl-amino)methan, Base
0,084 M Tris · HCl
3.) Mische gut, z. B. durch Vortexen.
Andere Verfahren, um eine Lyse zu verursachen, können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel Kombinationen anderer basischer Lösungen, gefolgt von neutralisierenden Säurelösungen, oder enzymatische oder milde Detergens-Mittel. Solche Verfahren sind für mononukleäre Zellen und für andere Zellen im Fachbereich bekannt.

Verwendung des Lysates in Amplifikationsreaktionen

Das vorausstehende Lysat enthält eine rohe Mischung von Moleküle biologischer Herkunft, von denen viele Hydrolyseprodukte mit einem niedrigen Molekulargewicht von den ursprünglichen Bestandteilen der Probe sind. Die in diesen Lysaten vorhandene DNA ist, während sie fragmentiert und denaturiert ist im Vergleich zu ihrer Originalstruktur in den Zellen, immer noch ein geeigneter Reaktand für eine Vielzahl von chemischen und biochemischen Reaktionen, einschließlich als Templat für eine Amplifikation einer Ziel- Nukleinsäure. Um die Komplexität und die an einer praktischen Routineverwendung einer Ziel-Amplifikation, um von Blut stammende Nukleinsäuren zu analysieren, beteiligten Manipulationen zu minimieren, wird in einem Aspekt der Erfindung, das Lysat direkt zu der Amplifikationsreaktion als die Quelle des Analyten zugegeben, ohne eine weitere Reinigung. Es ist jedoch wohlbekannt, daß Proben biologischer Herkunft häufig Komponenten enthalten, welche für biochemische Reaktionen in vitro inhibitorisch sind, einschließlich von Enzymreaktionen. Es wurde zum Beispiel berichtet, daß selbst Nukleinsäurepräparationen, die wesentlich höher gereinigt sind als das, durch das hierin beschriebene Verfahren erhaltene Lysat, potente Inhibitoren der Amplifikation durch die Polymerase-Ketten-Reaktion enthalten (R. deFranchis, N. C. P. Cross, N. S. Foulkes und T. M. Cox, A Potent Inhibitor of Taq Polymerase Copurifies with Human DNA, Nucleic Acid Research 16: 10 355 (1988)).
Viele Metallionen, insbesondere polyvalente Spezies, können Enzymaktivitäten über eine Vielzahl von Mechanismen hemmen, einschließlich einer Verdrängung oder einer Substitution von erforderlichen Metallkofaktoren, oder durch das Bilden stabiler Komplexe mit empfänglichen Komponenten, einschließlich von Aminosäureseitenketten, welche für die katalytische Aktivität nötig sind, oder welche zu schädlichen sterischen Veränderungen in dem Enzym führen, oder durch das Vorantreiben schädlicher Redoxreaktionen. Manchmal werden Chelatbildner verwendet, um unerwünschte Metalle zu maskieren, aber es ist in keinen bestimmten Fall offensichtlich, daß ein wirksamer Chelatbildner identifiziert werden kann, welcher nicht selbst die Enzymaktivität inhibiert, z. B. durch das Komplexieren notwendiger Kofaktoren oder sogar durch das Entfernen gebundener Metalle aus dem Enzym. Es wurde gefunden, daß Deferoxamin, ein natürliches Produkt biologischer Herkunft mit einer extrem hohen Affinität für Fe(III), in hohem Maße wirksam ist, die Hemmung zu neutralisieren, welche Amplifikationsreaktionen durch Lysate von Blutfraktionen auferlegt wird, und man hat gefunden, daß es gut in der Reaktion mindestens über den Konzentrationsbereich von 0,001 bis 1 mM toleriert wird. Ein Beispiel für die Verwendung von Deferoxamin ist nachstehend beschrieben und die vorteilhaften Wirkungen sind in den Fig. 2 und 3 gezeigt.
Eines der getesteten Mittel, von denen gefunden wurde, daß es wirksam war, die Hemmung der Amplifikation in der Lysatprobe zu bekämpfen, war Zn(OAc)&sub2;. Obwohl berichtet wurde, daß die reverse Transkriptase ein Zn-Metalloenzym sei (wie von der T7-RNA-Polymerase, obwohl man nicht länger annimmt, daß dies der Fall ist) ist unbekannt ob (oder es wird gefordert, daß) die nützliche Aktivität von Zn&spplus;&spplus; in diesem Zusammenhang mit der normalen Zn&spplus;&spplus;-Bindungsstelle von einem oder mehreren Enzymen in der Reaktion verknüpft ist. Es ist möglich, daß Zn&spplus;&spplus; mit (einer) anderen Stelle(n) auf dem bzw. den Enzymen auf eine vorteilhafte Weise interagiert oder daß es auf eine direkte oder eine indirekte Weise mit einem der Inhibitoren in Reaktionen dieser Art interferiert. Es war nicht offensichtlich, daß Bedingungen identifiziert werden könnten, in welchen vorteilhafte Nettoeffekte beobachtet würden. Die Fig. 2 zeigt ein Beispiel für die Verstärkung, welche durch Zn&spplus;&spplus; in der Amplifikationsreaktion möglich ist, insbesondere bei zu vernachlässigenden Spiegeln an Deferoxamin. Während die vorteilhaften Wirkungen von Deferoxamin auf eine geringe Weise durch hohe Zn&spplus;&spplus;-Spiegel antagonisiert werden können, ist es offensichtlich, daß Mischungen über ziemlich breite Konzentrationsbereiche von einem jeden identifiziert werden können, welche eine stabile Grundlage für eine wirksame Amplifikation unterstützen.
Mit vielen Nukleinsäuren reaktive Enzyme werden durch eine Vielzahl von Polyanionen inhibiert. Eine Strategie zur Neutralisierung von Polyanionen besteht darin, eine polykationische Spezies wie Polyethylenimin (PEI) in der Reaktion einzuschließen. Da Nukleinsäuren selbst dicht geladene Anionen sind, war es überraschend, daß Bedingungen identifiziert werden konnten, unter welchen eine erhöhte Amplifikation beobachtet werden konnte ohne einen nachweisbaren Verlust der endogenen Aktivität der Matritze. PEI- Konzentrationen von ≤ 3 · 10&supmin;&sup5; % (Gew./Vol.) in der Amplifikationsreaktion waren in einer konsistenten Weise diesbezüglich vorteilhaft. Ein Beispiel der möglichen Verstärkung ist in der Fig. 3 gezeigt.
Das nachfolgend beschriebene Beispiel erläutert die Ausführung einer Amplifikation, welche eine oder mehrere dieser anti-inhibitorischen Verbindungen enthalten kann.
1.) Stelle eine Lösung, welche folgende Bestandteile enthält, her und verteile 40 ul davon. Die aufgelisteten Konzentrationen beziehen sich auf die jeweiligen Konzentrationen in den vollständigen Reaktionen von 100 ul.
50 mM Tris · HCl (pH 8,0 bei Raumtemperatur)
17,5 mM MgCl&sub2;
5 mM DTT
2 mM Spermidin
6,25 mM ea GTP & ATP
2,5 mM ea UTP & CTP
0,2 mM ea dATP, dGTP, dCTP, dTTP
0,3 uM ea Primer "A" & Primer "B"
2.) Schließe wahlweise Deferoxaminmesylat mit einer Endkonzentration von 0-1 mM ein. Schließe wahlweise Zn(OAc)&sub2; mit einer Endkonzentration von 0 - 0,1 mM ein. Wahlweise schließe PEI mit einer Endkonzentration von 0-3 · 10&supmin;&sup5; % ein.
3.) Gebe zu dieser Mischung 40 ul der hydrolysierten MNC-Suspension, hergestellt wie vorausstehend beschrieben. Wahlweise füge eine bekannte Menge einer gereinigten Nukleinsäure zu, welche die Zielsequenz(en) von Interesse enthält, als eine Basis für den Vergleich des Leistungsvermögens der Amplifikation, welches von den unterschiedlichen Bedingungen unterstützt wird.
4.) Erwärme die Mischung auf 95ºC und behalte dies 5 Minuten lang bei. Kühle die Mischung auf 37ºC ab.
5.) Gebe 10 ul einer Lösung zu, welche 600 U Moloney MuLV Reverse Transkriptase (MMLV-RT) enthält, bevorzugtermaßen in einer gepufferten Lösung mit einer Zusammensetzung, welche ausreicht, um die Stabilität des Enzyms während der Handhabung aufrechtzuerhalten. Inkubiere die Mischung 10-15 Minuten lang bei 37ºC.
6.) Erwärme die Mischung auf 95ºC und behalte diese Temperatur während 5 Minuten bei. Dann kühle die Mischung auf 37ºC ab.
7.) Gebe 10 ul einer Lösung, welche 600 U von MMLV-RT und 400 U T7-RNA- Polymerase enthält zu, bevorzugtermaßen in einer gepufferten Lösung, welche ausreicht, um die Stabilität des Enzyms während der Handhabung beizubehalten.
8.) Mische kurz und inkubiere die Mischung bei 37ºC während 1-2 Stunden.
9.) Bestimme die Menge des Amplifikationsproduktes, welches als eine Kopie der beabsichtigten Zielsequenz gebildet wurde unter Verwendung eines spezifischen Hybridisierungsverfahrens wie dem Hybridisierungs-Protektionsassay; siehe z. B. Arnold et al., supra.
Andere Formen von Deferoxamin können ebenfalls verwendet werden, sowie andere Zink bereitstellende Mittel wie ZnCl&sub2; oder ZnSO&sub4;. Ebenfalls können andere polykationische Polymere wie Polyallylamin oder Polybrene® (Hexadimethrinbromid) auch mit oder anstelle von PEI verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in einem Amplifikations- Gemisch, wobei das Gemisch ein erstes Komplexierungsmittel einschließt, das fähig ist, Eisen(III)-Ionen zu komplexieren, wobei das erste Komplexierungsmittel gewählt wird aus Deferoxamin, Sideramin, Sideramycin und Ferrimycin, so daß die Amplifikation der Zielsequenz in dem Gemisch mehr amplifizierte Nukleinsäure ergibt, als wenn das erste Komplexierungsmittel von dem Gemisch abwesend ist.

2. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 1, wobei das erste Komplexierungsmittel Deferoxamin ist.

3. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Gemisch zusätzlich ein zweites Komplexierungsmittel einschließt, das fähig ist, Calciumionen zu komplexieren, so daß die Amplifikation der Zielsequenz in dem Gemisch mehr amplifizierte Nukleinsäure ergibt, als wenn das zweite Komplexierungsmittel von dem Gemisch abwesend ist.

4. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 3, wobei das zweite Komplexierungsmittel eine größere Affinität für unerwünschte Ionen aufweist als für erwünschte Ionen.

5. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 4, wobei die erwünschten Ionen mindestens eines von Zink-, Mangan- und Magnesiumionen einschließen.

6. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 5, wobei das zweite Komplexierungsmittel gewählt wird aus EGTA, Citrat und Oxalat.

7. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei mindestens eines von den ersten und zweiten Komplexierungsmitteln in dem Gemisch als ein Komplex oder Salz bereitgestellt wird und wobei der Komplex oder das Salz das Komplexierungsmittel und mindestens ein erwünschtes Ion, gewählt aus Zink-, Mangan- und Magnesiumionen, umfaßt.

8. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, welches ferner das Herstellen der Amplifikations-Mischung durch ein Verfahren umfaßt, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Zentrifugieren einer Zusammensetzung, umfassend ein Zentrifugationsmedium und eine Probe von Blutzellen, umfassend mononukleare Zellen, unter Zentrifugationsbedingungen, so daß sich ein wesentlicher Anteil der mononuklearen Zellen in der Zusammensetzung in einer diskreten Bande sammelt;

(b) Trennen der diskreten Bande von der Zusammensetzung;

(c) Lysieren der mononuklearen Zellen in der diskreten Bande durch

(i) Zufügen eines lysierenden Mittels zu der Bande, oder

(ii) Aussetzen der Bande an eine Beschallungs-Disruption, so daß die mononuklearen Zellen in der Bande lysieren, wodurch die Nukleinsäure für Amplifikation verfügbar gemacht wird;

(d) Zufügen des ersten Komplexierungsmittels oder des ersten und zweiten Komplexierungsmittels zu der Bande; und

(e) Unterziehen der Nukleinsäure unter ausreichende Bedingungen, um die Zielnukleinsäuresequenz zu amplifizieren.

9. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 8, wobei Zink-Ionen der Bande während mindestens einem der Zufügungs-, Aussetzungs- oder Unterziehungs-Schritte zugegeben werden.

10. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung isotonisch mit den mononuklearen Zellen ist, so daß die Zusammensetzung zu weniger als 20% der in der Zusammensetzung vorhandenen mononuklearen Zellen vor dem Lysier- Schritt lysiert.

11. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das Zentrifugationsmedium isopyknisch zu den Blutzellen ist.

12. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Bande mindestens 30% der in der Zusammensetzung vorhandenen mononuklearen Zellen umfaßt.

13. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei das Zentrifugationsmedium ein zu den mononuklearen Zellen isotonisches osmotisches Mittel enthält, wobei das osmotische Mittel Saccharose, Sorbital, Mannitol, Natriumchlorid oder Natriumglutamat umfaßt.

14. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 13, wobei das osmotische Mittel die ionische Konzentration der Zusammensetzung nicht verändert.

15. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 14, wobei das Zentrifugationsmedium kolloidales Silica oder mit Polyvinylpyrrolidon beschichtetes kolloidales Silica umfaßt.

16. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 15, wobei das Zentrifugationsmedium mit einer Verbindung hergestellt wird, die iodierte Benzoesäure- Derivate aufweist.

17. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 16, wobei die Blutzellen aus Vollblut oder Tierserum abgeleitet werden.

18. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 17, wobei mindestens 80% der Blutzellen in der Probe nach dem Trennungsschritt und vor dem Lysier-Schritt intakt bleiben.

19. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 18, wobei in Schritt (e) die Bedingungen ausreichend sind, um die Zielsequenz durch Polymerase-Ketten- Reaktion-Amplifikation zu amplifizieren.

20. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 19, wobei der Unterziehungs-Schritt das Bereitstellen von reverser Transkriptase und RNA-Polymerase einschließt.

21. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 20, wobei das lysierende Mittel ein Alkali, ein Enzym oder ein Detergenz ist.

22. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 21, wobei das lysierende Mittel KOH, NaOH, (CH&sub3;)&sub4;NOH oder LiOH ist.

23. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 22, wobei das Zentrifugationsmedium eine Dichte zwischen 1,105 und 1,115 Gram pro Milliliter aufweist.

24. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 23, wobei in Schritt (e) ein polykationisches Polymer in einer Menge vorgesehen wird, die wirksam ist, um die Inhibition der Amplifikation durch ein Polyanion zu vermindern.

25. Verfahren, wie beansprucht in mindestens einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die Zielsequenz in Nukleinsäure von einem Humanen-Immundefizienz-Virus oder Hepatitis B-Virus vorhanden ist.

26. Kit zur Herstellung einer Amplifikations-Mischung, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 8 bis 25, umfassend:

(a) das erste Komplexierungsmittel oder das erste Komplexierungsmittel und das zweite Komplexierungsmittel; und

(b) eine oder mehrere Komponenten, gewählt aus:

(i) einem Zentrifugationsmedium;

(ii) einem lysierenden Mittel, das fähig ist, mononukleare Zellen zu lysieren; und

(iii) Amplifikationsmaterialien für die Amplifikation der Zielnukleinsäure-Sequenz.

27. Kit, wie beansprucht in Anspruch 26, ferner umfassend das Zentrifugationsmedium, wobei das Zentrifugationsmedium gewählt ist, um eine solche Dichte aufzuweisen, daß sich mindestens 30% mononukleare Zellen in einer Zusammensetzung, welche das Medium und eine Probe von die mononuklearen Zellen enthaltenden Blutzellen umfaßt, in einer diskreten Bande unter Zentrifugationsbedingungen sammeln.

28. Kit, wie beansprucht in Anspruch 26 oder Anspruch 27, ferner umfassend ein osmotisches Mittel in einer ausreichenden Menge, um das Medium im wesentlichen isotonisch zu Vollblut zu machen.

29. Kit, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 26 bis 28, ferner umfassend die Amplifikationsmaterialien in ausreichenden Mengen, um die Zielnukleinsäure-Sequenz zu amplifizieren.

30. Kit, wie beansprucht in Anspruch 29, wobei die Amplifikationsmaterialien ausreichend sind, um die Zielnukleinsäure-Sequenz unter Anwendung von Polymerase-Ketten- Reaktion-Amplifikation zu amplifizieren.

31. Kit, wie beansprucht in Anspruch 29, wobei die Amplifikationsmaterialien reverse Transkriptase und RNA-Polymerase einschließen.

32. Kit, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 26 bis 31, ferner umfassend ein lysierendes Mittel, das fähig ist, mononukleare Zellen zu lysieren.

33. Kit, wie beansprucht in Anspruch 32, wobei das lysierende Mittel KOH, (CH&sub3;)&sub4;NOH, NaOH oder LiOH ist.

34. Kit, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 26 bis 33, ferner umfassend ein polykationisches Polymer in einer wirksamen Menge, um die Inhibition der Nukleinsäure- Amplifikation durch ein Polyanion zu vermindern.

35. Kit, wie beansprucht in Anspruch 34, wobei das polykationische Polymer Polyethylenimin, Polyallylamin oder Hexadimethrinbromid ist.

36. Kit, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 26 bis 35, ferner umfassend eine Nukleinsäure-Sonde, die fähig ist, hinsichtlich der Zielnukleinsäure-Sequenz zu screenen.

37. Kit, wie beansprucht in Anspruch 26, zum Screenen hinsichtlich eines Virus, das in einer Probe von Vollblut vorhanden sein kann, wobei das Kit folgendes umfaßt:

(a) ein Zentrifugationsmedium, gewählt, um eine solche Dichte aufzuweisen, daß mindestens 20% der mononuklearen Zellen in einer das Medium und das Vollblut umfassenden Zusammensetzung sich in einer diskreten Bande in der Zusammensetzung unter Zentrifugationsbedingungen sammeln;

(b) lysierendes Mittel, um die mononuklearen Zellen zu lysieren, wodurch Nukleinsäure aus dem Virus zur Amplifikation verfügbar gemacht wird;

(c) das erste Komplexierungsmittel oder das erste Komplexierungsmittel und das zweite Komplexierungsmittel; und

(d) Amplifikationsmaterialien, ausreichend, um eine Ziel-Nukleinsäuresequenz der Nukleinsäure zu amplifizieren.

38. Kit, wie beansprucht in Anspruch 37, das eine oder mehrere Komponenten, wie definiert in mindestens einem der Ansprüche 28, 30, 31 und 33 bis 36, einschließt.