TECHNISCHES GEBIET
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Phosphatidylcholin, das hervorragend bezüglich
Oxidationsstabilität ist, und ein Verfahren zum Herstellen desselben.
HINTERGRUND
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Im allgemeinen enthalten Phosphatidylcholine als eine konstituierende Fettsäure davon eine
ungesättigte Fettsäure, wie etwa Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Docosahexaensäure oder
Arachidonsäure, so daß sie die Eigenschaft haben, leicht oxidiert zu werden. Insbesondere,
wenn Phosphatidylcholine zu hoher Reinheit gereinigt werden, werden sie von neutralen
Lipiden oder Proteinen abgetrennt, die als Verunreinigungen existiert und gerade wie
Schutzschichten fungiert haben, und werden Sauerstoff in der Luft direkt ausgesetzt, so daß sie
leichter oxidiert werden.
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Aus diesem Grund ist ein Versuch unternommen worden, zu verhindern, daß
Phosphatidylcholine oxidiert werden, z. B. während der Lagerung. Im allgemeinen werden sie an einem
dunklen und kühlen Ort oder unter einer inerten Gasatmosphäre aufbewahrt; ein Antioxidans,
wie etwa Vitamin E, wird ihnen zugegeben; oder eine ungesättigte Bindung, die in ihnen
enthalten ist, wird in eine gesättigte Bindung durch Hydrierung umgewandelt.
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Phosphatidylcholine, die zu großer Reinheit gereinigt werden, werden oft für Kosmetika,
Arzneien etc. verwendet. In solchen Fällen werden sie gewöhnlich als Liposomen oder
Emulgiermittel verwendet. Es ist bekannt gewesen, daß, in solchen Fällen, je geringer die Menge
von Verunreinigungen, wie etwa anorganischen Salzen und freien Aminosäuren, ist, desto
besser die erhaltenen Produkte sind. (Siehe z. B. offengelegte japanische
Patentveröffentlichung Nr. 3115/1989.)
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Ebenso relevant auf diesem Gebiet ist die Patentveröffentlichung JP-A-63-112589, die ein
Verfahren zur Trennung und Reinigung von verschiedenen Phosphatidylcholinen in eine
erwünschte Alkylzusammensetzung vermittels Flüssigchromatographie offenbart.
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Obwohl die Lagerung an einem dunklen und kühlen Ort oder unter einer inerten
Gasatmosphäre für hergestellte Phosphatidylcholine wirksam ist, ist sie jedoch unpraktisch und
beinahe unmöglich für diejenigen Produkte, wie etwa Kosmetika und Arzneien, die unter
Verwendung der Phosphatidylcholine produziert werden.
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Weiterhin ist die Zugabe eines Antioxidans zu Phosphatidylcholinen ungünstig, wenn ihre
Verwendung bei Kosmetika, Arzneien, Nahrungsmitteln und berücksichtigt wird. Es gibt
auch den Fall, wo ein Antioxidans nicht zugegeben werden kann.
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Weiterhin ist es zur Durchführung einer Hydrierungsbehandlung notwendig, zusätzlich einen
Schritt zu diesem Zweck bereitzustellen.
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Zusätzlich wird die Stabilität von Liposomen oder emulgierten Produkten reduziert, die unter
Verwendung von Phosphatidylcholinen erhalten worden sind, wenn die Phosphatidylcholine
oxidiert sind. Darüberhinaus bringen die Phosphatidylcholinoxide auch das Problem von
Toxizität für den Körper mit sich.
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Somit ist es allgemeine Regel gewesen, daß gereinigte Phosphatidylcholine an einem dunklen
und kühlen Ort unmittelbar nach ihrer Herstellung gelagert und zum Produzieren von
erwünschten Produkten sobald als möglich verwendet werden sollten und daß die erhaltenen
Produkte ebenso in einer kurzen Zeitperiode verbraucht werden sollten.
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Unter diesen Umständen wird jetzt anerkannt, daß die Entwicklung von
Phosphatidylcholinen, die per se hervorragend bezüglich der Oxidationsstabilität sind, in starkem Maße
erforderlich ist.
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Deshalb ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Phosphatidylcholine bereitzustellen,
die hervorragend bezüglich der Oxidationsstabilität sind und damit das obige Erfordernis
erfüllen können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Wir haben umfangreiche Studien durchgeführt, um die vorgenannte Aufgabe zu erfüllen, und
haben schließlich die vorliegende Erfindung erreicht.
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Die vorliegende Erfindung besteht darin, ein Phosphatidylcholin bereitzustellen, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß das Verhältnis des Gesamtgewichts von Palmitoyl-Linoleoyl-
Glycerophosphocholin (PLPC) und Palmitoyl-Oleoyl-Glycerophosphocholin (POPC) zum
Gesamtgewicht von Stearoyl-Linoleoyl-Glycerophosphocholin (SLPC) und Stearoyl-Oleoyl-
Glycerophosphocholin (SOPC) 4,5 oder weniger beträgt, wobei PLPC, POPC, SLPC und
SOPC Molekülarten sind, die das Phosphatidylcholin bilden, und daß die elektrische
Leitfähigkeit einer 5 Gew.-%-Suspension des Phosphatidylcholins in destilliertem Wasser 100
uS/cm oder weniger beträgt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
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Fig. 1 ist ein Graph, der das ultraviolette Absorptions-Chromatogramm des in Beispiel 1
erhaltenen Eluats der vorliegenden Erfindung zeigt.
DIE BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
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Das Phosphatidylcholin, Gegenstandssubstanz der vorliegenden Erfindung, wird im
allgemeinen durch die folgende Strukturformel repräsentiert:
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wobei R¹ und R² eine Acylgruppe repräsentieren.
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In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Molekülart" eine individuelle
Verbindung, die durch die Veränderung der Kombination der gebundenen Acylgruppen gegeben
wird. Deshalb ist die Molekülart, die ein Phosphatidylcholin bildet, ein individuelles
Phosphatidylcholin, dessen Struktur durch Zuordnen spezifischer Gruppen an die in diesem
Phosphatidylcholin enthaltenen und durch R¹ und R² in der obigen Formel angezeigten
Acylgruppen bestimmt wird.
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Bei der vorliegenden Erfindung ist SLPC ein Phosphatidylcholin mit der obigen Formel, bei
dem die Acylgruppe R¹ ein Stearinsäurerest ist und die Acylgruppe R² ein Linolensäurerest
ist.
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SOPC ist ein Phosphatidylcholin mit der obigen Formel, bei dem die Acylgruppe R¹ ein
Stearinsäurerest ist und die Acylgruppe R² ein Ölsäurerest ist.
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PLPC ist ein Phosphatidylcholin mit der obigen Formel, bei dem die Acylgruppe R¹ ein
Palmitinsäurerest ist und die Acylgruppe R² ein Linolensäurerest ist.
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POPC ist ein Phosphatidylcholin mit der obigen Formel, bei dem die Acylgruppe R¹ ein
Palmitinsäurerest ist und die Acylgruppe R² ein Ölsäurerest ist.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung
eines, das ein Verhältnis (das Gewicht von PLPC + das Gewicht von POPC)/(das Gewicht
von SLPC + das Gewicht von SOPC) von 4,5 oder weniger hat. Wenn dieses
Gewichtsverhältnis höher als dieser Wert ist, d. h. 4,5, ist es schwierig, ein Phosphatidylcholin zu erhalten,
das Oxidationsstabilität hat.
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Darüberhinaus ist das Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung eines, das eine
elektrische Leitfähigkeit von 100 uS/cm oder weniger in einer 5 Gew.-%-Suspension des
Phosphatidylcholins in destilliertem Wasser hat. Es wird bemerkt, daß alle elektrischen
Leitfähigkeitswerte, die hierin gezeigt sind, durch eine Messung bei 25ºC erhalten wurden. Wenn diese
elektrische Leitfähigkeit höher als 100 uS/cm ist, ist es schwierig, ein Phosphatidylcholin zu
erhalten, das Oxidationsstabilität hat.
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Das Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung ist damit dadurch gekennzeichnet, daß
das Gewichtsverhältnis (PLPC + POPC)/(SLPC + SOPC) 4,5 oder weniger beträgt und daß
die elektrische Leitfähigkeit, bestimmt unter den vorgenannten Bedingungen, 100 uS/cm oder
weniger beträgt. Wie aus den Resultaten der Veränderung hinsichtlich des Peroxid-Werts mit
einem Zeitablauf während der Lagerung klar sein wird, die in dem Testbeispiel, das später
beschrieben werden wird, erhalten worden sind, ist es essentiell erforderlich, daß das
Phosphatidylcholin sowohl das oben beschriebene Gewichtsverhältnis zwischen den Molekülarten
als auch die oben beschriebene elektrische Leitfähigkeit im Hinblick auf die
Oxidationsstabilität hat.
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Es ist nicht notwendig, daß das Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung ein reines
Produkt ist, solange es die oben beschriebenen Erfordernisse hat. Zum Beispiel kann das
Phosphatidylcholin neutrale Lipide oder Cholesterin enthalten, welches im allgemeinen in
herkömmlichen Phosphatidylcholinen enthalten ist, die aus natürlichen Produkten extrahiert
worden sind, oder eine extrem geringe Menge an anderen Phospholipiden, die kontaminiert
sein können. Da jedoch das Phosphatidylcholin ein Hauptbestandteil des Endproduktes ist,
wird bevorzugt, daß wenigstens 70% oder mehr der gesamten Bestandteile des
Phosphatidylcholins im Endprodukt enthalten sind.
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Das Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung kann im allgemeinen auf die folgenden
Weise hergestellt werden.
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Eine Lipidzusammensetzung, die ein Phosphatidylcholin umfaßt, wird zuerst hergestellt.
Beispiele einer solchen Lipidzusammensetzung schließen diejenigen, die durch Extraktion mit
einem herkömmlichen Verfahren aus bekannten Phospholipidenthaltenden Materialien
erhalten werden, wie etwa Pflanzensamen, Dotter, Hirn, inneren Organen oder Bakterien, und
diejenigen ein, die durch verschiedene Syntheseverfahren erhalten werden. Zum Beispiel wird
ein organisches Lösungsmittel, wie etwa Dichlormethan oder ein Alkohol, in dem sich das
Phosphatidylcholin leicht auflöst, einem getrockneten und pulverisierten
Phospholipidenthaltenden Material zugegeben, und die Mischung wird gerührt. Festsubstanzen werden aus
der Mischung entfernt, um eine flüssige Phase zu erhalten, die mit einem organischen
Lösungsmittel gewaschen wird, in dem sich das Phosphatidylcholin kaum auflöst, wie etwa
Aceton. Das Lösungsmittel wird dann von einem Niederschlag entfernt. Eine
Lipidzusammensetzung, die das Phosphatidylcholin enthält, kann damit erhalten werden. Diese
Lipidzu
sammensetzung kann entweder eine sein, die nur das Phosphatidylcholin umfaßt, oder eine,
die weiterhin Lipide, andere als das Phosphatidylcholin, enthält.
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Darauffolgend wird die so erhaltene Lipidzusammensetzung unter Verwendung von
Säulenchromatographie behandelt, und der Anteil an Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung
wird fraktioniert und gesammelt.
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Ein typisches Verfahren zum Fraktionieren und Sammeln des Phosphatidylcholins der
vorliegenden Erfindung, bei dem Flüssig-Säulenchromatographie als die Säulenchromatographie
verwendet wird, wird jetzt erläutert werden.
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Es ist bevorzugt, daß die auf die oben beschriebene Weise erhaltene Lipidzusammensetzung
im allgemeinen 5% oder mehr des Phosphatidylcholins enthält. Es ist bevorzugter, abhängig
von dem erwünschten Endprodukt, den Phosphatidylcholingehalt der Lipidzusammensetzung
vor der chromatographischen Behandlung zu kontrollieren. Zum Beispiel ist es bevorzugt,
den Phosphatidylcholingehalt der Lipidzusammensetzung dahingehend zu kontrollieren, daß
er 20% oder mehr beträgt, um ein Produkt hoher Reinheit zu erhalten.
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Flüssig-Säulenchromatographie kann in Übereinstimmung mit einer herkömmlichen Technik
durchgeführt werden. Jedoch ist es in dem Fall, wo das gesammelte Phosphatidylcholin für
Arzneien, Kosmetika, Nahrungsmittel etc. verwendet werden soll, besser, als mobile Phase
ein Lösungsmittel zu verwenden, das für den menschlichen Körper sicher ist.
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Ein Fall, bei dem Kieselgel als der Füllstoff verwendet wird und ein Alkohol und Wasser als
das Mobilphasen-Lösungsmittel verwendet werden, wird jetzt als ein Beispiel erläutert
werden.
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In Bezug auf das Kieselgel gibt es keine besondere Beschränkung hinsichtlich des Typs
davon. Es ist jedoch wünschenswert, Kieselgel zu verwenden, das aus Siliziumtetrachlorid oder
Natriumsilikat erhalten wird und bei dem Kieselsäuren dreidimensional polymerisiert sind.
Kieselgel mit feinen Poren mit einem Durchmesser von 10 bis 2.000 Angstrom, bezeichnet
als vollkommen poröses Silika, ist als das Kieselgel des obigen Typs bevorzugt. Spezifische
Beispiele eines solchen Kieselgels schließen vollkommen poröses, sphärisches Kieselgel ein,
das einen Partikeldurchmesser von 3 bis 50 um hat, vollkommen poröses pulverisiertes
Kieselgel, das einen Partikeldurchmesser von 5 bis 350 um hat.
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Jeder Alkohol kann als das Mobilphasen-Lösungsmittel verwendet werden, so lange er dafür
verwendet werden kann. Jedoch ist eine Lösungsmittelmischung eines Alkohols mit 4 oder
weniger Kohlenstoffatomen und Wasser bevorzugt unter dem Gesichtspunkt der Löslichkeit
des Phosphatidylcholins. Spezifische Beispiele für ein solches Mobilphasen-Lösungsmittel
schließen Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol und strukturelle Isomere davon ein. Unter
dem Gesichtspunkt der Sicherheit für den menschlichen Körper wird Ethanol verwendet. Das
bevorzugte Mischungsverhältnis eines Alkohols zu Wasser ist näherungsweise von 99 : 1 bis
50 : 50 im Volumen. Dies beruht darauf, daß, wenn der Anteil des Alkohols entweder höher
oder niedriger als dieses ist, die Tendenz dazu besteht, daß es schwierig ist, das
Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
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Der Nachweis des von einer Säule eluierten Phosphatidylcholins kann mit einem
herkömmlicherweise bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie etwa dem Ultraviolett-
Absorptionsverfahren oder dem Ultraschallmessungsverfahren. Das Eluat wird versammelt
(fraktioniert und gesammelt) nach dem Zeitpunkt, an dem das Chromatogramm der
Phosphatidylcholin-Fraktion, das als ein Resultat des Nachweises erhalten wird, einen Maximalwert
zeigt, und das Lösungsmittel wird von dem Eluat mit einem herkömmlichen Verfahren
entfernt. Das Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung kann damit erhalten werden. Es
wird bemerkt, daß jeder Teil gesammelt werden kann, solange der Teil nach dem Zeitpunkt
erhalten wird, an dem der Maximalwert gezeigt wird, und solange das Phosphatidylcholin in
dem Teil nachgewiesen wird.
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Um den Gehalt des so erhaltenen Phosphatidylcholins selbst zu erhöhen, d. h. um die Reinheit
des Phosphatidylcholins der vorliegenden Erfindung zu erhöhen, kann der Schritt der oben
beschriebenen Chromatographie wiederholt werden, oder die Aufreinigung kann mit einem
herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wie etwa
einem Alkohol oder Aceton, durchgeführt werden.
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Wie aus den im Testbeispiel erhaltenen Resultaten deutlich werden wird, das später
beschrieben werden wird, ist das so erhaltene Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung per se
hervorragend bezüglich Oxidationsstabilität.
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Die vorliegende Erfindung wird jetzt genauer erläutert werden durch Bezugnahme auf die
folgenden Beispiele und ein Testbeispiel. Es wird bemerkt, daß alle prozentualen Angaben
und Verhältnisse, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, auf Gewicht
bezogen sind, wenn nicht andersartig spezifiziert.
Beispiel 1
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150 g gereinigtes Dotter-Phospholipid (das näherungsweise 80% eines Phosphatidylcholins
enthielt) mit der folgenden Zusammensetzung wurde in 300 ml einer 92 Vol.-% wässerigen
Ethanol-Lösung aufgelöst, um eine Probe zu erhalten. Hochleistungs-Flüssig-
Säulenchromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
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(Phospholipid-Zusammensetzung, Einheit = %)
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Phosphatidylcholin 81,6
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Phosphatidylethanolamin 16,3
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Cholesterin 1,1
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Sphingolipid 0,8
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Lysophospholipid 0,2
(Bedingungen)
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Säule: Innerer Durchmesser 50 mm · Länge 1.000 mm
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Packmaterial: Kieselgel (vollkommen poröses sphärisches Kieselgel mit einem
Partikeldurchmesser von 40 bis 60 um)
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Mobile Phase: Ethanol/Wasser = 92/8 (v/v), 150 ml/min
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Nachweis: Ultraviolett-Absorption (λ = 204 nm)
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Die Reihenfolge der Elution der Phospholipide ist dergestalt, daß das
Phosphatidylethanolamin (PE) das erste ist, und das Phosphatidylcholin (PC) das dazu nächste ist. Deshalb wurde,
während die Ultraviolett-Absorption des Eluats, das von der Säule abgegeben wird, gemessen
wurde, die Sammlung des Eluats an dem Punkt begonnen, an dem das Chromatogramm der
Phosphatidylcholin-Fraktion einen Maximalwert zeigte, und wurde fortgesetzt bis zu der Zeit,
zu der der Nachweis des Phosphatidylcholins mit Ultraviolett-Absorption abgeschlossen war.
(siehe Fig. 1)
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Die Lösungsmittelbestandteile wurden aus der gesammelten Lösung entfernt, und der Rest
wurde in einem Vakuumtrockner getrocknet, um 98,1 g des Phosphatidylcholins der
vorliegenden Erfindung zu erhalten.
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Die Reinheit des oben erhaltenen Phosphatidylcholins der vorliegenden Erfindung war 99,9%,
gemessen mit dem TLC-FID-Verfahren (Journal of the Japan Oil Chemistry, 32, (10, 566-573
(1983), veröffentlicht von der Japan Oil Chemists' Society), vorausgesetzt, daß die
Bedingungen der Entwicklung wie folgt modifiziert waren.
(Bedingungen der Entwicklung)
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Stab: Chromatorod S-111 (hergestellt von Kabushiki Kaisha Yatoron)
Lösungen für die Entwicklung:
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Erste Entwicklung: Chloroform/Methanol/Wasser (70/30/3 v/v), 8 cm
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Zweite Entwicklung: n-Hexan/Diethylether/Ameisensäure
(90/10/0,1 v/v), 10 cm
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Die Zusammensetzung der vier Molekülarten, die das oben erhaltene Phosphatidylcholin,
PLPC, POPC, SLPC und SOPC, bilden, wurde anhand eines RI-Nachweis-Diagramms
bestimmt, das mit der Hochleistungs-Flüssig-Säulenchromatographie unter den folgenden
Meßbedingungen erhalten worden war. Die Resultate waren wie in Tabelle 1 gezeigt, die später
angegeben werden wird. Das (PLPC + POPC)/(SLPC + SOPC)-Gewichtsverhältnis wurde
auf der Grundlage des Inhalts der so bestimmten Arten bestimmt. Die Resultate sind in
Tabelle 2 gezeigt, die später angegeben werden wird.
(Meßbedingungen)
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Füllstoff: Octadecyl-Kieselgel (innerer Durchmesser 4,6 mm · Länge 250 mm)
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Mobile Phase: Methylalkohol/l mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4, 93/7 v/v), 1,5
ml/min
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Nachweis: Differentialrefraktometer (RI)
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Probenmenge: 500 ug
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Weiterhin wurde die elektrische Leitfähigkeit des oben erhaltenen Phosphatidylcholins der
vorliegenden Erfindung mit dem folgenden Verfahren gemessen.
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Destilliertes Wasser wurde zu 1,5 g der Probe auf ein Gesamtgewicht von 30 g zugegeben.
Die Probe wurde in einem Homogenisator dispergiert, um eine 5%-Suspension der Probe in
destilliertem Wasser herzustellen. Die elektrische Leitfähigkeit dieser Phosphatidylcholin-
Suspension wurde mit einem elektrischen Leitfähigkeitsmeßgerät gemessen ("Conductivity
Meter DS-14" (Markenbezeichnung), hergestellt von Horiba, Ltd.). Die Resultate waren wie
in Tabelle 2 gezeigt, die später angegeben werden wird.
Beispiel 2
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250 g Dotter-Phospholipid (das näherungsweise 60% eines Phosphatidylcholins enthielt) mit
der folgenden Zusammensetzung wurde in absolutem Ethanol auf eine Gesamtmenge der
Lösung von 500 ml aufgelöst, um eine Probe zu erhalten.
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(Phospholipid-Zusammensetzung, Einheit = %)
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Phosphatidylcholin 62,4
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Phosphatidylethanolamin 11,8
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Neutrale Lipide 24,3
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Sphingolipid 0,7
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Lysophospholipid 0,8
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Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel
1 durchgeführt, und die Sammlung des Eluats wurde an dem Punkt begonnen, an dem das
Chromatogramm der Phosphatidylcholinfraktion einen Maximalwert zeigte, und wurde bis
zum Abschluß des Nachweises des Phosphatidylcholins mit Ultraviolett-Absorption
fortgesetzt.
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Die erhaltene Lösung wurde in einem Vakuumtrockner getrocknet, um 102,7 g des
Phosphatidylcholins der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Die Reinheit und Zusammensetzung des
Phosphatidylcholins wurden mit dem TLC-FID-Verfahren bestimmt, das in Beispiel 1
angewendet worden war. Die Resultate waren wie folgt.
(Zusammensetzung an Phosphatidylcholin der vorliegenden Erfindung)
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Phosphatidylcholin 74,9%
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Neutrale Lipide 24,6
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Sphingolipid 0,3
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Lysophospholipid 0,2
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Die Zusammensetzung der vier Molekülarten, die das erhaltene Phosphatidylcholin bilden,
und die elektrische Leitfähigkeit davon wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1
bestimmt. Die Resultate waren wie jeweils in Tabellen 1 und 2 gezeigt, die später angegeben
werden.
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Proben 1 bis 7 der Phosphatidylcholine, die als Kontrollen gegenüber den
Phosphatidylcholinen der vorliegenden Erfindung im Testbeispiel verwendet werden sollten, das später
beschrieben werden wird, wurden jeweils hergestellt oder auf die folgende Weise bereitgestellt.
Im Hinblick auf die erhaltenen Kontroll-Phosphatidylcholine wurden die Zusammensetzung
der vier Molekülarten, die das Phosphatidylcholin bilden, und die elektrische Leitfähigkeit auf
dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Resultate sind jeweils in Tabellen 1 und 2
gezeigt, die später angegeben werden.
Kontrollprobe 1
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Das selbe Dotter-Phospholipid wie in Beispiel 1 wurde einer Chromatographie unter
denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen.
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Ein Teil, bei dem das Phosphatidylethanolamin mit der Phosphatidylcholin-Fraktion
überlappt, wurde im voraus mittels Dünnschichtchromatographie bestätigt. Die Sammlung des
Eluats wurde begonnen, als die Elution des Phosphatidylethanolamins abgeschlossen war,
(bevor das Chromatogramm der Phosphatidylcholinfraktion einen Maximalwert zeigte), und
wurde bis zum Abschluß des Nachweises des Phosphatidylcholins mit Ultraviolett-
Absorption fortgesetzt.
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Die Lösungsmittelbestandteile wurden aus der gesammelten Lösung entfernt, und der
erhaltene Niederschlag wurde in einem Vakuumtrockner getrocknet, um 110,4 g eines
Phosphatidylcholins zu erhalten (Reinheit: 98,2%). (Die Reinheit wurde in Übereinstimmung mit dem
in Beispiel 1 angewendeten Verfahren gemessen, wie bei allen folgenden Proben.).
Kontrollprobe 2
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Das Phosphatidylcholin wurde mit dem in der japanischen Patentveröffentlichung Nr.
16/1985 beschriebenen Verfahren gereinigt.
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D. h. 50 ml Methanol wurden 5 g desselben gereinigten Dotter-Phospholipids wie in Beispiel
1 zugegeben, um eine Lösung zu erhalten. Dazu wurde eine Lösung zugegeben, die durch
Auflösen von 0,5 g Magnesiumsulfat in 3 ml destilliertem Wasser erhalten worden war.
Nachdem die Mischung gerührt und dann stehengelassen worden war, wurde nur der
Überstand der Mischung gesammelt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt,
um ein aufgereinigtes Phosphatidylcholin zu erhalten (Reinheit: 97,2%).
Kontrollprobe 3
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Eine die elektrische Leitfähigkeit kontrollierende Lösung, enthaltend Kaliumchlorid,
Natriumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid und Eisenchlorid, jedes in einer Konzentration
von 10 mM, wurde hergestellt.
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Destilliertes Wasser wurde getrennt zugegeben zu 1,5 g des in Beispiel 1 erhaltenen
Phosphatidylcholins auf ein Gesamtgewicht von 30 g. Danach wurde das Phosphatidylcholin in einem
Homogenisator dispergiert, um eine 5%-Suspension des Phosphatidylcholins in destilliertem
Wasser herzustellen.
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Dieser Phosphatidylcholin-Suspension wurden 0,3 ml der die elektrische Leitfähigkeit
kontrollierenden Lösung zugegeben, und die Mischung wurde dann lyophilisiert. Ein
Phosphatidylcholin mit einer kontrollierten elektrischen Leitfähigkeit wurde somit hergestellt.
Kontrollprobe 4
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Ein Phosphatidylcholin mit einer kontrollierten elektrischen Leitfähigkeit wurde auf dieselbe
Weise wie im Fall der Kontrollprobe 3 hergestellt, außer daß 0,5 ml der die elektrische
Leitfähigkeit kontrollierenden Lösung zugegeben wurde.
Kontrollprobe 5
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Ein Phosphatidylcholin mit einer kontrollierten elektrischen Leitfähigkeit wurde auf dieselbe
Weise wie im Fall von Kontrollprobe 3 hergestellt, außer daß 1 ml der die elektrische
Leitfähigkeit kontrollierenden Lösung zugegeben wurde.
Kontrollprobe 6
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Ein kommerziell erhältliches, gereinigtes Dotter-Phosphatidylcholin ("Coatsome NC-10S"
(Handelsmarke), hergestellt von Nippon Oils & Fats Co., Ltd., Reinheit: näherungsweise
99%) wurde bereitgestellt.
Kontrollprobe 7
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Ein kommerziell erhältliches aufgereinigtes Dotter-Phosphatidylcholin ("L-α-
Phosphatidylcholine Type X1-E" (Handelsmarke), hergestellt von SIGMA Co., Ltd.,
Reinheit: näherungsweise 99%) dessen Hersteller von dem von Kontrollprobe 6 unterschiedlich
ist, wurde bereitgestellt.
Tabelle 1
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Bemerkung 1: Die Zahlenwerte in der Tabelle zeigen die Höhen (cm) der jeweiligen
Molekülarten auf dem Diagramm an.
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Bemerkung 2: Die Zusammensetzungen der Molekülarten von Kontrollproben 3, 4
und 5 sind dieselben wie von Beispiel I.
Testbeispiel
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Im Hinblick auf die in Beispielen 1 und 2 erhaltenen Phosphatidylcholine der vorliegenden
Erfindung und die Phosphatidylcholine von Kontrollproben 1 bis 7 wurde eine Veränderung
des Peroxid-Werts (POV) mit Zeitablauf während der Lagerung auf die folgende Weise unter
den folgenden Bedingungen bestimmt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 2
angegeben.
(Lagerungsbedingungen)
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Jede Probe wurde auf eine Petrischale gebracht und ohne Abdeckung in einer dunklen
thermostatischen Kammer bei 20ºC stehengelassen.
(Messung von POV)
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Die Messung wurde in Übereinstimmung mit dem auf der ersten und zweiten Seite von
2.4.12-71 aus "Standard Assay Methods of Oils and Fats" beschriebenen Verfahren,
veröffentlicht von der Japan Oil Chemists' Society am 30. Januar 1972, durchgeführt.
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Die in Tabelle 2 gezeigten Resultate zeigen, daß nur die Phosphatidylcholine, die sowohl die
Gewichtsverhältnis- als auch die elektrischen Leitfähigkeits-Erfordernisse erfüllen, d. h. nur
diejenigen, die den Phosphatidylcholinen der vorliegenden Erfindung äquivalent sind,
bemerkenswert hohe Oxidationsstabilität haben.
Tabelle 2
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Bemerkung 1: Die in der Tabelle gezeigten Gewichtsverhältnisse wurden wie in
Beispiel 1 auf der Grundlage der in Tabelle 1 gezeigten Resultate erhalten.
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Bemerkung 2: Hinsichtlich der Punkte "Bewertung" und "Gesamtbewertung", gezeigt
in der Tabelle, zeigt "O" an, daß das Phosphatidylcholin die
Erfordernisse der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf das
Gewichtsverhältnis zwischen den Molekülarten und der elektrischen Leitfähigkeit des
Phosphatidylcholins der vorliegenden Erfindung erfüllt, und "X" zeigt
an, daß das Phosphatidylcholin diese Erfordernisse nicht erfüllt.
Weiterhin zeigt "-" an, daß die Messung unterbrochen wurde, da gefunden
wurde, daß das erhaltene Resultat klar unterschiedlich von denjenigen
war, die in Beispielen 1 und 2 erhalten worden waren.
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Beispiele von herkömmlicherweise bekannten Phosphatidylcholinen mit dem selben
Gewichtsverhältnis zwischen den Molekülarten wie dem der Phosphatidylcholine der
vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Bezugsbeispielen 1 und 2 dargestellt.
Bezugsbeispiel 1
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Ein Dotter-Phosphatidylcholin wurde in Übereinstimmung mit dem in LIPIDS, 2 (3), 217-224
(1967) beschriebenen Verfahren hergestellt. (Das so hergestellte Phosphatidylcholin hat einen
(PLPC + POPC)/(SLPC + SOPC)-Wert von 2,9, bestimmt gemäß der auf Seite 125 von
"Lecithins" (1985) gezeigten Tabelle der Molekülarten von Dotter-Phosphatidylcholinen,
veröffentlicht von der American Oil Chemists'Society.)
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Die elektrische Leitfähigkeit der oben hergestellten Probe war 270 uS/cm, gemessen auf die
selbe Weise wie in Beispiel 1.
Bezugsbeispiel 2
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Ein Dotter-Phosphatidylcholin wurde in Übereinstimmung mit dem in J. Biol. Chem., 188,
471-476 (1950) beschriebenen Verfahren hergestellt. (Das so hergestellte Phosphatidylcholin
hat das oben definierte Gewichtsverhältnis von 2,1, bestimmt gemäß der Tabelle auf Seite 125
des zuvor erwähnten "Lecithins".)
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Die elektrische Leitfähigkeit der oben hergestellten Probe war 390 uS/cm, gemessen auf
dieselbe Weise wie in Beispiel 1.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Die Phosphatidylcholine der vorliegenden Erfindung, ohne eine besondere Behandlung zu
erfordern, sind per se hervorragend bezüglich Oxidationsstabilität und haben die
fundamentalen Probleme eliminiert, die bei der Anwendung der herkömmlichen Phosphatidylcholine
angetroffen werden.
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Deshalb können die Phosphatidylcholine der vorliegenden Erfindung auf leichte Weise
gelagert werden, und Arzneien, Kosmetika, Nahrungsmittel oder ähnliches können ebenso leicht
unter Verwendung der Phosphatidylcholine hergestellt und stabil gelagert werden. Zusätzlich
sind die Phosphatidylcholine gegenüber Oxidation nicht empfindlich, so daß erwartet werden
kann, daß stabile Arzneien, Kosmetika, Nahrungsmittel oder ähnliches durch die Verwendung
der Phosphatidylcholine hergestellt werden.