DE69324118T2

DE69324118T2 - Verfahren zur Herstellung von Riboflavin

Info

Publication number: DE69324118T2
Application number: DE69324118T
Authority: DE
Inventors: Satoshi Koizumi; Sadao Teshiba; Yoshiyuki Yonetani
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1992-12-07
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2013-12-08
Also published as: JPH06225776A; NZ250369A; CA2110759A1; AU5221493A; AU673387B2; DE69324118D1; EP0604060B1; US5589355A; EP0604060A1; DK0604060T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin (Vitamin B2). Riboflavin ist ein wichtiges Vitamin, das in Medikamenten, Nahrungsmittelzusätzen, Färbemitteln für Nahrungsmittel etc. verwendbar ist.
Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Fermentation sowie Verfahren, charakterisiert durch das Kultivieren von mutierten Stämmen von Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii; Candida flareri, Saccharomyces cerevisiae etc. sind bekannt (Progress Industrial Microbiology, 1, 139 (1959), US-Patent Nr. 5 164 303 und veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 112 996/88).
In den Zusammenfassungen von japanischen Patenten, Band 14, Nr. 377, 15. August 1990, Nr. 2-138-988 ist die Herstellung von Flavinmononucleotid und Flavinadenindinucleotid aus einem ihrer Vorläufer durch Reaktion des Vorläufers mit Adenosin- 5'-triphosphat in Gegenwart eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, das eine rekombinante DNA enthält, die Enzyme codiert, die in der Biosynthese von Flavinmononucleotid oder Flavinadenindinucleotid eine Rolle spielen, beschrieben.
Zusätzlich beschreibt die EP 405 370, daß gentechnisch veränderte Mikroorganismen, die zu der Gattung Bacillus gehören, in die von Bacillus-abgeleitete Gene eingeführt werden, die Enzyme codieren, die bei der Biosynthese von Riboflavin eine Rolle spielen, zur Herstellung von Riboflavin verwendet werden. Die Veröffentlichung enthält eine Beschreibung von Bacillus-abgeleiteten Genen, die Enzyme codieren, die bei der Biosynthese von Riboflavin eine Rolle spielen, aber dort fin det sich keine spezifische Beschreibung einer DNA, die von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehört, und die beim Einführen in einen Riboflavin-benötigenden Mikroorganismus diesem Mikroorganismus die Fähigkeit verleiht, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum effizienten Herstellen von Riboflavin bei niedrigeren Kosten zur Verfügung zu stellen. Somit betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA, die von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Corynebacterium gehört, und die beim Einführen in einen Riboflavin-benötigenden Mikroorganismus auf den Mikroorganismus die Fähigkeit überträgt, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine isolierte DNA zur Verfügung gestellt, die von einem Mikroorganismus ableitbar ist, der zu der Gattung Corynebacterium gehört, und die beim Einführen in einem Riboflavin-benötigenden Wirtsmikroorganismus in der Lage ist, dem Mikroorganismus die Fähigkeit zu verleihen, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen, wobei die DNA mindestens Guanosintriphosphatcyclohydrolase und Riboflavinsynthase codiert.
Die Erfindung stellt auch eine rekombinante DNA zur Verfügung, umfassend die DNA und eine Vektor-DNA, einen Mikroorganismus, der die rekombinante DNA trägt, und ein Verfahren zum Herstellen von Riboflavin durch Kultivierung des Mikroorganismus in einem Medium, bis sich Riboflavin in der Kultur angesammelt hat, und das Gewinnen des Riboflavins aus dieser.
In den beiliegenden Zeichnungen zeigt:
Fig. 1 Restriktionsenzymkarten für die Plasmide pFM21 und pFM41 und
Fig. 2 eine Restriktionsenzymkarte für das Plasmid pFM201.
Als DNA der vorliegenden Erfindung ist jede DNA geeignet, sofern sie von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Corynebacterium gehört, und sie beim Einführen in einen Riboflavin-benötigenden Mikroorganismus dem Mikroorganismus die Fähigkeit verleiht, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen. Von der DNA wird angenommen, daß sie genetische Information für Enzyme trägt, die bei der Biosynthese von Riboflavin eine Rolle spielen, da die DNA beim Einführen in einen Riboflavin-benötigenden Mikroorganismus, dem die Enzymaktivität, die bei der Biosynthese von Riboflavin eine Rolle spielen, fehlt, dem Mikroorganismus die Fähigkeit verleiht, in einem Riboflavin-freien Medium zu wachsen.
Die DNA der vorliegenden Erfindung ist insbesondere eine DNA, die die Nucleotidsequenz aufweist, die in SEQ. ID Nr. 1 dargestellt ist. Zudem können DNAs, die eine Teilsequenz von dieser aufweisen, oder die eine teilweise durch eine andere Nueleotidsequenz ersetzte Sequenz aufweisen, als die DNA der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern sie einen Riboflavin-benötigenden Mikroorganismus die Fähigkeit verleihen, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen. Zum Beispiel wird ein 2,7 kb DNA-Fragment erwähnt, das die Nucleotidsequenz von Position 1476 zu Position 4164 in SEQ. ID Nr. 1 aufweist. Das DNA-Fragment enthält die Gene, die mindestens zwei Enzyme codieren, die bei der Synthese von Riboflavin eine Rolle spielen, wie Guanosintriphosphatcyclohydrolase und Riboflavinsynthase.
Als Donorquelle der DNA der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus erwähnt, der zu der Gattung Corynebacterium gehört, vorzugsweise Corynebacterium ammoniagenes. Insbesondere wird Corynebacterium ammoniagenes KY13313 (Amino acid Nucleic acid, 22, 15 (1970)) ganz besonders bevorzugt.
Eine chromosomale DNA (eine Donor-DNA) wird von dem Donor- Mikroorganismus auf konventionelle Art erhalten, z. B. durch Extraktion einer chromosomalen DNA mit Phenol [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)].
Als Vektor-DNA, in die die DNA der vorliegenden Erfindung eingeführt wird, ist jeder der Phagenvektoren, Plasmidvektoren etc. geeignet, sofern sie in einem Mikroorganismus, der zu der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium oder Escherichia gehört, autonom replizierbar ist. Bevorzugte Beispiele sind pCG1, pCG2, pCG4, pCGll, pCE52, pCE53 und pCE54 (US- Patente Nr. 4 617 267, 4 500 640 und 4 710 471).
Eine rekombinante DNA, umfassend eine Vektor-DNA und die DNA, die von dem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Corynebacterium gehört, und die beim Einführen in einen Riboflavin-benötigenden Mikroorganismus dem Mikroorganismus die Fähigkeit verleiht, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen, kann zusammen mit einer Vielzahl von rekombinanaten DNAs durch Spalten einer Donor-DNA und einer Vektor-DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen, z. B. PstI und BgIII, und anschließendes Ligieren beider DNAs durch die Wirkung einer DNA- Ligase erhalten werden. Die so erhaltene Mischung ligierter DNAs wird zum Transformieren eines Empfängers verwendet. Jeder der Riboflavin-benötigenden Mikroorganismen, der zu der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehört, und dem die Enzymaktivität fehlt, die bei der Biosynthese von Riboflavin eine Rolle spielt, kann als Empfänger verwendet werden. Zum Beispiel kann Corynebacterium ammoniagenes RK122 (Beispiel 4) als Empfänger verwendet werden.
Der Empfänger wird mit der Vielzahl der so erhaltenen rekombinanten DNAs nach einem konventionellen Verfahren transformiert, wie dem Protoplast-Verfahren (veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 248 394/88), dem Elektroporationsverfahren [W. J. Dower et al., Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)] und dem Verfahren von Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1979)].
Ein Transformant mit der gewünschten Enzymaktivität, die bei der Biosynthese von Riboflavin eine Rolle spielt, kann durch Selektieren der so erhaltenen Transformanten nach einem Transformanten, der fähig ist, auf einem Riboflavin-freien Medium zu wachsen, erhalten werden.
Falls die Vektor-DNA einen selektiven Marker enthält, z. B. eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, kann nach dem erwünschten Transformanten durch Zugabe des Antibiotikums zu dem selektiven Medium leichter selektiert werden.
Die erwünschte rekombinante DNA kann aus dem so selektierten Transformanten isoliert werden und dann in einen anderen Mikroorganismus, der zu der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehört, nach einem konventionellen Verfahren eingeführt werden. Alternativ kann die eingesetzte DNA aus der rekombinanten DNA ausgeschnitten werden und in eine andere Vektor-DNA ligiert werden, und die DNA kann dann in einen Mikroorganismus eingeführt werden, der zu der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehört. Solche Mikroorganis men schließen z. B. Corynebacterium ammoniagenes KY13313 etc. ein.
Unter Verwendung eines anderen bakteriellen Wirt-Vektor- Systems kann die DNA der vorliegenden Erfindung auch in eine andere bakterielle Spezies eingeführt werden.
Jede der bekannten Wirt-Vektor-Systeme, wie die der Gattungen Escherichia, Bacillus etc., können verwendet werden. Insbesondere wird Escherichia coli JM105 [GENE, 33, 103 (1985)] für diesen Zweck erwähnt.
Als Transformanten mit der gewünschten Enzymaktivität können Corynebacterium ammoniagenes KY13313/pFM21 und KY13313/pFM41 erwähnt werden. KY13313/pFM21 bzw. KY13313/pFM41 tragen die rekombinanten DNAs pFM41. pFM21 und pFM41 tragen die DNA der vorliegenden Erfindung. Corynebacterium ammoniagenes KY13313/pFM41 ist als Corynebacterium ammoniagenes FM41 (FERM BP-4003) beim National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 9. September 1992, gemäß dem Budapester Abkommen, hinterlegt worden.
Riboflavin kann effizient bei geringeren Kosten durch Kultivierung eines Mikroorganismus hergestellt werden, der zu der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium oder Escherichia gehört und der eine rekombinante DNA trägt, die eine Vektor- DNA und eine DNA umfaßt, die von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehört, und die beim Einführen in einen Riboflavinbenötigenden Mikroorganismus diesem Mikroorganismus die Fähigkeit verleiht, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen.
Der Mikroorganismus wird gemäß einem für die Kultivierung von üblichen Mikroorganismen herkömmlichen Verfahren kultiviert. Das heißt, der Mikroorganismus wird unter Steuerung der Temperatur und des pHs unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Medium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen, Aminosäuren und Vitamine enthält, kultiviert.
Jede eingesetzte Kohlenstoffquelle kann verwendet werden, sofern der Mikroorganismus sie assimilieren kann. Zum Beispiel werden Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Sucrose, Melasse, Stärke, Stärkehydrolysate etc., organische Säuren, wie Gluconsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure etc., und Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Alanin, Aspartinsäure etc., erwähnt. Die Kohlenstoffquelle wird vorzugsweise in einer Konzentration von 5 bis 40% verwendet.
Als Stickstoffquelle können Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat etc., Stickstoff-enthaltende organische Substanzen, wie Harnstoff, Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Kaseinhydrolysate, Fischmehl oder seine verdauten Produkte, und verschiedene Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure etc., erwähnt werden. Diese Substanzen werden üblicherweise in einer Konzentration von 0,1 bis 10% eingesetzt.
Als anorganische Verbindung können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumphosphat, Natriumchlorid, Eisen(II)sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Calciumcarbonat etc., erwähnt werden. Falls von den Mikroorganismen für ihr Wachstum benötigt, werden Nährstoffe, wie Aminosäuren, Nucleinsäuren, Vitamine etc., in einer geeigneten Menge zugegeben. Wenn diese Substanzen in anderen Nährstoffen, wie sie oben aufgezählt sind, enthalten sind, ist ihre Zugabe nicht speziell erforderlich.
Die Kultivierung erfolgt unter aeroben Bedingungen, z. B. durch Schüttelkultur oder durch Belüftungs-Rührkultur, vorzugsweise bei 20 bis 40ºC für 24 bis 144 Stunden. Der pH des Mediums wird vorzugsweise durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak, einer Harnstofflösung, einer Natriumhydroxidlösung etc., im neutralen Bereich gehalten.
Das so gebildete Riboflavin kann durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Reverse-Phase-Säule [z. B. RP-18 (ein Produkt von Merck)] anhand der Überwachung seiner Fluoreszenzintensität bei einer Emissionswellenlänge von 530 nm und einer Erregerwellenlänge von 450 nm quantitativ bestimmt werden.
Riboflavin kann aus der Kultur durch eine konventionelle Reinigungsmethode, wie Fällung, Chromatograhie, z. B. unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, etc., gewonnen werden.
Erfindungsgemäß kann Riboflavin effizient durch Fermentation hergestellt werden.

BEISPIELE

Hieran anschließend wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele spezifisch beschrieben.

Beispiel 1 Herstellung von chromosomaler DNA

Corynebacterium ammoniagenes KY13313 wurde in ein AIII-AG- Medium [10 g/l Polypepton, 10 g/l Fleischextrakt, 5 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Natriumchlorid, 30 ug/l Biotin, 20 mg/l Adenin und 10 g/l Glycin, pH 7,2] eingeimpft und durch Schütteln bei 30ºC für 10 Stunden kultiviert. 0,6 g der kultivierten Zellen wurden in 18 ml P-4-Puffer [25 mM N-Tris(hydroxymethyl)- methyl-2-aminoethansulfonsäure, (pH 7,6), 70 mM Natriumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid, 5 mM Calciumchlorid und 1,6 M D-Sorbitol] suspendiert, gefolgt von der Zugabe von 2 ml P-4- Puffer, der 12 mg/ml Lysozym und 3 mg/ml Acromopeptidase enthält. Man ließ die Zellsuspension für 20 Stunden bei 30ºC stehen, wodurch ein Protoplast erhalten wurde. Der Protoplast wurde durch Zentrifugation angesammelt und dann in TSMC- Puffer [50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 0,6 M Natriumsuccinat, 10 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Calciumchlorid] suspendiert und erneut zentrifugiert. Der als Präzipitat erhaltene Protoplast wurde in 12 ml TES-Puffer [10 mM Tris- HCl-puffer (pH 8,0), 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat (EDTA) und 10 mM Natriumchlorid] suspendiert und man ließ für 30 Minuten bei 4ºC stehen. 0,28 ml 5 M Natriumchlorid und 0,04 ml 5 mg/ml Ribonuclease A (Produkt von Sigma) wurden dazugegeben, und die Mischung wurde für 20 Minuten bei 37ºC stehengelassen. Anschließend wurden 0,72 ml 10%i Natriumlaurylsulfat dazugegeben, und die Mischung wurde für 2 Stunden bei 4ºC stehengelassen und dann für 5 Minuten auf 65ºC erhitzt. Zu der Lösung wurden 13 ml mit TES-Puffer gesättigtes Phenol zugegeben, und die Mischung wurde gründlich gerührt. Die Lösung wurde zentrifugiert, und die wäßrige Schicht wurde gewonnen. Dieses Verfahren der Phenolextraktion wurde weitere zweimal wiederholt, und dann wurde ein gleiches Volumen Chloroform zugegeben, gründlich gerührt und zentrifu giert, wodurch sich eine wäßrige Schicht ergab. 1,2 ml 2,5 M Natriumacetat wurden zu 12 ml dieser so erhaltenen Lösung zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 30 ml Ethanol. Die so gefällte chromosomale DNA wurde um einen Glasstab gewunden und dann getrocknet. Das Produkt wurde in 1 ml TE-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA] gelöst.

Beispiel 2 Herstellung von rekombinanter DNA

40 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu einer Lösung zugegeben, die 50 ug der in Beispiel 1 erhaltenen chromosomalen DNA enthielt, und die Mischung wurde für 3 Stunden bei 37ºC stehengelassen. Getrennt davon wurden 40 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI einer Lösung zugegeben, die 50 ug der Vektor pCG11-DNA enthielt, wie konstruiert gemäß dem Verfahren, wie es im US- Patent Nr. 4 500 640 beschrieben ist, und die Mischung wurde für 3 Stunden bei 37ºC stehengelassen, gefolgt von der Zugabe von 5 Einheiten alkalischer Phosphatase. Die Mischung wurde für 1 Stunde bei 65ºC dephosphoryliert. Von den beiden obigen Reaktionslösungen wurde die chromosomale DNA und die Vektor- DNA durch Phenolextraktion und Ethanolfällung in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, gereinigt. Für die Herstellung der rekombinanten DNAs wurden 10 ug der so behandelten chromosomalen DNA und 20 ug der so behandelten Vektor-DNA für 16 Stunden bei 16ºC in Gegenwart von 700 Einheiten T4-DNA-Ligase (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) in T4-Ligase-Puffer [66 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol und 0,1 mM ATP] ligiert.
40 Einheiten des Restriktionsenzyms BglII (Produkt von Takara Shuzo Co,. Ltd.) wurden zu einer Lösung zugegeben, die 50 ug der obigen chromosomalen DNA enthielt, und die DNA wurde für 3 Stunden bei 37ºC auf die gleiche Art, wie oben beschrieben, verdaut. Getrennt davon wurden 40 Einheiten des Restriktionsenzyms BgIII einer Lösung zugegeben, die 50 ug der Vektor- pCG11-DNA enthielt, und der Vektor wurde dann für 3 Stunden bei 37ºC verdaut. Nach Zugabe von 5 Einheiten alkalischer Phosphatase wurde die Mischung für 1 Stunde bei 65ºC dephosphoryliert. Aus den beiden resultierenden Reaktionslösungen wurde die chromosomale DNA und die Vektor-DNA durch Phenolextraktion und Ethanolfällung in gleicher Weise, wie oben beschrieben, gereinigt. Für die Herstellung von rekombinanten DNAs wurden 10 ug so behandelter chromosomaler DNA und 20 ug so behandelter Vektor-DNA für 16 Stunden bei 16ºC in Gegenwart von 700 Einheiten T4-DNA-Ligase (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) im T4-Ligase-Puffer ligiert.

Beispiel 3 Erhalt eines Riboflavin-benötigenden Stammes aus Corynebacterium ammoniagenes

Der Riboflavin-benötigende Stamm RK122 wurde aus Corynebacterium ammoniagenes KY13313 auf folgende Art erhalten.
Corynebacterium ammoniagenes KY13313 wurde für 7 Stunden bei 30ºC in einem Medium kultiviert, das die gleiche Zusammensetzung wie AIII AG Medium hat, außer daß Glycin nicht enthalten ist, und dann für 90 Minuten bei 30ºC unter Verwendung von 100 ug/ml N-Methyl-N'-nitronitrosoguanidin mutiert. Die Zellen wurden angesammelt, gewaschen und in ein Riboflavinfreies Minimalflüssigmedium eingeimpft [20 g/l Glucose, 0,1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,3 g/ K&sub2;HPO&sub4;, 0,3 g/l MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,01 g/l CaCl&sub2; · 2H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4; · 7H&sub2;O, 1 mg/l ZnSO&sub4;. 7H&sub2;O, 4 mg/l MnSO&sub4; · 4-6H&sub2;O, 0,2 mg/l CuSO&sub4; · 5H&sub2;O, 40 mg/l L-Cystein, 10 mg/l Vitamin B1, 20 mg/l Ca-D-Pantothensäure, 60 ug/l Biotin, 3 g/l NH&sub4;Cl, 2 g/l Harnstoff, 50 mg/l Adenin, pH 7,2], gefolgt von Kultivierung bei 30ºC. 100 U/ml Penicillin G wurden während der logarithmischen Wachstumsphase zugegeben, gefolgt von 16-stündiger zusätzlicher Kultivierung bei 30ºC, so daß die Riboflavin-benötigenden Stämme konzentriert wurden.
Der ausschließlich zum Wachstum in einem Riboflavin-enthaltenden Minimalmedium fähige Riboflavin-benötigende Stamm RK122 wurde durch Replika-Plattierung auf einem Minimalagarmedium mit oder ohne 5 mg/l Riboflavin [ein flüssiges Minimalmedium, das 2% Agar enthält] erhalten.

Beispiel 4 Transformation des Riboflavin-benötigenden Stammes Corynebacterium ammoniagenes RKIZZ mit der rekombinanten DNA

Gemäß dem Elektroporationsverfahren [W. J. Dower et al., Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)] wurde der Riboflavin-benötigende Stamm mit der rekombinanten DNA auf die folgende Weise transformiert.
Corynebacterium ammoniagenes RK122 wurde für 5 Stunden bei 30ºC in einem AIII AG Medium kultiviert, dann mit 15% Glycerinlösung (gekühlt auf Eis), die 272 mM Sucrose enthielt, gewaschen und in der gleichen Lösung, wie oben erwähnt, suspendiert. Die resultierende Zellsuspension wurde mit einer Lösung der in Beispiel 2 erhaltenen PstI-verdauten rekombinanten DNA gemischt, und die Transformation wurde mit einem Gene-Pulser (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) gemäß dem Elektroporationsverfahren (eine Spannung von 2,5 kV, Kapazität von 24 uF und ein Widerstand von 200 Ω) ausgeführt.
Dann wurde die Zellsuspension auf einem Minimalmediumagar, der 150 ug/l Spectinomycin enthielt, ausplattiert und für 3 Tage bei 30ºC kultiviert. Corynebacterium ammoniagenes RK122/pFM21 (das resistent ist gegen Spectinomycin und kein Riboflavin benötigt) wurde von Kolonien, die auf der Mediumagarplatte erschienen, erneut ausplattiert.
Gemäß dem Verfahren, wie oben beschrieben, wurde das Transformant RK122/pFM41 unter Verwendung der BglII-verdauten rekombinanten DNA, die in Beispiel 2 erhalten wurde, erhalten.

Beispiel 5 Gewinnung von Plasmiden aus den Transformanten

Die Transformanten RK122/pFM21 bzw. RK122/pFM41 wurden in 250 ml AIII AG Medium, das Spectinomycin enthielt, kultiviert. Gemäß dem Verfahren, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, wurden Plasmid-DNAs, jeweils etwa 100 ug, aus den Kulturen von RK122/pFM21 bzw. RK122/pFM41 erhalten, und diese Plasmide wurden als pFM21 bzw. pFM41 bezeichnet. Fig. 1 zeigt Restriktionsenzymkarten der rekombinanten Plasmide pFM21 und pFM41, in denen die eingesetzten Fragmente 4,7 bzw. 4,2 kb betragen. In pFM41, das in Fig. 1 beschrieben ist, konnte die in Klammern gesetzte BglII-Schnittstelle nicht mit BglII geschnitten werden, aufgrund einiger möglicher Gründe, wie Mikroorganismus bei der Spaltung der chromosomalen DNA oder der Behandlung der Vektor-DNA mit Phosphatase. Das mit den Restriktionsenzymen PstI und BglII ausgeschnittene 2,7 kb-Fragment war in beiden Plasmiden enthalten.

Beispiel 6 Messung der Riboflavinsynthase-Aktivität

Gemäß dem in Method in Enzymology 122, 192 (1986) beschriebenen Verfahren wurden die Transformanten KY13313/pCG11, KY13313/pFM21 und KY13313/pFM41 auf ihre Riboflavinsynthase- Aktivität hin vermessen. Das Ergebnis zeigte, daß die Transformanten, die die rekombinanten DNAs pFm21 und pFM41 trugen, Enzymaktivitäten aufwiesen, die 3,8- bzw. 1,8-fach so hoch waren wie die des Transformanten, der den Vektor pCG11 allein trug.

Beispiel 7 Messung der Guanosintriphosphatcyclohydrolase- Aktivität

Gemäß dem Verfahren, wie in Archives of Microbiology, 124, 255 (1980) beschrieben, wurden die Transformanten KY13313/pCG11, KY13313/pFM21 und KY13313/pFM41 auf ihre Guanosintriphosphatcyclohydrolase-Aktivität hin vermessen. Das Ergebnis zeigte, daß die Transformanten, die pFM21 und pFM41 trugen, eine 6,1- bzw. 4,3-fach höhere Enzymaktivität, verglichen mit der des Transformanten, der den Vektor pCG11 allein trug, aufwiesen.

Beispiel 8 Analyse der DNA, die dem Riboflavin-benötigenden Stamm die Fähigkeit verleihen kann, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen

Die DNA-Nucleotid-Sequenz des 5,6 kb-SalI-SalI-Fragments (das das gemeinsame 2,7 kb-Fragment enthält), eingesetzt in Plasmid pFM21 und pFM41, wurde durch die Didesoxymethode [Messing, J., Method in Enzymology, 101, 20 (1983)] bestimmt. Das Ergebnis ist in SEQ. ID Nr. 1 angegeben.

Beispiel 9 Einführen des Plasmids in Escherichia coli

Eine Lösung, die 1 ug der Plasmid pFM21-DANN enthält, die in Beispiel 5 erhalten wurde, wurde für 1 Stunde bei 37ºC mit 2 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI verdaut. Dann wurde ein 4,7 kb-Fragment aus dem verdauten Produkt durch Agarosegel- Elektrophorese isoliert.
Getrennt davon wurden 0,5 ug des Vektors pUC19 (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) für 1 Stunde bei 37ºC mit 2 Einheiten von PstI verdaut und dann mit alkalischer Phosphatase auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, dephosphoryliert. Die so erhaltene Vektor-DNA wurde dann einer Phenolextraktion und Ethanolfällung unterworfen. 100 ng des obigen pFM21-abgeleitete DNA-Fragments wurden mit 50 ng der obigen Vektor-DNA gemischt. Die Mischung wurde bei 16ºC für 2 Stunden in Gegenwart von 100 Einheiten T4-Ligase im T4-Ligase- Puffer ligiert. Die resultierende rekombinante DNA wurde zur Transformation von E. coli JM105 gemäß dem von Cohen et al. beschriebenen Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1979)] verwendet, und die Zellen wurden auf LB-Agarmedium [ein Medium, das durch Zugabe von 1,5% Agar zu einem LB-Flüssigmedium (10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid, pH 7,2) hergestellt wird], das 100 mg/l Ampicillin, 0,1 mM Isopropylthiogalactosid und 0,004% 5-Brom- 4-chlor-3-indoyl-β-D-galactopyranosid enthält, ausplattiert.
Aus den resultierenden weißen Transformanten wurde Plasmid- DNA gemäß dem Verfahren von Maniatis et al. [Molecular Cloning A Labaoratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] isoliert und gereinigt. Diese Plasmid-DNA wurde durch Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen auf ihre Struktur hin analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Plasmid-DNA die in Fig. 2 beschriebene Struktur hat, in der ein pFM21-abgeleitetes DNA-Fragment, das die Gene enthält, die die Enzyme codieren, die bei der Synthese des Riboflavins eine Rolle spielen, nach dem pUC19-Lac-Promotor eingesetzt sind, und diese Plasmid-DNA wurde als pFM201 bezeichnet.

Beispiel 10 Herstellung von Riboflavin durch Verwendung eines Escherichia coli-Transformanten

Ein Transformant Escherichia coli JM105/pFM201, erhalten in Beispiel 9, wurde in 8 ml flüssiges LB-Medium eingeimpft, das 100 mg/l Ampicillin enthielt, gefolgt von Kultivierung für 16 Stunden bei 30ºC. Die so erhaltene Kulturlösung wurde in 8 ml Minimalmedium eingeimpft, das 100 mg/l Ampicillin enthielt (3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 5 g/l NaCl, 1 g/l NH&sub4;Cl, 6 g/l NaHPO&sub4;, 0,25 g/l MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 4 mg/l Vitamin B1 und 3 g/l Glucose) und für 24 Stunden bei 30ºC kultiviert. Die Menge des Riboflavins, das sich in der Kulturlösung ansammelte, betrug 14,4 mg/l. Im Gegensatz dazu wurden 0,3 mg/l Riboflavin in der Kultur angesammelt, die unter den gleichen Bedingungen mit E. coli JM105/pUC19, die nur das Vektorplasmid pUC19 enthielten, erhalten wurde.

Beispiel 11 Herstellung von Riboflavin durch Verwendung eines Corynebacterium ammoniagenes-Transformanten

Corynebacterium ammoniagenes KY13313 wurde nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren mit der pFM41-DNA, die in Beispiel 5 erhalten wurde, transformiert. Eine Suspension der Zellen wurde auf einem Medium ausplattiert, das 150 ug/l Spectinomycin enthielt und für 3 Tage bei 30ºC kultiviert. Ein Spectinomycin-resistenter Transformant, Corynebacterium ammoniagenes FM41 (FERM BP-4003) wurde aus den wachsenden Kolonien erhalten.
Corynebacterium ammoniagenes FM41 wurde in 8 ml Aussaatmedium [10 g/l Polypepton, 10 g/l Fleischextrakt, 5 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Natriumchlorid, 30 ug/l Biotin, 20 mg/l Adenin und 150 mg/l Spectinomycin, pH 7,2] in einem Teströhrchen ausgesät. Die Zellen wurden dann für 24 Tage bei 30ºC unter Schütteln kultiviert. 1,5 ml der Kultur wurden in 30 ml Fermentationsmedium (Tabelle 1) in einen 300 ml-Erlenmeyerkolben eingesät. Nach 72-stündigem Schütteln der Kultur bei 30ºC hatte sich das Riboflavin in einer Menge von 620 mg/l in der Kultur angesammelt. Im Gegensatz dazu hatte sich das Riboflavin in einer Menge von 35 mg/l in der Kultur angesammelt, die unter den gleichen Bedingungen mit Corynebacterium ammoniagenes KY13313, das nur das Vektorplasmid pCG11 trug, erhalten wurde.

Tabelle 1

Bestandteil Gehalt

Polypepton 10 g/l
Glucose 80 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 1 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 3 g/l
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 1 g/l
CaCl&sub2; · 2H&sub2;O 0,1 g/l
FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 10 mg/l
ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O 1 mg/l
MnSO&sub4; · 4-6H&sub2;O 4 mg/l
CuSO&sub4; · 5H&sub2;O 0,2 mg/l
L-Cystein 40 mg/l
Vitamin B1 10 mg/l
Ca-D-Pantothensäure 20 mg/l
Biotin 60 ug/l
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 5 g/l
Harnstoff 5 g/l
Adenin 100 mg/l
Spectinomycin 150 mg/l
CaCO&sub3; 20 g/l
pH 7,2

Beispiel 12 Unterschied zum Bacillus-abgeleiteten Gen

5 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI wurden zu einer Lösung zugegeben, die 2 ug chromosomale DNA von Bacillus subtilis 168 enthielt, und die DNA wurde für 5 Stunden bei 37ºC verdaut. Anschließend wurden die DNA-Fragmente einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, auf einem Nylonfilter immobilisiert, und einer Southern-Hybridisierung mit einem 1 kb- XhoI-HindIII-Fragment als Sonde, die von pFM201 abgeleitet war, unterzogen, unter Verwendung eines nichtradioaktiven Systemkits zum Markieren und Nachweisen von DNA, produziert von Boehringer Mannheim Yamanouchi Co., Ltd. Als Ergebnis wurde keine Hybridisierung zwischen der Sonde und der chromosomalen DNA vom Stamm 168 beobachtet.

Sequenzauflistung

SEQ ID Nr: 1
Sequenzlänge: 5589
Sequenztyp: Nucleinsäure
Topology: linear
Molecularer Typ: genomische DNA
hypothetisch: Nein
Gegenstrang: Nein
Originalquelle
Organismus: Corynebacterium ammoniagenes Sequenz:

Claims

1. Isolierte DNA, die von einem Mikroorganismus ableitbar ist, der zur Gattung Corynebacterium gehörte und die beim Einführen in einen Riboflavin-benötigenden Wirtsmikroorganismus in der Lage ist, dem Mikroorganismus die Fähigkeit zu verleihen, seinen Riboflavin-Bedarf zu ergänzen, wobei die DNA mindestens Guanosintriphosphatcyclohydrolase und Riboflavinsynthase codiert.

2. DNA nach Anspruch 1, die die in SEQ. ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder eine Teilsequenz von dieser aufweist.

3. DNA nach Anspruch 2, die das 2,7 kb DNA-Fragment von Position 1476 bis Position 4164 in der Nucleotidsequenz ist, die in SEQ. ID Nr. 1 dargestellt ist.

4. DNA nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, die von Corynebacterium ammoniagenes ableitbar ist.

5. Rekombinante DNA, umfassend eine DNA, wie in mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche definiert, und eine Vektor-DNA.

6. Mikroorganismus, der eine rekombinante DNA, wie in Anspruch 5 definiert, trägt.

7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, der zu der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium oder Escherichia gehört.

8. Verfahren zur Herstellung von Riboflavin, wobei das Verfahren das Kultivieren eines Mikroorganismus in einem Medium umfaßt, bis sich Riboflavin in der Kultur angesammelt hat, und das Gewinnen des Riboflavins aus dieser, wobei der Mikroorganismus wie in Anspruch 6 oder 7 definiert ist.