-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von 5'-Guanylsäure (hier nachstehend als GMP
bezeichnet). Es betrifft insbesondere ein Verfahren zur
Herstellung von GMP unter Verwendung von Escherichia coli
mit der Fähigkeit zur Umwandlung von 5'-Xanthylsäure (hier
nachstehend als XMP bezeichnet) und Ammoniak und/oder
L-Glutamin zu GMP und ferner mit der Fähigkeit zur Umwandlung von
Adenosinmonophosphat (hier nachstehend als AMP bezeichnet)
zu Adenosintriphosphat (hier nachstehend als ATP bezeichnet)
in Gegenwart eines anderen Energiedonors als
phosphorylierter Verbindungen, und ein Verfahren zur Herstellung
von GMP aus XMP durch Züchtung einer Transformanten in einem
Medium, die durch Transformation eines Mikroorganismus mit
einer rekombinanten DNA aus einem DNA-Fragment, das ein
Guanylsäure-Synthetase-Gen mit der Fähigkeit zur Umwandlung von
XMP und Ammoniak und/oder L-Glutamin zu GMP in Gegenwart von
ATP enthält (die Guanylsäure-Synthetase wird auch als
Xanthylsäure-Aminase bezeichnet und wird hier nachstehend als
GMP-Synthetase bezeichnet) und einem Vektor-DNA-Fragment,
und durch Durchführung der Umsetzung unter Verwendung der
erhaltenen Kulturflüssigkeit, der Zellen oder ihrer
behandelten Produkte als einer Enzymquelle.
-
Es besteht eine große Nachfrage nach GMP als
Gewürzwirkstoff, und die Entwicklung eines Verfahrens zur
Herstellung von GMP mit niedrigeren Kosten war wünschenswert. Zu
den bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von GMP
gehören (1) ein Verfahren zum enzymatischen Abbau von
Ribonucleinsäuren, (2) ein Verfahren zur chemischen
Phosphorylierung von Guanosin und (3) ein Verfahren zur Umwandlung
von XMP zu GMP mit Hilfe von Bakterien, die zur Gattung
Brevibakterium oder der Gattung Corynebakterium gehören
[japanische Patentveröffentlichung Nr. 39069/71; japanische
Patentanmeldung Nr. 187050/82], etc.. Verfahren (3) ist ein
vorteilhaftes Verfahren unter Verwendung eines
Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Regeneration von ATP, das zur
Umwandlung von AMP durch Assimilierung von billigen
Energiedonoren, zum Beispiel Glucose benötigt wird, wie nachstehend
dargestellt ist.
-
Ferner ist ein Verfahren unter Verwendung eines
Mutanten-Stammes bekannt, dessen GMP-Synthetase-Aktivität
durch eine Resistenz gegen Chemikalien verstärkt wird
[Biotechnol. Bioengineer. 13 (1971), 229-240].
-
Als Ergebnis von Untersuchungen zur Entwicklung eines
vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung von GMP ist
festgestellt worden, daß GMP durch Escherichia coli mit einer GMP-
Synthetase-Aktivität und einer Fähigkeit zur Umwandlung von
AMP zu ATP durch Verwendung eines anderen Energiedonors als
phosphorylierte Verbindungen in Gegenwart von Phosphationen
und Magnesiumionen hergestellt werden kann (die Fähigkeit
wird hier nachstehend als Fähigkeit zur ATP-Regeneration
bezeichnet), und daß eine Transformante mit einer hohen
Aktivität zur Umwandlung von XMP zu GMP durch Clonierung
eines GMP-Synthetase-Gens (hier nachstehend manchmal als guaA
bezeichnet) in den Plasmid-Vektor pBR322, durch Ligierung
eines Promotors des Tryptophan-Operons von Escherichia coli
(hier nachstehend als trp-Promotor oder Ptrp bezeichnet)
stromaufwärts von guaA zur Konstruktion eines rekombinanten
Plasmids und durch Transformation eines Mikroorganismus mit
dem so erhaltenen Plasmid erhalten werden kann.
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden XMP und
Ammoniak und/oder L-Glutamin in einem wäßrigen Medium in
Gegenwart von Zellen eines Mikroorganismus, der ausgewählt
wurde aus der Gruppe von Escherichia coli K294/pXAI, FERM
BP-498, Escherichia coli K294/pXA10, FERM BP-499 und
Escherichia coli K294/pXAR33, FERM BP-500, und in Gegenwart
eines anderen Energiedonors als phosphorylierte Verbindungen
zu GMP umgewandelt, und GMP wird aus der Reaktionslösung
gewonnen, wodurch GMP in hoher Ausbeute hergestellt werden
kann.
-
Weitere Escherichia coli (hier nachstehend manchmal
als E. coli bezeichnet), die in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können, da sie eine Fähigkeit zur Bildung
von GMP aus dem Substrat aufweisen, sind E. coli PL1068
[vgl. J. Gen. Microbiol. 123 (1981), 27-37] und E. coli K294
(r&supmin;, m&spplus;) FERM BP-526.
-
Die Transformante, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, kann auf die nachfolgend beschriebene Weise
erhaltenen werden.
-
Das DNA-Fragment, das ein in der vorliegenden
Erfindung zu verwendendes GMP-Synthetase-Gen enthält,
schließt die ein, die von Prokaryoten, Bacteriophagen und
Plasmiden abstammen, von denen DNA-Fragmente, die ein GMP-
Synthetase-Gen enthalten und von Escherichia coli abstammen,
und das DNA-Fragment enthaltende Plasmide bevorzugt werden.
Insbesondere ist pLC34-10 oder pLC32-25, ein Hybrid-Plasmid
eines DNA-Fragments, das vom Chromosom von Escherichia coli
abstammt und sowohl ein Inosinsäure-Dehydrogenase-Gen (hier
nachstehend gelegentlich als guaB bezeichnet) als auch ein
guaA-Gen zusammen mit Colicin E&sub1;-(hier nachstehend als ColE&sub1;
bezeichnet) DNA enthält, eine bevorzugte guaA-Quelle [beide
werden in Methods in Enzymology 68 (1979), 396-408,
beschrieben], und die Plasmid-DNA wird vom Escherichia coli-
Stamm JA200, der diese Plasmide enthält, gewonnen [erhalten
von der Yale University, E. coli Genetic Stock Center (hier
nachstehend als CGSC bezeichnet), beschrieben von L. Clarke
und J. Carbon, Cell 9 (1976), 91-99] und nach einem
bekannten Verfahren [Nucleic Acids Research 7 (1979), 1513, dieses
Verfahren wird hier nachstehend zur Gewinnung der Plasmide
verwendet] gereinigt.
-
Auf dem Chromosom von Escherichia coli befindet sich
guaA unmittelbar stromabwärts von guaB, und sowohl das guaA-
als auch das guaB-Gen bilden zusammen mit der Promotor-
Operator- Region stromaufwärts von guaB ein Operon [Molec.
gen. Genet. 147 (1976), 203-208]
-
Bei einer Anreicherung von GMP in den Zellen wird die
Expression beider Gene unterdrückt. Ferner ist bekannt, daß
es einen sekundären Promotor zwischen guaB und guaA (oder in
der guaB-Region) gibt, der bei der Transkription eine
niedrigere Aktivität als der Promotor stromaufwärts aufweist
[J. Bact. 131 (1977) , 685-688]
-
Jedes Plasmid kann zur Konstruktion eines
rekombinanten Plasmids verwendet werden, das zur wirksamen Expression
der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden
GMP-Synthetase fähig ist, wenn es die Expression des
GMP-Synthetase-Gens in Escherichia coli ermöglicht. Diejenigen, die
eine Eigenschaft wie die Verleihung einer Resistenz gegen
Antibiotika etc. an einen Wirtsmikroorganismus aufweisen,
werden stärker bevorzugt. Bestimmte Beispiele dafür
schließen pBR322 [Gene. 2 (1977), 95] und pBR325 [Gene. 4
(1978), 121] ein, und z. B. die Vektoren pGBK3 oder pGBY1,
die einen trp-Promotor aufweisen und in den Beispielen der
vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden besonders
erwähnt.
-
Die Herstellung des rekombinanten DNA-Fragmentes, das
ein Gen und die Vektor-DNA enthält, kann nach einer
bekannten in vitro-DNA-Rekombinationstechnik durchgeführt werden.
Die in vitro-DNA-Rekombination wird üblicherweise durch
physikalische oder enzymatische Spaltung und Ligierung (Ligase-
Reaktion) einer Donor-DNA, die das gewünschte Gen enthält,
und einer Vektor-DNA durchgeführt. Die Gewinnung der
gewünschten Rekombinante aus der Ligase-Reaktionslösung kann
durch direkte Transformation von Escherichia coli mit dem
DNA-Gemisch, selektive Abtrennung der Transformanten, die
mit einer genetischen Eigenschaft ausgestattet ist, die von
der genetischen Information des gewünschten Gens stammt, und
Isolierung durch Extraktion der Rekombinante aus den
gezüchteten Zellen der Transformanten durchgeführt werden. Bei
Verwendung eines Vektors, der einem Wirtsstamm eine
Resistenz gegen Chemikalien verleihen kann, wie pBR322, kann die
gewünschte Rekombinante auch durch eine zunächst erfolgende
Selektion eines Chemikalien-resistenten Stammes nach der
Transformation und einer anschließenden Abtrennung der
Transformanten, die mit der von der genetischen Information
des gewünschten Gens stammenden genetischen Eigenschaft
ausgestattet ist, erhalten werden.
-
Jeder Mikroorganismus kann gemäß der vorliegenden
Erfindung als ein Wirtsmikroorganismus verwendet werden,
wenn er die rekombinante DNA exprimieren und zur Erhöhung
der GMP-Produktion verwendet werden kann, und es werden
Stämme bevorzugt, die zu Escherichia coli gehören und DNA
aufnehmen können. Insbesondere können z. B. Escherichia coli
PL1068 (guaA&supmin;) [vgl. J. Gen. Microbiol. 126 (1981), 497-501]
oder Escherichia coli K294 (r&supmin;, m&spplus;) FERM BP-526 verwendet
werden.
-
Die Transformation eines Wirtsmikroorganismus mit der
rekombinanten DNA kann nach einem bekannten Verfahren
durchgeführt werden [Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69
(1972), 2110, die Transformation von E. coli wird hier
nachstehend nach diesem Verfahren durchgeführt]. Rekombinante,
die fähig sind, das im rekombinanten Plasmid enthaltene guaA
in der Wirtszelle zu exprimieren, können durch Verwendung
von guaA-defizienten E. coli-PL1068-Stämmen als Wirt und
durch Selektion der Stämme, die nach der Transformation
guaA&spplus; sind, selektiert werden.
-
Die Züchtung von Escherichia coli wird in einem
üblichen Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle,
anorganische Stoffe, Aminosäuren, Vitamine etc.
enthält, unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
-
Als eine Kohlenstoffquelle können Kohlenhydrate, wie
Glucose, Fructose, Sucrose, Maltose, Mannit oder Sorbit,
Zuckeralkohol, Glycerin, Lösung von Stärkehydrolysat,
Melasse etc. verwendet werden. Ferner können verschiedene
organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Milchsäure oder
Zitronensäure, und verschiedene Aminosäuren, wie
Glutaminsäure oder Methionin, verwendet werden.
-
Als eine Stickstoffquelle können Ammoniak,
verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie
Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat oder
Ammoniumacetat, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Glutamin oder
Methionin, oder Stickstoff-enthaltende organische Stoffe, wie
Peptone, NZ-Amin, Maisquellwasser, Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder seine Abbauprodukte
oder Larvenhydrolysat, verwendet werden.
-
Als ein anorganischer Stoff werden, falls
erforderlich, z. B. Kaliumdihydrogenphosphat,
Natriummonohydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Calciumchlorid,
Eisenchlorid, Kupfersulfat, Manganchlorid, Ammoniummolybdat
oder Zinksulfat zugesetzt. Es ist nicht erforderlich,
Vitamine, Aminosäuren etc., die für das Wachstum des
Mikroorganismus erforderlich sind, dem Medium zuzusetzen, wenn sie
zusammen mit anderen, vorstehend beschriebenen
Mediumbestandteilen zugeführt werden.
-
Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen durch
Schüttelkultur oder eine Kultur mit Rühren unter Luftzufuhr
bei einer Temperatur von 20 bis 50ºC, vorzugsweise 28 bis
42ºC, und einem pH-Wert etwa am Neutralpunkt. Die Züchtung
ist üblicherweise in 1 bis 24 Stunden abgeschlossen.
-
Die Kultur des Mikroorganismus kann direkt verwendet
werden, und auch behandelte Produkte der Kultur, zum
Beispiel ein Konzentrat oder getrocknetes Produkt der
Kultur, ein Filtrat oder Zellen, die durch Zentrifugation
der Kultur erhalten werden, getrocknete Zellen,
Aceton-behandelte Zellen, Zellen, die mit einem grenzflächenaktiven
Mittel behandelt worden sind, mit organischen Lösungsmitteln
behandelte Zellen, mit lytischen Enzymen behandelte Zellen,
immobilisierte Zellen, eine aus den Zellen extrahierte
Enzym-Präparation etc. können verwendet werden.
-
Die GMP-produzierende Kontaktreaktion kann in
irgendeinem wäßrigen Medium durchgeführt werden. Besonders
bevorzugt
werden XMP und Ammoniak oder Glutamin und, falls
erforderlich, ATP, ein Energie-Donor, Phosphationen,
Magnesiumionen, ein grenzflächenaktives Mittel, ein organisches
Lösungsmittel etc. in der Kulturflüssigkeit eines
Mikroorganismus umgesetzt, wodurch GMP in der Kulturflüssigkeit
angereichert wird, oder diese Bestandteile werden der
Kulturflüssigkeit, den Zellen oder ihren behandelten Produkten
nach Beendigung der Züchtung zugesetzt und zur Anreicherung
von GMP 1 bis 48 Stunden bei 20 bis 50ºC umgesetzt. In
diesem Fall ist die Einstellung des pH-Werts auf 6-10
wünschenswert. Als Ammoniumquelle wird üblicherweise ein
Ammoniumsalz verwendet. Die Konzentrationen (g/l) der Substrate
und Zusätze im Medium oder in der Reaktionslösung betragen
1-100 XMP, 1-100 ATP, 1-50 MgSO&sub4;·7 H&sub2; 0, 1-25 (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;·7
H&sub2;O und 1-25 Glutamin.
-
Neben der hochreinen Präparation kann als XMP-Quelle
jede XMP-enthaltende verwendet werden, zum Beispiel eine
mikrobielle XMP-Fermentationsflüssigkeit direkt, ein
Konzentrat davon oder eine teilgereinigte Präparation
daraus, sofern sie die Erzeugung von GMP nicht verhindert.
-
Als ein Energiedonor kann jedes Kohlenhydrat, zum
Beispiel Glucose, Arabinose, Lactose, Maltose, Sucrose,
Mannit, Sorbit, Trehalose, Melasse oder Stärkehydrolysat,
organische Säuren, zum Beispiel Brenztraubensäure, Milchsäure,
Essigsäure oder α-Ketoglutarsäure und Aminosäuren, zum
Beispiel Glycin, Alanin, Asparaginsäure oder Glutaminsäure
verwendet werden, sofern es eine nicht-phosphorylierte
Verbindung ist und durch den verwendeten Escherichia coli benutzt
werden kann. Diese werden in einer Konzentration von 1-200
g/l verwendet.
-
Es ist wünschenswert, daß die Konzentration von
Phosphat- und Magnesiumionen in der Lösung der Kontaktreaktion
in einem Bereich von 4-400 mM bleibt. Wenn die Ionenmenge,
die von der Kulturflüssigkeit oder den Zellen in die
Reaktionslösung eingebracht wird, in diesem
Konzentrationsbereich liegt, ist ein Zusatz von Ionen nicht erforderlich,
während sie im Fall einer unzureichenden Ionen-Konzentration
zugesetzt werden, damit die Menge in diesem
Konzentrationsbereich liegt. Als Phosphationen kann jedes Natriumsalz,
Kaliumsalz, Magnesiumsalz etc. der Phosphorsäure verwendet
werden. Als Magnesiumionen können alle anorganischen Salze
und Salze der organischen Säuren verwendet werden.
-
Als grenzflächenaktives Mittel können kationische
grenzflächenaktive Mittel, zum Beispiel
Polyoxyethylenstearylamin (z. B. Nymeen S-215, hergestellt von Nippon Oil and
Fats Co., Ltd.) oder Cetyltrimethylammoniumbromid,
anionische grenzflächenaktive Mittel, zum Beispiel
Natriumoleylamidsulfat, nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel, zum
Beispiel Polyoxyethylensorbitanmonostearat (z. B. Nonion
ST221, hergestellt von Nippon Oil and Fats Co., Ltd.),
amphotere grenzflächenaktive Mittel, zum Beispiel
Laurinbetain (z. B. Anon BF, hergestellt von Nippon Oil and Fats
Co., Ltd.), verwendet werden. Sie werden üblicherweise in
einer Konzentration von 0,1 bis 50 g/l, vorzugsweise 1 bis
20 g/l, verwendet.
-
Als organisches Lösungsmittel können Toluol, Xylol,
nicht-aliphatischer Alkohol, Benzol, Ethylacetat etc. in
einer Konzentration von 0,1 bis 50 ml/l, vorzugsweise 1 bis 20
ml/l, verwendet werden.
-
In der wäßrigen Reaktionslösung angereichertes GMP
kann nach dem üblichen Verfahren unter Verwendung von
Aktivkohle, Ionenaustauscherharz etc. gewonnen werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
-
Fig. 1 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des
Plasmids pXAR33 dar.
-
Fig. 2 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des
Plasmids pGC7 dar.
-
Fig. 3 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des
Plasmids pGKA2 dar.
-
Fig. 4 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des
Plasmids pGBK3 dar.
-
Fig. 5 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des
Plasmids pGBY1 dar.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Beispiel 1
Konstruktion eines rekombinanten Plasmids. das die GMP-
Synthetase wirksam exprimiert
1) Subclonierung von guaA in pBR322
-
Mit dem E. coli-Stamm JA200, der pLC34-10, ein
Hybrid-Plasmid des gua-Operons (guaA und guaB enthaltend), das
vom Chromosom von E. coli und ColE&sub1; abstammt, wurde ein L-
Medium angeimpft, das 10 g/l Bacto-Tryptone (durch Difco Co.
hergestellt), 5 g/l Hefe-Extrakt (durch Difco Co.
hergestellt) und 5 g/l Natriumchlorid enthielt, und auf einen pH-
Wert von 7,2 eingestellt war und 18 Stunden bei 30ºC
gezüchtet. Das Plasmid pLC34-10 wurde aus den gezüchteten Zellen
abgetrennt und nach dem bekannten, vorstehend beschriebenen
Verfahren gereinigt. Das als Vektor verwendete pBR322 wurde
vom ihn tragenden E. coli-Stamm JA194 [B. Ratzlein und J.
Carbon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 487],
abgetrennt und auf dieselbe, vorstehend beschriebene Weise
gereinigt. Zur Züchtung und Erhaltung der hier nachstehend
beschriebenen Mikroorganismen wurde, wenn nicht anders
angegeben, ein L-Medium verwendet.
-
pPLC34-10, das eine Größe von etwa 15 Kilobasen (die
hier nachstehend als kBp abgekürzt werden) aufwies, wurde
mit dem Restriktionsenzym EcoRI an einer Stelle und mit PstI
an drei Stellen gespalten (vgl. Fig. 1). Es wurde erwartet,
daß das guaA auf dem EcoRI-PstI-Fragment von etwa 7 kBp lag,
das eine PstI-Spaltstelle enthielt [Biochem. Biophys. Res.
Commun. 72 (1976), 1129-1136]
-
Anschließend wurden 5 ug der vorstehend hergestellten
Plasmid-DNA von pLC34-10 in 50 ul einer Pufferlösung gelöst,
die 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH-Wert 7,5), 50 mM
NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol (hier
nachstehend
als "Y-50-Pufferlösung" bezeichnet) enthielt, und 20
Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI [hergestellt von
Takara Shuzo Co., die hier nachstehend beschriebenen
Restriktionsenzyme sind, wenn nicht anders angegeben,
sämtlich Produkte der Takara Shuzo Co.] wurden zugesetzt. Mit
dem Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC eine Spaltungsreaktion
durchgeführt, und anschließend wurden 5 Einheiten PstI (von
den New England Biolabs Co. hergestellt) zugesetzt. Mit dem
Gemisch wurde 30 Minuten bei 37ºC eine partielle
Spaltungsreaktion vorgenommen, und die Reaktion wurde durch eine
10-minütige Hitzebehandlung bei 65ºC beendet. Ein Plasmid-
DNA-Fragment von etwa 7 kBp wurde durch Gel-Elektrophorese
in bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose gereinigt
[Analytical Biochemistry 98 (1979), 305] (dieses Verfahren
wurde hier nachstehend zur Reinigung von DNA-Fragmenten
verwendet). 2 ug pBR322-Plasmid-DNA wurden getrennt davon in
20 ul Y-50-Pufferlösung gelöst und 8 Einheiten EcoRI und 8
Einheiten PstI zugesetzt. Mit dem Gemisch wurde 2 Stunden
bei 37ºC eine Spaltungsreaktion durchgeführt und das größere
Plasmidfragment (etwa 3,6 kBp) gereinigt.
-
Im Anschluß daran wurden etwa 0,2 ug des von pLC34-10
stammenden DNA-Fragmentes und etwa 0,05 ug des von pBR322
stammenden DNA-Fragmentes, die vorstehend erhalten wurden,
18 Stunden bei 4ºC mit 2 Einheiten T4-Ligase in 40 ul einer
Pufferlösung behandelt, die 20 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure
(pH-Wert 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 0,5 mM
ATP enthielt (hier nachstehend als
"T4-DNA-Ligase-Pufferlösung" bezeichnet). Der im guaA-Locus mutierte E. coli-Stamm
PL1068 wurde durch die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA
nach dem vorstehend angegebenen Verfahren von Cohen et al.
transformiert, wodurch eine Transformante, die eine
Resistenz gegen Tetracyclin (20 ug/ml) und nicht die vom Wirt
gezeigte Guanin-Abhängigkeit aufwies, erhalten wurde.
-
Das Plasmid wurde abgetrennt und aus der
Transformanten gereinigt, und es wurde durch Spaltung der DNA mit
Restriktionsenzymen, wie EcoRI oder PstI, eine
Strukturanalyse des Plasmids durchgeführt. Man stellte als Ergebnis
fest, daß es ein rekombinantes Plasmid war, in dem das von
pLC34-10 stammende EcoRI-PstI-DNA-Fragment (etwa 7 kBp) an
der EcoRI-PstI-Stelle von pBR322 inseriert war, und es
erhielt die Bezeichnung pXA1. Durch pXA1 transformierte E.
coli KLC421 (guaA&supmin;, guaB&supmin;) [J. Bact. 139 (1979), 320] wurden
zur Untersuchung des Wachstums auf M9-Plattenmedium (das 1 g
NH&sub4;Cl, 6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 5 g NaCl&sub1; 0,25 g MgSO&sub4;·7
H&sub2;O, 3 g Glucose, 4 g Vitamin B&sub1;, 2 g Casaminosäuren in 1 l
Wasser und ferner 1,5% Agar enthielt) ausgestrichen. Man
stellte fest, daß sie auf einem Plattenmedium wuchsen, das 5
mg/l Xanthin oder Guanin enthielt, während auf den
M9-Plattenmedien, die 5 mg/l Hypoxanthin enthielten, kein Wachstum
beobachtet wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß das pXA1 nur
das von pLC34-10 stammende guaA trägt, obgleich pLC34-10
sowohl guaA als auch guaB trägt. Der durch Transformation
von E. coli-K294 mit pXA1 erhaltene Stamm wurde am 8. März
1984 als E. coli K294/pXA1 FERM BP-498 beim Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science and
Technology, hinterlegt.
2) Ligierung des trp-Promotors (hier nachstehend als Ptrp
bezeichnet) stromaufwärts von guaA
-
Zunächst wurden 3 ug pXA1-DNA in 30 ul
Y-50-Pufferlösung gelöst und 15 Einheiten HindIII zugesetzt. Mit dem
Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC eine Spaltungsreaktion
durchgeführt, und 2 ul 2 M NaCl und 15 Einheiten MluI wurden
zugesetzt. Mit dem Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC eine
Spaltungsreaktion durchgeführt. Nach einer 10-minütigen
Hitzebehandlung bei 65ºC wurde das kleinere DNA-Fragment,
das das guaA (etwa 3,3 kBp) enthielt, gereinigt.
Andererseits wurde pGBK3 als ein Ptrp-enthaltendes Plasmid
verwendet. Ein Verfahren zur Konstruktion von pGBK3 ist im
Referenzbeispiel 2 dargestellt. pGBK3 weist stromabwärts von
Ptrp eine HindIII-Spaltstelle auf (vgl. Fig. 1).
-
3 ug pGBK3-DNA wurden mit HindIII und MluI in der
vorstehend beschriebenen Weise gespalten, und das Ptrp
enthaltende,
größere DNA-Fragment (etwa 4 kBp) wurde gereinigt.
Im Anschluß daran wurde mit etwa 0,2 ug des von pXA1
stammenden DNA-Fragmentes und mit etwa 0,1 ug des von pGBK3
stammenden DNA-Fragmentes, die vorstehend erhalten wurden,
18 Stunden bei 4ºC in 20 ul T4-DNA-Ligase-Pufferlösung in
Gegenwart einer Einheit T4-DNA-Ligase eine
Ligierungsreaktion durchgeführt. Der E. coli-Stamm K294 wurde durch das so
erhaltene rekombinante Plasmid transformiert, wodurch eine
Transformante, die eine Resistenz gegen Ampicillin aufwies,
erhalten wurde. Eine Plasmid-DNA wurde von der
Transformanten abgetrennt und gereinigt, und es wurde durch eine
Strukturanalyse bestätigt, daß das Plasmid die Struktur
aufwies, in der das DNA-Fragment, das guaA enthielt und von
pXA1 stammte, stromabwärts von Ptrp, das von pGBK3 stammte,
inseriert war. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pXA10
(vgl. Fig. 1). Der E. coli-Stamm, der pXA10 trug, wurde am
8. März 1984 unter der Bezeichnung E. coli K294/pXA10 FERM
BP-499 beim Fermentation Research Institute hinterlegt.
3) Verkürzung des Abstandes zwischen Ptrp und guaA
-
Wie nachstehend beschrieben, wurde bei der Expression
von guaA kein wesentlicher Unterschied zwischen dem pXA10-
tragenden Stamm und dem pXA1-tragenden Stamm festgestellt
(vgl. Tabelle 1).
-
Somit wurde das Plasmid pXAR33, das einen verkürzten
Abstand zwischen Ptrp und guaA aufwies, in der nachstehenden
Weise konstruiert (vgl. Fig. 1).
-
Zunächst wurden 10 ug pXA10 in 60 ul einer
Pufferlösung (hier nachstehend als "Y-150-Pufferlösung"
bezeichnet), die 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH-Wert
7,5), 150 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 2-Mercaptoethanol
enthielt, gelöst, und 40 Einheiten HindIII wurden zugesetzt.
Mit dem Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC eine
Spaltungsreaktion vorgenommen. Zu 30 ul der Reaktionslösung nach
HindIII-Spaltung wurden 20 ul Bal31 Pufferlösung in 5facher
Konzentration (100 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,1), 60 mM MgCl&sub2;,
60 mM CaCl&sub2; und 3 M NaCl), 46 ul destilliertes Wasser und 2
Einheiten Bal31 (von Bethesda Research Laboratories
hergestellt) zugesetzt, und mit dem Gemisch wurde bei 30ºC einer
Spaltungsreaktion durchgeführt. Während des Zeitraums von 5
bis 50 Minuten nach Reaktionsbeginn wurden gelegentlich aus
der Reaktionslösung Proben in Portionen von 10 ul entnommen,
und jede Portion wurde in 20 ul eines Phenol:Chloroform-
Gemisches (1:1 nach Volumen) gegeben. Das Gemisch wurde zur
Beendigung der Reaktion sorgfältig gerührt und mit Eis
gekühlt. Nach der Zentrifugation wurde aus der oberen
Schicht eine Probe entnommen und das 2fache Volumen
eisgekühlten Ethanols zugesetzt. Man ließ das Gemisch 30
Minuten bei -80ºC stehen. Nach der Zentrifugation der
jeweiligen Ethanolgemische wurde der Überstand verworfen, während
zur Auflösung der Niederschläge 5 ul Y-150-Pufferlösung in
10facher Konzentration und 43 ul destillierten Wassers zu
den Niederschlägen zugesetzt wurden. Anschließend wurden 3
Einheiten MluI zu den jeweiligen Lösungen zugesetzt und mit
den Lösungen wurde 2 Stunden bei 37ºC eine Spaltungsreaktion
vorgenommen. Die Reaktionslösungen wurden 10 Minuten bei
65ºC hitzebehandelt und die kleineren DNA-Fragmente (nicht
größer als 3 kBp) gereinigt. Andererseits wurde das Plasmid
pGBY1, in dem die NruI-Stelle auf dem von pBR322 stammenden
DNA-Fragment von pGBK3 in eine BglII-Stelle umgewandelt war,
als Vektor verwendet (das Verfahren zur Konstruktion von
pGBY1 ist im Referenzbeispiel 3 dargestellt).
-
3 ug pGBY1-DNA wurden in 20 ul Y-50-Pufferlösung
gelöst und 15 Einheiten HindIII zugesetzt. Mit dem Gemisch
wurde 2 Stunden bei 37ºC eine Spaltungsreaktion vorgenommen.
Nach der Umsetzung wurde mit der Reaktionslösung eine
Extraktion mit Phenol und Chloroform vorgenommen und eine
Ausfällung mit Ethanol durchgeführt. Das DNA-Fragment wurde
in 40 ul (Gesamtvolumen) 50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure
(pH-Wert 7,6), 7 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 0,25 mM
dATP, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dTTP und 0,25 mM dCTP gelöst,
und anschließend wurden 6 Einheiten Klenow-Fragment der DNA-
Polymerase I von E. coli (1 ul, von New England Biolabs
hergestellt)
zugesetzt. Das Gemisch ließ man 2 Stunden bei 15ºC
reagieren, und das durch die HindIII-Spaltung gebildete
überstehende 5'-Ende wurde in ein glattes Ende umgewandelt.
-
Nach der Extraktion mit Phenol-Chloroform und der
Ausfällung mit Ethanol wurde der DNA-Niederschlag in 20 ul
Y-150-Pufferlösung gelöst, und 15 Einheiten MluI wurden
zugesetzt. Mit dem Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC eine
Spaltungsreaktion durchgeführt. Das größere DNA-Fragment, das
Ptrp aufwies (etwa 4,2 kBp), wurde durch Gel-Elektrophorese
in bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose vom
Reaktionsprodukt der MluI-Spaltung gereinigt.
-
Zu etwa jeweils 0,1 ug der so erhaltenen, von pXA10
stammenden DNA-Fragmenten wurden 0,05 Hg des von pGBY1
stammenden DNA-Fragmentes zugesetzt. Mit den jeweiligen
Gemischen wurde 18 Stunden bei 4ºC in 20 ul (Gesamtvolumen)
T4-DNA-Ligase-Pufferlösung in Gegenwart einer Einheit T4-
DNA-Ligase eine Ligierungsreaktion durchgeführt. E. coli
K294-Stämme wurden anschließend durch die so erhaltene
rekombinante Plasmid-DNA transformiert, und die
Transformanten, die eine Resistenz gegen Ampicillin aufwiesen, wurden
selektiert. Die erhaltenen Ampicillin-resistenten Stämme
wurden 18 Stunden bei 30ºC in M9-Flüssigmedium
(M9-Plattenmedium ohne Agar) gezüchtet, und die
GMP-Synthetase-Aktivität wurde zur Selektion von Stämmen mit einer höheren
Aktivität als die des E. coli-Stammes K294, der pXA10 trug,
in der nachstehend beschriebenen Weise untersucht. Plasmid-
DNAs wurden von den Stämmen, die eine höhere Aktivität (R-
33-Stamm) aufwiesen, isoliert und ihre Strukturen
analysiert. Es wurde festgestellt, daß das im R-33-Stamm
enthaltende Plasmid pXAR33 das HindIII-MluI-DNA-Fragment
aufwies, das guaA von pXA10 enthielt. Unter den analysierten
Plasmid-DNAs wies pXAR33 das kürzeste DNA-Fragment auf, und
der R-33-Stamm, der es trug, zeigte eine hohe
GMP-Synthetase-Aktivität. Der R-33-Stamm wurde am 8. März 1984 als
Escherichia coli K294/pXAR33 FERM BP-500 beim Fermentation
Research Institute hinterlegt.
4) GMP-Synthetase-Aktivität der rekombinante Plasmide
tragenden Stämme:
-
Die Bestimmung der GMP-Synthetase-Aktivität wurde
nach einem bekannten Verfahren [J. Biol. Chem. 226 (1957),
351-363] mit einer Modifikation, wie nachstehend
beschrieben, durchgeführt.
-
Mit einer Saatkultur von E. coli wurde für den Test
zur Feststellung der Aktivität M9-Flüssigmedium angeimpft,
und es wurde 18 Stunden bei 30ºC eine Schüttelkultur
durchgeführt. Die Kulturflüssigkeit wurde mit destilliertem
Wasser verdünnt oder nach der Zentrifugation durch Suspension
in einer geeigneten Menge destillierten Wassers
konzentriert, und anschließend wurde Toluol zugesetzt, um eine
Endkonzentration von 20 ml/l zu erhalten. Das Gemisch wurde
20 Minuten bei 37ºC geschüttelt.
-
Die mit Toluol behandelte Kulturflüssigkeit wurde in
eine Reaktionslösung gegeben, die 160 mM
Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH-Wert 8,6), 12 mM ATP, 25 mM XMP, 16 mM MgSO&sub4;
·7 H&sub2;O und 40 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; umfaßte, und das Gemisch wurde
zur Durchführung der Umwandlung von XMP zu GMP bei 42ºC
geschüttelt.
-
Das erzeugte GMP wurde durch gelegentliche
Probenentnahme aus der Reaktionslösung, Vermischung der Probe mit
dem 40fachen Volumen 3,5% Perchlorsäure, Zentrifugation des
Gemisches und Messung der Absorption des Überstands bei
290 nm quantitativ bestimmt.
-
In Tabelle 1 sind die Aktivitäten der GMP-Synthetase
der in der vorliegenden Erfindung verwendeten oder
erhaltenen Stämme dargestellt, wobei eine Aktivitätseinheit als die
Aktivitätsmenge definiert ist, bei der 1 umol GMP pro Minute
gebildet wird.
Tabelle 1
Wirtsstamm E.coli Plasmid Hinterlegungsnr. Aktivität pro nasser Zelle (Einheit/g nasser Zelle)
Beispiel 2
-
Die Kulturflüssigkeit (Naßzellgewicht: 4,6 mg/ml) des
pXAR33-tragenden, in Beispiel 1 erhaltenen Stammes (R-33)
wurde durch Zentrifugation 40fach konzentriert, und es wurde
Toluol zugesetzt, um eine Endkonzentration von 20 ml/l zu
erhalten. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 37ºC geschüttelt.
Im Anschluß daran wurden 30 ml einer Reaktionslösung, die 20
mg/ml XMP·Na&sub2;·7 H&sub2;O, 20 mg/ml ATP·Na&sub2;·3 H&sub2;O und 10
mg/ml (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; umfaßte und auf einen pH-Wert von 8,6
eingestellt war, in einen 200 ml-Becher gegeben, und 0,2 ml der
Toluol-enthaltenden Zellsuspension wurden zugesetzt. Das
Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe eines Magnetrührers (900
UpM) gerührt und 5 Stunden bei 42ºC gehalten, während der
pH-Wert mit Ätznatron auf 8,6 eingestellt wurde. Als Folge
der Umsetzung wurden 13,0 mg/ml 5'-GMP·Na&sub2;·7 H&sub2;O in der
Reaktionslösung gebildet. Bei Verwendung des Wirtsstammes
K294 anstelle des R-33-Stammes betrug die Ausbeute weniger
als 1 mg/ml.
Beispiel 3
-
Der R-33-Stamm wurde in einen 30 ml L-Medium
enthaltenden 300 ml-Erlenmeyer-Kolben inokkuliert und mit Hilfe
eines rotierenden Schüttlers (220 UpM) wurde 18 Stunden bei
30ºC eine Schüttelkultur durchgeführt. Zur Kulturflüssigkeit
wurden Toluol, XMP Na&sub2;·7 H&sub2;O, ATP·Na&sub2;·3 H&sub2;O und
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; zugesetzt, um 20 ul/ml, 20 mg/ml, 20 mg/ml bzw. 10
mg/ml zu erhalten. Die Schüttelkultur wurde weitere 10
Stunden fortgesetzt, wobei die Temperatur bei 42ºC gehalten
und der pH-Wert durch Ätznatron auf 8,6 eingestellt wurde.
Als Folge der Umsetzung wurden 13,7 mg/ml GMP·Na&sub2;·7 H&sub2;O
gebildet und im Medium angereichert. Bei Verwendung des
Wirtsstammes K294 anstelle des R-33-Stammes betrug die
Ausbeute weniger als 1 mg/ml.
Beispiel 4
-
Der Stamm E. coli K294 (FERM BP-526) wurde in einen 1
l-Erlenmeyerkolben, der 200 ml M9-Medium enthielt, das 6 g/l
Dinatriumphosphat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 5 g/l
Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 4 mg/l
Thiaminhydrochlorid, 250 mg/l Magnesiumsulfat und 3 g/l Glucose umfaßte,
inokkuliert und über Nacht bei 28ºC unter hin und herbewegen
in Schüttelkultur gezüchtet. Die Zellen wurden durch
Zentrifugation gesammelt und im gefrorenen Zustand (-20ºC)
aufbewahrt.
-
Zu den gefrorenen Zellen wurde zur Herstellung einer
Suspension mit einer Endkonzentration von 200 g/l als
Naßzellgewicht bei Raumtemperatur Wasser zugesetzt, und es
wurden 40 g/l XMP Na&sub2;·7 H&sub2;O, 50 g/l Glucose, 2 g/l
Natriumphytat, 5 g/l Na&sub2;HPO&sub4; und 5 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O in der
Suspension gelöst (Konzentrationen sind Endkonzentrationen).
Das erhaltene Gemisch wurde in Portionen von 20 ml in 200
ml-Becher gegeben. Die jeweiligen Becher wurden bei 37ºC in
einem Wasserbad mit Thermostat gehalten und zur Umwandlung
von XMP zu GMP 24 Stunden mit Hilfe eines Magnetrührers bei
900 UpM gerührt, während der pH-Wert mit 9% wäßrigem
Ammoniak auf 7,4 eingestellt wurde (vgl. Tabelle 2). Tabelle
2 zeigt (1) das Ergebnis, das durch Verwendung des
Reaktionsgemisches an sich und (2) das Ergebnis, das durch
Verwendung
des Reaktionsgemisches der Zusammensetzung, der
zusätzlich 4 g/l Nymeen S-215 und 10 ml/l Xylol zugesetzt
wurden, erhalten wurde.
Tabelle 2
Nymeen S-215 und Xylol
Beispiel 5
-
Der Stamm E. coli K294 und der Stamm E. coli
K294/pXA10 wurden mit der Ausnahme, daß 50 mg/l
Ampicillinenthaltendes M9-Medium zur Züchtung des Stammes K294/pXA10
verwendet wurde, auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 4,
gezüchtet. Als Ergebnis der Reaktion unter denselben
Bedingungen, wie in Beispiel 4-(2), unter Verwendung von Nymeen S-
215 und Xylol bildete der Stamm E. coli-K294 in 23 Stunden
5,5 g/l GMP·Na&sub2;·7 H&sub2;O, und der Stamm E. coli K294/pXA10
in 6 Stunden 23,8 g/l GMP·Na&sub2;·7 H&sub2;O.
Beispiel 6
-
Der Stamm E. coli K294/pXA10 wurde auf dieselbe
Weise, wie in Beispiel 4, in 50 mg/l Ampicillin-enthaltendem
M9-Medium gezüchtet. Die Menge der Zellen betrug 7,5 g/l als
Naßzellgewicht. Zur Kulturflüssigkeit wurden zur Herstellung
einer Endkonzentration von 40 g/l, 50 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 5
g/l, 4 g/l bzw. 10 ml/l: XMP, Glucose, Natriumphytat,
Na&sub2;HPO&sub4;, MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, Nymeen S-215 und Xylol zugesetzt,
und die Umwandlung von XMP zu GMP wurde auf dieselbe Weise,
wie in Beispiel 4, durchgeführt. Als ein Ergebnis wurden in
23 Stunden 5,2 g/l GMP·Na&sub2;·7 H&sub2;O gebildet.
Referenzbeispiel 1
Konstruktion des das menschliche Interferon (IFN-γ)
(val. auch J. Biochem. 97 (1985). 153-159) exprimierenden
rekombinanten Plasmids pGKA2 (vgl. Fig. 2 und 3)
(a) Insertion von menschlicher IFN-γ-DNA in den
Expressionsvektor pKYP11
-
In diesem Beispiel wurden 6 ug des Plasmids pIFNγ-G4,
das aus dem Stamm ATCC 39123 durch das vorstehend
beschriebene Verfahren zur Isolierung eines Plasmids isoliert worden
war, in 50 ul (Gesamtvolumen) einer Lösung, die 20 mM Tris-
Chlorwasserstoffsäure (Tris-HCl) (pH-Wert 7,5), 10 mM MgCl&sub2;,
10 mM Dithiothreit und 50 mM NaCl enthielt, gelöst.
Anschließend wurden jeweils 12 Einheiten der
Restriktionsenzyme PvuII und HindIII zugesetzt, und die
Spaltungsreaktion wurde 4 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Die
Reaktionslösung wurde zur Inaktivierung der Enzyme 7 Minuten bei
65ºC erhitzt und zum Erhalt von 1,2 ug eines DNA-Fragmentes
von 1,3 kBp, das menschliche IFN-γ-DNA enthielt, wurde eine
Reinigung durch Gel-Elektrophorese in einer bei niedriger
Temperatur schmelzenden Agarose durchgeführt.
-
4 ug pKYP11 wurden getrennt davon in 40 ul
(Gesamtvolumen) einer Lösung gelöst, die 20 mM Tris-HCl (pH-Wert
7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 50 mM NaCl
enthielt. 3 Einheiten BamHI wurden zugesetzt, und die
Spaltungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Die
Reaktionslösung wurde zur Inaktivierung des Enzyms 5 Minuten
auf 65ºC erhitzt. Danach wurden jeweils 30 uM dATP, dCTP,
dGTP und dTTP und 8 Einheiten DNA-Polymerase I von
Escherichia coli (Klenow-Fragment, Produkt der New England
Biolabs, 1 ul) zugesetzt. Die Auffüllreaktion wurde 1 Stunde
bei 15ºC durchgeführt, und die Reaktionslösung wurde zur
Inaktivierung der DNA-Polymerase I 15 Minuten auf 68ºC
erhitzt. 10 Einheiten HindIII wurden zugesetzt, und die
Spaltungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC durchgeführt, mit
einer anschließenden 5-minütigen Erhitzung auf 65ºC zur
Inaktivierung von HindIII.
-
Mit der Lösung der so erhaltenen
Spaltungsreaktionsprodukte des Plasmids pKYP11 wurde eine Reinigung durch
Gel-Elektrophorese in bei niedriger Temperatur schmelzender
Agarose durchgeführt, wobei etwa 2,5 ug eines
Ptrp-enthaltenden DNA-Fragmentes von etwa 4,7 kBp erhalten wurden.
-
Anschließend wurden 0,5 ug des menschliche IFN-γ-DNA
enthaltenden DNA-Fragmentes von 1,3 kBp und 1,0 ug des
Ptrpenthaltenden DNA-Fragmentes von etwa 4,7 kBp, das aus dem
Plasmid pKYP11 erhalten wurde, in 20 ul einer Lösung gelöst,
die 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 5 mM
Dithiothreit und 500 uM ATP enthielt, und 4 Einheiten T4-DNA-
Ligase (Produkt der New England Biolabs) wurden zugesetzt.
Die Ligierungsreaktion wurde 18 Stunden bei 4ºC
durchgeführt, und Escherichia coli HB101 wurde durch ein übliches
Verfahren mit dem erhaltenen rekombinanten Plasmidgemisch
transformiert, um eine ApR-Kolonie zu erhalten. Ein Plasmid,
pGC7, das in Fig. 2 dargestellt ist, wurde aus der
Kulturbrühe der Kolonie isoliert. Die Struktur von pGC7 wurde
durch Spaltung mit HindIII, BamHI, HpaI, SalI, EcoRI und
ClaI und Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Der pGC7-
tragende Escherichia coli-Stamm ist als Escherichia coli-
IGC7 (FERM BP-497) bei dem Fermentation Research Institute
hinterlegt worden.
(b) Konstruktion des rekombinanten Plasmids pGKA2:
-
In diesem Beispiel wurden 6 ug pGC7-DNA, die im
Referenzbeispiel 1(a) erhalten wurden, in 50 ul
(Gesamtvolumen) einer Lösung gelöst, die 20 mM Tris-HCl (pH-Wert
7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 10 mM NaCl
enthielt, und 12 Einheiten des Restriktionsenzyms BstNI
(Produkt der New England Biolabs) wurden zugesetzt. Die
Umsetzung wurde 3 Stunden bei 60ºC durchgeführt.
Anschließend wurden 150 mM NaCl und 8 Einheiten SalI
zugesetzt, und die Spaltungsreaktion wurde 3 Stunden bei 37ºC
durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde zur Inaktivierung
von SalI erneut 5 Minuten auf 65ºC erhitzt, und es wurde
eine Reinigung durch Gel-Elektrophorese in bei niedriger
Temperatur schmelzender Agarose durchgeführt, wobei etwa 0,8
ug eines einen großen Teil der menschlichen IFN-γ-DNA
enthaltenden DNA-Fragmentes von etwa 1,125 kBp erhalten wurde.
-
3 ug pKYP10 wurden getrennt davon in 40 ul
(Gesamtvolumen) einer Lösung gelöst, die 20 mM Tris-HCl (pH-Wert
7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 100 mM NaCl
enthielt. 6 Einheiten der Restriktionsenzyme HindIII bzw.
SalI wurden zugesetzt, und die Spaltungsreaktion wurde 3
Stunden bei 37ºC durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde zur
Inaktivierung von HindIII und SalI 5 Minuten auf 65ºC
erhitzt, und es wurde eine Reinigung durch Gel-Elektrophorese
in bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose
durchgeführt, wobei etwa 1,8 ug eines Ptrp-enthaltenden
DNA-Fragmentes von etwa 4,1 kBp erhalten wurde.
-
Die N-terminale Aminosäure des reifen menschlichen
IFN-γ-Polypeptids ist Cys. Zur Expression von reifer IFN-γ-
DNA ist es notwendig, ein Initiationscodon (ATG) genau vor
das 5'-terminale Codon TGT (Cys) einzubauen und die Länge
zwischen der SD-Sequenz stromabwärts von Ptrp und ATG auf
eine geeignete Länge von 6-18 Bp einzustellen. Daher wurde
der nachstehende DNA-Linker synthetisiert.
-
Zwei einzelsträngige 18-mer und 15-mer DNAs wurden
durch ein übliches Triester-Verfahren synthetisiert [Crea,
R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 5765]. Im
Anschluß daran wurden jeweils 2 ug der 18-mer und 15-mer
DNAs in 20 ul (Gesamtvolumen) einer Lösung, die 50 mM Tris-
HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 0,1 mM
EDTA und 1 mM ATP enthielt, gelöst. 30 Einheiten
T4-Polynucleotid-Kinase (Produkt von Boehringer Mannheim) wurden
zugesetzt und die Phosphorylierungsreaktion 60 Minuten bei
37ºC durchgeführt.
-
Anschließend wurden jeweils 2 ug der phosphorylierten
18-mer- und 15-mer-DNAs gemischt, das Gemisch wurde 5
Minuten auf 70ºC erhitzt und zur Aneinanderlagerung bei
Raumtemperatur stehengelassen, wobei DNA-Linker, die die
vorstehend dargestellte Struktur aufwiesen, erhalten wurden.
-
0,4 ug des BstNI-SalI-Fragmentes von 1,125 kBp, das
vorstehend erhalten wurde und von pGC7 stammte, und 1,0 ug
des DNA-Fragmentes von 4,1 kBp, das durch Spaltung des
Expressionsvektors pKYP10 mit HindIII und SalI erhalten
wurde, wurden in 25 ul (Gesamtvolumen) einer Lösung, die 20
mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit und
500 uM ATP enthielt, gelöst. Etwa 0,1 ug des vorstehend
erwähnten DNA-Linkers wurde dem Gemisch zugesetzt, und
anschließend daran 6 Einheiten T4-DNA-Ligase. Die
Ligierungsreaktion wurde 17 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Escherichia
coli HB101 wurde unter Verwendung des erhaltenen
rekombinanten Plasmid-Gemisches durch ein übliches Verfahren
transformiert, wobei eine ApR-Kolonie erhalten wurde. Ein
Plasmid, pGKA2, das in Fig. 3 dargestellt ist, wurde aus der
Kulturbrühe der Kolonie isoliert. Die Struktur von pGKA2
wurde durch Spaltung mit EcoRI, ClaI, HindIII, BstNI und
SalI und Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Es wurde durch
das Verfahren von Maxam-Gilbert bestätigt [Maxam, A. M. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560], daß die
Basensequenz von der SD-Sequenz (AAGG) bis zum
Initiationscodon (ATG) im Plasmid pGKA2 "AAGGGTATCGATAAGCTTATG" war.
-
Die menschliche IFN-γ-DNA in pGKA2 unterscheidet sich
von den bekannten DNAs dadurch, daß die DNA eine RsaI-Stelle
aufweist und die neunte Aminosäure des menschlichen, von der
DNA-codierten IFN-γ-Polypeptids, Glutamin (Gln) ist.
-
Ferner unterscheidet sich die synthetisierte,
vorstehend verwendete DNA in den unterstrichenen Teilen von der
von Gray, P. W. et al., verwendeten, die die nachfolgend
dargestellte Struktur aufweist:
-
Demgemäß weist pGKA2 eine Restriktionsstelle für BstNI,
CCAGG, in der menschliches IFN-γ-codierenden DNA-Region auf,
und auch dieses Merkmal unterscheidet pGKA2 von bekannten
Plasmiden. Ferner sind die Länge und Struktur zwischen der
SD-Sequenz und ATG wichtig, da sie einen Einfluß auf die
Expression von Proteinen in Escherichia coli haben. Die
Basensequenz zwischen der SD-Sequenz und ATG in pGKA2
unterscheidet sich anscheinend von der in dem bekannten
rekombinanten Plasmid pIFN-γ-trp48 (Gray, P. W. et al.).
-
Escherichia coli, das pGKA2 trägt, ist als
Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-496) beim Fermentation Research
Institute hinterlegt worden.
Referenzbeispiel 2
-
Konstruktion des rekombinanten Plasmids pGBK3, das
menschliches IFN-γ unter der Kontrolle des tacI-Promotors exprimiert
-
Als erster Schritt zur Konstruktion des rekombinanten
Plasmids wurde die Insertion der Terminationsstelle der
Transkription des Lipoprotein-(lpp)-Gens von Escherichia
coli (hier nachstehend als lpp-Terminator bezeichnet) in das
IFN-γ-exprimierende Plasmid pGKA2 (das Verfahren zur
Konstruktion von pGKA2 ist im Referenzbeispiel 1 dargestellt)
gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren (a), (b), (c)
und (d) durchgeführt (vgl. Fig. 4).
(a) Konstruktion von pGBD1
-
In diesem Beispiel wurden 2 ug des Plasmids pIFNγ-G4
(etwa 3,6 kBp) in 20 ul Y-50-Pufferlösung gelöst und 6
Einheiten PvuII zugesetzt. Die Spaltungsreaktion wurde 2
Stunden bei 37ºC durchgeführt und anschließend durch 10-
minütige Hitzebehandlung bei 65ºC beendet. Anschließend
wurde mit 0,1 ug des gespaltenen Materials mit 2 Einheiten
T4-DNA-Ligase in 20 ul T4-DNA-Ligase-Pufferlösung in
Gegenwart von 5 Picomol 5'-phosphoryliertem BamHI-Linker (5'-
pCCGGATCCGG-3'; von Collaborative Research Co. hergestellt)
18 Stunden bei 4ºC eine Ligierungsreaktion durchgeführt.
-
Der Escherichia coli-Stamm HB101 wurde durch die so
erhaltene rekombinante Plasmid-DNA transformiert, wobei eine
Ap-resistente Kolonie erhalten wurde. Plasmid-DNA wurde aus
der Transformanten isoliert und die DNA mit
Restriktionsenzymen, wie BamHI, gespalten, um eine Strukturanalyse des
Plasmids durchzuführen. Als Ergebnis wurde der Erhalt des
rekombinanten Plasmids pGBD1, in das der BamHI-Linker an der
PvuII-Stelle von pIFNγ-G4 inseriert worden war, bestätigt.
(b) Konstruktion von pKYP14
-
Die Konstruktion des als Quelle für den
lpp-Terminator verwendeten rekombinanten Plasmids pKYP14 wird
nachstehend beschrieben.
-
Zunächst wurden 5 ug des den trp-Promotor-tragenden
Plasmids pKYP10 (Ungeprüfte veröffentlichte japanische
Patentanmeldung Nr. 110600/83) in 40 ul Y-100-Pufferlösung
gelöst und 10 Einheiten BamHI zugesetzt. Die
Spaltungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt, und
anschließend wurden 1 ul Y-100-Pufferlösung, 2,5 ul 1 M
NaCl, 5,5 ul destilliertes Wasser und 20 Einheiten SalI
zugesetzt. Die Reaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC fortgesetzt.
Nach einer 10-minütigen Hitzebehandlung bei 65ºC wurde das
größere Plasmid-DNA-Fragment (etwa 4,9 kBp) durch eine Gel-
Elektrophorese in bei niedriger Temperatur schmelzender
Agarose gereinigt. 5 ug eines den lpp-Terminator tragenden
Plasmids pIN-II-A1 [Nakamura, K. et al., The EMBO Journal 1
(1982), 771] (identisch mit pKENO45 in der ungeprüften
veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 140800/82)
wurden gesondert mit BamHI und SalI auf dieselbe, vorstehend
beschriebene Weise, gespalten. Das erhaltene BamHI-SalI-
Fragment von etwa 0,95 kBp, das den lpp-Terminator enthielt,
wurde gereinigt.
-
Mit etwa 0,1 ug des von pKYP10 stammenden DNA-
Fragmentes und etwa 0,05 ug des von pIN-II-A1 stammenden
DNA-Fragmentes, die vorstehend erhalten wurden, wurde
anschließend in 20 ul T4-DNA-Ligase-Pufferlösung in Gegenwart
einer Einheit T4-DNA-Ligase bei 4ºC eine 18-stündige
Ligierungsreaktion durchgeführt.
-
Plasmid-DNA wurde aus dem Escherichia coli-Stamm
HB101 isoliert, der durch die so erhaltene rekombinante
Plasmid-DNA transformiert worden war, und es wurde eine
Strukturanalyse durchgeführt, durch die bestätigt wurde, daß
der lpp-Terminator stromabwärts auf dem Plasmid pKYP14, das
vom Stamm IKYP14 getragen wird, inseriert wurde.
(c) Konstruktion von pGBJ2
-
Die Insertion des lpp-Terminators stromabwärts der
IFN-γ-DNA wurde durch Rekombination der rekombinanten
Plasmide pGBD1 und pKYP14 in der nachstehend beschriebenen Weise
durchgeführt, die in den vorstehenden Verfahren (a) und (b)
erhalten wurden.
-
Zunächst wurden 5 ug des Plasmids pGBD1 (etwa 3,6
kBp) in 30 ul einer Pufferlösung gelöst, die 10 mM Tris-HCl
(pH-Wert 7,5), 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol (hier
nachstehend als "Y-O-Pufferlösung" bezeichnet) enthielt, und
es wurden 10 Einheiten ClaI zugesetzt. Die Spaltungsreaktion
wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach einer
10-minütigen Hitzebehandlung bei 65ºC und einer anschließenden
Kühlung auf Eis wurden 2 ul Y-O-Pufferlösung in 10facher
Konzentration, 5 ul 1 M NaCl, 12 ul destilliertes Wasser und
2,0 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI zugesetzt und
gemischt. Die Spaltungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC
durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde während der Reaktion
partiell mit BamHI gespalten. Das erhaltene ClaI-BamHI-DNA-
Fragment (etwa 1,3 kBp), das die IFN-γ-DNA enthielt, wurde
gereinigt. 5 ug des den lpp-Terminator enthaltenden Plasmids
pKYP14 (etwa 5,8 kBp) wurden gesondert mit 10 Einheiten ClaI
und 20 Einheiten BamHI in 50 ul Y-50-Pufferlösung 2 Stunden
gespalten, und anschließend wurde das größere, den
lpp-Terminator enthaltende Plasmid-DNA-Fragment von etwa 5,0 kBp
gereinigt. Mit dem so erhaltenen, von pKYP14 stammenden DNA-
Fragment (etwa 0,1 ug) und dem von pGBD1 stammenden DNA-
Fragment (etwa 0,05 ug) wurde in Gegenwart einer Einheit T4-
DNA-Ligase bei 4ºC in 20 ul T4-DNA-Ligase-Pufferlösung eine
18-stündige Ligierungsreaktion vorgenommen.
-
Eine Plasmid-DNA wurde aus dem Escherichia coli-Stamm
HB101, der durch das so erhaltene rekombinante Plasmid
transformiert worden war, isoliert, und es wurde eine
Strukturanalyse durchgeführt, in der die Struktur mit der
Insertion des lpp-Terminators stromabwärts der IFN-γ-DNA des im
Stamm IGBJ2 enthaltenden Plasmids pGBJ2 bestätigt wurde.
(d) Konstruktion von pGBK3
-
Das Plasmid pGBK3 mit der Struktur, in der der lpp-
Terminator stromabwärts der IFN-γ-DNA inseriert ist, wurde
durch Rekombination des rekombinanten Plasmids pGBJ2, das im
vorstehend beschriebenen Schritt (c) erhalten wurde, und des
IFN-γ-exprimierenden Plasmids pGKA2 (vgl. Referenzbeispiel
1) in der nachstehend beschriebenen Weise konstruiert.
-
Zunächst wurden 5 ug des Plasmids pGKA2 (etwa 5,2
kBp) in 30 ul Y-50-Pufferlösung gelöst, und es wurden mehr
als 10 Einheiten PstI zugesetzt. Die Spaltungsreaktion wurde
2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach einer 10-minütigen
Hitzebehandlung bei 65ºC und einer anschließenden Kühlung
auf Eis wurden 2 ul Y-150-Pufferlösung in 10facher
Konzentration,
3 ul 1 M NaCl, 14 ul destilliertes Wasser und 10
Einheiten des Restriktionsenzyms NcoI (von New England
Biolabs hergestellt, dasselbe Restriktionsenzym wurde hier
nachstehend verwendet) zugesetzt, und die Spaltungsreaktion
wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Nach einer
10-minütigen Hitzebehandlung bei 65ºC wurde ein Plasmid-DNA-Fragment
von etwa 1,85 kBp, das die IFN-γ-DNA enthielt, gereinigt.
Anschließend wurde mit etwa 5 ug des vorstehend erhaltenen,
rekombinanten Plasmids pGBJ2 (etwa 6,4 kBp) dieselbe, bei
pGKA2 angewendete Behandlung durchgeführt, und das erhaltene
PstI-NcoI-Plasmid-DNA-Fragment von etwa 4,7 kBp wurde
gereinigt. Mit dem so erhaltenen, von pGKA2 stammenden DNA-
Fragment (etwa 0,1 ug) und dem von pGBJ2 stammenden DNA-
Fragment (etwa 0,1 ug) wurde in Gegenwart einer Einheit T4-
DNA-Ligase bei 4ºC in 20 ul T4-DNA-Ligase-Pufferlösung eine
18-stündige Ligierungsreaktion durchgeführt. Eine Plasmid-
DNA wurde aus dem Escherichia coli-Stamm HB101, der durch
die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA transformiert
worden war, isoliert und gereinigt, und es wurde eine
Strukturanalyse durchgeführt, in der bestätigt wurde, daß das im
Stamm IGBK3 enthaltende Plasmid pGBK3 die gewünschte
Struktur aufwies.
Referenzbeispiel 3
Konstruktion von pGBY1 (vgl. Fig. 5)
-
Das rekombinante Plasmid pGBY1, in dem der BglII-
Linker an der NruI-Stelle des im Referenzbeispiel 2 (d)
erhaltenen, rekombinanten Plasmids pGBK3 inseriert ist, wurde
in der nachstehend beschriebenen Weise erhalten.
-
Zunächst wurden 2 ug des Plasmids pGBK3 (etwa 5,9
kBp) in 20 ul Y-100-Pufferlösung gelöst und 4 Einheiten NruI
(von New England Biolabs hergestellt) zugesetzt. Die
Spaltungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt und
durch eine 10-minütigen Hitzebehandlung bei 65ºC beendet.
Anschließend wurde mit 0,1 ug des gespaltenen Materials mit
2 Einheiten T4-DNA-Ligase in Gegenwart von 5 pM
5'-phosphoryliertem BglII-Linker (5'-pCAGATCTG-3'; von Takara Shuzo
Co. hergestellt) bei 4ºC in 20 ul T4-DNA-Ligase-Pufferlösung
eine 18-stündige Ligierungsreaktion durchgeführt.
-
Der Escherichia coli-Stamm HB101 wurde durch die so
erhaltene rekombinante Plasmid-DNA transformiert, um eine
Ap-resistente Kolonie zu erhalten. Plasmid-DNA wurde aus der
Transformanten isoliert, und es wurde durch Spaltung der DNA
mit Restriktionsenzymen, wie BglII, die Strukturanalyse des
Plasmids durchgeführt, in der bestätigt wurde, daß das
rekombinante Plasmid pGBY1 mit der Insertion des BglII-Linkers
an der NruI-Stelle von pGBK3 erhalten wurde.