DE69233671T2 - Inhibitoren der Dipeptidyl-Aminopeptidase vom Typ IV - Google Patents
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Description
- Hintergrund der Erfindung
- Diese Erfindung betrifft Inhibitoren der Aminopeptidaseaktivität der Dipeptidylpeptidase Typ IV (DP-IV).
- DP-IV ist ein nach Prolin spaltendes Enzym, das Xaa-Pro-Dipeptide (wobei Xaa für jede Aminosäure stehen kann) spezifisch von dem aminoterminalen Ende von Polypeptiden entfernt. DP-IV wird auch Xaa-Ala-Dipeptide von aminoterminalen Enden entfernen, wenn auch mit geringerer Effizienz. DP-IV ist in vielen Säugerzellen und -geweben vorhanden, zum Beispiel in Nierenkanälchenzellen, Zellen des Darmepitheliums und Blutplasmazellen. Es ist auch auf der Oberfläche von CD4+- und einigen CD8+-T-Zellen vorhanden. Man glaubt, dass es an der Regulation der Immunantwort beteiligt ist; das Auftreten von DP-IV auf einer Zelloberfläche ist mit der Fähigkeit der Zellen verbunden, Interleukin-2 (IL-2) zu produzieren. DP-IV wird auch als Dipeptidyl-Peptidhydrolase DAP-IV oder DPP-IV bezeichnet; ihm wurde die EC-Nummer 3.4.14.5. zugeordnet.
- Es sind drei verschiedene Inhibitoren von DP-IV bekannt. Einer von diesen ist N-Ala-Pro-O-(Nitrobenzyl-)Hydroxylamin, ein Suizid-Inhibitor. (In dieser Anmeldung werden die Standard-Aminosäurecodes mit drei Buchstaben verwendet; O steht für Sauerstoff.) Ein weiterer Inhibitor ist e-(4-Nitro-)Benzoxycarbonyl-Lys-Pro, ein kompetitiver Inhibitor. Der dritte Inhibitor ist ein polyklonales anti-Schweinenieren-DP-IV-Immunglobulin aus Kaninchen. Schön et al. (Biol. Chem., 1991, 372, 305-311) berichten von spezifischen Inhibitoren von DP-IV und ihren Wirkungen auf die Proliferation menschlicher Lymphozyten. WO 89/03223 berichtet von Prolin- und Prolinanalogon umfassenden Verbindungen, die Enzyme inhibieren, die nach Prolyl spaltende Enzyme umfassen. Wood et al. (J. Med. Chem., 1989, 32, 2407-2411) berichten von Tetrapeptidinhibitoren von IgA1-Proteinasen.
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DD 270 382 - Zusammenfassung der Erfindung:
- Die enzymatische Aktivität von DP-IV umfasst das Abspalten eines Dipeptides vom freien aminoterminalen Ende eines Polypeptides. DP-IV weist eine Präferenz für das Abspalten nach einem Prolin auf, d.h. einem Prolin an der vorletzten Position des aminoterminalen Endes. Es wird ein freies aminoterminales Ende benötigt; DP-IV ist somit ein nach Prolin spaltendes Enzym, das spezifisch ein N-terminales Xaa-Pro-Dipeptid von einem Polypeptid abspaltet (wobei Xaa jede Aminosäure, einschließlich Prolin, sein kann). DP-IV wird auch ein Xaa'-Ala-Dipeptid von einem aminoterminalen Ende eines Polypeptides abspalten, wenn Xaa' eine Aminosäure mit einer sperrigen Seitengruppe, z.B. Tyrosin, ist.
- Diese Erfindung betrifft die Bereitstellung von wirksamen Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von DP-IV. Im Allgemeinen ist ein α-Aminoboronsäure-Analogon von Prolin (boroPro wird verwendet, um ein solches Analogen zu bezeichnen, bei dem die Carboxygruppe von Prolin durch eine B(OH)2-Gruppe ersetzt wurde, wobei (OH)2 für zwei Hydroxygruppen steht und B für Bor steht) unter Bildung eines Dipeptides mit boroPro als carboxyterminalem Rest an eine Aminosäure gebunden ist. Diese dipeptidischen Prolyl-Boronsäuren sind wirksame und hochspezifische Inhibitoren von DP-IV, wobei die Ki-Werte im nanomolaren Bereich liegen.
- Dipeptide, die den boroPro-Teil aufweisen, sind relativ instabil; somit haben wir Inhibitoren entworfen, die wenigstens zwei andere Aminosäurereste aufweisen. Im Allgemeinen ist die Struktur dieser Inhibitoren X-Pro-Y-boroPro, wobei X und Y unter allen Aminosäuren (einschließlich Prolin) ausgewählt sind. Dieses Tetrapeptid kann an seinem aminoterminalen Ende durch das Hinzufügen von einem oder mehr als einem Dipeptid verlängert sein, wobei jedes Dipeptid die allgemeine Formel Z-Pro oder Z-Ala aufweist, wobei jedes Z unabhängig jeder Aminosäurerest (einschließlich Prolin) sein kann. Diese allgemeine Struktur wird unten detaillierter definiert. Diese Inhibitoren fungieren als Inhibitoren von DP-IV, weil jeder Dipeptidteil ein Substrat von DP-IV ist und das Endprodukt der Reaktion eines solchen Inhibitors mit DP-IV der Dipeptidinhibitor Y-boroPro ist. Das aminoterminale Ende dieser Inhibitoren darf nicht blockiert sein, ansonsten büßen sie ihre inhibitorische Fähigkeit bezüglich DP-IV ein, da DP-IV nicht in der Lage ist, ein Dipeptid von einem Polypeptid mit blockiertem aminoterminalen Ende abzuspalten.
- Somit stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt eine inhibitorische Verbindung dar, die die Struktur Gruppe I-Gruppe II aufweist. Gruppe I weist die Strukturauf, wobei H einen Wasserstoff; C einen Kohlenstoff; O einen Sauerstoff; N einen Stickstoff darstellt; jedes R unabhängig aus der Gruppe gewählt ist, die die R-Gruppen einer Aminosäure, einschließlich Prolin, umfasst; jede gestrichelte Linie unabhängig eine Bindung an ein H oder eine Bindung an eine R-Gruppe darstellt und jedes H' diese Bindung oder einen Wasserstoff darstellt und p eine ganze Zahl zwischen einschließlich 0 und einschließlich 4 ist.
- Gruppe II weist die Strukturauf, wobei T eine Gruppe der Formel:
ist, wobei G entweder H, Fluor (F) oder eine Alkylgruppe ist, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome und optional Heteroatome, die N, S (Schwefel) oder O sein können, umfasst, oder eine Phosphonatgruppe der Formel
wobei jedes J unabhängig O-Alkyl, N-Alkyl oder Alkyl ist. Jedes O-Alkyl, N-Alkyl oder Alkyl umfasst 1 bis 20 Kohlenstoffatome und optional Heteroatome, die N, S oder O sein können. T ist im Allgemeinen in der Lage, einen Komplex mit dem katalytischen Zentrum von einer DP-IV zu bilden.
und jedes R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 und R8 ist getrennt eine Gruppe, die die ortsspezifische Erkennung der inhibitorischen Verbindung durch DP-IV nicht wesentlich stört, und erlaubt, dass ein Komplex mit DP-IV gebildet wird.
- In bevorzugten Ausführungsformen ist T eine Phosphonatgruppe oder eine Trifluoralkylketongruppe; jedes R1-R8 ein H; jedes R1 und R2 ein H, und jedes Y CH2-CH2, jedes R unabhängig gewählt aus der R-Gruppe von Prolin und Alanin; weist die inhibitorische Verbindung bezüglich DP-IV eine Bindungs- oder Dissoziationskonstante von mindestens 10–9 M, 10–8 Mol oder sogar 10–7 M auf, und ist die inhibitorische Verbindung mit einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz gemischt.
- In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Inhibieren der enzymatischen Aktivität von DP-IV in einem Säuger bereit. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer wirksamen Menge einer oben beschriebenen inhibitorischen Verbindung an den Säuger. Bevorzugtesterweise liegt die Menge der verabreichten Verbindung zwischen 1 und 500 mg/Kilogramm des behandelten Tieres/Tag.
- In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung einen Inhibitor von DP-IV bereit, der die Strukturaufweist, wobei m eine ganze Zahl zwischen einschließlich 0 und einschließlich 10 ist; A und A' derart gewählte L-Aminosäurereste (bei Glycin gibt es keine derartige Unterscheidung) sind, dass das A in jeder sich wiederholenden Einheit in Klammern ein anderer Aminosäurerest sein kann; T wie oben definiert ist; das an T gebundene C sich in der L-Konfiguration befindet; und die Bindungen zwischen A und N, A' und C und zwischen A' und N Peptidbindungen sind. Damit, dass „das an T gebundene C sich in der L-Konfiguration befindet", ist gemeint, dass die absolute Konfiguration des C die gleiche wie die einer L-Aminosäure ist.
- Somit hat die T-Gruppe zu dem C das gleiche Verhältnis wie die -COOH-Gruppe einer L-Aminosäure zu ihrem α-Kohlenstoff. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen sind A und A' unabhängig Prolin- oder Alaninreste; und m ist 0.
- In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Inhibieren von DP-IV in einem Säuger bereit. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer wirksamen Menge der oben beschriebenen Verbindungan einen Säuger auf. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Menge 1 mg/kg Säuger pro Tag bis 500 mg/kg Säuger pro Tag.
- Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen offenkundig werden.
- Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
- Zunächst werden die Figuren kurz beschrieben werden.
- Figuren
-
1 ist eine schematische Darstellung der Synthese einer Boro-Prolin-Verbindung, die nicht zur Erfindung gehört, und -
2 ist eine schematische Darstellung von mehreren Verbindungen, die nicht zur Erfindung gehören. - Struktur
- Die inhibitorischen Verbindungen der Erfindung weisen die in der Zusammenfassung der Erfindung oben zitierte allgemeine Struktur auf. Beispiele von bevorzugten Strukturen sind diejenigen, auf die oben als bevorzugte Ausführungsformen Bezug genommen wird.
- Die Struktur der bevorzugten inhibitorischen Verbindungen ist derart beschaffen, dass wenigstens ein Teil der Aminosäuresequenz nahe der Spaltstelle eines DP-VI-Substrates dupliziert oder nahezu dupliziert ist. Diese Duplizierung ist teilweise für die Fähigkeit der inhibitorischen Verbindungen verantwortlich, DP-IV über einen Mechanismus zu inhibieren, von dem man glaubt, dass an ihm eine kompetitive Inhibition zwischen einer DP-IV-inhibitorischen Verbindung oder einem DP-IV-Spaltprodukt der inhibitorischen Verbindung und dem eigentlichen DP-IV-Substrat beteiligt ist.
- Die Wahl der Aminosäuresequenz beeinflusst die inhibitorische Aktivität der inhibitorischen Verbindung und ihrer Spezifität. Peptidfragmente können synthetisiert und anschließend unter Verwendung von Standardmethoden getestet werden, um ihre Wirksamkeit als Inhibitoren zu bestimmen. Die Spezifität wird in einer ähnlichen Weise durch Testen der inhibitorischen Wirkung einer bestimmten inhibitorischen Verbindung auf die Enzymaktivität, bestimmt. Die inhibitorischen Verbindungen inhibieren bevorzugterweise die enzymatische Aktivität von DP-IV und inhibieren keine Enzyme, die für die normalen Zellfunktionen erforderlich sind.
- Die inhibitorischen Verbindungen umfassen eine Gruppe (T), die bewirkt, dass die inhibitorische Verbindung einen Komplex mit DP-IV bildet, nicht nur in einer kompetitiven Weise, sondern auch auf einem chemisch-reaktiven Weg, so dass eine starke Bindung zwischen der inhibitorischen Verbindung und DP-IV gebildet wird. Diese Gruppe wirkt somit derart, dass sie die inhibitorische Verbindung an DP-IV bindet und die inhibitorische Bindungskonstante (Ki) der inhibitorischen Verbindung erhöht. Beispiele solcher Gruppen umfassen Fluoralkylketone und Phosphoramidate (mit den in der Zusammenfassung oben angegebenen Formeln). Diese Gruppen sind wie in der obigen Formel kovalent an den Prolylrest der Verbindung gebunden.
- Das Prolin oder Prolinanalogon, oben dargestellt durchist derart gewählt, dass es die Struktur von Prolin, das von dem aktiven Zentrum der DP-IV erkannt wird, nachahmt. Es kann durch das Bereitstellen von R1- und R2-Gruppen, die diese Erkennung nicht erheblich stören und den Ki der Verbindung somit nicht erheblich beeinflussen, modifiziert sein. Somit kann eine oder mehr als eine Hydroxygruppe unter Bildung von Hydroxyprolin eingesetzt sein, und Methyl- oder Zucker-Teile können mit diesen Gruppen verbunden sein. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Gruppen bei dieser Erfindung nicht entscheidend sind und dass eine große Auswahl an Substituenten bei R1 und R2 akzeptabel sind. Teilweise bedeutet das Erfordernis, dass das oben beschriebene Prolinanalogon die Struktur des durch das aktive Zentrum der DP-IV erkannten Prolins nachahmt, dass das an das N und Y gebundene C die gleiche Stereochemie aufweist wie das α-Atom von L-Prolin.
- Synthese von BoroProlin (Beispiel, nicht Teil der Erfindung)
- Unter Bezugnahme auf
1 wird die Ausgangsverbindung I im Wesentlichen nach der Vorgehensweise von Matteson et al. (Organometallics 3:1284, 1984) hergestellt, abgesehen davon, dass der Pinanediolester durch einen Pinakolester ersetzt wird. Ähnliche Verbindungen wie Borpipecolinsäure und 2-Azetodinboronsäure können hergestellt werden, indem das Ausgangsmaterial in geeigneter Weise ausgewählt wird, um die Pentyl- und Propylanaloga von Verbindung I zu ergeben. Weiterhin kann Br in der Formel durch Cl, und Pinakol in der Formel durch andere Diol-Schutzgruppen, z.B. 2,3-Butandiol und alpha-Pinandiol, ersetzt werden. - Verbindung II wird dadurch hergestellt, dass Verbindung I mit [(CH3)O3Si]2N-Li+ umgesetzt wird. Bei dieser Reaktion wird Hexamethyldisilazan in Tetrahydrofuran gelöst, und ein Äquivalent n-Butyllithium wird bei –78°C hinzugefügt. Nach dem Aufwärmen bis auf Raumtemperatur (20°C) und dem Abkühlen bis auf –78°C wird ein Äquivalent von Verbindung I in Tetrahydrofuran hinzugegeben. Der Mischung wird erlaubt, langsam Raumtemperatur zu erreichen, und sie wird über Nacht gerührt. Das alpha-bis[Trimethylsilan]-geschützte Amin wird durch Verdampfen des Lösungsmittels und Hinzugeben von Hexan unter wasserfreien Bedingungen isoliert. Der unlösliche Rückstand wird durch Filtrieren unter Stickstoffschutz entfernt, was eine Hexanlösung der Verbindung II ergibt.
- Verbindung III, die N-Trimethylsilyl-geschützte Form von boroProlin, wird durch die thermische Zyklisierung von Verbindung II während des Destillationsvorganges erhalten, bei dem die Verbindung II auf 100-150°C erhitzt und das Destillat, das bei 62-66°C und 0,06-0,10 mm Druck siedet, aufgefangen wird.
- Verbindung IV, boroProlin-Pinakol-Hydrogenchlorid, wird durch Behandlung von Verbindung III mit HCl:Dioxan erhalten. Überschüssiges HCl und Nebenprodukte werden durch Trituration mit Ether entfernt. Das Endprodukt wird mit hohem Reinheitsgrad durch Umkristallisation aus Ethylacetat erhalten.
- Die boroProlin-Ester können auch durch Behandlung des Reaktionsgemisches, das bei der Herstellung von Verbindung II erhalten wird, mit wasserfreier Säure erhalten werden, um 1- Amino-5-brombutylboronat-Pinakol als Salz zu ergeben. Die Zyklisierung findet nach dem Neutralisieren des Salzes mit Base und dem Erhitzen des Reaktionsansatzes statt.
- Herstellung von boroProlin-Pinakol (Beispiel, nicht Teil der Erfindung)
- Das Zwischenprodukt, 4-Brom-1-chlorbutylboronat-Pinakol, wurde durch das Verfahren nach Matteson et al. (Organometallics 3:1284, 1984) hergestellt, abgesehen davon, dass die Bedingungen im Hinblick auf Herstellungen im Großmaßstab modifiziert wurden und die Pinanediol-Schutzgruppe durch Pinakol ersetzt wurde.
- 3-Brompropylboronat-Pinakol wurde durch Hydrogenboronierung von Allylbromid (173 ml, 2,00 Mol) mit Catechinboran (240 ml, 2,00 Mol) hergestellt. Catechinboran wurde zu dem Allylbromid hinzugegeben und die Reaktion 4 Stunden lang in einer Stickstoffatmosphäre auf 100°C erhitzt. Das Produkt, 3-Brompropylboronat-Catechin (Siedepunkt 95-102°C, 0,25 mm) wurde mit einer Ausbeute von 49% durch Destillation isoliert. Der Catechinester (124 g, 0,52 Mol) wurde mit Pinakol (61,5 g, 0,52 Mol) durch Vermischen des Bestandteils in 50 ml THF und dadurch, dass sie 0,5 Stunden lang bei 0°C und 0,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurden, umgeestert. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfung entfernt und 250 ml Hexan wurden hinzugegeben. Catechin wurde als kristalliner Feststoff entfernt. Die quantitative Entfernung wurde durch schrittweise Verdünnung auf 500 ml und auf 1000 ml mit Hexan und durch Entfernen der Kristalle bei jeder Verdünnung erreicht. Das Hexan wurde verdampft und das Produkt destilliert, was 177 g (Siedepunkt 60-64°C, 0,35 mm) ergab.
- 4-Brom-1-chlorbutylboronat-Pinakol wurde durch Homologisierung des entsprechenden Propylboronates hergestellt. Methylenchlorid (50,54 ml, 0,713 Mol) wurde in 500 ml THF gelöst, und 1,54 N n-Butyllithium in Hexan (480 ml, 0,780 Mol) wurden langsam bei –100°C hinzugegeben. 3-Brompropylboronat-Pinakol (178 g, 0,713 Mol) wurde in 500 ml THG gelöst, bis auf den Gefrierpunkt der Lösung abgekühlt und zur Reaktionsmischung zugegeben. Zinkchlorid (54,4 g, 0,392 Mol) wurde in 250 ml THG gelöst, auf 0°C abgekühlt und in mehreren Portionen zur Reaktionsmischung hinzugegeben. Dem Reaktionsansatz wurde erlaubt, sich langsam auf Raumtemperatur aufzuwärmen und über Nacht zu rühren. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand in Hexan (1 Liter) gelöst und mit Wasser (1 Liter) gewaschen. Unlösliches Material wurde verworfen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Filtrieren wurde das Lösungsmittel verdampft. Das Produkt wurde destilliert und ergab 147 g (Siedepunkt 110-112°C, 0,200 mm).
- N-Trimethylsilyl-boroProlin-Pinakol wurde zuerst durch Auflösen von Hexamethyldisilizan (20,0 g, 80,0 mMol) in 30 ml THF, Abkühlen der Lösung auf –78°C und Hinzugeben von 1,62 N n-Butyllithium in Hexan (49,4 ml, 80,0 mMol) hergestellt. Der Lösung wurde gestattet, sich langsam bis auf Raumtemperatur aufzuwärmen. Sie wurde wieder bis auf –78°C abgekühlt, und 4-Brom-1-chlorbutylboronat-Pinakol (23,9 g, 80.0 mMol) in 20 ml THF wurde hinzugegeben. Der Mischung wurde erlaubt, sich langsam auf Raumtemperatur aufzuwärmen, und sie wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfung entfernt und trockenes Hexan (400 ml) hinzugegeben, was ein Präzipitat ergab, das durch Filtration in einer Stickstoffatmosphäre entfernt wurde. Das Filtrat wurde verdampft und der Rest destilliert, was 19,4 g des erwünschten Produktes (Siedepunkt 60-62°C, 0,1-0,06 mm) ergab.
- H-boroProlin-Pinakol·HCl (boroProlin-Pinakol·HCl) wurde durch das Abkühlen von N-Trimethylsilyl-boroProlin-Pinakol (16,0 g, 61,7 mMol) auf –78°C und das Hinzugeben von 4 N HCl:Dioxan (46 ml, 185 mMol) hergestellt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei –78°C und eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand mit Ether trituriert, was einen Feststoff ergab. Das unreine Produkt wurde in Chloroform gelöst und unlösliches Material durch Filtration entfernt. Die Lösung wurde verdampft und das Produkt aus Ethylacetat kristallisiert, was 11,1 g des erwünschten Produktes (Schmelzpunkt 156,5-157°C) ergab.
- Synthese von boroProlin-Peptiden (Beispiel, nicht Teil der Erfindung)
- Allgemeine Verfahren zum Koppeln von N-geschützten Peptiden und Aminosäuren mit geeigneten Seitenketten-Schutzgruppen an H-boroProlin-Pinakol sind anwendbar. Wenn diese benötigt werden, können Seitenketten- und N-terminale Schutzgruppen durch Behandlung mit wasserfreiem HCl, HBr, Trifluoressigsäure oder durch katalytische Hydrierung entfernt werden. Diese Vorgehensweisen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannt.
- Die Vorgehensweise mit gemischtem Anhydrid nach Anderson et al. (J. Am. Chem. Soc. 89:5012, 1984) ist zum Peptidkoppeln bevorzugt. Unter erneuter Bezugnahme auf
1 wird das gemischte Anhydrid einer N-geschützten Aminosäure oder eines N-geschützten Peptides durch das Auflösen des Peptides in Tetrahydrofuran und durch das Hinzugeben von einem Äquivalent N-Methylmorpholin hergestellt. Die Lösung wird auf –20°C abgekühlt, und ein Äquivalent Isobutylchlorformiat wird hinzugegeben. Nach 5 Minuten wird diese Mischung und ein Äquivalent Triethylamin (oder einer anderen sterisch gehinderten Base) zu einer Lösung von H-boroPropinaol hinzugegeben, das entweder in kaltem Chloroform oder Tetrahydrofuran aufgelöst ist. - Die Reaktionsmischung wird routinemässig eine Stunde lang bei –20°C und 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur (20°C) gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Verdampfung entfernt, und der Rückstand wird in Ethylacetat aufgelöst. Die organische Lösung wird mit 0.20 N Salzsäure, 5% wässrigem Natriumhydrogencarbonat und gesättigtem wässrigem Natriumchlorid gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und verdampft. Die Produkte werden entweder durch Silikagel-Chromatographie oder Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von SephadexTM LH-20 und Methanol als Lösungsmittel gereinigt.
- Frühere Studien haben gezeigt, dass die Pinakol-Schutzgruppe in situ durch Vorinkubation in Phosphatpuffer vor der Durchführung von biologischen Experimenten entfernt werden kann (Kettner et al., J. Biol. Chem. 259:15106, 1984). Mehrere andere Verfahren sind ebenfalls zum Entfernen von Pinakolgruppen von Peptiden, die boroProlin umfassen, und zur Charakterisierung des Endproduktes anwendbar. Zunächst kann das Peptid mit Diethanolamin behandelt werden, um den entsprechenden Diethanolaminboronsäureester zu ergeben, der wie von Kettner et al. (wie oben) beschrieben leicht durch Behandlung mit wässriger Säure oder einem Schwefelsäure-substituierten Polystyrol-Harz hydrolysiert werden kann. Sowohl Pinakol- als auch Pinandiol-Schutzgruppen können durch Behandeln mit BC13 in Methylenchlorid wie bei Kinder et al. (J. Med. Chem. 28:1917) beschrieben entfernt werden. Schließlich kann die freie Boronsäure durch Behandlung mit wässriger HF wie von Kinder et al. (oben) beschrieben zu dem Difluorboronderivat(-BF2) umgewandelt werden.
- In ähnlicher Weise können verschiedene Estergruppen dadurch eingeführt werden, dass die freie Boronsäure mit verschiedenen di-Hydroxy-Verbindungen (zum Beispiel denjenigen, die Heteroatome wie S oder N umfassen) in einem inerten Lösungsmittel zur Reaktion gebracht wird.
- Herstellung von H-Ala-boroPro (Beispiel, nicht Teil der Erfindung)
- Boc-Ala-boroPro wurde durch gemischtes Anhydrid-Koppeln von dem N-Boc-geschützten Alanin und H-boroPro hergestellt, das wie oben beschrieben hergestellt wurde. H-Ala-boroPro (Ala-boroPro) wurde durch Entfernung der Boc-Schutzgruppe bei 0°C in 3,5 molarem Überschuss von 4N HCl-Dioxan hergestellt. Die Kopplungs- und Entschützungsreaktionen wurden durch chemische Standardreaktionen durchgeführt. Ala-boroPro weist bezüglich DP-IV einen Ki im nanomolaren Bereich auf. Boc-blockiertes Ala-boroPro weist keine Affinität zu DP-IV auf.
- Die zwei Diastereomere von Ala-boroPro-Pinakol, L-Ala-D-boroPro-Pinakol und L-Ala-L-boroPro-Pinakol können durch Silica-Gelchromatographie mit 20% Methanol in Ethylacetat als Elutionsmittel teilweise getrennt werden. Die frühe Fraktion scheint nach einer NMR-Analyse bezüglich eines Isomers zu 95% angereichert zu sein. Weil diese Fraktion DP-IV (bei gleichen Konzentrationen) in einem höheren Ausmaß als spätere Fraktionen hemmt, ist sie wahrscheinlich bezüglich des L-boroPro (L-Ala-L-boroPro-Pinakol)-Isomers angereichert.
- Ein erheblicher Nachteil von H-Ala-boroPro als ein Inhibitor von DP-IV besteht darin, dass es in wässriger Lösung bei neutralem pH und bei Raumtemperatur (20-25°C) mit einer Halbwertszeit von etwa 0,5 Stunden zerfällt. Viele Dipepid-Derivate mit einer freien N-terminalen Aminogruppe und einer funktionellen Gruppe (wie einem Difluormethylketon) am C-Terminus sind aufgrund von intramolekularen Reaktionen ähnlich instabil. Zwischen den amino- und C-terminalen funktionellen Gruppen wird ein sechsgliedriger Ring gebildet, der nachfolgend weitere Reaktionen wie Hydrolyse durchläuft. An DP-IV gebundener Inhibitor ist stabiler, was konsistent mit der Hypothese ist, dass der Zerfall aufgrund einer intramolekularen Reaktion auftritt.
- H-Pro-boroPro ist stabiler als H-Ala-boroPro. Der Ki von H-Pro-boroPro bezüglich DP-IV beträgt etwa 1 × 10–8 M, und es zerfällt in wässriger Lösung bei Raumtemperatur (20-25°C) mit einer Halbwertszeit von etwa 1,5 Stunden. Obwohl die Affinität von H-Pro-boroPro etwa 10-fach geringer ist als die von H-Ala-boroPro, ist die erhöhte Stabilität vorteilhaft.
- Aufgrund der relativ kurzen Halbwertszeit der obigen Dipeptide werden inhibitorische Verbindungen der Erfindung als Tetrapeptide oder längere Peptide gebildet, wie oben in der allgemeinen Formel gezeigt. Andere inhibitorische Verbindungen sind Substrate von DP-IV und ergeben den Dipeptidinhibitor A'-boroPro. Diese Polypeptidboronsäuren sind im Allgemeinen stabil und können über jede Standardvorgehensweise verabreicht werden, um als Substrat von DP-IV und anschließend als Quelle eines wirksamen DP-IV-Inhibitors zu fungieren. Die Vorteile von solchen Molekülen liegen darin, dass der Inhibitor erst in der Umgebung von aktivem DP-IV freigesetzt wird. Diese Polypeptidboronsäuren können durch das Verfahren des Koppelns gemischter Anhydride durch den Durchschnittsfachmann hergestellt werden, z. B. nach Matteson (Organometallics 3:1284, 1984).
- Tests auf DP-IV-Inhibition
- Im folgenden sind Beispiele von Systemen angegeben, durch die die inhibitorische Aktivität der oben beschriebenen inhibitorischen Verbindungen auf DP-IV getestet werden kann. Als ein Beispiel wird H-Ala-boroPro verwendet, um ein jedes dieser Systeme zu testen. Inhibitorische Verbindungen können dadurch getestet werden, dass H-Ala-boroPro einfach durch sie ersetzt wird.
- DP-IV wird aus Schweinenierenkortex durch das Verfahren nach Barth et al. (Acta Biol. Med. Germ. 32:157, 1974) und Wolf et al. (Acta Biol. Med. Germ. 37:409, 1978) und aus menschlicher Plazenta durch das Verfahren nach Puschel et al. (Eur. J. Biochem. 126:359, 1982) gereinigt. H-Ala-boroPro inhibiert beide Enzyme mit einer Ki im nanomolaren Bereich.
- Menschliche mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
- H-Ala-boroPro wurde auf seinen Einfluss auf die PHA-induzierte Proliferation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes getestet. Menschliche mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden aus gesunden menschlichen Spendern durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifugation erhalten. Die Zellen wurden dreimal mit RPMI-1640-Medium gewaschen und mit einer Konzentration von 1 × 106 in RPMI resuspendiert. 10% menschliches Serum wurden verwendet, wie erforderlich.
- Die proliferative Antwort von Lymphozyten wurde unter Verwendung von 3H-Thymidin-Einbau gemessen. 5 × 103 MNC-Zellen (Ford in Handbook of Experimental Immunology, Weir, ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1978) wurden in Reaktionsnäpfen von Mikrotiterplatten mit rundem Boden gegeben und in Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen Verdünnungen von Antigen, Mitogen, Lymphokin oder anderen interessierenden Agenzien inkubiert. Die Zellen wurden in einer Atmosphäre von 5%-igem CO2 in Luft 72 Stunden lang kultiviert, wonach 3H-Thymidin (0,5 μC1/Napf; 2,0 Ci/mM, New England Nuclear) 6 Stunden vor der Beendigung der Kultur hinzugegeben wurden. Die Zellen wurden mit einem multiplen automatischen Erntegerät geerntet und der 3H-Thymidin-Einbau durch Flüssigkeitsszintillationszählung bewertet. Der 3H-Thymidin-Einbau wurde relativ zu Kontrollwerten in Abwesenheit von Inhibitor bestimmt. Der Inhibitor wurde in einer Endkonzentration von 1 × 10–4 M hinzugegeben, aber es können geringere Konzentrationen verwendet werden.
- HIV-Genreplikation
- Wir untersuchten die Wirkung von H-Ala-boroPro auf die HIV-1-Replikation in vitro. Der Sinn dieser Experimente entstammt der veröffentlichten Verbindung zwischen der T-Zellen-Aktivierung, der IL-2-Produktion und der HIV-Replikation sowie der Expression von HIV-Proteinen. Zum Beispiel umfassen induktive Signale, die mit der HIV-Replikation verbunden sind, Mitogene, Antigene, Lymphokine und Transkriptionsfaktoren wie NF-κB, von denen gezeigt wurde, dass sie alle mit der Induktion der IL-2-Produktion, der T-Zellen-Aktivierung oder beiden zusammenhängen.
- In den vorliegenden Studien verwendete Zelllinien umfassen A3.5-Zellen (eine monozytische Zelllinie, die CD4+, HLA-DR+ und CD3– ist) und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC). Die A3.5-Zellen wachsen ohne exogene Wachstumsfaktoren kontinuierlich in Kulturen. Die PBMC-Zellen benötigen IL-2 zur Vermehrung in vitro. Die Zellen wurden mit HIV-1-IIIB sowohl bei den A3.5-Zellen als auch bei den PBMC-Zellen mit einer Infektionsmultiplizität (moi) von 5 × 10–4 Gewebekulturinfektionsdosis 50 (TCID50)/Zelle infiziert. Verdünnungen des Inhibitors wurden in RPMI-1640 hergestellt und anschließend durch einen 0,22 um-Filter geführt. Zu Beginn jedes Experiments wurden 1 × 106 Zellen/Napf in Platten mit 24 Näpfen mit HIV-1-IIIB bei der oben angegebenen moi infiziert. Der Inhibitor wurde in geeigneten Verdünnungen gleichzeitig hinzugegeben. Alle Kulturen wurden bei 5% CO2 und 37°C in RPMI-1640 gehalten, das mit Penicillin, Streptomycin, L-Glutamin, Hepespuffer und 20% Hitze-inaktiviertem fötalen Kalbsserum supplementiert war. Die Zellzahlen und die -lebensfähigkeit wurden durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Die Kulturüberstände wurden geerntet und durch ELISA (NEN-DuPont, Boston, MA) auf HIV-1 p24-Antigen getestet. An jedem Tag wurde frisches Medium und frischer Inhibitor hinzugegeben. Für die PBMC-Kulturen wurden Zellen aus HIV-1-sero-negativen Spendern gewonnen und mit PHA-P (Difco, Detroit, MI, 10 μg/ml) und 10% IL-2 (Electronnucleonics, Silver Spring, MD) 3 Tage vor der Infektion mit HIV-1 stimuliert. PBMC-Kulturen umfassten bei allen Experimenten nicht infizierte und infizierte Zellen ohne Inhibitor, nicht-infizierte Zellen mit Inhibitor bei verschiedenen Konzentrationen und infizierte Zellen in Gegenwart von 1 μm Zidovudin (Azidothymidin, AZT).
- Bei den A3.5 drückt H-Ala-boroPro HIV unter die Nachweisgrenzen in einer Weise, die der anti-HIV-Wirkung von 1 μm AZT ähnlich ist. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den PBMC-Zellen beobachtet. Somit haben die Inhibitoren dieser Erfindung eine anti-HIV-Wirkung. Zell-Lebensfähigkeitstests zeigen, dass diese Inhibitoren selbst bei relativ hohen Konzentrationen (10–3 M bei A3.5-Zellen) nicht zytotoxisch sind.
- Bestimmung von DP-IV-Aktivitäten in biologischen Proben
- Die Fähigkeit, mit Zellen oder Geweben verbundene DP-IV-Aktivitäten bestimmen zu können, ist hochgradig wünschenswert. Zum Beispiel wird sie erlauben, Korrelationen zwischen dem Ausmaß der Inhibition von DP-IV und der Größenordnung der beobachteten biologischen Wirkungen, z. B. auf die Zellproliferation und die IL-2-Produktion, festzustellen. Eine solche Korrelation ist bei der Feststellung hilfreich, ob die biologische Wirkung durch die Inhibition von DP-IV verursacht wird. Wir haben festgestellt, dass solche Bestimmungen unter Verwendung der leicht verfügbaren chromogenen Substrate von DP-IV, nämlich X-Pro-p-Nitroaniliden und X-Pro-7-amino-4-Trifluormethyl-Kumarinen (AFC), reproduzierbar sind und zuverlässig durchgeführt werden können. Die AFC-Substrate sind fluoreszent und liefern somit eine höhere Empfindlichkeit. Die DP-IV-Aktivität wird als Freisetzung von p-Nitroanilid spelctrophotometrisch bei 410 nM gemessen oder durch das Messen der Fluoreszenz bei 505 nM unter Verwendung von X-Pro-AFC-Derivaten. Die Verringerung der Aktivität in Gegenwart eines Inhibitors stellt einen einfachen Test für die inhibitorische Aktivität bereit.
- Wirkung der Inhibitor-Stereochemie auf die DP-IV-Inhibierung
- Die unten beschriebenen Experimente zeigen, dass Ala-boroPro und Pro-boroPro wirksame Inhibitoren von DP-IV mit Ki-Werten im nanomolaren Bereich sind. Zusätzlich wird von der L,L-Form von Pro-boroPro gezeigt, dass sie ein weit wirksamerer Inhibitor von DP-IV als die L,D-Form von Pro-boroPro ist.
- Die Aktivität von aus Schweinenieren nach dem Verfahren von Wolf et al. (ACTA Bio. Mes. Ger. 37:409, 1972) isolierter DP-IV wurde unter Verwendung von Ala-Pro-p-Nitroanilid als Substrat gemessen. Kurz gesagt enthielt eine Reaktion 50 μMol Natrium-Hepes (pH 7,8), 10 μMol Ala-Pro-p-Nitroanilid, 6 Milli-Einheiten DP-IV und 2% (Vol/Vol) Dimethylformamid in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Enzym gestartet, und Reaktionsgeschwindigkeiten wurden bei 25°C gemessen.
- Die Geschwindigkeiten der DP-IV-katalysierten Hydrolyse von Ala-Pro-p-Nitroanilid wurden bei 3 bis 5 verschiedenen Konzentrationen von Ala-boroPro Pro-boroPro, boroPro und N-Boc-Ala-boroPro bestimmt. In einigen Fällen waren die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten nicht linear. Die Geschwindigkeiten wurden nach 10 Min. linear; dieser lineare Teil kann durch zehnminütige Vorinkubation des Enzyms mit Inhibitor vor dem Hinzugeben des Substrates verdoppelt werden. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von Ki-Messungen, die in dem linearen Bereich vorgenommen wurden.
- Ala-boroPro war ein wirksamer Inhibitor von DP-IV und wies einen Ki-Wert von 2 × 10–9 M auf (Tabelle 1). Das Blockieren des N-Terminus dieses Inhibitors (z. B. N-Boc-Ala-boroPro, Tabelle 1) beseitigte die Inhibition, was zeigt, dass eine freie, positiv geladene Aminogruppe für die Enzymerkennung und -bindung wahrscheinlich wesentlich ist. Die Ki von 3 × 10–9 M von Pro-boroPro zeigt, dass DP-IV eine Iminogruppe an Stelle der funktionalen Aminogruppe am N-Terminus genauso wie den Austausch einer Prolinseitenkette als Ersatz für die Alanin-Methylgruppe toleriert. Dies zeigt, dass die S2-Spezifitätssubstelle nicht hochgradig restriktiv ist. Obwohl DP-IV nahezu jede Aminosäure am N-Terminus akzeptieren wird, sind Wechselwirkungen zwischen dieser Aminosäure und dem Enzym für die Bindung entscheidend. Dies wird durch die 105-106-fache Verringerung der Affinität beim Übergang von Ala-boroPro oder Pro-boroPro zu boroPro selbst (Tabelle 1) veranschaulicht.
- Die in Tabelle 1 gezeigten Inhibitionsexperimente wurden mit aus Schweinenieren isolierter DP-IV ausgeführt. Pro-boroPro und Ala-boroPro inhibieren DP-IV aus humaner Plazenta genauso gut.
- Das in den oben beschriebenen Experimenten verwendete Ala-boroPro und Pro-boroPro bestand aus racemischen Mischungen, bei denen der boroPro-Teil sowohl in der D-Form als auch der L-Form vorhanden war, während sowohl Ala als auch Pro als L-Isomer vorlagen.
- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) kann verwendet werden, um L-Pro-D-boroPro von L-Pro-L-boroPro zu trennen. Eine 4,6 mm × 250 mm Nucleosil C 18 (5 μ Partikel)-Säule, die ein Zwei-Puffer-System (Puffer A ist 100% H2O mit 0,1% TFA, und Puffer B ist 70% CH3CN, 30% H2O, 0,86% TFA) einsetzt, kann verwendet werden, um die Trennung durchzuführen. Von 0 bis 5 Min. werden 5% B und 95% A verwendet, und von 5 bis 25 Min. werden 5% bis 100% B verwendet. Das L,L-Isomer tritt als erstes bei etwa 7 Min. aus, gefolgt von dem L,D-Isomer bei ungefähr 10 Min. NMR- und massenspektrometrische Analysen waren konsistent damit, dass beide Verbindungen Pro-boroPro sind. Ein erneuter Chromatographiedurchgang der gereinigten Isomere zeigte an, dass der erste Durchgang auf der HPLC-Säule eine Isomerenreinheit von etwa 99-6% für jedes Isomer erreichte. Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) kann in ähnlicher Weise verwendet werden, um L-Ala-D-boroPro von L-Ala-L-boroPro zu trennen oder um die D-boroPro-Form von anderen Inhibitoren von der L-boroPro-Form zu trennen.
- Wenn L-Pro-L-boroPro und L-Pro-L-boroPro in einem DP-IV-Inhibitionstest verwendet wurden, betrug der Ki bezüglich L-Pro-D-boroPro 3,2 × 10–11 M, während der Ki bezüglich L- Pro-D-boroPro 6,0 × 10–8 M betrug. Das L,L-Isomer stellt einen viel besseren Inhibitor von DP-IV dar als das L,D-Isomer. Weiterhin wird bevorzugt, dass alle Aminosäurereste von DP-IV-Inhibitoren der Erfindung als L-Isomer und nicht als D-Isomer vorliegen.
- Verwendung
- Die inhibitorischen Verbindungen können in einer wirksamen Menge entweder alleine oder in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht werden.
- Die obigen inhibitorischen Verbindungen sind bei der Behandlung einer großen Vielzahl von Krankheiten nützlich; zum Beispiel einer Autoimmunkrankheit, deren Krankheitsentstehung von der T-Zellen-Aktivität abhängig ist. DP-IV spielt bei einer solchen Autoimmunkrankheit eine Rolle, und die Inhibition der DP-IV-Aktivität erlaubt eine Regulierung des Fortschreitens der Krankheit. Solche Krankheiten umfassen Arthritis, die Abstoßung von transplantierten Organen genauso wie SLE und AIDS. Die inhibitorischen Verbindungen dieser Erfindung verstärken die Fähigkeit z. B. des Immunsystems des Säugers, die Krankheit zu bekämpfen, wenn sie an Säuger (z. B. oral, topisch, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, parenteral, nasal oder als Zäpfchen) verabreicht werden.
- Inhibitoren von DP-IV können die IL-2-Produktion unterdrücken, und somit können Krankheiten, bei denen die Produktion von IL-2 verändert ist, durch die Verwendung dieser Inhibitoren behandelt werden. Diese Inhibitoren können auch den Katabolismus von Wachstumshormon-freisetzendem Faktor verzögern und die DP-IV-Aktivität von Amöben und mikrobiellen Pathogenen blockieren, um einem Immunsystem zu erlauben, wirksamer zu funktionieren.
- Die inhibitorischen Verbindungen oder Zusammensetzungen können alleine oder in Verbindung miteinander oder in Verbindung mit anderen therapeutischen Agenzien verabreicht werden. Die Dosierungsmenge kann zwischen 1-500 mg/kg/Tag liegen.
- Andere Ausführungsformen
- Andere Ausführungsformen sind vom Umfang der folgenden Ansprüche. umfasst Diese Inhibitoren wechselwirken mit und/oder binden an DP-IV und verringern dadurch die enzymatische Aktivität von DP-IV gegenüber einem normalen Substrat. Diese Inhibitoren werden durch Vorgehensweisen synthetisiert, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wohlbekannt sind.
Claims (16)
- Inhibitor der Aminopeptidaseaktivität von Dipeptidylpeptidase Typ IV (im Folgenden "DP-IV" genannt), mit der Strukturwobei m eine ganze Zahl zwischen einschließlich 0 und 10 ist; A und A' L-Aminosäurereste sind, derart, dass das A in jeder sich wiederholender Einheit in Klammern ein anderer Aminosäurerest sein kann; das an T gebundene C sich in der L-Konfiguration befindet; die Bindungen zwischen A und N, A' und C und zwischen A' und N Peptidbindungen sind; und T Folgendes ist, entweder: (i)
wobei G entweder H, F oder eine Alkylgruppe enthaltend 1 bis 20 Kohlenstoffatome und wahlweise Heteroatome ist, die N, S oder O sein können; oder (ii)
wobei jedes J unabhängig O-Alkyl, N-Alkyl oder Alkyl ist, wobei jedes Alkyl 1 bis 20 Kohlenstoffatome und wahlweise Heteroatome einschließt, die N, S oder O sein können.
- Inhibitor nach Anspruch 1, wobei A und A' unabhängig Prolin- oder Alaninreste sind.
- Inhibitor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei m 0-4 oder 0 beträgt.
- Inhibitor nach einem der Ansprüche 1-3, mit der Maßgabe, dass, wenn m 0 beträgt, A' etwas Anderes als Ala ist.
- Verbindung mit der Struktur:wobei jedes R unabhängig eine R-Gruppe einer Aminosäure ist; jede gestrichelte Linie unabhängig eine Bindung an einen H oder eine Bindung an eine R-Gruppe ist; und jedes H' diese Bindung oder einen Wasserstoff darstellt; p eine ganze Zahl zwischen einschließlich 0 und 4 ist;
und jedes R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 und R8 getrennt eine Gruppe ist, die die stellenspezifische Erkennung der Verbindung durch DP-IV nicht wesentlich stört und erlaubt, dass eine Komplexverbindung mit DP-IV gebildet wird; und T Folgendes ist, entweder: (i)
wobei G entweder H, F oder eine Alkylgruppe enthaltend 1 bis 20 Kohlenstoffatome und wahlweise Heteroatome ist, die N, S oder O sein können; oder (ii)
wobei jedes J unabhängig O-Alkyl, N-Alkyl oder Alkyl ist, wobei jedes Alkyl 1 bis 20 Kohlenstoffatome und wahlweise Heteroatome einschließt, die N, S oder O sein können.
- Verbindung nach Anspruch 5, wobei jedes von R1-R8 H ist; oder wobei R1 und R2 H sind und jedes Y CH2-CH2 ist.
- Verbindung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei jedes R unabhängig die R-Gruppe von Prolin oder Alanin ist.
- Verbindung nach einem der Ansprüche 5-7, wobei die Verbindung eine Bindungs- oder Dissoziationskonstante zu DP-IV von mindestens 10–9 M, 10–8 M oder 10–7 M aufweist.
- Inhibitor nach einem der Ansprüche 1-4, oder Verbindung nach einem der Ansprüche 5-8, wobei T eine Phosphonatgruppe ist.
- Inhibitor nach einem der Ansprüche 1-4 und 9 oder Verbindung nach einem der Ansprüche 5-9, wobei T eine Trifluoralkylketongruppe ist.
- Inhibitor nach einem der Ansprüche 1-4, 9 und 10 oder Verbindung nach einem der Ansprüche 5-10 mit einer isomeren Reinheit von ca. 96-99%.
- Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen oder mehrere Inhibitoren nach einem der Ansprüche 1-4 und 9-11 oder Verbindung nach einem der Ansprüche 5-11 in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder einem pharmazeutischen Verdünnungsmittel.
- Zubereitung umfassend einen Inhibitor nach einem der Ansprüche 1-4 und 9-11, Verbindung nach einem der Ansprüche 5-11 oder Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der Inhibitor oder die Verbindung mit einer isomeren Reinheit von ca. 96-99% vorliegt.
- Inhibitor nach einem der Ansprüche 1-4 und 9-11 oder Verbindung nach einem der Ansprüche 5-11 zur Verwendung zum Hemmen der enzymatischen Aktivität von DP-IV bei einem Säuger.
- Verwendung eines Inhibitors nach einem der Ansprüche 1-4 und 9-11 oder einer Verbindung nach einem der Ansprüche 5-11 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Hemmen der enzymatischen Aktivität von DP-IV bei einem Säuger.
- Inhibitor oder Verbindung nach Anspruch 14 oder Verwendung nach Anspruch 15 für das Regulieren einer Immunantwort.
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