DE69232252T2

DE69232252T2 - Herstellung und Verwendung von aktivierten Carbamaten

Info

Publication number: DE69232252T2
Application number: DE69232252T
Authority: DE
Inventors: Steven Cohen; Dennis Michaud
Original assignee: Waters Investments Ltd
Current assignee: Waters Investments Ltd
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1992-09-18
Publication date: 2002-07-18
Anticipated expiration: 2012-09-19
Also published as: EP0533200A1; JPH05222033A; EP0533200B1; US5296599A; JP3128353B2; DE69232252D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Bei Biochemikern, klinischen Chemikern und Arzneimittelherstellern besteht beträchtliches Interesse hinsichtlich der Bestimmung der Konzentration von Aminosäuren, Peptiden und anderen Verbindungen mit Aminfunktionen in einer komplexen biologischen Probe. Diese Analyse kann beispielsweise die Bestimmung von 20 oder mehr Aminosäuren im Pikomolbereich erfordern. Eine typische Anwendung ist die qualitative und quantitative Analyse der Aminosäuren, die in einem synthetischen Peptid, möglicherweise einem, das nach DNA- Rekombinationsv synthetisiert wurde, vorliegen. Bei dieser Anwendung ist es nicht ungewöhnlich, dass der Analysator mit Submikrogrammmengen einer Probe arbeiten muss. In ähnlicher Weise verlangt die Analyse auf Aminosäuren im Blut von Neugeborenen beispielsweise die Handhabung sehr kleiner Proben.
Um die Probengröße in Anpassung an die mögliche Knappheit der zur Verfügung stehenden Probe zu verringern und eine Möglichkeit zur Erfassung in Gegenwart von Nicht- Aminosäurekomponenten zu bieten, muss das gewählte analytische Verfahren einen sehr hohen Grad an Empfindlichkeit und Erfassungsselektivität bieten. Die Empfindlichkeit und Selektivität eines Tests für eine Verbindung hängt von der verwertbaren Reaktion, die er liefert, ab. Typische Erfassungsschemata umfassen das Absorptionsvermögen oder die Emission von Licht oder die elektrochemische Reaktivität der interessierenden Verbindung(en).
Die qualitative und quantitative Analyse von komplexen Gemischen aus Aminosäuren und/oder Peptiden umfasst das Analysieren von Proben, die 20 oder mehr Aminosäuren enthalten können und bei denen die Strukturunterschiede zwischen vielen der Aminosäuren subtil sind, beispielsweise besteht der Unterschied zwischen Leucin und Valin in einer Methylengruppe in der aliphatischen Seitenkette. Daher ist ein hoher Grad an Selektivität zu deren Unterscheidung erforderlich. Ein typisches Gemisch enthält Aminosäuren mit sauren, basischen und neutralen Seitengruppen.
Das Absorptionsvermögen, die Fluoreszenz und das elektrochemische Ansprechender meisten Aminosäuren ist sehr schwach. Eine häufig verwendete Taktik zur Maximierung der Empfindlichkeit eine Tests besteht in der Umwandlung der interessierenden Verbindung(en) in ein Derivat, das ein besseres Ansprechen als die interessierende Verbindung selbst aufweist. Die Auswahl eines Derivatisierungsmittels ist eine entscheidende Wahl bei der Entwicklung eines analytischen Verfahrens. Das Derivatisierungsmittel beeinflusst die letztendliche Empfindlichkeit und Genauigkeit der Analyse durch. Maximieren der Empfindlichkeit, Ausbeute und Stabilität der derivatisierten Aminosäuren.
Mehrere Kriterien sind für die Brauchbarkeit eines Derivatisierungsverfahrens wichtig. Das analytische Verfahren muss eine genaue Mengenbestimmung für jede in einem komplexen Gemisch vorhandene Komponente liefern. Zu diesem Zweck müssen die interessierenden Komponenten nicht nur voneinander, sondern von den durch das Derivatisierungsverfahren erzeugten Komponenten getrennt werden. Eine quantitative Umwandlung aller nicht-derivatisierten Aminosäuren einschließlich von sekundären Aminosäuren in einzelne Produkte ist stark erwünscht und sie erleichtert eine gute quantitative Bestimmmung.
Die Erfassungsselektivität ist ein weiteres vorteilhaftes Merkmal für Aminosäurederivate. Nicht-derivatisierte Aminosäuren absorbieren alle schwach im niedrigen UV-Bereich (200-220 nm), doch wird eine Erfassung bei diesen Wellenlängen durch viele in Probengemischen oder mobilen Phasen in der Chromatographie vorhandene Verbindungen gestört. Eine Derivatisierung mit Reagenzien, die bei etwa 254 nm absorbieren, bietet eine Maßnahme für Selektivität, doch können aromatische organische Verbindungen, die häufig in biologischen Proben vorhanden sind, bei dieser Wellenlänge stören. Reagenzien, die eine Erfassung über Fluoreszenz, eine elektrochemische Reaktion oder Absorptionsvermögen im sichtbaren Bereich ermöglichen, sind für eine höhere Erfassungsselektivität erwünscht.
Schließlich ist es notwendig, dass die Derivate ausreichend stabil sind, um eine Trennung und Erfassung ohne einen signifikanten Abbau zu ermöglichen. Hochstabile Derivate sind ebenfalls günstig, da sie bei Bedarf eine erneute Analyse einer Probe, ohne eine andere Probe zu testen, ermöglichen.
In der Vergangenheit wurde eine Anzahl von Derivatisierungsverfahren entwickelt, um den Test von Aminosäuren mittels Hochleistungsflüssigchromatographie und elektrophoretischen Trennungen zu ermöglichen. Vier dieser Verfahren, die häufig zu diesem Zweck verwendet werden, umfassen:
1) Die o-Phthalaldehyd(OPA)/Mercaptanmethode. Das OPA- Verfahren kann Aminosäuren mit einer typischen Erfassungsmenge in der Größenordnung von etwa 100 Femtomol (fmol) erfassen. Die Bildung der Derivate erfolgt rasch. Eine signifikante Schwierigkeit bei diesem Verfahren besteht darin, dass das Addukt ziemlich instabil ist und sehr kurz vor der Erfassungsstufe hergestellt werden muss. Ein weiteres Problem besteht darin, dass dieses Reagens mit sekundären Aminosäuren kein Derivat bildet.

2) Die 9-Fluorenylmethylchlorformiat(FMOC)-Methode.

Das FMOC-Verfahren liefert stabile Derivate mit einer minimalen Erfassungsmenge in der Größenordnung von einigen Hundert fmol. Bei dem FMOC-Verfahren bestehen eine Anzahl von Nachteilen. Freies Tryptophan und Cystein können nicht ohne weiteres quantitativ bestimmt werden. Das Derivatisierungsreagens muss aus dem Reaktionsgemisch mittels einer Extraktionsstufe entfernt werden, da es selbst fluoresziert. Es wurde auch berichtet, dass das Reagens mit Histidin Mehrfachderivate bildet. Das Arbeiten mit dem Reagens ist außerdem gefährlich, da es korrodierend und tränenreizend wirkt.

3) Die Phenylisothiocyanat(PITC)-Methode.

Das PITC-Verfahren ergibt stabile Derivate, die rasch gebildet werden. Es kann sowohl für primäre als auch für sekundäre Aminosäuren sowie für Cystein verwendet werden. Das Verfahren verwendet das Absorptionsvermögen als Erfassungsmaßnahme und es kann eine minimale Erfassungsgrenze von 1 pmol bieten. Die Derivate fluoreszieren jedoch nicht und die Erfassung muss bei 254 nm durchgeführt werden, was keine gute Erfassungsselektivität ermöglicht.

4) Die Dansylchlorid-Methode.

Das Dansylchlorid-Verfahren bildet stabile Derivate mit einer minimalen Erfassbarkeit in der Größenordnung von etwa 1,5 umol. Mit diesem können sekundäre Amine und Cystein erfasst werden, doch führt es zu Mehrfachderivaten.
Außer den genannten Verfahren wurden fluoreszierende Succinimidocarbamate als Derivatisierungsmittel für Amine, Aminosäuren, Peptide, Phosphate und andere Verbindungsklassen verwendet. Wenn das Succinimidocarbamat-Reagens zur Markierung einer Verbindung mit einer fluoreszierenden Gruppe verwendet wird, kann eine Erfassungsgrenze von etwa 1 umol erreicht werden. Diese Reagenzien werden in Verbindung mit modernen Trennverfahren, wie Hochleistungsflüssigchromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Kapillarelektrophorese, verwendet. Nimura et al., Anal. Chem., 58: 2372-2375 (1986). Succinimidyl-aktivierte Carbamate wurden durch Umsetzen von carbocyclischen aromatischen Aminen mit Di-(N-succinimidyl)carbonat hergestellt. Takeda et al., Tetrahedron Lett., 24: 4569-4572 (1983).
Verbesserte Verfahren zur Erfassung und genauen Ermittlung des Vorhandenseins und der Menge von Verbindungen mit Aminfunktionen, insbesondere Aminosäuren und Proteinen, werden benötigt. Es wird ein Verfahren, das die Erfassung dieser Verbindungen in Subpikomolmengen in sehr kleinen Proben erlaubt und die bei der Analyse verbrauchte Probenmenge minimiert, benötigt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Klasse heterocyclischer aromatischer Carbamatverbindungen und deren Verwendung zur Erfassung kleiner Mengen von Verbindungen mit Aminfunktionen. Die vorliegenden Carbamatverbindungen besitzen die folgende allgemeine Formel:
worin Ar für eine Chinolylgruppe, die ggf. mit einer C&sub1;-C&sub6;- Alkylgruppe, wie Methyl oder Ethyl, einer C&sub1;-C&sub6;- Alkoxygruppe, wie Methoxy oder Ethoxy, oder einer Phenylgruppe substituiert ist, steht. Heterocyclische aromatische Amine, die sich zur Bildung der vorliegenden Carbamatverbindungen eignen, umfassen beispielsweise Aminochinolin, substituiertes Aminochinolin oder Aminoisochinolin.
Ein Verfahren zur Herstellung der vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamate ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren umfasst allgemein die Umsetzung des heterocyclischen aromatischen Amins mit Di-[N-succinimidyl]carbonat unter Bedingungen, die zur Bildung der heterocyclischen aromatischen Carbamatverbindung geeignet sind.
Die vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbarnatverbindungen eignen sich zur Derivatisierung von Molekülen mit Aminfunktionen, um diese mit einer fluoreszierenden Gruppe zu markieren. Die heterocyclische aromatische Einheit ist von Natur aus fluoreszierend und kann zur Derivatisierung und Erfassung einer Verbindung mit Aminfunktionen verwendet werden, wobei das entstandene Derivat fluoresziert und aufgrund der hohen Fluoreszenzquantenausbeute der heterocyclischen aromatischen Einheit ohne weiteres in Spurenmengen erfasst werden kann. Das Verfahren eignet sich besonders zur Erfassung und Ermittlung sehr kleiner Mengen, beispielsweise im Femtomolbereich, von Aminosäuren, Peptiden, anderen Verbindungen mit Aminfunktionen oder aminierten Kohlehydraten einschließlich von komplexen Kohlehydraten.
Ein Verfahren zur Erfassung und Ermittlung kleiner Menge von Aminosäuren unter Verwendung der heterocyclischen aromatischen Carbamatverbindungen ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Bei diesem Verfahren werden die interessierenden Aminosäuren mit der heterocyclischen aromatischen Carbamatverbindung durch Umsetzen derselben mit der primären oder sekundären Amingruppe der Verbindung zur Bildung des fluoreszierenden Derivats derivatisiert. Die Derivatisierung dieser Amine führt zu einem einzigen Produkt für jede Aminosäure ohne die Bildung störender Nebenprodukte. Dies vereinfacht eine quantitative Bestimmung der vorhandenen Komponenten.
Peptide/Proteine können ebenfalls unter Verwendung der vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamatverbindungen derivatisiert und ermittelt werden. Ein Verfahren zur Erfassung von Peptiden unter Verwendung einer Derivatisierung mit den vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamaten ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Bei einer typischen Anwendung des Verfahrens wird ein Protein enzymatisch oder chemisch zur Bildung von Peptiden verdaut. Die Peptide werden dann mit den Carbamatverbindungen derivatisiert und analysiert, wobei eine Peptidkarte erhalten wird, wodurch ein Profil des Proteins geliefert wird.
Die heterocyclischen aromatischen Carbamatverbindungen der vorliegenden Erfindung sind problemlos zu synthetisieren und sie weisen eine höhere Fluoreszenzquantenausbeute als viele aminreaktive Derivatisierungsmittel auf. Daher wird im Vergleich zu vielen üblichen Verfahren eine größere Empfindlichkeit zur Erfassung winziger Mengen von Aminverbindungen erreicht. Das Derivatisierungsverfahren ist schnell und effizient und es umfasst keinen Umgang mit toxischen oder gefährlichen Nebenprodukten. Das Verfahren erlaubt die Erfassung und Ermittlung von Femtomolmengen von Aminen. Einige der vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamatverbindungen bieten insofern einen zusätzlichen Vorteil, als das Emissionsmaximum des markierten oder derivatisierten Amins bei einer deutlich unterschiedlichen Wellenlänge gegenüber dem Emissionsmaximum des freien heterocyclischen Amins, das zur Bildung des aktivierten Carbamats verwendet wird und ein normales Hydrolyseprodukt der Derivatisierungsreaktion ist, liegt. Daher können die Derivatisie- rungsprodukte vom Ausgangsmaterial und den Nebenprodukten unterschieden werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1A zeigt ein Chromatogramm von Aminosäurederivaten unter Verwendung von 6-Aminochinolyl-N- hydroxysuccinimidylcarbamat als Markierungsmittel (Erfassung der Fluoreszenz, Anregung 254 nm, Emission 395 nm). Die Trennung wurde auf einer NovaPakTM Phenyl-Säule (Waters, Abteilung von Millipore) durchgeführt. Fig. 18 zeigt eine wie in Fig. 1A durchgeführte Trennung (Erfassung mittels UV bei 254 nm), wobei jedoch eine NovaPakTM C18- Säule (Waters, Abteilung von Millipore) verwendet wurde.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer HPLC-Trennung von Aminosäurederivaten unter Verwendung von 3-Aminochinolin.
Fig. 3 zeigt ein Chromatogramm einer kapillarelektrophoretischen Trennung von Aminosäurederivaten. 10-fach verdünntes Hydrolysat (250 umol/l).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft heterocyclische aromatische Carbamatreagenzien, die zur Bildung chemischer Derivate geeignet sind, die bei der Analyse und Reinigung von Aminen verwendet werden können, und die Synthese dieser Reagenzien aus heterocyclischen aromatischen Aminen. Sie werden in hoher Reinheit (d. h. ohne fluoreszierende Verunreinigungen) über eine schnelle, sichere und eine hohe Ausbeute liefernde chemische Reaktion hergestellt. Die vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamate besitzen die folgende allgemeine Formel:
worin Ar für eine Chinolylgruppe steht, die mit einer elektronenliefernden Gruppe, wie Alkyl (beispielsweise C&sub1;-C&sub6;- Alkyl, wie Methyl oder Ethyl), Alkoxy (beispielsweise C&sub1;-C&sub6;- Alkoxy, wie Methoxy oder Ethoxy) oder Phenyl, substituiert sein kann. Die zur Bildung der vorliegenden aktivierten Carbamatverbindungen geeigneten heterocyclischen aromati- schen Amine umfassen beispielsweise Aminochinolin, substituiertes Aminochinolin, Aminoisochinolin, Aminocumann, substituiertes Aminocumann, Aminoacridin oder eine substituiertes Aminoacridin. Außerdem können Verbindungen mit mehr als einem Heteroatom an der Bildung der Carbamatverbindung teilnehmen.
Die vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamate werden durch Umsetzen des heterocyclischen aromatischen Amins mit Di-(N-succinimidyl)carbonat hergestellt. Die Reaktion ist in der im folgenden angegebenen Gleichung (1) schematisch angegeben, wobei ArNH&sub2; das heterocyclische aromatische Amin bedeutet:
Die Reaktion wird allgemein in einem polaren aprotischen Lösemittel, wie Acetonitril, DMF, DMSO, THF, Aceton, Methylenchlorid, Chloroform oder Dioxan, durchgeführt. Die Lösung des Amins in dem Lösemittel wird zu einer gerührten Lösung des Carbonats über einen Zeitraum von vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 4,0 h gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch eine Zeit lang (beispielsweise etwa 1 bis 24 h) zur Sicherstellung einer vollständigen Umsetzung gerührt. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur, jedoch können bei einigen Reaktionen verbesserte Ausbeuten erhalten werden, wenn das Reaktionsgemisch während der und/oder anschließend an die Zugabe des Amins unter Rückflusskühlung erhitzt wird.
Erfindungsgemäße neue heterocyclische aromatische Carbamate umfassen die folgenden Verbindungen:
6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
3-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
5-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
5-Aminisoochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
6-Amino-4-methylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
6-Amino-2,4-dimethylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
6-Amino-2-phenylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
6-Amino-2-methoxy-4-methylchinolyl-N- hydroxysuccinimidylcarbamat, und
4-Aminochinaldin-N-hydroxysuccinimidylcarbamat.
In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wurde 6-Aminochinolin mit Di-(N-succinimidyl)carbonat zur Bildung des entsprechenden Carbamats, 6-Aminochinolyl-Nhydroxysuccinimidylcarbamat, umgesetzt. Die Reaktion ist schematisch in Gleichung (2) angegeben.
Die Synthese dieser Verbindung wurde durch Umsetzen des Amins mit dem Carbonat in Acetonitril durchgeführt. Eine Lösung des Amins wurde zu einer gerührten Lösung des Carbonats gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch eine Zeit lang zur Sicherstellung einer vollständigen Umsetzung gerührt.
In einer weiteren Ausführungsform werden die vorliegenden Carbamate aus heterocyclischen aromatischen Aminen über die Bildung der Isocyanat-Zwischenverbindung synthetisiert. Diese Reaktion erfordert die Verwendung von Phosgen, das ein gefährliches und toxisches Material ist. Auf diesem Weg gebildete Carbamate können ebenfalls fluoreszierende Verunreinigungen enthalten.
Die vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamatreagenzien können zur Derivatisierung von Aminen in komplexen Gemischen verwendet werden, was deren Erfassung in Subpikomolmengen erlaubt. Die Bildung der Aminderivate ist einfach und das Derivat ist über einen so ausreichend langen Zeitraum stabil, dass der Analysator die Konzentration der Amine in einer Anzahl von Proben ermitteln kann.
Bei diesem Verfahren werden die vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamatreagenzien zur Markierung von Aminen mit einer fluoreszierenden Einheit verwendet. Die zur Bildung des Derivats verwendete Grundreaktion ist in Gleichung 3 angegeben. Das Carbamat reagiert rasch mit dem Amin unter Bildung des Derivats.
In dieser Gleichung bedeutet R'NH&sub2; die interessierende Aminverbindung.
Die vorliegenden Verbindungen besitzen eine heterocyclische aromatische Gruppe, die eine höhere Fluoreszenzquantenausbeute als die von als Markierungen bei anderen Derivatisierungsreaktionen verwendeten carbocyclischen Aromaten aufweist. Nimura et al., Anal. Chem, 58: 2372 (1986). Diese Zunahme der Fluoreszenzquantenausbeute der Markierung ergibt eine Zunahme der Empfindlichkeit des markierten Amins. Das vorliegende Verfahren bietet ein Verfahren zur Erzeugung dieser heterocyclischen aromatischen Carbamate, die bisher nicht verfügbar waren.
Bei einigen der vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamate liegt das Emissionsmaximum einer mit dem Carbamat derivatisierten Aminverbindung bei einer deutlich unterschiedlichen Wellenlänge gegenüber dem Emissionsmaximum des freien heterocyclischen Amins, das zur Bildung des Carbamats verwendet wird. Beispielsweise weist das freie 6- Aminochinolin ein Emissionsmaximum bei 550 nm auf; jedoch liegt, wenn die fluoreszierende Einheit an ein Protein gebunden ist, das Emissionsmaximum bei 375 nm. Bryness, Bevilaqua und Green, Anal. Biochem., 116: 408 (1981).
Aus dieser Wellenlängenverschiebung ergeben sich sehr bedeutsame Folgerungen hinsichtlich der Fluoreszenzerfassung von markierten Aminen. Zur Erfassung der markierten Amine unter Verwendung des beispielsweise 6-Aminochinolinderivats wird der Emissionsmonochromator beispielsweise auf 395 nm, wo die 6-Aminochinolin-derivatisierten Amine fluoreszieren, eingestellt. Bei dieser Wellenlänge ist die Fluoreszenz aus dem freien 6-Aminochinolin vernachlässigbar. Da die beobachtete Fluoreszenz vorwiegend vom Derivat kommt, wird das Hintergrundrauschen eliminiert oder vermindert und es wird ein empfindlicherer Test erhalten.
Im Gegensatz dazu sind bei den meisten Markierungsderivatisierungsmitteln die Emissionseigenschaften des markierten Amins, eines nicht-umgesetzten Derivatisierungsmittels und der Hydrolyseprodukte des Derivatisierungsmittels sehr ähnlich. Dies kann ein sehr bedeutendes analytisches Problem schaffen, da es notwendig ist, sicherzustellen, dass ein nicht-umgesetztes Derivatisierungsmittel und/oder das Produkt bzw. die Produkte der Hydrolyse des Derivatisierungsmittels, die fluoreszieren können, die Erfassung der markierten Amine nicht stören. Beim vorliegenden Verfahren zur Derivatisierung von Aminen wird ein nicht-umgesetztes Carbamatreagens unter den Bedingungen der Derivatbildungsreaktion zum freien Amin hydrolysiert. Daher stört, wenn beispielsweise 6-Aminochinolin zur Bildung des heterocyclischen aromatischen Carbamats verwendet wird, dessen Vorhandensein den Test von markierten Aminen nicht.
Die Analyse von Aminen nach diesem Verfahren bietet eine signifikante Verbesserung hinsichtlich der minimal erfassbaren Grenze von Aminen. Bei typischen Experimenten unter Verwendung der vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamate wird die minimal erfassbare Grenze für Amine um mindestens eine Größenordnung verbessert. Daher kann eine Grenze von 100 Femtomol (fmol = 10&supmin;¹&sup5; mol) vieler Amine unter Verwendung eines aus 6-Aminochinolin oder anderen heterocyclischen aromatischen Aminen gebildeten Carbamats erfasst werden. Wenn das Carbamatreagens aus einem nichtheterocyclischen Amin, d. h. Naphthylamin, gebildet wird, beträgt die Erfassungsgrenze 0,15- 0,3 ng (1-2 pmol; pmol = 10&supmin;¹² mol). Nimura et al., ibid. Daher liefert die Verwendung einer heterocyclischen aromatischen Einheit als Markierung mindestens eine weitere Größenordnung der Empfindlichkeit. Daher ist zur Analyse eine um eine Größenordnung kleinere Probe erforderlich.
Unter Verwendung der vorliegenden Carbamatreagenzien gebildete derivatisierte Amine werden innerhalb von Minuten gebildet und sie sind über einen Zeitraum von mindestens 14 Tagen in Lösung stabil. Die Reagenzien erlauben die Erfassung von Aminen in komplexen Proben und deren Ermittlung im 100-Femtomol-Bereich.
Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren eignen sich besonders zur Derivatisierung und Erfassung von Aminosäuren. Die zur Bildung des Derivats verwendete Grundreaktion ist in Gleichung (4) angegeben. In dieser Gleichung ist Ar die heterocyclische Einheit und R' steht für die Seitenkette der Aminosäure.
Die im folgenden angegebenen heterocyclischen aromatischen Carbamatreagenzien sind für diesen Zweck bevorzugt:
6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
3-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
5-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
5-Aminoisochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamate
6-Amino-4-methylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
6-Amino-2,4-dimethylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
6-Amino-2-phenylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,
6-Amino-2-methoxy-4-methylchinolyl-N- hydroxysuccinimidylcarbamat, und
4-Aminochinaldin-N-hydroxysuccinimidylcarbamat.
Das allgemeine Vorgehen bei der Analyse von Aminosäuren besteht aus drei in enger Beziehung zueinander stehenden Prozessen: (1) der Bildung von Derivaten der Aminosäuren in der Probe; (2) der Trennung der Aminosäurederivate; und (3) der Erfassung der getrennten Derivate. Die erste Stufe wird im allgemeinen durch Umsetzen eines die Aminosäuren enthaltenen Gemischs mit einem der vorliegenden Carbamatreagenzien unter Bildung einer unterschiedlichen Verbindung für jede Aminosäure durchgeführt. Diese Derivate liefern ein Fluoreszenzsignal, das dann in der Erfassungsstufe der Analyse erfasst werden kann. Die vorliegenden heterocyclischen Verbindungen eignen sich besonders zur Derivatisierung von Aminosäuren, da sie rasch mit den Aminosäuren reagieren und ein stabiles, stark fluoreszierendes Derivat bilden.
Die Trennstufe beruht auf den Unterschieden bezüglich der chemischen Struktur der Derivate. Die derivatisierten Aminosäuren unterscheiden sich voneinander auf die gleiche Weise, wie sich die chemischen Strukturen der Vorläuferaminosäuren unterscheiden. Die Derivate müssen so getrennt werden, dass das Detektorsignal korrekt auf die Konzentration jedes Derivats bezogen werden kann. Die derivatisierten Aminosäuren können durch Chromatographie, beispielsweise Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder Kapillarzonenelektrophorese (CZE), getrennt und erfasst werden. HPLC eignet sich für diesen Zweck besonders. Diese Verfahren sind für diesen Zweck gut geeignet, da sie selektiv sind und bei sehr kleinen Proben verwendet werden können. Es ist auch möglich, die Trennstufe durch Trennen der Aminosäuren vor deren Derivatisierung durchzuführen.
Die Erfassungsstufe wird im allgemeinen unter Verwendung entweder eines Extinktions- oder Fluoreszenzdetektors durchgeführt. Da jedes Derivat nach der Stufe (2) aus der Chromatographiesäule eluiert wird, wird dessen Vorhandensein und Menge durch die Extinktion oder Emission von Licht erfasst. Die Empfindlichkeit des Tests hängt von der Stärke des Signals von jeder Aminosäure ab. Die vorliegenden Carbamatverbindungen weisen eine hohe Quantenextinktion auf, wodurch die Erfassung von Femtomolmengen möglich wird.
Eine typische HPLC-Trennung der Derivate unter Verwendung von 6-Aminochinolin ist in Fig. 1 gezeigt. Die Trennung anderer repräsentativer Derivate unter Verwendung von 3- Aminochinolin ist in Fig. 2 gezeigt.
In einer weiteren Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden die heterocyclischen aromatischen Carbamatreagenzien zur Markierung von Peptiden mit einer fluoreszierenden Einheit verwendet. Die Grundreaktion entspricht der zur Bildung von Aminosäurederivaten verwendeten, die in der obigen Gleichung (4) angegeben ist. Das Carbamat reagiert rasch mit dem Peptid unter Bildung des Derivats. Wenn das Reagens mit einem Peptid reagiert, wird die heterocyclische aromatische Einheit ein Teil der Verbindung, wobei diese letztendlich, wie im vorhergehenden beschrieben, erfasst wird.
Die Analyse von Peptiden und/oder Proteinen nach diesem Verfahren liefert eine signifikante Verbesserung hinsichtlich der minimal erfassbaren Grenze von Peptiden. In typischen Experimenten wird die minimal erfassbare Grenze für Peptide um eine Größenordnung verbessert; daher kann eine Grenze von 100 fmol unter Verwendung eines aus den vorliegenden heterocyclischen aromatischen Aminen gebildeten Carbamatreagens erfasst werden.
Die vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamate eignen sich zur Peptid/Proteinkartierung. Peptidkartierung ist ein bei der Charakterisierung der Struktur eines Proteins verwendetes wirksames Verfahren. Bei diesem Verfahren wird ein Protein enzymatisch oder chemisch zur Bildung von Peptiden, die aus kürzeren Ketten der Aminosäuren bestehen, verdaut. Die Spaltprodukte enthalten die Aminosäuren in genau der gleichen Sequenz wie im ursprünglichen Protein. Der Vorteil der Spaltung des Proteins besteht darin, dass der Analysator kleinere Segmente erhält, die leichter zu untersuchen sind. Die unterschiedlichsten Enzyme und Reagenzien können zur Spaltung eines Proteins verwendet werden; jedes ergibt eine unterschiedliche Sammlung von Peptiden. Diese Verdauungsgemische werden dann analysiert, wobei eine "Peptidkarte" erhalten wird, die ein einzigartiges Profil des Proteins ist. Die Peptidkartierungsdaten werden mit Referenzchromatogrammen verglichen, um die Äquivalenz des interessierenden Proteins festzustellen oder zur Bestimmung der Struktur eines unbekannten Proteins beizutragen, beispielsweise Mutationsvarianten zu bestimmen.
Umkehrphasen-HPLC wird allgemein zur Analyse der Peptidverdauungsgemische verwendet. In einem gegebenen Peptidverdauungsgemisch können 20-150 unterschiedliche Peptide sein, von denen jedes getrennt und quantitativ erfasst werden muss. In vielen Fällen ist die zur Verfügung stehende Probe sehr klein. Beispielsweise kann der Analysator die Struktur eines Proteins, das aus einem Organismus isoliert wurde oder mittels DNA-Rekombinationstechnik synthetisiert wurde, bestimmen. Typischerweise werden Nanomolmengen eines Proteinverdauungsgemischs untersucht. Aufgrund der Knappheit und der Kosten vieler Proteine wird die Verwendung einer möglichst kleinen Probe erstrebt.
Eine Extinktionserfassung wird im allgemeinen bei Proteinkartierungsarbeiteri verwendet. Zwei unterschiedliche Erfassungsprozesse, die für diesen Zweck häufig verwendet werden, sind: a) die Erfassung bei 210-215 nm unter Verwendung eines Einzelwellenlängendetektors; und b) eine Breitbandspektralerfassung unter Verwendung eines Photodiodenarray- (PDA)-Detektors. Beim ersten Verfahren absorbieren alle Peptide bei dieser Wellenlänge, weshalb der Nutzer sichergeht, dass alle aus der Säule eluierten Peptide erfasst werden. Eine Schwierigkeit bei diesem Verfahren besteht darin, dass eine breite Vielzahl von Verbindungen in diesem Bereich des Spektrums absorbieren, und es muss äußerst stark darauf geachtet werden, sicherzugehen, dass alle Reagenzien, Elutionsmittel, Glasteile und dgl. peinlichst sauber sind, um sicherzustellen, dass das beobachtete Signal einzig von den Peptiden stammt. Bei dem zweiten Verfahren sammelt der PDA-Detektor die Spektren des Eluens in speziellen Zeitabständen (beispielsweise wird ein Spektrum zwischen 200 und 350 nm jede Sekunde aufgenommen). Dies liefert mehr Information als eine einzige Wellenlänge und es kann zur Unterscheidung zwischen Peptiden, die mit ähnlichen Retentionszeiten eluiert werden, beitragen.
Eine Peptidkartierung umfasst häufig die qualitative und quantitative Analyse von Spurenmengen von Peptiden in dem verdauten Protein. Die Identifizierung und quantitative Bestimmung von Peptiden in komplexen Gemischen bei dem vorliegenden Verfahren wird durch einen Dreistufenprozess bewirkt: a) die Markierung der interessierenden Peptide mit den heterocyclischen aromatischen Carbamaten, die ein gegenüber der ursprünglichen Verbindung stärkeres Extinktions- oder Fluoreszenzsignal aufweisen; b) das Trennen der derivatisierten Proben; und c) das Erfassen der derivatisierten Peptide durch Extinktions- oder Fluoreszenzverfahren. Die Trennungsbedingungen für ein Derivat unterscheiden sich häufig drastisch von der Trennung der Ausgangsverbindungen. In ähnlicher Weise hat die Effizienz einer Trennung einen starken Einfluss auf den Erfassungsprozess. Die Verwendung der vorliegenden heterocyclischen aromatischen Carbamate liefert ein Markierungsverfahren, das zur Verwendung mit Nanogrammmengen eines Proteins anpassbar ist. Ferner liefern die erfindungsgemäßen Verfahren ein Mittel zur Erhöhung der Empfindlichkeit bekannter Verfahren zur Erfassung von Peptiden in biologischen Proben, wie Gewebea Urin, Blut und Speichel.
Die Erfindung wird nun mittels der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiele

Beispiel 1: Synthese von 6-Aminochinolyl-N- hydroxysuccinimidylcarbamat

6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat wurde gemäß dem folgenden Verfahren synthetisiert. Acetonitril (500 ml, HPLC-analysenrein) wurde destilliert, um eventuell vorhandenes Wasser durch Azeotropbildung zu entfernen. Die ersten 50 ml des Acetonitrils-wurden verworfen. 6-Aminochinolin (1,5 g, 10 mmol, Aldrich Chemical Co.) wurde in 50 ml Acetonitril gelöst und in einen Zugabetrichter gegeben. Di(Nsuccinimidyl)carbonat (DSC; 3 g, 12 mmol, Fluka Chemical Co.) wurde in 100 ml Acetonitril gelöst und unter Rühren unter Rückflusskühlung erhitzt. Die Aminochinolinlösung wurde über einen Zeitraum von etwa 30 min tropfenweise zu der unter Rückfluss erhitzten Lösung gegeben.
Nach der Beendigung der Zugabe wurde die Lösung weitere 30 min unter Rückflusskühlung erhitzt und dann wurden etwa 30 ml des Acetonitrils aus dem Reaktionsgemisch abdestilliert. Die Lösung wurde abkühlen gelassen und mit Aminochinolyl-Nhydroxysuccinimidylcarbamat beimpft. Nach 24 h wurde die Lösung abdekantiert und die Kristalle wurden abfiltriert und mit 100 ml Acetonitril portionsweise gewaschen, wobei 1,95 g (66%) Rohprodukt erhalten wurden. Die Mutterlauge enthielt weiteres Produkt zusammen mit DSC, N-Hydroxysuccinimid und 1,3-Di(6-aminochinolyl)harnstoff. Das Produkt wurde durch Auflösen des Rohmaterials in heißem Acetonitril (100 ml/g Produkt), Filtrieren der Lösung über ein 0,5-um-Filter und Beimpfen des Filtrats mit 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat umkristallisiert. Es wurde eine Gesamtausbeute des Produkts von 24% (724 mg) erhalten.

Beispiel 2: Synthese von 3-Aminochinolyl-N- hydroxysuccinimidylcarbamat

3-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren synthetisiert, wobei jedoch 3-Aminochinolin anstelle von 6-Aminochinolin verwendet, die Aminlösung zu der Carbonatlösung während 3 h zugegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Nach der Beendigung der Zugabe des Amins wurden 20% des Acetonitrils durch Rotationsverdampfung entfernt. Die entstandene konzentrierte Lösung wurde dann kaltgestellt, um ein Ausfallen des festen Produkts zu bewirken.
Beispiel 3: Allgemeines Verfahren zur Derivatisierung von Aminen mit einem heterocyclischen aromatischen Carbamat Standardkalibrierungslösungen wurden nach dem folgenden Verfahren hergestellt: es wurden 5 ul einer Standardlösung des Amins (0,1 mmol/ul) hergestellt und mit 35 ul eines Boratpuffers (0,2 M Borat, 5 M EDTA) versetzt. Dieses Gemisch wurde mit 10 ul der Reagenslösung (3 mg Carbamatverbindung in 1 ml HPLC-Acetonitril) versetzt. Das entstandene Gemisch wurde 5 min lang auf 70ºC erhitzt.
Derivate wurden durch Zugabe von 10 ul von 10 M HCl zur Deproteinierung der Probe und Verwirbelung hergestellt. Dieses Gemisch wurde mit Boratpuffer (30 ul) und anschließend mit 10 ul der Carbamatreagenslösung versetzt. Das entstandene Gemisch wurde 5 min lang auf 70ºC erhitzt.
Die Reaktion ist sehr schnell und Derivatisierungsprodukte werden tatsächlich sofort gebildet. Die Lösung wird jedoch dann auf 50 bis 70ºC zur quantitativen Umwandlung von Tyrosin in ein einziges stabiles Derivat erhitzt. Bei Umgebungsbedingungen ergibt Tyrosin auch ein zweites Derivat, das sich langsam in die stabile Form umwandelt.

Beispiel 4

Die HPLC-Trennung von gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 hergestellten Aminosäurederivaten wurde unter Verwendung einer Umkehrphasensäule durchgeführt. Es wurde ein Gradientenelutionsverfahren unter Verwendung eines Puffersystems mit einem organischen Modifikationsmittel verwendet. Die folgenden Bedingungen wurden zur Trennung eines 17 Aminosäuren und Ammoniak enthaltenden Standardproteinhydrolysatgemischs unter Verwendung von 6-Aminochinolyl-Nhydroxysuccinimidylcarbamat als Markierungsmittel verwendet.
a) Säule: Eine mit NovaPakTM Phenyl (Waters, Abteilung von Millipore) gepackte Säule (15 cm · 3,9 mm-Säule) wurde für die Aminosäurehydrolysate verwendet. Waters HPLC System mit 2 M510-Pumpen, M712-Autosampler, M-440- Extinktionsdetektor, M470-Fluoreszenzdetektor, Säulentemperaturkontrollmodul und M860-Datensystem.
b) Mobile Phasen
Mobile Phase (A): 60 mM Natriumacetat (pH-Wert: 6,35).
Mobile Phase (B): 60% Acetonitril.
Gradient: 0-20% mobile Phase B unter Verwendung eines linearen Gradienten während eines Zeitraums von 30 min.
c)Temperatur: 35ºC
5 ul eines gemäß der Beschreibung in Beispiel 5 hergestellten Standards wurden zuerst injiziert. Danach wurden 10 ul der Probe injiziert. Die Fluoreszenzerfassung der aus dem aktivierten Carbamat gebildeten Aminosäurederivate wurde bei einer Anregung bei 245 nm und der Emission bei 395 nm durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1A angegeben.
Die gleiche Trennung wurde unter Verwendung einer Nova- PakC18-Säule (3,9 mm · 15 cm) durchgeführt. Die mobile Phase A bestand aus 140 mm Natriumacetat, 17 mm Triethylamin, pH-Wert 4,95. Die Erfassung wurde mit UV bei 254 nm durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Trennung sind in Fig. 1B gezeigt.

Beispiel 5

Kapillarelektophorese wurde ebenfalls zur Trennung und Erfassung von gemäß dem vorliegenden Verfahren hergestellten Aminosäurederivaten verwendet. Die kapillarelektrophoretische Trennung der Derivate wurde unter Verwendung der im folgenden angegebenen Bedingungen unter Verwendung eines Waters Quanta 4000-Kapillarelektrophoresesystems mit 254- nm-Erfassung durchgeführt.
Trennlösung: 0,05 M wässriger Natriumboratpuffer (pH-Wert: 9,5) mit Methanol (90 : 10) und 0,05 M Natriumdodecylsulfat. Kapillarröhre: Länge: 60 cm, I. D.: 50 um, Quarzglas mit Polyimidüberzug. Spannung: 20 kV.
Die Extinktionserfassung erfolgte bei 254 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.

Äquivalente

Fachleute auf dem einschlägigen Gebiet können viele Äquivalente zu den hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung erkennen oder unter Verwendung lediglich routinemäßiger Versuche feststellen. Ein Beispiel für ein solches Äquivalent ist die Erfassung von derivatisierten Komponenten durch von Fluoreszenz verschiedene Mittel, einschließlich von Chemilumineszenz oder einer elektrochemischen Reaktion. Diese Äquivalente sollen von den im folgenden angegebenen Ansprüchen umfasst werden.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend eine heterocyclische, aktivierte Carbamatverbindung der Formel:

worin Ar für eine gegebenenfalls mit einer C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy- oder Phenylgruppe substituierte Chinolylgruppe steht.

2. Zusammensetzung, umfassend ein heterocyclisches, aromatisches Carbamat nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe:

a) 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,

b) 3-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,

c) 5-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,

d) 5-Aminoisochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,

e) 6-Amino-4-methylchinolyl-Nhydroxysuccinimidylcarbamat,

f) 6-Amino-2,4-dimethylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,

g) 6-Amino-2-phenylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat,

h) 6-Amino-2-methoxy-4-methylchinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat und

i) 4-Aminochinaldin-N-hydroxysuccinimidylcarbamat.

3. Verfahren zur Herstellung eines heterocyclischen, aromatischen Carbamats nach Anspruch 1 in folgenden Stufen:

a) Umsetzen eines heterocyclischen Amins ArNH&sub2;, worin Ar die in Anspruch 1 definierte Bedeutung besitzt, mit Di-(N-succinimidyl)carbonat, und

b) Halten der in (Stufe) (a) gebildeten Kombination unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung des heterocyclischen Carbamats zu bewirken.

4. Verfahren zum Derivatisieren von Verbindungen mit einer Aminfunktion in folgenden Stufen:

a. Kontaktieren der Verbindung mit einer Aminfunktion mit einem heterocyclischen, aktivierten Carbamat der Formel:

worin Ar die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, und

b. Halten der in (Stufe) (a) gebildeten Kombination unter Bedingungen, die ausreichen, um eine Reaktion zwischen der Carbamatverbindung und der Aminverbindung ablaufen zu lassen.

5. Verfahren zum Derivatisieren von Aminosäuren in folgenden Stufen:

a. Kontaktieren der Aminosäure mit einem heterocyclischen, aktivierten Carbamat der Formel:

worin Ar die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, und

b) Halten der in (Stufe) (a) gebildeten Kombination unter Bedingungen, die ausreichen, um eine Reaktion zwischen der Aminosäure und dem heterocyclischen Carbamat ablaufen zu lassen.

6. Verfahren zum Derivatisieren von Peptiden oder Proteinen in folgenden Stufen:

a. Kontaktieren des Peptids oder Proteins mit einem heterocyclischen, aromatischen Carbamat der Formel:

worin Ar die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, und

b) Halten der in (Stufe) (a) gebildeten Kombination unter Bedingungen, die ausreichen, um eine Reaktion zwischen dem Peptid oder Protein und dem heterocyclischen Carbamat ablaufen zu lassen.

7. Verfahren zum Nachweis von Verbindungen mit einer Aminfunktion in folgenden Stufen:

a. Markieren der Verbindungen mit einer Aminfunktion mit einem heterocyclischen, aromatischen Carbamat nach Anspruch 1, und

b. Nachweisen der Verbindung mit einer Aminfunktion mittels eines Fluoreszenznachweises.

8. Peptidkartierungsverfahren, umfassend die Markierung des Peptids mit einem fluoreszierenden, heterocyclischen, aromatischen Carbamat nach Anspruch 1.

9. Heterocyclische, aktivierte Carbamatverbindung der Formel:

10. Verwendung einer heterocyclischen, aktivierten Carbamatverbindung nach Anspruch 9 zum Nachweis und zur Analyse aminhaltiger Verbindungen.