CN109690297A - 使用分子量截留过滤和过滤器上去糖基化从复杂基质快速制备标记的葡基胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法。所述方法包括以下步骤：使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物；将所述变性的复杂基质混合物加载到MWCO过滤装置上；将糖苷酶酶溶液添加到所述MWCO过滤装置上而形成包含葡基胺的去糖基化的复杂基质混合物；收集从所述MWCO过滤装置释放的葡基胺；以及用快速标记试剂使葡基胺衍生化而形成适用于在各种液相色谱***和检测器中检测的多种标记的葡基胺。

Description

使用分子量截留过滤和过滤器上去糖基化从复杂基质快速制 备标记的葡基胺的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月1日提交的美国临时专利申请No.62/357,552的优先权，该申请以引用方式并入本文。
背景技术
用于分析复杂基质中存在的糖蛋白的方法包括以下步骤：去糖基化，之后用标记试剂衍生化而产生衍生化的葡基胺。在某些条件下，可在不从生物样品分离糖蛋白的情况下进行衍生化。在给定情况下，复杂基质中衍生化的葡基胺的分析可一直持续到包括高效液相色谱(“HPLC”)、超高效液相色谱(UHPLC)、质谱(“MS”)、超临界流体色谱、紫外(“UV”)、荧光(“FLR”)检测、基质辅助激光解吸/电离质谱(“MALDI-MS”)和/或毛细管电泳(“CE”)的分析和/或检测。
此外，最近已开发了允许葡基胺的快速衍生化而不会引起生物样品的降解或过度标记的方法。已描述了一种此类程序，其中样品在不预先纯化的情况下被去糖基化，并且用快速标记试剂RapiFluor-MS(“RFMS”)进行标记。参见作为WO 2016/069764公布的国际申请No.PCT/US2015/057848。然而，并非所有样品类型都适于该简约方法，因为它们可能含有能够干扰葡基胺衍生化反应的亲核分子。
在此类情况下，糖蛋白通常需要使用洗涤剂和其他试剂来有效增溶。必须在质谱检测之前去除这些洗涤剂和试剂，因为它们的存在可不利于该分析。此外，可能需要大量细胞，这阻止了中至高通量分析并且通常排除了重复样的制备，从而无法报告固有样品间变异性之间的差别以及不同生物样品之间的差异。Rahman,S.A,et al.,Filter-Aided N-Glycan Separation(FANGS):A Convenient Sample Preparation Method for MassSpectrometric N-Glycan Profiling,J.Proteome Res.2014,13,1167-1176(2014)at1167-68(Rahman,S.A等人，“过滤器辅助N-聚糖分离(FANGS)：一种用于质谱N-聚糖谱分析的方便样品制备方法”，《蛋白质组研究杂志》，2014年，第13卷，第1167-1176页中的第1167-1168页)。
因此，已开发了克服这些问题的方法，这些方法可包括使用甲基酯化的唾液酸、昂贵试剂(诸如siRNA)和/或分离的膜–这些都不是适合中至高通量分析的溶液。同上第68页。此外，这些方法的葡基胺分离和纯化步骤可较复杂，特别是对于质谱分析而言。同上此外，已设计了将糖蛋白固定到膜上的方法。然而，这些膜由疏水性聚合物(诸如PVDF、尼龙和硝化纤维)构造而成，并且在结合能力方面有限，因为此类膜依赖于基于吸附的保留。参见例如Baginski等人的US 8,198,063 B1。例如，在越来越高的质量负载下，疏水性膜将变饱和。另外，非分析物疏水性化合物将污浊疏水性膜，达到超过糖蛋白对膜的吸附的程度。
因此需要可建立对复杂基质中的葡基胺的中至高通量分析的方法。
发明内容
提供了用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法。本发明方法包括以下步骤：(a)使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物；(b)将变性的复杂基质混合物加载到分子量截留(“MWCO”)过滤装置上；(c)将糖苷酶酶溶液添加到MWCO过滤装置上，其中MWCO过滤装置上的糖蛋白被去糖基化，并且形成包含葡基胺的去糖基化的复杂基质混合物；(d)收集从MWCO过滤装置释放的葡基胺；以及(e)用快速标记试剂使葡基胺衍生化而形成多种标记的葡基胺。在一个实施方案中，该方法还可包括稀释变性的复杂基质混合物的步骤。在一个实施方案中，该方法还可包括离心变性的复杂基质混合物的步骤。此外，在一个实施方案中，该方法还可包括稀释去糖基化的复杂基质混合物的步骤。在一个实施方案中，加热和/或温育MWCO过滤装置。在一个实施方案中，MWCO过滤装置是96孔滤板。在一个实施方案中，葡基胺穿过MWCO过滤装置流动到滤液收集装置。在一个实施方案中，在液相色谱***中检测所述多种标记的葡基胺。
另外，本文提供了用于制备葡基胺的试剂盒，该试剂盒包括MWCO过滤装置、快速标记试剂、变性溶液和酶溶液。变性溶液使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物。将酶溶液与过滤装置上变性的复杂基质一起混合和温育而得到葡基胺。用MWCO过滤装置对去糖基化的复杂基质混合物进行过滤而得到葡基胺。用快速标记试剂使葡基胺衍生化。能够在液相色谱***、毛细管电泳和/或MALDI-MS***中检测标记的葡基胺。本文还提供了具有MWCO过滤装置、荧光检测装置和质谱检测装置的液相色谱***。在液相色谱***中，MWCO过滤装置被构造为产生葡基胺，这些葡基胺被收集用于衍生化以及后续在荧光检测装置中的荧光检测和在质谱检测装置中的质谱检测。
附图说明
图1是使用过滤器上去糖基化从复杂基质制备标记的葡基胺的方法步骤的示意图。
图2A和图2B示出了如亲水作用色谱和荧光检测所分析的标记的葡基胺样品的比较。图2A示出了在存在过滤器上去糖基化的情况下执行样品制备而得出的清晰、可判读的聚糖信号。图2B示出了在不存在过滤器上去糖基化的情况下执行样品制备而得出的受影响的聚糖信号。
具体实施方式
本文描述了用于从复杂基质制备标记的葡基胺的新型方法，一般称为“过滤器上去糖基化”。葡基胺或N-糖苷是由具有β-N-糖苷键的胺组成的一类化合物，该β-N-糖苷键键合至碳水化合物而形成环状半胺醛醚键(α-氨基醚)。葡基胺具有连接到氨基的糖基。葡基胺可包括但不限于核苷(诸如腺苷)以及具有胺基的糖苷，诸如N,N-二甲基-β-d-吡喃葡萄糖胺、葡基胺、葡糖基-正丁胺、葡糖基-正己胺、葡糖基-正辛胺、葡糖基-正癸胺、葡糖基-正十二胺、麦芽糖基-正十二胺。在存在一当量碳酸氢铵的情况下用氨水溶液处理后，D-葡萄糖、D-半乳糖、乳糖、纤维二糖和麦芽糖都会产生对应葡基胺，即1-氨基-1-脱氧-D-葡萄糖、1-氨基-1-脱氧-D-半乳糖、1-氨基-1-脱氧乳糖、1-氨基-1-脱氧纤维二糖和1-氨基-1-脱氧麦芽糖。
我们已发现，并非所有复杂基质(本文也称为“糖蛋白样品”或“样品”)都适于此前所述的制备技术。参见例如Lauber,M.A.et al,Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that FacilitatesSensitive Fluorescence and ESI-MS Detection.Anal Chem,87(10),5401-9(2015)(Lauber,M.A.等人，“使用促进灵敏荧光和ESI-MS检测的标记试剂快速制备释放的N-聚糖以供HILIC分析”，《分析化学》，第87卷，第10期，第5401-5409页，2015年)。复杂基质中含有某些糖蛋白分析物，除了别的以外，这些复杂基质还可包含能够干扰葡基胺衍生化反应的亲核分子。
因此，本文提供了用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法。在本发明方法中，糖蛋白样品在分子量截留(“MWCO”)过滤装置上被去糖基化，以最大程度减少样品处理步骤的数量和样品制备时间。在去糖基化反应之后，使葡基胺滤过MWCO过滤器，并且用试剂使所得的葡基胺滤液衍生化。然后使用高效液相色谱(“HPLC”)、超高效液相色谱(UHPLC)、质谱(“MS”)、超临界流体色谱、紫外(“UV”)、基质辅助激光解吸/电离质谱(“MALDI-MS”)、毛细管电泳(“CE”)和/或荧光(“FLR”)检测对衍生化的葡基胺进行分析。
术语“糖蛋白”是用糖修饰的多肽。
术语“复杂基质”或复数形式的复杂基质意指且包括但不限于血浆、细胞裂解物、生物流体和/或组织提取物。
糖基化是分泌性蛋白和膜蛋白的翻译后修饰。不同单糖彼此连接而形成低聚糖，并且一个或多个所得聚糖链可连接到多肽主链而形成糖蛋白。从而，某些葡基胺(诸如聚糖)是蛋白功能的重要调节因子，但具有其自身在细胞/组织结构和信号传导方面的功能。Rahman,S.A,et al.,Filter-Aided N-Glycan Separation(FANGS):A Convenient SamplePreparation Method for Mass Spectrometric N-Glycan Profiling,J.ProteomeRes.13,1167-1176(2014)at 1167(Rahman,S.A等人，“过滤器辅助N-聚糖分离(FANGS)：一种用于质谱N-聚糖谱分析的方便样品制备方法”，《蛋白质组研究杂志》，2014年，第13卷，第1167-1176页中的第1167页)。
图1中示出了从复杂基质中所含的糖蛋白制备标记的葡基胺的本发明方法的示例性制备工作流程。在本发明方法中，从糖蛋白制备标记的(或“加标签的”)葡基胺，首先在复杂基质中使糖蛋白变性。在变性步骤中，将含有糖蛋白的复杂基质与包含缓冲液、任选的还原剂(也称为“氧化还原试剂”)以及表面活性剂和/或其他增强蛋白的酶消化的试剂的溶液混合，并且随后加热而形成变性的复杂基质。然后可稀释变性的复杂基质(含有变性的糖蛋白)。在变性步骤中，可将约1至约100mM之间的特定量的硫醇还原剂添加到复杂基质，这有利于使聚糖易被接近而发生去糖基化。无法在不采用过滤器辅助方法的情况下结合硫醇还原剂的添加，因为硫醇具有足够亲核性，而会竞争葡基胺衍生化试剂。在采用过滤器辅助方法时，复杂基质中变性的糖蛋白经历与衍生化相容缓冲液的缓冲液更换，因此被浓缩。因此虽然稀释是任选的，但也是优选的。
在一个实施方案中，为了使复杂基质中的糖蛋白变性，将包含50mM HEPES、20mM二硫苏糖醇(“DDT”)和1％RapiGest SF的pH为7.9的溶液与含有0.5mg/ml蛋白的裂解物(复杂基质)混合，从而形成复杂基质混合物。RapiGest SF是用于增强蛋白的凝胶内和溶液内酶消化并且增溶蛋白、使蛋白更易发生酶促裂解而不抑制酶活性的表面活性剂/试剂。然后将复杂基质混合物在90℃下加热三分钟，从而生成变性的复杂基质混合物，随后用270μL的水稀释而形成经稀释的变性的复杂基质混合物。
在过滤器上去糖基化步骤中，接着将变性的复杂基质混合物加载到分子量截留(“MWCO”)过滤装置上。在一个实施方案中，将变性的复杂基质混合物过滤并离心，用水稀释并且再次离心。更具体地讲，在一个实施方案中，将变性的复杂基质混合物离心约六分钟，但可离心约1分钟与约20分钟之间。
在变性的复杂基质混合物的稀释和离心后，接着将糖苷酶(诸如PNGase F)添加到MWCO过滤装置，从而形成去糖基化的复杂基质混合物。糖苷酶酶溶液可包含非亲核缓冲化合物，示例包括但不限于磷酸盐或HEPES缓冲溶液。另外，可在酶法去糖基化溶液中使用pKa在约7至约9之间且非亲核的其他缓冲性两性离子化合物(如HEPES)，包括但不限于ADA(N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、BICINE(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、DIPSO(3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸)、EPPS(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPBS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(4-丁磺酸))、MOBS(4-(N-吗啉)丁磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)、MOPSO(3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、POPSO(哌嗪-N,N'-二(2-羟基丙磺酸))。呈电中性或带正电而非带负电的缓冲化合物的电离状态可进一步减少色谱背景。因此，可使用阳离子非亲核缓冲化合物，诸如叔胺：TEA(三乙基氨)、BIS-TRIS(2,2-双(羟甲基)-2,2',2"-次氮基三乙醇)、BIS-TRIS丙烷(1,3-双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷)。
糖蛋白的基本酶法去糖基化利用糖苷酶，包括但不限于N-糖苷酶A(PNGase A)、N-糖苷酶F(PNGase F)、O-糖苷酶、神经氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。例如，如本文详述，可用肽N-糖苷酶F(PNGase F)这种酶使糖蛋白样品去糖基化，该酶从糖蛋白去除N连接的低聚糖，但还原末端上含有α(1-3)连接的岩藻糖的化合物除外。但是N-糖苷酶A(PNGase A)可去除所有N-聚糖。其他可用的酶包括内切糖苷酶或糖酰胺酶，诸如内切糖苷酶和N-聚糖酶。在酶法去糖基化后，以葡基胺的形式从天冬酰胺残基释放N-聚糖。
之后，可温育和/或加热MWCO过滤装置以便催化葡基胺的释放。可将MWCO装置在约30℃至约70℃之间加热约1分钟至约60分钟的时间段。
可结合本发明方法使用的MWCO过滤装置可由范围从单一小柱到96孔板到毛细管格式的许多不同设计构造而成。在一个实施方案中，可使用96孔MWCO板，诸如由Pall LifeSciences AcroPrepTMAdvance 96滤板部件号8164或8034提供的96孔MWCO板。该滤板被设计为结合蛋白和核酸，并且可用于生物分子回收。同样可使用单一小柱装置，诸如MilliporeAmicon Ultra-0.5mL离心过滤器。
在实践中，MWCO过滤装置可通过众多机制(其中包括离心、真空和正压)驱使液流穿过其中。MWCO过滤装置的温育也可经由不同方式完成，包括烘箱中的对流加热以及向装置自身施加的直接加热。MWCO过滤装置可具有不同特性，并且由不同材料制成。通常滤膜被制造为具有将引起某些溶质尺寸被保留的孔隙特性。例如，10kDa MWCO滤膜被制造为使得显示出重10kDa的化合物被保留。大于10kDa的物质将被更有效地保留，而小于10kDa的物质将更易滤过该材料。在一个实施方案中，选择10kDa MWCO过滤装置，因为其将促进大多数蛋白保留，而又允许葡基胺穿过。来自真核生物的蛋白的平均分子量为大约60kDa，而N-葡基胺的分子量在1至6kDa的范围内。因此10kDa MWCO过滤装置适用于样品制备技术。然而，可以预见，可使用更低或更高的截留分子量，例如3kDa或30kDa MWCO过滤器。另外，MWCO过滤装置可由包括但不限于聚醚砜(“PES”)和再生纤维素的不同材料构造而成。
过滤器上去糖基化步骤还可在如Kim等人所述的装置上进行，其中色谱***用于驱使连续流穿过微孔中空纤维酶反应器。此处，由微孔中空纤维酶反应器保留糖蛋白和酶。Kim,J.Y.,et al.,Development of an Online Microbore Hollow Fiber EnzymeReactor Coupled with Nanofl ow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometryfor Global Proteomics,Analytical Chemistry,(85),5506-5513(2013)(Kim,J.Y.等人，“用于整体蛋白质组学的在线微孔中空纤维酶反应器联用纳流液相色谱串联质谱的开发”，《分析化学》，第85卷，第5506-5513页，2013年)。由于蛋白的去糖基化可在过滤器上去糖基化步骤中进行，因此释放的葡基胺穿过MWCO纤维过滤到下游容器，可在下游容器中进行标记。
值得注意的事实是，本文所述的MWCO过滤装置未面临在采用上文所讨论的疏水性膜时与膜上去糖基化有关的上述问题，因为过滤取决于尺寸排阻机制而非吸附。因此，将蛋白加载到MWCO过滤装置上的能力相对较高。另外，与疏水性膜不同，MWCO过滤装置不会被疏水性化合物污浊。
在完成去糖基化反应后，使葡基胺滤过MWCO过滤装置，并且在滤液收集步骤中保留蛋白对应物。从而，从样品去除葡基胺而产生去糖基化混合物。在滤液收集步骤中，可稀释并离心去糖基化复杂基质混合物。然后用快速标记试剂使含有葡基胺的滤液(或“含葡基胺的滤液”)衍生化，该快速标记试剂诸如为以引用方式并入的美国专利申请No.14/458,760(作为US2014/0350263公布)的[0008]-[0022]、[0054]-[182]和[0191]以及美国专利申请No.15/005,619(作为US2016-0139136公布)的第2页第20行至第4页第10行所述的那些。
可通过液体处理***(有时称为“液体处理机器人”或“液体处理工作站”)执行本发明方法。液体处理***可用于使实验室自动化。在液体处理***中，机器人将所选量的试剂、样品或其他液体分配到指定容器。在一个实施方案中，液体处理***从电动移液器或注射器分配指定体积的液体。其他更复杂的机器也可操纵分配器和容器的位置(通常为直角坐标型机器人)和/或集成附加实验室装置，诸如离心机、酶标仪、热封机、加热器/振荡器、条形码读取器、分光光度装置、储存装置和培养箱。更复杂的液体处理工作站可执行多个任务，诸如样品输送、样品混合、操纵和温育、以及将容器输送到其他工作站/从其他工作站输送容器。从而，液体处理***可像台式8通道DNA PCR处理机器人一样简单，或范围扩展到为工艺定制的自动化液体处理***。
标记反应的条件(包括温度、有机溶剂组成、有机溶剂浓度、缓冲液组成、pH、离子强度、试剂的摩尔过量和时间)被选择和控制为使得实现伯胺与羟基之间的所需反应选择性。继而，优化标记的聚糖的收率，并且最大程度减少所谓“过度标记的”聚糖(由>1个标签修饰的聚糖/葡基胺)的生成。任选的淬灭溶液可包含亲水性含胺化合物。也可使用乙二胺。该淬灭溶液不仅控制葡基胺被允许与标记试剂反应的时间，而且使反应的pH移动至升高的pH(>10)，这增强了标记的聚糖在高有机溶剂(即，>50％乙腈)中的溶解度，从而促进了基于亲水作用色谱(“HILIC”)的下游SPE程序。
在一个实施方案中，当采用以下条件时，可在具有最少过度标记水平的情况下实现衍生化的化合物的高标记收率：(1)温度处于环境温度至低于环境温度；(2)二甲基甲酰胺(DMF)用作有机溶剂；(3)DMF占反应混合物不超过20-30％；(4)采用pH 7.9与pH 8.2之间的磷酸钠溶液缓冲液，以及(5)保持磷酸盐浓度≤50mM。此处，预期过度标记小于约1摩尔％，更优选地为约0.0至约0.5摩尔％，以及约0.0至约0.2％。另外，缓冲液浓度可在约5mM至约1000mM之间，或在一些实施方案中为约5mM至约200mM、或约5mM至约100mM、或约5mM至50mM。在标记试剂相对于可修饰的胺的摩尔过量达到约10至约2000、或约30至约1000、或约40至约500、或约50至约300之间的范围内的量时，可实现标记的葡基胺的高收率。我们此前发现，20-30％DMF足以增强溶解度，而不会显著影响标记反应的收率和选择性。为此，由20-30％DMF构成的反应混合物是优选的。
然后使用液相色谱和/或其他检测方法和***分析衍生化的葡基胺，所述其他检测方法和***包括但不限于高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)、质谱(“MS”)、超临界流体色谱、紫外(“UV”)和/或荧光(“FLR”)检测，和/或采用分析仪器诸如毛细管电泳(“CE”)、具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(“HPAEC-PAD”)、具有荧光检测的亲水作用色谱-液相色谱(“HILIC-LC/FLR”)、反相液相色谱/质谱(“RPLC/MS”)以及基质辅助激光解吸/电离质谱。
与现有技术方法不同，在本发明方法中，从样品去除蛋白类胺和干扰性亲核物质。因此，预期需要更少标记试剂。另外，通过使用该样品制备，易于从复杂基质获得标记的葡基胺，这些标记的葡基胺在分析测试平台(诸如与荧光或质谱检测配对的亲水作用色谱)上呈现清晰、可判读的信号(图2)。
实施例I
通过使用过滤器上去糖基化对海拉细胞裂解物(Abcam ab170197)进行快速标记方法而得到标记的葡基胺。在由50mM HEPES(pH 7.9)、1％(w/v)RapiGest SF、20mM二硫苏糖醇(DTT)构成的30μL体积中混合海拉细胞裂解物，使之达到0.5mg/mL蛋白浓度。将该混合物在90℃下加热3分钟，然后用270μL水稀释而形成经稀释的变性的复杂基质混合物。之后将该经稀释、变性的复杂基质混合物转移到10kDa MWCO过滤装置(Pall Life SciencesAcroPrepTMAdvance 96滤板部件号8164)并且在4,000g下离心6分钟。接下来用300μL水稀释经过滤的浓缩液，并且再次在4,000g下离心6分钟。向收集的浓缩液和滤膜上分配20μLPNGase F溶液(50mM HEPES中的50毫IUB/mL PNGase F(New England BioLabs P0709)，1％(w/v)RapiGest SF pH 7.9)。接下来通过对流烘箱加热MWCO过滤装置，使得在15分钟内以50℃的平均温度温育去糖基化混合物。温育后，用20μL水稀释去糖基化混合物，并且经由4,000g下3min的离心来从MWCO过滤装置收集滤液。然后对含有释放的葡基胺的该滤液进行衍生化反应，其中将大约60μL含水滤液与16μL的27.2mg/mL RapiFluor-MS增溶无水二甲基甲酰胺(DMF)混合。5分钟后，通过用额外17μL的DMF和70μL的乙腈稀释，使所得标记的葡基胺作好分析的准备。
通过亲水作用色谱来分析上述制备物中的葡基胺以比较它们对普遍存在的释放聚糖分析测试的适合性。采用以下液相色谱(“LC”)条件：
梯度时间表
对于比较样品制备而言，还根据此前所述的实验程序在不存在过滤器上去糖基化的情况下制备海拉细胞裂解物。Lauber,M.A.et al,Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that FacilitatesSensitive Fluorescence and ESI-MS Detection.Anal Chem,87(10),5401-9(2015)(Lauber,M.A.等人，“使用促进灵敏荧光和ESI-MS检测的标记试剂快速制备释放的N-聚糖以供HILIC分析”，《分析化学》，第87卷，第10期，第5401-5409页，2015年)，不同的是存在去糖基化的15分钟温育时间段以考虑对流加热与直接加热，并且需要低四倍的RFMS浓度来保持最佳试剂过量(其考虑了过滤器制备涉及对去除了蛋白的样品的标记这一事实)并且DTT用于变性步骤。
图2中示出了与该比较例相对应的数据，其中可明显看出当遇到含有复杂基质的样品时，快速制备标记的葡基胺的过滤器上去糖基化方法有利于获得清晰、可判读的聚糖信号。

Claims (13)

1.一种用于从复杂基质制备标记的葡基胺的方法，包括以下步骤：
使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物；
将所述变性的复杂基质混合物加载到MWCO过滤装置上；
将糖苷酶酶溶液添加到所述MWCO过滤装置上，其中所述MWCO过滤装置上的所述糖蛋白被去糖基化，并且形成包含葡基胺的去糖基化的复杂基质混合物；
收集从所述MWCO过滤装置释放的葡基胺；以及
用快速标记试剂使葡基胺衍生化而形成多种标记的葡基胺。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MWCO过滤装置被加热。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述MWCO过滤装置被温育。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述变性的复杂基质混合物通过液体处理***加载到所述MWCO过滤装置上。
5.根据权利要求1所述的方法，还包括稀释所述变性的复杂基质混合物的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括离心所述变性的复杂基质混合物的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括稀释所述去糖基化的复杂基质混合物的步骤。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡基胺穿过所述MWCO过滤装置流动到滤液收集装置。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在液相色谱***中检测所述多种标记的葡基胺。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述MWCO过滤装置是96孔滤板。
11.一种用于制备标记的葡基胺的试剂盒，包括MWCO过滤装置、快速标记试剂、变性溶液和酶溶液，其中所述变性溶液使复杂基质中的糖蛋白变性而形成变性的复杂基质混合物，所述MWCO过滤装置被构造为过滤所述变性的复杂混合物，并且将所述酶溶液与所述过滤装置上所述变性的复杂基质混合物一起混合和温育而得到葡基胺，所述快速标记试剂使所述葡基胺衍生化，能够在液相色谱、毛细管电泳或质谱***中检测所述葡基胺。
12.一种包括MWCO过滤装置、荧光检测装置和质谱检测装置的液相色谱***，其中所述MWCO过滤装置被构造为产生葡基胺，所述葡基胺流过所述过滤装置并且被收集用于由快速标记试剂衍生化以及后续在所述荧光检测装置中的荧光检测和/或在所述质谱检测装置中的质谱检测。
13.一种包括MWCO过滤装置的液体处理***，其中所述MWCO过滤装置被构造为产生葡基胺，所述葡基胺流过所述过滤装置并且被收集用于由快速标记试剂衍生化以及后续在荧光检测装置中的荧光检测和/或在质谱检测装置中的质谱检测。
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