DE69231576T2

DE69231576T2 - Verwendung von Peptiden ZUR BEHANDLUNG VON KOMPLIKATIONEN UND PATHOLOGY BEI DIABETES

Info

Publication number: DE69231576T2
Application number: DE69231576T
Authority: DE
Inventors: Roger Hipkiss; Juergen Michaelis; Sianna Panagiotopoulos
Original assignee: Peptech Ltd; Kings College London
Current assignee: Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd; Kings College London
Priority date: 1991-09-09
Filing date: 1992-09-09
Publication date: 2001-06-13
Anticipated expiration: 2012-09-10
Also published as: JPH07500580A; EP0666753B9; US5561110A; EP0666753B1; CA2117199C; DE69231576D1; CA2117199A1; WO1993004690A1; EP0666753A4; EP0666753A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen bei der Herstellung von Medikamenten zur Verwendung bei der Behandlung der Komplikationen und Pathologie von Diabetes in einem Diabetespatienten.
Das Dipeptid Carnosin wurde vor etwa 90 Jahren (Gulewitsch and Amiradzibi, 1900) als ein hitzestabiler Extrakt aus Fleisch entdeckt, seit diesen frühen Ursprüngen haben sich beträchtliche Daten bezüglich der Verteilung und des Metabolismus des Dipeptids angehäuft. Carnosin (β-Alanyl-L-Histidin) und dessen verwandte Verbindungen wie etwa Anserin (β-Alanyl-1-methyl-L-Histidin) und Homocarnosin (γ- Aminobutyryl-L-Histidin) sind in millimolaren Konzentrationen in zahlreichen Säugergeweben, umfassend Skelettmuskel (2-20 mM) und Hirn (0,3-5 mM), vorhanden. Obwohl keine umfassende Hypothese zur Erklärung einer physiologischen Funktion dieser Gruppe von Dipeptiden existiert, haben deren antioxidative Eigenschaften, Fähigkeit DNA vor Strahlenschäden zu schützen, Fähigkeit zweiwertige Kationen zu komplexieren, und bemerkenswerte Pufferkapazität bei physiologischen pH-Werten zu dem Vorschlag geführt, daß deren primäre Funktion in vivo die Bereitstellung eines Schutzes für Proteine, Lipide und andere Makromoleküle ist.
Von Carnosin wurde behauptet, daß es zusätzlich zu seiner Rolle als Radikalfänger als ein "Immunregulator" (Nagai, Patent GB 2143732A) mit nützlichen Eigenschaften bei der Behandlung von verschiedenen Krebsarten wirkt (Nagai, Patent DE 34 24 781A1). Es wurde auch nahegelegt, daß Carnosin bei der Behandlung von Lipidperoxid-induzierten Katarakten nützlich sei (Babizhayev, 1989). Es gibt auch Hinweise, daß Carnosin den Wundheilungsprozeß beschleunigen kann. Derwent Publications Ltd., London, AN-89-153915 (& JP-1093526) offenbart die Verwendung von Homocarnosin zur Behandlung von Diabetes-induzierter Leukopenie.

Nicht-enzymatische Glycosilierung

Schädigung durch Radikale ist nicht der einzige Prozeß, welcher die Struktur von Proteinen und Nukleinsäuren beeinträchtigt. Nicht-enzymatische Glycosilierung (glycation), die Maillard-Reaktion in Lebensmittelchemie (Maillard, 1912) oder Bräunungsreaktion, beinhaltet eine Reaktion von Aminogruppen mit Zuckeraldehyd- oder -ketogruppen, wobei modifizierte Aminogruppen erzeugt werden und schließlich Endprodukte fortgeschrittener Glycosilierung (advanced-glycosilation-end-products, AGE-Produkte) gebildet werden. Obwohl die nicht-enzymatische Glycosilierung in vivo langsam abläuft, ist sie bei der Alterung und in pathologischen Zuständen, bei denen Zuckerwerte erhöht sind, z. B. in Diabetes, von fundamentaler Bedeutung.
Es ist möglich, die nicht-enzymatische Glycosilierung von Proteinen im Reagenzglas zu zeigen. Verschiedene Studien haben gezeigt, daß die meisten Proteine und DNA potentielle Ziele für nicht-enzymatische Glycosilierung sind, wobei Zucker über eine Schiffsche Base an Aminogruppen im Molekül gebunden werden. Anschließend findet eine Umlagerung statt, wobei das gefärbte Produkt (genannt das Amadori- Produkt) entsteht. Weitere langsame und uncharakterisierte Reaktionen des Amadori-Produkts treten auf.
Eine Analyse der bevorzugten Stellen für nicht-enzymatische Glycosilierung in Proteinen zeigt, daß die epsilon-Aminogruppen von Lysinresten Primärziele sind, insbesondere wenn sie in Nähe von Histidinresten vorliegen (Shilton & Walton, 1991). Bei einer Suche nach stabilen Peptiden mit langen in vivo-Halbwertszeiten haben wir herausgefunden, daß die Aminosäuresequenz von Carnosin ähnlich zu Lys-His ist, und somit das Potential aufweist, mit Zuckern zu reagieren und als Abfänger für Aldehydgruppen zu wirken. Zusätzlich ist Carnosin praktisch nicht toxisch, gut dokumentierte Toxizitätsstudien haben gezeigt, daß das Material in einer Menge von 5-10 g/kg Körpergewicht Säugern verabreicht werden kann, und daher sind bei einer Langzeitbehandlung keine toxischen Nebenwirkungen zu erwarten.
Bisher wurde nur von einer weiteren Verbindung gezeigt, daß sie durch eine Reaktion mit Zuckern und Blockierung der Amadori-Umlagerung die nichtenzymatische Glycosilierung verlangsamen kann. Aminoguanidin kann von Glucose abgeleitete Endprodukte fortgeschrittener nicht-enzymatischer Glycosilierung sowohl in vitro als auch in vivo vermindern. Unglücklicherweise ist Aminoguanidin eine nukleophile Hydrazinverbindung, nicht-physiologisch, und seine Langzeit-Toxizität ist unbekannt.

Diabetes

Diabetes ist eine Stoffwechselerkrankung, welche durch eine akute oder chronische Insulin-Defizienz verursacht wird. Er wird anhand eines erhöhten Blutglucosewerts diagnostiziert. Der akute Zustand ist durch eine reduzierte Glucoseaufnahme der Insulin-abhängigen Gewebe charakterisiert. Der Körper wirkt der resultierenden Energiedefizienz entgegen durch eine Erhöhung der Lipolyse und eine Verringerung der Glycogensynthese. Bei schwerem Diabetes werden Kalorien aus zwei Hauptquellen verloren; Glucose wird im Urin verloren und Körperprotein wird ebenfalls abgereichert. Der Grund dafür ist, daß eine Insulininsuffizienz die Gluconeogenese von aus Muskel stammenden Aminosäuren erhöht. Der Akutzustand kann durch Insulininjektionen gesteuert werden, aber da die Steuerung niemals perfekt sein kann, hängt das Langzeitschicksal eines Diabetespatienten von Komplikationen ab, welche später im Leben in Auge (Bildung von Katarakten und Retinopathie), Niere (Nephropathie), Neuronen (Neuropathie) und Blutgefäßen (Angiopathie und Atherosklerose) auftreten. Es ist gut manifestiert, daß koronare Herzkrankheiten eine der häufigsten Todesursachen gleichermaßen bei Diabetikern wie bei nicht-Diabetikern sind.
Üblicherweise werden bei Diabetespatienten Urinprotein-Analysen angefordert um das Vorliegen einer schweren Nierenerkrankung (Nephropathie) auszuschließen. Ein positives Urinprotein-Ergebnis kann vorübergehender Natur oder ein unbedeutender Laborbefund sein, oder es kann ein früher Hinweis einer Nierenverletzung sein. Die schwerste Proteinurie ist assoziiert mit dem nephrotischen Symptom, Hochdruck und progressivem Nierenversagen. Bei diesen Zuständen werden die Glomeruli zunehmend für Proteine durchlässig, durch Mechanismen die schlecht verstanden sind. Die Konsequenzen sind extrem schwerwiegend, da sie sich ziemlich rasch zu vollständigem Nierenversagen und schließlich dem Tod fortentwickeln können. Diese Form von Proteinurie tritt als eine Sekundärfolge bei Erkrankungen wie Diabetes, Amyloidose und Lupus erythematodes auf Wie bei anderen Diabetes-Komplikationen muß eine potentielle Rolle von nichtenzymatischer Glycosilierung bei der Entwicklung von Retinopathie in die Überlegungen eingeschlossen werden. Die Netzhautkapillaren enthalten Endothelzellen, welche den Kapillarhohlraum auskleiden und eine Permeabilitätsbarriere (Blut-Netzhaut) bilden, und Perizyten (wandständige Zellen), welche durch eine von den zwei Zelltypen produzierte Basalmembran eingeschlossen sind. Perizyten innerhalb der Organwand gehen im Frühstadium von Diabetes-Retinopathie selektiv verloren, wobei eine umgebende Basalmembran mit geistähnlichen Taschen verbleibt. Der Zusammenbruch der Blut-Netzhaut-Barriere ist ein weiterer Defekt. Aldosereduktase-Inhibitoren werden hinsichtlich einer Behandlung von experimenteller Retinopathie in Tieren untersucht. Deren Wirkmechanismus ist die Verhinderung einer Anhäufung von Sorbitol und von resultierenden osmotischen Änderungen. Die Verbindung mit nicht-enzymatischer Glycosilierung wird jedoch dadurch offensichtlich, daß Hammes et al. (1991) gezeigt haben, daß eine Behandlung mit Aminoguanidin die Ausbildung von experimenteller Diabetes-Retinopathie hemmt. Es ist sehr wahrscheinlich, daß andere potentielle Inhibitoren nicht-enzymatischer Glycosilierung wie Carnosin ebenfalls eine positive Wirkung aufweisen sollten.

Nicht-enzymatische Glykosilierung und Atherosklerose

Neuere Studien haben nahegelegt, daß AGE eine Rolle bei der Ausbildung von Atherosklerose spielen könnten. Dies beruht auf der Feststellung, daß humane Monozyten AGE-spezifische Rezeptoren auf ihren Oberflächen aufweisen und bei Stimulierung durch die Freisetzung von Cytokinen reagieren. Eine geringfügige Verletzung der Blutgefäßwand kann AGE, welche unterhalb des Endothels vorkommen, exponieren und die Infiltration von Monozyten fördern und die Ausbildung einer atherosklerotischen Läsion initiieren. Zirkulierende Lipoproteine können ebenfalls nicht-enzymatische Glycosilierung eingehen, und werden danach schneller durch Endothelzellen aufgenommen als nicht-glycosiliertes Lipoprotein. Dies ist von Bedeutung in Diabetes, bei dem eine erhöhte Serumkonzentration von nicht-glycosiliertem Lipoprotein berichtet wurde. Eine Verbindung mit anti- Glycosilierungseigenschaften wie Carnosin sollte daher eine positive Wirkung auf Gefäßkrankheiten haben.
Die Ursachen für die diabetischen Komplikationen sind nicht vollständig verstanden, da eine kontinuierliche Freisetzung von Insulin nach subkutaner Injektion inadäquat sein mag, um auf variierende Glucosekonzentrationen ausreichend zu reagieren, um periodische hyperglycämische Zustände zu vermeiden. Daher können bei Diabetikern Blutzuckerwerte im Mittel höher sein als in normalen Individuen, was zu einem erhöhten Niveau an nicht-enzymatischer Glykosilierung führt. Das beste Beispiel sind Glycohämoglobine, die nicht-enzymatisch in roten Blutzellen in Mengen gebildet werden, welche proportional zu den zellulären Glucosekonzentrationen sind. Der höhere Prozentsatz an nicht-enzymatisch glycosiliertem Hämoglobin und Serumalbumin wird zur Überwachung des Ausmaßes der Hyperglycämie eines Diabetikers verwendet.
Eine gesteuerte Nahrungsaufnahme von Verbindungen, die den Langzeitwirkungen von hohen Blutglucosekonzentrationen gegensteuern können, wäre günstig als eine Ergänzung zu einer gesteuerten Diabetestherapie wie etwa Insulinverabreichung, Sulfonylharnstoff- und Biguanidbehandlung, oder der Verwendung von Amylin- Blockern. Nur die offenkettige Form von reduzierenden Zuckern wie Glucose, Galactose, Fructose, Ribose und Desoxyribose gehen nicht-enzymatische Glycosilierung ein. Wir gehen davon aus, daß durch Abfangen dieser freien Aldehydgruppen und deren Bindung in einer nicht-toxischen Form möglich sein sollte, den durch hohe Zuckerkonzentrationen in vivo und in vitro verursachten Schaden zu verringern. Die Verbindungen, welche für die Behandlung der Komplikationen und Pathologie von Diabetes vorgeschlagen werden, könnten Peptide mit einer oder mehreren der nachfolgenden charakteristischen Eigenschaften sein:
1) Sie sollten sogar in relativ hohen Dosierungen nicht toxisch sein.
2) Sie sollten gegenüber Spaltung durch nicht-spezifische Proteasen im Darm beständig sein und intakt in das Blut und in Organe aufgenommen werden, aber sie sollten von den Nieren aus dem System entfernt werden, wobei sie einer ähnlichen Gewebeverteilung unterliegen wie Glucose in Diabetes.
3) Die Peptide sollten rasch, im Vergleich zu Aminogruppen auf Proteinoberflächen, mit reduzierenden Zuckern reagieren.
4) Die resultierenden nicht-enzymatisch glycosilierten Peptide sollten nicht mutagen sein, im Gegensatz zu nicht-enzymatisch glycosilierten Aminosäuren.
5) Nach Spaltung des Peptids durch spezifische Proteasen in Blut und Gewebe sollten die resultierenden Aminosäuren einen Nährwert für Diabetiker aufweisen, beispielsweise indem sie Gluconeogenese erleichtern und einer negativen Stickstoffbilanz entgegenwirken.

Zusammenfassung der Erfindung

Die jetzigen Erfinder gehen davon aus, daß Peptide mit einer Aktivität, welche der von Carnosin ähnlich ist, für die Behandlung der Komplikationen und Pathologie von Diabetes geeignet sein können.
Dementsprechend besteht die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt in der Verwendung einer Verbindung, welche (β-Ala-His)n, (Lys-His)n, eine Verbindung der Formel R&sub1;-X=R&sub2; ist, pharmazeutisch verträglichen Salze davon oder Kombinationen davon, wobei n gleich 1 bis 5 ist, R, eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren, optional alpha Aminoacyliert mit einer Alkyl- oder Aralkylgruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, R&sub2; eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren, optional alpha-Carboxyl verestert oder amidiert mit einer Alkyl- oder Aralkylgruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, und X gleich R&sub3;-L oder D-His (R&sub4;)-R&sub5; ist, wobei R&sub3; nichts oder -Aminoacyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, R&sub4; nichts oder eine Imidazolmodifikation mit Alkyl-Sulfhydryl-, Hydroxyl-, Halogen- und/oder Aminogruppen ist, und R&sub5; nichts oder Carboxyl(alkyl)amide mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Komplikationen und Pathologie von Diabetes in einem Diabetes-Patienten, mit Ausnahme von Leukopenie.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind R&sub1; und R&sub2; L- oder D-Lysin oder L- oder D-Asparaginsäure oder L- oder D-Glutaminsäure oder Homologa davon. In einer bevorzugten Form der Erfindung ist die Verbindung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Carnosin, Anserin, Ophidin, Homocarnosin, Homoanserin, D-Carnosin und Carcinin; derzeit ist am meisten bevorzugt, daß die Verbindung Carnosin ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung andere Verbindungen umfassen, welche eine günstige Wirkung bei der Behandlung der Komplikationen und Pathologie von Diabetes haben, wie etwa Aminoguanidin.
Weiterhin kann, da eine Reihe der zu behandelnden Patienten auch eine Insulin-, Sulfonylharnstoff-, Biguanid- oder Amylinblockertherapie durchführen kann, die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zusammen mit der Insulin-, Sulfonylharnstoff-, Biguanid- oder Amylinblockertherapie verabreicht werden. Weitere Information hinsichtlich Sulfonylharnstoff Säure Biguanid Therapie kann Beck-Nielsen, "Pharmacology of Diabetes", Hrsg. C. E. Mogensen und E. Standl, 1991, Seiten 75-92, entnommen werden.
Weitere Information bezüglich der Verwendung einer Amylinblockertherapie bei Diabetes kann Westermerk et al., 1987, DNAS 84, 3881-3885, entnommen werden.
Einer der Hauptnachteile bei einer Insulintherapie ist der fortwährende Bedarf für Injektionen. Die vorliegende Erfindung kann mit der oralen Verabreichung von Carnosin zusammen mit Biguaniden oder Sulfonylharnstoffen eine Alternative bereitstellen, die für Diabetiker attraktiver sein kann.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auf jede geeignete Weise verabreicht werden, wie etwa durch Injektion, Infusion, Nahrungsaufnahme, Inhalation, Iontophorese oder topische Anwendung. Derzeit ist jedoch bevorzugt, daß die Zusammensetzung oral verabreicht wird.
In nochmals einer weiteren Ausführungsform wird der Wirkstoff mit einem anderen Molekül gemischt oder daran gebunden, wobei das Molekül derart ist, daß die Zusammensetzung bezüglich Hautpenetration, Hautauftragung, Gewebeabsorption/adsorption, Hautsensibilisierung und/oder Hautreizung verbessert wird. Das Molekül wird bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumlaurylsulfat, Laurylammoniumoxid, Ozon, Decylmethylsulfoxid, Laurylethoxylat, Octenol, Dimethylsulfoxid, Propylenglykol, Nitroglycerin, Ethanol und Kombinationen davon.
Es ist ebenfalls möglich, daß die Verbindung in Form einer Arzneimittelvorstufe vorliegt. Weitere Information bezüglich Arzneimittelvorstufen-Technologie kann gefunden werden in "A Text Book of Drug Design and Development", herausgegeben von Povl Krogsgaard-Larsen und Hans Bundgaard, Kapitel 5 "Design and Application of Prodrugs", H. Bundgaard. Die Offenbarung dieser Literaturstelle wird mittels Querverweisung hierin aufgenommen.
Wie vorstehend angegeben, ist es bevorzugt, daß die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung oral verabreicht wird. Wie vom Fachmann verstanden werden wird, können zahlreiche Modifikationen an der Zusammensetzung vorgenommen werden um die Eignung der Zusammensetzung für orale Verabreichung zu verbessern. Weitere Information bezüglich oraler Verabreichung kann in "Peptide and Protein Drug Delivery", herausgegeben von Vincent H.L. Lee, Kapitel 16, "Oral Route of Peptide and Protein Drug Delivery", V.H.L. Lee et al., gefunden werden.
Wie vorstehend angegeben, kann die Zusammensetzung mittels Injektion verabreicht werden. Injizierbare Präparationen, beispielsweise sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspensionen, können nach Methoden formuliert werden, welche dem Fachmann gut bekannt sind, unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspendiermittel. Die sterile injizierbare Präparation kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht-toxischen parenteral verträglichen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, welche verwendet werden können, gehören Wasser, Ringer-Lösung, und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden herkömmlich sterile, fette Öle als ein Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Für diesen Zweck kann jedes milde, fette Öl verwendet werden, einschließlich synthetischer Mono- und Diglyceride. Zusätzlich finden Fettsäuren wie etwa Ölsäure Verwendung bei der Herstellung von Injektionspräparaten.
Die zu verabreichende tägliche Gesamtdosis der Zusammensetzung hängt von dem zu behandelnden Wirt und dem besonderen Verabreichungsmodus ab. Es wird verstanden werden, daß die spezifische Dosismenge für einen bestimmten Patienten, der einer Therapie unterzogen wird, von einer Reihe von Faktoren abhängt, umfassend die Aktivität der spezifischen verwendeten Verbindung, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Nahrung, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, und dem Schweregrad der besonderen Nebenwirkungen. Es wird davon ausgegangen, daß die Auswahl der erforderlichen Dosismenge im Fachwissen des Fachmanns liegt.
Es wird angenommen, daß die Dosierung für Carnosin im Bereich von 20 mg bis 2 g/kg Körpergewicht/Tag, und bevorzugt im Bereich von 100 mg bis 200 mg/kg Körpergewicht/Tag liegen würde.
Wie vorstehend angegeben, ist eine der mit Diabetes assoziierten Komplikationen Katarakte. Demgemäß ist ein besonders bevorzugter Verabreichungsmodus der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die ophthalmologische Verabreichung. In dieser Situation wird der pharmazeutisch verträgliche Träger sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen, Emulsionen und Salben sein. Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Vehikel für die ophthalmologische Verabreichung sind Propylenglykol und andere pharmazeutisch verträgliche Alkohole, Sesam- oder Erdnußöl und andere pharmazeutisch verträgliche Öle, Rohvaseline, wasserlösliche ophthalmologisch verträgliche nichttoxische Polymere wie etwa Methylcellulose, Carboxymethylcellulosesalze, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Acrylate wie etwa Polyacrylsäuresalze, Ethylacrylate, Polyacrylamide, Naturprodukte wie etwa Gelatine, Alginate, Pektine, Stärkederivate wie etwa Stärkeacetat, Hydroxyethylstärkeether, Hydroxypropylstärke, sowie andere synthetische Derivate wie etwa Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polyethylenoxid, Carbopol und Xanthanlösung, und Gemische dieser Polymere. Derartige Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe enthalten, wie etwa Puffer, Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Dispergiermittel. Geeignete Konservierungsmittel umfassen antibakterielle Substanzen wie etwa quaternäre Ammoniumverbindungen, Phenyl-Quecksilbersalze, Benzoylalkohol, Phenylethanol, und Antioxidantien wie etwa Natriummetabisulfid. Geeignete Puffer umfassen Borat-, Acetat-, Glyconat- und Phosphatpuffer. Die pharmazeutischen ophthalmologischen Zusammensetzungen können auch in Form eines festen Inserts vorliegen.
Damit die Natur der vorliegenden Erfindung genauer verstanden werden kann, werden nunmehr bevorzugte Formen davon unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele und Figuren beschrieben, worin:
Fig. 1 die Reaktionsrate von L-Carnosin mit Zuckern zeigt. L-Carnosin (60 mM) wurde mit Zuckern (180 mM) 5 Stunden bei 60ºC in 50 mM Na-Phosphatpuffer pH7 umgesetzt und der Verlust der freien Aminogruppen von Carnosin mittels HPLC untersucht. SEM < ± 1% des gesamten Carnosins im Inkubationsgemisch;
Fig. 2 die Wirkung von Carnosin auf Atherosklerose zeigt ( Cholesterin, Cholesterin plus Carnosin), und
Fig. 3 die Wirkung von Carnosin auf die Bildung von Katarakten in Diabetes-Ratten zeigt ( Cholesterin, Diabetes-Ratte, Diabetes-Ratte plus Carnosin).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Methoden:

Reaktion von Peptiden und Aminosäurederivaten mit Zuckern

Sofern nicht anders angegeben, wurden Reaktionen in Phosphat-gepufferter Salzlösung, PBS (140 mM NaCl /10 mM Natriumphosphat, pH 7,4) in verschlossenen Mikrozentrifugationsgefäßen in einem 60ºC Wasserbad durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Peptid und 500 mM Zucker. Zu spezifischen Zeitpunkten wurden Proben entnommen, 1 : 20 mit Wasser verdünnt, und vor Analyse mittels HPLC bei -20ºC aufbewahrt.

Bestimmung von Aminogruppen

Für die Bestimmung von freien Aminogruppen auf Peptiden wurde der Waters AUTO. OPATM verwendet (Waters AUTO. TAGTM Bedienungshandbuch). In kurzen Worten wurden Peptide mit o-Phthalaldehyd umgesetzt und das fluoreszierende Derivat mittels HPLC über eine Radical-PAKTM C&sub1;&sub8; Säule abgetrennt, unter Verwendung eines 10% (v/v) bis 90% (v/v) Methanolgradienten über 15 Minuten als Lösungsmittel. Es wurde ein Waters 470 Fluoreszenz-Detektor, eingestellt auf 340 nm Anregung/440 nm Emission, verwendet.

Gelfiltrationschromatographie von nicht-enzymatisch glykosilierten Proteinen

HPLC-Spezifikationen
SÄULE Superose 6, Pharmacia
PROBE: 100 u Proteinprobe (annähernd 100 ug)
ELUENT: 10 mM Phosphatpuffer pH7,38, 140 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,02% NaN&sub3;, 0,05% Tween 20
FLIESSRATE: 0,5 ml/min
BESTIMMUNG: 280 nm
Kalibrierung wurde durchgeführt unter Verwendung des Pharmacia-Kalibrierungskits für hohes Molekulargewicht (HMW) und niedriges Molekulargewicht (LMW).

Analyse des mutagenen Potentials von nicht-enzymatisch glykosilierten Verbindungen, "Ames Test"

Die Herstellung von nicht-enzymatisch glykosilierten Verbindungen wurde gemäß Kim et al. (1991) durchgeführt. In kurzen Worten wurden D-Glucose (1 M) und jede der nachfolgenden Verbindungen: L-Carnosin, L-Lysin, L-Alanin (jeweils 1 M) in destilliertem Wasser aufgelöst, der pH-Wert auf 7 eingestellt, und die Gemische 80 min bei 100ºC erhitzt. Die Lösungen (50 ul und 250 ul) wurden unter Verwendung der Plattenaufnahme-Methode (Maron & Ames, 1983) mit oder ohne metabolische Aktivierung mittels einer Standard-Rattenleber-Mikrosomenpräparation (S-9) gegen den Salmonella typhimuria -Stamm TA 100 bewertet. 2-AF und 2-AAF wurden als positive Kontrollen für die Experimente mit metabolischer Stimulation verwendet, ansonsten wurde Natriumazid als Stamm-spezifische positive Kontrolle aufgenommen.

Die Wirkung von Carnosin auf Atherosklerose

Männliche New Zealand White Cross Kaninchen, die mit Cholesterin-reicher Nahrung (2%) gefüttert worden waren, wurden nach dem Zufallsprinzip der Kontrolle oder einer 2% Carnosin-Behandlung ausgesetzt und das Plasma wurde auf Cholesterin und Triglyceride und Carnosin untersucht. Alle Tiere erhielten 100 g Nahrungsmittelpellets/Tag und freien Zugang zu Wasser.
Am Ende des achtwöchigen Behandlungszeitraums wurden die Kaninchen mit Pentobarbital (325 mg/kg) anästhesiert und die gesamte Aorta entfernt. Der Aortenbogen, der Brust- und der Bauchbereich wurden isoliert durch Schneiden der Aorta entlang des Umfangs 1,0 cm proximal zum ersten Paar von Zwischenrippenarterien und 0,3 cm oberhalb der Baucharterie. Die äußerste Gefäßhaut wurde vorsichtig wegseziert und die Arterie in Längsrichtung aufgeschnitten um die Gefäßinnenhautoberfläche freizulegen. Die Aorta wurde 48 Stunden in 10% gepuffertem Formalin fixiert. Die Lipidplaques in diesen Gefäßen wurden danach unter Verwendung von Sudan IV angefärbt und mit einem wässrigen Fixiermedium (Kaisers Glycerol Jelly) fixiert. Die geschädigten Bereiche wurden unter Verwendung eines Bildanalysators (Eye Com 850 Image Processor) direkt auf den fixierten Präparaten nachgewiesen. Computergestützte Flächenmessung wurde verwendet um den Prozentsatz des betroffenen Bereichs makroskopisch zu bestimmen. Repräsentative Abschnitte von atherosklerotischen Plaques wurden zur Bestätigung mittels Lichtmikroskopie entfernt. Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert ± SEM.

Bildung von Katarakten in Diabetes-Ratten

Männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g und einem Alter von 6 Wochen wurden nach dem Zufallsprinzip den nachfolgenden drei Behandlungsgruppen zugeordnet: Kontrolle, Diabetes-Ratten und Carnosinbehandelte Diabetes-Ratten. Diabetes wurde induziert mit Streptozotozen STZ (60 mg/kg Körpergewicht, in Citratpuffer, pH 4,5, iv.), und alle Tiere mit Plasmaglucosekonzentrationen > 20 mM nach einer Woche wurden in die Studie aufgenommen. Diabetes-Ratten erhielten nach dem Zufallsprinzip entweder keine Therapie oder 2% Carnosin im Trinkwasser.

Ergebnisse

Beispiel 1

Reaktion von Carnosin mit Zucker

Die Reaktionsrate zwischen Aldehyden und Aminogruppen bei der nichtenzymatischen Glykosilierung hängt ausschließlich von der Temperatur und der Reaktantenkonzentration ab, was somit die Verwendung nicht-physiologischer Bedingungen in in vitro Experimenten gestattet, wobei die Reaktion beschleunigt wird ohne das Gleichgewicht zu beeinflußen. Der erste Schritt in der Maillard-Reaktion, die Bildung einer Schiffschen Base zwischen Aldehyd und primärer Aminogruppe, variiert entsprechend der Menge der linearen Kettenform des Zuckers. Danach folgen eine Amadori-Umlagerung, und komplizierte Sekundärreaktionen, von denen die meisten kaum verstanden sind.
Die Inkubation von Glucose, Galactose und Dihydroxyaceton (DHA) mit Carnosin ergab braune Lösungen, welche für nicht-enzymatische Glykosilierung charakteristisch sind, wie ursprünglich von Maillard beschrieben (1912). Der Reaktion von Carnosin mit den Zuckern folgte das Verschwinden freier Aminogruppen, wie fluorimetrisch nach HPLC bestimmt. Glucose, Galactose und DHA unterschieden sich hinsichtlich ihrer Reaktion mit Carnosin (Fig. 1). Glucose war am wenigsten reaktiv und DHA am meisten, wobei ein mindestens 15-facher Unterschied auftrat. Aus Praktikabilitätsgründen entschieden wir uns zur Verwendung der Triose DHA in den meisten der nachfolgenden Studien.

Beispiel 2

Verhinderung einer Dihydroxyaceton-induzierten Modifikation von Rinderserumalbumin durch Carnosin

Physiologische Konzentrationen von Rinderserumalbumin (50 mg/ml in 50 mM Na- Phosphatpuffer, pH 7,0) wurden 4 Wochen bei 23ºC mit oder ohne 250 mM Dihydroxyaceton in der Gegenwart und Abwesenheit von 250 mM L-Carnosin inkubiert. Das Experiment wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt und die Ionenstärke war in allen Testgefäßen die gleiche. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
In diesem Langzeitexperiment hatte Dihydroxyaceton Albumin nicht-enzymatisch glykosiliert und infolge einer Amadori-Umlagerung danach die Bildung eines festen Gels induziert. Bei Gegenwart von Carnosin blieb der Inhalt des Gefäßes fluid.

Tabelle 1

Inkubationsbedingungen Resultierende Wirkungen

Albumin + Phosphatpuffer farblos, fluid
Albumin + Dihydroxyaceton braun, festes Gel
Albumin + Dihydroxyaceton dunkelbraun, fluid
Die Wirkungen von Carnosin auf Dihydroxyaceton-induzierte nicht-enzymatische Glykosilierung von Rinderserumalbumin.

Beispiel 3

Vergleich der Reaktionsrate von Carnosin und verschiedenen Aminosäuren mit Glucose

Langsame nicht-enzymatische Glykosilierung von Proteinen und Nucleinsäuren durch Glucose kann in vitro durch Erhöhung der Temperatur von physiologischen Werten auf 50ºC beschleunigt werden. Die Hauptziele von Glucose in vivo und in vitro sind die basischen Aminosäuren Lysin und Arginin (entweder frei oder nach deren Einbau in Proteine). Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der Reaktion von Carnosin und verschiedenen Aminosäuren mit Glucose. Um die Spezifität der Maillard- Reaktion für reduzierende Zucker zu zeigen, wurde Glucose durch Sorbitol (einen nicht-reduzierenden Zucker) ersetzt. 500 ul Glucose oder Sorbitol (250 mg/ml in 50 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,0) wurden 18 h bei 50ºC mit verschiedenen Aminosäuren oder Carnosin (500 mM) inkubiert. Die optischen Dichten der resultierenden Lösungen bei 400 nm wurden gemessen (Tabelle 2). Carnosin bildete bei weitem am meisten Maillard-Reaktionsprodukt, annähernd 2-fach oder 8-fach mehr als die am schnellsten reagierende Aminosäure, L-Lysin bzw. beta-Alanin. Bei der Reaktion von Carnosin mit Sorbitol ist auch eine geringe Menge Maillard- Reaktionsprodukt bemerkbar, vermutlich aufgrund von Autoxidation von Sorbitol zu einem reduzierenden Zucker.

Tabelle 2

Optische Dichte von Maillard-Reaktionsprodukten zwischen Dipeptiden oder Aminosäuren mit Glucose oder Sorbitol bei 400 nm

Inkubationsbedingungen OD 400 nm

Glucose + PBS 0,175
Glucose + Carnosin 8,455
Sorbitol + PBS 0,000
Sorbitol + Carnosin 0,209
Carnosin + PBS 0,041
Glucose + D,L-Alanin 0,266
Sorbitol + D,L-Alanin 0,008
Glucose + beta-Alanin 1,240
Sorbitol + beta-Alanin 0,010
Glucose + L-Arginin 0,469
Sorbitol + L-Arginin 0,010
Glucose + L-Lysin 4,170
Sorbitol + L-Lysin 0,009
Glucose + Imidazol 0,046
Sorbitol + Imidazol 0,035

Beispiel 4

Reaktion von Carnosin, verwandten Peptiden und Aminosäuren mit Dihydroxyaceton

Bei Vergleich der Reaktionsraten von Carnosin, verwandten Peptiden und Aminosäuren mit DHA (Tabelle 3) reagierte Carnosin schneller als Lysin, was nehelegte, daß das Dipeptid gegen andere Aminosäurequellen um nichtenzymatische Glykosilierung kompetieren könnte. In diesem Assay hatte Lysin jedoch zwei Aminogruppen, die zu dessen Reaktivität beitrugen, während in Proteinen üblicherweise nur die epsilon-Aminogruppe verfügbar ist. Um die Glykosilierungsrate von lediglich der epsilon-Aminogruppe zu vergleichen, wurde N- alpha-Carbobenzoxyl-Lysin (Z-Lysin) verwendet, welches eine blockierte alpha- Aminogruppe hat. Bei Zugabe von DHA zu einem äquimolaren Gemisch von Carnosin und Z-Lysin reagierte das Dipeptid etwa zehnfach schneller als die blockierte Aminosäure (Tabelle 3). Die relative Reaktivität blieb beibehalten, wenn Glucose als der nicht-enzymatisch glykosilierende Zucker verwendet wurde, obwohl das Experiment bis zur Vollendung zehn Tage benötigte (nicht gezeigt). Ac-Lys- NHMe, ein Molekül, das einem in ein Protein eingebauten Lysinrest stark ähnelt, zeigte ebenfalls eine langsamere Reaktion mit DHA, verglichen mit Carnosin. Das Peptid Ac-Lys-His-NH&sub2; ähnelt der bevorzugten nicht-enzymatischen Glykosilierungsstelle in Proteinen und zeigte die gleiche Reaktivität wie Carnosin. Das Peptid beta-Alanyl-Glycin war mit DHA praktisch nicht reaktiv, was die Erfordernis für Histidin an Position zwei in einem Peptid für schnelle nichtenzymatische Glykosilierung bestätigt (Shilton & Walton, 1991). Während D-Carnosin (beta-Alanyl-D-Histidin) genauso schnell wie das natürlich vorkommende Isomer reagierte, reagierte das höhere Homolog Homocarnosin (gamma-Aminobutyryl-L- Histidin) langsamer. Dies deutet darauf hin, daß eine geringfügige Strukturveränderung von Carnosin (die Hinzufügung einer Methylengruppe) dessen Reaktivität verringert. Es wird auch offensichtlich, daß eine Modifizierung von Lysin durch verschiedene Gruppen eine signifikante Wirkung auf die Reaktionsrate hat. Während Ac-Lys-NH&sub2;Me (blockierte Amino- und Carboxylgruppe) schneller reagierte, reagierte Z-Lysin langsamer als die freie Aminosäure.
Es wurde auch festgestellt, daß die Zugabe von freiem Imidazol und Succinyl-Histidin (alpha-Aminogruppe blockiert) die Reaktivität von Carnosin mit DHA förderte, wie durch eine Erhöhung der Verlustrate der Aminogruppe des Dipeptids gezeigt. Dies ist in Übereinstimmung mit den Verschlägen, daß Imidazol entweder die Amadori- Umlagerung katalysiert oder mit einer intermediären Form reagiert, wodurch das Reaktionsgleichgewicht in Richtung zu AGE-Produkten verschoben wird (Shilton & Walton, 1991). Tabelle 3
Nicht-enzymatische Glykosilierung von Peptiden und Amino-Analoga durch DHA
A und B: Verbindungen wurden 5 Stunden bei 60ºC in PBS mit DHA umgesetzt und der Verlust an freier Aminogruppe mittels HPLC untersucht. Daten sind ausgedrückt als Prozent von Aminogruppen, die mit DHA reagiert haben (SEM ± 1% von gesamtem Peptid oder gesamter Aminosäure im Inkubationsgemisch). Nur B: Succinyl-His und Imidazol wurden in äquimolaren Konzentrationen zu beta-Ala-L-His- OH zugegeben und die Aminogruppe der letzteren Substanz untersucht.

Beispiel 5

Mutagene Eigenschaften von nicht-enzymatisch glykosilierten Aminosäuren und nicht-enzymatisch glykosiliertem Carnosin

Es ist berichtet worden, daß nicht-enzymatisch glykosilierte Aminosäuren wie etwa Lysin und Arginin in einem zuerst von Maron & Ames (1983) beschriebenen Assaysystem "Ames-Test" mutagen sind (Kim et al., 1991). Andere nichtenzymatisch glykosilierte Aminosäuren wie etwa Prolin und Cystein zeigten keine Mutagenität. Wir haben die Mutagenität von L-Carnosin und der nicht-enzymatisch glykosilierten Formen von L-Carnosin, L-Lysin und L-Alanin untersucht (Tabelle 4). Alle vier Lösungen scheinen den lndikatorstamm in einem gewissen Ausmaß zu hemmen, insbesondere bei der 250 ul Dosis. Unsere Daten bestätigen frühere Ergebnisse von Kim et al. (1991), daß nicht-enzymatisch glykosiliertes L-Lysin mutagen ist und daher kanzerogen sein kann. Die Aktivität wird durch das Rattenleber S-9 System mit metabolischer Aktivierung leicht verstärkt. Nichtenzymatisch glykosiliertes L-Alanin zeigte in unseren Experimenten keine Mutagenität und in der früheren Arbeit nur geringfügige Mutagenität. Sowohl freies Carnosin als auch nicht-enzymatisch glykosiliertes Carnosin sind nicht mutagen. Davon würde ausgegangen werden, wenn Carnosin bei der Maillard-Reaktion in vivo eine signifikante Rolle spielen würde. Der Grund für den Unterschied zwischen den nicht-enzymatisch glykosilierten Formen von L-Carnosin und L-Lysin ist nicht bekannt. Tabelle 4
Mutagenes Potential nicht-enzymatisch glykosilierter Verbindungen
Salmonella typhimurium TA 100 Indikatorstamm his&supmin; nach his&spplus; Reversionssystem. Daten stellen die mittlere Anzahl von Revertanten pro Platte und deren Standardabweichung für die Testlösungen und Kontrollen mit und ohne metabolische Stimulation durch Rattenlebermikrosomen (S-9) Präparation dar.

Beispiel 6

Vergleich von Carnosin mit Aminoguanidin als Inhibitoren für nicht-enzymatische Glykosilierung

Um die Wirkung von sowohl Carnosin als auch Aminoguanidin auf die nichtenzymatische Glykosilierung zu vergleichen, wurden Rinderserumalbumin (BSA) und Ovalbumin mit einer konstanten Menge an DHA und variierenden Konzentrationen jedes anti-Glykosilierungsmittels bei 60ºC inkubiert. Zu Beginn der Reaktion und nach sieben Stunden wurden Aliquots entnommen und der Reaktionsfortschritt mittels Gelfiltration über eine Superose 6 Säule analysiert. Proteinvernetzung oder - fragmentierung wurde klar sichtbar durch eine Veränderung in der Retentionszeit bezogen auf das als Kontrolle verwendete unbehandelte Protein. Manche Verbindungen eluierten nach der theoretischen Retentionszeit für die kleinste Verbindung. Sie neigten sogar bei hoher Ionenstärke und in Gegenwart eines Detergens (Tween 20) zu einer Störung mit dem Harz der Säule. Sie sind nicht notwendigerweise kleine Verbindungen sondern vielmehr stark geladen und reaktiv. Tabelle 5 faßt die Daten zusammen. Beide Verbindungen scheinen in diesem System unterschiedlich zu reagieren: Carnosin verringerte die Bildung von Verbindungen mit hohem Molekulargewicht und war in niedrigen Konzentrationen geringfügig wirksamer als Aminoguanidin. In allen Aminoguanidin-Proben werden, vorwiegend in hohen Konzentrationen, uncharakterisierte Reaktionsprodukte gebildet (beschrieben als Form mit geringem Molekulargewicht "LMW", da die Retentionszeit länger ist als für alle anderen Verbindungen beobachtet. Da die Albuminmonomer- Peakfläche ebenfalls vermindert ist, ist es höchst wahrscheinlich, daß dies Reaktionsprodukte zwischen Ovalbumin, Aminoguanidin und DHA sind. Alle drei Verbindungen zeigten keine Veränderungen hinsichtlich der Retentionszeit oder Peakfläche bei separater 7-stündiger Inkubation unter den gleichen Bedingungen. LMW wurden auch beobachtet, wenn im Inkubationsgemisch Ovalbumin durch Rinderserumalbumin ersetzt wurde (nicht gezeigt). In den Carnosin-Proben waren die LMW-Formen nie vorhanden. Ein gutes Maß für die Wirksamkeit eines anti- Glykosilierungsmittels ist die Menge an unmodifiziertem Ovalbumin, welche nach 7- stündiger Reaktion verbleibt. Hier war Carnosin bei allen Konzentrationen wirksamer als Aminoguanidin. Tabelle 5 OVALBUMIN
Legende: Ovalbumin wurde 7 Stunden in der Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von entweder Carnosin oder Aminoguanidin mit DHA inkubiert. Reaktionsprodukte wurden über eine Gelfiltrationssäule (Superose 6) aufgetrennt und Peaks gemäß ihren Retentionszeiten gruppiert: HMW, hohes Molekulargewicht (15-30 min); Albumin-Monomer (35 min); und spät eluierende Verbindungen, LMW, niedriges Molekulargewicht (> 40 min). Carnosin- und Aminoguanidin-Konzentration [Kontrolle] 0 mM, [A] 600mM, [B] 300mM, [C] 100mM, [D] 50mM.

Beispiel 7

Die Wirkung von Carnosin auf Atherosklerose

Koronare Herzkrankheit ist eine der häufigsten Todesursachen gleichermaßen bei Diabetikern wie bei nicht-Diabetikern. Nicht-enzymatische Glykosilierung wurde, zusätzlich zu vielen Komplikationen bei Diabetes, umfassend Diabetes-Niere und Augenerkrankung, mit der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques in Verbindung gebracht. Kaninchen, die mit Cholesterin-reicher Nahrung gefüttert wurden, wurden verwendet um die Wirkung von Carnosin auf die Bildung von atherosklerotischen Plaques während eines Zeitraums von 8 Wochen zu beobachten. Unsere Studien haben gezeigt, daß die Inhibition der nichtenzymatischen Glykosilierung mit Carnosin die Plaquebildung verringern, aber nicht verhindern kann. Diese Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Die zweischwänzigen P- Werte für die Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney Zwei-Proben- Tests berechnet: Brustaorta = 0,0529, Bauchaorta = 0,5368, Aortenbogen = 0,6623, alle Daten Carnosinfütterung (n = 6) gegen Diabetes-Kontrolle (n = 5). Zum Vergleich ergab Aminoguanidin in einem ähnlichen Experiment die nachfolgenden Ergebnisse: Brustaorta = 0,12, Bauchaorta = 0,044, Aortenbogen = 0,067, alle Daten Aminoguanidinfütterung (n = 11) gegen Diabetes-Kontrolle (n = 12). In dieser Studie wurden mehr Tiere verwendet, was ein statistisch besseres Ergebnis ergab. Es gibt jedoch klare Hinweise, daß beide Inhibitoren der nicht-enzymatischen Glykosilierung die Plaquebildung verringern können.
Das Körpergewicht der Tiere nahm über den 8-wöchigen Behandlungszeitraum ab, es gab jedoch keinen Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der Carnosinbehandelten Gruppe. Es wurde kein Gewichtsunterschied von verschiedenen Organen zwischen Kontrolle gegenüber Carnosinbehandlung festgestellt.

Beispiel 8

Die Wirkung von Carnosin auf die Bildung von Katarakten in Diabetes-Ratten

Katarakt ist eine Trübung der Augenlinse, welche ausreichend ist um das Sehvermögen zu beeinträchtigen. Diabetes ist seit vielen Jahren mit Katarakt assoziiert und viele Laborexperimente unterstützen die Ansicht, daß Diabetes die Ursache für eine Form von Katarakt ist. In Tieren kann Diabetes durch Streptozotozin induziert werden, und die Linsentrübung beginnt sich etwa 20 Tage nach Injektion auszubilden, aber dichte Trübungen erscheinen erst nach etwa 100 Tagen, in Abhängigkeit vom Alter bei Injektion.
In Katarakten sind Addukte von Zuckern an Proteine, umfassend Linsenproteine identifiziert und quantifiziert worden. In den meisten Geweben gibt es sogar bei Diabetes nur eine geringe Anhäufung von späten Maillard-Produkten, aber Proteine im Linsenkern haben nicht nur die Zeit, frühe Produkte nicht-enzymatischer Glykosilierung anzuhäufen, sondern auch, um sie zu gelben Maillard-Produkten umzusetzen. Der anfängliche Angriff eines Zuckers führt zu einer Vielzahl chemischer Einheiten und induziert Strukturveränderungen bei Enzymen, Membranproteinen und Kristallinen in der Linse, und daher können mehrere Routen zu einer Schädigung führen. Eine Verbindung wie Carnosin mit ihrer Fähigkeit, die reaktive Aldehydgruppe von Zuckern abzufangen, sollte den Ausbruch von Katarakt verzögern. Wir haben dies im Streptozotozin-induzierten Diabetes-Rattenmodell getestet. Nach 8 Wochen auf Carnosinfütterung zeigten die Tiere eine höhere Klarheit (geringere Trübung) im Vergleich zu einer Diabetes-Kontrollgruppe (Mann- Whitney Zwei-Proben-Test, zweischwänziger P-Wert = 0,2092, Carnosinfütterung gegen Diabetes-Kontrolle) (siehe Fig. 3). Da dieses Ergebnis nach 56 Tagen, zur Halbzeit des Experiments gemessen wurde, deutet der Trend eine Verringerung der Kataraktbildung durch Carnosinfütterung an.
Katarakt kann in Tiermodellen nicht nur durch reduzierende Zucker induziert werden. Babizhayev (1989) hat gezeigt, daß Lipidperoxidation eine anfängliche Ursache von Kataraktentwicklung in Tiermodellen sein kann. Eine Injektion einer Liposomensuspension, welche hergestellt wurde aus Phospholipiden, die Lipidperoxidationsprodukte enthielten, induziert die Entwicklung von posteriorem subkapsulären Katarakt. Entsprechend seiner Feststellung beruht eine derartige Kataraktformung ausschließlich auf Lipidperoxidation und kann durch Antioxidantien wie Carnosin inhibiert werden. Die Bildung von Maillard-Reaktionsprodukten ist jedoch eine unabhängige Route und kann durch Antioxidantien nicht beeinflußt werden.

Beispiel 9

Die Wirkung von Carnosin auf Proteinurie, nicht-enzymatisch glykosiliertes Hämoglobin und Blutglucosewerte in Diabetes-Ratten

Für die nachfolgenden Parameter wurden in Woche 8 keine signifikanten Veränderungen beobachtet:
Veränderungen in Proteinurie und Retinopathie können erst nach etwa 30 Wochen Diabeteszustand beobachtet werden. Die Verbindung Aminoguanidin, welche üblicherweise für die Verhinderung nicht-enzymatischer Glykosilierung verwendet wird, verringert in Diabetes-Modellen auch nach 30 Wochen Fütterung die Menge an nicht-enzymatisch glykosiliertem Hämoglobin nicht. Diese Studie wird derzeit fortgesetzt.
Vom Fachmann wird erkannt werden, daß zahlreiche Veränderungen und/oder Modifikationen an der Erfindung, wie in den spezifischen Ausführungsformen gezeigt, durchgeführt werden können, ohne von der Grundidee oder dem Umfang der Erfindung, wie breit beschrieben, abzuweichen. Die vorliegenden Ausführungsformen sind daher in jeder Beziehung als erläuternd und nicht als einschränkend anzusehen.

Literatur:

Gulewitsch, W. & Amiradzibi, S. (1900) Ber. Dtsch. Chem. Ges. 33, 1902-1903
Maillard, L.C. (1912) C.R. Acad. Sci. 154, 66-68
Shilton, B.H., & Walton, D.J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 5587-5592
Hammes, H.P., Martin, S., Federlin, K., Brownlee (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11555-11558
Kim, S.B., Kim, I.S., Yeum. D.M., & Park, Y.H. (1991) Mut. Res. 254, 65-59
Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983) Mut. Res. 113, 173-215
Babizhayev, M.A. (1989) Biochimica et Biophysica Acta 1004, 363-371

Claims

1. Verwendung einer Verbindung, welche (β-Ala-His)n, (Lys-His)n, eine Verbindung der Formel R&sub1;-X-R&sub2; ist, pharmazeutisch verträglichen Salze davon oder Kombinationen davon,

wobei n gleich 1 bis 5 ist,

R&sub1; eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren, optional alpha Aminoacyliert mit einer Alkyl- oder Aralkylgruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist,

R&sub2; eine oder zwei natürlich vorkommende Aminosäuren, optional alpha- Carboxyl verestert oder amidiert mit einer Alkyl- oder Aralkylgruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, und

X gleich R&sub3;-L oder D-His (R&sub4;)-R&sub5; ist, wobei R&sub3; nichts oder -Aminoacyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist,

R&sub4; nichts oder eine Imidazolmodifikation mit Alkyl-Sulfhydryl-, Hydroxyl-, Halogen- und/oder Aminogruppen ist, und

R&sub5; nichts oder Carboxyl(alkyl)amide mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen ist,

bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Komplikationen und Pathologie von Diabetes in einem Diabetes-Patienten, mit Ausnahme von Leukopenie.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der die Verbindung Carnosin, Anserin, Ophidin, Homocarnosin, Homoanserin, D-Carnosin oder Carcinin umfaßt.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei R&sub1; und R&sub2; L- oder D-Lysin oder L- oder D-Asparaginsäure oder L- oder D-Glutaminsäure oder Homologe davon sind.

4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medikament ferner Aminoguanidin umfaßt.

5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medikament zusammen mit Insulin, Sulfonylharnstoffen, Biguaniden und/oder Amylinblockern verabreicht wird.

6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Medikament durch Injektion, Infusion, durch Einnahme, Inhalieren, Iontophorese, opthalmisch, oral oder durch topische Anwendung verabreicht wird.

7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verbindung mit einem anderen Molekül gemischt oder an dieses gebunden wird, wobei dieses Molekül so ist, daß die Zusammensetzung in Bezug auf Hautdurchdringung, Hautaufbringung, Gewebeabsorption/Gewebeadsorption, Hautsensibilisierung und/oder Hautirritation verbessert ist.

8. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das Molekül Natriumlaurylsulfat, Laurylammoniumoxid, Ozon, Decylmethylsulfoxid, Laurylethoxylat, Octenol, Dimethylsulfoxid, Propylenglykol, Nitroglycerin, Ethanol oder Kombinationen davon umfaßt.

9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Verbindung in Form einer Arzneimittelvorstufe vorliegt.