DE69231403T2

DE69231403T2 - Reinigung einer den müller-mischtumor inhibierenden substanz und behandlung von einigen tumoren

Info

Publication number: DE69231403T2
Application number: DE69231403T
Authority: DE
Inventors: Taiwai Chin; K. Donahoe; James Epstein; T. Maclaughlin; L. Parry; C. Ragin
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1991-04-12
Filing date: 1992-04-13
Publication date: 2001-02-08
Anticipated expiration: 2012-04-14
Also published as: EP0584287A1; EP0584287B1; ATE195876T1; JPH06510022A; WO1992018152A1; EP0584287A4; CA2108264A1; DE69231403D1; AU1799392A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Anmeldung betrifft die Behandlung bestimmter Tumoren unter Verwendung einer wirksamen Menge des Glykoproteins Müller'sche inhibierende Substanz. Insbesondere betrifft die Anmeldung die Behandlung von vulvaren epidermoiden Karzinomen, zervikalen Karzinomen, endometrialen Adenokarzinomen, ovaren Adenokarzinomen und okularen Melanomen. Es werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die bei einer solchen Behandlung verwendet werden können, offenbart.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Müller'sche inhibierende Substanz (MIS) wird von den fötalen Hoden als 140 kDa glykosyliertes Disulfid-verbrücktes Homodimer produziert, das die Zurückbildung des Müller-Gangs im männlichen Fötus verursacht. Unter reduzierenden Bedingungen wandert das Protein bei der Gelelektrophorese bei einem scheinbaren Molekulargewicht von 70 kDa. Das Protein kann durch exogenes Plasmin proteolytisch in zwei unterschiedliche Fragmente gespalten werden, die elektrophoretisch als 57 kDa- und 12,5 kDa-Einheiten wandern, bei einer Spaltstelle bei Rest 427 des intakten 535 Aminosäure-Monomers (Pepinsky, R. B., et al., J. Biol. Chem. 263: 18961-4 (1988)).
Es sind verschiedene Verfahren zur Reinigung von MIS bekannt. Zum Beispiel beschreibt US-Patent Nr. 5 011 687, eingereicht am 19. Oktober 1985, inzwischen erteilt, unter dem Titel "Gereinigte Müller'sche inhibierende Substanz und Verfahren zur Behandlung von humanen ovaren Krebszellen", ein Verfahren zur Reinigung von MIS aus Hoden unter Verwendung von wäßrigen po laren dissoziativen Lösungen, Abtrennung der DNA und RNA, Fraktionierung durch Gelfiltrations-Chromatographieelution und Isolierung des MIS. US-Patent Nr. 4 404 188, eingereicht am 29. Juli 1981, beschreibt unter dem Titel "Gereinigte Müller'sche inhibierende Substanz und Verfahren zur Aufreinigung" ein Verfahren zum Reinigen von MIS, das die Behandlung mit einem Protein-Inhibitor, Chromatographie an einem Ionen- Austauscher, Chromatographie an Weizenkeimlectin, an Concanavalin A und/oder an einem immobilisierten Triazinyl-Farbstoff umfaßt. US-Patent Nr. 4 487 833, eingereicht am 1. März 1982, beschreibt unter dem Titel "Verfahren zur Herstellung von Hybridomas und zur Reinigung von immunogenen Materialien", ein Verfahren zur Abtrennung von MIS unter Verwendung von Immunoaffinitätschromatographie. MIS kann auch durch rekombinante DNA-Techniken erhalten werden (Cate, R. L. et al., Cell 45: 685-698 (1986)).
Im weiblichen Fötus entwickelt sich der Müller'sche Gang in die Eileiter, den Uterus und die obere Vagina. Es ist bekannt, daß MIS die Regression des Müller'schen Gangs im männlichen Fötus bewirkt. Von MIS ist auch gezeigt worden, daß es eine Rolle spielt bei der Inhibierung der Oozyten-Meiose (Takahashi, M. et al., Mol. Cell. Endocrinol. 47: 225-234 (1986)), dem testikulären Abstieg (Hudson, J. M. et al., Endocr. Rev. 7: 270-283 (1986)), der Inhibierung der fötalen Lungenentwicklung (Catlin, E. et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 159: 1299-1303 (1988)), der Inhibierung der Autophosphorylierung des EGF-Rezeptors (Coughlin, J. P. et al., Mol. Cell. Endocrinol. 49: 75-86 (1987); Cigarroa, F. G. et al., Growth Factors 1: 179-191 (1989)) und bei der Inhibierung des Tumor- Wachstums (Donahoe, P. K. et al., Science 205: 913-915 (1979); Donahoe, P. K. et al., Ann. Surg. 194: 472-480 (1981); Fuller, Jr., A. F. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 54: 1051-1055 (1982); Fuller, Jr., A. F. et al., Gynecol. Oncol. 22: 135-148 (1985); US-Patent Nr. 4 404 188, Donahoe, P. K. et al., eingereicht am 29. Juli 1981).
Die im US-Patent Nr. 5 011 687 gezeigte Antitumorwirkung von MIS wurde unter Verwendung von natürlichem aus bovinen Hoden extrahierten und teilweise aufgereinigten MIS aufgefunden. Seit dieser Zeit sind die bovinen und humanen MIS-Gene geklont und das humane Protein in Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) exprimiert worden. Anfängliche Antiproliferationsuntersuchungen an etablierten Zellinien involvierten die Verwendung eines hochaufgereinigten rekombinanten humanen MIS (rhMIS), aber diese Untersuchungen legten nahe, daß die antiproliferative Wirkung von rhMIS in bezug auf humane gynäkologische Tumorzellen auf ovare Tumoren beschränkt ist. (Wallen, J. W. et al., Cancer Res. 49: 2005-2011 (1989)).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Angesichts der vorhergehend berichteten Inhibierung des Tumorwachstums durch bovines MIS spekulierten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung darauf, daß eine hochgereinigte Form von MIS bei der Behandlung von Tumoren von allgemein ähnlichem Ursprung wirksam sein könnte. Obwohl eine relativ hochgereinigte Form von MIS vorhergehend erhalten worden ist, wurde bezüglich der Tumorbehandlung nur wenig Erfolg demonstriert (Wallen et al., Cancer Res. 49 (2005-2001) (1989)). Demgemäß war es wünschenswert, weiterhin eine Form von MIS zu entwickeln, die bei der Inhibierung des Tumorwachstums wirksam sein würde.
Dieses Anliegen wird durch die vorliegende Erfindung erreicht, die ein Verfahren zur Inhibierung des Tumorwachstums bereitstellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge der Müller'schen inhibierenden Substanz an einen Patienten umfaßt, wobei der Tumor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus vulvarem epidermoidem Karzinom, zervikalem Karzinom, endometrialem Adenokarzinom, ovarem Adenokarzinom und okularem Melanom besteht.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht in der Reduktion der Konzentration chemotherapeutischer Mittel, die gegenwärtig bei der Behandlung von Tumoren, auf die sich diese Erfindung bezieht, verwendet werden. Dieses Ziel ist auch durch das Bereitstellen eines Verfahrens zur Inhibierung des Tumorwachstums erreicht worden, das die Anwendung einer wirksamen Menge einer Kombination eines chemotherapeutischen Mittels und der Müller'schen inhibierenden Substanz bei einem Patienten umfaßt, wobei der Tumor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus vulvarem epidermoidem Karzinom, zervikalem Karzinom, endometrialem Adenokarzinom, ovarem Adenokarzinom und okularem Melanom besteht.
Die Erfindung stellt darüber hinaus eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine zur Inhibierung des Tumors wirksame Menge einer proteolytisch gespalteten Müller'schen inhibierenden Substanz und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt, wobei der Tumor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus vulvarem epidermoidem Karzinom, zervikalem Karzinom, endometrialem Adenokarzinom, ovarem Adenokarzinom und okularem Melanom besteht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung ist durch Bezugnahme auf die Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen besser zu verstehen, wenn die angefügten Zeichnungen hinzugenommen werden, wobei:
Fig. 1 das Ergebnis eines Kolonieinhibierungsassays auf halbfestem Medium (Doppelschicht) zeigt. Die linke Seite der Figur zeigt die Wirkungen des hierin beschriebenen Immunoaffinitäts-Chromatographieverfahrens (IAP-MIS), in dem die Koloniebildung von A431-, HT-3-, HEC-1-A-, NIH:OVCAR-3- und OM431- Zellen signifikant inhibiert wurde (30 nM). Die rechte Seite der Fig. 1 zeigt die Wirkung der von der Immunoaffinitätssäule voreluierten Salzfraktion (IAP-Salz). Bei Behandlung mit der salzeluierten Fraktion wurde Stimulierung von A431-, OM431- und Hep-3B-Koloniebildung beobachtet. Das Symbol "*" zeigt p < 0,05, verglichen mit der Kontrolle.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Flüssigmedium- Kolonieinhibierungsassays. Die linke Seite der Figur zeigt die Wirkung von IAP-MIS, bei dem die Koloniebildung von A431- und OM431-Zellen signifikant inhibiert wurde (30 nM). Die rechte Seite der Figur zeigt die Wirkung der von der Immunoaffinitätssäule voreluierten Salzfraktion (IAP-Salz). Die Koloniebildung von A431- und OM431-Zellen wurde durch IAP- Salz stimuliert. IPA-MIS- und IAP-Salz zeigten keine Wirkung auf HT-3- und RT4-Zellen. Das Symbol "*" zeigt p < 0,05, verglichen mit der Kontrolle.
Fig. 3 zeigt die dosisabhängige Inhibierung der A431- Koloniebildung durch MIS. Die linke Seite der Figur zeigt, wie durch Farbstoffaffinitätschromatographie (DG-MIS) gereinigtes MIS mit ansteigender Dosis unter Verwendung des Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassays getestet wurde. Bei MIS-Konzentrationen von 3,5 und 7,0 nM wurde eine signifikante Inhibierung beobachtet. Die rechte Seite der Figur zeigt, daß IAP-MIS bei Konzentrationen von 24, 48 und 96 nM signifikante Inhibierung verursachte. Das Symbol "*" zeigt p < 0,05, verglichen mit den Kontrollen.
Fig. 4 zeigt die Antikörperabsorption von DG-MIS. Die inhibitorische Wirkung von MIS dieses Reinheitsgrades auf A431-Koloniebildung wurde nach Absorption mit dem MIS-spezifischen monoklonalen Antikörper (6E11) signifikant reduziert, aber nicht nach nichtspezifischer Absorption durch normales IgG. Das Symbol "*" zeigt p < 0,05, verglichen mit MIS alleine.
Fig. 5 zeigt die Wirkungen von verschiedenen immunogereinigten Fraktionen auf A431-Zellen im flüssigen Kolonieinhibierungsassay. Das IAP-MIS (50 nM) inhibierte, nach Salz- und Säureelution, das Koloniewachstum, während die salzeluierten Fraktionen das Wachstum stimulierten. Nach Wiederzusammenbringen dieser beiden Zusammensetzungen reduziert sich die inhibitorische Wirkung von MIS. Das prozentuale Überleben war bei dieser Kombination signifikant höher als das bei MIS alleine. Das Symbol "*" zeigt p < 0,05, verglichen mit IAP-MIS alleine, obwohl die MIS-Konzentrationen gleich waren.
Fig. 6 zeigt die additive Wirkung von Cisplatin und DG- MIS. Wenn Cisplatin und MIS auf A431-Zellen im Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassay getestet wurden, waren deren Wirkungen bei Cisplatin-Konzentrationen von 0,078 und 0,156 mg/ml additiv. Das Symbol "*" zeigt p < 0,05, wenn Cisplatin plus MIS mit Cisplatin alleine verglichen wird.
Fig. 7A zeigt die Ergebnisse eines spheroiden Assays. DG- MIS (7 nM) inhibierte das Wachstum von HT-3- Spheroiden, verglichen mit der Kontrolle (p < 0,05).
Fig. 7B zeigt die Ergebnisse eines spheroiden Assays. DG- MIS (7 nM) zeigte keine Wirkung auf das Wachstum von Hep-3B-Spheroiden, verglichen mit der Kontrolle (p < 0,05).
Fig. 8A zeigt MIS-Serumgehalte. Mit 33 ug MIS beladene Alzetpumpen wurden in CD-1-Mäuse implantiert. 24 Stunden nach Implantierung wurde ein relativ konstanter Gehalt von MIS erreicht.
Fig. 8B zeigt die Inhibierung des Tumorwachstums in vivo durch MIS. A431- und OM431-Zellen wurden in den Raum der subrenalen Kapsel von CD-1-Mäusen implantiert. Die Transplantat-Größenverhältnisse beider Tumoren wurden bei der MIS-behandelten Gruppe signifikant reduziert. Das Symbol "*" zeigt p < 0,05, verglichen mit den Kontrollen.
Fig. 9 zeigt die dosisabhängige Inhibierung der OM431- Koloniebildung durch MIS in einem flüssig- Kolonieinhibierungsassay. Das prozentuale Überleben war für MIS-Konzentrationen von 100,8, 75,6, 50,4, 25,2, 9,8 und 0,98 nM 33%, 29,5%, 56,6%, 71%, 109,8% bzw. 96,8%. Signifikante Inhibierungen wurden bei MIS-Konzentrationen von 50,4 (p < 0,05), 75,6 (p < 0,004) und 100,8 (p < 0,006) nm MIS beobachtet.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse eines Kolonieinhibierungsassays auf halbfestem Medium (Doppelschicht). Alle Zellinien wurden durch rhMIS signifikant inhibiert. Das prozentuale Überleben der verschiedenen Zellinien war 34% für OM431 (in 30 nM MIS) (p < 0,01), 61% für OM467 (in 150 nM MIS) (p < 0,02) und 80% für OM482 (in 90 nM MIS) (p < 0,03).
Fig. 11A zeigt die Ergebnisse eines multizellulären spheroiden Assays von OM467-Zellen. Die durchschnittlichen Transplantat-Größenverhältnisse der OM467- Spheroide in der Kontrollgruppe (n = 6) waren an den Tagen 5, 8 bzw. 11 3,85 ± 0,43, 4,85 ± 0,64 bzw. 5,52 ± 0,78. Die durchschnittlichen Transplantat-Größenverhältnisse in der MIS-Gruppe (n = 6) waren 2,17 ± 0,26, 2,79 ± 0,33 bzw. 3,91 ± 0,59. Dieser Unterschied war signifikant (p < 0,02).
Fig. 11B zeigt die Ergebnisse eines multizellulären spheroiden Assays von OM482-Zellen. Die durchschnittlichen Transplantat-Größenverhältnisse der OM482- Spheroide in der Kontrollgruppe (n = 10) waren an den Tagen 3 und 6 2,18 ± 0,17 bzw. 8,22 ± 0,81. Die durchschnittlichen Transplantat-Größenverhältnisse in der MIS-Gruppe (n = 10) waren 1,93 ± 0,14 bzw. 9,0 ± 0,67.
Fig. 12A zeigt die Ergebnisse eines subrenalen Kapselassays von bestrahlten CD-1-Mäusen. Das Transplantat- Größenverhältnis des OM431-Tumors war 3,93 ± 0,49 in der Kontrolle (n = 7), verglichen mit 1,42 ± 0,44 in der MIS-Gruppe (n = 5). Jede MIS-behandelte Maus erhielt 48,6 ug MIS über den 8-tägigen Assay. Das Wachstum des Tumors war in jeder MIS-Gruppe signifikant geringer als in der Kontrolle (p < 0,005).
Fig. 12B zeigt die Ergebnisse eines subrenalen Kapselassays unter Verwendung von Nacktmäusen. Die Transplantat- Größenverhältnisse des OM431-Tumors waren für die Kontrollen signifikant größer (3,02 ± 0,17), verglichen mit der MIS-Gruppe (1,68 ± 0,09). Die MIS- behandelte Gruppe erhielt 44,7 ug MIS über acht Tage. Die durchschnittlichen MIS-Serumgehalte der MIS-behandelten Mäuse betrugen am 8. Tag des Nacktmaus-Assays 794 pM. Die gemessen Kontrollen wiesen MIS-Gehalte von weniger als 10 pM auf. Das Wachstum der Tumoren war in jeder MIS-Gruppe signifikant geringer als in der Kontrolle (p < 0,001).
Fig. 12C zeigt die Ergebnisse eines subrenalen Kapselassays unter Verwendung von Nacktmäusen. Die Transplantat- Größenverhältnisse der OM431-Tumoren waren für die Kontrollen (3,14 ± 0,40) signifikant größer, verglichen mit der MIS-Gruppe (1,69 ± 0,43). Die MIS- behandelte Gruppe erhielt 130 ug MIS über 8 Tage. Die durchschnittlichen MIS-Serumgehalte der MIS- behandelten Mäuse betrugen am 8. Tag des Nacktmaus- Assays 570 pM. Die gemessenen Kontrollen wiesen MIS-Gehalte von weniger als 10 pM auf. Das Wachstum der Tumoren war in jeder MIS-Gruppe signifikant geringer als in der Kontrolle (p < 0,05)

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Der Begriff "Müller'sche inhibierende Substanz" (in austauschbarer Weise auch als "MIS" bezeichnet) soll Verbindungen und Materialien einschließen, die zu MIS strukturell ähnlich sind. Beispiele solcher einbezogener Substanzen und Materialien sind Salze, Derivate und unglykosylierte Formen von MIS. Zusätzlich soll die hier vorliegende Erfindung Mutanten von MIS einschließen, die im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie MIS aufweisen. Beispiele solcher mutanter Formen wären MIS-Moleküle, die eine Deletion, Insertion oder eine Änderung der Aminosäuresequenz tragen. MIS kann aus jeder Säugetierquelle erhalten sein oder, wie oben gezeigt, aus Nichtsäugetierquellen durch die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie oder aus der chemischen Synthese des MIS-Proteins.
Ein Gen wird als "rekombinantes" Gen bezeichnet, wenn es das Ergebnis der Anwendung rekombinanter DNA-Techniken ist. Beispiele für rekombinante DNA-Techniken schließen Klonierung, Mutagenese, Transformation usw. ein. Rekombinante DNA- Techniken werden in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982), offenbart.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Reinigung von MIS kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Tumoren, die diese Erfindung betrifft, hergestellt werden. Um ein hochgereinigtes MIS zu erhalten, das im wesentlichen von proteolytischen Enzymen oder der Inhibierung der MIS-antiproliferativen Aktivität frei ist, ist die Verwendung von Verfahren bevorzugt, die die Spezifität der Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen zur Gewinnung eines Produkts mit im wesentlichen reinem MIS-Produkt vorteilhaft einsetzen. Dieses einen Aspekt der vorliegenden Erfindung ausmachende Verfahren schließt die Verwendung von Immunoaffinitätschromatographie ein, aber es verbessert früher verwendete Verfahren in dem Sinne, daß das gewonnene MIS-Produkt im wesentlichen frei ist von kontaminierenden Enzymen mit MIS-proteolytischer Aktivität oder Inhibitoren der MIS-antiproliferativen Aktivität.
Das hier verwendete Immunoaffinitäts-Chromatographieverfahren eliminiert kontamierende Enzyme mit MIS-proteolytischer Aktivität oder Inhibitoren der MIS-antiproliferativen Aktivität durch Elution mit einer wirksamen Menge eines Alkalimetallhalogenids und eines Erdalkalimetallhalogenids wirksam von der Immunoaffinitäts-Chromatographie-Matrix. Das MIS wird dann durch Elution mit einer einen pH-Wert zwischen 2,5 und 4,0 aufweisenden sauren Lösung eluiert. Dieses Endprodukt wird hierin als IAP-MIS bezeichnet.
Das IAP-MIS kann in Lösung mit bis zu 95% Reinheit erhalten werden. Während die prozentuale Reinheit mit der anderer Immunoaffinitäts-Reinigungsverfahren vergleichbar ist, ist das IAP-MIS im wesentlichen frei von kontaminierenden proteolytischen Enzymen oder Inhibitoren der MIS-antiproliferativen Aktivität.
Das erfindungsgemäße gereinigte MIS kann in Lösung mit bis zu 95% Reinheit oder mehr erhalten werden. Während die prozentuale Reinheit mit der anderer Immunoaffinitäts- Reinigungsverfahren vergleichbar ist, ist die erfindungsgemäße MIS-Zusammensetzung im wesentlichen frei von kontaminierenden proteolytischen Enzymen oder Inhibitoren der MIS- antiproliferativen Aktivität.
Zum Zweck dieser Erfindung wird aufgereinigtes MIS als eine MIS-Zusammensetzung aufgefaßt, die im wesentlichen frei von kontaminierenden proteolytischen Enzymen und Inhibitoren der MIS-antiproliferativen Aktivität ist, unabhängig von der prozentualen Reinheit. Die Zusammensetzung wird als im wesentlichen frei von proteolytischen Enzymen aufgefaßt, wenn die Gelelektrophorese des gereinigten MIS-Produktes ein Protein mit einem Molekulargewicht von 140 kDa oder 70 kDa anzeigt. Die Gelelektrophorese eines solchen Produktes zeigt keine zeitabhängigen proteolytischen Fragmente, die Abbauprodukte von MIS sind. Zum Beispiel sind die 57 kDa, 12,5 kDa, 34 kDa und 22 kDa Abbaufragmente von MIS, die hier im weiteren beschrieben sind, durch Standard-Gelelektrophoreseverfahren nicht ohne weiteres erkennbar.
Die MIS-Zusammensetzung wird als im wesentlichen frei von Inhibitoren der MIS-antiproliferativen Aktivität aufgefaßt, wenn das MIS die Proliferation von Tumorzellen blockiert. Beispiele solcher Tumorzellen sind hier einbezogen.
Diese Beispiele beinhalten Tumoren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus vulvarem epidermoidem Karzinom, endometricelem Adenokarzinom, zervikalem Karzinom, endometrialem Adenokarzinom, ovarem Adenokarzinom und anderen okularen Melanomen besteht. Die Bestimmung der antiproliferativen Akti vität dieser Zellen kann durch irgendeine der hierin beschriebenen Verfahren erfolgen.
Um im wesentlichen von proteolytischen Enzymen oder Inhibitoren der MIS-antiproliferativen Aktivität freies MIS zu erhalten, werden die Kontaminanten von dem MIS unter Verwendung von Immunoaffinitätschromatographie getrennt. Die Trennung erfolgt durch Elution der Enzyme oder der Inhibitoren mit einem Alkalmetallhalogenid oder einem Erdalkalimetallhalogenid. Solche Verbindungen liegen im allgemeinen in Lösung vor, und eine wirksame Menge von Halogenid wird zwischen 0,1 M und 2,0 M liegen. Als Alkalimetalle sind die Ionen von Lithium, Natrium und Kalium bevorzugt, wobei Natrium am meisten bevorzugt ist. Als Erdalkalimetalle sind die Ionen von Magnesium und Calcium bevorzugt. Als Halogenide sind die Ionen von Fluor, Chlor, Brom und Iod bevorzugt, wobei Chlor am meisten bevorzugt ist. Bei Elution mit Natriumchlorid wird eine Lösung von zwischen etwa 0,1 und 2,0 M bevorzugt. Die Konzentration an Halogenid kann, falls gewünscht, auch im Verlauf der Elution variiert werden. Dies kann durch ansteigende molare Konzentration des Halogenids in einer stufenweisen Art vorgenommen werden. Es ist bevorzugt, daß jede Stufe verändert wird, nachdem etwa 0,1 bis 2,0 Bettvolumen der Lösung mit der Chromatographie-Matrix in Kontakt getreten sind, obwohl solche Schritte, wenn gewünscht, weiter verändert werden können.
Das Halogenid kann in der Lösung auch von einer wirksamen Menge eines chelatisierenden Mittels begleitet werden. Diese Mittel sind zum Binden von Metallionen fähig, die für ihre Aktivität Metallionen benötigende Enzyme inaktivieren können. Solche Mittel schließen die Verbindungen Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure (EGTA) ein. Chelatisierer können in einem Bereich von zwischen 0,1 und 50 mM wirksam zugegeben werden.
Nachdem die kontaminierenden proteolytischen Enzyme oder Inhibitoren der MIS-antiproliferativen Aktivität abgetrennt worden sind, kann MIS durch Elution mit einer einen pH-Wert zwischen etwa 2,0 und 4,0 aufweisenden sauren Lösung gewonnen werden. Obwohl Verdünnungen starker Säuren wie HCl verwendet werden können, sind organische Säuren aufgrund ihrer relativ milden Säurestärke bevorzugt. Zum Beispiel können saure Amine und Imine sowie Monocarbonsäuren, Dicarbonsäuren und Tricarbonsäuren verwendet werden. Als Monocarbonsäuren sind Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure bevorzugt. Als Dicarbonsäuren sind Bernsteinsäure, Fumarsäure und Maleinsäure bevorzugt. Als Tricarbonsäure ist Zitronensäure bevorzugt. Unter den Aminen sind saure Aminosäuren, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure bevorzugt. Der pH der sauren Lösung kann auch inkrementell verändert werden, wie bei der Verwendung des Halogenids.
Nachdem das gereinigte MIS-Produkt eluiert worden ist, ist es bevorzugt, das Produkt auf einen pH von zwischen 6,8 und 7,6 zu neutralisieren, um es vor Säurehydrolyse zu schützen. Dies kann durch verschiedene Hydroxidverbindungen, wie NaOH oder NH&sub4;OH, oder durch verschiedene Puffer erreicht werden, die die Neutralisation des Produktes auf den gewünschten pH- Bereich schnell bewirken können. Diese Hydroxidverbindungen sollten nicht so aufgefaßt werden, daß sie alle einschließen, wie der Durchschnittsfachmann weiß.
Obwohl diese Beschreibung eine pharmazeutische Zusammensetzung beschreibt, die eine proteolytisch gespaltene Müller'sche inhibierende Substanz umfaßt und ein Verfahren zur Herstellung dieser, soll dies so aufgefaßt werden, daß das 140 kDa-Homodimer oder die 70 kDa-Untereinheit von MIS in der pharmazeutischen Zusammensetzung beinhaltet sein kann. In diesem Fall können natürlich vorkommende proteolytische Enzyme in vivo das MIS in seine wirksame Form proteolytisch spalten. Solche Enzyme werden durch die hierin beschriebenen proteolytischen Verbindungen verkörpert.
Der Begriff "Proteinfragment" soll sowohl synthetische als auch von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzen des MIS ableitbare Aminosäuresequenzen beinhalten. Das Protein wird als "von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzen des MIS ableitbares" Protein bezeichnet, wenn es durch Fragmentierung der natürlich vorkommenden ausgewählten Sequenzen von MIS erhalten werden kann, oder wenn es auf Grundlage des Wissens über die Sequenz der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz oder des diese Sequenz kodierenden genetischen Materials (DNA oder RNA) synthetisiert werden kann.
Der Begriff "proteolytisch gespalten" bezieht sich auf ein durch Behandlung mit irgendeiner zum Spalten entweder des Homodimers oder der 70 kDa-Untereinheit des MIS in Proteinfragmente geeigneten Substanz erhaltenes MIS-Produkt, das das Wachstum von Tumoren, auf die sich diese Erfindung bezieht, inhibiert. Im allgemeinen ist MIS bei der Behandlung von Tumoren, auf die sich diese Erfindung bezieht, wirksam, wenn es unter Bildung von Proteinfragmenten von etwa 57 kDa und 12,5 kDa gespalten ist. Substanzen, die MIS in dieser Art spalten, schließen Serinproteasen, wie Plasmin, und Endopeptidasen ein. Diese Enzyme sollen nicht als alle einschließend aufgefaßt werden oder als in irgendeiner Weise eingrenzend, da andere Enzyme MIS ebenfalls proteolytische spalten können, und solche Enzyme vom Durchschnittsfachmann leicht bestimmt werden können.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus Polypeptide, die, zusätzlich zur ausgewählten Sequenz, eine oder mehrere Aminosäuren enthalten oder nicht enthalten können, die in der natürlich vorkommenden Sequenz möglicherweise nicht vorliegen, wobei solche Polypeptide im Vergleich zum ausgewählten Polypeptid funktional ähnlich sind oder gegenüber diesem antagonistische Aktivität besitzen. Solche Polypeptide werden in der vorliegenden Erfindung als "funktionale Derivate" bezeichnet, vorausgesetzt, sie zeigen eine zu MIS im wesentlichen ähnliche oder dazu antagonistische Aktivität.
In den Schutzbereich dieser Erfindung einbezogen ist die Verwendung von zusätzlichen hinzugefügten Aminosäureresten, um das Koppeln an ein Trägerprotein zu verstärken, oder von zugesetzten Aminosäureresten, um die erfindungsgemäße Tumorbehandlung zu verbessern. Die MIS-Zusammensetzung kann in Form der freien Amine (am N-Terminus) oder als Säureadditionssalz davon vorliegen. Übliche lösliche saure Salze sind Salze von Halogenwasserstoffsäuren, z. B. HBr, HI oder stärker bevorzugt HCl. Verwendbare Kationen sind die Alkali- oder Erdalkalimetallkationen (z. B. Na, K, Li, 1/2Ca, 1/2Ba usw.) oder Aminkationen (z. B. Tetraalkylammonium, Trialkylammonium, wobei Alkyl C&sub1;-C&sub1;&sub2; sein kann). Wie im Fachgebiet bekannt, können die Aminosäurereste von MIS in geschützter oder ungeschützter Form vorliegen, wobei zweckmäßige Amino- oder Carboxyl- Schutzgruppen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können gemäß den für die Herstellung pharmazeutisch verwendbarer Zusammensetzungen bekannten Methoden hergestellt werden, wo bei MIS oder seine funktionellen Derivate in Abmischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägervehikel verwendet werden. Geeignete Vehikel und ihre Herstellung, einschließlich anderer humaner Proteine, z. B. humanem Serumalbumin, sind z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Auflage, A. Oslo, Hg., Mack, Easton, Pa (1980)), beschrieben. Um eine für die wirksame Verabreichung geeignete pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung zu bilden, enthalten solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge von MIS oder eines funktionellen Derivats davon, zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägervehikels.
Eine "wirksame Menge" von MIS ist eine, die zur Wachstumsinhibierung des Tumors, auf den sich diese Erfindung bezieht; in Mensch oder Tier geeignet ist. Gemäß dieser Erfindung kann die Inhibierung eines Tumor-Implantates durch eines Verminderung des Implantat-Größenverhältnisses angezeigt werden. Das Implantat-Größenverhältnis wird als (L2 · W2 · W2) / (L1 · W1 · W1) berechnet, wobei L1 der längste Durchmesser des Implantats, W1 der zu L1 rechtwinklige Durchmesser, L2 der längste Durchmesser des Tumors und W2 der Durchmesser rechtwinklig zu L2 ist. Unter Verwendung dieser Berechnungsmethode wird eine Inhibierung angezeigt, wenn das Transplantat-Größenverhältnis einer behandelten Probe geringer ist als das Transplantat- Größenverhältnis einer unbehandelten Kontrolle. Bei der Beurteilung der Inhibierung eines natürlich vorkommenden Tumors bei einem Patienten muß lediglich das Volumen des Tumors (L2 · W2 · W2) vor und nach Behandlung verglichen werden.
Die wirksame Menge kann in Abhängigkeit von Kriterien, wie Alter, Gewicht, körperlichem Zustand, vorhergehendem medizinischen Werdegang und Empfindlichkeit des Empfängers variiert werden. Die wirksame Menge wird auch davon abhängen, ob die Verabreichung oral, intravenös, intramuskulär, subkutan, lokal oder durch direkte Applikation am Tumor erfolgt. Im Falle der direkten Applikation am Tumor ist es bevorzugt, daß eine Serum-Endkonzentration von mindestens 0,1 nM, vorzugsweise etwa 0,1 bis 1,0 nM, MIS erreicht wird. Die wirksame individuelle Dosis bezüglich der zusätzlich benannten Verabreichungsart kann durch den Fachmann durch bekannte Verfahren leicht bestimmt werden. Zum Beispiel kann der Durchschnittsfachmann unter Verwendung von Größenverhältnis-Berechnungen, wie sie oben detailliert beschrieben sind, die optimalen Dosisgehalte für jede Art der Verabreichung bestimmen. Bei Behandlung eines Patienten ist es bevorzugt, einen Serumgehalt von mindestens 10 ng/ml an MIS zu erreichen.
MIS oder seine funktionellen Derivate enthaltende Zusammensetzung können oral, intravenös, intramuskulär, subkutan oder lokal verabreicht werden. Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können angewandt werden, um die Zeitdauer der Aktion zu kontrollieren. Zusammensetzungen mit kontrollierter Abgabe können durch Verwendung von Polymeren zum Komplexieren oder Adsorbieren von MIS oder seiner funktionellen Derivate verwendet werden. Die kontrollierte Abgabe kann durch Auswahl geeigneter Makromoleküle (z. B. Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carobxymethylcellulose und Protaminsulfat) ausgeführt werden und die Konzentration an Makromolekülen sowie die Verfahren des Einbaus, um die Abgabe zu kontrollieren.
Ein anderes mögliches Verfahren zur Kontrolle der Dauer der Wirkung durch Zusammensetzungen mit kontrollierter Abgabe besteht darin, MIS in Partikel aus polymerem Material, wie Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Poly(milchsäure) oder Ethylenvinylacetat-Copolymeren, einzubauen. Alternativ ist es an Stelle des Einbaus von MIS in polymere Partikel möglich, MIS in Mikrokapseln einzuschließen, die z. B. durch Koazervierungstechniken oder durch Oberflächenpolymerisation hergestellt sind, z. B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine- Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln oder in kolloidalen Arzneimittel-Abgabesystemen, z. B. Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Solche Lehren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, supra (1980), offenbart.
Die die erfindungsgemäßen proteolytisch gespaltenen MIS- Proteinfragmente enthaltenden pharmazeutische Zusammensetzungen können auch chemotherapeutische Mittel einschließen, von denen bekannt ist, daß sie das Tumorwachstum in Mensch oder Tier inhibieren. Das in dieser Zusammensetzung enthaltene chemotherapeutische Mittel kann gegen jede spezifische neoplastische Krankheit gerichtet sein. Solche Mittel werden in Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 8. Aufl., Pergamon Press, New York, N. Y., 1985, beschrieben. Es ist jedoch bevorzugt, daß das chemotherapeutische Mittel das Wachstum der Tumoren, auf die sich diese Erfindung bezieht, inhibiert.
Im allgemeinen wird das mit MIS kombinierte chemotherapeutische Mittel einen additiven Effekt bei der Behandlung des Tumors, auf den sich diese Erfindung bezieht, aufweisen. Dies bedeutet, daß die bei der Behandlung des Tumors, auf den sich diese Erfindung bezieht, verwendete Menge des chemotherapeutischen Mittels gegenüber der vom Hersteller empfohlenen Dosis reduziert werden kann, wodurch unerwünschte Nebenwirkungen reduziert werden. Zum Beispiel kann für jede Menge an chemotherapeutischem Mittel, um die bei der Tumorbehandlung reduziert wird, eine äquivalente Menge an MIS zugegeben werden.
Die Verwendung des Begriffs "äquivalente wirksame Menge" soll so verstanden werden, daß nicht notwendigerweise eine äquivalente Gewichts- oder Volumenmenge gemeint ist, sondern daß die Menge an MIS, die eine gleiche Inhibierung des Tumorwachstums bietet, dargestellt wird. Dies muß möglicherweise Patient für Patient evaluiert werden, kann aber, z. B. durch Vergleich der Mengen bestimmt werden, die gleiche Größenreduktionsverhältnisse, wie oben definiert, ergeben. Typischerweise sind chemotherapeutische Mittel, die zur Behandlung der Tumoren, auf die sich diese Erfindung bezieht, mit MIS kombiniert werden können, zwischen etwa 0,001 und 10,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten wirksam. Die Verabreichung der Kombination von MIS und chemotherapeutischem Mittel kann in der gleichen Art erfolgen wie die Verabreichung von MIS alleine.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen schließen als chemotherapeutische Mittel ein: Stickstoffloste, wie Cyclophosphamid, Ifosfamid und Melphalan; Ethylenimine und Methylmelamine, wie Hexamethylmelamin und Thiotepa; Pyrimidin- Analoge, wie Fluoruracil und Fluordesoxyuridin; Vincaalkaloide, wie Vinblastin; Epipodophyllotoxine, wie Etoposid und Teniposid; Antibiotika, wie Actinomycin D, Doxorubicin, Bleomycin und Mithramycin; Modifikatoren biologischer Wirkung, wie Interferon α; Platin-Koordinationskomplexe, wie Cisplatin und Carboplatin; Östrogene, wie Diethylstilbestrol und Ethinylöstradiol; Antiandrogene, wie Flutamin; und Analoga des Gonadotropin-Freisetzungshormons, wie Leuprolid. Andere Verbindungen, wie Decarbazin, Nitrosoharnstoffe, Methotrexat, Diticen und Procarbazin, sind ebenfalls wirksam.
Selbstverständlich können andere dem Durchschnittsfachmann bekannte chemotherapeutische Mittel leicht ersatzweise eingesetzt werden, da diese Liste nicht als erschöpfend oder begrenzend aufgefaßt werden sollte.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, wird sie durch Verweis auf die folgenden spezifischen Beispiele leichter verständlich, die hier nur zur Erläuterung einbezogen sind und nicht eingrenzend sein sollen, wenn nicht anders beschrieben.
Die Namen "Sepharose" und "Alzet" sind als Marken bekannt.

BEISPIEL 1

I. Materialien und Methoden

A. Herstellung und Reinigung von rhMIS

Nach Klonierung von MIS-cDNA und genomischer DNA wurden Dihydrofolat-Reduktase-defiziente CHO mit einem linearen Transkript sowohl von menschlichem MIS als auch von Dihydrofolat- Reduktase-Genen nach dem Verfahren von Cate (Cate, R. L. et al., Cell 45: 685-698 (1986)) kotransfiziert. Die transfizierten CHO-Zellen wurden in Methotrexat amplifiziert und bei 37ºC in α-minimalem essentiellem Medium ohne Ribonucleoside und Desoxyribonucleoside, das mit 10% bovinem MIS-freiem weiblichen fötalen Kälberserum (FCS) supplementiert war, angezogen. Zwei unterschiedliche MIS-Aufreinigungsprotokolle wurden verwendet, um entweder teilgereinigtes oder homogenes MIS bereitzustellen. Das erste beinhaltete seriell Anionen- Austausch- und Farbstoffaffinitätschromatographie (DG-MIS) gemäß dem Verfahren nach Budzik (Budzik, G. P. et al., Cell 34: 307-314 (1983)), um eine 1- bis 10%ige Konzentration von MIS bereitzustellen. Das zweite Verfahren beinhaltete das hierin detailliert beschriebene Immunoaffinitäts-Chromatographieverfahren (IAP-MIS), um eine 90- bis 95%ige Konzentration von MIS bereitzustellen.
Das hierin verwendete Immunoaffinitäts-Chromatographie-verfahren war auf die Gewinnung von rekombinantem humanem MIS (rhMIs) gerichtet. Das Protein wurde aus dem konditionierten Medium von chinesischen Hamster-Ovarzellen (CHO) gewonnen, die mit einem linearen Konstrukt des humanen rhMIS-Gens und des DHFR-Gens transfiziert, durch 30 nM Methotrexat-Selektion amplifiziert und in 4-Liter-Bioreaktoren auf Spulen aus rostfreiem Stahl bis zur Konfluenz angezogen wurden, wie durch Epstein beschrieben (Epstein et al., In Vitro Cell. and Devel. Biol 25(2): 213-6 (1989)) oder in modifizierten Rollerflaschen in α-modifiziertem Eagle's Medium (α-MEM-), supplementiert mit 5% weiblichem fötalem Kälberserum (FFCS), 10 mg/ml Amikacin, 1,3 g/l l-Glutamin, 2,0 g/l d-Glucose und 0,1 g/l Natriumpyruvat in der Abwesenheit von Nucleosiden. Das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage gesammelt und bei -20ºC aufbewahrt. Die Medien wurden, aufgetaut und durch Whatman-#4- Filterpapier gefiltert, um Trümmer zu entfernen, auf einem Minitan (Millipore) mit einem 30 kDa-Ausschlußultrafilter 20- fach konzentriert und bis zur Aufreinigung bei -70ºC aufbewahrt. Es wurde eine 5-ml-Immunoaffinitätssäule konstruiert, wobei etwa 50 mg eines an Protein-A-Sepharose (BioRad) gereinigten monoklonalen anti-humanen rhMIS-Antikörpers [6E11], wie von Hudson (Hudson, P. L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 70: 16-22 71990)) beschrieben verwendet und kovalent an Affigel-10-Agaroseharz (BioRad) gebunden wurden, unter Anwen dung der Anweisungen des Herstellers (etwa 80% Kopplungseffizienz). Die Säule wurde mit 100 ml 20 mM HEPES, pH 7,4, equilibriert und 200 ml des konzentrierten Mediums wurden bei 4ºC mit einem Säulenvolumen/Stunde beladen. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 20 mM HEPES, pH 7,4, gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm wieder auf der Basislinie lag (60-100 ml).
Die Elution des an diese Säule gebundenen rhMIS erfolgte unter Verwendung von 2,0 M Natriumthiocyanat (NaSCH) oder 1 M Essigsäure, 20 mM HEPES, pH 3,0, mit oder ohne einen Vorelutionsschritt mit 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,001% NP-40, 20 mM HEPES, pH 7,4. Die Hauptmenge des rhMIS-Proteins eluierte in einer einzelnen 2-ml-Fraktion, die sofort mit entweder NaOH oder NH&sub4;OH auf einen pH zwischen 7,0 und 7,4 neutralisiert wurde. In Abhängigkeit vom Anfangs-pH der Fraktion und der Neutralisierungstechnik reichten die Verdünnungseffekte von 10 bis 50%.
Die biologische Aktivität von MIS wurde in vitro unter Verwendung des Ratten-Müller'schen-Gang-Regressions-Organkulturassays von Donahoe bestimmt (Donahoe, P. K. et al., J. Surg. Res. 23: 141-148 (1977)). Die MIS-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines enzymgekoppelten immunosorbenten Assays (ELISA) auf MIS gemäß dem Verfahren von Hudson, supra, abgeschätzt. Die Protein-Konzentrationen wurden nach dem Verfahren von Bradford gemessen (Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976)).

B. Herstellung des monoklonalen Antikörpers für die MIS-Absorption

Monoklonale Antikörper wurden durch Immunisierung von weiblichen A/J-Mäusen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME.) mit immunoaffinitätsgereinigtem rhMIS unter Verwendung der vorhergehend für bovines MIS beschriebenen Methode (Hudson, P. L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 70: 16-22 (1990); Mudgett- Hunter, M. et al., J. Immunol. 128: 1327-33 (1982)) hergestellt. MIS-Antikörper produzierende Nierenzellen wurden geerntet und es wurden Hybridomas, wie von Kohler beschrieben, erzeugt (Kohler, G., Immunol. Methods 2: 285-98 (1981)). Eine monoklonale Linie (6E11) wurde selektiert und in Dulbecco's s modifiziertem essentiellem Medium, supplementiert mit 15% FCS, amplifiziert. Der Antikörper wurde aus 6E11 konditioniertem Medium mit 50% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; präzipitiert und durch Protein-A-Sepharose CL-4B (Sigma, St. Louis, MO.)-Chromatographie weiter gereinigt.

C. Zellinien

A431, eine von humanem vulvarem epidermoidem Karzinom abgeleitete Zellinie, HT-3 aus einer humanen Lymphknoten- Metastase eines zervikalen Karzinoms, NIH:OVCAR-3 aus einem humanen ovaren Andenokarzinom, HEC-1-A aus einem humanen endometrialen Adenokarzinom, RT4 aus einem humanen Blasen- Transitionalzell-Papillom und Hep 3B aus einem humanen hepatozellulären Karzinom wurden von American Culture Type Collection erhalten. OM431, aus einem humanen okularen Melamon, wurde von Dr. James Epstein vom Massachusetts General Hospital erhalten.
Die A431-, HT-3-, NIH:OVCAR-3-, OM431- und Hep-3B-Zellen wurden mit α-minimalem Essentiellmedium mit Ribonucleosiden und Desoxyribonucleosiden (α-MEM+), supplementiert mit 10% weiblichem FCS und 2 mM L-Glutamin, gehalten. HEC-1-A und RT4 wurden mit McCoy's 5A-Medium, supplementiert mit 10% weiblichem FCS, gehalten. Vor der Untersuchung wurden die Zellen seriell subkultiviert, dann zur 70 bis 80%igen Konfluenz trypsinisiert, um Synchronität zu erzielen. Diese Proliferations-Zellpopulation wurde dann bei 1500 UpM für 5 Minuten zentrifugiert und mit mit 10% weiblichem FCS supplementierten Medium resuspendiert. Die Zellen wurden in einem Hemozytometer gezählt.

D. Kolonieinhibierungsassay an halbfestem Medium (Doppelschicht)

Die Wirkungen von IAP-MIS und der salzeluierten Fraktion von der Immunoaffinitätssäule (IAP-Salz) wurden unter Verwendung von A431-, HT-3-, HEC-IA-, NIH:OVCAR-3-, OM431- und Hep-3B- Zellen im konventionellen Doppelschicht-Agarose-Kolonieinhibierungsassay von Hamburger getestet (Hamburger, A. W. et al., Science 197: 461-463 (1977); Hamburger, A. W. et al., J. Clin. Invesst. 60: 846-854 (1977)). Die untere Schicht der 35-mm- Kulturschale enthielt 1 ml 0,6% Agarose (Sigma, St. Louis, MO.) in mit 10% weiblichem FCS supplementierten α-MEM+. Die obere Schicht bestand aus 0,3% Agarose in mit 10% weiblichem FCS supplementierten α-MEM+, den zu testenden Zellen (50.000 Zellen/ml für A431, HT-3 und OM431; 25.000 Zellen/ml für HEC- 1-A, NIH:OVCAR-3 und Hep 3B), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) 10 ng/ml (Sigma, St. Louis, MO.) und einem der folgenden: (a) IAP-MIS (Endkonzentration 30 nM); (b) IAP-Salz (Endproteinkonzentration 19,3 ug/ml); oder (c) Vehikelpuffer als Negativkontrolle. Die Schalen wurden in feuchter Luft mit 5% CO&sub2; bei 37ºC für 10-21 Tagen inkubiert. Kolonien mit mehr als 30 Zellen wurden mit einem Le-Chateller-Mikroskop (Nikon) ausgezählt. Die Ergebnisse wurden als prozentuales Überleben im Vergleich zur Kontrollgruppe (Anzahl der Kolonien in der Testgruppe · 100/Anzahl der Kolonien in der Kontrollgruppe) ausgedrückt.

E. Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassay

Einzelzell-Suspensionen wurden in 24-Napf-Kulturplatten (Falcon, Oxnard, CA., #3047) plaziert und angezogen. Nach der Zelladhärenz wurden nur solche mit guten Einzelzelldispersionen ohne Klumpen für weitere Untersuchungen verwendet. Die zu testenden Mittel wurden in einem Volumen von weniger als 1/10 des Gesamtvolumens in einen Napf gegeben und durch Dreifachbestimmung getestet. Die Zellen wurden in feuchter Luft mit 5% CO&sub2; bei 37ºC inkubiert. In 5 bis 7 Tagen gebildete Kolonien wurden mit Giemsa-Lösung gefärbt, und solche mit mehr als 30 Zellen wurden mit einem Le-Chateller-Mikroskop oder einem computergestützten Bildanalysator ausgezählt.

F. Vergleich von IAP-MIS und IAP-Salz in Bezug auf die Koloniebildung

IAP-MIS (Endkonzentration 30 nM) und IAP-Salz (Endproteinkonzentration 19,3 ug/ml) wurden im Flüssigmedium- Kolonieinhibierungsassay unter Verwendung von 0,3 ml pro Napf A431 (25.000 Zellen/ml), OM431 (25.000 Zellen/ml), HT-3 (5000 Zellen/ml) und RT4 (5000 Zellen/ml) getestet. 50 ng/ml EGF wurden zu A431 und OM431 zugegeben, um gemäß dem Verfahren von Lee (Lee, K. et al. Exp. Cell Res. 173: 156-162 (1987)) das Monoschichtwachstum zu unterdrücken aber die Koloniebil dung zu stimulieren. Das Ergebnis wurde als prozentuales Überleben im Vergleich zur Vehikelpufferkontrolle ausgedrückt.

G. Dosisabhängige Inhibierung von A431-Zellen durch MIS

Nach Verdünnung in Vehikelpuffer wurde DG-MIS in Endkonzentrationen von 0,9, 1,8, 3,5 und 7,0 nM unter Verwendung von A431-Zellen (25.000 Zellen/ml, 50 ng/ml EGF) im Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassay getestet. IAP-MIS wurde in Konzentrationen von 12, 24, 48 und 96 nM getestet. Die Ergebnisse wurden als prozentuales Überleben im Vergleich zur Vehikelpufferkontrolle ausgedrückt.

H. Antikörper-Absorption von MIS

Monoklonaler MIS-Antikörper (6E11) und normales Kaninchen IgG (Dako Corporation, Dänemark, Charge 108) wurden vor Verwendung in serumfreies α-MEM+ dialysiert. Vorherige Experimente zeigten maximale Absorption der MIS-Aktivität bei einem MIS:Ak-Verhältnis von 1 : 3. Daher wurden 17,4 ug 6E11 zu 5,6 ug DG-MIS zugegeben. Herkömmliches Kaninchen IgG wurde mit Kulturmedium verdünnt und zu MIS im gleichen 1 : 3-Verhältnis zugegeben, um die nichtspezifische Absorption zu bestimmen. Eine äquivalente Menge von aus konditioniertem Medium von untransfiziertem Wild-Typ-CHO-Zellen gereinigtem Protein diente bei 1 : 3-Mischung mit Antikörper wie oben beschrieben als Negativkontrolle. Die Ansätze wurden bei 4ºC für 12 Stunden gemischt.
Protein-A-Sepharose 9CL-4B (Sigma, St. Louis, MO.) wurde nach Waschen in serumfreiem Medium zugegeben und bei 4ºC für wei tere 12 Stunden inkubiert. Die Mischungen wurden zentrifugiert und die Überstände unter Verwendung von A431-Zellen (25.000 Zellen/ml, 50 ng/ml EGF) im Flüssigmedium- Kolonieinhibierungsassay getestet. Das prozentuale Überleben jeder Gruppe wurde durch Vergleich der Anzahl der Kolonien in jeder Gruppe mit der Wild-Typ-Negativkontrolle berechnet.

I. Gemeinsame Behandlung von IAP-MIS und der salzeluierten Fraktion (IAP-Salz)

IAP-MIS wurde mit einem gleichen Volumen von IAP-Salz vermischt (Proteinkonzentration 0,199 mg/ml), um eine End-MIS- Konzentration von 50 nM zu ergeben. Es wurde unter Verwendung von A431-Zellen (25.000 Zellen/ml, 50 ng/ml EGF) im Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassay getestet und mit IAP-MIS, IAP-Salz und Vehikelpuffer verglichen. Das prozentuale Überleben wurde durch Vergleich der Anzahl der Kolonien in jeder Gruppe mit der der Vehikelpuffer-Negativkontrolle berechnet.

J. Gemeinsame Behandlung von MIS und Cisplatin

Cisplatin (Bristol Laboratory, Syracuse, NY) wurde in serumfreiem Kulturmedium auf Konzentrationen von 0, 0,078, 0,156, 0,312 und 0,624 ug/ml verdünnt und mit oder ohne DG-MIS (Endkonzentration 7 nM) unter Verwendung von A431-Zellen (25.000 Zellen/ml, 50 ng/ml EGF) im Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassay dreifach getestet. Als Negativkontrolle wurde Vehicelpuffer verwendet. Das prozentuale Überleben wurde durch Vergleich der Anzahl der Kolonien, die bei der jeweiligen Dosis gewachsen waren, mit der in der Vehikelpuffer- Negativkontrolle erreichten berechnet.

K. Multizellulärer Tumor-Spheroid-Assay

Multizelluläre Tumor-Spheroide von HT-3- und Hep-3B-Zellen wurden nach der von Yuhas et al. beschriebenen Methode hergestellt (Yuhas, J. M. et al., Cancer Res. 37: 3639-3643 (1977)). In Kürze wurden entweder 10&sup6;-Zellen von HT-3 oder Hep 3B in 10 ml mit 10% weiblichem FCS supplementiertem α-MEM+ in einer 10-cm-Kulturschale auf 1%ige Agarose ausplatiert und in feuchter Luft mit 5% CO&sub2; bei 37ºC inkubiert. Normalerweise bildeten sich innerhalb von 2 bis 5 Tagen Spheroide. Zu jedem Napf einer 24-Napf-Kulturschale (Falcon, Oxnard, CA., #3047) wurden 0,5 ml 1%ige Agarose zugegeben, um vor der Verwendung eine Bodenschicht zu bilden. Individuelle Spheroide ähnlicher Größe (etwa 250 um Durchmesser) wurden unter einem Präpariermikroskop ausgewählt und mit einer Mikropipette wurde ein Spheroid pro Napf übertragen, der 0,5 ml mit 10% weiblichem FCS supplementiertes α-MEM+ auf der Agaroseschicht enthielt. Die Größen der Spheroide wurden am Tag 0 durch den längsten Durchmesser (L) und dem zum längsten rechtwinkligen Durchmesser (W) gemessen. Das Volumen wurde dann als (L · W · W) ausgedrückt. Sechs Spheroid enthaltende Näpfe jedes Zell-Typs wurden entweder mit DG-MIS (Endkonzentration 7 nM) oder Vehikelpuffer behandelt. Die Volumina wurden erneut am 3., 6. und 9. Tag gemessen. Das Größenverhältnis jedes Spheroids zu verschiedenen Intervallen wurde durch Vergleich mit der Größe des gleichen Spheroids am Tag 0 erhalten. Das durchschnittliche Größenverhältnis jeder Gruppe wurde in einer Wachstumkurve gegen die Zeit aufgetragen und mit den anderen Gruppen verglichen.

L. Subrenaler Kapselassay

Unter Befolgung des Verfahrens von Bogden (Bogden, A. Z. et al., Exp. Cell Biol. 47: 281-293 (1979)), das später durch Fingert modifiziert wurde (Fingert, H. J. et al., Cancer Res. 47: 3824-3829 (1987)) wurden A431- und OM431-Zellen getestet. 10&sup7; Zellen wurden bei 1500 UpM 5 Minuten zentrifugiert, um Pellets zu bilden. 15 ul Fibrinogen (Sigma, St. Louis, MO., 20 mg/ml, gelöst in PBS pH 7,4) wurden zu dem Pellet zugegeben, gefolgt von 8 ul Thrombin (Sigma, St. Louis, MO., 20 Einheiten/ml, gelöst in doppelkonzentriertem Dulbecco- modifiziertem essentiellem Medium). Die Mischung wurde bei 37ºC für 15 Minuten inkubiert. Der so gebildete Zellklumpen wurde zur Vorbereitung der Implantation in etwa 100 Fragmente geschnitten (jeweils 1 mm³, enthaltend etwa 10&sup5; Zellen).
MIS wurde durch eine zum Zeitpunkt der Tumor-Implantation in die peritoneale Kavität eingesetzte Alzet-mini-osmotische- Pumpe (#2001, Alza, Palo Alto, CA.) verabreicht. Diese Pumpen haben ein Füllungsvolumen von 209 ± 6 ul und geben ihren Inhalt mit einer Geschwindigkeit von 1,03 ± 0,04 ul/h für eine etwa 8-tägige Abgabezeit ab. Die Pumpen wurden entweder mit IAP-MIS (MIS: 159 ug/ml gemäß ELISA) oder mit Vehikelpuffer gefüllt. Eine Gesamt-MIS-Dosis von etwa 33 ug (230 nM) wurde jeder Maus in der MIS-Gruppe über die Dauer des Experiments verabreicht.
Virus- und pathogenfreie weibliche CD-1-Mäuse (10 Wochen alt, Durchschnittsgewicht 35 g, Charles River Breeding Laboratory, Wilmington, MA.) wurden Ganzkörperbestrahlungen von 640 rad durch Mark-1-Cäsium-137-Bestrahlung 16 bis 24 Stunden vor dem Experiment verabreicht (Gajewski, W. H. et al., Surgical Forum 38: 468-470 (1987)). Nach Induzieren einer Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von 0,3 ml 10% Pentobarbital (Abbott Laboratory, North Chicago, IL) wurde ein Schnitt in der linke Seite der Maus gemacht und die linke Niere wurde nach außen verlagert. Es wurde unter Verwendung eines Nadeltrokars der Stärke 19 (19 gauge) ein subkapsularer Raum gebildet. In den Raum wurde ein Zellklumpen mit einem Stück eines 5-0- Nylon-Nahtfadens (etwa 1 mm in der Länge) eingeführt, der sowohl zur Kalibrierung der okularen Mikrometermessungen als auch zur Lokalisierung des Tumors verwendet wurde. 24 Mäuse wurden mit A431-Zellklumpen und 12 Mäuse mit OM431- Zellklumpen implantiert. Der längste Durchmesser (L1) des Implantates, der zum längsten rechtwinklige (W1) und die Länge des Nahtfadens wurden mit dem okularen Mikrometer eines Präpariermikroskops gemessen. Die Tiere wurden entweder mit IAP- MIS oder Vehikelpuffer behandelt, verabreicht durch eine in die peritoneale Kavität eingebrachte Alzet-Pumpe. Es wurden Blutproben nach 6, 24, 48, 120 (fünfter Tag) und 192 Stunden (achter Tag) durch Blutentnahme an der Orbita von ausgewählten Tieren genommen und die Serum-MIS-Gehalte wurden durch ELISA gemessen. Die Tiere wurden am achten Tag getötet. Der längste Durchmesser (L1) des Tumors, der zum längsten rechtwinklige (W1) und die Länge des Nahtfadens wurden von zwei unabhängigen Untersuchungspersonen blind gemessen. Nach Kalibrierung der Messungen wurde das Transplantat- Größenverhältnis durch (L2 · W1 · W2) / (L1 · W1 · W1) dargestellt. Histologische Sektionen der Nieren wurden ebenfalls erhalten und untersucht. Tumoren mit zystischer Änderung wurden ausgeschlossen.

M. Statistische Analyse

Die Ergebnisse der Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassays und der im halbfestem Medium wurden durch Chi-Quadrat-Test analysiert, mit oder ohne Yates-Korrektur, während die multizellulären Spheroid- und die subrenalen Kapselassays durch den Student-t-Test getestet wurden. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant aufgefaßt.

II. ERGEBNISSE

A. Kolonieinhibierungsassay auf halbfestem Medium (Doppelschicht)

Das prozentuale Überleben verschiedener Zellinien nach Inkubation mit 30 nM IAP-MIS war 45% für A431, 747% für HT-3, 54% für HEC-1-A, 59% für NIH:OVCAR-3, 34% für OM431 und 114% für Hep 3B. Im Vergleich zu Kontrollen war das Überleben nach Behandlung mit MIS in allen Zellenlinien außer Hep 3B durch IAP-MIS signifikant inhibiert (p < 0,05). Das Wachstum von Hep 3B wurde durch MIS nicht inhibiert. Das prozentuale Überleben nach Inkubation mit IAP-Salz war 172% für A431, 93% für HT3, 92% für HEC-1-A, 120% für OM431, 105% für NIH:OVCAR-3 und 173% für Hep 133B. Der stimulierende Effekt war für A431-, OM431- und Hep-3B-Zellen signifikant (p < 0,05) (Fig. 1).

B. Wirkung von IAP-MIS und IAP-Salz auf die Koloniebildung bei Verwendung des Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassays

Das prozentuale Überleben war 55,9% für A431, 36,8% für OM431, 100,5% für HT-3 und 115,8% für RT4 bei Behandlung mit 30 nM IAP-MIS. Das prozentuale Überleben war 169,0% für A431, 226,7% für OM431, 101,6% für HT-3 und 96,5% für RT4 bei Behandlung mit IAP-Salz (Endproteinkonzentration von 19,3 ug/ml). Der inhibitorische Effekt von IAP-MIS und der stimu latorische Effekt von IAP-Salz waren für die A431- und OM431- Koloniebildung signifikant (p < 0,05) (Fig. 2).

C. Dosisabhängige Inhibierung der A431-Koloniebildung durch MIS

Das prozentuale Überleben betrug bei DG-MIS-Konzentrationen von 0,9, 1,8, 3,5 und 7,0 nM 103,4%, 81,4%, 61,3% bzw. 26,5%. Signifikante Inhibierungen wurden bei DG-MIS-Konzentrationen von 3,5 und 7,0 nM (p < 0,05) beobachtet. Das prozentuale Überleben war bei IAP-MIS-Konzentrationen von 12, 24, 48 und 96 nM 109,7%, 71,1%, 56,6% bzw. 33,3%. Signifikante Inhibierungen wurden bei IAP-MIS-Konzentrationen von 24, 48 und 96 nM beobachtet (Fig. 3). DG-MIS war somit 10- bis 14-fach stärker als IAP-MIS.

D. Antikörper-Absorption von MIS

Die MIS-Gehalte, gemessen durch ELISA auf MIS, betrugen 9,0 nM für die Positivkontrolle (MIS alleine), 8,8 nM nach normaler IgG-Absorption (nicht spezifisch) und 0,62 nM nach Absorption mit monoklonaler Antikörper-Absorption (spezifisch). Alle Wild-Typ-Negativkontrollen hatten einen MIS-Gehalt von 0. Das prozentuale Überleben war 42,9% für MIS alleine, 38,0% für normales IgG (nichtspezifische Absorption) und 74,2% für den monoklonalen Antikörper (spezifische Absorption). Es fand keine signifikante nichtspezifische Absorption der MIS- Aktivität statt (p > 0,05, verglichen mit der Negativkontrolle). Das prozentuale Überleben nach der Absorption mit monoklonalen Antikörpern war signifikant höher als das der Positivkontrolle (MIS alleine) und des normalen IgG (Fig. 4).

E. Die salzeluierte Fraktion (IAP-Salz) inhibiert IAP-MIS

Das prozentuale Überleben von A431-Zellen war 51,3% für IAP- MIS alleine (50 nM), 116,9% für IAP-Salz alleine und 81,6% für die Kombination aus diesen beiden (MIS 50 nM). Die Differenz zwischen IAP-MIS alleine und die Kombination aus IAP- MIS/IAP-Salz war signifikant (p < 0,05) (Fig. 5). Nach Reduktion von IAP-Salz und zwei separaten Ansätzen von IAP-MIS wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. In der Region von 14-43 kDa wurden mehrere Proteinbanden bei dem IAP-Salz gesehen, die aber im IAP-MIS nicht vorhanden waren.

F. Additive Wirkung von Cisplatin und MIS

Das prozentuale Überleben von A431-Zellen war bei Cisplatin- Konzentrationen von 0, 0,078, 0,156, 0,312 und 0,624 ug/ml 100%, 56,5%, 38,7%, 34,3% bzw. 10,8%. Bei Zusatz von 7 nM DG- MIS betrug das prozentuale Überleben bei den gleichen Konzentrationen von Cisplatin 39,3%, 32,2%, 23,1%, 20,4% bzw. 5,4%. Das prozentuale Überleben von Cisplatin alleine und Cisplatin plus MIS war bei Cisplatin-Konzentrationen von 0,078 und 0,156 ug/ml signifikant unterschiedlich (Fig. 6).

G. Multizellulärer Spheroid-Assay

Die durchschnittlichen Größenverhältnisse von HT-3-Spheroiden in der Kontrollgruppe (n = 6) betrugen an Tag 3, 6 bzw. 9 1,15 ± 0,04, 1,44 ± 0,02 und 151,96 ± 0,11, während sie in der MIS-Gruppe (n = 6) 0,98 ± 0,04, 0,94 ± 0,04 und 1,08 ± 0,06 betrugen (Fig. 7A). Die durchschnittlichen Größenverhältnisse von Hep-3B-Spheroiden betrugen in der Kontrollgruppe (n = 6) an Tag 3, 6 und 9 2,56 ± 0,05, 5,64 ± 0,53 bzw. 13,07 ± 1,09, während sie in der MIS-Gruppe (n = 6) 2,36 ± 0,25, 5,77 ± 0,54 und 14,30 ± 0,54 betrugen. Das Wachstum der Hep-3B-Spheroide war schneller und von MIS nicht inhibiert (Fig. 7B).

H. Subrenaler Kapselassay

Die MIS-Gehalte im Mausserum waren nach Implantierung der mit MIS gefüllten Alzet-Pumpe von Stunde 24 an bis zum 8. Tag relativ stabil (Fig. 8A). Der durchschnittliche MIS-Gehalt von 14 Blutproben von Tag 2 bis zu Tag 8 betrug 19,1 ± 2,7 ng/ml (etwa 140 pM). Die Serum-MIS-Gehalte der Kontrollmäuse waren nicht detektierbar. Das Transplantat-Größenverhältnis des implantierten A431-Tumors betrug in der Kontrollgruppe (n = 12) 3,70 ± 0,31 gegenüber 1,50 ± 0,26 in der MIS-Gruppe (n = 12). Das Transplantat-Größenverhältnis des OM431-Tumors betrug in der Kontrollgruppe 3,93 ± 0,49 (n = 7) gegenüber 1,42 ± 0,44 in der MIS-Gruppe (n = 5). Das Wachstum des Tumors war für beide Zellinien in der MIS-Gruppe signifikant geringer als in der Kontrollgruppe (p < 0,05) (Fig. 8B).

III. Diskussion

Rekombinantes humanes MIS (rhMIS) aus dem konditioniertem Medium von amplifizierten CHO-Zellinien, gereinigt entweder durch serielle Ionenaustausch und Farbstoffaffinitätschromatographie (DG-MIS) oder Immunoaffinitätschromatographie (IAP- MIS), wurde in einer Anzahl von Wachstumsassays gegen verschiedene Zellinien untersucht. Insgesamt waren die Ergebnisse des Flüssigkeits- und des halbfesten Assays recht ähnlich, mit Ausnahme der HT-3-(zervikales Karzinom)Zellinie, die durch hochgereinigtes MIS im halbfesten Assay inhibiert wurde, jedoch nicht im flüssigen Assay. Der multizelluläre Spheroid-Assay wurde zur Rekapitulierung von Tumor-Mikroregionen mit Zell-Zell-Wechselwirkungen und nährstoffabhängigen Wachstumsmustern verwendet. HT-3-Zellen bildeten hinlängliche Spheroide, die durch MIS inhibiert wurden. Auf das spheroide Wachstum von Hep 3B (hepatozelluläres Karzinom) wurde keine MIS-Wirkung festgestellt. Die Zugänglichkeit von allen drei in vitro-Assays erlaubt die Auswahl optimaler Bedingungen für jeden Tumor.
Bei der Beurteilung von MIS als Antikrebsmittel ist es wichtig, seines Wechselwirkung mit verfügbaren Chemotherapien zu berücksichtigen. Um dies zu beurteilen, wurden MIS und Cisplatin allein und in verschiedenen Kombinationen getestet. Da die inhibitorischen Wirkungen von MIS und Cisplatin additiv sind, konnten Cisplatin-Dosen bei Gabe mit MIS gesenkt werden. Daher könnte dieser biologische Modifikator als Adjuvanz bei der multimodalen Behandlung von ausgewählten humanen Malignitäten wirken. Die Flüssigkolonieinhibierung und die spheroiden Assays können zum Testen wiederholter Dosen von entweder MIS oder MIS plus zytotoxische Mittel verwendet werden. Asynchrone Zugabe von zunächst MIS, das auf proliferative Zellpopulationen am besten wirkt, und dann zytotoxisches Mittel ist jedoch bevorzugt.
DG-MIS, obwohl weniger gereinigt, zeigte durchgängig Inhibierung des Zellwachstums in vitro. Die Spezifität der MIS- Wirkung wurde durch Blockierung der inhibitorischen Wirkung mit einem monoklonalen MIS-Antikörper demonstriert.
Wallen et al. (Wallen, J. W. et al., Cancer Res. 49: 2005-2011 (1986)) berichtete über eine nur minimale antiproliferative Wirkung, wenn ein immunoaufgereinigter MIS-Ansatz gegen eine Vielzahl von etablierten Zellinien getestet wurde. In Beispiel 1 wurde das gleiche schwache Ansprechen auf IAP-MIS be obachtet, bevor der Salzelutionsschritt vor der Elution mit 1 M Essigsäure hinzugefügt wurde. Zusätzlich zeigte die von der Immunoaffinitätssäule eluierte Salzfraktion sogar eine wachstumsstimulierende Wirkung auf einige Zellinien. Elektrophorese dieser Salzfraktion zeigte in der Region von 14-20 kDa mehrere Banden, die in der anschließend mit 1 M Essigsäure eluierten Fraktion abwesend waren. Wenn man konzentriertes Kulturmedium von untransfizierten Wild-Typ-CHO-Zellen dem gleichen Reinigungsverfahren unterzog, zeigte die Salzfraktion, die auch eine stimulatorische Wirkung auf A431-Zellen zeigte (Fig. 1 und 2), die Anwesenheit der gleichen Banden bei 14-43 kDa, was darauf schließen läßt, daß diese Proteinprodukte der untransfizierten CHO-Zellen unter Blockierung der MIS-Wirkung als stimulierende Faktoren wirken könnten. Dieser Befund wird durch die in Fig. 5 gezeigten Ergebnisse unterstützt. Wenn die dosisbezogenen Wirkungen von hochgereinigtem IAP-MIS und DG-MIS verglichen wurden, zeigte sich, daß DG-MIS gegenüber dem stärker aufgereinigten IAP-MIS 10-fach stärker war.
Der subrenale Kapselassay wurde zum Testen der Wirkung von MIS in vivo verwendet. Durch Abgabe von MIS mittels einer zum Zeitpunkt der Tumor-Implantation eingesetzten intraperitonealen Alzet-Pumpe zur konstanten Infusion, wurde das Wachstum einer vulvaren epidermoiden Karzinom-Zellinie, A431, und einer okularen Melanomlinie, OM431, in vivo inhibiert. Bei der Auswertung dieses Assays ist es wichtig, daß die Histologie für jeden verschiedenen Tumor dokumentiert wird und das Experiment vor Auftreten zentraler Nekrose abgeschlossen wird. Daher wurde der Assay nach 8 Tagen beendet, da eine längere Dauer zu variablen zystischen Änderungen führte. Solche Änderungen können das Transplantat-Größenverhältnis in hinreichendem Ausmaß variieren, um Vergleiche aufgrund von Flüssig keit-Inhibition und zystischer Änderungen unzuverlässig zu machen. Durch diese sorgfältige Analyse können die Post- Implantierungs-Charakteristika jeder Tumor-Zellinie etabliert und Artefakte vermieden werden. Die in vivo-Wirkung wird bei diesem subrenalen Assay bei physiologischen oder pikomolaren Konzentrationen erreicht. In vitro-Untersuchungen benötigen andererseits 50- bis 500-fach höhere Gehalte, was ein Ausbleiben der Aktivierung bedeuten könnte. Es wurde keine offensichtliche Toxizität für Tiere beobachtet.

BEISPIEL 2

I. Materialien und Methoden

A. Herstellung und Aufreinigung von rhMIS

Nach Klonierung von MIS-cDNA und genomischer DNA wurden Dihydrofolat-Reduktase-defiziente CHO mit einem linearen Konstrukt von sowohl humanem MIS als auch Dihydrofolat- Reduktase-Genen wie in Beispiel 1 kotransfiziert. Die transfizierten CHO-Zellen wurden in Methotrexat amplifiziert und bei 37ºC im α-minimalem essentiellem Medium ohne Ribonucleoside und Desoxyribonucleoside, supplementiert mit 10% bovinem MIS-freiem weiblichen fötalen Kälberserum (FCS), angezogen. Zur Aufreinigung des rhMIS (90- bis 95%ige rein) wurde wie in Beispiel 1 Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung eines anti-humanes-MIS monoklonalen Antikörpers verwendet.
Die biologische Aktivität von MIS wurde in vitro wie in Beispiel 1 unter Verwendung des Ratten-Müller'scher-Gang- Regressionsorgankulturassays bestimmt. MIS-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines Enzym-gekoppelten immunosorben ten Assays (ELISA) auf MIS abgeschätzt und die Proteinkonzentrationen wurden wie in Beispiel 1 gemessen.

B. Zellinien

Die humanen okularen Melanom-Zellinien OM431, OM464, OM467 und OM482 wurden 1984 etabliert und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis Ampullen mit frühen Passagierungen für diese Untersuchungen aufgetaut wurden. Sie wurden in der α- Modifizierung von mit Ribonucleosiden und Desoxyribonucleosiden supplementiertem Eagle's Medium (α-MEM+) gehalten, zu dem 10% weibliches FCS und 1 g/l L-Glutamin zugesetzt wurden. Vor der Untersuchung wurden die Zellen seriell subkultiviert und dann bei 70 bis 80% Konfluenz trypsinisiert. Diese proliferierende Zellpopulation wurde dann für 5 Minuten bei 1500 UpM zentrifugiert und mit mit 10% weiblichem FCS supplementiertem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden in einem Hämozytometer gezählt.

C. Kolonieinhibierungsassay in halbfestem Medium (Doppelschicht)

Die Wirkung von rhMIS wurde unter Verwendung eines konventionellen Doppelschicht-Agarose-Kolonieinhibierungsassays wie in Beispiel 1 getestet. Die untere Schicht der 35-mm- Kulturschalen enthielt 1 ml 0,6% Agarose (Sigma, St. Louis, MO.) in mit 10% weiblichem FCS supplementiertem α-MEM+. Die obere Schicht bestand aus 0,3% Agarose in mit 10% weiblichem FCS supplementiertem α-MEM+, den zu testenden Zellen (50.000 Zellen/ml für OM431; 25.000 Zellen/ml für OM464, OM467 und OM482), 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (Sigma, St. Louis, MO.) und entweder rhMIS oder Vehikelpuffer als Ne gativkontrolle. Die Schalen wurden für 10 bis 21 Tage bei 37ºC in feuchter Luft mit 5% CO&sub2; inkubiert. Kolonien mit mehr als 30 Zellen wurden mit einem Le-Chateller-Mikroskop (Nikon) gezählt. Die Ergebnisse werden als prozentuales Überleben im Vergleich zur Kontrollgruppe ausgedrückt (Anzahl der Kolonien in der Testgruppe · 100/Anzahl der Kolonien in der Kontrollgruppe).

D. Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassay

Einzelzellsuspensionen von OM431 wurden bei Konzentrationen von 8250 Zellen pro Napf in 0,5 ml Medium (α-MEM+ mit 10% weiblichem FCS und 50 ng/ml EGF) wie in Beispiel 1 in 24- Napf-Kulturplatten (Falcon, Oxnard, CA. #3047) eingebracht und angezogen. Nach Zellanheftung wurden nur solche mit guter Einzelzelldispersion ohne Verklumpen für die weiteren Untersuchungen verwendet. Die zu testenden Mittel wurden zugegeben (50 ul pro Napf) und dreifach getestet. Die Zellen wurden in feuchter Luft mit 5% CO&sub2; bei 37ºC inkubiert. Die innerhalb von 5 bis 7 Tagen gebildeten Kolonien wurden, mit Giemsa- Lösung gefärbt, und solche mit mehr als 30 Zellen wurden mit einem Le-Chateller-Mikroskop durch das Auge gezählt, oder die Zählung erfolgte automatisiert unter Verwendung eines computerbasierten Bildanalysators.

E. Dosisabhängige Inhibierung von OM431-Zellen durch MIS

Nach Verdünnung in Vehikelpuffer wurde MIS in Konzentrationen von 0,98, 9,8, 25,2, 50,4, 75,6 und 100,8 nM getestet. Die Ergebnisse wurden als prozentuales Überleben im Vergleich zur Vehikelpufferkontrolle ausgedrückt.

F. Multizellulärer Tumor-Spheroid-Assay

Multizelluläre Tumor-Spheroide von OM467- und OM482-Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. In kürze wurden 105 Zellen OM467 in 1 ml mit 10% weiblichem FCS supplementierten α-MEM+ auf 1,5 ml 1% Agarose in einer 35 · 10- Kulturschale nach gründlichem Waschen zum Entfernen restlichen Trypsins ausplattiert und in feuchter Luft mit 5% CO&sub2; bei 37ºC für 2 bis 5 Tage inkubiert, worauf sich in der Regel Spheroide bildeten. Jedem Napf in der 24-Napf-Kulturplatte (Falcon, Oxnard, CA., #3047) wurden dann 0,5 ml 1% Agarose zugesetzt. Individuelle Spheroide ähnlicher Größe (etwa 250 mm Durchmesser) wurden unter einem Präpariermikroskop ausgewählt und jeweils durch Mikropipette in einen 0,5 ml mit 10% weiblichem FCS supplementiertes α-MEM+ enthaltenden Napf auf die Agaroseschicht übertragen. Die Größen der Spheroide am Tag 0 wurden durch den längsten Durchmesser (L) und dem zum längsten rechtwinkligen Durchmesser (W) gemessen und das Volumen wurde dann als (L · W · W) ausgedrückt. Sechs Spheroid enthaltende Näpfe wurden entweder mit rhMIS oder Vehikelpuffer behandelt. Die Volumina wurden in regelmäßigen Intervallen gemessen. Das Größenverhältnis jedes Spheroids zu verschiedenen Intervallen wurde durch Vergleich dessen mit der Größe des gleichen Spheroids am Tag 0 erhalten. Das durchschnittliche Größenverhältnis jeder Gruppe wurde in einer Wachstumskurve gegen die Zeit aufgetragen und mit den anderen Gruppen verglichen.

G. Subrenaler Kapselassay

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wuchsen OM431- Zellen zu einer Implantatgröße von 3,68 ± 0,56, OM482 zu 1,97 ± 0,67, OM467 zu 1,34 ± 0,5 und OM464 zu < 1. Danach wurden 10&sup7; OM431-Zellen für 5 Minuten bei 1500 UpM zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden. 20 ml Fibrinogen (Sigma, St. Louis, MO., 20 mg/ml in PBS pH 7,4 gelöst) wurden dem Pellet zugegeben, gefolgt von 10 ml Thrombin (Sigma, St. Louis, MO., 20 Einheiten/ml, gelöst in doppelkonzentriertem Dulbecco's modifiziertem essentiellem Medium). Die Mischung wurde für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Der so gebildete Zellklumpen wurde zur Vorbereitung der Implantation in etwa 50 Fragmente geschnitten (1 mm³, jeweils etwa 10&sup5; Zellen enthaltend).
MIS wurde durch eine zum Zeitpunkt der Tumor-Implantation in die peritoneale Kavität eingebrachte Alzet Mini-osmotische Pumpe (#2001, Alza, Palo Alto, CA.) abgegeben. Diese Pumpen haben ein Füllungvolumen von etwa 210 ul und entlassen ihren Inhalt über eine Abgabezeit von 8 Tagen mit einer Abgaberate von etwa 1 ul/h. Die Pumpen wurden entweder mit rhMIS oder mit Vehikelpuffer gefüllt.
Virus- und pathogenfreie weibliche CD-1-Mäuse (10 Wochen alt, durchschnittliches Gewicht 35 g, Charles River Breeding Laboratory, Wilmington, MA.) wurde wie in Beispiel 1 durch einen Mark-I-Cäsium-137-Bestrahler 16 bis 24 Stunden vor dem Experiment eine Ganzkörperbestrahlung von 640 rad verabreicht. Nacktmäuse (8 Wochen alt, durchschnittliches Gewicht 24 g, Edwin L. Steele Laboratory, Massachusetts General Hospital, Boston, MA.) wurden ebenfalls verwendet. Nach Einleiten der Anästhesie mit einer intraperitonealen Injektion von 0,3 ml 10% Pentobarbital (Abbott Laboratory, North Chicago, IL) wurde an der linken Flanke der Maus ein Schnitt gemacht und die Niere nach außen verlagert. Unter Verwendung eines 19-Gauge- Nadeltrokars wurde ein subkapsulärer Hohlraum entwickelt. In den Hohlraum wurde ein Zellklumpen unter Verwendung eines Stücks 5-0-Nylon-Nahtmaterial (etwa 1 mm Länge) eingeführt, das sowohl zum Kalibrieren der okularen Mikrometermessungen als auch zum Lokalisieren des Tumors verwendet wurde. 12 CD- 1-Mäuse und 20 Nacktmäuse wurden mit OM431-Zellklumpen implantiert. Der längste Durchmesser (L1) des Implantats, der zum längsten Durchmesser rechtwinklige Durchmesser (W1) und die Länge des Nahtmaterials wurden mit dem okularen Mikrometer eines Präpariermikroskops gemessen. Die Tiere wurden entweder mit rhMIS oder Vehikelpuffer, abgegeben durch in die peritoneale Kavität eingesetzte Alzet-Pumpen, behandelt. Die Tiere wurden am achten Tag getötet. Am achten Tag wurden Blutproben von den Nacktmäusen genommen und Serum-MIS-Gehalte wurden durch ELISA gemessen. Der längste Durchmesser (L2) des Tumors, der zum längsten Durchmesser rechtwinklige Durchmesser (W2) und die Länge des Nahtmaterials wurden von zwei unabhängigen Untersuchungspersonen blind gemessen. Nach Kalibrierung der Messungen wurden die Implantat- Größenverhältnisse durch (L2 · W2 · W2) / (L1 · W1 · W1) dargestellt. Es wurden auch histologische Sektionen der Nieren genommen und untersucht. Tumoren mit zystischen Änderungen wurden ausgeschlossen.

H. Statistische Analyse

Die Ergebnisse der Flüssigmedium-Kolonieinhibierungsassays und der im halbfesten Medium sowie des multizellulären spheroiden und subrenalen Kapselassays wurden durch den Studentt-Test getestet. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant aufgefaßt.

II. Ergebnisse

A. Dosisabhängige Inhibierung der OM431-Koloniebildung durch MIS im Flüssigkolonieinhibierungsassay

Nur OM431-Zellen erreichten adäquates Wachstum mit ihrem Ligand-Kolonieinhibierungsassay. Das prozentuale Überleben war für MIS-Konzentration von 100,8, 75,6, 50,4, 25,2, 9,8 und 0,98 nM 33%, 29,5%, 56,6%, 71%, 109,8% bzw. 96,8%. Bei MIS- Konzentrationen von 50,4 (p < 0,05), 75,6 (p < 0,004) und 100,8 (p < 0,006) nM MIS wurden signifikante Inhibierungen beobachtet (Fig. 9).

B. Kolonieinhibierungsassay im halbfestem Medium (Doppelschicht)

Alle Zellinien, außer die kein Kolonie-Wachstum zeigende OM434, wurden durch rhMIS signifikant inhibiert. Das prozentuale Überleben der verschiedenen Zelllinien war 34% für OM431 (in 30 nM MIS) (p < 0,1), 61% für OM467 (in 150 nM MIS) (p < 0,02) und 80% für OM482 (in 90 nM MIS) (p < 0,03) (Fig. 2).

C. Multizellulärer spheroider Assay

Die durchschnittlichen Größenverhältnisse der OM467-Spheroide betrugen in der Kontrollgruppe (n = 6) an den Tagen 5, 8 bzw. 11 3,85 ± 0,43, 4,85 ± 0,64 und 5,52 ± 0,78, während sie in der MIS-Gruppe (n = 6) 2,17 ± 0,26, 2,79 ± 0,33 und 3,91 ± 0,59 betrugen. Diese Differenz war signifikant (p < 0,02). Die durchschnittlichen Größenverhältnisse von OM482- Spheroiden betrugen in der Kontrollgruppe (n = 10) an den Tagen 3 und 6 2,18 ± 0,17 bzw. 8,22 ± 0,81, während sie in der MIS-Gruppe (n = 10) 1,93 ± 0,14 und 9,0 ± 0,67 betrugen (Fig. 11A und B). OM431 und OM464 wuchsen nicht als Spheroide.

D. Subrenaler Kapselassay

In den CD-1-bestrahlten Mäusen betrug das Implantat- Größenverhältnis des OM431-Tumors 3,93 ± 0,49 in der Kontrolle (n = 7) im Vergleich zu 1,42 ± 0,44 (p < 0,005) in der MIS-Gruppe (n = 5). Jede MIS-behandelte Maus erhielt im Verlauf des 8-tägigen Assays 48,6 ug MIS. In zwei Nacktmäuse verwendenden Assays, mit 11 Kontrollen und 9 MIS-behandelten Mäusen, waren die Implantat-Größenverhältnisse der OM431- Tumoren für die Kontrollen signifikant größer, 3,02 ± 0,17 bzw. 3,14 ± 0,40, gegenüber 1,68 ± 0,09 (p < 0,001) und 1,69 ± 0,43 (p < 0,005) für die MIS-Gruppe. Im ersten Nacktmausassay erhielt die MIS-behandelte Gruppe im Verlauf von 8 Tagen 44,7 ug MIS, während die MIS-Gruppe im zweiten Nacktmausassay 130 ug erhielt. Die durchschnittlichen MIS-Serumgehalte der MIS-behandelten Mäuse betrugen am achten Tag des Nacktmausassays 749 bzw. 570 pM. Die gemessenen Kontrollen wiesen MIS- Gehalte von weniger als 10 pM auf. Das Wachstum der Tumoren war in jeder MIS-Gruppe in allen drei Assays signifikant geringer als in der Kontrolle (p < 0,05) (Fig. 12A-C).

III. Diskussion

In Beispiel 2 wurde die Wirkung von rekombinantem humanem MIS auf drei humane okulare Melanom-Zellinien unter Verwendung von drei in vitro-klonogenischen Assays untersucht. Der zuverlässige und reproduzierbare Doppelschicht-Inhibierungsassay wurde auf jede Zellinie angewendet. Trotz seiner ziemlich langen Inkubationszeiten (10 bis 21 Tage) wuchsen alle Zellinien in diesem Assay gut. OM482, OM431 und OM467 wurden signifikant inhibiert. Bei der OM431-Zellinie wurde der Flüssigkolonieinhibierungsassay angewendet. OM467 und OM482 bilden in diesem Assay keine Einzelkolonie. Dieser Assay ist, wenn er wie bei OM431, funktioniert, schnell (5 bis 7 Tage) und benötigt wenig Probe. OM431 zeigte bei rhMIS- Konzentrationen über 25 nM ein klares Dosisansprechen mit Inhibierung der Koloniebildung. Das prozentuale Überleben von OM431 korrelierte gut zwischen den beiden Assays. Der multizelluläre spheroide Assay wurde zur Rekapitulierung von Tumor-Mikroregionen mit Zell-Zell-Interaktionen und nahrungsmittelabhängigen Wachstumsmustern angewendet. OM467- und OM482-Zellinien bildeten hinlängliche Spheroide. OM467 zeigte signifikante Inhibierung, während das Wachstum von OM482 unbeeinflußt war. OM431 bildete keine Spheroide. Die Zugänglichkeit aller drei in vitro-Assays erlaubt die Auswahl der für jeden Tumor optimalen Bedingungen.
Der subrenale Kapselassay wurde zum Testen der Wirkung von MIS auf OM431 in vivo angewendet, da diese Linie schnell genug wuchs, um Vergleiche zu ermöglichen. Durch Abgabe von MIS mittels einer zum Zeitpunkt der Tumor-Implantation eingesetzten intraperitonealen Alzet-Pumpe mit konstanter Infusion wurde das Wachstum von OM431 in vivo inhibiert. Es ist bei der Auswertung dieses Assays wichtig, daß für jeden verschiedenen Tumor die Histologie dokumentiert wird und das Experiment abgeschlossen wird, während die Tumoren noch fest sind und bevor ein lymphozytisches Infiltrat und/oder eine zentrale Nekrose auftreten. Der Assay wurde daher bei den betrahlten CD-1-Mäusen am Tag 8 beendet, da eine längere Inkubationsdauer zu variablen histologischen Änderungen führte, die das Transplantat-Größenverhältnis in hinreichendem Ausmaß verändern, um Vergleiche aufgrund der Inbibition von kurzlebigen Flüssigkeiten, inflammatorischer Zellinfiltration und zystischen Änderungen unzuverlässig zu machen. Um potentielle auf die strahlungsinduzierte Immunosupression beruhende Schwierigkeiten zu vermeiden, wurden auch Nacktmäuse verwendet und eine ähnliche Inhibierung des Tumorwachstums wurde beobachtet. Bei der Implantierung in die Nacktmäuse wurde die gleiche Zeitspanne angewendet. Während der kurzen Zeitdauer dieser Untersuchung wurde keine offensichtliche Toxizität auf Tiere festgestellt. Die In vivo-Wirkung wird in diesem subrenalen Assay in pikomolaren Konzentrationen erreicht. In vitro-Studien benötigen auf der anderen Seite 10- bis 100- fach höhere Gehalte, was ein Ausbleiben von Spaltung und Aktivierung nahelegt.

Claims

1. Verfahren zum Reinigen von MIS, umfassend:

(a) Binden des MIS an eine Antikörper-Chromatographie Matrix, wobei der Antikörper für MIS spezifisch ist;

(b) in wesentlichem Umfang Entfernen kontaminierender Enzyme mit MIS-protolytischer Aktivität oder von Inhibitoren der antiproliferativen Aktivität des MIS durch Zugabe einer wirksamen Menge eines Alkalimetallhalogenids oder eines Erdalkalimetallhalogenids zu der Matrix; und

(c) Gewinnen des MIS durch Elution mit einer einen pH- Wert zwischen etwa 2,5 und 4,0 aufweisenden sauren Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das MIS rekombinantes MIS ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das des weiteren die Zugabe einer wirksamen Menge eines chelatisierenden Mittels mit dem Halogenid aus Schritt (b) umfaßt.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, das des weiteren das Neutralisieren des gewonnenen MIS auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,8 und 7,6 umfaßt.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Alkalimetallhalogenidlösung zwischen etwa 0,1 M und 2,0 M liegt.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Alkalimetallhalogenid Natriumchlorid ist.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Säure Essigsäure ist.

8. Verwendung von rekombinanter MIS bei der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Inhibierung des Wachstums eines Tumors, ausgewählt aus der Gruppe, die aus vulvar epidermoidem Karzinom, cervicularem Karzinom, endometrialem Adenokarzinom, ovarem Adenokarzinom und ocularem Melanom besteht, wobei das MIS nach einem Reinigungsverfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 erhältlich ist und im wesentlichen frei von Antiproliferativinhibitoren ist.

9. Verwendung von rekombinantem MIS nach Anspruch 8, wobei das MIS ein Molekulargewicht von 140 kDa oder 70 kDa aufweist.

10. Verwendung von rekombinantem MIS nach Anspruch 8, wobei das MIS durch Reaktion mit einer proteolytischen Verbindung proteolytisch gespalten wird, um Proteinfragmente mit einem Molekulargewicht von etwa 57 kDa und 12,5 kDa zu bilden.

11. Verwendung Von rekombinantem MIS gemäß Anspruch 10, wobei die proteolytische Verbindung Plasmin ist.

12. Verwendung von rekombinantem MIS nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10, die des weiteren die Zugabe einer wirksamen Menge eines chemotherapeutischen Mittels in die Zusammensetzung des pharmazeutischen Mittels umfaßt, wobei das chemotherapeutische Mittel zur Inhibierung des Wachstums des Tumors wirksam ist.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das chemotherapeutische Mittel Cisplatin ist.

14. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, das das Mischen von im wesentlichen von Antiprolieferativinhibitoren freiem und rekombinantem MIS, das durch ein Reinigungsverfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 erhältlich ist, und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

15. Zusammensetzung, umfassend rekombinantes MIS, das im wesentlichen frei von Antiproliverativinhibitoren ist und nach der Reinigungsmethode nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 erhältlich ist.