DE69130262T2

DE69130262T2 - Isolierte virale proteine als cytokinantagonisten

Info

Publication number: DE69130262T2
Application number: DE69130262T
Authority: DE
Inventors: Raymond G. Seattle Wa 98119 Goodwin; Craig A. Seattle Wa 98119 Smith
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1991-03-29
Publication date: 1999-03-18
Anticipated expiration: 2011-03-30
Also published as: ATE171471T1; WO1992017583A1; EP0604418A1; ES2123515T3; JPH06508502A; DK0604418T3; AU646695B2; DE69130262D1; AU8656991A; EP0604418B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet viraler Proteine und spezifischer auf virale Proteine, die immunregulatorische Aktivität besitzen.
Viren sind infektiöse Partikel, die genetische Elemente enthalten, welche das Virus befähigen, sich in einer lebenden Wirtszelle zu replizieren. Durch Sequenzieren der Gene der Viren und Analysieren der DNA-Sequenz war es möglich, viele offene Leseraster (ORFs) zu identifiziern, die lange Bereiche an Triplettcodons umfassen, die mit einem Translations-Initiationscodon beginnen (davor liegt eine Ribosomenbindungsstelle) und nicht von einem Translations-Stopcodon unterbrochen sind. Es ist jedoch gezeigt worden, daß die meisten ORFs in Viren keine Proteine kodieren. Zum Beispiel wurde die genomische Organsiation und DNA-Sequenz von mehreren ORFs aus der Telomerregion des Shope Fibroma Virus (SFV) kürzlich charakterisiert (Upton et al., Virology 160: 20 (1987)). Obwohl gezeigt wurde, daß diese ORFs transkriptionell aktiv sind und für mRNAs kodieren, wurden bisher keine von diesen mRNAs kodierten Proteine weder identifiziert oder isoliert noch wurde irgendeine biologische Funktion für die mutmaßlichen Proteine (wie von dem ORF gemutmaßt) identifiziert. Ähnlich wurde die DNA- Sequenz der Telomerregion des Myxomavirus erhalten und mehrere ORFs identifiziert: Jedoch wurde kein von diesen ORFs kodiertes Protein identifiziert, isoliert oder charakterisiert. Die vorliegende Erfindung identifiziert eine spezifische Klasse an viralen Proteinen, die immunsuppressive Aktivität besitzen und stellt ein Verfahren zum Identifizieren und Isolieren solcher viraler Proteine zur Verfügung. Die Erfindung stellt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zum Regulieren von Immunantworten zur Verfügung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt gemäß einem ersten Aspekt ein isoliertes und im wesentlichen homogenes lösliches virales Protein zur Verfügung, welches in der Lage ist TNF zu binden und durch ein T2 offenes Leseraster eines Pockenvirus kodiert wird, wobei das virale Protein, das Myxoma Virus T2 Protein ist, welches die Sequenz der Aminosäuren 1-326 der SEQ ID NR: 3 hat.
Es wird ebenfalls eine DNA-Sequenz zur Verfügung gestellt, die für den ersten Aspekt der Erfindung kodiert.
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, welche ein virales Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfaßt oder ein isoliertes und im wesentlichen homogenes lösliches virales Protein umfaßt, welches in der Lage ist, TNF zu binden und durch ein T2 offenes Leseraster eines Pockenvirus kodiert wird, wobei das virale Protein das Shope Firbroma Virus T2 Protein ist, welches die Sequenz der Aminosäuren 1-325 von SEQ ID NR: 1 hat und ein geeignetes Verdünnungsmittel oder Träger.
Die isolierten viralen Proteine dieser Erfindung sind ähnlich zu Cytokin-bindenden Proteinen, wie die extrazelluläre Region eines Cytokinrezeptors und sind in der Lage, ein Cytokin zu binden und das Cytokin daran zu hindern, an seinen Rezeptor zu binden. Die Fähigkeit solcher viraler Proteine, die Aktivität eines Cytokinrezeptors nachzuahmen (und dadurch spezifische Immunantworten runterzuregulieren) befähigt das virale Protein, die antiviralen Verteidigungsmechanismen der Wirtsorganismen zu umgehen und verleiht dem Virus einen selektiven Vorteil. Die viralen Proteine der vorliegenden Erfindung können benutzt werden, um Immunantworten in einer therapeutischen Umgebung (engl. therapeutic setting) zu regulieren. Die vorliegende Erfindung stellt spezifisch Zusammensetzungen in Kombination mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger zur Verfügung, einschließlich eines isolierten Shope Fibroma Virus (SFV) T2 Proteins, welches ein Expressionsprodukt des SFV T2 offenen Leserasters ist und isoliertes Myxoma Virus (MV) T2 Protein, welches ein Expressionsprodukt des Myxoma T2 offenen Leserasters ist. Das SVF T2 Protein und Myxoma T2 Protein haben beide TNF antogonistische Aktivität.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nach Verweis auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
Bevorzugt umfaßt die pharmazeutische Zusammensetzung, in der das Protein in der Lage ist TNF zu binden, ein oder mehrere der folgenden: ist in der Form eines sauren oder basischen Salzes oder in neutraler Form; einzelne Aminosäurereste sind durch Oxidation oder Reduktion modifiziert; die primäre Aminosäurestruktur des Proteins ist durch Bildung eines kovalenten Konjugates oder Aggregat-Konjugates mit anderen chemischen Einheiten modifiziert; das Protein ist durch Verbinden bestimmter funktioneller Gruppen an Aminosäureseitenketten oder an die N- oder C-Termini in der Form eines kovalenten Derivates oder ist in der Form eines kovalenten Konjugates oder Aggregat-Konjugates mit anderen Proteinen oder Polypeptiden; das Protein besitzt ein Quervemetzungsmittel an Cystein und/oder Lysinresten; das Protein ist kovalent durch reaktive Seitengruppen an ein unlösliches Substrat gebunden; das Protein liegt mit oder ohne assoziierte Glykosylierung im ursprünglichen Muster (engl. native-pattem glycosylation) vor; das Protein hat modifizierte angrenzende zweibasische Aminosäuren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als ein Lyophilisat hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls, gemäß einem vierten Aspekt, die Verwendung eines isolierten und im wesentlichen homogenen löslichen viralen Proteins gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder definiert gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung für die Herstel lung eines Medikamentes zur Verwendung beim Inhibieren, Entgegenwirken oder Neutralisieren der biologischen Aktivität eines Cytokins zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin, gemäß einem fünften Aspekt, ein Verfahren zum Herstellen eines isolierten und im wesentlichen homogenen löslichen viralen Proteins zur Verfügung, welches in der Lage ist, TNF zu binden und durch ein T2 offenes Leseraster eines Pockenvirus kodiert wird, wobei das virale Protein das Myxoma Virus T2 Protein ist, welches die Sequenz der Aminosäuren 1-326 von SEQ ID NR: 3 hat, wobei das Verfahren das Kultivieren eines geeigneten Wirts/Vektorsystems zum Exprimieren eines rekombinanten DNA Translationsproduktes und Reinigen des Proteins aus Kulturmedien oder Zellextrakten umfaßt. Gemäß einem sechsten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung zur Verfügung gestellt, welches Kombinieren des viralen Proteins mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger umfaßt.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 stellen die cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Shope Fibroma Virus (SFV) T2 offenen Leserasters (ORF) dar. Das SFV T2 ORF reicht von Nukleotid 1332 bis 2306 und kodiert eine Aminosäuresequenz, die als das c-Phase Leseraster bezeichnet wird.
SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 bezeichnen die cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Myxoma Virus T2 ORFs. Das Myxoma Virus T2 ORF reicht von Nukleotid 2 bis 979 und kodiert eine Aminosäuresequenz, die als das b-Phase Leseraster bezeichnet wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das Immunsystem schützt den menschlichen Körper vor Infektion und Krankheit durch die Interaktion von spezialisierten weißen Blutzellen, die eindringende Mikroben und erkrankte Zellen erkennen und zerstören. Weiße Blutzellen, einschließlich T-Zellen, B-Zellen, Granulocyten und Makrophagen werden von spezifischen Proteinen, bekannt als Cytokine, kontrolliert und koordiniert, welche die Entwicklung, Proliferation, Funktion und Wirksamkeit dieser Zellen dirigieren. Cytokine wirken auf Immunzellen durch Kontaktieren und Anheften (d. h. Binden) an spezifische Proteine, die Cytokinrezeptoren genannt werden, welche auf den Oberflächen von Immunzellen lokalisiert sind. Das Binden eines Cytokins an seinen spezifischen Rezeptor initiiert eine komplexe Folge von Ereignissen in der reagierenden Zelle, welche das Cytokinsignal auf diese Zelle überträgt. Dieses Signal kann dann Zellteilung oder Herstellung von Antikörpern, Enzymen oder anderen Cytokinen stimulieren, wodurch es die Funktion von Immunzellen, die über den ganzen Körper verteilt sind, kontrolliert und koordiniert. In ihrer nativen Konfiguration sind Rezeptorproteine als intakte menschliche Plasmamembranproteine vorhanden, die eine extrazelluläre Region besitzen, welche an einen Liganden bindet, eine hydrophobe Transmembranregion, die bedingt, daß das Protein in der Plasmamembranlipiddoppelschicht immobilisiert ist und eine cytoplasmatische oder intrazelluläre Region, die mit Proteinen und/oder Chemikalien in der Zelle interagiert, um ein biologisches Signal über eine Kaskade an chemisches Reaktionen in dem Cytoplasma der Zelle an Effektorzellen zu übergeben. Die extrazelluläre Region definiert so eine Domäne des Rezeptormoleküls, an welche ein Ligand binden kann, um ein biologisches Signal zu übertragen.
Die normale Immunantwort kann durch eine übermächtige Infektion oder andere immunsuppressive Bedingungen, die mit der Entwicklung von Krebs assoziiert sind, geschwächt werden Immunsystemfunktionsstörungen können ebenfalls in Autoimmunkrankheiten wie Arthritis und Diabetis resultieren, welche resultieren, wenn eine fehlgeleitete Immunantwort Gelenkgewebe oder pankreatische Zellen zerstört. Transplantatpatienten leiden oft unter Organabstoßung, bei welcher das Immunsystem das transplantierte Organ als einen Fremdkörper angreift. Bei anderen Immunerkrankungen überreagiert das Immunsystem auf normale Begegnungen mit fremden Substanzen, was in allergischen Beschwerden oder Asthma resultiert. Nebenprodukte von schweren Immunantworten können ebenfalls schädlich sein, z. B. bei den Entzündungsbeschwerden, die als Kachexie und septischer Schock bekannt sind. Weiterhin kann eine Cytokin-dirigierte Akkumulation von weißen Blutzellen in Antwort auf eine Infektion zu Entzündungsbeschwerden führen, welche die Schwere von Lungenkrankheitsbeschwerden wie Emphysemen verschlimmern.
Solchen fehlgeleiteten und unangemessenen Immunantworten kann durch Cytokinantagonisten entgegengewirkt werden, welche an das Cytokin binden und das Cytokin daran hindern, an seinem Rezeptor zu binden, wodurch die Initiation einer Immunantwort inhibiert wird. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf virale Proteine, welche in der Lage sind, die Aktivität von Cytokinen durch Wirken als Cytokinantagonisten zu modulieren. Die viralen Proteine der vorliegenden Erfindung haben eine Sequenz an Aminosäure, die der Ligandenbindungsregion eines Cytokinrezeptors (z. B. der extrazellulären Region des Rezeptors) oder einem löslichen Cytokinrezeptor ähnlich ist und in der Lage ist, an das Cytokin zu binden und das Cytokin daran zu hindern, an sein Rezeptor zu binden.

Definitionen

Wie hier benutzt, bezieht sich der Terminus "virales Protein" auf Proteine, die durch RNA, DNA, mRNA oder cDNA kodiert werden, welche von einer viralen Quelle isoliert oder anders davon abgeleitet wurden.
"Isoliert" wie im Kontext der vorliegenden Erfindung benutzt, um die Reinheit von viralen Proteinen zu definieren, bezieht sich auf Proteine, welche im wesentlichen frei von anderen menschlichen oder viralen Proteinen von natürlichem oder endogenem Ursprung sind und weniger als ungefähr 1% an Masse an Proteinkontaminationsrückständen von Herstellungsprozessen enthalten. Solche Zusammensetzungen können jedoch andere Proteine, die als Stabilisatoren, Träger, Arzneimittelträger oder Koherapeutika zugesetzt wurden, enthalten. Isolierte virale Proteine sind durch Silberfärbung als eine einzelne Proteinbande in einem Polyacrylamindgel detektierbar.
Ein "Cytokin" ist ein spezifisches Protein, welches die Entwicklung, Proliferation, Funktion und Wirksamkeit von Zellen des Immunsystems steuert. Spezifische Beispiele für "Cytokine" schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf, die Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-3, II-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8), Interferon (IFNα und IFNß), Tumomekrosefaktor (TNFα und TNFß) und verschiedene Wachstumsfaktoren wie GM-CSF, G-CSF und CSF-1. Jedes der obigen Cytokine überträgt ein biologisches Signal durch Binden an ein für das Cytokin spezifisches Rezeptormolekül.
Ein virales Protein, das "Cytokin-antagonistische Aktivität" hat, inhibiert, wirkt gegen oder neutralisiert die biologische Aktivität eines Cytokins. Cytokin-antagonistische Aktivität kann beeinflußt werden dadurch, daß das virale Protein sterisch das Binden eines Cytokins an seinen Rezeptor behindert, wodurch die Übertragung des Cytokinsignals verhindert wird. Zum Beispiel kann eine virales Protein sterisch das Binden eines Cytokins an seinen Rezeptor durch Binden des Cytokins oder seines Rezeptors an oder nahe einer Stelle, die für die Cytokin/Rezeptorbindung benötigt wird, behindern. Das virale Protein kann so physisch das Cytokin und den Rezeptor daran hindern zu interagieren und ein biologisches Signal zu übertragen. Spezifische Beispiele von viralen Proteinen, die Cytokin-antagonistische Aktivität haben, schließen Polypeptide ein, die von dem SFV T2 offenen Leseraster und dem Myxoma Virus T2 offenen Leseraster kodiert werden, hier jeweils als SFV T2 Protein und Myxoma Virus T2 bezeichnet. Die DNA-Sequenz des offenen Leserasters, welches das SFV T2 Protein kodiert und die Aminosäuresequenz des SFV T2 Proteins sind in SEQ ID NR: 1 dargestellt. Die DNA-Sequenz des offenen Leserasters, welches das Myxoma T2 Protein und die Aminosäuresequenz des Myxoma T2 Proteins kodiert, ist in Fig. 2 dargestellt.
SFV T2 und Myxoma T2 sind TNF Antagonisten. Tumornekrosefaktor-α (TNF-α, ebenfalls bekannt als Cachectin) und Tumornekrosefaktor-β (TNF-β, ebenfalls bekannt als Lymphotoxin) sind homologe endogene sekretorische Säugerproteine, die in der Lage sind, eine große Vielfalt an Effekten auf eine große Anzahl an Zelltypen zu induzieren. Die großen Ähnlichkeiten in den strukturellen und funktionalen Charakteristika dieser zwei Cytokine resultierten in ihrer kollektiven Beschreibung als "TNF". Komplementäre DNA-Klone, die TNF-α (Pennica et al., Nature 312: 724, 1984) und TNF-β (Gray et al., Nature 312: 721, 1984) kodieren, sind isoliert worden.
TNF initiiert seinen biologischen Effekt auf Zellen durch Binden spezifisches TNF Rezeptorprotein, welches auf der Plasmamembran einer auf TNF reagierenden Zelle exprimiert wird. Es wird angenommen, daß TNF-α und TNF-β einen gemeinsamen Rezeptor teilen. Die Aminosäurensequenzen von SFV T2 und Myxoma T2 sind der extrazellulären Region des Rezeptors, an welchen TNF bindet, ähnlich und ahmen den TNF Rezeptor durch Binden an TNF nach. SFV T2 und Myxoma T2 inhibieren so das Binden von TNF an TNF Rezeptor. Wegen ihrer Fähigkeit, das Binden von TNF an TNF Rezeptor zu inhibieren, werden isolierte SFV T2 und Myxoma T2 Proteinzusammensetzungen sowohl nützlich in diagnostischen Tests für TNF als auch beim Herstellen von Antikörpern gegen SFV T2 und Myxoma T2 zur Verwendung in der Diagnostik und Therapie sein. Zusätzlich können gereinigte SFV T2 und Myxoma T2 Zusammensetzungen direkt in der Therapie benutzt werden, um TNF zu binden oder abzufangen, wodurch ein Weg zum Regulieren der Immunaktivitäten von TNF zur Verfügung gestellt wird. Um die strukturellen und biologischen Eigenschaften von SFV T2 und Myxoma T2 und die Rollen, die von SFV T2 und Myxoma T2 in den Antworten von verschiedenen Zellpopulationen auf virale Infektion durch SFV und MV spielen; zu untersuchen oder um SFV T2 und Myxoma T2 wirksam in der Therapie, Diagnose oder Test zu benutzen, werden gereinigte Zusammensetzungen von SFV T2 und Myxoma T2 benötigt. Solche Zusammensetzungen sind jedoch in praktischen Mengen (engl. practical yields) nur durch Klonieren und Exprimieren von Genen, die die Rezeptoren kodieren, unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie erhältlich.
Die Ausdrücke "TNF Rezeptor" und "TNF-R" beziehen sich auf Proteine, die die Aminosäuresequenzen der nativen Säuger-TNF-Rezeptor-Aminosäuresequenzen haben.
Ein "löslicher Cytokinrezeptor", wie in dem Kontext der vorliegenden Erfindung benutzt, bezieht sich auf ein Protein oder ein im wesentlichen äquivalentes Analog, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die der extrazellulären Region eines nativen Cytokinrezeptors entspricht, z. B. Polypeptide, welche die Aminosäuresequenzen besitzen, die im wesentlichen äquivalent zu der extrazellulären Region des TNF Rezeptors sind. Da lösliche Proteine keine Transmembranregion besitzen, werden sie von der Wirtszelle, in welcher sie hergestellt werden, abgesondert. Virale Proteine, die eine Aminosäuresequenz besitzen, die ausreichend ähnlich zu der extrazellulären Region eines Cytokinrezeptors oder zu einem löslichen Cytokinrezeptor ist, behalten die Fähigkeit, das Cytokin zu binden und inhibieren die Fähigkeit des Cytokins, ein Signal durch Cytokinrezeptorproteine, die an die Zelloberfläche gebunden sind, zu übertragen. Wenn in therapeutischen Formulierungen verabreicht, zirkulieren die viralen Proteine in dem Körper und binden an zirkulierende Cytokinmoleküle, wodurch sie Interaktion des Cytokins mit natürlichen Cytokinrezeptoren verhindern und Übertragung von Cytokin-Vermittelten biologischen Signalen, wie Immun- oder Entzündungsantworten, inhibieren.
Ein virales Protein hat "Cytokin-antagonistische Aktivität", falls das virale Protein eine Aminosäuresequenz hat, die "ausreichend ähnlich" zu entweder der extrazellulären Region eines Cytokinrezeptors oder zu einem löslichen Rezeptor ist, so daß das virale Protein in der Lage ist, das Binden des Cytokinrezeptors an seinen Liganden zu inhibieren, wodurch die Cytokinsignalübertragung inhibiert wird. Tests zum Bestimmen von Cytokinbindungsinhibition sind unten in Beispiel 1 beschrieben. Inhibition der Cytokinsignalübertragung kann bestimmt werden durch Transfizieren von Zellen mit rekombinanten Cytokinrezeptor-DNAs, um rekombinante Rezeptorexpression zu erhalten. Die Zellen werden dann mit dem Cytokinliganden in Kontakt gebracht, und die resultierenden metabolischen Effekte untersucht. Falls ein Effekt, der auf die Wirkung des Liganden zurückzuführen ist, resultiert, dann hat der rekombinante Rezeptor Signalübertragungsaktivität. Beispielhafte Verfahren zum Bestimmen, ob ein Polypeptid Signalübertragungsaktivität hat, sind von Idzerda et al., J. Exp. Med. 171: 861(1990); Curtis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3045 (1989); Prywes et al., EMBO J. 5: 2179 (1986); und Chou et al., J. Biol. Chem. 262: 1842 (1987) offenbart. Alternativ können primäre Zellen von Zellinien, die einen endogenen Cytokinrezeptor exprimieren und eine nachweisbare biologische Antwort auf das Cytokin haben, benutzt werden. Solche Verfahren werden als Kontrollen zum Testen von Inhibition der Signalübertragung durch die viralen Proteincytokinantagonisten der vorliegenden Erfindung benutzt.
"Rekombinant", wie hier benutzt bedeutet, daß ein Protein von rekombinanten (z. B. mikrobiellen oder Säuger-)Expressionssystemen stammt. "Mikrobiell" bezieht sich auf rekombinante Proteine, die in bakteriellen oder Pilz-(z. B. Hefe-)Expressionssystemen hergestellt werden. Als ein Produkt definiert "rekombinant mikrobiell" ein Protein, das in einem mikrobiellen Expressionssystem hergestellt wird, welches im wesentlichen frei von nativen endogenen Substanzen ist. Protein, welches in den meisten bakteriellen Kulturen, z. B. E. coli, exprimiert wird, ist frei von Glycan. Protein, das in Hefe exprimiert wird, kann ein Glykosylierungsmuster haben, welches unterschiedlich zu dem in Säugerzellen exprimierten ist.
"Biologisch aktiv", wie in der ganzen Beschreibung als ein Charakteristikum eines Cytokins oder eines Cytokinrezeptors benutzt, bedeutet, daß ein bestimmtes Molekül ausreichende Aminosäuresequenzähnlichkeit mit dem Cytokin oder Rezeptor teilt, um in der Lage zu sein, nachweisbare Mengen des Cytokins zu binden oder mit Anticytokinrezeptorantikörpern, die gegen das Cytokin aus natürlichen (d. h. nichtrekombinanten) Quellen erzeugt wurden, kreuzzureagieren.
"DNA-Sequenz" bezieht sich auf ein DNA-Polymer in der Form eines separaten Fragmentes oder als eine Komponente eines größeren DNA-Konstruktes, weiches aus DNA stammt, die mindestens einmal in im wesentlichen reiner Form isoliert wurde, d. h. frei von kontaminierenden endogenen Stoffen und in einer Menge oder Konzentration, die Identifikation, Manipulation und Wiedergewinnung der Sequenz und seiner Komponentennukleotidsequenzen durch biochemische Standardverfahren, z. B. unter Verwendung eines Klonierungsvektors, ermöglicht. Solche Sequenzen werden vorzugsweise in der Form eines offenen Leserasters zur Verfügung gestellt, welches nicht durch interne nichttranslatierte Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryontischen Genen vorhanden sind, unterbrochen wird. Genomische DNA, die die relevanten Sequenzen enthält, kann ebenfalls benutzt werden. Sequenzen von nichttranslatierter DNA können 5' oder 3' von dem offenen Leseraster anwesend sein, wobei dieselben nicht mit Manipulation oder Expression der kodierenden Regionen interferieren. Die viralen Proteine der vorliegenden Erfindung, die Cytokin-antagonistische Aktivität haben, werden durch Isolieren und dann Analysieren eines viralen Proteins, RNA, DNA, mRNA oder cDNA identifiziert, um eine Aminosäuresequenz des viralen Proteins zur Verfügung zu stellen. Die Aminosäuresequenz des viralen Proteins wird dann verglichen mit der Aminosäuresequenz eines Cytokins oder Cytokinrezeptors und solche viralen Proteine werden selektiert und isoliert, die eine Sequenz von Aminosäuren haben, welche ausreichend ähnlich zu einer extrazellulären Region eines Cytokinrezeptors oder eines löslichen Cytokinrezeptors ist, so daß das virale Protein in der Lage ist, Bindung des Cytokinrezeptors an seinen Liganden zu inhibieren. Alternativ können virale Proteine ausgewählt und isoliert werden, welche eine Sequenz haben, die ähnlich zu einem Cytokin ist, und welche in der Lage sind, an einen Cytokinrezeptor (ohne Übertragung eines Cytokinsignals) zu binden und Binden des Cytokins an seinen Rezeptor zu inhibieren.

Proteine und Analoga

Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Proteine zur Verfügung, die Cytokin-antagonistische Aktivität haben. Solche Proteine sind im wesentlichen frei von kontaminierenden endogenen Stoffen und gegebenenfalls ohne assoziierte Glykosylierung im ursprünglichen Muster. Derivate der viralen Proteine im Rahmen der Erfindung schließen ebenfalls verschiedene strukturelle Formen des primären Proteins ein, welche biologische Aktivität behalten, wie oben und in den Ansprüchen definiert. Bedingt durch die Anwesenheit von ionisierbaren Amino- und Carboxylgruppen kann z. B. ein Protein in der Form von sauren oder basischen Salzen vorliegen oder kann in neutraler Form vorliegen. Einzelne Aminosäurereste können ebenfalls durch Oxidation oder Reduktion modifiziert sein.
Die primäre Aminosäurestruktur kann durch Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Einheiten, wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und ähnlichem modifiziert sein.
Kovalente Derivate werden durch Verknüpfen bestimmter funktioneller Gruppen mit Aminosäureseitenketten oder mit den N- oder C-Termini hergestellt. Andere Derivate des Proteins im Rahmen dieser Erfindung schließen kovalente oder aggregative Konjugate des Proteins mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein, wie bei Synthese in rekombinanten Kulturen als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das konjugierte Peptid eine Signal (oder Leader)-Polypeptidsequenz in der N-terminalen Region des Proteins sein, welche cotranslationell oder post-translationell den Transfer des Proteins von seinem Ort der Synthese an seinen Ort der Funktion innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand (z. B. der Hefe α-Faktorleader) dirigiert. Proteinfusionen können Peptide umfassen, die zugesetzt werden, um Reinigung oder Identifikation von viralen Proteinen (z. B. poly-His) zu erleichtern. Die Aminosäuresequenz des viralen Proteins kann ebenfalls mit dem Peptid Asp-Tyr-Lys-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988) verknüpft sein.
Die letztgenannte Sequenz ist hoch antigen und stellt ein Epitop zur Verfügung, das reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden wird, wodurch ein schneller Test und leichte Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins ermöglicht wird. Diese Sequenz wird ebenfalls spezifisch durch Schleimhaut-Enterokinase vom Rind an dem Rest gespalten, der direkt auf die Asp-Lys-Paarung folgt. Fusionsproteine, die mit diesem Peptid geschützt (engl. capped) sind, können resistent gegen intrazelluläre Degradation in E. coli sein. Proteinderivate können ebenfalls als Immunogene, Reagenzien auf Rezeptor-basierenden Immuntests oder als Bindemittel für Affinitätsreinigungsverfahren von Cytokinen oder anderen bindenden Liganden benutzt werden. Virale Proteinderivate können ebenfalls durch quervernetzende Mittel wie M-Maleimidobenzoytsuccinimidester und N-Hydroxysuccinimid an Cystein- und Lysinresten erhalten werden. Proteine können ebenfalls kovalent durch reaktive Seitengruppen an verschiedene unlösliche Substrate gebunden werden, wie Cyanbromid-aktivierte, Bisoxiran-aktivierte, Carbonyldiimidazol-aktivierte oder Tosyl-aktivierte Agarosestrukturen oder durch Adsorbieren an Polyolefinoberflächen (mit oder ohne Glutaraldehyd-Quervernetzung). Wenn Proteine einmal an ein Substrat gebunden sind, können sie benutzt werden, um selektiv (für Test- oder Reinigungszwecke) Antikörper, die gegen das virale Protein oder gegen Cytokinrezeptoren, welche dem viralen Protein ähnlich sind, erzeugt wurden, zu binden.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls virale Proteine mit oder ohne assoziierter Glykosylierung im ursprünglichen Muster ein. Proteine, die in Hefe oder Säugerexpressionssystemen, z. B. COS-7 Zellen, exprimiert wurden, können in dem Molekulargewicht und Glykosylie rungsmuster ähnlich oder leicht anders als die nativen Moleküle sein, abhängig von dem Expressionssystem. Expression von viralen DNAs in Bakterien wie E. coli stellt nichtglykosylierte Moleküle zur Verfügung. Funktionelle mutierte Analoga von viralen Proteinen, die inaktivierte N-Glykosylierungsstellen haben, können durch Oligonukleotidsynthese und Ligation oder durch positionsspezifische Mutageneseverfahren hergestellt werden. Diese analogen Proteine können in einer homogenen reduzierten Kohlehydrafform in guten Ausbeuten unter Verwendung von Hefe-Expressionssystemen hergestellt werden. N-Glykosylierungsstellen in eukaryontischen Proteinen sind durch das Aminosäuretriplett Asn-A&sub1;-Z charakterisiert, wobei A&sub1; jede Aminosäure außer Pro ist und Z Ser oder Thr ist. In dieser Sequenz stellt Asparagin eine Seitenkettenaminogruppe für kovalente Anlagerung von Kohlehydraten dar. Solch eine Stelle kann durch Substitution einer anderen Aminosäure für Asn oder für den Rest Z, Deletieren von Asn oder Z oder Inserieren einer nicht-Z-Aminosäure zwischen A&sub1; und Z oder einer anderen Aminosäure als Asn zwischen Asn und A&sub1; eliminiert werden.
Ebenfalls eingeschlossen ist Modifikation von benachbarten dibasischen Aminosäureresten, um die Expression in Hefesystemen zu verstärken, in welchen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist. Im allgemeinen sollten Substitutionen konservativ durchgeführt werden, d. h. die am meisten bevorzugten substituierten Aminosäuren sind solche, die physicochemische Charakteristika haben, welche denen der zu ersetzenden Aminosäure ähneln.

Expression von rekombinanten viralen Protein-Cytokin-Antagonisten

Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch rekombinante DNA-Verfahren durch Inserieren von DNA-Sequenzen, die virales Protein kodieren, in einen rekombinanten Expressionsvektor und Exprimieren der DNA-Sequenz in einem rekombinanten mikrobiellen Expressionssystem unter Bedingungen, die die Expression fördern, hergestellt. DNA-Sequenzen, die die Proteine, welche durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt werden, kodieren, können aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern oder aus einer Serie von Oligonukleotiden zusammengesetzt werden, um ein synthetisches Gen zur Verfügung zu stellen, welches ist der Lage ist, in einen rekombinanten Expressionsvektor inseriert und in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert zu werden.
Rekombinante Expressionsvektoren schließen synthetische oder von cDNA-abstammende DNA-Fragmente ein, die virale Proteine oder bioäquivalente Analoga kodieren, die operativ an geeignete transkriptorische oder translatorische regulatorische Elemente gebunden sind, welche von Säuger-, mikrobiellen, viralen oder Insektengenen abstammen. Solche regulatorischen Elemente schließen einen Transkriptionspromotor, eine optionale Operatorsequenz um Transkription zu kontrollieren, eine Sequenz, die geeignete mRNA Ribosomenbindungsstellen kodiert und Sequenzen, die die Termination der Transkription und Translation kontrollieren, wie unten im Detail beschrieben, ein. Die Fähigkeit in einem Wirt zu replizieren, gewöhnlich durch einen Replikationsursprung verliehen und ein Selektionsgen, um die Identifizierung (engl. recognition) von Transformanten zu erleichtern, kann zusätzlich eingefügt werden. DNA- Regionen sind operativ verknüpft, wenn sie funktionell miteinander in Beziehung stehen. Zum Beispiel ist DNA für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) operativ mit DNA für ein Polypeptid verknüpft, falls es als ein Vorläufer exprimiert wird, der in der Sekretion des Polypeptides teilnimmt; ein Promotor ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, falls er die Transkription der Sequenz kontrolliert; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, falls sie so positioniert ist, daß sie Translation erlaubt. Im allgemeinen bedeutet operativ verknüpft aufeinanderfolgend und im Falle der sekretorischen Leader, aufeinanderfolgend und im Leseraster.
DNA-Sequenzen, die virale Proteine kodieren, welche in einem Mikroorganismus exprimiert werden sollen, werden vorzugsweise keine Introns enthalten, die die Transkription von DNA in mRNA frühzeitig abbrechen können. Bedingt durch Degeneration des Codes, können bemerkenswerte Variationen in Nukleotidsequenzen auftreten, die die gleiche Aminosäuresequenz kodieren.
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert wurden, welche unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt wurden und welche Sequenzen enthalten, die virale Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren. Transformierte Wirtszellen können das gewünschte virale Protein exprimieren, jedoch müssen Wirtszellen, für Zwecke des Klonierens oder Amplifizierens viraler DNA transformiert wurden, das virale Protein nicht exprimieren. Exprimierte virale Proteine werden vorzugsweise in den Kulturüberstand abgesondert, abhängig von der ausgewählten DNA, können jedoch ebenfalls in der Zellmembran abgelagert werden. Geeignete Wirtszellen zur Expression von viralen Proteinen schließen Prokaryonen, Hefe oder höhere eukaryonische Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren ein. Prokaryonten schließen Gram-negative oder Gram- positive Organismen, z. B. E. coli oder Bazillen ein. Höhere eukaryontische Zellen schließen etablierte Zellinien mit Säugerherkunft wie unten beschrieben ein. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um virale Proteine unter Verwendung von RNAs, die aus den hier offenbarten DNA-Konstrukten abstammen, herzustellen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zum Gebrauch zusammen mit zellulären Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Säugerwirten sind von Pouweis et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) beschrieben; die relevante Offenbarung ist hier durch Referenz miteingeschlossen.
Prokaryontische Expressionswirte können zur Expression von viralen Proteinen benutzt werden, die keine umfangreiche proteolytische und Disulfld-Prozessierung benötigen. Prokaryontische Expressionsvektoren umfassen im allgemeinen einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker, z. B. ein Gen, das Proteine kodiert, die Antibiotikaresistenz vermitteln oder ein autotrophes Bedürfnis vermitteln (engl. supply) und einen Replikationsursprung haben, der von dem Wirt erkannt wird, um Amplifikation in dem Wirt sicherzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte zur Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl andere ebenfalls je nach belieben benutzt werden können.
Nützliche Expressionsvektoren für bakterielle Verwendung können einen selektierbaren Marker und bakteriellen Replikationsursprung umfassen, der aus kommerziell erhältlichen Plasmiden abstammt, die genetische Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche kommerziellen Vektoren schließen z. B. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese pBR322-"Rückgrat"-Sektionen werden mit einem geeigneten Promotor und der strukturellen zu exprimierenden Sequenz kombiniert. E. coli wird typischerweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem Plasmid, das aus einer E. coli Spezies abstammt, transformiert (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt daher einfache Mittel zum Idendifizieren transformierter Zellen zur Verfügung.
Promotoren, die häufig in rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendet werden, schließen das β-Lactamase- (Penicillinase) und Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979) ein, das Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EPA 36,776) und den tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laborafory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412,1982) ein. Ein besonders nützliches bakterielles Expressionssystem verwendet den Phagen X PL-Promotor und c1857ts thermolabilen Repressor. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, welche Derivate des X PL-Promotors inkorporiert haben, schließen Plasmid pHUB2, auftretend in (engl. resident in) E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092) und pPLc28, auftretend in E. coli RR1 (ATCC 53082), ein.
Rekombinante virale Proteine können ebenfalls in Hefewirten exprimiert werden, bevorzugt von den Saccharomyces-Spezien wie S. cerevisiae. Hefe oder andere Gattungen, wie Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden im allgemeinen einen Replikationsursprung aus dem 2u-Hefeplasmid oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), Promotor, DNA, die das virale Protein kodiert, Sequenzen zur Polyadenylie rung und Transkriptionstermination und ein Selektionsgen enthalten. Bevorzugt schließen Hefevektoren einen Replikationsursprung und selektierbare Marker ein, die Transformation von sowohl Hefe als auch E. coli, z. B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und S. cerevisiae trp1-Gen, ein, welches einen Selektionsmarker für einen mutierten Stamm von Hefe zur Verfügung stellt, dem die Fähigkeit in Tryptophan zu wachsen fehlt und einen Promotor, der von einem hoch exprimierten Hefegen stammt, um Transkription einer strukturellen Sequenz stromabwärts zu induzieren. Die Anwesenheit der trp1-Funktionsstörung in dem Hefewirtszellgenom stellt dann eine wirksame Umgebung zum Detektieren von Transformation durch Wachstum in der Abwesenheit von Trypthophan zur Verfügung.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073,1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden weiter in R. Hitzeman et al., EPA 73,657 beschrieben.
Bevorzugte Hefevektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen aus pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Amp'-Gen und Replikationsursprung) und Hefe-DNA-Sequenzen, einschließlich eines Glucose-reprimierbaren ADH2-Promotors und eines α-Faktor- Sekretionsleaders, zusammengesetzt werden. Der ADH2-Promotor ist von Russel et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300: 724, 1982) beschrieben worden.
Der Hefe α-Faktorleader, welcher Sekretion von heterologen Proteinen steuert, kann zwischen den Promotor und das strukturelle Gen inseriert werden, um exprimiert zu werden. Siehe, z. B., Kurjan et al., Cell 30 : 933, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1983. Die Leadersequenz kann modifiziert sein, um nahe an ihrem 3'-Ende eine oder mehrere nützliche Restriktionsschnittstellen zu enthalten, um Fusion der Leadersequenz mit fremden Genen zu erleichtern.
Geeignete Hefe-Transformationsprotokolle sind dem Fachmann bekannt; ein beispielhaftes Verfahren ist von Hinnen et al., Prec. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978 beschrieben, welches für Trp-Transformanten in einem selektiven Medium selektiert, das aus 0,67% Hefestickstoffbase, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 ug/ml Adenin und 20 ug/ml Uracil besteht.
Wirtsstämme, die mit Vektoren transformiert sind, welche den ADH2-Promotor umfassen, können zur Expression in einem reichen Medium, bestehend aus 1% Hefeextrakt, 2% Pep ton und 1% Glucose, ergänzt mit 80 ug/ml Adenin und 80 ug/ml Uracil, herangezogen werden. Derepression des ADH2-Promotors tritt nach Verbrauch von Glucose im Medium auf. Unbehandelte Hefeüberstände werden durch Filtration geerntet und für weitere Reinigung bei 4ºC gehalten.
Verschiedene Säuger- oder Insektenzellkultursysteme können verwendet werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Baculovirussysteme zur Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen sind von Luckow und Summers, Bio/Technology 6 : 47 (1988) besprochen worden. Beispiele für geeignete Säugerwirtszellinien schließen die COS-7 Linien von Affennierenzellen, beschrieben von Gluzman (Cell 23: 175, 1981) und andere Zellinien, einschließlich z. B. L-Zellen, C127, 3T3, Chinese hamster ovary (CHO), HeLa- und BHK-Zellinien ein, die in der Lage sind, einen geeigneten Vektor zu exprimieren. Säugerexpressionsvektoren können nichttranskribierte Elemente wie einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer, verbunden mit dem zu exprimierenden Gen und andere 5'- oder 3'-flankierende nichttranskribierte Sequenzen und 5' oder 3' nichttranskribierte Sequenzen, wie notwendige Ribosomenbindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleiß-Donor und -Akzeptorstellen und Transkriptionsterminationssequenzen, umfassen.
Die Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in zu benutzenden Expressionsvektoren in transformierenden Vertebratenzellen können aus viralen Quellen zur Verfügung gestellt werden. Zum Beispiel stammen häufig benutzte Promotoren und Enhancer von Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und menschlichem Cytomegalovirus ab. DNA-Sequenzen, die vor dem SV40 viralen Genom abstammen, z. B. SV40 Ursprung, früher und später Promotor, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen, können benutzt werden, um andere genetische Elemente, die zur Expression einer heterologen DNA-Sequenz benötigt werden, zur Verfügung zu stellen. Die frühen und späten Promotoren sind besonders nützlich, weil sie leicht von dem Virus als ein Fragment erhalten werden können, welches ebenfalls den SV40 viralen Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Kleinere oder größere SV40 Fragmente können ebenfalls benutzt werden, vorausgesetzt, daß die ungefähr 250 Bp-Sequenz, die von der HindIII-Schnittstelle bis zur Bg/I-Schnittstelle reicht, welche in dem viralen Replikationsursprung lokalisiert sind, eingeschlossen ist. Weiter können ein viraler genomischer Promotor, Kontroll- und/oder Signalsequenzen eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß solche Kontrollsequenzen mit der gewählten Wirtszelle kompatibel sind. Exemplarische Vektoren können wie bei Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart, hergestellt werden.
Ein nützliches System zur stabilen starken (engl. high level) Expresson von Säugerrezeptor- cDNAs in C127 murinen Brustepithelzellen können im wesentlichen wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben, hergestellt werden.
Ein besonders bevorzugter eukaryontischer Vektor zur Expression von viraler Protein DNA ist in Beispielen 2 und 6 unten beschrieben. Dieser Vektor, als pCAV/NOT bezeichnet, stammte aus dem starken Säugerexpressionsvektor pDC201 und enthält regulatorische Sequenzen aus SV40, Adenovirus-2 und menschlichem Cytomegalovirus.
Gereinigte virale Proteine oder Analoga werden durch Kultivieren geeigneter Wirts/Vektorsysteme hergestellt, um die rekombinaten Translationsprodukte der DNAs der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, welche dann aus Kulturmedien oder Zellextrakten gereinigt werden. Zum Beispiel können Kulturüberstände von Systemen, die rekombinantes Protein in Kulturmedien absondern zuerst unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, z. B. eine Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Auf den Konzentrationsschritt folgend kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix aufgetragen werden. Eine geeignete Affinitätsmatrix kann z. B. ein virales Protein oder Lectin oder Antikörpermolekül, das an einen geeigneten Träger (engl. support) gebunden ist, umfassen. Alternativ kann ein Anionaustauscherharz verwendet werden, z. B. eine Matrix oder Substrat, welches anhängende Diethylaminoethyl(DEAE)-Gruppen hat. Diese Matrices können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Arten, die häufig bei Proteinreinigung verwendet werden, sein. Alternativ kann ein Kationaustauschschritt verwendet werden. Geeignete Kationaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrizes, umfassend Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen, ein. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt.
Schließlich können ein oder mehrere Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) Schritte, die hydrophobe RP-HPLC-Medien verwenden, z. B. Silicagel, das anhängende Methyl- oder andere aliphatische Gruppen hat, verwendet werden, um eine virale Proteinzusammensetzung weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorstehenden Reinigungsschritte können ebenfalls in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, um ein homogenes rekombinantes Protein zur Verfügung zu stellen.
Rekombinantes virales Protein, welches in Bakterienkultur hergestellt wurde, wird im allgemeinen durch anfängliche Extraktion aus Zeilsedimenten gereinigt, gefolgt von ein oder mehreren Konzentrations-, Aussalzungs-, wäßrigen Ionenaustausch- oder Größenexclusions-Chromatographieschritten. Schließlich kann High Performance Liquid Chromatography (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen, die zur Expression von rekombinantem viralen Protein verwendet werden, können durch jedes bequeme Verfahren, einschließlich Gefriertrocknung (engl. freeze-thaw cycling), Sonifikation, mechanische Aufbrechen oder Verwendung von Zell-lysierenden Mitteln aufgebrochen werden.
Fermentation von Hefe, die virales Protein als ein abgesondertes Protein exprimiert, vereinfacht die Reinigung sehr. Abgesondertes rekombinantes Protein, welches aus Fermentation im großen Maßstab resultiert, kann durch Verfahren, die analog zu denen von Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbart sind, gereinigt werden. Diese Referenz beschreibt zwei sequentielle Reverse-Phase HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem menschlichem GM-CSF auf einer präparativen HPLC-Säule.
Virales Protein, welches in rekombinanter Kultur synthetisiert wird, ist charakterisiert durch die Anwesenheit von nichtviralen Zellkomponenten, einschließlich Proteinen, in Mengen und von einem Charakter, der von den Reinigungsschritten abhängt, die unternommen wurden, um das virale Protein aus der Kultur zu reinigen. Diese Komponenten stammen gewöhnlich von Hefe, prokaryontischen oder nicht menschlichen höheren eukaryontischen Quellen und sind bevorzugt in harmlosen kontaminanten Mengen in der Größenordnung von weniger als 1% in Gewicht vorhanden. Weiterhin ermöglicht rekombinante Zellkultur die Herstellung von viralem Protein, welches frei von anderen Proteinen ist, die normalerweise mit dem viralen Protein assoziiert sein können, wie es in der Natur in seinen Ursprungsspezien vorgefunden wird, z. B. in Zellen, Zellexudaten oder Körperflüssigkeiten.

Verabreichung von viralen Proteinzusammensetzungen

Die vorliegende Erfindung stellt therapeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die eine wirksame Menge eines viralen Proteins und eines geeigneten Verdünnungsmittels und Trägers zur Verwendung beim Inhibieren, Entgegenwirken oder Neutralisieren der biologischen Aktivität eines Cytokins umfassen.
Die Verwendung von SFV T2 und Myxoma T2 Proteinen in Verbindung mit löslichen Cytokinrezeptoren, z. B. TNF-Rezeptor, wird ebenfalls in Betracht gezogen.
Für therapeutische Verwendung wird gereinigtes virales Protein einem Patienten, vorzugsweise einem Menschen, zur Behandlung in einer der Indikation angemessenen Weise verabreicht. So können z. B. SFV T2 und Myxoma T2 Proteinzusammensetzungen als Bolus-Injektion, kontinuierliche Infusion, langzeitiger Freisetzung aus Implantaten oder anderen geeigneten Verfahren verabreicht werden, um Immunfunktion zu unterdrücken. Typischerweise wird ein therapeutisches Mittel in der Form einer Zusammensetzung verabreicht werden, die gereinigtes Protein in Verbindung mit physiologisch verträglichen Trägem, Arzneimittelträger oder Verdünnungsmitteln umfaßt. Solche Träger werden für den Empfänger in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sein. Gewöhnlich bringt die Herstellung solcher Zusammensetzungen das Kombinieren des viralen Proteins mit Puffern, Antioxidanzi en wie Ascorbinsäure, Polypeptiden geringen Molekulargewichts (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlehydraten einschließlich Glucose, Sucrose oder Dextrinen, Komplexbildnern wie EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Arzneimittelträgern mit sich. Neutrale gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung, die mit conspezifischem (engl. conspecific) Serumalbumin gemischt ist, sind beispielhafte verträgliche Verdünnungsmittel. Bevorzugt wird ein Produkt als ein Lyophilisat unter Verwendung geeigneter Arzneimittelträgerlösungen (z. B. Sucrose) als Verdünnungsmittel formuliert. Geeignete Dosierungen können durch Versuche bestimmt werden. Die Menge und Häufigkeit der Anwendung wird selbstverständlich von solchen Faktoren wie der Natur und der Schwere der zu behandelnden Indikation, der gewünschten Antwort, dem Zustand des Patienten usw. abhängen.
SFV T2 und Myxoma T2 Proteine werden zu dem Zweck des Inhibierens von TNF-abhängigen Antworten verabreicht. TNF wird klinisch als ein Antitumormittel verwendet und resultiert in schweren Toxizitäten. Die Toxizitäten, die mit der Verabreichung von TNF assoziiert sind, sind identisch zu den Effekten, die das Cytokin offenbart, wenn es bei normalen oder überaktiven Immunantworten hergestellt wird. Es wird angenommen, daß TNF, welches als ein Ergebnis auf die Immunantwort auf malignes Gewebe hergestellt wird, ein verursachender Faktor für Kachexie ist. Zusätzlich wird TNF im Laufe anderer Immunreaktionen hergestellt, wie der Antwort des Körpers auf schwere bakterielle Infektionen, wobei TNF-Herstellung zu der Entwicklung von septischem Schock beitragen kann. Die Herstellung von anderen Schlüsselcytokinen (IL-1, IL-2 oder einer Anzahl von Kolonie-stimulierenden Faktoren) kann ebenfalls signifikante Wirtsherstellung von TNF induzieren. So wurden Nebenwirkungen dieser Cytokine, die in bestimmten Dosen menschlichen Patienten verabreicht wurden, auf die Induktion von TNF-Herstellung zurückgeführt. Da TNF an einen spezifischen TNF-Rezeptor, der auf der Oberfläche von reaktionsfähigen Zellen vorhanden ist, bindet, können virale TNF-Antagonisten wie SFV T2 und Myxoma T2 nützlich sein als eine Therapie für Kachexie oder septischen Schock oder um Nebenwirkungen, die mit Cytokintherapie assoziiert sind, zu behandeln.
Die folgenden Beispiele werden als Illustration angeboten, jedoch nicht als Limitierung.

BEISPIELE

Beispiel 1

Bindungstests

A. Radiomarkierung von TNFα und TNFß. Radiomarkiertes TNFα und TNFß (in verschiedenen Tests für TNF-Antagonisten verwendet) wurde wie folgt hergeleitet. Rekombinantes menschliches TNFα in der Form eines Fusionsproteins, welches ein hydrophiles Octapeptid an dem N-Terminus enthielt, wurde in Hefe als ein abgesondertes Protein exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988). Gereinigtes rekombinantes menschlichen TNFß wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) bezogen. Beide Proteine wurden auf eine spezifische Aktivität von 2 · 10¹&sup5; cpm/mmole (cpm-Zerfälle pro Minute) unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Festphasemittels Iodogen (Pierce) radiomarkiert. Bei diesem Verfahren wurden 5 ug an Iodogen auf den Boden eines 10 · 75 mm Glasröhrchens plattiert und für 20 Minuten bei 4ºC mit 75 ul an 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4 und 20 ul (2 mCi) Na ¹²&sup5;I inkubiert. Diese Lösung wurde dann in ein zweites Glasröhrchen transferiert, welches 5 ug TNFα (oder TNFß) in 45 ul PBS für 20 Minuten bei 4ºC enthielt. Die Reaktionsmischung wurde durch Gelfiltration über ein 2 ml Säulenvolumen aus Sephadex G- 25 (Sigma) fraktioniert, welches in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium äquilibriert war, das 2,5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% (wlv) Natriumazid und 20 mM Hepes pH 7,4 (Bindemedium) enthielt. Die endgültigen vereinigten Fraktionen (engl. final pool) an ¹²&sup5;I-TNF wurde zu einer Arbeitsstammlösung von 1 · 10&supmin;&sup7; M in Bindemedium verdünnt und für bis zu 3 Wochen bei 4ºC ohne bedeutenden Verlust an Rezeptorbindungsaktivität gelagert.
B. Detektion von SFV T2 Bindug an TNF-Rezeptoren. Zwei separate Bindungstests wurden benutzt, um T2 Proteinbindung an TNF-Rezeptoren zu messen. Bei dem ersten Verfahren wurde die Anwesenheit von SFV T2 in COS-7 Zellüberständen durch Inhibition von ¹²&sup5;I-TNFα- Bindung an U937-Zellen gemessen. Überständen von COS-Zellen, die mit rekombinanten SFV T2 ORF Konstrukten transfiziert waren, wurden drei Tage nach Transfektion geerntet. Serielle zweifache Verdünnungen dieses Überstandes wurden mit 0,3 nM ¹²&sup5;I-TNFα (spezifische Aktivität 1 · 10¹&sup5; cpm/mmole) für zwei Stunden bei 4ºC vor dem Zusetzen von 2 · 10&sup6; U937 Zellen vorinkubiert. Die Zellen werden für zusätzliche zwei Stunden bei 4ºC inkubiert, wonach freies und zellgebundenes menschliches ¹²&sup5;I-TNFα unter Verwendung eines Pthalatöl- Separationsverfahrens aufgetrennt wurden (Dower et al., J. Immunol. 132: 751, 1984), im wesentlichen wie von Park et al. (J. Biol. Chem. 261: 4177, 1986) beschrieben. Nichtspezifische Ligandenbindung wurde in allen Tests durch Einschließen eines 200 molaren Überschusses an nicht markiertem Liganden bestimmt.
Bei dem zweiten Verfahren wurde ¹²&sup5;I-TNF-Bindung an T2 Protein direkt durch Nitrocellulosepunktblots nachgewiesen. Die Fähigkeit von TNF-Rezeptor oder T2 stabil an Nitrocellulose aus Detergensextrakten von menschlichen Zellen zu adsorbieren, jedoch Bindungsaktivität beizubehalten, stellt einen Weg zum Detektieren von T2 dar. Zellextrakte wurden durch Mischen durch heftiges Schütteln (engl. vortexing) eines Zellsedimentes mit einem 2 · Volumen an PBS hergestellt, welches 1% Triton X-100 und einen Cocktail Proteaseinhibitoren (2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 uM Pepstatin, 10 uM Leüpeptin, 2 mM o-Phenänthrolin und 2 mM EGTA) enthielt. Die Mischung wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert, wonach sie bei 12.000 · g für 15 Minuten bei 8ºC zentrifugiert wurde, um Nuklei und andere Zelitrümmer zu entfernen. Alternativ wurde rekombinantes T2 Protein in der Form von COS Überständen mit einem gleichen Volumen an PBS/1% Triton X-100 und einem Cocktail derselben Proteaseinhibitoren gemischt. Zwei Mikroliter Testproben des Zellextraktes oder T2 Proteinextraktes wurden auf trockene BA85/21 Nitrocellulosemembranen (Schleicher und Schuell, Keene, NH) plaziert und ihnen erlaubt zu trocknen. Die Membranen wurden in Gewebekulturschalen für 4 Stunden in Tris (0,05 M) gepufferter Kochsalzlösung (0,15 M) pH 7,5 inkubiert, welche 3% w/v BSA enthält, um nichtspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Membran wurde dann mit 5 · 10&supmin;¹¹ M ¹²&sup5;I-TNF in PBS + 3% BSA bedeckt und für 2 h für 4ºC unter Schütteln inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Membranen dreimal in eiskaltem PBS gewaschen, getrocknet und auf einen Kodak X-Omat AR Film für 18 h bei -70ºC plaziert.

Beispiel 2

Expression des SFV T2 ORF

Ein Vektor (pKTH-1), welcher das Shope Fibroma Virus T2 offene Leseraster (SFV T2 ORF) enthielt und in pUC19 kloniert war, wurde von Dr. Grant McFadden der University of Alberta, Edmonton, Kanada, erhalten. Ein SpellBamHI-Restriktionsfragment, welches einen Großteil des SFV T2 offenen Leserasters enthielt, wurde aus pKTH-1 durch Verdau mit Spel und BamHI-Restriktionsenzymen ausgeschnitten, was in einem partiellen SFV T2 ORF cDNA Fragment resultierte, aus dem die ersten 7 Codons (einschließlich des ATG-Initiationscodons) des 5'-Terminus deletiert worden waren. Die 5'-terminale kodierende Sequenz wurde durch Ligation des folgenden synthetischen Oligonukleotides an das partielle SFV cDNA Fragment rekonstruiert, welches eine Consensussequenz für optimale Translationsinitiation enthielt (engl. incorporated) und ein 5'-Terminus, der mit einer Asp718 Restriktionsstelle kompatibel ist, enthielt:
Die resultierende cDNA wurde in den eukaryontischen Expressionsvektor pDC302 ligiert, welcher mit den Asp718 und BgIII-Restriktionsenzymen verdaut wurde. pDC302 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20842, USA unter dem Namen pCAV/NOT-IL-7R, Hinterlegungsnummer 68014, hinterlegt. Der resultierende Expressionsvektor wurde pDC302-SFVT20RF bezeichnet. pDC302 wurde aus pDC201 (be schrieben von Sims et al., Science 241: 585,1988 und abstamniend von pMLSV, beschriben von Cosman et al., Nature 312: 768,1984), SV40 und Cytomegalovirus DNA zusammengesetzt und umfaßt in Sequenz mit der Transkriptionsrichtung von dem Replikationsursprung: (1) SV40-Sequenzen von Koordinaten 5171-270, einschließlich des Replikationsursprungs, Enhancersequenzen und frühe und späte Promotoren; (2) Cytomegalovirus-Sequenzen einschließlich der Promotor- und Enhancerregionen (Nukleotide 671 bis +63 aus der von Boechart et al. (Cell 41: 521, 1985) veröffentlichten Sequenz; (3) Adenovirus-2 Sequenzen, die das erste Exon und einen Teil des Introns zwischen dem ersten und zweiten Exon des dreigeteilten Leaders enthalten, das zweite Exon und Teil des dritten Exons des dreigeteilten Leaders und eine multiple Klonierungsstelle (MCS), die Schnittstellen für Xhol, KpnI, Smal, Notl und Bg/l enthält; (4) SV40 Sequenzen von Koordinaten 4127-4100 und 2770-2533, welche die Polyadenylierungs- und Terminationssignale für frühe Transkription einschließen; (5) Sequenzen, die aus pBR322 und mit Virusassoziierten Sequenzen VAI und VAII von pDC201 stammen, mit Adenovirussequenzen 10532-11156, welche die VAI- und VAII-Gene enthalten, gefolgt von pBR322-Sequenzen von 4363-2486 und 1094-375, welche das Ampicillin-Resistenzgen und Replikationsursprung enthalten.
SFV T2 Protein wurde dann transient in Affen COS-7 Zellen wie folgt exprimiert. Eine subkonfluente Lage COS-7 Zellen wurde mit pDC302-SFVT20RF unter Verwendung von DEAE- Dextran transfiziert, gefolgt von Choroquin-Behandlung wie von Luthman et al., Nucl. Acids Res. 11: 1295 (1983) und McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41: 351 (1968) beschrieben. Die Zellen wurden dann für drei Tage in Kulturmedium herangewachsen, um transiente Expression der inserierten SFV T2 ORF Sequenzen zu erlauben. Nach drei Tagen wurden die Zellkulturüberstände und die einlagigen Zellen, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet und TNF Bindung und TNF/TNF-Rezeptorbindungsinhibition wurden bestätigt. COS-Zellen werden dann in ausreichenden Mengen herangezogen (engl. bulked up), um mehrere Liter an konditioniertem Medium, welches Mikrogramm Mengen an SFV T2 Protein enthält, zu erzeugen.

Beispiel 3

Reinigung von SFV T2 Protein durch TNF-Affinitätschromatographie

SFV T2 Protein wird aus COS-Zellüberständen aus Beispiel 2 unter Verwendung von TNF als ein Affinitätsligand gereinigt. Um große Mengen an rekombinantem TNF zur Herstellung einer TNF-Affinitätsmatrix zu erhalten, wurde ein Flag®-TNF-Fusionsprotein, welches das "Flag®"- Octapeptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys an dem Aminoterminus von TNF enthält, konstruiert und exprimiert. Diese Octapeptidsequenz ändert die biologische Aktivität von TNF nicht, ist hoch antigen und stellt ein Epitop zur Verfügung, das reversibel durch einen spezifi schen monoklonalen Antikörper gebunden wird, was einfache Reinigung des exprimierten TNFs erlaubt (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204 (1988).
Das Flag®-TNF-Fusionsprotein wird an Affigel-10 (Bio-Rad) oder CnBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) gemäß den Vorschlägen des Herstellers gekoppelt und wie vorher von Urdal et al., J. Biol. Chem. 263: 2870 (1988) beschrieben. COS Zellenkonditioniertes Medium aus Beispiel 2 wird geerntet und zentrifugiert und das resultierende konditionierte Medium (RPMI 1640) wird auf 1% BSA, 0,1% Natriumazid, 20 mM HEPES, pH 7,4 eingestellt. Zu dem konditioniertem Medium wird ein Cocktail an Proteaseinhibitoren (2 mM PMSF, 2 mM O-Phenanthrolin, 1 mM Pepstatin, 1 mM Leupeptin) zugesetzt. Das resultierende Medium wird auf eine Flag®-TNF-Affinitätssäule, äquilibriert mit PBS, pH 7,4, aufgetragen. Die Säule wird dann mit 10 Säulenvolumen an PBS, pH 7,4 gewaschen, wonach gebundenes Protein mit 0,1 M Glycin-HCl, pH 3,0 eluiert wird. Eluat, das SFV T2 Protein enthält, wird sofort mit 80 ml an 1,0 M HEPES, pH 7,4 neutralisiert und Proben für Bindungstests entnommen (beschrieben in Beispiel 1 oben) und durch SDS-PAGE analysiert, wie vorher von Urdal J. Biol. Chem. 263: 2870 (1988) beschrieben.

Beispiel 4

Reinigung von SFV T2 Protein unter Verwendung von Reverser-Phase HPLC

SFV T2 Protein wird ebenfalls durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung von Flag®- TNF-Bindung als ein biologischer Test zur Detektion von SFV T2-Aktivität gereinigt. Flag®-TNF wird wie in Beispiel 3 oben beschrieben hergestellt. COS Zellen-konditioniertes Medium aus Beispiel 2 wird geerntet und zentrifugiert und das resultierende konditionierte Medium (RPMI 1640) wird auf 1% BSA, 0,1% Natriumazid, 0,5 M CaCl&sub2; und 20 mM HEPES, pH 7,4 eingestellt. Zu dem konditioniertem Medium wird ein Cocktail an Proteaseinhibitoren (2 mM PMSF, 2 mM O-Phenanthrolin, 1 mM Pepstatin, 1 mM Leupeptin) zugesetzt. SFV T2 Protein wird aus dem resultierenden Medium durch herkömmliche Reinigungsverfahren, einschließlich Ionenaustausch, hydrophobe Interaktion, Gelexclusion und Reverse-Phase HPLC, gereinigt.

Beispiel 5

Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen SFV T2 Protein

Präparationen von z. B. gereinigtem rekombinantem SFV T2 oder transfizierten COS Zellen, die große Mengen an SFV T2 exprimieren, werden verwendet, um monoklonale Antikörper gegen SFV T2 unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, z. B. solche wie in US-Patent 4,411,993 offenbart, erzeugt. Solche Antikörper sind wahrscheinlich nützlich beim Interferieren mit TNF Bindung an TNF-Rezeptoren, z. B. beim Verbessern toxischer oder anderer unerwünschter Effekte von TNF oder als Komponenten von diagnostischen und Forschungs-Tests für TNF oder löslichen TNF-Rezeptor.
Um Mäuse zu immunisieren, wird SFV T2 Immunogen in vollständigem Freund's Adjuvans emulgiert und in Mengen, die von 10-100 ug reichen, subkutan in Balb/c-Mäuse injiziert. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem Immunogen behandelt (engl. boosted), welches in unvollständigem Freunds Adjuvans emulgiert ist und in bestimmten Zeitabständen danach in einem ein- bis zweiwöchigen Immunisierungszeitplan behandelt. Serumproben werden in bestimmten Zeitabständen durch retro-orbitales Bluten oder Schwanzspitzenabschneiden zum Testen durch Punktblottest (Antikörper Sandwich) oder ELISA (Enzym-gebundener Immunsorbenttest) entnommen. Andere Testverfahren sind ebenfalls geeignet. Nach Detektion eines geeigneten Antikörpertiters, wird positiven Tieren eine intravenöse Injektion von Antigen in Kochsalzlösung gegeben. Drei bis vier Tage später werden die Tiere geopfert, die Splenozyten geerntet und mit der murinen Myelomzellinie NS1 fusioniert. Hybridomzellinien, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, werden in multiple Mikrotiterplatten in einem HAT-selektiven Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) ausplattiert, um Proliferation von nichtfusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu inhibieren.
Hybridomklone, die so hergestellt wurden, können durch ELISA nach Reaktivität mit SFV T2 oder TNF-Rezeptor durchmustert werden, z. B. durch Adaptionen der Verfahren, die von Engvall et al. Immunochem. 8: 871 (1971) und in US-Patent 4,703,004 offenbart sind. Positive Klone werden dann in die Peritonealhöhlen von syngenen Balb/c-Mäusen injiziert, um Aszites herzustellen, welches hohe Konzentrationen (> 1 mg/ml) an anti-SFV T2-monoklonalem Antikörper enthält. Der resultierende monoklonale Antikörper kann durch Ammoniumsulfatfällung gefolgt von Gelexklusionschromatographie und/oder Affinitätschromatographie, die auf dem Binden von Antikörper an Protein A von Staphylococcus aureus basiert, gereinigt werden.

Beispiel 6

Expression des Myxoma Virus T2 ORF

Ein Vektor (pMTN-6), der das Myxoma Virus T2 offene Leseraster (MYXOMA T2 ORF) erhält, wurde von Dr. Grant McFadden an der Universität von Alberta, Edmonton, Kanada, erhalten. Dieser Vektor wurde durch Inserieren eines Myxoma BamHl-Fragmentes (siehe Russell & Robbins, Virology 170,147-159 (1989)) in die BamHI-Stelle von pUC19 hergestellt. Ein NlaIII- Fragment, welches die gesamte kodierende Region des MYXOMA T2 ORF enthält, wurde aus pMyBT-5 isoliert und in die Sphl-Stelle von pMH21p kloniert, um pMTN-6 zu bilden.
Das MYXOMA T2 ORF wurde aus pMTN-6 durch Verdau mit HindIII und Pstl-Restriktionsenzymen ausgeschnitten, was in einem vollständigen MYXOMA T2 ORF cDNA-Fragment resultiert. Die resultierende cDNA wurde mit glatten Enden versehen (engl. blunt-ended) und in den eu karyontischen Expressionsvektor pDC302 ligiert, welcher mit dem Smal-Restriktionsenzym verdaut wurde. Der resultierende Expressionsvektor wurde pDC302-MVT20RF-1 benannt.
SFV T2 Protein wurde dann transient in Affen COS-7 Zellen wie folgt exprimiert. Eine subkonfluente Lage COS-7 Zellen wurde mit pDC302-MVT20RF unter Verwendung von DEAE- Dextran transfiziert, gefolgt von Choroquin-Behandlung wie von Luthman et al., Nuci. Acids Res. 11: 1295 (1983) und McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41: 351 (1968) beschrieben. Die Zellen wurden dann in Kulturmedium für drei Tage herangewachsen, um transiente Expression der inserierten MYXOMA T2 ORF-Sequenzen zu erlauben. Nach drei Tagen wurden die Zellkulturüberstände und die einlagigen Zellschichten wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Die Zellkulturüberstände inhibierten die Bindung von TNF an TNF-Rezeptor nicht, möglicherweise weil das HindIII/PstI-Restriktionsfragment nicht die spezifischen Sequenzen 5' der kodierenden Region enthielt, welche für Expression benötigt werden. Demgemäß Myxoma T2 ORF kloniert in den Säugerexpressionsvektor pDC302 unter Verwendung des Polymerasekettenreaktionsverfahrens (PCR). Dieses Verfahren inseriert eine CACC-Nukleotidsequenz vor dem Initiationscodon, welches wichtig für die optimale Initiation der Translation (Kozak, Mol. Cell. Bio. 8: 2737 (1988)) ist. Die folgenden Primer werden für diese Konstruktion benutzt: 5' Ende Primer 3' Ende Primer

BgIII-Stelle

Das PCR-Produkt enthält so jeweils NotI- und BgIII-Restnktionsschnittstellen an den 5'- und 3'- Termini. Diese Restriktionsschnittstellen werden zum Klonieren in pDC302 benutzt. Das Template für die PCR-Reaktion ist der Klon Myxoma T2 Klon, oben beschrieben, welcher das Myxoma T2 ORF (pMTN-6) enthält. Die DNA-Sequenzen, die das Myxoma T2 ORF (einschließlich der stromaufwärts Kozak-Sequenzen) kodieren, werden dann durch PCR amplifiziert, im wesentlichen wie von Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990) beschrieben. Der resultierende amplifizierte Klon wird dann isoliert und in pDC302 ligiert und transient in Affen COS-7 Zellen, wie oben beschrieben, exprimiert. COS-Zellen werden dann in ausreichenden Mengen herangezogen, um mehrere Liter an konditioniertem Medium, welches Mikrogramm Mengen an SFV T2 Protein enthält, zu ergeben.

Beispiel 7

Reinigung von Myxoma T2 Protein durch TNF-Affinitätschromatographie

Myxoma T2 Protein wird aus COS-Zellüberständen aus Beispiel 6 unter Verwendung von TNF als einen Affinitätsligand gereinigt. Um große Mengen an rekombinantem TNF zur Herstellung einer TNF-Affinitätsmatrix zu erhalten, wurde ein Flag®-TNF-Fusionsprotein, welches das "Flag®"-Octapeptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys fusioniert an dem Aminoterminus von TNF enthält, konstruiert und exprimiert. Diese Octapeptidsequenz ändert die biologische Aktivität von TNF nicht, ist hoch antigen und stellt ein Epitop zur Verfügung, welches reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden werden kann, was einfache Reinigung des exprimierten TNFs ermöglicht (Hopp et al., Bio/Technology 6 : 1204 (1988). Das Flag®-TNF-Fusionsprotein wird an Affigel-10 (Bio-Rad) oder CnBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) gemäß den Vorschlägen des Herstellers und wie vorher von Urdal et al., J. Biol. Chem. 263 : 2870 (1988) beschrieben, gekoppelt. COS-Zellenkonditioniertes Medium aus Beispiel 6 wird geerntet und zentrifugiert und das resultierende konditionierte Medium (RPMI 1640) wird auf 1% BSA, 0,1% Natriumazid, 20 mM HEPES, pH 7,4 eingestellt. Zu dem konditioniertem Medium wird ein Cocktail an Proteaseinhibitoren (2 mM PMSF, 2 mM O-Phenanthrolin, 1 mM Pepstatin, 1 mM Leupeptin) zugesetzt. Das resultierende Medium wird auf eine Flag®-TNF-Affinitätssäule, die mit PBS, pH 7,4 äquilibriert ist, geladen. Die Säule wird dann mit 10 Säulenvolumen an PBS, pH 7,4 gewaschen, wonach gebundenes Protein mit 0,1 M Glycin-HCl, pH 3,0 eluiert wird. Eluat, das Myxoma T2 Protein enthält, wird sofort mit 80 ml an 1,0 M HEPES, pH 7,4 neutralisiert und Testproben für Bindungstests entnommen (beschrieben in Beispiel 1 oben) und Analyse durch SDS-PAGE wie oben von Urdal J. Biol. Chem. 263: 2870 (1988) vorher beschrieben.

Beispiel 8

Reinigung von SFV T2 oder Myxoma T2 Protein unter Verwendung von Reverser Phase HPLC

Myxoma T2 Protein wird ebenfalls durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung von Flag®-TNF-Bindung als ein biologischer Test zur Detektion von Myxoma T2-Aktivität gereinigt. Flag®-TNF wird wie in Beispiel 3 oben beschrieben hergestellt. COS-Zellen-konditioniertes Medium aus Beispiel 6 wird geerntet und zentrifugiert und das resultierende konditionierte Medium (RPMI 1640) wird auf 1% BSA, 0,1% Natriumazid, 0,5 M CaCl&sub2; und 20 mM HEPES, pH 7,4 eingestellt. Zu dem konditioniertem Medium wird ein Cocktail an Proteaseinhibitoren (2 mM PMSF, 2 mM O-Phenanthrolin, 1 mM Pepstatin, 1 mM Leupeptin) zugesetzt. Myxoma T2 Protein wird aus dem resultierenden Medium durch herkömmliche Reinigungsverfahren, einschließlich Ionenaustausch, hydrophobe Interaktion, Gelexclusion und Reverse-Phase HPLC, gereinigt.

Beispiel 9

Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Myxoma T2 Protein

Präparationen von z. B. gereinigtem rekombinantem Myxoma T2 oder transfizierten COS- Zellen, die große Mengen an Myxoma T2 exprimieren, werden verwendet, um monoklonale Antikörper gegen Myxoma T2 unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, z. B. solche wie in US-Patent 4,411,993 offenbart, erzeugt. Solche Antikörper sind wahrscheinlich nützlich beim Interferieren mit TNF Bindung an TNF-Rezeptoren, z. B. beim Verbessern toxischer oder anderer unerwünschter Effekte von TNF oder als Komponenten von diagnostischen und Forschungs-Tests für TNF oder löslichen TNF-Rezeptor.
Um Mäuse zu immunisieren, wird Myxoma T2 Immunogen in vollständigem Freunds Adjuvans emulgiert und in Mengen, die von 10-100 ug reichen, subkutan in Balb/c-Mäuse injiziert. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem Immunogen behandelt (engl. boosted), welches in unvollständigem Freunds Adjuvans emulgiert ist und in bestimmten Zeitabständen danach in einem ein- bis zweiwöchigen Immunisierungszeitplan behandelt. Serumproben werden in bestimmten Zeitabschnitten durch retro-orbitales Bluten oder Schwanzspitzenabschneiden zum Testen durch Punktblottest (Antikörper Sandwich) oder ELISA (Enzym-gebundener Immunsorbenttest) entnommen. Andere Testverfahren sind ebenfalls geeignet. Nach Detektion eines geeigneten Antikörpertiters, wird positiven Tieren eine intravenöse Injektion von Antigen in Kochsalzlösung gegeben. Drei bis vier Tage später werden die Tiere geopfert, die Splenozyten geerntet und mit der murinen Myelomzellinie NS1 fusioniert. Hybridomzellinien, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, werden in multiple Mikrotiterplatten in einem HAT-selektiven Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) ausplattiert, um Proliferation von nichtfusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu inhibieren.
Hybridomklone, die so hergestellt wurden, können durch ELISA nach Reaktivität mit Myxoma T2 oder TNF-Rezeptor durchmustert werden, z. B. durch Adaptionen der Verfahren, die von Engvall et al. Immunochem. 8: 871 (1971) und in US-Patent 4,703,004 offenbart sind. Positive Klone werden dann in die Peritonealhöhlen von syngenen Balb/c-Mäusen injiziert, um Aszites herzustellen, welches hohe Konzentrationen (> 1 mg/ml) an anti-Myxoma T2-monoklonalem Antikörper enthält. Der resultierende monoklonale Antikörper kann durch Ammoniumsulfatfällung gefolgt von Gelexklusionschromatographie und/oder Affinitätschromatographie, die auf dem Binden von Antikörper an Protein A von Staphylococcus aureus basiert, gereinigt werden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Smith, Craig A.
Goodwin, Raymond G.
(ii) NAME DER ERFINDUNG: Isolierte virale Protein Cytokin Antagonisten
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A)ADRESSAT: Immunex Corporation
(B) STRASSE: 51 University Street
(C) STADT: Seattle
(D) STAAT: Washington
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 98101
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) DATENSPEICHER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOSIMS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.24
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG
(C) KLASSIFIKATION
(viii) ANWALT/VERTRETER INFORMATION:
(A) NAME: Wight, Christopher L.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 31,680
(C) REFERENZ/DOCKETNUMMER: 2602
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEPHON: (206) 587-0430
(B) TELEFAX: (206) 587-0606
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1200 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: N
(iv) ANTI-SENSE: N
(vi) HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Kaninchen Fibrom Virus
(vii) DIREKTE HERKUNFT:
(B) KLON: T2 ORF
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:192.. 1169
(D) WEITERE INFORMATION:
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat-peptide
(B) LAGE:192.. 1166
(D) WEITERE INFORMATION:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 325 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN
(A) LÄNGE: 1064 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGART: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: N
(iv) ANTI-SENSE: N
(vi) HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Myxoma Virus
(vii) DIREKTE HERKUNFT:
(B) KLON: T2 ORF
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat-peptid
(B) LAGE: 2..979
(D) WEITERE INFORMATION:
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:2.. 982
(D) WEITERE INFORMATION:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR: 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 326 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:

Claims

1. Isoliertes und im wesentlichen homogenes lösliches virales Protein, fähig TNF zu binden und kodiert durch ein T2 offenes Leseraster eines Pockenvirus, wobei das virale Protein das Myxoma Virus T2 Protein ist, welches die Sequenz der Aminosäuren 1-326 von SEQ ID NR: 3 hat.

2. DNA, die das virale Protein wie in Anspruch 1 beansprucht kodiert.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend: ein virales Protein wie in Anspruch 1 beansprucht oder ein isoliertes und im wesentlichen homogenes lösliches virales Protein, welches fähig ist TNF zu binden und durch ein T2 offenes Leseraster eines Pockenvirus kodiert wird, wobei das virale Protein das Shope Fibroma Virus T2 Protein ist, das die Sequenz der Aminosäuren 1-325 von SEQ ID NR: 1 hat und ein geeignetes Verdünnungsmittel oder Träger.

4. Zusammensetzung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das Protein fähig ist TNF zu binden, welches ein oder mehrere des folgenden umfaßt: ist in der Form eines sauren oder basischen Salzes oder in neutraler Form; einzelne Aminosäurereste sind durch Oxidation oder Reduktion modifiziert; die primäre Aminosäurestruktur des Proteins ist durch Bildung eines kovalenten oder Aggregat- Konjugates mit anderen chemischen Einheiten modifiziert; das Protein ist in der Form eines kovalenten Derivates durch Verbinden bestimmter funktioneller Gruppen mit Aminosäureseitenketten oder an die N- oder C-Termini oder ist in der Form eines kovalenten oder Aggregat-Konjugates mit anderen Proteinen oder Polypeptiden; das Protein hat ein Quervernetzungsmittel an Cystein- und/ oder Lysin-Resten; das Protein ist kovalent durch reaktive Seitengruppen an ein unlösliches Substrat gebunden; das Protein ist mit oder ohne assoziierte Glycosylierung im ursprünglichen Muster; das Protein hat modifizierte angrenzende dibasische Aminosäuren.

5. Zusammensetzung wie in Anspruch 3 oder Anspruch 4 beansprucht, wobei die Zusammensetzung als ein Lyophilisat hergestellt wird.

6. Zusammensetzung wie in Anspruch 3, 4 oder 5 beansprucht, zur Verwendung beim Inhibieren, Entgegenwirken oder Neutralisieren der biologischen Aktivität eines Cytokins.

7. Verwendung eines isolierten und im wesentlichen homogenen löslichen viralen Proteins wie in Anspruch 1 beansprucht oder wie in Anspruch 3 definiert bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung beim Inhibieren, Entgegenwirken oder Neutralisieren der biologischen Aktivität eines Cytokins.

8. Verfahren zum Herstellen eines isolierten und im wesentlichen homogenen löslichen viralen Proteins, fähig TNF zu binden und kodiert durch ein T2 offenes Leseraster eines Pockenvirus, wobei das virale Protein das Myxoma Virus T2 Protein ist, welches die Sequenz der Aminosäuren 1-326 von SEQ ID NR: 3 hat, wobei das Verfahren Kultivieren eines geeigneten Wirts-/Vektorsystemes umfaßt, um ein rekombinantes DNA Translationsprodukt zu exprimieren und Reinigen des Proteins aus Kulturmedien oder Zellextrakten.

9. Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung wie in Anspruch 3 oder Anspruch 4 beansprucht, wobei das Verfahren das Kombinieren des viralen Proteins mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger umfaßt.